JP2006075046A - 改良された核酸増幅方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】増幅効率を向上させたRNA増幅方法を提供する。
【解決手段】標的RNAを鋳型とし、標的RNAと相同的な第一のプライマーおよび標的RNAに相補的な第二のプライマーにより、プロモーター配列を有し、かつ前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるRNAを転写可能な2本鎖DNAを生成する工程、該2本鎖DNAを鋳型とし前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるRNA転写産物を生成する工程、該RNA転写産物が更に前記2本鎖DNA合成のための鋳型として前記工程を連鎖的に繰り返される条件で実施することからなるRNA増幅工程において、1本鎖DNA結合タンパク質を共存させる。
【選択図】 図2
【解決手段】標的RNAを鋳型とし、標的RNAと相同的な第一のプライマーおよび標的RNAに相補的な第二のプライマーにより、プロモーター配列を有し、かつ前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるRNAを転写可能な2本鎖DNAを生成する工程、該2本鎖DNAを鋳型とし前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるRNA転写産物を生成する工程、該RNA転写産物が更に前記2本鎖DNA合成のための鋳型として前記工程を連鎖的に繰り返される条件で実施することからなるRNA増幅工程において、1本鎖DNA結合タンパク質を共存させる。
【選択図】 図2
Description
本発明は、分子生物学の分野に属する。本発明は、DNAやRNA等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定核酸配列を含む標的RNAの増幅を行う際に有用な、新規組成物を用いる核酸増幅方法に関するものである。本発明は遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量を行う際に有用である。
一般的に、遺伝子診断や微生物の定量等では、試料中の核酸(ウィルスや微生物)が極微量であることが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために、信号強度を向上し高感度化する目的で、標的核酸を増幅する方法がとられる。
特定のDNA配列を増幅する方法として、ポリメレースチェーンリアクション(PCR)法が知られている。この方法では、特定のDNAの有無は判定できるが、該DNAの存在が生菌の存在と必ずしも一致しないため、生菌の有無を判断することは困難である。一方、感染症の遺伝子診断では、特定塩基配列を含むRNA(標的RNA)を増幅することで、体内で特定塩基配列を有する微生物が生存しているかどうかを判断可能である。以上の理由から、生菌の指標として有用な標的RNAを増幅する方法の重要性が高まってきている。
標的RNAの増幅法としては、RT−PCR法、NASBA法(特許文献1及び2、非特許文献1及び2参照)、3SR法(特許文献3、非特許文献3参照)等が知られている。
RT−PCRにおいては、1本鎖DNA結合タンパク質を用いることで生体成分由来試料中の核酸増幅阻害物質の影響を低減させ、核酸増幅効率を向上させるという報告(特許文献4及び5、非特許文献4及び5参照)はあるが、該報告の方法はあくまで段階的に核酸を増幅させるPCRもしくはRT−PCRの場合のみ実現される。また、RT−PCRは基本的に逆転写(RT)とPCRの2段階の工程が必要であり、操作の煩雑性や2次汚染の危険性が課題となる。
一方、1段階のRNA増幅方法であるNASBA、3SR等は、標的RNAに対してプロモーター配列を含むプライマーと逆転写酵素及びリボヌクレエースHを用いて、プロモーター配列を含む1本鎖DNAを生成し、1本鎖DNAに相補的な配列を有するプライマーと逆転写酵素により、標的RNAに相補的な配列を有するRNAを転写可能な2本鎖DNAを生成し、RNAポリメレースにより、特定塩基配列を含むRNAを生成する。以後は、生成されたRNAを、前記プロモーター配列を含む2本鎖DNA合成の鋳型とする連鎖反応を生じさせるものである。
これら1段階のRNA増幅方法においては、操作の煩雑性および2次汚染の危険性という課題を解決し、一定温度、1段階での反応が可能であるため、自動化へ適用が容易である。
RNAの増幅法において、試料中に存在する極微量の標的RNAをより高感度かつ再現性良く検出するため、簡便に増幅効率を向上できる方法が望まれている。NASBA、3SR等のRNAの増幅法は、35℃から65℃という比較的低温かつ一定温度、1段階での反応を実施するため、前記したように非常に好ましいRNA増幅方法である。しかし、増幅効率を低下させる一つの原因と考えられるプライマーダイマー等に由来する非特異産物が生成しやすいという課題が存在するため、これを解決できればさらに増幅効率を向上できるものと思われる。また、至適条件の異なる複数の酵素を使用することから、最適な増幅系構築のためには、プライマー配列の微調整や反応温度、塩濃度等反応条件の微調整および厳密な制御が必要となることが課題である。
そこで本発明は、試料中の標的RNAの高効率な核酸増幅方法を提供するものである。
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、標的RNAを鋳型として、プロモーター配列を有し特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるRNAを転写可能な2本鎖DNAを生成し、RNAポリメレースによって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなるRNA転写産物を生成し、更に、該RNA転写産物を鋳型として前記2本鎖DNAを生成する工程からなるRNA増幅工程を、1本鎖DNA結合タンパク質の共存下で実施することによって、RNA増幅の促進に効果があることを見出した。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、特定塩基配列を含む試料中の標的RNAを増幅する方法である。標的RNAを鋳型とし、標的RNAに相同的な第一のプライマーおよび標的RNAに相補的な第二のプライマー(ここで第一又は第二のプライマーのいずれか一方はその5’末端側にRNAポリメレースのプロモーター配列が付加されたプライマーである)の存在下で逆転写反応を実施すると、第二のプライマーが標的RNAの特定塩基配列に結合し、RNA依存DNAポリメレース活性を持つ酵素によりcDNA合成が行われる。得られたRNA−DNAハイブリッドはリボヌクレエースH活性を有する酵素によってRNA部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記cDNAに結合する。
引き続いて、DNA依存DNAポリメレース活性を持つ酵素によりプロモーター配列を有し、かつ前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるRNAを転写可能な2本鎖DNAが生成される。該2本鎖DNAを鋳型としRNAポリメレース活性を持つ酵素によって前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるRNA転写産物が生成される。該RNA転写産物は更に前記2本鎖DNA合成のための鋳型となり、RNA転写産物を生成する工程が連鎖的に繰り返される。本発明は、これら一連のRNA増幅工程を、1本鎖DNA結合タンパク質の共存下で実施することを特徴とする改良された核酸増幅方法を提供する。
さらに、本発明は前記核酸増幅方法により増幅されたRNA転写産物を、RNA転写産物と相補的2本鎖を形成可能な核酸プローブとインターカレーター性蛍光色素、もしくは、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブで、かつ標的核酸と形成した相補的2本鎖部分に前記インターカレーター性蛍光色素部分がインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの、蛍光特性の変化を測定することで検出する核酸検出法も提供する。
1本鎖DNA結合タンパク質は、PCRにおいて生体成分由来試料中の核酸増幅阻害物質の影響を低減させ、核酸増幅効率を向上させるという報告(特許文献4及び5、非特許文献4及び5参照)はあるが、該報告の方法はあくまで段階的に核酸を増幅させるPCRもしくはRT−PCRの場合のみ実現される。本発明中の1本鎖DNA結合タンパク質が一定温度、1段階での連鎖的なRNA増幅効率を向上させる詳細な機構は不明であるが、相補的結合による2本鎖構造を不安定化させる機能を有するため、プライマーダイマー等に由来する非特異産物を低減させ、結果として増幅効率を向上させる可能性が挙げられる。さらには標的RNAの高次構造形成を低減しプライマーのプライミング効率を向上させることも期待される。この目的としては1本鎖DNA結合タンパク質ならば特に限定されず、大腸菌1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)、T4ファージ遺伝子32タンパク質等既知の1本鎖DNA結合タンパク質が使用可能である。1本鎖DNA結合タンパク質の添加量は反応条件によって適切に設定する必要はあるものの特に限定されるわけではない。また、1本鎖DNA結合タンパク質はRNAの増幅反応に共存していればよく、単独で添加することや、標的RNAを含む試料や増幅試薬等にあらかじめ添加することが可能であり、特に限定されるわけではない。
本発明中の特定塩基配列とは標的RNAの少なくとも一部の配列あるいは該配列の相補配列からなり、第一のプライマーおよび第二のプライマーによって規定される領域の配列を有する。したがって、特定塩基配列が標的RNAに対して相補的である場合は、第一のプライマーとRNA依存DNAポリメレース活性を持つ酵素によりcDNA合成が行われ、得られたRNA−DNAハイブリッドはリボヌクレエースH活性を有する酵素によってRNA部分が分解され、解離することによって第二のプライマーが前記cDNAに結合し、2本鎖DNAが合成される。
本発明のRNA増幅工程において、1本鎖RNAを鋳型とするRNA依存DNAポリメラーゼ活性を有する酵素(逆転写酵素)、リボヌクレエースH活性を有する酵素、1本鎖DNAを鋳型とするDNA依存DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、およびRNAポリメラーゼ活性を有する酵素が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。
本発明の一態様は、標的RNAを含む試料と、いずれかにプロモーター配列を有する第一のプライマーおよび第二のプライマー、RNA依存DNAポリメラーゼ活性、リボヌクレエースH活性、DNA依存DNAポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素、RNAポリメレース、さらにT4ファージ遺伝子32タンパク質を含む増幅反応試薬とを混合し、35℃〜65℃の範囲で設定された一定温度で反応させることからなる。前記増幅反応試薬は、逆転写酵素およびRNAポリメレースを機能させるための既知の成分、すなわち少なくとも、基質であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、マグネシウム塩、必要に応じてリボヌクレエースH、カリウム塩、ジメチルスルホキシド(DMSO)等の有機溶剤を含むことはいうまでもない。
本発明中のプロモーター配列とはRNAポリメレースの認識・結合部位配列で、特定のRNAポリメレースによって転写開始できる配列ならば特に限定されない。通常、汎用されるのは、T7 RNAポリメレース、T3 RNAポリメレース、SP6 RNAポリメレースで、それぞれに特異的なプライマー配列が既知であり、該配列を本発明で使用することが可能である。本発明中の逆転写酵素は既知の逆転写酵素、すなわちAMV逆転写酵素、RAV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素等が使用可能である。
T4ファージ遺伝子32タンパク質の添加量は特に限定されないが、終濃度が10〜200μg/mlの範囲となるように添加することが好ましく、さらに好適には30〜60μg/mlの範囲となるように添加することが好ましい。なお、T4ファージ遺伝子32タンパク質は標的RNAを含む試料に添加しておくことも可能である。
本発明は、さらに別の一態様として、前記RNA増幅工程を、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブで、かつ標的核酸と形成した相補的2本鎖部分に前記インターカレーター性蛍光色素部分がインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下で実施し、経時的に蛍光特性の変化を測定することによって試料中の標的RNA量を測定する方法を提供する。この態様の場合、測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的に標的RNAを増幅し検出することができる。この容器は、試料を分注した後に密閉することが可能であればコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。また、この態様のRNA増幅・測定方法は、1段階、一定温度で実施可能であるため、RT−PCRに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。
本発明によってはじめて、増幅された試料中の特定塩基配列を含む標的RNAが再び増幅反応の鋳型となり、連鎖的に生じるRNA増幅法の増幅効率を、1本鎖DNA結合タンパク質を共存させることで向上させ、一定温度、1段階の反応による標的RNAの高感度検出が可能になった。また、本発明の一態様として、標的RNAの増幅反応において相補的2本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計されたインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブ存在下で実施することで、経時的な蛍光特性の変化を測定する核酸検出方法の検出効率を増加する方法を提供した。
さらに、本発明においては1本鎖DNA結合タンパク質をRNA増幅反応系内に共存させることのみで増幅効率を向上できるため、従来必要であったプライマー設計ソフトおよび手作業による煩雑なプライマー設計、配列微調整、評価や、高額な装置による厳密な反応条件制御なしにRNA増幅効率を向上させることが可能となった。
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される物ではない。
実施例1 T4ファージ遺伝子32タンパク質の添加によるRNA増幅の効率向上
(1)使用した標準RNAは、mecA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細胞壁合成酵素PBP2’遺伝子配列(非特許文献6参照)を含む2183塩基のRNA)。この標準RNAをRNA希釈液(10mM Tris−HCl (pH8.0)、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.5U/μl RNase Inhibitor)で1000コピー/5μlになるように調製しRNA試料とした。
(2)以下の組成のmecA増幅用反応液20μlを0.5ml容PCRチューブ(GeneAmp Thin−Walled Reaction Tubes、パーキンエルマー製)に分注し、上記RNA試料5μlを添加した。これを基本試薬組成とする。
実施例1 T4ファージ遺伝子32タンパク質の添加によるRNA増幅の効率向上
(1)使用した標準RNAは、mecA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細胞壁合成酵素PBP2’遺伝子配列(非特許文献6参照)を含む2183塩基のRNA)。この標準RNAをRNA希釈液(10mM Tris−HCl (pH8.0)、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.5U/μl RNase Inhibitor)で1000コピー/5μlになるように調製しRNA試料とした。
(2)以下の組成のmecA増幅用反応液20μlを0.5ml容PCRチューブ(GeneAmp Thin−Walled Reaction Tubes、パーキンエルマー製)に分注し、上記RNA試料5μlを添加した。これを基本試薬組成とする。
反応液の組成(各濃度は最終反応液量30μlにおける濃度)
(特許文献6、非特許文献7参照)
60mM Tris−塩酸緩衝液(pH8.6)
18.7mM 塩化マグネシウム
120mM 塩化カリウム
6U RNase Inhibitor
1mM DTT
各0.25mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP
3.6mM ITP
各3.0mMのATP、CTP、GTP、UTP
1.0μMの第一のオリゴヌクレオチド(T7RNAポリメレース・プロモーター配列含有第一のプライマー:配列番号1に記載)
1.0μMの第二のオリゴヌクレオチド(第二のプライマー:配列番号2に記載)
0.16μMの第三のオリゴヌクレオチド(3’末端をアミノ基修飾:配列番号3に記載)
13% DMSO
容量調整用蒸留水
(3)基本組成試薬にT4ファージ遺伝子32タンパク質4mg/ml(ニッポンジーン)を1μg(最終反応液量30μlにおける重量)添加したmecA増幅用反応液20μlを0.5ml容PCRチューブに分注し、上記RNA試料5μlを添加した。
(4)上記の反応液を43℃で5分間保温後、以下の組成の酵素液5μlを添加した。
(特許文献6、非特許文献7参照)
60mM Tris−塩酸緩衝液(pH8.6)
18.7mM 塩化マグネシウム
120mM 塩化カリウム
6U RNase Inhibitor
1mM DTT
各0.25mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP
3.6mM ITP
各3.0mMのATP、CTP、GTP、UTP
1.0μMの第一のオリゴヌクレオチド(T7RNAポリメレース・プロモーター配列含有第一のプライマー:配列番号1に記載)
1.0μMの第二のオリゴヌクレオチド(第二のプライマー:配列番号2に記載)
0.16μMの第三のオリゴヌクレオチド(3’末端をアミノ基修飾:配列番号3に記載)
13% DMSO
容量調整用蒸留水
(3)基本組成試薬にT4ファージ遺伝子32タンパク質4mg/ml(ニッポンジーン)を1μg(最終反応液量30μlにおける重量)添加したmecA増幅用反応液20μlを0.5ml容PCRチューブに分注し、上記RNA試料5μlを添加した。
(4)上記の反応液を43℃で5分間保温後、以下の組成の酵素液5μlを添加した。
酵素液の組成(各濃度は最終反応液量30μlにおける濃度)
1.7% ソルビトール
3.6μg 牛血清アルブミン
170.4U T7RNAポリメレース(ギブコ製)
8U AMV逆転写酵素(宝酒造製)
1U/ml RNaseH
容量調整用蒸留水
(5)引き続き上記PCRチューブを43℃で30分間保温し、RNA増幅反応を行った。
(6)上記溶液の、それぞれ2μlをアガロースゲルで電気泳動を行った後、SYBR GreenIIで染色し、デンシトメーターで増幅産物RNAのバンド濃度を定量した。
1.7% ソルビトール
3.6μg 牛血清アルブミン
170.4U T7RNAポリメレース(ギブコ製)
8U AMV逆転写酵素(宝酒造製)
1U/ml RNaseH
容量調整用蒸留水
(5)引き続き上記PCRチューブを43℃で30分間保温し、RNA増幅反応を行った。
(6)上記溶液の、それぞれ2μlをアガロースゲルで電気泳動を行った後、SYBR GreenIIで染色し、デンシトメーターで増幅産物RNAのバンド濃度を定量した。
アガロースゲル電気泳動で増幅産物量を数値化した結果、基本試薬組成における産物RNA量に対して、T4ファージ遺伝子32タンパク質を添加した試薬では、産物RNA量が2倍量以上得られた。(図1、2)
Claims (5)
- 特定塩基配列を含む試料中の標的RNAを増幅する方法であって、標的RNAを鋳型とし、標的RNAに相同的な第一のプライマーおよび標的RNAに相補的な第二のプライマー(ここで第一又は第二のプライマーのいずれか一方はその5’末端側にRNAポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである)により、プロモーター配列を有し、かつ特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるRNAを転写可能な2本鎖DNAを生成する工程、2本鎖DNAを鋳型とし特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるRNA転写産物を生成する工程、RNA転写産物が更にDNA合成のための鋳型となり、RNA転写産物を生成する工程が連鎖的に繰り返される条件で実施することからなるRNA増幅工程を、1本鎖DNA結合タンパク質の共存下で実施することを特徴とする改良された核酸増幅方法。
- 1本鎖DNA結合タンパク質がファージT4遺伝子32タンパク質であることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 請求項1又は請求項2に記載の核酸増幅方法により増幅されたRNA転写産物を、相補的2本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計されたインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブの蛍光特性の変化を測定することで検出する核酸検出方法。
- 標的RNAを鋳型とする第一のプライマーおよび第二のプライマー、1本鎖DNA結合タンパク質を含むことを特徴とする、前記標的RNAの増幅試薬。
- 請求項4の標的RNAの増幅試薬において、相補的2本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計されたインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを含むことを特徴とする標的RNAの検出試薬。
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JP2004260992A JP2006075046A (ja) | 2004-09-08 | 2004-09-08 | 改良された核酸増幅方法 |
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
JP2001037500A (ja) * | 1999-05-24 | 2001-02-13 | Tosoh Corp | 核酸定量分析方法 |
JP2001046099A (ja) * | 1999-06-04 | 2001-02-20 | Tosoh Corp | 増強された核酸増幅法 |
JP2001069992A (ja) * | 1999-09-06 | 2001-03-21 | Tosoh Corp | 簡便で増強された核酸増幅法 |
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