DE60222390T2 - Verbessertes in-vitro-synthesesystem - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die in vitro Herstellung von Protein von Input-mRNA oder von Input-DNA, die wirksam transkribiert und/oder translatiert wird, um Protein in verbesserten Mengen herzustellen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich des Weiteren auf die in vitro Produktion von Nukleinsäuremolekülen.
  • Stand der Technik
  • Zu den Vorteilen von in vitro Protein Synthese zählt im Speziellen die Produktion des gewünschten Proteins ohne unnötige Produktion von unerwünschten Proteinen, die erforderlich sind, damit zur Proteinherstellung in in vivo oder in zellulären Systemen verwendete Zellen für die Proteinsynthese erhalten bleiben. Wenn eine Zelle als eine Proteinfabrik verwendet wird, so stellt diese Zelle zusätzlich zur Herstellung des gewünschten Proteins ebenfalls die anderen für den Erhalt der Zelle erforderlichen Moleküle, einschließlich unerwünschter Proteine, her. Zellfreie Systeme sind auf Grund der Tatsache, dass Standard-Protokolle für ihre Herstellung verfügbar sind und auf Grund der Tatsache, dass sie von einer Vielzahl an Quellen kommerziell erhältlich sind, sehr beliebt.
  • Die in vitro Proteinsynthese ist vorteilhaft bei der Produktion von zytotoxischen, instabilen oder unlöslichen Proteinen, da sie im Wesentlichen frei von zellulärer Regulation der Genexpression ist. Die Überproduktion von Protein über eine zuvor bestimmte Konzentration hinaus ist in vivo möglicherweise schwer zu erzielen, da die Expression durch die Konzentration des Produkts reguliert wird. Die Konzentration von in der Zelle akkumuliertem Protein beeinflusst im Allgemeinen die Lebensfähigkeit der Zelle, so dass die Überproduktion des gewünschten Proteins nur schwer erreicht werden kann. In einem Isolierungs- und Reinigungsverfahren sind viele Arten von Protein unlöslich oder instabil und werden entweder durch intrazelluläre Protease abgebaut oder sammeln sich in Einschlusskörperchen an, so dass die Verlustrate hoch ist. Dank der in vitro Synthese können viele dieser Probleme vermieden werden. Darüber hinaus kann diese Technologie dank gleichzeitiger und schneller Expression von zahlreichen Proteinen in einer multiplexen Konfiguration ein wertvolles Hilfsmittel für die Entwicklung von kombinatorischen Anordnungen für die Forschung und für das Screenen von Proteinen darstellen. Zusätzlich können zahlreiche Arten von nicht natürlichen Aminosäuren effizient für spezifische Zwecke in Proteine inkorporiert werden (Noren et al, Science 244: 182–188 (1989)). Trotz aller vielversprechenden Aspekte hat das in vitro System jedoch noch keine breite Anerkennung als tatsächliche Alternative gefunden, was teilweise durch die kurze Reaktionszeit bedingt ist, die zu schwacher Ausbeute bei der Proteinsynthese führt.
  • Die Proteinsynthese wird von einem RNA-Polynukleotid-Template gesteuert, das für das gewünschte Protein kodiert. Die Proteinsynthese kann anfänglich von einem DNA-Template gesteuert werden, das transkribiert wird, um das für das gewünschte Protein kodierende RNA-Polynukleotid zu produzieren. Das DNA-Template schließt deshalb mindestens die zu transkribierende DNA sowie eine Bindungsstelle für RNA-Polymerase, die die Transkription des mRNA-Templates, das zur Produktion von Protein translatiert wird, katalysiert, ein. Wenn die Transkription und Translation in einem System gekoppelt sind, wird das System ein System zur in vitro Transkription/Translation (IVTT) genannt.
  • IVTT oder Proteinsynthese, die zellfreie Extrakte verwenden, werden zunehmend zu einem wichtigen Mittel bei der Analyse von Proteinen. Die Verfügbarkeit der vollständigen Genomsequenz führt dazu, dass eine Fülle an Informationen über die molekulare Struktur und Organisation einer Myriade an Genen und offenen Leserahmen, deren Funktionen nicht bekannt sind und nur unzureichend verstanden werden, zur Verfügung stehen. Somit wird erwartet, dass der Nutzen von IVTT und im Allgemeinen von in vitro Proteinsynthese in Zukunft mit Bezug auf schnelle und effiziente Proteinsynthese und funktionelle Analyse noch weiter an Bedeutung zunehmen wird.
  • Dank der Techniken der modernen Molekularbiologie wurde die Manipulation von DNA ebenso wie der anderen zellulären Bestandteile, die von den in der DNA eines Organismus enthaltenen Genen exprimiert werden, möglich. In lebenden Zellen wird DNA transkribiert um mRNA herzustellen, die dann als ein Template für die Translation verwendet wird, wodurch wiederum ein Protein, dessen Sequenz durch die DNA bestimmt wird, hergestellt wird. Bei der Entwicklung der modernen Hilfsmittel der Molekularbiologie orientierte sich die Forschung in Richtung von Möglichkeiten zur Durchführung zahlreicher Schritte der Transkriptions- und/oder Translationsprozesse in vitro unter kontrollierten Bedingungen und mit definierten Eingaben. Diese Verfahren imitieren im Wesentlichen ähnliche Prozesse, die in einer sehr viel stärker heterogenen Mischung in lebenden Zellen stattfinden.
  • Selbst vor dem Aufkommen der modernen rekombinanten Technologie wurden Zellextrakte entwickelt, welche die in vitro Proteinsynthese von gereinigten mRNA-Transkripten ermöglichten. Heutzutage sind mehrere Systeme zur Untersuchung von Proteinsynthese und RNA-Struktur und -Funktion verfügbar. Um ein Protein, das untersucht wird, zu synthetisieren, muss ein Translationsextrakt mit einer mRNA, die dem untersuchten Gen und Protein entspricht, "programmiert" werden. Die mRNA kann aus DNA hergestellt werden oder alternativ kann die mRNA exogen in gereinigter Form hinzugefügt werden. Früher wurden solche mRNA-Templates aus natürlichen Quellen gereinigt, oder, bei Einsatz von in neuerer Zeit entwickelten Technologien, synthetisch aus klonierter DNA unter Verwendung von RNA-Polymerasen aus Bakteriophage in einer in vitro Reaktion hergestellt.
  • In letzter Zeit wurden Techniken entwickelt, die gekoppelte oder komplementäre Transkriptions- und Translationssysteme (IVTT) verwenden, bei denen die Synthese von sowohl RNA als auch Protein in derselben Reaktion stattfindet. Die Zellextrakte, die für die modernen Techniken verwendet werden, müssen alle für sowohl die Transkription (zur Herstellung von mRNA) als auch für die Translation (zur Proteinsynthese) notwendigen Komponenten in einem einzigen System vereinen. In einem solchen System handelt es sich bei dem Input-Template um DNA, die normalerweise sehr viel einfacher erhalten werden kann als RNA und auch einfacher manipulierbar ist.
  • Ein frühes gekoppeltes System basierte auf einem bakteriellen Extrakt (Lederman und Zubay, Biochim. Biophys. Acta, 149: 253 (1967). Da Prokaryoten normalerweise eine gekoppelte Reaktion innerhalb ihres Zytoplasmas ausführen, ist dieses System auf bakterieller Basis exakt in dem in vivo Prozess reflektiert. Dieses allgemeine System hat breite Verwendung bei der Untersuchung von prokaryotischen Genen gefunden. Dieses allgemeine bakterielle System ist auf Grund seiner Ineffizienz und seines relativ hohen Nuklease-Gehalt im Allgemeinen jedoch nicht auf eukaryotische Gene anwendbar.
  • Bei Nukleasen handelt es sich um Phosphodiesterasen mit zahlreichen Substratanforderungen. Nukleasen sind durch ihre Spezifität als Exo- oder Endonukleasen, die Phosphodiesterbindungen wie Polynukleotide von DNA oder RNA bildende Bindungen spalten, klassifiziert. DNasen spalten Phosphodiesterbindungen in DNA-Molekülen. RNasen spalten Phosphodiesterbindungen in RNA-Molekülen.
  • Für Exonukleasen ist ein freies Ende für den Start der Spaltung des Polynukleotidstrangs erforderlich, während Endonukleasen vom Inneren eines Polynukleotidmoleküls spalten, selbst wenn keine freien Enden verfügbar sind, zum Beispiel in einem kovalent geschlossenen Polynukleotidkreis. Manche Nukleasen haben sowohl Endo- als auch Exo-Aktivitäten. Manche sind für einzelsträngige DNA (ss-DNA) andere für doppelsträngige DNA (ds-DNA) spezifisch. Mehrere Nukleasen können beide Typen von DNA spalten.
  • Manche Exonukleasen arbeiten in einer Richtung von 3' zu 5', während andere in einer Richtung von 5' zu 3' wirken. Manche sind nicht richtungsspezifisch und arbeiten in beide Richtungen. Manche Endonukleasen sind Nukleotidsequenzen oder stellenspezifisch in ihren Erkennungsstellen für Spaltung. Darüber hinaus gibt es Nukleasen, die andere Funktionen (d.h. Funktionen, die nichts mit Spaltung zu tun haben) auf demselben Protein oder Komplex wie das Protein mit Nuklease-Aktivität aufweisen. Manchmal können verschiedene Funktionen spezifischen funktionalen Domänen zugeschrieben werden. In dieser Anwendung bezieht sich der Begriff „Nuklease" auf Nukleasen im Allgemeinen, außer wenn der spezifische Zusammenhang eine spezifische Nuklease oder eine Nuklease mit einer spezifischen Aktivität, wie zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Endo-Aktivität oder DNase-Aktivität beschreibt.
  • Neben den Extrakten aus prokaryotischen Systemen wurden auch Extrakte aus eukaryotischen Systemen entwickelt. Diese eukaryotischen Systeme verwenden exogen hinzugefügte E. coli RNA-Polymerase oder Weizenkeim RNA-Polymerase für die Transkription von exogener DNA. Diese Systeme haben auf Grund ihrer niedrigen Effizienz und der Tatsache, dass sie vor dem verbreiteten Erfolg von cDNA-Klonierungstechniken entwickelt und verwendet wurden nur begrenzten Erfolg, was die allgemeine Untersuchung von eukaryotischen Genen angeht. Andere gekoppelte Systeme wurden für die Untersuchung von viraler Proteinsynthese entwickelt, sind jedoch nicht im Allgemeinen für nicht-virale Templates verwendbar.
  • Mitte der 1980er Jahre ermöglichte die Entwicklung von effizienteren in vitro Transkriptionssystemen, insbesondere solchen, die Phagen-Polymerasen wie T7, SP6 und T3 verwenden, die Ausbildung von Systemen zur Proteinsynthese, die klonierte mRNA-Sequenzen in vitro unter Verwendung von Translationsextrakten aus Weizenkeim und Kaninchen Reticulocyten effektiver translatierten. So zeigten zum Beispiel Perara and Lingappa (J. Cell Biol., 101: 2292–2301 (1985)), dass SP6 RNA-Polymerase Transkriptionsreaktionen für die Produktion von Protein direkt zu Reticulocyten-Lysat hinzugefügt werden konnten.
  • Diese Erkenntnis machte die Erfordernis, die mRNA vor der Translation zu reinigen, deutlich. Später zeigten andere Gelehrte, dass die Transkription und Translation in Reticulocyten-Lysat durch Einschließen einer Phagen-Polymerase und geeigneter transkriptionaler Co-Faktoren in die Reaktion gekoppelt werden konnte (Spirin et al, Science, 242: 1162–1164 (1988); Craig et al, Nucleic Acids Res., 20: 4987–4995 (1992)). In letzteres Zeit beschrieb das US Patent Nr. 5,324,637 von Thompson et al. ein gekoppeltes Transkriptions- und Translationssystem in Eukaryoten. Thompson verwendete Reticulocyten-Lysat und eine Phagen-Polymerase, wobei die Kopplung der beiden Reaktionen durch spezifische Bedingungen (vor allem durch die Konzentration von Magnesiumionen), die es ermöglichten, dass sowohl Transkription als auch Translation in der selben Reaktionsmischung abliefen, erleichtert wurde.
  • Obwohl der kombinierte Ansatz für Transkriptions- und Translationssysteme für viele Proteine von Nutzem ist, variiert die Effizienz der Translation je nach Typ des verwendeten DNA-Templates (z.B. supercoiled Plasmid-DNA oder lineare DNA) stark. Zusätzlich ist es unter den meisten gekoppelten Bedingungen schwierig, die Menge von in einer gekoppelten Reaktion synthetisierter mRNA zu kontrollieren, wie in Thompson offenbart. Da die Effizienz und Verlässlichkeit der Translation von der Menge der hinzugefügten und während der Reaktion anwesenden mRNA abhängig sind, besteht eine mögliche Erklärung für die unerwünschte Variabilität der erzielten Ergebnisse unter Verwendung dieser gekoppelten Systeme, bei denen die Reaktionen gleichzeitig stattfinden, darin, dass die Transkription und Translation zwischen verschiedenen Templates unter herkömmlichen Reaktionsbedingungen nicht einheitlich sind.
  • Daraufhin wurde eine Anzahl an Verbesserungen vorgenommen (siehe z.B. Kim et al, Eur. J. Biochem., 239: 881–886, (1996); Patnaik and Swartz, Biotechniques, 24: 862–868, (1998); und Kim and Swartz, Biotech. and Bioeng., 66: 180–188, (1999)), um das IVTT-System zu verbessern. Eines der Hauptprobleme der herkömmlichen IVTT-Systeme besteht jedoch darin, dass diese Systeme nicht ausreichende Mengen an Protein zur ausführlichen Analyse des Proteins/der Proteine von Interesse herstellen.
  • Die herkömmliche, ineffiziente Proteinsynthese kann teilweise Faktoren wie Aufrechterhaltung einer Energieversorgung, Stabilität des DNA-Templates für Transkription und Stabilität der mRNA für Translation zugeschrieben werden.
  • Das Problem mit der Stabilität von DNA-Templates ist besonders offensichtlich wenn lineare Substrate wie von PCR stammende Produkte oder durch Restriktionsenzym(e) verdaute Fragmente in zellfreien Extrakten zur Erzeugung von Protein(en) verwendet werden. Die linearen DNA-Fragmente sind empfänglich für den schnellen Abbau durch intrazelluläre Exonukleasen von E. coli, insbesondere RecBCD (Pratt et al, Nucleic Acids Res., 9: 4459–4474, (1981); Benzinger et al, J. Virol., 15: 861–871, (1975); Lorenz and Wackernagel, Microbiol Rev., 58, 563–602, (1994)) und möglicherweise auch durch andere Nukleasen.
  • In den meisten Fällen wird in IVTT-Systemen eine supercoiled Plasmid-DNA, die das Gen von Interesse enthält, verwendet, da Plasmid-DNAs stabiler sind (Kudlicki et al, Anal. Biochem., 206: 389–393, (1992)). Lineare DNAs werden von DNA-Nukleasen lesbarer abgebaut, insbesondere von DNA-Exonukleasen wie RecBCD. Mutante RecBCD-Stämme, die keine Exonuklease aufweisen, wurden hergestellt. Diese mutanten Stämme bauen lineare DNA nicht so schnell ab, allerdings wachsen solche mutanten Stämme auch extrem schlecht und deshalb können keine zufriedenstellenden Ergebnisse mit ihnen erzielt werden (Yu et al, PNAS, 97: 5978–5983, (2000)).
  • E. coli-Extrakt für zellfreie Proteinsynthese wurde unter Verwendung einer RecD Mutante von E. coli hergestellt (Lesley et al, J. Biol. Chem., 266: 2632–2639, (1991)). Der unter Verwendung des RecD mutanten E. coli hergestellte zellfreie Extrakt enthielt jedoch ein hohes Niveau an Kontamination durch chromosomale DNA, da gescherte chromosomale DNA nicht durch die zur Mutation gebrachte Nuklease abgebaut wird Mit dem Ziel dem entgegenzuwirken, wurde Mikrococcus-Nuklease hinzugefügt, um die kontaminierende chromosomale DNA abzubauen und den Background zu minimieren. Auf dieselbe Weise wurden auch RNase E Deletionsmutanten hergestellt, aber das Zellwachstum dieser vollständigen Deletionsmutanten ist ebenfalls schlecht und nicht dafür geeignet, einen zellfreien Extrakt zur Verfügung zu stellen.
  • Hinzu kommt, dass der aus solchen Mutanten gewonnene zellfreie Extrakt die Proteinerzeugung nicht förderte und aus unbekannten Gründen ist die Proteinsynthese unabhängig von der Zugabe von T7-RNA-Polymerase, obwohl das PCR-Produkt T7-Promoter enthielt.
  • E. coli enthält auch Desoxyribonukleasen (DNasen) (Linn and Deutscher, in: Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 455–468, (1993)) mit Spezifität für doppelsträngige DNA. Es kann sein, dass diese Nukleasen auch für den Abbau der Template-DNA verantwortlich sind und dadurch zu einer Reduzierung der Proteinproduktion führen.
  • Wie oben besprochen kann die ungenügende Proteinsynthese in einem gekoppelten IVTT-System entweder von der Instabilität von DNA oder von der Instabilität von mRNA herrühren. In nicht gekoppelten Synthesesystemen kann unzureichende Proteinsynthese vor allem durch Instabilität von mRNA bedingt sein.
  • Es ist bekannt, dass E. coli eine große Anzahl an RNasen enthält (Linn and Deutscher, In: Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 455–468, (1993)).
  • RNase I, ein periplasmatisches Enzym, ist eine der wichtigsten nicht-spezifischen RNasen in E. coli, die auf Oligo-RNA als ein Substrat wirkt (Meador et al, Eur. J. Biochem., 187: 549, (1990); and Meador and Kennel, Gene, 95: 1, (1990)). Mehrere RNasen spielen beim mRNA-Abbau in E. coli eine Rolle, einschließlich Endonukleasen (wie RNase E, RNase K und RNase III) und 3'-Exonukleasen wie RNase II und Polynukleotid-Phosphorylase (Gros et al, Nature, 190: 581–585, (1961); Emory et al, Genes Dev., 6: 135–148, (1992); Belasco, J. G., Control of mRNA stability, Academic Press, 3–12, (1993); Lopez et al, Mol. Microbiol., 33: 188–199, 1999; Mohanty and Kushner, PNAS, 97: 11966–11971, (2000)). Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Voraussetzung, dass Mutieren oder Hemmen dieser Enzyme deshalb die Proteinsynthese in zellfreien Extrakten fördert.
  • RNase-Mutanten sind im Stand der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel Niyogi and Datta, J. Biol. Chem., 250: 7307–12 (1975), worin E. coli ohne RNase I, RNase II und RNase III für die Charakterisierung einer neuen Ribonuklease genutzt wurden. Eine Mutante ohne RNase I wurde als potentielle Materialquelle für IVTT verwendet, allerdings mit nicht zufriedenstellenden Ergebnissen was eine effiziente Proteinproduktion angeht (Kudlicki et al, Anal. Biochem., 206: 389–393 (1992); and Ellman et al, Methods in Enzymology, 202: 301–336 (1991)). Verfahren zum Mutieren und Auswählen andere Mutanten, wie zum Beispiel Nuklease-Mutanten, sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die nicht effiziente Proteinsynthese, die das Ergebnis herkömmlicher Synthesesysteme ist, kann teilweise auch Faktoren zugeschrieben werden, die sich auf den Erhalt der Aminosäure- und Energieversorgung (Nährstoffe) um die Synthesereaktion zu fördern, beziehen.
  • WO 00/55353 offenbart zwei Verfahren zur Regeneration des für die Translation notwendigen ATP. Gemäß diesen Verfahren wird PEP (Phosphoenolpyruvat) oder Pyruvat für die Regenerierung der ATP Energiequelle verwendet. Das erste offenbarte Verfahren war im Stand der Technik vorbeschrieben und beinhaltet Phosphoenolpyruvat (PEP), das in Verbindung mit Pyruvat-Kinase verwendet wird um ATP von ADP zu regenerieren. Im zweiten Verfahren gemäß WO 00/55353 , wird Pyruvat in Verbindung mit Pyruvat-Oxidase verwendet, um erneut ATP zu generieren.
  • Sowohl Energiequellen als auch Aminosäuren wurden in diesem System unabhängig von der Proteinsynthese depletiert ( WO/0055353 ; Kim and Choi, J. Biotech., 84: 27–32, (2000)). Die Proteinsynthese konnte durch nochmaliges Hinzufügen von Aminosäuren und der Energiequelle wieder hergestellt werden.
  • Diese Verfahren mögen zwar für die erneute Bildung von ATP nützlich sein, aber die ineffiziente Verwendung des anfangs zur Verfügung stehenden oder anfänglich erzeugten ATPs kann dennoch zu reduzierter Proteinausbeute führen. So können zum Beispiel Phosphatasen das ATP hydrolysieren, was dazu führt, dass die ATP-Energie nicht für den gewünschten IVTT-Prozess zur Verfügung steht. Die alkaline Phosphatase von E. coli ist eine der bekannten Phosphatasen, die ATP hydrolysieren können (siehe zum Beispiel Enzymology Primer for Recombinant DNA Technology, von Hyone-Myong Eun, Academic Press, Seiten 307–333). Aber auch viele Enzyme, die das Wort „Phosphatase" nicht in ihrem Namen tragen, z.B. „Helikase", sind ebenfall in der Lage, ATP zu hydrolisieren. Deshalb kann das durch das energieerzeugende System mit dem Ziel der Förderung der Proteinsynthese hergestellte ATP potentiell durch aktive Phosphatasen, wie eine alkaline Phosphatase oder eine Helikase verschwendet werden, was zu einer Reduzierung der Proteinsynthese führt.
  • In einem zellfreien Weizenkeim-System wurde gezeigt, dass Phosphatase-Immundepletion die Proteinsynthese durch Reduzierung der ATP- und GTP-Hydrolyse verbesserte. Darüber hinaus wurde angedeutet, dass Phosphoenolypyruvat (PEP), das im Allgemeinen für die Regenerierung von ATP verwendete Substrat auch durch Phosphatase(n), die die Proteinsynthese einschränkt/einschränken, abgebaut wird (Kim and Swartz, Biotech. and Bioeng., 66: 180–188, (1999); Swartz and Kim, USP 6,168,931 (2001) ; Kim and Choi, J. Biotech. 84: 27–32, (2000)).
  • Unter Berücksichtigung des aktuellen Stands der Technik besteht Bedarf, ein verbessertes IVTT-System zu entwickeln, dass die Produktion von Protein/Proteinen verbessert. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf durch das Vorsehen von Zusammensetzungen und Verfahren für das Stabilisieren oder Erhalten von Template-DNA, durch Stabilisieren oder Erhalten von mRNA, einschließlich von dem/den Template/s stammender mRNA, durch Erhalten von Energie, die zur Synthese verwendet wird und/oder durch Bereitstellen von einer ausreichenden Menge an Substraten zur erneuten Erzeugung von Energie, um so die für eine effiziente Proteinsynthese von den Templates notwendige Energie bereit zu stellen.
  • Alle Veröffentlichung und Patentanmeldungen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, sind hiermit zu Gänze durch Bezugnahme inkorporiert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf in vitro Synthese, spezifischer auf in vitro Synthesesysteme für Peptid/Protein oder Nukleinsäure und auf Verfahren und Kits, welche die Effizienz von in vitro Synthese und von darauf bezogenen Zusammensetzungen erhöhen. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung Systeme, Verfahren und Kits, welche die Effizienz von Protein- oder Nukleinsäuresynthese durch Vorsehen einer verbesserten Energiequelle zur Synthese und/oder durch Erhalten des/der Nukleinsäure-Templates zur Synthese von Proteinen oder Nukleinsäuren für eine effizientere und erweiterte Synthesereaktion verbessern. Die vorliegende Erfindung kann in jedem Typ eines Systems, einschließlich gekoppelter Transkription-Translation-Systeme und nicht gekoppelter Translationssysteme zur in vitro Proteinsyntheseverwendet werden. Bevorzugte Synthesesysteme der Erfindungen umfassen mindestens einen Zellextrakt, mindestens eine Energiequelle und mindestens ein Nukleinsäure-Template.
  • Zusammensetzungen und Verfahren werden vorgesehen, die dazu dienen, die Synthese mit Zellextrakten zu fördern. Gemäß einem Aspekt wird die Zelle, die den Extrakt oder die Komponenten für die Synthese bereit stellt, modifiziert oder mutiert, um unerwünschte Komponenten/Proteine/Enzyme in der Synthesereaktion zu hemmen oder zu inaktivieren. So können zum Beispiel Mutationen in RNasen, wie RNase E oder in anderen Enzymen, wie alkaliner Phosphatase und Endonuklease A in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Zusätzlich können Inhibitoren, wie Inhibitoren von Nukleasen, die auf Nukleinsäure-Templates (z.B. Garn Protein von Bakteriophage Lambda zur Hemmung von RecBCD) oder Inhibitoren von anderen ungewünschten oder schädlichen Komponenten/Proteinen/Enzymen in der Synthesereaktion, verwendet werden, um die Produktion des erwünschten Produkts in vitro zu erhöhen.
  • Alternativ oder zusätzlich zu den modifizierten/mutierten Zellextrakten und/oder Inhibitoren können Synthesewege von schädlichen Komponenten/Proteinen/Enzymen unterbunden oder verlangsamt werden, zum Beispiel mittels Wachstumsstrategien, durch die die Ausbildung von normalen Mengen von schädlichen Komponenten/Proteinen/Enzymen nicht induziert wird oder durch die keine Cofaktoren für die enzymatische Aktivität zur Verfügung gestellt werden, oder durch Inhibitoren der Transkription oder Translation der schädlichen Gene oder Proteine. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Modulation oder Hemmung von Inhibitoren beinhaltet den Einsatz von Wachstumsstrategien, die zu reduzierter Enzymaktivität führen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf diese modifizierten/mutierten Zellen und/oder Gene und Medien, die in der Lage sind, diese Zellen wachsen zu lassen.
  • Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung im allgemeineren Sinn auf effizientere Synthese, die zum Beispiel folgendes beinhaltet: mindestens einen Extrakt von einer Zelle, in dem zumindest ein Enzym/eine Komponente/ein Protein das/die an der Hydrolyse von energiereichen Phosphatbindungen oder an der Hydrolyse oder Bildung von Phosphodiesterbindungen beteiligt ist, fehlt, entfernt oder modifiziert wird, um dessen/deren Aktivität zu inaktiveren (zum Beispiel durch modulieren, mutieren oder modifizieren von einem oder mehr als einem an der Expression beteiligten oder für solch ein Protein/eine Komponenten/ein Enzym kodierendes Gen); mindestens einen Inhibitor von mindestens einem Enzym/einer Komponente/einem Protein das/die an der Hydrolyse von energiereichen Phosphatbindungen oder an der Hydrolyse oder Bildung von Phosphodiesterbindungen beteiligt ist; und/oder mindestens zwei Energiequellen zur Bereitstellung der chemischen Energie für den Syntheseprozess. In Übereinstimmung mit der Erfindung kann ein beliebiges oder ein Anzahl dieser Merkmale kombiniert und in verschiedenen in vitro Synthesesystemen verwendet werden. Es ist klar ersichtlich, dass die Erfindung auch verwendet werden kann, um gegebenenfalls verschiedene Intermediate einer Proteinsynthesereaktion herzustellen. Die Erfindung kann zum Beispiel verwendet werden, um RNA (während der Transkription eines DNA-Templates) herzustellen, und diese RNA kann isoliert oder mittels molekularbiologischer Standardverfahren weiter bearbeitet werden.
  • Spezifischer beinhaltet die vorliegende Erfindung Ausführungsformen, die ein in vitro Synthesesystem, das eine oder mehr als eine der folgenden Komponenten (oder Kombinationen derselben) einschließt: i) Entfernung, Modulation, Hemmung oder Inaktivierung von mindestens einer Aktivität, z.B. einer enzymatischen Aktivität, welche die Hydrolyse von energiereichen Phosphatbindungen oder die Hydrolyse oder Bildung von Phosphodiesterbindungen, zum Beispiel ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase katalysiert; ii) Verwendung von mindestens einem Zellextrakt zur Synthese, wobei der Extrakt so modifiziert wird, dass er reduzierte Aktivität aufweist (verglichen mit einem nicht modifizierten Extrakt) oder Inaktivierung von mindestens einem Enzym, das die Hydrolyse von energiereichen Phosphatbindungen oder die Hydrolyse oder Bildung von Phosphodiesterbindungen katalysiert, zum Beispiel ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase; und iii) mindestens zwei Energiequellen, die die zur Synthese benötigte Energie bereit stellen.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Zusammensetzung zur Durchführung der Erfindung und Zusammensetzungen, die während der Durchführung der Erfindung hergestellt werden. Solche Zusammensetzungen können ein beliebiges oder eine Kombination der Elemente der vorliegenden Erfindung umfassen (z.B. Inhibitoren, Zellextrakte, Energiequellen, etc.) und/oder sie können ebenfalls während der Transkriptions- und/oder Tranlationsreaktionen verwendete Substrate (z.B. Nukleotide, Aminosäuren, Polymerasen, Enzyme, Cofaktoren, Puffer und Puffersalze) umfassen. Zusätzlich können solche Zusammensetzungen eine beliebige Anzahl an Produkten der Transkriptions- und/oder Translationsreaktion wie RNA, Peptide, Proteine, etc. umfassen. Vorzugsweise umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung mindestens eine Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mindestens einem Inhibitor von mindestens einem Enzym, z.B. einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase; mindestens einen Extrakt zur Proteinsynthese, wobei der Extrakt so modifiziert wird, dass er verringerte Aktivität von mindestens einer Funktion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus z.B. einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase aufweist; und mindestens zwei Energiequellen, die die für die Synthese benötigte Energie bereit stellen.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenfalls verbesserte Verfahren für die in vitro Synthese. Solche Verfahren sorgen für die in vitro Produktion von zahlreichen Produkten, einschließlich RNA oder anderer Nukleinsäuremoleküle und Peptide oder Proteine. Gemäß einem Aspekt können RNA oder andere Nukleinsäuremoleküle durch Mischen von einem oder mehr als einem Nukleinsäure-Template und mindestens einer Komponente der Erfindung (z.B. Inhibitoren, Energiequellen, Zellextrakte, etc.) und Inkubieren der Mischung unter ausreichenden Bedingungen, um ein oder mehr als ein Nukleinsäuremolekül (z.B. RNA) komplementär zu dem gesamten oder einem Teil des Templates zu produzieren, hergestellt werden. Gemäß einem anderen Aspekt können Peptide oder Proteine durch Mischen von einem oder mehr als einem Nukleinsäure-Template (vorzugsweise RNA) und mindestens einer Komponente der Erfindung (z.B. Inhibitoren, Energiequellen, etc.) und Inkubieren dieser Mischung unter ausreichenden Bedingungen, um ein oder mehr als ein Peptid oder Protein, das/die von dem gesamten oder einem Teil des Templates kodiert wird/werden, zu produzieren. Die Verfahren der Erfindung können des Weiteren zusätzliche Schritte zur weiteren Bearbeitung des hergestellten Produkts umfassen. So können die produzierten Nukleinsäuremoleküle und Proteine zum Beispiel zur Herstellung anderer Produkte verwendet werden. Sie können in funktionalen Assays oder in Aktivitäts-Assays verwendet werden oder weiter gereinigt werden. Es ist zu beachten, dass die Verfahren der Erfindung auch in Anwesenheit von einer oder mehr als einer anderen Komponente, wie einem oder mehr als einem Nukleotid oder Derivaten davon (die so markiert sein können, dass sie detektierbar sind), einer oder mehr als einer Aminosäure oder Derivate davon, einer oder mehr als einer Polymerase, einem oder mehr als einem Cofaktor, einem oder mehr als einem Puffer und/oder Puffersalz, einer oder mehr als einer Energiequelle (ATP, PEP, etc.), einem oder mehr als einem Zellextrakt, einem oder mehr als einem Nukleinsäure-Template und dergleichen ausgeführt werden können. Die Verfahren der Erfindung umfassen vorzugsweise eine oder mehr als eine Komponente der Erfindung (oder Kombinationen derselben), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mindestens einem Inhibitor von mindestens einem Enzym, z.B. einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase; mindestens einen Extrakt zur Synthese, wobei der Extrakt so modifiziert wird, dass er verringerte Aktivität von mindestens einem Enzym, z.B. einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase aufweist; und mindestens zwei Energiequellen, die die für die Synthese benötigte Energie bereit stellen. Das Verfahren beinhaltet vorzugsweise Kontaktieren von einem oder mehr als einem Nukleinsäure-Template mit mindestens einer Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: mindestens einem Extrakt aus einer Zelle, in dem zumindest ein Enzym/eine Komponente/ein Protein fehlt, entfernt oder modifiziert wird, um dessen/deren Aktivität, die die Hydrolyse von energiereichen Phosphatbindungen oder die Hydrolyse oder Bildung von Phosphodiesterbindungen katalysiert, zu reduzieren oder zu inaktiveren; mindestens einen Inhibitor von mindestens einem Enzym/einer Komponente/einem Protein das/die Hydrolyse von energiereichen Phosphatbindungen oder die Hydrolyse oder Bildung von Phosphodiesterbindungen katalysiert; und mindestens zwei Energiequellen zur Bereitstellung der chemischen Energie für die Synthese, um eine Mischung zu bilden; und Inkubieren der Mischung unter Bedingungen, die ausreichen, um mindestens ein von den gesamten oder einem Teil der Templates kodiertes Protein zu produzieren. Gegebenenfalls kann jedes beliebe Detektionsverfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, verwendet werden, um die Herstellung von Produkten (z.B. RNA und Protein) zu überwachen. Die Hemmung eines Enzyms kann anstelle von oder zusätzlich zu dem Hinzufügen eines chemischen Inhibitors durch selektierte Wachstumsbedingungen erreicht werden. Der Inhibitor kann auch in situ synthetisiert werden. Zum Beispiel kann ein oder mehr als ein Gen, das für mindestens einen Inhibitor (z.B. Gam) kodiert, in einer Zelle, die zur Herstellung eines in der Erfindung verwendeten Zellextrakts verwendet wird, exprimiert werden. Dementsprechend kann eine beliebige Anzahl an gewünschten Inhibitoren für die in vitro Reaktionsmischung zur Verfügung gestellt werden, ohne dass ein separates Hinzufügen erforderlich würde. Gemäß einem Aspekt werden solche Inhibitoren rekombinant produziert, z.B. wird mindestens ein Inhibitor-Gen kloniert und exprimiert.
  • Spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren einer in vitro Synthese, die mindestens eine oder mindestens zwei oder mindesten drei Komponenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mindestens einem Inhibitor von mindestens einem Enzym, z.B. einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase; mindestens einer Zelle oder einem Extrakt zur Synthese, wobei die Zelle oder der Extrakt so aus einem nativen oder Wildtyp Extrakt modifiziert wird, dass er verringerte Aktivität von mindestens einem Enzym, z.B. einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase aufweist; und mindestens zwei Energiequellen, die die für die Synthese von Proteinen oder Nukleinsäure benötigte Energie bereit stellen.
  • Kits für die in vitro Synthese sind ebenfalls ein Merkmal der vorliegenden Erfindung. Solche Kits können eine beliebige Anzahl oder Kombination an Reagenzien oder Komponenten für die Durchführung der Erfindung enthalten. Kits gemäß der Erfindung umfassen vorzugsweise ein oder mehr als ein Element ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer oder mehr als einer Komponente der Erfindung (z.B. Inhibitoren, Energiequellen, Zellextrakte, etc.), einem oder mehr als einem Nukleotid oder Derivate davon, einer oder mehr als einer Aminosäure oder Derivate davon, einer oder mehr als einer Polymerase, einem oder mehr als einem Cofaktor, einem oder mehr als einem Puffer und/oder Puffersalz, einer oder mehr als einer Energiequelle, einem oder mehr als einem Zellextrakt, einem oder mehr als einem Nukleinsäure-Template, einem oder mehr als einem Reagens zur Bestimmung der Wirksamkeit des Kits oder Assays für die Herstellung der Produkte wie Nukleinsäure und Proteinprodukte, und Anleitungen und Protokolle für die Durchführen der Verfahren gemäß der Erfindung oder für die Verwendung der Kits der Erfindung und/oder deren Komponenten. Das Kit der Erfindung kann eine oder mehr als eine der oben genannten Komponenten in einer beliebigen Anzahl an separaten Behältern, Röhrchen, Ampullen und dergleichen umfassen oder solche Komponenten können in zahlreichen Kombinationen in solchen Behältern kombiniert sein. Spezifischer können die Kits der Erfindung mindestens eine Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mindestens einem Inhibitor von mindestens einem Enzym, z.B. einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase; mindestens einen Extrakt zur Proteinsynthese, wobei der Extrakt so modifiziert wird, dass er verringerte Aktivität von mindestens einem Enzym, z.B. einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase aufweist; und mindestens zwei Energiequellen, die die für die Synthese benötigte Energie bereit stellen, umfassen.
  • Viele Nukleasen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung entfernt, moduliert, mutiert oder inhibiert werden können, sind bekannt. Gemäß einem Aspekt können die Gene, die für solche Nukleasen kodieren, in den Zellen, aus denen ein Extrakt zur in vitro Synthese hergestellt wird, mutiert oder modifiziert werden. Viele solche Gene sind bekannt oder können durch im Stand der Technik hinreichend bekannte oder hierin beschriebene Techniken einfach identifiziert und modifiziert werden. Des Weiteren kann die Expression solcher Nukleasen durch steuernde Wachstumsbedingungen einer Zelle moduliert werden. Darüber hinaus können Verbindungen/Moleküle/Proteine verwendet werden, um eine oder mehr als eine solche Nuklease zu hemmen, mit dem Ziel zu verhindern, dass solche Nukleasen die Synthese beeinflussen. Solche Inhibitoren sind bekannt oder können zur Verwendung in der Erfindung einfach identifiziert werden. Durch Beginnen mit diesen mutierten oder selektiv kultivierten Zellen oder durch Hinzufügen oder Einfügen von Inhibitoren von Nukleasen in das Synthese-System, können verbesserte Syntheseergebnisse erreicht werden.
  • Inhibitoren können in den Systemen der Erfindung verwendet, oder durch ein beliebiges bekanntes Verfahren eingeschlossen werden. So können Inhibitoren zum Beispiel vor, während oder nach der Einführung des Nukleinsäure-Templates zu dem System hinzugefügt werden. Inhibitoren können auch in einer zur Herstellung des Extrakts verwendeten Zelle oder während der Proteinsynthesereaktion transkribiert oder exprimiert werden. Obwohl es sich bei Inhibitoren um biosynthetische Verbindungen handeln kann, sind die Inhibitoren der Erfindung nicht auf Verbindungen beschränkt, die biologisch hergestellt werden können.
  • Beispiele für Nukleasen, die gemäß der Erfindung entfernt, gehemmt, mutiert, modifiziert oder moduliert werden können, schließen die Folgenden ein: Exonuklease I, Exonuklease II, Exonuklease III, DNA-Polymerase II, DNA-Polymerase III (E Untereinheit), Exonukleasen IVA und IVB, RecBCD (Exonuklease V), Exonuklease VII, Exonuklease VIII, RecJ, dRpase, Endonuklease I, Endonuklease III, Endonuklease IV, Endonuklease V, Endonuklease VII, Endonuklease VIII, fpg, uvrABC, mutH, vsr-Endonuklease, ruvC, ecoK, ecoB, mcrBC, mcrA, mrr, und Topoisomerasen (wie Topoisomerase I, Topoisomerase II, Topoisomerase III und Topoisomerase IV). Durch solches Entfernen, Hemmen, etc. wird die Erhaltung oder der Schutz des in den Synthesereaktionen der Erfindung verwendeten Nukleinsäure-Templates ermöglicht. So können zum Beispiel DNA-Nukleasen von Zellen mutiert, modifiziert, gehemmt, etc. werden, damit die DNA- Templates erhalten bleiben oder bewahrt werden. Solche DNasen aus E. coli und anderen Zellen sind im Stand der Technik bekannt.
  • Zusätzlich können RNA-Nukleasen mutiert, modifiziert, gehemmt, etc. werden, um das RNA-Template zu schützen oder zu erhalten. Zum Beispiel können E. coli Ribonukleasen, wie Endoribonuklease I, M, R, III, P, E, K, H, HII, IV, F, N, P2, O, PC und PIV, und Exonukleasen wie Polynukleotid-Phosphorylase, Oligoribonuklease, und Exoribonukleasen II, D, BN, T, PH und R mit dem Ziel, mRNA für die Proteinsynthese zu schützen, mutiert oder modifiziert oder gehemmt werden. In Abhängigkeit von der für den Extrakt verwendeten Zelle können andere zu dieser Zelle native Ribonukleasen mutiert, entfernt, modifiziert oder gehemmt, etc. werden, damit das/die Template(s) zur Proteinsynthese erhalten bleiben oder geschützt werden. Viele Nukleasen und Nukleaseinhibitoren sind im Handel erhältlich. So ist zum Beispiel Rnasin® (Promega) als ein Inhibitor von RNase in Säugetiersystemen gut charakterisiert, aber bei der Hemmung von prokaryotischen RNasen nicht wirksam.
  • Verfahren für die Mutation von Genen und die Auswahl von Nukleotiden, die für mutierte Gene kodieren, sind im Stand der Technik bekannt. Solche Mutationen schließen Punktmutationen (zum Beispiel durch ortsspezifische Mutagenese), Deletionsmutationen und Insertionsmutationen ein. Die Erfindung betrachtet ebenfalls die Verwendung der Aspekte der Erfindung, einschließlich der Mutation(en), Modifikation(en), Inhibitor(en) und anderer Verfahren im Einzelnen oder bevorzugt in Kombination. Diese Ausführungsformen, die sich auf die Entfernung, Modulation oder Reduzierung der enzymatischen Aktivität beziehen, schließen des Weiteren Merkmale ein, welche die Energievorraussetzungen für die Synthesereaktion stützen.
  • Entfernung, Modulation oder Reduzierung von anderen Enzymen kann ebenfalls aus dem Grund nützlich sein, da diese die Herstellung des gewünschten Produkts steuern oder fördern. Ist das Nukleinsäure-Template zum Beispiel eine RNA, so kann es sein, dass Polymeraseaktivität unerwünscht ist. Die Inaktivierung oder Hemmung von Polymeraseaktivität kann deshalb zu verbesserter Ausbeute und Reinheit des gewünschten Proteinprodukts führen.
  • Die Modulation von RNA-Polymerase kann auch in Systemen, die ein DNA-Template zur Herstellung von RNA verwenden, hilfreich sein. Verläuft die RNA-Synthese schnell, kann es sein, dass die RNA nur unzureichend durch Ribosome geschützt ist. Die Verwendung von mutierter oder modulierter RNA-Polymerase kann vorteilhafterweise dazu führen, dass RNA auf Grund der Tatsache geschützt wird, dass den Ribosomen ausreichend Zeit gegeben wird, um die in Entstehung befindliche RNA zu binden und zu schützen.
  • Die Protein- und Nukleinsäuresynthese erfordert typischerweise eine Energiequelle. Somit besteht ein Merkmal der vorliegenden Erfindung darin, eine ausreichende Energiequelle zur Unterstützung einer solchen Synthese bereitzustellen. Energie wird für die Initiierung der Transkription zur Herstellung von mRNA benötigt (z.B. wenn ein DNA-Template verwendet wird und für die Initiierung der Translation von energiereichem Phosphat, zum Beispiel in Form von GTP). Jeder aufeinanderfolgende Leseschritt eines Codons durch das Ribosom (drei Nukleotide; eine Aminosäure) macht die Hydrolyse eines zusätzlichen GTP zu GDP erforderlich. ATP wird üblicherweise ebenfalls benötigt. Damit während der Proteinsynthese eine Aminosäure polymerisiert werden kann, muss diese zunächst aktiviert werden. Für die Aktivierung ist die Hydrolyse von zwei energiereichen Phosphatbindungen nötig. Deshalb reagiert ein Aminsäuremonomer in Anwesenheit von Mg+2 tRNA und ATP, um eine Aminoacyl-tRNA, AMP und PPj zu bilden. Somit werden erhebliche Mengen an Energie von energiereichen Phosphatbindungen benötigt, damit die Protein- und/oder Nukleinsäuresynthese fortgesetzt werden kann.
  • Die anwesenden Erfinder haben gefunden, dass unter Verwendung von mehr als einer, vorzugsweise von zwei oder mehr Energiequellen, die die zur Synthese benötigten chemischen Metaboliten vorsehen können, eine verbesserte Synthese erreicht werden kann. Energiequellen, die energiereiche Phosphatbindungen generieren oder regenerieren sind bevorzugt.
  • Vorzugsweise beinhaltet die vorliegende Erfindung eine oder mehr als eine der oben genannten Komponenten oder Verfahren zur Verbesserung der Wirksamkeit von Nukleinsäure- und/oder Proteinsynthese. Kombinationen dieser Verbesserungen stellen ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. So kann zum Beispiel eine Zusammensetzung, ein System, ein Verfahren oder ein Kit der Erfindung jede beliebige oder eine Kombination der hierein beschriebenen Verbesserung aufweisen, wie zum Beispiel: mindestens eine Energiequelle und Entfernen und/oder Modulation von mindestens einer Enzymaktivität; mindestens eine Energiequelle und mindestens einen Inhibitor; Entfernen und/oder Modulation von mindestens einer Enzymaktivität und einem Inhibitor; mindestens eine Energiequelle, Entfernen und/oder Modulation von mindestens einer Enzymaktivität und einem Inhibitor; mindestens zwei Energiequellen; Entfernen und/oder Modulation von mindestens zwei Enzymaktivitäten; und mindestens zwei Inhibitoren. Allgemeiner ausgedrückt wird in Übereinstimmung mit der Erfindung mindestens ein Typ einer ersten Verbesserung mit mindestens zwei Typen einer anderen Verbesserung kombiniert; drei oder mehr Typen einer beliebigen Verbesserung mit einer, zwei, drei, etc. anderen Verbesserungen. Die Erfindung ist somit robust was ihre Anwendungen angeht und schließt zahlreiche verschiedene Ausführungsformen ein, die für den Durchschnittsfachmann von der vorliegenden Offenbarung klar ersichtlich sein werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN/FIGUREN
  • 1 zeigt GamS-vermittelte Hemmung von RecBCD-Aktivität.
  • 2 zeigt GamS-vermittelte Hemmung von Nuklease-Aktivität in Zellextrakten.
  • 3 zeigt, dass IVTT-Reaktionen in Anwesenheit von GamS zu gesteigerter Proteinsynthese führten.
  • 4 zeigt die Konsistenz von gesteigerter Proteinsynthese aus RNase E Extrakten aus mutierten Stämmen im Zeitverlauf.
  • 5 zeigt gesteigerte Proteinsynthese in IVTT-Reaktionen bei Anwesenheit von Acetylphosphat.
  • 6 zeigt die zeitabhängige Synthese von Protein in Anwesenheit und Abwesenheit von Acetylphosphat.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die in vitro Synthese von Proteinen und Nukleinsäuren. Die Erfindung schließt Synthesesysteme, Verfahren und Kits ein, die eines oder mehr als eines der Merkmale der vorliegenden Erfindung als Ausführungsform beinhalten. Das Synthesesystem der vorliegenden Erfindung schließt die notwendigen Komponenten für die Synthese von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-Templates und von Proteinen aus Nukleinsäure-Templates ein. Das in vitro Synthesesystem der Erfindung sieht effiziente Synthese außerhalb der Begrenzungen einer Zelle vor. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können dafür verwendet werden, Systeme oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung herzustellen und die Systeme der vorliegenden Erfindung zu verwenden, um Produktmoleküle von Interesse herzustellen. Die Kits der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Ausführung der in vitro Synthesesysteme der vorliegenden Erfindung oder erleichtern diese.
  • Das allgemeine System schließt ein Nukleinsäure-Template ein, das für eine gewünschte Nukleinsäure (z.B. RNA oder mRNA) und/oder Protein kodiert. Bei dem Nukleinsäure-Template kann es sich um jedes beliebe Template, z.B. DNA, RNA, insbesondere mRNA handeln, und es kann in jeder beliebigen Form vorliegen (z.B. linear, ringförmig, supercoiled, einzelsträngig, doppelsträngig, etc.). Solche Templates werden auf Grund ihrer Fähigkeit, die Produktion des gewünschten Proteins oder Nukleinsäuremoleküls zu steuern, ausgewählt. Bei dem gewünschten Protein kann es sich um jedes beliebiges Polymer von Aminosäuren handeln, das durch ein Nukleinsäure-Template mit dem Ziel, ein Polypeptidmolekül herzustellen, kodiert werden kann. Das Protein kann des Weiteren zeitgleich mit oder nach der Synthese weiter verarbeitet werden. Wenn erwünscht, kann das System wie im Stand der Technik bekannt so verändert werden, dass Codons für eine andere als die normale Aminosäure kodieren, einschließlich nicht herkömmlicher oder nicht natürlicher Aminosäuren (einschließlich solcher Aminosäuren, die detektierbar markiert wurden).
  • In dieser Anwendung haben Begriffe, falls nicht anders angegeben, ihre übliche im Bereich der Protein- oder Nukleinsäuresynthese aus genetischem, kodierendem Material verwendete Bedeutung. Zum Beispiel:
    Translation beschreibt die Synthese eines Polypeptids, z.B. eines Proteins, aus einem mRNA-Template.
  • Bei einer Nuklease handelt es sich um eine Verbindung mit enzymatischer Aktivität, die zur Hydrolyse von Polynukleotiden oder Polynukleinsäuren führt. In der Regel sind die Phosphodiesterbindungen von sowohl DNA als auch RNA resistent gegenüber Hydrolyse. Biologische Systeme haben das durch die Produktion von vielen Nukleasen, die die Fähigkeit besitzen, die Hydrolyse dieser Bindungen zu beschleunigen, kompensiert. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, Nukleasen zu klassifizieren. So handelt es sich zum Beispiel bei einer Endonuklease um eine Nuklease, die ihr Nukleinsäuresubstrat an internen Stellen in der Nukleotidsequenz spaltet. Bei einer Exonuklease handelt es sich um eine Nuklease, die Nukleotide sequentiell von freien Enden ihres Nukleinsäuresubstrats spaltet. Manche Nukleasen haben sowohl Endonuklease- als auch Exonuklease-Aktivität.
  • Nukleasen haben mit Bezug auf ihre Spezifitäten zahlreiche Funktionen, wie zum Beispiel, DNA-Reparatur-Aktivität, 3' zu 5'- oder 5' zu 3'-Spezifität, doppelsträngige oder einzelsträngige DNA- oder RNA:DNA-Spezifität, etc. Nukleasen können ein 3'-terminales α,β-ungesättigtes Aldehyd und 5'-terminales Phosphat (AP-Lyasen); ein 3'-Hydroxylnukleotid und 5'-terminale Phosphate (Endonuklease der Klasse II); oder ein 5'-Hydroxyl und 3'-Phosphat (Endonuklease der Klasse III) herstellen. Nukleasen können vorzugsweise einen oder mehr als einen Typ von Polynukleotid verarbeiten, zum Beispiel einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, mRNA, oligoRNA, ribosomale RNA, etc. Bei Restriktionsnukleasen handelt es sich um Nukleasen, die an Stellen mit spezifischen Nukleotidsequenzen spalten.
  • Zusätzliche Eigenschaften und Typen von Nukleasen sind im Stand der Technik wie in den zahlreichen Publikationen mit Bezug auf die verfügbaren Nukleasen beschrieben, bekannt. Bezug genommen wird hierin insbesondere auf Nucleases, Second Edition, Linn et al, Hrsg. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993) und dieses Werk ist in seiner Gänze durch Bezugnahme inkorporiert. Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Entfernen, Verhindern oder Hemmen von einer beliebigen oder mehr als einer der Nukleasefunktionen oder auf die Verwendung von Zellextrakten aus Zellen mit einer oder mehr als einer Nuklease oder anderer für das Nukleinsäure-Template schädliche oder zerstörende Aktivität, die zum Beispiel durch Modifizieren oder Mutieren von einem oder mehr als einem solche Aktivitäten kodierenden Gen reduziert, im Wesentlichen reduziert oder eliminiert wurde.
  • Eine DNase spaltet DNA. Bei DNA handelt es sich um eine Nukleinsäure, die eine gemeinsame molekulare Grundlage der Vererbung darstellt. Üblicherweise liegt DNA in einzelsträngiger und in doppelsträngiger Form vor. Doppelsträngige DNA besteht aus einer durch Wasserstoffbindungen zwischen Purin- und Pyrimidinbasen zusammengehaltenen Doppelhelix, wobei die Basen von zwei alternierenden Verbindungen von Desoxyribose und Phosphat enthaltenden Ketten nach innen stehen. Die vorliegende Erfindung betrachtet die Verwendung einer beliebigen Form von DNA, einschließlich cDNA, rekombinante DNA, isolierte DNA und synthetische DNA.
  • Eine RNase spaltet RNA. Bei RNA handelt es sich um eine Nukleinsäure, die Ribose und jede der vier Hauptbasen, die in DNA gefunden werden, enthält, mit der Ausnahme, dass anstelle von Thymin Uracil als strukturelle Komponente vorhanden ist. RNAs werden mit der Steuerung der chemischen Aktivitäten in Zellen in Verbindung gebracht. Bei Messenger RNA (mRNA) handelt es sich um eine RNA, die als Template für die Proteinsynthese dient. RNA, die für das Protein von Interesse kodiert, kann zu dem System hinzugefügt werden oder kann aus vorhandener oder zu dem System hinzugefügter DNA hergestellt werden.
  • „Nukleotid” bezieht sich auf eine Kombination aus Base, Zucker und Phosphat. Bei Nukleotiden handelt es sich um monomere Einheiten von Nukleinsäuren wie DNA und RNA. Nukleotide werden durch Polymerasen in Nukleinsäuren eingebaut. Der Begriff Nukleotid schließt zum Beispiel Ribonukleosidtriphosphate wie ATP, CTP, ITP, UTP GTP, TTP oder Derivate derselben und Desoxyribonukleosidtriphosphate wie dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP oder Derivate derselben ein. Solche Derivate schließen jedes beliebige Monomer, das in ein Polynukleinsäuremolekül eingebaut werden kann, ein, wie zum Beispiel [αS]dATP, 7-deaza-dGTP und 7-deaza-dATP. Der Begriff Nukleotid wie hierin verwendet bezieht sich ebenfalls auf Didesoxyribonukleosidtriphopsphate (ddNTPs) und deren Derivate. Die veranschaulichenden Beispiele von Didesoxyribonukleosidtriphosphat schließen ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, und ddTTP ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein "Nukleotid" in nicht markierter Form vorliegen oder durch wohlbekannte Techniken detektierbar markiert sein. Detektierbare Markierungen schließen zum Beispiel unterschiedliche Isotope wie radioaktive Isotope, fluoreszierende Markierungen, chemilumineszierende Markierungen, biolumineszente Markierungen und Enzymmarkierungen ein.
  • Im hier vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck in vitro auf Systeme außerhalb einer Zelle oder eines Organismus und kann manchmal mit Bezug auf zellfreie Systeme verwendet werden. In vivo Systeme beziehen sich auf im Wesentlichen intakte Zellen, unabhängig davon, ob diese in Suspension oder gebunden an oder in Kontakt mit anderen Zellen oder einem Feststoff sind. In vitro Systeme haben den Vorteil, dass sie stärker manipulierbar sind. Die Abgabe von Komponenten an das Innere einer Zelle stellt kein Problem dar; ebenso sind Manipulationen, die mit fortgesetzter Zellfunktion inkompatibel sind, möglich. Allerdings schließen in vitro Systeme zerstörte Zellen oder die Verwendung von zahlreichen Komponenten für das Vorsehen der gewünschten Funktion ein, womit die räumlichen Verhältnisse der Zelle verloren gehen. Wenn ein in vitro System hergestellt wird, können Komponenten, die möglicherweise für die gewünschte Aktivität entscheidend sind, mit entsorgten Zelltrümmern verloren gehen. Somit sind in vitro Systeme stärker manipulierbar und können anders als in vivo Systeme funktionieren.
  • Bei einem Nukleinsäure-Template handelt es sich um eine Polynukleinsäure, die dazu dient, die Synthese eines anderen Nukleinsäure-Templates oder eines Proteins zu steuern. Bei dem Template handelt es sich um ein Molekül, das aus zahlreichen Nukleotid-Untereinheiten zusammengesetzt ist, sich allerdings in Länge und Typ von Nukleotid-Untereinheiten unterscheiden kann. DNA und RNA, z.B. mRNA sind Spezies von Nukleinsäuren, die als Templates zur Protein und Nukleinsäuresynthese verwendet werden können. Ein DNA-Template wird transkribiert, um ein RNA-Template zu bilden, das komplementär zu dem gesamten oder einem Teil des Templates ist. Ein RNA-Template wird zur Herstellung eines von dem gesamten oder einem Teil des Templates kodierten Proteins oder Peptids translatiert. Somit handelt es sich bei dem Template in einer Synthesereaktion um eine oder mehr als eine Spezies von Nukleinsäure, die direkt oder indirekt für das gewünschte Protein/die gewünschten Proteine kodiert.
  • Bei einem Protein handelt es sich um ein Molekül aus polymerisierten Aminosäuren (oder Derivaten derselben), die durch Peptidbindungen aneinander gebunden sind. Im hier vorliegenden Zusammenhang, handelt es sich bei einem Polypeptid um eine Klasse von Proteinen. Proteine, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können durch jedes beliebige im Stand der Technik bekannte Verfahren untersucht werden. So können zum Beispiel Assays, die für das produzierte Protein spezifisch sind, oder auch allgemeinere Assays, wie zum Beispiel radioaktive Assays, z.B. solche, die 35S-Met verwenden, eingesetzt werden.
  • Bei einer Energiequelle handelt es sich um ein chemisches Substrat, das enzymatisch so verarbeitet werden kann, dass es Energie für die Umsetzung von gewünschten chemischen Reaktionen zur Verfügung stellt. Energiequellen, welche die Freisetzung von Energie zur Synthese durch Spaltung von energiereichen Phosphatbindungen, wie jene, die in Nukleosidtriphosphaten gefunden werden, z.B. ATP, gefunden werden, werden üblicherweise verwendet.
  • Andere Energiequellen wie zum Beispiel Quellen, die energiereiche Phosphatbindungen bilden, können ebenfalls Energie für den Syntheseprozess zur Verfügung stellen. Beispiele für Energiequellen zur Verwendung in in vitro Synthese sind Glucose, Phosphoenolpyruvat (PEP), Carbamoylphosphat, Acetylphosphat, Creatinphosphat, Phosphopyruvat, Glyceraldehyd-3-Phosphat, Pyruvat und Glucose-6-Phosphat. Jede beliebige in energiereiche Verbindungen konvertierbare Quelle ist besonders geeignet.
  • So katalysiert zum Beispiel Pyruvatkinase eine Reaktion von PEP und ADP, um Pyruvat und ATP zu bilden. ATP kann reversibel in Triphosphate oder andere Ribonukleoside umgewandelt werden. Somit können ATP, GTP, etc normalerweise als äquivalente Energiequellen für die Unterstützung von Proteinsynthese gesehen werden. Ein System zur Proteinsynthese der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehr als eine solche Energiequelle einschließen, vorzugsweise zwei, drei, sogar vier oder mehr verschiedene Energiequellen, die in der Lage sind, ATP zu generieren oder zu regenerieren.
  • Bei einem Extrakt handelt es sich um ein Zelllysat oder Exsudat. Bei der Zelle kann es sich um jede beliebige Zelle handeln, die zur Herstellung eines Extrakts kultiviert werden kann. Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen können zur Protein- und/oder Nukleinsäuresynthese gemäß der Erfindung verwendet werden. Prokaryotische Systeme profitieren von gleichzeitiger oder "gekoppelter" Transkription und Translation. Ebenso sind eukaryotische Systeme beliebt. Siehe z.B. Pelham et al, European Journal of Biochemistry, 67: 247, (1976). Der Durchschnittsfachmann erkennt, dass verschiedene Aspekte der Erfindung von größerem oder geringerem Vorteil sind, abhängig vom Typ der Zelle oder des Systems, zum Beispiel eukaryotische oder prokaryotische Systeme oder die spezifische Zelle oder Zelllinie.
  • Vorzugsweise wird der Extrakt bearbeitet, um Zelltrümmer zu entfernen. Ein übliches Verfahren zur Entfernung von solchen Festestoffen besteht in Zentrifugation. Filtration, Chromatographie oder jedes beliebige andere Verfahren zur Trennung oder Reinigung können verwendet werden, um einen gewünschten Extrakt zu produzieren. Der Extrakt schließt vorzugsweise alle zur Synthese notwendigen Komponenten ein, die nicht auf andere Weise in dem System zur Verfügung stehen. Der Extrakt kann unter Verwendung von einem oder mehreren der im Stand der Technik bekannten Hilfsmittel konzentriert werden. Enzyme und andere zur Bereitstellung von Energie im Extrakt vorhandene Komponenten und andere Komponenten für die Synthesereaktion können ihren Ursprung in der extrahierten Zelle haben oder während der Herstellung des Extrakts hinzugefügt werden. „Zellextrakt" schließt ebenfalls eine Mischung von Komponenten ein, die hergestellt wurden, um ein Zelllysat oder Exsudat mit Bezug auf die für Protein- oder Nukleinsäuresynthese notwendigen oder gewünschten Komponenten zu imitieren. Bei einem Zellextrakt kann es sich somit um eine Mischung von Komponenten handeln, die dazu dienen, ein Zelllysat oder Exsudat bei Proteinsynthesereaktionen zu imitieren oder zu verbessern und/oder um für die Synthese aus einem Nukleinsäure-Template verwendete Komponenten vorzusehen. Solch eine Mischung kann, wie dem Durchschnittsfachmann ersichtlich ist, durch Erhalten eines partiellen Extrakts oder einer Fraktion desselben und/oder durch Mischen einer beliebigen Anzahl an einzelnen Komponenten hergestellt werden.
  • Bei einem Gen handelt es sich um die fundamentale physikalische und funktionale Einheit der Vererbung. Gene kodieren für spezifische funktionale Produkte, z.B. ein Protein oder RNA. Gene schließen kodierende und nicht-kodierende Regionen ein. Eine Änderung beim Ort, an dem sich das Gen oder eine beliebige seiner kodierenden oder nicht-kodierenden Regionen befinden, kann Auswirkungen auf die Funktion haben. Der funktionale Effekt eines Gens kann durch Ändern des Gens oder durch Ändern eines Faktors, der die Aktivität oder Funktion des Gens steuert, modifiziert werden.
  • Gemäß einem Aspekt wird ein Gen mutiert oder modifiziert (zum Beispiel durch Punktmutation, Deletionsmutation, Insertionsmutation, etc.), um die Aktivität des kodierten Produkts oder Proteins des Gens zu reduzieren, im Wesentlichen zu reduzieren oder zu eliminieren. Gemäß einem weiteren Aspekt kann das durch das modifizierte Gen kodierte Produkt oder Protein nicht produziert werden, oder wenn es produziert wird, hat es reduzierte, im Wesentlichen reduzierte oder eliminierte Aktivität. Zur Bestimmung der relativen Aktivität kann die Aktivität des Produkts des mutierten Gens (oder der es enthaltenden Zelle) mit der Aktivität des Produkts oder Proteins, (oder der es enthaltenden Zelle) für das das nicht modifizierte Gen kodiert, verglichen werden. Ein mutiertes Gen kann zu einem solchen Ausmaß mutiert werden, dass die Aktivität seines kodierten Produkts oder Proteins nicht länger in der Zelle detektierbar ist. Bei einem deletierten Gen handelt es sich um eine Spezies von mutiertem Gen.
  • Bei einer Phosphatase handelt es sich um ein Enzym, das die Hydrolyse von organischen Estern von Phosphorsäuren fördert oder beschleunigt, z.B. die Hydrolyse von ATP zu ADP fördert oder beschleunigt. Eine Alkaline Phosphatase ist in einem Medium mit alkalinem pH aktiv. Eine saure Phosphatase ist in einem Medium mit saurem pH aktiv. Viele Phohphatase-Enzyme weisen eine oder mehr als eine zusätzliche Aktivität auf.
  • Bei einem Inhibitor handelt es sich um eine Substanz, die die Aktivität einer anderen Verbindung/eines anderen Proteins/Moleküls/einer anderen Substanz, z.B. eines Enzyms reduziert, im Wesentlichen reduziert oder eliminiert. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung für das Erhalten von Nukleinsäure-Templates sind die wichtigsten Inhibitoren Nukleaseinhibitoren. Bei Inhibitoren kann es sich zum Beispiel um Proteine, Metalle oder Verbindungen, etc. handeln, aber auch um eine Bedingung (z.B. pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur, etc.), wodurch die Aktivität des zu hemmenden Enzyms reduziert, im Wesentlichen reduziert oder eliminiert wird. Phosphataseinhibitoren und Polymeraseinhibitoren können ebenfalls vorteilhaft bei der in vitro Synthese der Erfindung verwendet werden.
  • Bei einer Polymerase handelt es sich um ein Enzym, das die Synthese von Nukleinsäuren unter Verwendung eines bereits existierenden Nukleinsäure-Templates katalysiert. Wenn es sich bei dem Template um ein DNA-Template handelt, muss ein RNA-Molekül transkribiert werden, bevor Protein synthetisiert werden kann. Enzyme mit Nukleinsäurepolymerase-Aktivität, die für die Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignet sind, schließen jede beliebige Polymerase ein, die in dem gewählten System mit dem gewählten Template aktiv ist, um Protein zu synthetisieren. Der Extrakt einer Zelle umfasst üblicherweise eine geeignete Polymerase, wie RNA-Polymerase II, SP6 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase, T7 RNA-Polymerase, RNA-Polymerase III und im Allgemeinen RNA-Polymerasen, die aus Phagen stammen. Diese und andere Polymerasen sind im Stand der Technik bekannt und können vom Fachmann auf einfache Weise bewertet werden, indem eine oder mehr als eine öffentliche oder private Datenbank durchsucht wird. Geeignete Polymerasen können auch in dem System ergänzt werden. Wenn RNA aus einem DNA-Template synthetisiert werden soll, sollte eine Polymerase verwendet werden, die auf das DNA-Molekül von Interesse wirkt. RNA-Polymerasen und Transkriptionsfaktoren, die in der Erfindung verwendet werden können, sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und für den Fachmann klar ersichtlich.
  • Bei RecBCD handelt es sich um ein Enzym, das sowohl einzel- als auch doppelsträngige Exonuklease-Aktivität, einzelsträngige Endonuklease-Aktivität und Helikase-Aktivität aufweist. Der Komplex (und RecB in Isolierung) zeigt ATPase-Aktivität. Bei RecBCD handelt es sich somit um eine Nuklease und auch um eine funktionale Phosphatase.
  • Um Energie für die Synthesereaktion zur Verfügung zu stellen, schließt das System vorzugsweise hinzugefügte Energiequellen, wie Glucose, Pyruvat, Phosphoenolpyruvat (PEP), Carbamoylphosphat, Acetylphosphat, Creatinphosphat, Phosphopyruvat, Glyceraldehyd-3-Phosphat und Glucose-6-Phosphat ein, die energiereiche Triphosphat-Verbindungen wie ATP, GTP, etc. generieren oder regenerieren können. Gemäß der Erfindung können eine oder mehr als eine (vorzugsweise zwei oder mehr, drei oder mehr, etc.) solcher Energiequellen verwendet werden und in jeder beliebigen Kombination oder in jeder beliebigen Reihenfolge hinzugefügt werden.
  • Wenn anfänglich nicht ausreichend Energie in dem Synthesesystem vorhanden ist, wird vorzugsweise eine zusätzliche Energiequelle hinzugefügt. Diese Ergänzung kann kontinuierlich erfolgen oder in einer oder mehr als einer einzelnen Ergänzung. Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung schließt das Hinzufügen von mindestens zwei (oder drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, sechs oder mehr, etc.) Energiequellen ein, um die Energie für die Synthesereaktionen der Erfindung zur Verfügung zu stellen. Häufig enthält die Energiequelle/enthalten die Energiequellen, vor allem hinzugefügte Energiequelle(n), selbst keine energiereiche Phosphatbindung. Vorzugsweise handelt es sich dabei nicht um Triphosphat-Verbindungen, spezifischer Nukleotidtriphosphate.
  • Die Energiequelle kann in jeder beliebigen Menge, die für die gewünschte Synthese geeignet ist, vorliegen. So kann die chemische Energiequelle zum Beispiel mit dem Ziel hinzugefügt werden, eine Konzentration von 10–100 mM zu erzielen. Weitere Zielkonzentrationen können ungefähr 5, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80 oder 90 mM sein. Die genaue Konzentration variiert, da Synthese Energie verbraucht und die Energie aus diesen Quellen aufgefüllt wird. Die Konzentration kann innerhalb verschiedener Bereiche gesteuert sein, zum Beispiel ungefähr 10–100 mM, 15–90 mM, 20–80 mM, 30–60 mM, etc. Jede Zielkonzentration kann als ungefähre Grenze für den gewünschten Konzentrationsbereich an Energiequelle verwendet werden. Energiequellen können auch während der in vitro Synthesereaktion hinzugefügt oder ergänzt werden.
  • Wenn zwei oder mehr als zwei Energiequellen verwendet werden, kann jede Quelle unabhängig als eine dieser Zielkonzentrationen ausgewählt werden.
  • Wenn mehrere Energiequellen in dem System eingeschlossen sind, wird die Synthese (vor allem die Proteinsynthese) beschleunigt und in ihrem zeitlichem Ablauf verlängert, so dass Protein- und/oder Nukleinsäureprodukte effizienter durch das Synthesesystem produziert werden. Werden zum Beispiel Phosphoenolpyruvat (PEP) und Acetylphosphat als hinzugefügte Energiequellen verwendet, so kann die Menge an synthetisiertem Protein mehr als verdoppelt werden im Vergleich zu dem Hinzufügen von Acetylphosphat alleine. Somit schließt die vorliegende Erfindung ein in vitro Synthesesystem ein, das mindestens eine und vorzugsweise mindestens zwei oder mehr unterschiedliche Energiequellen umfasst, die energiereiche Phosphatbindungen für die Synthesereaktionen zur Verfügung stellen.
  • Die Synthesesysteme der Erfindung basieren auf einem oder mehr als einem Zellextrakt. Zellen besitzen die notwendigen Komponenten, um Proteine und/oder Nukleinsäuren zu synthetisieren. Zellextrakte sind somit eine einfach erhältliche Quelle für die Synthese von Komponenten. Aus Zellen bearbeitete/entwickelte Komponenten oder aus anderen Quellen synthetisierte Komponenten können in dem Extrakt enthalten sein.
  • Die Erhaltung des Templates ist notwendig, um die Dauer des Syntheseprozesses zu maximieren. Somit kann das Synthesesystem der vorliegenden Erfindung Komponenten beinhalten, die bewirken, dass das Template erhalten bleibt. Das Template kann durch Verhindern von enzymatischem, chemischem oder einer anderen Form des Abbaus des Templates erhalten bleiben.
  • Das Synthesesystem der Erfindung kann deshalb Modifizierungen an dem Extrakt zur Verbesserung der Produktsynthese beinhalten. Wenn der Extrakt Enzyme enthält, deren Aktivitäten Protein- und/oder Nukleinsäureproduktion umfassen, führt die Hemmung dieser Enzyme zu effizienterer Synthese durch das System. Somit sind in vitro Synthesesysteme, die Inhibitoren von mindestens einem Enzym umfassen, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Nuklease- und Phosphataseinhibitoren werden vorteilhafterweise verwendet, um die Effizienz von Protein- und/oder Nukleinsäuresynthese zu erhöhen. Die Hemmung von Enzymen, die unnötigerweise in der Synthesereaktion verwendete Verbindungen konsumieren kann die Effizienz der Synthese ebenfalls erhöhen. In Abhängigkeit von den spezifischen Enzymen, die in dem Extrakt vorhanden sind, können zum Beispiel eine oder mehr als eine der vielen bekannten Nuklease-, Polymerase- oder Phosphataseinhibitoren ausgewählt und vorteilhaft zur Verbesserung der Effizienz der Synthese verwendet werden.
  • Es kann allerdings sein, dass es nicht wünschenswert ist, die Aktivitäten aller Nukleasen zu verhindern oder zu hemmen. So bauen beispielsweise RNase I und RNase I* vorzugsweise kurze RNA-Oligonukleotide und nicht RNAs von ganzer Länge ab. Unter manchen Umständen kann sich diese Aktivität als hilfreich erweisen. Zellen verwenden dieses Enzym, um RNA abzubauen, die nicht mehr benötigt wird. So wären beispielsweise Mononukleotide, die durch RNase I verfügbar gemacht werden, als Substrate zur Transkription von DNA verfügbar. Alternativ kann das Blockieren von RNase I an sich nicht ausreichend sein, damit die RNA zur Translation während des Proteinsyntheseprozesses erhalten bleibt. So können zum Beispiel andere Enzyme bei dem anfänglichen Abbau von mRNA aktiver sein.
  • Für den Erhalt des Templates können für die Produktion des Extrakts verwendete Zellen dazu ausgewählt werden, die Aktivitäten von schädlichen Enzymen zu reduzieren, im Wesentlichen zu reduzieren oder zu eliminieren oder für Enzyme mit modifizierter Aktivität ausgewählt werden. Somit sind in vitro Synthesesysteme, die Extrakte von Zellen mit geänderter Aktivität (zum Beispiel durch Modifikation oder Mutation von einem oder mehr als einem Gen) umfassen, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Zellen mit modifizierte Nuklease- oder Phosphatase-Aktivität (z.B. mit mindestens einem mutierten Phosphatase- oder Nuklease-Gen oder Kombinationen derselben) werden besonders vorteilhaft verwendet, um die Effizienz der Synthese zu erhöhen.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein in vitro Synthesesystem wobei eine oder mehr als eine Polymerase modifiziert wird (oder Polymeraseaktivität wird moduliert). Für einen Aspekt wird die Polymeraseaktivität reduziert, oder im Wesentlichen reduziert oder gehemmt (zum Beispiel durch Mutieren eines Polymerase-Gens oder dessen regulatorischer Elemente), damit das Template erhalten bleibt. So werden zum Beispiel an Ribosome gebundene RNAs vor RNase E geschützt. Ist die Polymeraseaktivität jedoch zu groß, so ist es möglich, dass die RNase E die RNA abbaut, bevor ein Ribosom binden kann. Somit kann das Template durch Hemmung von RNA-Polymerase oder durch Verwendung von Zellen mit reduzierter Polymeraseaktivität erhalten bleiben. Eine Zelle mit einer RNA-Polymerase, die so modifiziert wurde, dass die Polymerisationsgeschwindigkeit moduliert wird, um die Bindung von Ribosom zu verbessern, kann gemäß der Erfindung verwendet werden, um ein Proteinsynthesesystem herzustellen, in dem RNA effizienter verwendet wird. Darüber hinaus kann es sein, dass DNA-Polymerasen in manchen Systemen nicht benötigt werden (z.B. in Translationssystemen) und somit bezieht sich die Erfindung auf Hemmung, Reduzierung, substantielle Reduzierung oder Eliminierung von einer oder mehr als einer Polymerase wie zum Beispiel einer DNA-Polymerase, zum Beispiel um solche DNA-Polymerasen davon abzuhalten, Reaktionskomponenten zu verwenden (z.B. Verhinderung von unnötigem Verbrauch von Energie).
  • Alternativ kann die Zelle für die Produktion des Extrakts unter solchen Bedingungen gezüchtet werden, dass ein Produkt oder Protein oder eine Aktivität reduziert oder moduliert oder eliminiert wird (z.B. um die Expression eines Proteins von Interesse zu reduzieren). Solche Wachstumsbedingungen werden als eine Art der Modulation oder Hemmung gemäß der Erfindung angesehen. Die daraus resultierenden Extrakte ähneln Extrakten, die aus Zellen, in denen ein Gen mutiert oder modifiziert ist, erhalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Verfahren für die Produktion von Protein- und/oder Nukleinsäuremolekülen in einem in vitro Synthesesystem ein. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen Produzieren solcher Produkte mit in vitro Systemen, die mindestens eine, bevorzugt mindestens zwei oder drei oder mehr Energiequellen aufweisen, ein, wobei die Energiequellen entweder kontinuierlich hinzugefügt werden können, oder durch einen oder mehr als einen einzelnen Vorgang. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen auch die Produktion von Proteinen und/oder Nukleinsäuren mit in vitro Systemen ein, die modifiziert wurden, damit das Nukleotid-Template erhalten bleibt. Zum Beispiel: Nukleasen, Phosphatasen oder Polymerasen können durch chemische oder physikalische Bedingungen gehemmt werden; und/oder Extrakte aus defizienten oder mutierten oder modulierten Zellen mit Bezug auf ein oder mehr als ein Enzym, wie Nuklease, Phosphatase oder Polymerase, können als Basis für das System verwendet werden.
  • Mutierte oder modifizierte Zellen können wie in den Beispielen angegeben hergestellt werden und/oder können gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei einer modifizierten Zelle um eine Zelle mit einem oder mehr als einem modifizierten Gen oder die auf solche Art und Weise modifiziert oder moduliert sind, dass sie eine bestimmte Aktivität oder Aktivitäten von Interesse reduzieren, im Wesentlichen reduzieren, eliminieren, hemmen oder modulieren. Ein mutiertes Gen schließt ein Gen ein, das nicht in das vollständig funktionale Genprodukt, das mit dem Wiltyp-Gen assoziiert wird, transkribiert oder translatiert wurde. Bei einer Mutation kann es sich um jede beliebige Mutation handeln, die dazu führt, dass das Wildtyp-Genprodukt nicht die volle Funktion aufweist. Zum Beispiel kann es sich bei der Mutation um eine Punktmutation, eine vollständige oder teilweise Deletion des Gens, eine vollständige oder teilweise Substitution des Gens und/oder eine oder mehr als eine Insertion in ein Gen handeln.
  • Der Extrakt kann aus allen beliebigen geeigneten Zellen hergestellt werden. Zu den geeigneten Zellen zählen jene, die Komponenten für die Protein- und/oder Nukleinsäuresynthese aufweisen und optional unter ausgewählten Wachstumsbedingungen oder mit Modifikation(en) und/oder Mutation(en) hergestellt wurden, die ungewünschte, für die in vitro Synthese schädliche Eigenschaften inaktivieren oder reduzieren oder im Wesentlichen reduzieren. Wirtszellen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, schließen bakterielle Zellen, Pilz- und Hefezellen, pflanzliche und tierische Zellen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Bevorzugte bakterielle Wirtszellen schließen zum Beispiel Gram-positive und Gram-negative Bakterien und besonders Escherichia spp. Zellen (vor allem E. coli Zellen und besonders die E. coli Stämme DH10B, Stbl2, DH5α, DB3, D63.1 (vorzugsweise E. coli LIBRARY EFFICIENCY® DB3.1TM Competent Cells; Invitrogen Corp., Life Technologies Division, Rockville, MD), DB4 und DB5 (siehe US Anmeldung Nr. 09/518,188, eingereicht am 2. März 2000, und US provisorische Anmeldung Nr. 60/122,392, eingereicht am 2. März 1999, deren Offenbarungen durch Bezugnahme hierin zu ihrer Gänze inkorporiert sind), BL21, HB101, INV110, INVαF', MC1061/P3, PIR1, PIR2, TOP10, TOP10F', TOP10/P3, etc., Bacillus spp. Zellen (insbesondere B. subtilis und B. megaterium Zellen), Aspergillus spp. Zellen, Streptomyces spp. Zellen, Erwinia spp. Zellen, Klebsiella spp. Zellen, Serratia spp. Zellen (insbesondere S. marcessans Zellen), Pseudomonas spp. Zellen (insbesondere P. aeruginosa Zellen), und Salmonella spp. Zellen (insbesondere S. typhimurium und S. typhi Zellen). Bevorzugte tierische Wirtszellen schließen Insektenzellen (insbesondere Drosophila melanogaster Zellen und insbesondere S2 Zellen, Spodoptera frugiperda Sf9 und Sf21 Zellen und Trichoplusa High-Five- Zellen), Zellen von Nematoden (insbesondere C. elegans Zellen), Zellen von Vögeln, Zellen von Amphibien (insbesondere Xenopus laevis Zellen), Zellen von Reptilien und Säugetierzellen (ganz besonders NIH3T3, CHO, COS, C127, VERO, BHK, HeLa, 293, Per-C6, Bowes Melanoma und im Allgemeinen humane, Kaninchen-, Mäuse-, Ratten-, Hamster-, Schweine-, Rinder- und Wüstenrennmaus-Zellen). Bevorzugte Hefe-Wirtszellen schließen Saccharomyces cerevisiae Zellen und Pichia pastoris Zellen ein. Diese und andere geeignete Wirtszellen sind kommerziell zum Beispiel von Invitrogen Corp., Life Technologies Division (Rockville, Maryland), American Type Culture Collection (Manassas, Virginia), und Agricultural Research Culture Collection (NRRL; Peoria, Illinois) erhältlich, deren Kataloge hierin jeweils zu Gänze durch Bezugnahme inkorporiert sind. Als Beispiele für Pflanzenzellen dienen Zellen von Protoplasten, Tabak, Kartoffel und anderen Knollenpflanzen, Gräser einschließlich Mais, Baumwolle und andere faserhaltige Pflanzen, einjährige und mehrjährige Pflanzen, Monokotyledonen und Dikotyledonen und besonders Pflanzenzellen, die transformiert und/oder in Kulturen gezüchtet werden können.
  • Der Zellextrakt kann so ergänzt werden, dass er Komponenten vorsieht, die nicht oder nach der Extraktion nicht in ausreichenden Mengen vorhanden sind.
  • Der Extrakt kann mit jedem beliebigen im Stand der Technik verwendeten Verfahren hergestellt werden, dass die Integrität des Transkriptions-/Translationssystem erhält, oder, falls der Prozess eine oder mehr als eine für ein beliebiges Stadium der Transkription/Translation benötigte Komponente beeinträchtigt, kann diese beeinträchtigte Komponente für einen Zeitpunkt nach der Extraktherstellung ersetzt oder substituiert werden.
  • Die Extrakte wurden gemäß der Methode von Zubay (1973), auf die oben Bezug genommen wird, hergestellt. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass viele Modifikationen an dem Extraktionsprozess innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung möglich sind.
  • Wenn nicht anders angegeben, enthielt die Inkubationsreaktion 57 mM Hepes/KOH, pH 8,2, 230 mM K-Glutamat, 1,2 mM ATP, jeweils 0,85 mM GTP, UTP, CTP, 30 mM PEP, 1,7 mM DTT, 12 mM Mg(OAc)2, 0,17 mg/ml E. coli Gesamt-RNA-Mischung, 34 μg/ml Folsäure, 66 μg/ml T7 RNA-Polymerase, jeweils 1,25 mM von den Aminosäuren, 14 mg/ml Extrakt, 3 μl 35S-Met (15 μCi/μl) und verschiedene Mengen an DNA-Template.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass die Konzentrationen der verschiedenen Komponenten des Inkubationsmediums wie im Stand der Technik bekannt angepasst werden können während gleichzeitig ihre Synthesefunktion aufrecht erhalten wird. Zum Beispiel kann der pH-Wert von ungefähr 5,6 bis ungefähr 8,8 oder bevorzugter von ungefähr 6,1 bis 8,5 oder sogar von ungefähr 7,2 bis 8,4 reichen, je nachdem welches Produkt synthetisiert werden soll. Ebenso kann die Konzentration von K-Glutamat einfach zwischen 80 mM und 320 mM oder bevorzugter von ungefähr 120 bis 280 mM oder sogar von ungefähr 180 bis 250 mM variiert werden; die Konzentration von ATP kann von ungefähr 0,1 bis 3,0 mM oder bevorzugter von ungefähr 0,3 bis 2,0 mM oder sogar von ungefähr 0,8 bis 1,5 mM variiert werden; die Konzentrationen von GTP, UTP, CTP und TTP können von ungefähr 0 oder 0,1 bis 2 mM oder bevorzugter von ungefähr 0,4 bis 1,2 mM oder sogar von ungefähr 0,7 bis 1,0 mM variieren; PEP kann von ungefähr 10 bis 60 mM oder bevorzugter von ungefähr 20 bis 50 mM oder sogar von ungefähr 25 bis 40 mM variieren; DTT kann von ungefähr 0,5 bis 3,0 mM oder bevorzugter von ungefähr 1,0 bis 2,5 mM oder sogar von ungefähr 1,5 bis 2,0 mM variieren; Magnesium kann von ungefähr 7,5 bis 20 mM oder bevorzugter von ungefähr 10 bis 15 mM oder sogar von ungefähr 11,5 bis 14 mM variieren; Gesamt-RNA-Mischung kann von ungefähr 0,1 bis 0,5 mg/ml oder bevorzugter von ungefähr 0,12 bis 0,3 mg/ml oder sogar von 0,15 bis 0,2 mg/ml variieren; Folsäure kann von ungefähr 15 bis 50 μg/ml oder bevorzugter von ungefähr 25 bis 40 μg/ml oder sogar von ungefähr 30 bis 35 μg/ml variieren; Polymerase kann von ungefähr 0 oder 1,0 bis 300 μg/ml, oder bevorzugter von ungefähr 20 bis 200 μg/ml oder sogar von ungefähr 30 bis 150 μg/ml, von ungefähr 40 bis 120 μg/ml, von ungefähr 50 bis 100 μg/ml oder von ungefähr 60 bis 75 μg/ml variieren; Aminosäuren können unabhängig von ungefähr 0,4 bis 5 mM oder bevorzugter von ungefähr 0,5 bis 2,0 mM oder sogar von ungefähr 0,8 bis 1,5 mM variieren; der Extrakt kann von ungefähr 2 bis 40 mg Protein/ml oder bevorzugter von ungefähr 5 bis 25 mg Protein/ml oder sogar von ungefähr 10 bis 18 mg Protein/ml variieren; und gegebenenfalls kann ein Synthese-Marker (35S-Met im oben beschriebenen Beispiel) wie gewünscht ausgewählt und in jeder beliebigen detektierbaren Menge, durch die die Synthese nicht unzulässig beeinflusst wird, verwendet werden. Der Fachmann kann leicht erkennen, dass viele der Komponenten bekannte Substitute oder Äquivalente haben, die entweder in der selben Konzentration oder in einer Konzentration, die zu einer qualitativ und/oder quantitativ ähnlichen Wirkung führt, verwendet werden.
  • BEISPIEL 1
  • Zellfreie in vitro Proteinsynthese unter Verwendung von mutiertem E. coli
  • Ein mutantes Derivat von BL21 wurde zur zellfreien Proteinsynthese in dem IVTT-System der vorliegenden Erfindung verwendet. Der anfängliche BL21-Stamm wies keine OmpT- und Ion-Proteasen auf (Studier, Methods in Enzymology, 185: 60–89, (1990)). Die folgenden Gene wurden mutiert: RNase I, die carboxyterminale Deletion von RNase E und Endonuklease I durch im Stand der Technik bekannte Techniken. Diese Mutationen führten zu Stabilisierung oder Erhalt des DNA-Templates und der mRNA, ebenso wie zu Stabilisierung der in Synthese befindlichen Proteine. Es wurde berichtet, dass Wachstum von E. coli Zellen in Phosphat-enthaltenden Medien die Synthese von alkaliner Phosphatase unterdrückt (Malamy und Horecker, Biochemistry, 3: 1893–1897). Es wurde deshalb versucht, Zellen in phosphatreichem Medium zu züchten, um Zellen mit niedriger Phosphatase-Aktivität zu produzieren. Zusätzliche Mutationen von anderen Nukleasen oder anderen schädlichen Genen können ebenso zur weiteren Steigerung durchgeführt werden (z.B. siehe Beispiel 6 unten). Die aus mutantem E. coli, gezüchtet in Phosphat-enthaltendem Medium, hergestellten Extrakte erhöhen die Produktion von Proteinen.
  • BEISPIEL 2
  • Klonierung und Expression von Lambda Gam
  • Anstelle der Mutation von RecBCD wurde ein neuartiges Verfahren zur Inaktivierung der RecBCD-Nuklease gefunden. Das neuartige Verfahren schließt den Einbau von Lambda Rekombinase Protein, Gam, in den zellfreien Extrakt ein.
  • Es wurde gezeigt, dass Gam E. coli RecBCD in vivo hemmt und dass es bei der homologen Rekombination unter Verwendung von linearer DNA hilfreich ist (Yu et al, PNAS, 97: 5978–5983, (2000); Datsenko and Warner, PNAS, 97: 6640–6645, (2000)). In beiden Fällen zeigten die Autoren, dass eine lineare DNA in Anwesenheit von Lambda Gam geschützt werden kann und Lambda Exo und Beta hocheffiziente, homologe Rekombination fördern. Gam wurde hier in dem Extrakt, der frei von E. coli Zellen war, verwendet, um zu versuchen die lineare DNA zu schützen und damit die Protein- und/oder Nukleinsäuresynthese potentiell zu steigern.
  • Multiple Gam Isoformen
  • In der Literatur gibt es mehrere Referenzen zu Kontroversen über die Größe des Gam-Genprodukts (Murphy, J. Bact., 173: 5808–21, (1991); Friedman and Hays, Gene, 43: 255–63, (1986)). Mindestens ein Forscher hat berichtet, dass bei SDS-PAGE zwei separate Gam-Formen detektiert wurden: eines bei einem apparenten Molekulargewicht von 17 kD und eines bei ungefähr 12 kD. Es wurde zunächst vermutet und später gezeigt, dass das kleinere Protein tatsächlich ein Produkt des Gam-Gens war, aber bei einem internen Methionin anstelle des zuvor vorhergesagten stromaufwärts gelegenen Startpunkts startete. Dieser interne Startpunkt hatte eine gute Shine-Dalgarno-Sequenz (AGGAGTTCAGCC) (SEQ ID NO: 1), wohingegen die ursprünglich kartierte Stelle keine detektierbare Startsequenz für die Translation aufwies.
  • Zusätzlich legte ein Bericht (Murphy, 1991) nahe, dass diese kurze Form von Gam, GamS genannt, alle RecBCD inhibitorischen Aktivitäten des in vivo Gam-Genprodukts aufwies. Aus diesen Gründen entschieden wir uns dafür, die kurze Form von Gam zu klonieren und zu versuchen, daraus Protein zu exprimieren.
  • Die Primer DE230 (SEQ ID NO: 2) (5'-GGGAGGCCATGGATATTAATACTGAAACTGAG) und DE231 (SEQ ID NO: 3) (5'-GGGAGGAGATCTTTATACCTCTGAATCAATATCAACC) wurden verwendet um per PCR das Lambda Gam-Gen aus pKD46 zu amplifizieren. Das PCR-Fragment wurde mit Ncol- und Bgl II-Stellen verdaut und in pBAD-HisA, das mit denselben Enzymen geschnitten wird, eingeführt. Das produzierte Konstrukt, pLDE129 enthielt Gam unter der Steuerung des pBAD-Promotors, der eine manipulierte optimale Shine-Dalgarno-Sequenz (AGGAGGAATTAACC) (SEQ ID NO: 4) verwendete.
  • GamS wurde wie oben für Gam beschrieben unter Verwendung der Primer DE255 (5'-GGGAGGCCATGGGAAACGCTTATTACATTCAGGATCGTCTTG) (SEQ ID NO: 5) und DE231 (SEQ ID NO: 3) (5'-GGGAGGAGATCTTTATACCTCTGAATCAATATCAACC) kloniert. Das Endkonstrukt pLDE136 wurde in DH10B (Life Technologies) eingeführt und auf Expression untersucht. Diese Zellen exprimierten signifikante Niveaus eines Proteins mit einem apparenten Molekulargewicht von 12 kD, genau wie für GamS erwartet. Extrakte in kleinem Maßstab wurden wie zuvor beschrieben hergestellt und im Fall von GamS erschien das gesamte Protein in der löslichen Fraktion.
  • pLDE129 wurde in E. coli DH10B, gezüchtet auf eine OD600 von 0,6 bei 37°C, eingeführt und mit 0,2% Arabinose induziert. Nach 3-ständiger Induktion wurde 0,05 OD Zellen entfernt und SDS-PAGE Analyse auf einem 4–12%igen NuPage-Gel neben 0,05 OD nicht induzierter Zellen unterzogen. Gam exprimierende Zellen produzierten eine signifikante Proteinbande bei einem apparenten Molekulargewicht von 17 kD, was der vorhergesagten Größe von Gam (16,3 kD) ziemlich genau entsprach. Eine 2 ml induzierte Kultur von Gam wurde zentrifugiert und die Zellen wurden bei –80°C tiefgefroren, aufgetaut und in 0,4 ml Extraktpuffer (50 mM Na-Phosphat, pH 7,0, 10% Glycerin) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden zwei Mal für 30 Sekunden unter Verwendung einer 1/8-Zoll-Sonde bei 50% Leistung sonifiziert, NaCl wurde zu einer abschließenden Konzentration von 0,5 M hinzugefügt und der Extrakt wurde durch Zentrifugation geklärt. Geklärter Extrakt und unlösliche Pelletfraktionen wurden einer Elektrophorese unterzogen und mit Gesamtzellextrakt verglichen. Obwohl Gram in signifikanten Mengen in den Gesamtzellextrakten vorhanden war, enthielt der lösliche Extrakt kein detektierbares Gam-Protein. Stattdessen befand sich fast die gesamte Menge an Protein in der unlöslichen Pelletfraktion.
  • BEISPIEL 3
  • Aktivitäts-Assay für Gam-vermittelte RecBCD-Hemmung
  • Zur in vitro Untersuchung von Gam wurde ein radioaktiver Assay entwickelt. Kurz zusammengefasst wird eine doppelsträngige, einheitlich markierte DNA als Substrat für RecBCD-Aktivität verwendet, und zwar unter Einsatz von gereinigtem RecBCD Protein (Plasmid- Safe ExoV, Epicentre). Gam-Protein wird mit RecBCD und ATP vorinkubiert und dann zu der DNA hinzugefügt. Nach einem Inkubationszeitraum wird die Mischung an GFB-Filter gebunden, gewaschen um kleine DNA-Fragmente zu entfernen und auf dem Filter verbleibende Zerfälle werden bestimmt. Durch den Vergleich mit der Anzahl an verbleibenden Zerfällen unter Verwendung von RecBCD ohne Vorinkubation mit Gam kann die prozentuelle Hemmung bestimmt werden.
  • Wie in 1 gezeigt wurden 0, 1,5 oder 30 Einheiten (U) GamS mit einer Einheit gereinigtem RecBCD (Plasmid-Safe, Epicentre) in 100 μl 1x Plasmid-Safe Puffer und 10 mM ATP für einen Zeitraum von 10 Minuten bei 37°C inkubiert. 50 fmol von intern mit 32P markiertem Exonukleasesubstrat wurden hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 37°C für 30, 60, 90 oder 120 Minuten fortgesetzt. Die Reaktionen wurden durch das Hinzufügen von 100 μl Filter-bindenden Puffers (6 M Guanidin, 100 mM MES) gestoppt und bis zur Vervollständigung aller Reaktionen auf Eis gelagert. Reaktionsmischungen (150 μl) wurden auf Millipore GF/B Filter gespottet, 3x mit 200 μl 80%igem Ethanol gewaschen, getrocknet, in 4 ml Scintisafe-F gelegt und Zerfall für 1 Minute ermöglicht. GamS hemmt den Abbau des Substrats in einer von der Konzentration abhängigen Art und Weise.
  • Wie in 2 gezeigt wurden 0,5 oder 5 Einheiten GamS mit 1 μl (ungefähr 40 μg) zellfreiem Extrakt in 100 μl 1x Plasmid-Safe Puffer und 10 mM ATP für einen Zeitraum von 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Exonuklease-Assays wurden wie in der Legende zu 1 beschrieben durchgeführt. Der Prozentsatz an verbliebener DNA wurde durch Teilen der Anzahl an gebundenen Zerfällen in jedem Assay durch die Anzahl an gebunden Zerfällen in Kontrollen, die keinen zellfreien Extrakt aufweisen, bestimmt.
  • BEISPIEL 4
  • Reinigung von GamS
  • Eine Übernachtkultur von pLDE136 wurde in 15 ml LB-Amp in einem 50 ml Kolben verdünnt und zu einer OD von 0,6 bei 37°C gezüchtet. Arabinose wurde zu einer abschließenden Konzentration von 0,2% hinzugefügt und die Zellen wurden für weitere 3 Stunden gezüchtet, bevor sie geerntet wurden. Das Pellet wurde tiefgefroren, aufgetaut, in 500 μl Extraktpuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 10% Glycerin, 500 mM NaCl) resuspendiert, zweimal für 30 Sekunden unter Verwendung einer 1/8-Zoll-Sonde bei 50% Leistung sonifiziert und durch Zentrifugation geklärt. Vor der Chromatographie wurde die Probe auf 100 mM NaCl verdünnt. Eine 1 ml Hitrap-MonoQ Säule (Pharmacia) wurde mit 10 ml Puffer B (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 10% Glycerin, 1 M NaCl, 1 mM DTT) und anschließend mit 10 ml Puffer A (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 10% Glycerin, 1 mM DTT) equilibriert und anschließend gründlich mit 10% Puffer B gewaschen. Der Extrakt wurde bei 10% Puffer B bei einer Flussrate von 0,5 ml/min geladen, mit 10% Puffer B bei 0,5 ml/min für 15 SV gewaschen und mit einem 20 SV Gradienten von 10%–70% Puffer B bei 0,25 ml/min eluiert. Jeweils nach 0,5 ml wurden Fraktionen gesammelt. GamS eluierte in 3 Hauptfraktionen bei einer Salzkonzentration von ungefähr 400 mM. Diese Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und in einen einzelnen MonoQ-Pool gepoolt. Die Reinheit dieses Pools wurde durch Coommassie-Färbung auf 70–80% geschätzt.
  • BEISPIEL 5
  • Assay von partiell gereinigtem GramS
  • Der GamS MonoQ-Pool wurde gemeinsam mit den Gam-Extrakten in einem Assay untersucht, um die Mengen an vorhandener Aktivität zu bestimmen. Der MonoQ-Pool hatte 25–30 E/μl Aktivität und die Proteinkonzentration betrug 194 ng/μl, was einen spezifischen Aktivitätswert zwischen 160–200 U/μg an tatsächlichem GamS-Protein (vorausgesetzte Reinheit 75–80%) ergab. Auf der Basis von Aktivitäts-Assays des Extrakts ging sehr wenig Aktivität über die MonoQ-Säule verloren und alle Verluste waren höchstwahrscheinlich durch herkömmliches Pooling verursacht. Aliquoten von Extrakten von Gam ganzer Länge zeigten nach genauerer Kontrolle der SDS-PAGE-Gels ein niedriges, aber detektierbares Aktivitätsniveau und eine kleine Menge an löslichem Gam ganzer Länge wurde gefunden. Diese lösliche Menge steht wahrscheinlich für eine beliebige für Gam ganzer Länge beobachtete Aktivität.
  • BEISPIEL 6
  • Stabilisierung von linearer DNA gegenüber gereinigter RecBCD und in E. colizellfreiem Extrakt in der Anwesenheit von Gam
  • Die Analyse von Extrakten, die frei von E. coli Zellen waren, unter Verwendung des radioaktiven Exonuklease-Assay zeigte, dass es signifikante Niveaus an RecBCD-ähnlicher Exonuklease-Aktivität in den Extrakten gibt (ungefähr 0,4 Einheiten/μl Extrakt). Dank der Zugabe von gereinigtem GamS zu dem Extrakt wurde der Großteil des Substrats vor Abbau geschützt. 20% des Substrats wurden allerdings selbst bei optimalen Niveaus von GamS abgebaut. Das legt nahe, dass der Extrakt mindestens einige andere Nukleasen enthält, die durch die Anwesenheit von GamS nicht gehemmt werden. Dieses Ergebnis wurde weiter durch bei längeren Inkubationszeiten durchgeführte Experimente bestätigt. Es wurde gezeigt, dass lineare DNA (PCR-Fragment) in der Anwesenheit von GamS für Inkubationszeiträume von bis zu 4 Stunden vollständig gegenüber gereinigter RecBCD geschützt werden kann (1). In Versuchen, in denen GamS und Rohextrakte beteiligt sind, führt eine Verlängerung der Inkubationszeit unabhängig von den Niveaus an hinzugefügtem GamS zum Abbau von mehr Substrat. Nach 30 Minuten sind noch 80% des Substrats, nach 2-ständiger Inkubation nur noch 30% des Substrats geschützt (2). Deshalb ist es wahrscheinlich, dass andere E. coli Nukleasen (wie ExoIII, ExoVIII, EndoIV und doppelsträngige, DNA-spezifische Nukleasen) ebenfalls auf die lineare DNA wirken, was zum Ergebnis hat, dass kein voller Schutz erzielt wurde. Deshalb wird erwartet, dass Mutationen oder Hemmung eines beliebigen oder aller dieser Gene nützlich sind, wenn es um den Schutz des Templates für längere Zeiträume geht.
  • BEISPIEL 7
  • Gesteigerte Proteinproduktion unter Verwendung linearer DNA in dem zellfreien Extrakt in Anwesenheit von Gam
  • Zellfreie in vitro Transkription-Translation-Reaktionen (50 μl) wurden wie oben beschrieben unter Verwendung von entweder einem supercoiled Plasmid DNA-Template oder einem PCR-Produkttemplate (50 ng) hergestellt. Jedes Template kodiert für das Cat-Gen unter der Steuerung des T7-Promoters. Das PCR-Produkt wurde direkt aus dem supercoiled Plasmid hergestellt. GamS-Protein (200 ng) wurde zu E. coli Extrakt hinzugefügt und für 2 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert und anschließend zu den Reaktionen hinzugefügt. Die Reaktionen wurden bei 37°C für einen Zeitraum von 2 Stunden durchgeführt. Um die Reaktionen zu löschen, wurde RNase A (5 μg) hinzugefügt und die Reaktionen wurden bei 37°C für einen Zeitraum von 15 Minuten inkubiert. Die Reaktionen (5 μl) wurden auf GFC Filter gespottet, 1x in 10%iger Trichloressigsäure, 2x in 5%iger Trichloressigsäure und 1x in Methanol gewaschen. Die Filter wurden getrocknet, in 4ml Scintisafe-F gelegt und Zerfall für eine Dauer von 1 Minute ermöglicht. Die Menge (pmol) an eingebautem Methionin für jede Probe ist ein Maß der Proteinsynthese.
  • Zellfreie Proteinsynthese wurde in Anwesenheit oder Abwesenheit von GamS-Protein verfolgt. Supercoiled Plasmid-DNA oder PCR-Produkte, die ein CAT-Gen unter Steuerung des T7-Promotors enthalten, wurden als Substrate für die Proteinsynthese verwendet. In Abwesenheit von Gam-Protein reduziert sich die Ausbeute von einem PCR-Produkt DNA-Template (um das 2-fache) im Vergleich zu der Ausbeute von einem supercoiled DNA-Plasmid-Template. Das Hinzufügen von GamS-Protein zu der Reaktion hat keine Auswirkung auf die Synthese aus dem supercoiled Template. Dennoch führt GamS dazu, dass die Proteinproduktion aus dem PCR-Produkt DNA-Template wieder auf ein mit dem bei dem supercoiled DNA-Template beobachteten Niveau vergleichbares Niveau gebracht wird (3).
  • BEISPIEL 8
  • Steigerung von Proteinsynthese in RNase E Deletionsmutante
  • Wie oben beschrieben ist die Stabilität von mRNA ein wichtiger Faktor bei der in vivo oder in vitro Produktion von mehr als einem Protein. Deshalb könnte die Inaktivierung von einer oder mehr als einer RNase dazu führen, dass die Halbwertszeit von mRNA erhöht wird, was wiederum eine Steigerung bei der Produktion von Proteinen zur Folge haben könnte. In E. coli sind die Transkription und Translation koordiniert und das Ribosom bindet frisch synthetisierte mRNA sobald die Ribsom-Bindungsstelle exponiert wird (Stent, G. S., Proc. R. Soc., 164: 181–197, (1966); Steitz, J. A, Nature, 224: 957–964, (1969); Miller et al, Science : 169: 392–395, (1970).
  • Der T7-Promoter, einer der stärksten Promotoren in E. coli, wurde häufig für die Expression von Proteinen verwendet. Mit dem T7-Promoter wird die mRNA jedoch ungefähr 8 Mal schneller als mit nativer Polymerase hergestellter mRNA und ebenfalls 8 Mal schneller als die Translation der Botschaft auf das Ribosom. Dies führt zu einer Situation, in der mRNA Ribosom-freie Teile aufweist und somit zu einem Ziel für RNase E (lost et al, J. Bacteriol. 174: 619–622; Makarova et al, PNAS, 92: 12250–12254, (1995)) werden kann. Aus diesem Grund schlossen die Autoren, dass die Expression eines Proteins pro Transkript niedriger ist, wenn der T7-Promotor verwendet wird. Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung zur in vitro Proteinsynthese besteht in der Verwendung einer modulierten Polymerase, welche die in Entstehung befindliche mRNA in dem zellfreien System schützt und erhält. Mutierte T7-Polymerasen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Siehe zum Beispiel, Bonner et al, EMBO J., 11: 3767–3775, (1992).
  • Vor nicht allzu langer Zeit berichteten Lopez et al, (Mol. Microbiol. 33: 188–199, (1999)), dass die Proteinsynthese pro Transkript in vivo erhöht werden konnte, wenn ein E. coli Stamm mit einer Mutation in RNase E als Wirt für die Expression verwendet wurde. Bei in vitro Transkription-Translation-Systemen wird der T7-Promotor häufig anstelle des nativen E. coli Promotors und der nativen Polymerase verwendet. Deshalb wurde untersucht, ob aus einer RNase E-Mutante von E. coli hergestellter zellfreier Extrakt auch unter Verwendung des anderen Promotor-Systems die Synthese von Proteinen fördert. Die Proteinexpression aus vier verschiedenen Plasmid-Templates, von denen jedes den T7-Promotor enthielt, wurde unter Verwendung von zellfreiem Extrakt, der sowohl aus einem RNase E mutantem Stamm als auch aus einem Wildtyp-Stamm hergestellt wurde, untersucht. Unsere Ergebnisse wie unten beschrieben deuten darauf hin, dass der zellfreie Extrakt von RNase E mutantem E. coli die Proteinsynthese bis zu um das 6-fache, verglichen mit Wildtyp E. coli, (Tabelle 1 und 4) erhöhte. Es scheint deshalb, dass die Koordination von Transkription, Translation und enzymatischem Abbau die Effizienz der Proteinsynthese verbessern kann.
  • Zellfreie in vitro Transkription-Translation-Reaktionen wurden unter Verwendung von drei unabhängigen supercoiled Plasmid DNA-Templates durchgeführt. Diese Templates kodieren unter der Steuerung des T7-Promotors jeweils für ein Säugetierprotein, Gus, v-Raf oder tTak. Jedes Template wurde unter Verwendung von Extrakten, die sowohl aus den Wildtyp- (BL21-ERP) als auch RNase E-Stämmen (BL21-Star, Invitrogen Corp.) hergestellt wurden, untersucht. Zwei Mengen jedes DNA-Templates wurden untersucht (500 ng und 100 ng). Die Menge (pmol) an eingebautem Methionin wird für jede Probe als Maß der Proteinsynthese gezeigt. Tabelle 1 RNase E Deletion steigert die Proteinsynthese in IVTT-Reaktionen
    Template pmol Met eingebaut RNase E+ pmol Met eingebaut RNase E– -fache Steigerung
    Gus 500ng 100ng 455 50 1194 279 2,6 5,6
    v-Raf 500ng 100ng 1700 810 2318 1657 1,4 2,0
    tTak 500ng 100ng 505 25 449 144 1,0 5,7
  • Um zu untersuchen, ob die gesteigerte Proteinsynthese aus dem RNase E mutanten Stamm im Zeitverlauf kontinuierlich ist, wurde ein Zeitverlauf-Versuch durchgeführt. Die Expression von zwei Proteinen, B-Gal und Gus, wurde nach 1, 2, 3 und 4 Stunden gemessen. Zellfreie in vitro Transkription-Translation-Reaktionen (100 μl) wurden wie oben beschrieben unter Verwendung von Extrakt, der entweder aus dem RNase E mutanten Stamm BL21-Star (Invitrogen Corp, Carlsbad, California) oder einem Wildtyp-Stamm (BL21-ERP) hergestellt wurde, präpariert. Die Reaktionen enthielten supercoiled Plasmid-DNA-Templates (1 μg), die unter der Steuerung des T7-Promotors entweder für das B-Gal- oder Gus-Gen kodierten. Die Reaktionen wurden bei 37°C inkubiert und Aliquoten (20 μl) wurden aus jeder Reaktion nach 1, 2, 3 und 4 Stunden entfernt und durch Behandlung mit RNase A gelöscht. Die Aliquoten wurden bis zur Vollständigkeit aller Reaktionen auf Eis gelagert. Proben wurden wie oben in Beispiel 7 beschrieben bearbeitet. Die Menge (pmol) an eingebautem Methionin für jede Probe ist ein Maß der Proteinsynthese.
  • Die Ergebnisse zeigen an, dass die Expression von Protein höher ist, wenn der RNase E mutante Stamm verwendet wird, als bei der Verwendung eines Wildtyp-Stammes und diese Wirkung bleibt im Zeitverlauf gesehen konstant. Des Weiteren scheint die Proteinexpression nach nur 1 Stunde ihren Höhepunkt erreicht zu haben, da zu späteren Zeitpunkten keine signifikante Steigerung der Expression beobachtet werden konnte (4).
  • RNase I und RNase E sind nicht die einzigen RNasen, die RNAs abbauen. Eine Anzahl an RNasen wirkt auf RNA (Linn and Deutscher: Nucleases, 455–468, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1993)). Die aktuellen Daten zeigen, dass Mutation(en) oder Hemmung von jeder beliebigen dieser RNasen auch vorteilhaft sein konnte(n).
  • BEISPIEL 9
  • Duale Energiequelle für die gesteigerte Proteinsynthese
  • Die biochemische Energiequelle in einem in vitro Proteinsynthesesystem stammt von der Hydrolyse von Triphosphaten, deren Konzentration durch ein Energieregenerationssystem aufrecht erhalten wird. Zu den üblicherweise verwendeten Verbindungen zählen Creatinphosphat für eukaryotische Systeme und Phosphoenolpyruvat (PEP) für bakterielle Systeme. In manchen Fällen wurde Acetylphosphat verwendet (Ryabova et al, Anal. Biochem., 226, 184–186, (1995)). Im Acetylphosphatasesystem wurde gezeigt, dass das Niveau an ATP zwei Mal so lange wie in einem PEP-System beibehalten werden kann. Es wurde gefunden, dass die optimale Konzentration von Acetylphosphat im Hinblick auf die Proteinsynthese bei ungefähr 25–30 mM lag. Es wurde gefunden, dass der Zusatz von höherer Konzentration, wie z.B. 40 mM, hemmende Wirkung hatte. Zur Bestimmung der Wirkung auf die Proteinsynthese wurde Acetylphosphat in IVTT-Reaktionen in Abwesenheit oder Anwesenheit von PEP titriert.
  • Zellfreie in vitro Transkription-Translation-Reaktionen wurden unter Verwendung von 750 ng supercoiled Plasmid DNA, die für das durch den T7-Promotor gesteuerte CAT-Gen kodierte, durchgeführt. Acetylphosphat wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit von 30 mM PEP in die Reaktionen (0,1 mM bis 60 mM) titriert. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 50 μl. Die Reaktionen wurden bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die Reaktionen wurden mit RNase A gelöscht und mit Trichloressigsäure wie für 3 beschrieben präzipitiert. In diesem Protokoll ist überraschenderweise keine Hemmung der Proteinsynthese beobachtet, zumindest nicht bis zu 60 mM Acetylphosphat (5).
  • Mit der Erhöhung der Konzentration von Acetylphosphat ging eine annähernde lineare Steigerung der Proteinsynthese einher. Der Zusatz von Acetylphosphat alleine stimuliert die Proteinsynthese bis zu einem Niveau, das mit dem bei der Verwendung von PEP alleine beobachteten Niveau vergleichbar ist. Des Weiteren wird durch die Zugabe von Acetylphosphat in Kombination mit PEP die Proteinproduktion um das Zweifache erhöht. Somit gibt es anscheinend eine besonders vorteilhafte Wirkung auf die Proteinsynthese, wenn sowohl PEP als auch Acetylphosphat zu IVTT-Reaktionen hinzugefügt werden.
  • Um die Wirkung von Acetylphosphat im Zeitverlauf zu zeigen, wurde ein Zeitverlauf-Versuch durchgeführt. CAT-Protein wurde in IVTT-Reaktionen, die 30 mM PEP und/oder 60 mM Acetylphosphat enthielten, synthetisiert. Zur Kontrolle wurden Reaktionen auch ohne exogene Energiequelle durchgeführt. Reaktionen wurden wie oben beschrieben unter Verwendung von 750 ng des T7-CAT-Plasmids hergestellt.
  • Proben wurden wie oben in Beispiel 7 beschrieben bearbeitet. Die Menge (pmol) an eingebautem 35S-Methionin für jede Probe wurde zur Quantifizierung der Proteinsynthese verwendet. Wie in 6 ersichtlich zeigen die Ergebnisse, dass die Anwesenheit von Acetylphosphat die Proteinsynthese steigert, wenn dieses zu PEP-enthaltenden Reaktionen hinzugefügt wird. Diese Wirkung wurde über die gesamten vier Stunden, in denen der Versuch durchgeführt wurde, beobachtet.
  • Mit Hinblick auf die obige Beschreibung, Beispiele und zugehörigen Figuren der vorliegenden Erfindung ist der Fachmann hiermit in der Lage, die Erfindung wie hierin beschrieben umzusetzen und die vorliegende Erfindung in Übereinstimmung mit dem Stand der Technik zu modifizieren, um denselben innerhalb eines großen Bereichs an unterschiedlichen Bedingungen umzusetzen, ohne dabei den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu beeinflussen. Sequenzprotokoll
    Figure 00420001
    Figure 00430001
    Figure 00440001

Claims (36)

  1. Ein System zur in vitro Synthese zur Herstellung eines Proteins oder einer Nukleinsäure aus einem Nukleinsäure-Template, das einen Extrakt aus einer bakteriellen Zelle umfasst, wobei diese Zelle eine Mutation aufweist, die zu reduzierter Aktivität von zumindest einer Nuklease führt, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Extrakt durch Hinzufügen von Gam-Protein modifiziert wird.
  2. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Gam-Protein um lösliches Gam-Protein handelt.
  3. Das System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Template um ein DNA-Template und bei der Nuklease um eine DNase handelt.
  4. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der DNase um DNA-Exonuklease handelt.
  5. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der DNase um DNA-Endonuklease handelt.
  6. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 5, wobei es sich bei der DNA-Endonuklease um Endonuklease A handelt.
  7. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Nuklease um eine RNase handelt.
  8. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei der RNase um eine RNA-Exonuklease handelt.
  9. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei der RNase um eine RNA-Endonuklease handelt.
  10. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 9, wobei es sich bei der Endonuklease um RNase E handelt.
  11. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 9, wobei es sich bei der Endonuklease um RNase I oder RNase I* handelt.
  12. Ein System zur in vitro Synthese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das des Weiteren mindestens ein Nukleinsäure-Template ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem DNA-Template und einem RNA-Template umfasst.
  13. Ein System zur in vitro Synthese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das zumindest ein DNA-Template umfasst und wobei es sich bei dem System zur in vitro Synthese um ein in vitro Transkriptions-/Translationssystem handelt.
  14. Ein System zur in vitro Synthese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das zumindest zwei hinzugefügte Energiequellen umfasst, die energiereiche Triphosphat-Verbindungen generiert oder regeneriert.
  15. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 14, das zumindest zwei hinzugefügte Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pyruvat, Phosphoenolpyruvat (PEP), Carbamoylphosphat, Acetylphosphat, Creatinphosphat, Phosphopyruvat, Glyceraldehyd-3-Phosphat und Glucose-6-Phosphat umfasst.
  16. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 15, das hinzugefügtes Acetylphosphat umfasst.
  17. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 16, das des Weiteren hinzugefügtes Phosphoenolpyruvat umfasst.
  18. Ein System zur in vitro Synthese gemäß Anspruch 17, das ungefähr 30 mM Phosphoenolpyruvat und ungefähr 60 mM Acetylphosphat umfasst.
  19. Ein System zur in vitro Synthese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Extrakt aus der Zelle bezüglich der Aktivität von zumindest einem Enzym ausgewählt aus der Liste bestehend aus OmpT, RNase E, Alkaliner Phosphatase und Endonuklease I reduziert ist.
  20. Ein System zur in vitro Synthese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zellextrakt aus einer Escherichia coli Zelle stammt.
  21. Eine Zusammensetzung, die folgendes umfasst: a. einen Extrakt aus einer bakteriellen Zelle, wobei diese bakterielle Zelle zumindest eine Mutation aufweist, die zu reduzierter Aktivität einer Nuklease führt, b. zumindest zwei hinzugefügte Energiequellen, welche die chemische Energie für die Synthese bereit stellen c. hinzugefügtes Gam-Protein.
  22. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 21, die des Weiteren zumindest ein Nukleinsäure-Template in Anwesenheit von zumindest einem partiellen Syntheseprodukt des Templates umfasst.
  23. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei es sich bei dem Produkt um ein Nukleinsäureprodukt handelt.
  24. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 23, wobei es sich bei dem Nukleinsäureprodukt um DNA handelt.
  25. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 23, wobei es sich bei dem Nukleinsäureprodukt um RNA handelt.
  26. Ein Kit für in vitro Synthese, das folgendes umfasst: a. einen Extrakt aus einer bakteriellen Zelle, wobei diese bakterielle Zelle zumindest eine Mutation aufweist, die zu reduzierter Aktivität einer Nuklease führt. b. hinzugefügtes Gam-Protein c. ein oder mehr als ein Reagens, ausgewählt aus der Liste bestehend aus Nukleotiden oder Derivaten von Nukleotiden, zumindest einer Polymerase, zumindest einem Co-Faktor, zumindest einem Puffer oder Puffersalz, zumindest einer Energiequelle für die Synthese, zumindest einem Nukleinsäure-Template, zumindest einem Reagens, um die Effizienz des Kits zu bestimmen.
  27. Ein Kit gemäß Anspruch 26, das zumindest zwei oder mehr als zwei Energiequellen für die Synthese umfasst.
  28. Ein Verfahren zur Herstellung von Protein oder Nukleinsäure aus einem Nukleinsäure-Template in einem in vitro System, das folgendes umfasst: Kontaktieren des Templates mit a. zumindest einem Extrakt aus einer bakteriellen Zelle, wobei diese Zelle eine Mutation aufweist, die zu reduzierter Aktivität von zumindest einer Nuklease führt, b. Gam-Protein; und c. zumindest zwei hinzugefügten Energiequellen, welche die chemische Energie für die Synthese bereit stellen; wobei eine Mischung gebildet wird; und Inkubieren dieser Mischung unter Bedingungen, die ausreichen, um zumindest ein durch das Template kodiertes Protein herzustellen.
  29. Ein Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die zumindest eine Nuklease ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus RNAse E, RNAse I und Endonuklease I.
  30. Ein Verfahren gemäß Anspruch 28 oder Anspruch 29, wobei es sich bei dem Gam-Protein-Inhibitor um lösliches Gam-Protein handelt.
  31. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei jede der zumindest zwei hinzugefügten Energiequellen energiereiche Triphosphatverbindungen für die Proteinsynthese generiert oder regeneriert.
  32. Ein Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die zumindest zwei hinzugefügten Energiequellen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Pyruvat, Phosphoenolpyruvat (PEP), Carbamoylphosphat, Acetylphosphat, Creatinphosphat, Phosphopyruvat, Glyceraldehyd-3-Phosphat und Glucose-6-Phosphat.
  33. Ein Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei es sich bei den zumindest zwei hinzugefügten Energiequellen um Phosphoenolpyruvat und Acetylphosphat handelt.
  34. Ein Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei die zumindest zwei hinzugefügten Energiequellen ungefähr 30 mM Phosphoenolpyruvat und ungefähr 60 mM Acetylphosphat umfassen.
  35. Das Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das Enzym ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Nuklease, einer Phosphatase und einer Polymerase.
  36. Ein Verfahren zur Konstruktion eines Systems zur in vitro Synthese wie in einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 20 beansprucht, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Erhalten von zumindest einem bakteriellen Extrakt, der eine Mutation aufweist, die zu reduzierter Aktivität von zumindest einer Nuklease führt; und Hinzufügen von Gam-Protein und zumindest zwei Energiequellen, welche die chemische Energie für die Synthese bereit stellen, zu diesem bakteriellen Zellextrakt.
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