CN113774141B - 一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,公开了一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物及其应用。本发明构建了一种基于不对称PCR偶联结构特异性核酸酶等温扩增技术,可以用于灵敏地检测肺癌患者用药相关双突变位点的顺反式构象及突变丰度。本发明可在核酸浓度为3ng时,检测低至0.1%的突变目标分子,整个检测过程不超过2.5小时。本发明成本低,操作简单方便,检测周期短,特异性好,假阳性率和假阴性率低。适用于实际样品的测定和临床标本的测定等,能成为具有实际临床应用价值的传感器。
Description
技术领域
本发明属于基因突变检测技术领域,涉及一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物及其应用。
背景技术
人表皮细胞生长因子受体(EGFR)基因突变/过表达,促进二聚体的形成,引起酪胺酸激酶的持续活化,是引起肺癌等肿瘤发生的关键驱动事件。美国国立综合癌症网络(NCCN)指南及中国临床肿瘤学会(CSCO)原发性肺癌诊疗指南(2019版)均明确指出:EGFR-酪氨酸受体阻滞剂(EGFR-TKIs)治疗进展期非小细胞肺癌(NSCLC)之前应对EGFR突变状态进行检测,以便筛选EGFR-TKI治疗的最适宜对象。利用基因检测直接反应酪胺酸激酶的活化状态,对预测靶向治疗效果、筛选可能获益患者,辅助肺癌的精准靶向治疗具有重要的意义。
根据回顾性临床分析结果表明,当同一个基因有不同突变位点时,其不同的空间结构对于临床治疗具有不同的影响。例如奥希替尼治疗后常有T790M伴随C797S、C796S/R或L792F/H等共同突变。当T790M与其突变处于反式构型(两个突变位于不同染色体上)时,第一代EGFR-TKI与第三代EGFR-TKI联合使用即可;当两突变处于顺式构型(两突变位于同一条染色体上)时,可选择布加替尼与抗EGFR药物(西妥昔单抗)联合使用。因此,在肿瘤治疗过程中,同一基因有不同突变位点时,明确其存在的构型方式对于指导患者后续的治疗用药,提高生存率具有重要意义。
在现有基因突变检测系统中,主要分为基于PCR原理的变温扩增技术、恒温扩增技术以及测序技术,具体如下。
1.PCR原理的变温扩增技术:
主要有扩增阻滞突变系统PCR(ARMS-PCR)和数字PCR(dPCR);
PCR主要原理:是目前应用较为广泛的一种点突变检测方法。在普通PCR的基础上,设计等位基因特异的上游引物,其3’端核苷酸对应突变型等位基因,在Taq DNA聚合酶的作用下,与野生型模版不完全匹配的上游引物将不能退火,生成PCR产物,而与突变型模版匹配的引物体系则可以扩增出产物。
数字PCR主要原理:将标准PCR反应体系分成几十到几万份,然后再将其分配到不同的反应单元中,使每个微滴单元包含一个或多个拷贝的核酸分子(即DNA模板),每个单元都会对目标分子进行扩增,扩增结束后含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号,最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。
缺点:试剂成本较高,无法检测未知类型的突变;一次测试仅能检测单个位点变异,无法适用于多突变位点的联合检测,更无从判断双突变位点在染色体上的空间位置分布。
2.等温扩增技术:
核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定的温度下,通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。常见的等温扩增技术有以下几种:
限制性片段长度多态性(RFLP):利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列,并在特定序列处切开DNA分子,即产生限制性片段的特性,对于不同种群的生物个体而言,他们的DNA序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点,并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时,就会少一个或多一个酶切位点,结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时,产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段。后将这些片段电泳、转膜、变性,与标记过的探针进行杂交,洗膜,即可分析其多态性结果。
侵袭性探针技术(Invader assay):反应中侵袭型探针和信号探针分别与目的核酸分子发生互补杂交,但信号探针的5′端部分碱基不与目的核酸互补配对,呈游离状态,称5′游离臂。在杂交过程中,上游的侵袭型探针的3′末端的一个核苷酸插入由下游的信号探针与目的核酸分子互补配对形成的双链核酸中,从而在该位置上形成一个重叠结构。这一三联体重叠结构可被侧翼核酸内切酶识别并切割,切割位点在信号探针的第一、二两个配对碱基之间,得到的切割产物为信号探针的5′游离臂再加上第一个配对碱基。
缺点:无法适用于多突变位点的联合检测,更无从判断双突变位点在染色体上的空间位置分布
3.测序技术:
一代测序:在合适的条件下,当DNA模板、引物及脱氧核苷三磷酸(dNTP)存在时,DNA聚合酶能够催化DNA链的合成。ddNTP是双脱氧核苷三磷酸,其C3位上连的是脱氧后的羟基。C3位上-OH可作为下一个dNTP连接的位点,失去氧原子的ddNTP不能与下一个dNTP连接,从而终止DNA链的延伸。利用放射性同位素标记ddNTP,同时往正常的PCR反应里分别掺入ddNTP(ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP)。当ddNTP结合时,DNA合成终止,因此DNA合成链可能随机停止在任何碱基处。经过几十个循环后,将得到长短不一且长度相差一个碱基的DNA产物,将所得产物分四个泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据四种碱基的条带位置反向推出DNA序列。
二代测序:其基本原理是DNA合成的可逆性末端循环,即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。将dNTP的3'-OH以叠氮基团可逆末端基团(RTG)进行修饰;将4种碱基分别与不同的荧光分子连接;DNA合成时,RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应;每次合成反应终止并读取信号之后,洗脱RTG和荧光分子,进行下一轮循环。
缺点:试剂设备昂贵,文库构建流程复杂,需要对结果专业的生物信息学分析,对专业技术人员提出了极高要求,测试周期较长,严重限制了临床应用。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物及其应用。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
1、一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物,包括:
单链目的片段上游引物和下游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
上游探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
连接体探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO.4~8所示;
下游探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO.9~13所示。
F:5’-CTCCACCGTGCAGCTCATCAT-3’,如SEQ ID NO.1所示;
R:5’-ATCTGCACACACCAGTTGAGC-3’,如SEQ ID NO.2所示;
Upstream(790):5’-TGCGCCTGGTTGAGGTGCTGCACGGTGGA-3’,如SEQ ID NO.3所示;
Linker1:5’-AGCAACCTGTGCCGAAGGGCATTAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.4所示;
Linker2:5’-AGCAACCTGTCGAAGGGCATTAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.5所示;
Linker3:5’-AGCAACCTGGCGAAGGGCATTAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.6所示;
Linker4:5’-AGCAACCTGTTAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.7所示;
Linker5:5’-AGCAACCTGGAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.8所示;
Downstream(797):5’-GACATAGTCGAGGAGGCT-3’,如SEQ ID NO.9所示;
Downstream(796S):5’-CATAGTCGAGGAGGCAA-3’,如SEQ ID NO.10所示;
Downstream(796R):5’-CATAGTCGAGGAGGCAC-3’,如SEQ ID NO.11所示;
Downstream(792F):5’-CAGCCGAAGGGCATGAT-3’,如SEQ ID NO.12所示;
Downstream(792H):5’-GCACCAAAGGGCATGAT-3’,如SEQ ID NO.13所示。
优选的,所述单链目的片段的制备方法如下:以突变型基因组为模板进行PCR扩增,上游引物与下游引物的体积浓度比为100:1,扩增条件为:95℃预变性10分钟;95℃变性15秒,60℃退火延伸30秒,共40个循环;最后12℃保存,即得所述的单链目的片段。
2、上述引物、探针组合物在制备一种用于双位点顺式突变检测的试剂盒或传感器中的应用。
3、一种用于双位点顺式突变检测的试剂盒或传感器,包含上述引物、探针组合物。
4、上述一种用于双位点顺式突变检测的试剂盒或传感器的制备方法,将单链目的片段、上游探针、连接体探针和下游探针按照体积浓度比为1.5:1:1.5:1.5加入缓冲液中,95℃变性,缓慢恢复至室温即可。
优选的,缓冲液包含:20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2mM MgSO4,质量浓度0.1%Triton X-100,去离子水补足至100%,pH=8.8。
本发明的有益效果在于:
1、本发明构建了一种基于不对称PCR偶联结构特异性核酸酶(FEN1)等温扩增技术,可以用于灵敏地检测肺癌患者双位点突变位点空间构象。该方法可在核酸浓度为3ng时,检测低至0.1%的突变目标分子。
2、本发明优化了一种不对称PCR方法,获得大量单链目标片段。首先针对T790M设计正向引物序列,反向引物跨过C797S区域,针对野生型模版进行设计,所述方法能够更好的获得大量单链基因片段;
3、本发明研制了一种基于不对称PCR偶联结构特异性核酸酶(FEN1)等温扩增技术同时检测肺癌患者双位点突变位点空间构象,整个检测过程不超过2.5h;
4、本发明成功构建了可用于检测肺癌患者双位点顺反式突变的检测探针、使用方法。本发明对双位点顺反式突变的测定显示了灵敏度高、稳定、重现性好的能力。与现有技术比较,本发明成本低,操作简单方便,检测周期短,特异性好,假阳性率和假阴性率低,尤其适用于实际样品的测定,具有重要的临床应用价值。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图进行说明:
图1为不对称PCR偶联结构特异性核酸酶等温扩增技术分析不同突变丰度的T790M/cis-C797S定量检测结果;误差棒表示平均值±标准差,其中n=3个重复。
图2为不对称PCR偶联结构特异性核酸酶等温扩增技术分析不同突变丰度的T790M/trans-C797S定量检测结果;误差棒表示平均值±标准差,其中n=3个重复。
图3为不对称PCR偶联结构特异性核酸酶等温扩增技术分析野生型、T790M/cis-C797S、T790M/cis-C796S、T790M/cis-C796R、T790M/cis-L792F、T790M/cis-C792H的结果。(基因组质粒浓度为3ng,突变丰度为0.1%)
图4为不对称PCR偶联结构特异性核酸酶等温扩增技术分析野生型、T790M/trans-C797S、T790M/trans-C796S、T790M/trans-C796R、T790M/trans-L792F、T790M/trans-C792H的结果。(基因组质粒浓度为3ng,突变丰度为0.1%)
图5为入侵式探针检测22例非小细胞肺癌患者的标本组织和血液检测结果,阳性结果的阈值为15.52%。结果显示,12份样品检测为野生型,另外10份为阳性(1、2为T790M/cis-C797S,3、4为T790M/cis-C796S,5、6为T790M/cis-C796R,7、8为T790M/cis-L792F,9、10为T790M/cis-C792H),检测结果与高通量测序(NGS)结果完全一致。
图6为入侵式探针检测22例非小细胞肺癌患者的标本组织和血液检测结果,阳性结果的阈值为679.5。结果显示,12份样品检测为野生型,另外10份阳性(1、2为T790M/trans-C797S,3、4为T790M/trans-C796S,5、6为T790M/trans-C796R,7、8为T790M/trans-L792F,9、10为T790M/trans-C792H),检测结果与高通量测序(NGS)结果完全一致。
图7为入侵式探针检测22例非小细胞肺癌患者的标本组织和血液检测结果,其中12份样品检测为野生型,另外10份为阳性(1、2为T790M/cis-C797S,3、4为T790M/cis-C796S,5、6为T790M/cis-C796R,7、8为T790M/cis-L792F,9、10为T790M/cis-C792H)。采用t检验,P<0.0001,ROC曲线下面积AUC=1。
图8为入侵式探针检测22例非小细胞肺癌患者的标本组织和血液检测结果,其中12份样品检测为野生型,另外10份为阳性(1、2为T790M/trans-C797S,3、4为T790M/trans-C796S,5、6为T790M/trans-C796R,7、8为T790M/trans-L792F,9、10为T790M/trans-C792H)。采用t检验,P<0.0001,ROC曲线下面积AUC=1。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1制备单链目标片段
1.材料与方法
1.1材料
Premix TaqTM购至于TAKARA(中国,北京)。HPLC纯化的DNA由上海生工合成。临床标本来源于重庆大学附属肿瘤医院。
1.2使用仪器
美国赛默飞SimpliAmp Thermal Cycler PCR仪。
1.3实验原理
当两条引物的浓度不同时,在PCR反应最初10~15个循环中,其扩增产物主要是双链DNA,但当低浓度引物消耗完后,高浓度引物引导的PCR即产生大量的单链DNA,从而得到检测所需的单链目标分子。
2.不对称PCR制备单链目标片段
2.1样本核酸提取
2.2单链目标片段制备:
1)配置反应体系(50μl),体系如表1所示。
表1.反应体系
2)将配置的反应液在SimpliAmp Thermal Cycler PCR仪中按照表2所示程序进行反应。
表2.反应程序
实施例2构建T790M伴随C797S、C796S/R或L792F/H顺反式突变检测方法
1.材料与方法
1.1材料
Thermostable FEN1(FEN1),FEN1缓冲液,MgSO4(100mM)购于New EnglandBiolabes(中国,上海)。HPLC纯化的DNA由上海生工合成。
序列信息如下:
F:5’-CTCCACCGTGCAGCTCATCAT-3’,如SEQ ID NO.1所示;
R:5’-ATCTGCACACACCAGTTGAGC-3’,如SEQ ID NO.2所示;
Upstream(790):5’-TGCGCC/iDabcyldT/GGT/i6FAMdT/GAGGTGCTGCACGGTGGA-3’(FAM为荧光基团,Dabcyl为其对应的淬灭基团),如SEQ ID NO.3所示;
Linker1:5’-AGCAACC/iBHQ2dT/GTGCCGAAGGGCAT/iTAMdT/AGCTGCT-3’(TAMRA为荧光基团,BHQ2为其对应的淬灭基团),如SEQ ID NO.4所示;
Linker2:5’-AGCAACCTGTCGAAGGGCATTAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.5所示;
Linker3:5’-AGCAACCTGGCGAAGGGCATTAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.6所示;
Linker4:5’-AGCAACCTGTTAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.7所示;
Linker5:5’-AGCAACCTGGAGCTGCT-3’,如SEQ ID NO.8所示;
Downstream(797):5’-GACATAGTCGAGGAGGCT-3’,如SEQ ID NO.9所示;
Downstream(796S):5’-CATAGTCGAGGAGGCAA-3’,如SEQ ID NO.10所示;
Downstream(796R):5’-CATAGTCGAGGAGGCAC-3’,如SEQ ID NO.11所示;
Downstream(792F):5’-CAGCCGAAGGGCATGAT-3’,如SEQ ID NO.12所示;
Downstream(792H):5’-GCACCAAAGGGCATGAT-3’,如SEQ ID NO.13所示。
1.2检测仪器
日本日立荧光分光光度计F-4700。
1.3检测原理
FEN1是结构特异性酶,当其作用切割结构特异位点后,使两荧光基团分别与各自淬灭基团分开,在495nm的荧光照射下,使用荧光分光光度计检测520nm和580nm处的荧光强度值,当两波长处均有波峰出现时,即为顺式突变,可通过F580/F520的比值,计算FAM荧光转移至TAMRA的荧光效率;当仅有520nm处有波峰出现时,则再次使用559nm的荧光进行照射,若580nm处有波峰出现时,即为反式突变。
2.T790M以及C797S顺反式突变检测方法的构建
2.1配置反应体系
将Target,Upstream probe,Linker probe和Downstream probe按浓度比为1.5:1:1.5:1.5混合于缓冲液中,95℃变性,缓慢恢复至室温备用。其中,缓冲液包含:20mMTris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,7mM MgSO4,质量浓度0.1%Triton X-100,去离子水补足至100%,pH=8.8。
反应体系:上述反应体系 19.5μL
FEN1酶 0.5μL
剪切过程酶反应体系在63℃下反应60min。
2.2反应完成后,用H2O扩容至200μL。设定激发波长495nm,扫描范围510nm~700nm,设定激发波长559nm,扫描范围570nm~700nm电压700V,测定上述反应溶液荧光光谱图。
实施例3制备的T790M伴随C797S顺反式突变检测性能分析
将不同突变丰度的标本经过PCR进行单链的制备,再将得到的单链产物进行T790M与C797S顺反式突变检测性能分析。具体的,在最优实验条件下,加入反应体系中,完成荧光光谱分析,实验结果显示,当上样量低至3ng时,突变丰度在0.1%到10%之间时,可检测到T790M/cis-C797S低至0.1%的突变序列(图1);且当T790M/trans-C797S的突变丰度在0.1%到10%之间时,也具有较好的检测结果(图2)。
实施例4制备的T790M伴随C796S/R或L792F/H顺反式突变检测性能分析
构建EGFR基因T790M/C796R、T790M/C796S、T790M/L792F、T790M/C792H突变的质粒,然后用实施例1制备单链的目的片段,采用实施例2所构建的顺反式突变检测策略进行测定。结果如图3、4所示,仅有出现T790M/cis-C796R、T790M/cis-C796S、T790M/cis-L792F、T790M/cis-C792H突变的标本具有较强的FRET转移效率,与野生型相比,具有显著性差异(P<0.0001);仅有出现T790M/trans-C796R、T790M/trans-C796S、T790M/trans-L792F、T790M/trans-C792H突变的标本具有较强的荧光强度值,与野生型相比,具有显著性差异(P<0.0001)。结果提示,该方法不仅能够用于T790M伴随的双突变位点正反式的检测,还可广泛用于同一外显子上两位点顺反式突变分析。
实施例5制备的T790M与C797S、C796S/R或L792F/H顺反式突变检测用于临床标本分析
双位点顺反式突变检测的准确性和特异性,在生物样本中基因序列分析具有重要的作用,主要取决于PCR的特异性扩增以及FEN1结构特异性酶的识别。为评价本策略的特异性和准确性,申请人对临床标本进行了检测。
具体的,将临床上肺癌组织标本中提取基因组DNA以及血液标本中提取的血浆游离DNA(ctDNA)(包括2例T790M/cis-C797S阳性标本,2例T790M/cis-C796S阳性标本、2例T790M/cis-C796R、2例T790M/cis-C792F阳性标本、2例T790M/cis-C792H阳性标本;2例T790M/trans-C797S阳性标本、2例T790M/trans-C796S阳性标本、2例T790M/trans-C796R、2例T790M/trans-C792F阳性标本、2例T790M/trans-C792H阳性标本,12例阴性标本),然后用实施例2所构建的双位点顺反式突变检测策略进行测定(图5、6)。和临床采用的二代测序技术进行统计分析,所得到的32例标本具有较好的一致性。采用t检验,P<0.0001,ROC曲线下面积AUC=1(图7、8)。这些结果说明制备的双位点顺反式突变检测策略能够有效的检测基因位点顺反式变异的方式,具有良好的特异性。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 重庆大学
<120> 一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctccaccgtg cagctcatca t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atctgcacac accagttgag c 21
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcgcctggt tgaggtgctg cacggtgga 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcaacctgt gccgaagggc attagctgct 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcaacctgt cgaagggcat tagctgct 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcaacctgg cgaagggcat tagctgct 28
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcaacctgt tagctgct 18
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcaacctgg agctgct 17
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacatagtcg aggaggct 18
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catagtcgag gaggcaa 17
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catagtcgag gaggcac 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagccgaagg gcatgat 17
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcaccaaagg gcatgat 17
Claims (5)
1.一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物,其特征在于,由以下引物和探针组成:
单链目的片段上游引物和下游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
上游探针:
5’-TGCGCC/iDabcyldT/GGT/i6FAMdT/GAGGTGCTGCACGGTGGA-3’ ,FAM为荧光基团,Dabcyl为其对应的淬灭基团;
连接体探针: 5’-AGCAACC/iBHQ2dT/GTGCCGAAGGGCAT/iTAMdT/AGCTGCT-3’ ,TAMRA为荧光基团,BHQ2为其对应的淬灭基团;
下游探针:5’-GACATAGTCGAGGAGGCT-3’,如SEQ ID NO.9所示;
所述双位点为EGFR基因T790M和C797突变。
2.权利要求1所述引物、探针组合物在制备一种用于双位点顺式、反式突变检测的试剂盒中的应用,所述双位点EGFR基因T790M和C797突变。
3.权利要求1所述引物、探针组合物在制备一种用于双位点顺式、反式突变检测的传感器中的应用,所述双位点为EGFR基因T790M和C797突变。
4.一种用于双位点顺式突变检测的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的引物、探针组合物,所述双位点为EGFR基因T790M和C797突变。
5.一种用于双位点顺式突变检测的传感器,其特征在于,包含权利要求1所述的引物、探针组合物,所述双位点为EGFR基因T790M和C797突变。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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