JPWO2002031192A1 - プローブ自己集合体の作製方法及びその検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一対のオリゴヌクレオチドからなる複数のダイマー形成用プローブ、そのダイマー形成用プローブによる自己集合体の作製方法、形成された自己集合体、及び形成させた自己集合体の検出方法に関する。
背景技術
お互いに相補的な部分がn(n≧3)カ所の数から構成される一対のプローブ(以下、HoneyComb Probe:HCPと称することがある。)の複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、2本鎖の自己集合体を形成させるプローブ自己集合体の作製方法(USP6,261,846、特開2000−201687号、及び特願2000−98797号、以下、PALSAR(Probe alternation link self−assembly reaction)法と称する。)では、一対のオリゴヌクレオチド・プローブだけで互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせて、2本鎖の自己集合体形成によりターゲット遺伝子を検出したが、使用するオリゴヌクレオチド・プローブが2本しかないために、ターゲット遺伝子を検出するために利用するオリゴヌクレオチド・プローブの領域、及び蛍光色素や酵素、又は抗体を標識する領域に限界があった。
また、2本のオリゴヌクレオチド・プローブが互い違いに反応することから、それぞれの領域が競合することになり、自己集合体の形成に多少の反応時間が必要であった。
PALSAR法で使用する一対のオリゴヌクレオチド・プローブでは、一対のオリゴヌクレオチド・プローブだけで互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせ、2本鎖の自己集合体を形成させていた。
本発明では、一対のオリゴヌクレオチド・プローブだけでなく、それぞれのオリゴヌクレオチド・プローブをあらかじめ複数のダイマープローブとして作製しておき、その種類を増やすことにより、今までよりもさらに自己集合体形成の反応時間を短縮することを可能にし、且つ、ターゲット遺伝子を検出するために利用できるオリゴヌクレオチド・プローブの領域を増やし、蛍光色素や酵素、又は抗体を標識する領域の増加を可能にした新しいプローブ自己集合体作製方法及びその自己集合体作製方法によって形成された自己集合体の検出方法を提供することを目的とする。
近年の遺伝子診断技術では、目的の遺伝子を検出するためにEIAと呼ばれるエンザイム・イムノ・アッセイや蛍光標識法に代表される様々な手法が用いられているが、いずれの方法においても高価な酵素や抗体、及び蛍光標識物質と煩雑な操作を必要としていた。
発明の開示
上記課題を解決するために、本発明の自己集合体の作製方法の第一の態様として、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系及び第2の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第1の系及び第2の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
本発明の自己集合体の作製方法の第二の態様として、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系及び第2の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第1の系及び第2の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドを自己集合させ、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
本発明の自己集合体の作製方法の第三の態様として、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第1番目の系から第n番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
本発明の自己集合体の作製方法の第四の態様として、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第1番目の系から第n番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
上記ダイマー形成用プローブの3つの領域の端部に、少なくとも1つのG(グアニン)またはC(シトシン)を配置させ、ダイマー形成用プローブがハイブリダイズした際に少なくとも1つのG−C結合を領域の端部に形成させることにより、安定した2本鎖の自己集合体を形成させることが可能となる。
上記ダイマー形成用プローブを構成する核酸は、通常DNA又はRNAで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸(PNA、WO 92/20702)やLocked Nucleic Acid(LNA、Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54,3607−3630.,Koshkin AA et al.J.Am.Chem.Soc.1998.120,13252−13253.,Wahlestedt C et al.PNAS.2000.97,5633−5638.)が挙げられる。また、一対のダイマー形成用プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばDNAプローブとRNAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はDNA、RNAまたは核酸類似体(たとえばPNAやLNA等)から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばDNAのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、DNAとRNAから構成されるプローブ(キメラプローブ)を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
上記複数対のダイマー作製用プローブのハイブリダイゼーションは、あらかじめ一対のダイマー作製用プローブによりダイマープローブを形成させた後、各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることが好ましい。
本発明の自已集合体は、上記自己集合体の作製方法によって形成されるものである。本発明の自己集合体作製方法で形成される自己集合体は、その塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることから、260nmにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認することが可能である。さらには、自己集合体の塩基の積み重ねの間に安価な蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認できるために、今までになく低コストでしかも簡便に遺伝子を検出することができる経済効果に優れた技術である。
本発明の自己集合体の検出方法の第一の態様は、上記自己集合体の作製方法で形成した自己集合体の紫外線に対する光化学的な吸収の変化を利用して上記自己集合体の存在を検出することを特徴とする。
本発明の自己集合体の検出方法の第二の態様は、上記自己集合体の作製方法で形成した自己集合体の塩基対に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする。
本発明のダイマー形成用プローブの第一の態様は、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系及び第2の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領城と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有することを特徴とする。
本発明のダイマー形成用プローブの第二の態様は、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系及び第2の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有することを特徴とする。
本発明のダイマー形成用プローブの第三の態様は、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有することを特徴とする。
本発明のダイマー形成用プローブの第四の態様は、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有することを特徴とする。
上記ダイマー形成用プローブの3つの領域の端部に、少なくとも1つのG(グアニン)またはC(シトシン)を配置させることが好ましい。
上記ダイマー形成用プローブは、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成されるものである。
本発明のダイマープローブは、上記一対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより形成されるものである。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱しない限り種種の変形が可能なことはいうまでもない。
本発明は、一対のダイマー形成用プローブを複数組使用し、両者を等温で酵素不在の条件下で反応させることにより自己集合体を形成させるものである。使用するダイマー形成用プローブの本数は、特に限定されないが、102〜1015本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。pHも常用の範囲で好適であり、好ましくはpH7.0〜pH9.0の範囲のものが使用できる。反応温度は40〜90℃、好ましくは55〜65℃である。これら条件は特に限定されない。
本発明の構成をさらに具体的な例でいえば、一本のダイマー形成用プローブの各領域の長さ(塩基の数)は、同一であっても異なってもよい。
また、ダイマー形成用プローブの各領域の長さは、塩基数にして、少なくとも5塩基であり、好ましくは少なくとも8塩基、さらに好ましくは10塩基〜100塩基、さらに好ましくは15〜30塩基である。
以下に本発明に係るダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の例を述べる。
1.2組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第一の例。
図1(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)も上記のように構成される(図1(b))。
第1のダイマープローブ(α)と第2のダイマープローブ(β)は、図1及び図2(a)に示したように、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図2(b))。
2.2組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第二の例。
2組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第二の例として、図3(b)に示したように、第2の系のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチドとNo.2−オリゴヌクレオチドにおいて、3’側領域もしくは5’側領域の入れ替えが可能である。
第1の系のダイマープローブ(α)と第2の系のダイマープローブ(β’)は、図4(a)に示したように、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、β’のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、β’のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、β’のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、β’のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図4(b))。
3.n組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第1の例。
No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成する。
ダイマー形成用プローブは、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
(b)第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
(d)最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する。
上記におけるn=3の場合の例を、図5及び図6に示し、n=4の例を、図7及び図8に示す。
4.3組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第1の例。
図5(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)と第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)も上記のように構成される(図5(b)及び(c))。
第1の系のダイマープローブ(α)と第2の系のダイマープローブ(β)と第3の系のダイマープローブ(γ)は、図5及び図6(a)に示したように、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図6(b))。
5.4組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第1の例。
図7(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)、第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)及び第4の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(δ)も上記のように構成される(図7(b)〜(d))。
第1の系のダイマープローブ(α)、第2の系のダイマープローブ(β)、第3の系のダイマープローブ(γ)及び第4の系のダイマープローブ(δ)は、図7及び図8(a)に示したように、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、δのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
δのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図8(b))。
6.n組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第2の例。
No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成する。
ダイマー形成用プローブは、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
(b)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
(d)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する。
上記におけるn=3の場合の例を図9に、n=4の例を図10及び図11に、n=5の場合の例を図12及び図13にそれぞれ示す。
7.3組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第2の例。
図9(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)と第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)も上記のように構成される。
第1のダイマープローブ(α)、第2のダイマープローブ(β)、及び第3のダイマープローブ(γ)は、図9(a)に示したように、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.2オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図9(b))。
8.4組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第2の例。
図10(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)、第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)、及び第4の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(δ)も上記のように構成される(図10(b)〜(d))。
第1のダイマープローブ(α)、第2のダイマープローブ(β)、第3のダイマープローブ(γ)及び第4のダイマープローブ(δ)は、図10及び図11(a)に示したように、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.2オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図11(b))。
9.5組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第2の例。
図12(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)、第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)、第4の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(δ)及び第5の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(θ)も上記のように構成される(図12(b)〜(e))。
第1のダイマープローブ(α)、第2のダイマープローブ(β)、第3のダイマープローブ(γ)、第4のダイマープローブ(δ)、及び第5のダイマープローブ(θ)は、図12及び図13(a)に示したように、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.2オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、θのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、θのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
θのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
θのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図13(b))。
また、上記において、n個の系からなるn組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の例としては、n組のダイマープローブのハイブリダイゼーションは、図13(c)に示した如くの組み合わせにより、自己集合体を形成する。
ダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせる好適な方法として、あらかじめダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせてダイマープローブを形成させた後、各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、自己集合体を形成させる方法を上述したが、本発明に係る自己集合体の形成方法は、上記方法に限定されるものではなく、例えば、各系のダイマー形成用プローブを同時に反応させ、ハイブリダイゼーションさせることにより、自己集合体を形成させる方法等も含まれるものである。
さらに本発明は、ダイマー形成用プローブの3つの領域の端部に、少なくとも1つのG(グアニン)またはC(シトシン)を配置させ、ダイマー形成用プローブがハイブリダイズした際に、少なくとも1つのGとCの結合を領域の端部に形成させて、塩基の積み重ね(stacking of base)により塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、安定した二本鎖の自己集合体を形成させる方法である。
自己集合体の形成方法では、各領域における分岐点の結合力が弱いとその分岐点にはさまれている領域のハイブリダイゼーションが不安定になることから、領域全体の塩基のπ電子による特殊な相互作用から生じる塩基の積み重ね(stacking of base)効果の強さを増すことにより、各領域のハイブリダイゼーション反応をより強固にさせることを考案したものである。
上記の領域端部に配置されるCまたはGの数は少なくとも1塩基であり、複数個であっても差し支えない。各領域の塩基配列を考慮し適宜選択することができる。複数個のCまたはGを配置させる場合、C、Gの順序は特に限定されず自由に組み合わせることができる。
本発明は、本発明において形成される自己集合体の塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることから、260nmにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認する方法を可能にするものである。
さらには、本発明は、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認する方法を可能にするものである。例えば、自己集合体は、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発する色素を添加し、セフェイド社のI−CORETM(Smart CyclerTM)等を用いて蛍光の発光状態を観察することにより検出可能である。
また、一般的なアガロースゲル電気泳動法等によっても、形成された自己集合体を簡単に確認することができる。
実施例
以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例において用いたオリゴヌクレオチド・プローブ
(実験例1〜6)
1.目的
第1及び第2の系からなる二組の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成を確認した。
2.材料
(1)第1の系の一対のダイマー形成用プローブとして、No.1−プローブ及びNo.2−プローブを、第2の系の一対のダイマー形成用プローブとして、No.3−プローブ及びNo.4−プローブを作製した。各オリゴヌクレオチド・プローブは、それぞれ100pmolに調製したものを用いた。
(2)緩衝液として20×SSC(3M−NaCl,0.3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH7.0)を用いた。
3.方法
(実験例1〜4)ダイマー形成用プローブの調製
0.2mLのマイクロチューブにそれぞれ、オリゴヌクレオチド・プローブを1μL、20×SSCを12μL、H2Oを7μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。オリゴヌクレオチド・プローブは、実験例1では、No.1−プローブを、実験例2では、No.2−プローブを、実験例3では、No.3−プローブを、実験例4では、No.4−プローブをそれぞれ用いた。
上記の各反応溶液を、94℃30秒間加熱させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
(実験例5及び6)ダイマープローブの調製
実験例5では、0.2mLのマイクロチューブにNo.1−プローブを0.5μL、No.2−プローブを0.5μ、20×SSCを12μL、及びH2Oを7μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。
実験例6では、0.2mLのマイクロチューブにNo.3−プローブを0.5μL、No.4−プローブを0.5μL、20×SSCを12μL、及びH2Oを7μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。
上記各反応溶液を、94℃30秒加熱後、64℃で30分間反応させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
4.結果
結果を図17に示す。図17のアガロースゲル電気泳動の写真に示したように、実験例1〜4では、各ダイマー形成用プローブが、モノマーの状態であることが確認された(レーン1、2、4及び5)。実験例5では、図17のアガロースゲル電気泳動の写真に示したように、本発明による第1の系の一対のダイマー形成用プローブは、PALSAR法のオリゴヌクレオチド・プローブとは異なり自己集合体は形成せず、ダイマーのみを形成するオリゴヌクレオチド・プローブであった(レーン3)。同様に、実験例6では、第2の系の一対のダイマー形成用プローブは、PALSAR法のオリゴヌクレオチド・プローブとは異なり自己集合体は形成せず、ダイマーのみを形成した(レーン6)。
(実施例1)
1.目的
あらかじめ二組のダイマープローブを形成させて自己集合体の形成を確認した。
2.材料
(1)第1の系のダイマープローブ(α)として、実験例5にて形成させた第1の系のダイマーを、第2の系のダイマープローブ(β)として、実験例6にて形成させた第2の系のダイマーを、それぞれ用いた。
(2)緩衝液として20×SSC(3M−NaCl,0.3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH7.0)を用いた。
3.方法
0.2μLのマイクロチューブに第1の系のダイマープローブ(α)と第2の系のダイマープローブ(β)を0.5μLずつ加え、20×SSCを12μL、H2Oを7μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。
上記反応溶液を、各々52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃及び70℃にてそれぞれ30分反応させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
4.結果
図14の写真に示したように、PALSAR法に比べ、同じ反応時間であるにもかかわらず、広い範囲の温度領域において自己集合体の形成が確認された。このことは、反応時間の短縮も意味するものである。
(実施例2)
1.目的
4種のダイマー形成用プローブを同時に反応させて、自己集合体の形成を確認した。
2.材料
(1)第1の系のダイマー形成用プローブとして、No.1−プローブ及びNo.2−プローブを、第2の系のダイマー形成用プローブとして、No.3−プローブ及びNo.4−プローブを用いた。各オリゴヌクレオチド・プローブは、実験例1〜4にて調製したものを用いた。
(2)緩衝液として20×SSC(3M−NaCl,0.3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH7.0)を用いた。
3.方法
0.2μLのマイクロチューブにNo.1−プローブ、No.2−プローブ、No.3−プローブ及びNo.4−プローブを同時に0.5μLずつ加え、20×SSCを12μL、H2Oを6μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。
上記反応溶液を、各々52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃及び70℃にてそれぞれ30分反応させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
4.結果
図15の写真に示したように、自己集合体の形成が観察されたが、実施例1に比べ、52℃〜62℃の反応温度において、非特異的な反応が確認された。
(実施例3)
1.目的
第1、第2及び第3の系からなる3組の一対のダイマー形成用プローブを用いて、自己集合体の形成を確認した。実施例1及び実施例2において、プローブをあらかじめダイマーとしておいた場合においても、同時に添加した場合においても同じ反応温度での自己集合体の形成が確認されたため、本実施例においては、プローブのダイマーの種類を3組に増やして、同時に添加し同じ反応温度における自己集合体の形成を調べた。
2.材料
(1)第1の系のダイマー形成用プローブとして、X1−プローブ及びX2−プローブを、第2の系のダイマー形成用プローブとして、Y1−プローブ及びY2−プローブを、第3の系のダイマー形成用プローブとして、Z1−プローブ及びZ2−プローブを作製した。各オリゴヌクレオチド・プローブは、それぞれ100pmolに調製したものを用いた。
(2)緩衝液として20×SSC(3M−NaCl,0.3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH7.0)を用いた。
3.方法
0.2μLのマイクロチューブにX1−プローブ、X2−プローブ、Y1−プローブ、Y2−プローブ、Z1−プローブ及びZ2−プローブを同時に0.5μLずつ加え、20×SSCを18μL、H2Oを9μL加えて、計30μLの反応溶液を調製した。
上記の各反応溶液を、94℃30秒間加熱させた。
加熱後、上記反応溶液を、各々52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃及び74℃にてそれぞれ30分反応させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
4.結果
図16の写真に示したように、3組のダイマープローブを形成する、6種のダイマー形成用プローブを用いた場合においても、2組のダイマープローブを用いた実施例1及び実施例2の場合と同様、自己集合体の形成が観察された。
産業上の利用可能性
以上述べたごとく、本発明の自已集合体の作製方法によれば、従来の方法よりもさらに自己集合体形成の反応時間を短縮することができる。また、本発明の自己集合体の検出方法によれば、上記自己集合体の作製方法によって形成された自己集合体を容易に検出することが可能である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は本発明の自己集合体の作製方法における二組のダイマープローブの作製の1例を示す模式図であり、(a)は第1の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、及び(b)は第2の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成をそれぞれ示す。
図2は図1に示した二組のダイマープローブによる自己集合体の形成の1例を示す模式図であり、(a)は二組のダイマープローブ、及び(b)は形成された自己集合体をそれぞれ示す。
図3は本発明の自己集合体の作製方法における二組のダイマープローブの作製の別の例を示す模式図であり、(a)は第1の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、及び(b)は第2の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成をそれぞれ示す。
図4は図3に示した二組のダイマープローブによる自己集合体の形成の1例を示す模式図であり、(a)は二組のダイマープローブ、及び(b)は形成された自己集合体をそれぞれ示す。
図5は本発明の自己集合体の作製方法における三組のダイマープローブの作製の1例を示す模式図であり、(a)は第1の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、(b)は第2の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、及び(c)は第3の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成をそれぞれ示す。
図6は図5に示した三組のダイマープローブによる自己集合体の形成の1例を示す模式図であり、(a)は三組のダイマープローブ、及び(b)は形成された自己集合体をそれぞれ示す。
図7は本発明の自己集合体の作製方法における四組のダイマープローブの作製の1例を示す模式図であり、(a)は第1の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、(b)は第2の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、(c)は第3の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、及び(d)は第4の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成をそれぞれ示す。
図8は図7に示した四組のダイマープローブによる自己集合体の形成の1例を示す模式図であり、(a)は四組のダイマープローブ、及び(b)は形成された自己集合体をそれぞれ示す。
図9は本発明の自己集合体の作製方法における三組のダイマープローブによる自己集合体の形成の別の例を示す模式図であり、(a)は第1の系から第3の系まで形成された一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、及び(b)は3組のダイマープローブにより形成される自己集合体をそれぞれ示す。
図10は本発明の自己集合体の作製方法における四組のダイマープローブの作製の別の例を示す模式図であり、(a)は第1の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、(b)は第2の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、(c)は第3の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、及び(d)は第4の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成をそれぞれ示す。
図11は図10に示した四組のダイマープローブによる自己集合体の形成の1例を示す模式図であり、(a)は四組のダイマープローブ、及び(b)は形成された自己集合体をそれぞれ示す。
図12は本発明の自己集合体の作製方法における五組のダイマープローブの作製の1例を示す模式図であり、(a)は第1の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、(b)は第2の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、(c)は第3の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、(d)は第4の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成、及び(e)は第5の系の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成をそれぞれ示す。
図13は図12に示した五組のダイマープローブによる自己集合体の形成の1例を示す模式図であり、(a)は五組のダイマープローブ、(b)は形成された自己集合体、及び(c)はn個の系からなるn組のダイマープローブのハイブリダイゼーションの組み合わせの例をそれぞれ示す。
図14は実施例1の結果を示す写真である。
図15は実施例2の結果を示す写真である。
図16は実施例3の結果を示す写真である。
図17は実験例1〜4(レーン1、2、4及び5)及び実験例5及び6(レーン3及び6)の結果を示す写真である。
Claims (17)
- No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系及び第2の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第1の系及び第2の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系及び第2の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領城と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第1の系及び第2の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第1番目の系から第n番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第1番目の系から第n番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - 前記ダイマー形成用プローブの3つの領域の端部に、少なくとも1つのG(グアニン)またはC(シトシン)を配置させ、ダイマー形成用プローブがハイブリダイズした際に少なくとも1つのG−C結合を領域の端部に形成させることにより、安定した2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記ダイマー形成用プローブが、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記複数対のダイマー作製用プローブのハイブリダイゼーションが、あらかじめ一対のダイマー作製用プローブによりダイマープローブを形成させた後、各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせるものであることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の方法で形成された自己集合体。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の方法で形成した自己集合体の紫外線に対する光化学的な吸収の変化を利用して前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする自己集合体の検出方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の方法で形成した自己集合体の塩基対に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする自己集合体の検出方法。
- No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系及び第2の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有することを特徴とする第1の系及び第2の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブ。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系及び第2の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有することを特徴とする第1の系及び第2の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブ。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有することを特徴とする第1番目の系から第n番目の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブ。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有することを特徴とする第1番目の系から第n番目の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブ。 - 前記ダイマー形成用プローブの3つの領域の端部に、少なくとも1つのG(グアニン)またはC(シトシン)を配置させることを特徴とする請求項11〜14のいずれか1項記載のダイマー形成用プローブ。
- 前記ダイマー形成用プローブが、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項11〜14のいずれか1項記載のダイマー形成用プローブ。
- 請求項11〜14のいずれか1項記載の一対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより形成されるダイマープローブ。
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