JP3912595B2 - プローブ自己集合体の作製方法 - Google Patents
プローブ自己集合体の作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3912595B2 JP3912595B2 JP2002534557A JP2002534557A JP3912595B2 JP 3912595 B2 JP3912595 B2 JP 3912595B2 JP 2002534557 A JP2002534557 A JP 2002534557A JP 2002534557 A JP2002534557 A JP 2002534557A JP 3912595 B2 JP3912595 B2 JP 3912595B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- oligonucleotide
- dimer
- complementary
- pair
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Ultrasonic Waves (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
Description
また、2本のオリゴヌクレオチド・プローブが互い違いに反応することから、それぞれの領域が競合することになり、自己集合体の形成に多少の反応時間が必要であった。
PALSAR法で使用する一対のオリゴヌクレオチド・プローブでは、一対のオリゴヌクレオチド・プローブだけで互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせ、2本鎖の自己集合体を形成させていた。
近年の遺伝子診断技術では、目的の遺伝子を検出するためにEIAと呼ばれるエンザイム・イムノ・アッセイや蛍光標識法に代表される様々な手法が用いられているが、いずれの方法においても高価な酵素や抗体、及び蛍光標識物質と煩雑な操作を必要としていた。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系及び第2の系の複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、第1の系及び第2の系のダイマープローブを形成させた後、各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系及び第2の系の複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、第1の系及び第2の系のダイマープローブを形成させた後、各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系から第3の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(g)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(h)第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系から第4の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1番目の系から第n番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系から第3の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(g)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(h)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系から第4の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1番目の系から第n番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系及び第2の系の一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1及び第2の系のダイマープローブのセットである。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系及び第2の系の一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1及び第2の系のダイマープローブのセットである。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系から第3の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1の系から第3の系のダイマープローブのセットである。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(g)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(h)第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系から第4の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1の系から第4の系のダイマープローブのセットである。
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1番目の系から第n番目の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1番目の系から第n番目の系のダイマープローブのセットである。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系から第3の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1の系から第3の系のダイマープローブのセットである。
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(g)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(h)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系から第4の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1の系から第4の系のダイマープローブのセットである。
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1番目の系から第n番目の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1番目の系から第n番目の系のダイマープローブのセットである。
上記ダイマー形成用プローブは、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる核酸から構成されるものである。
また、ダイマー形成用プローブの各領域の長さは、塩基数にして、少なくとも5塩基であり、好ましくは少なくとも8塩基、さらに好ましくは10塩基〜100塩基、さらに好ましくは15〜30塩基である。
1.2組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第一の例。
図1(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)も上記のように構成される(図1(b))。
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図2(b))。
2組のダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成の第二の例として、図3(b)に示したように、第2の系のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチドとNo.2−オリゴヌクレオチドにおいて、3’側領域もしくは5’側領域の入れ替えが可能である。
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、β’のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、β’のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、β’のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、β’のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図4(b))。
No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成する。
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
(b)第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
(d)最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する。
上記におけるn=3の場合の例を、図5及び図6に示し、n=4の例を、図7及び図8に示す。
図5(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)と第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)も上記のように構成される(図5(b)及び(c))。
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図6(b))。
図7(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)、第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)及び第4の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(δ)も上記のように構成される(図7(b)〜(d))。
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、δのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
δのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図8(b))。
No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、3’側領域、及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは2以上の整数)の系まで順番に複数個形成する。
(a)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
(b)第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
(c)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
(d)最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する。
上記におけるn=3の場合の例を図9に、n=4の例を図10及び図11に、n=5の場合の例を図12及び図13にそれぞれ示す。
図9(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)と第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)も上記のように構成される。
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.2オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図9(b))。
図10(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)、第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)、及び第4の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(δ)も上記のように構成される(図10(b)〜(d))。
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.2オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図11(b))。
図12(a)に示したように、第1の系は、一対のダイマー形成用プローブのNo.1−オリゴヌクレオチド、及びNo.2−オリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドが、3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分けられ、各オリゴヌクレオチドの中央領域が互いに相補的な塩基配列であることから、3’側領域、及び5’側領域が互いに非相補的な塩基配列である第1の系のダイマープローブ(α)を形成するオリゴヌクレオチドから構成される。同様にして第2の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(β)、第3の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(γ)、第4の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(δ)及び第5の系の一対のダイマー形成用プローブとそのダイマープローブ(θ)も上記のように構成される(図12(b)〜(e))。
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、βのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
αのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、βのNo.2オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
βのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、γのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
γのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、δのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、θのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
δのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、θのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
θのNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と、
θのNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域は、αのNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
それぞれが相補的な塩基配列であることから、それぞれがハイブリダイゼーションすることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する(図13(b))。
自己集合体の形成方法では、各領域における分岐点の結合力が弱いとその分岐点にはさまれている領域のハイブリダイゼーションが不安定になることから、領域全体の塩基のπ電子による特殊な相互作用から生じる塩基の積み重ね(stacking of base)効果の強さを増すことにより、各領域のハイブリダイゼーション反応をより強固にさせることを考案したものである。
上記の領域端部に配置されるCまたはGの数は少なくとも1塩基であり、複数個であっても差し支えない。各領域の塩基配列を考慮し適宜選択することができる。複数個のCまたはGを配置させる場合、C、Gの順序は特に限定されず自由に組み合わせることができる。
さらには、本発明は、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認する方法を可能にするものである。例えば、自己集合体は、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発する色素を添加し、セフェイド社のI−CORETM(Smart CyclerTM)等を用いて蛍光の発光状態を観察することにより検出可能である。
また、一般的なアガロースゲル電気泳動法等によっても、形成された自己集合体を簡単に確認することができる。
1)No.1−プローブ(配列番号1)
5'-GTGCTGACTT AACCGGATAC GAACAGGATC CTAGACCTAG CATAGTACAG TCCGATGGTG―3'
2)No.2−プローブ(配列番号2)
5'―CCTCAAGACG CATGTCTTTC CTAGGTCTAG GATCCTGTTC CTAGAACGGA CTGTACTTCG-3'
3)No.3−プローブ(配列番号3)
5'―GAAAGACATG CGTCTTGAGG CTATCCGTTC GACTTGCATG CGAAGTACAG TCCGTTCTAG-3'
4)No.4−プローブ(配列番号4)
5'―GTATCCGGTT AAGTCAGCAC CATGCAAGTC GAACGGATAG CACCATCGGA CTGTACTATG-3'
5)X1−プローブ(配列番号5)
5'―GTGCTGACTT AACCGGATAC GAACAGGATC CTAGACCTAG CATAGTACAG TCCGATGGTG―3'
6)X2−プローブ(配列番号6)
5'―CCTCAAGACG CATGTCTTTC CTAGGTCTAG GATCCTGTTC CTAGAACGGA CTGTACTTCG―3'
7)Y1−プローブ(配列番号7)
5'―GAAAGACATG CGTCTTGAGG CTATCCGTTC GACTTGCATG CTAGACGCTT CTTGCGTAAG―3'
8)Y2−プローブ(配列番号8)
5'-GTGTCGAATT GACACTCAGC CATGCAAGTC GAACGGATAG CACCATCGGA CTGTACTATG―3'
9)Z1−プローブ(配列番号9)
5'―GCTGAGTGTC AATTCGACAC GCACCCTATC AGGCAGTATC CGAAGTACAG TCCGTTCTAG―3'
10)Z2−プローブ(配列番号10)
5'―GTATCCGGTT AAGTCAGCAC GATACTGCCT GATAGGGTGC CTTACGCAAG AAGCGTCTAG―3'
1.目的
第1及び第2の系からなる二組の一対のダイマー形成用プローブによるダイマープローブの形成を確認した。
(1)第1の系の一対のダイマー形成用プローブとして、No.1−プローブ及びNo.2−プローブを、第2の系の一対のダイマー形成用プローブとして、No.3−プローブ及びNo.4−プローブを作製した。各オリゴヌクレオチド・プローブは、それぞれ100pmolに調製したものを用いた。
(2)緩衝液として20×SSC(3M−NaCl,0.3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH7.0)を用いた。
(実験例1〜4)ダイマー形成用プローブの調製
0.2mLのマイクロチューブにそれぞれ、オリゴヌクレオチド・プローブを1μL、20×SSCを12μL、H2Oを7μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。オリゴヌクレオチド・プローブは、実験例1では、No.1−プローブを、実験例2では、No.2−プローブを、実験例3では、No.3−プローブを、実験例4では、No.4−プローブをそれぞれ用いた。
上記の各反応溶液を、94℃30秒間加熱させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
実験例5では、0.2mLのマイクロチューブにNo.1−プローブを0.5μL、No.2−プローブを0.5μ、20×SSCを12μL、及びH2Oを7μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。
実験例6では、0.2mLのマイクロチューブにNo.3−プローブを0.5μL、No.4−プローブを0.5μL、20×SSCを12μL、及びH2Oを7μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。
上記各反応溶液を、94℃30秒加熱後、64℃で30分間反応させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
結果を図17に示す。図17のアガロースゲル電気泳動の写真に示したように、実験例1〜4では、各ダイマー形成用プローブが、モノマーの状態であることが確認された(レーン1、2、4及び5)。実験例5では、図17のアガロースゲル電気泳動の写真に示したように、本発明による第1の系の一対のダイマー形成用プローブは、PALSAR法のオリゴヌクレオチド・プローブとは異なり自己集合体は形成せず、ダイマーのみを形成するオリゴヌクレオチド・プローブであった(レーン3)。同様に、実験例6では、第2の系の一対のダイマー形成用プローブは、PALSAR法のオリゴヌクレオチド・プローブとは異なり自己集合体は形成せず、ダイマーのみを形成した(レーン6)。
1.目的
あらかじめ二組のダイマープローブを形成させて自己集合体の形成を確認した。
(1)第1の系のダイマープローブ(α)として、実験例5にて形成させた第1の系のダイマーを、第2の系のダイマープローブ(β)として、実験例6にて形成させた第2の系のダイマーを、それぞれ用いた。
(2)緩衝液として20×SSC(3M−NaCl,0.3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH7.0)を用いた。
0.2μLのマイクロチューブに第1の系のダイマープローブ(α)と第2の系のダイマープローブ(β)を0.5μLずつ加え、20×SSCを12μL、H2Oを7μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。
上記反応溶液を、各々52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃及び70℃にてそれぞれ30分反応させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
図14の写真に示したように、PALSAR法に比べ、同じ反応時間であるにもかかわらず、広い範囲の温度領域において自己集合体の形成が確認された。このことは、反応時間の短縮も意味するものである。
1.目的
4種のダイマー形成用プローブを同時に反応させて、自己集合体の形成を確認した。
(1)第1の系のダイマー形成用プローブとして、No.1−プローブ及びNo.2−プローブを、第2の系のダイマー形成用プローブとして、No.3−プローブ及びNo.4−プローブを用いた。各オリゴヌクレオチド・プローブは、実験例1〜4にて調製したものを用いた。
(2)緩衝液として20×SSC(3M−NaCl,0.3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH7.0)を用いた。
0.2μLのマイクロチューブにNo.1−プローブ、No.2−プローブ、No.3−プローブ及びNo.4−プローブを同時に0.5μLずつ加え、20×SSCを12μL、H2Oを6μL加えて、計20μLの反応溶液を調製した。
上記反応溶液を、各々52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃及び70℃にてそれぞれ30分反応させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
図15の写真に示したように、自己集合体の形成が観察されたが、実施例1に比べ、52℃〜62℃の反応温度において、非特異的な反応が確認された。
1.目的
第1、第2及び第3の系からなる3組の一対のダイマー形成用プローブを用いて、自己集合体の形成を確認した。実施例1及び比較実験例1において、プローブをあらかじめダイマーとしておいた場合においても、同時に添加した場合においても同じ反応温度での自己集合体の形成が確認されたため、本比較実験例においては、プローブのダイマーの種類を3組に増やして、同時に添加し同じ反応温度における自己集合体の形成を調べた。
(1)第1の系のダイマー形成用プローブとして、X1−プローブ及びX2−プローブを、第2の系のダイマー形成用プローブとして、Y1−プローブ及びY2−プローブを、第3の系のダイマー形成用プローブとして、Z1−プローブ及びZ2−プローブを作製した。各オリゴヌクレオチド・プローブは、それぞれ100pmolに調製したものを用いた。
(2)緩衝液として20×SSC(3M−NaCl,0.3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH7.0)を用いた。
0.2μLのマイクロチューブにX1−プローブ、X2−プローブ、Y1−プローブ、Y2−プローブ、Z1−プローブ及びZ2−プローブを同時に0.5μLずつ加え、20×SSCを18μL、H2Oを9μL加えて、計30μLの反応溶液を調製した。
上記の各反応溶液を、94℃30秒間加熱させた。
加熱後、上記反応溶液を、各々52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃及び74℃にてそれぞれ30分反応させた。
反応終了後、氷上で急冷した後、0.5%のアガロースゲルを用いて100V、30分間電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
図16の写真に示したように、3組のダイマープローブを形成する、6種のダイマー形成用プローブを用いた場合においても、2組のダイマープローブを用いた実施例1及び比較実験例1の場合と同様、自己集合体の形成が観察された。
Claims (20)
- No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む第1の系及び第2の系を形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系及び第2の系の複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、第1の系及び第2の系のダイマープローブを形成させた後、各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む第1の系及び第2の系を形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系及び第2の系の複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、第1の系及び第2の系のダイマープローブを形成させた後、各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系から第3の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系から第3の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系から第4の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(g)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(h)第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系から第4の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは4以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1番目の系から第n番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系から第3の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系から第3の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系から第4の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(g)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(h)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1の系から第4の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは4以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
あらかじめ前記第1番目の系から第n番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマープローブを形成させた後、前記各系の形成されたダイマープローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする自己集合体の作製方法。 - 前記ダイマー形成用プローブの3つの領域の端部全てに、少なくとも1つのG(グアニン)またはC(シトシン)を配置させ、ダイマー形成用プローブがハイブリダイズした際に少なくとも1つのG−C結合を領域の端部に形成させることにより、安定した2本鎖の自己集合体を形成させることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 前記ダイマー形成用プローブが、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる核酸から構成されることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む第1の系及び第2の系を形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系及び第2の系の一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1及び第2の系のダイマープローブのセット。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む第1の系及び第2の系を形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系及び第2の系の一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1及び第2の系のダイマープローブのセット。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系から第3の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系から第3の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1の系から第3の系のダイマープローブのセット。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系から第4の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(g)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(h)第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系から第4の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1の系から第4の系のダイマープローブのセット。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは4以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第(n−1)番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1番目の系から第n番目の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1番目の系から第n番目の系のダイマープローブのセット。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系から第3の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系から第3の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1の系から第3の系のダイマープローブのセット。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1の系から第4の系まで形成し、
(a)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(b)第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(c)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(d)第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(e)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(f)第3の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第4の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
(g)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
(h)第4の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1の系から第4の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1の系から第4の系のダイマープローブのセット。 - No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各一対のオリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、各一対のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’側領域及び5’側領域を全て互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第1番目の系から第n番目(nは4以上の整数)の系まで順番に複数個形成し、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第2の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第3の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
第(n−1)番目の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第n番目の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域を互いに相補的な塩基配列とし、
最後の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域を互いに相補的な塩基配列とした構造を有する第1番目の系から第n番目の系まで形成される一対のダイマー形成用プローブをそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより形成される第1番目の系から第n番目の系のダイマープローブのセット。 - 前記ダイマー形成用プローブの3つの領域の端部全てに、少なくとも1つのG(グアニン)またはC(シトシン)を配置させることを特徴とする請求項11〜18のいずれか1項記載のダイマープローブのセット。
- 前記ダイマー形成用プローブが、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる核酸から構成されることを特徴とする請求項11〜19のいずれか1項記載のダイマープローブのセット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000311151 | 2000-10-11 | ||
JP2000311151 | 2000-10-11 | ||
PCT/JP2001/008806 WO2002031192A1 (fr) | 2000-10-11 | 2001-10-05 | Procede de construction d"un autoassemblage de sondes et leur procede de detection |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2002031192A1 JPWO2002031192A1 (ja) | 2004-02-19 |
JP3912595B2 true JP3912595B2 (ja) | 2007-05-09 |
Family
ID=18790969
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002534557A Expired - Fee Related JP3912595B2 (ja) | 2000-10-11 | 2001-10-05 | プローブ自己集合体の作製方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7122310B2 (ja) |
EP (1) | EP1304386B1 (ja) |
JP (1) | JP3912595B2 (ja) |
AT (1) | ATE341647T1 (ja) |
AU (1) | AU2001294199A1 (ja) |
DE (1) | DE60123626T2 (ja) |
ES (1) | ES2273892T3 (ja) |
WO (1) | WO2002031192A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE60137104D1 (de) * | 2000-03-31 | 2009-02-05 | Sanko Junyaku Kk | Sonde zur herstellung einer polymersonde, verfahren zur herstellung einer polymersonde sowie verwendung derselben |
US20030175689A1 (en) * | 2000-08-30 | 2003-09-18 | Mitsugu Usui | Gene detecting method |
CA2515734C (en) * | 2003-02-14 | 2013-04-09 | Eisai Co., Ltd. | Signal amplification method for detecting expressed gene |
US7745124B2 (en) | 2004-04-28 | 2010-06-29 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Hybridization method |
ATE462802T1 (de) | 2004-09-08 | 2010-04-15 | Eisai R&D Man Co Ltd | Verfahren zur bildung eines signalsondenpolymers |
EP1997908A4 (en) | 2006-03-15 | 2010-09-29 | Eisai R&D Man Co Ltd | METHOD FOR FORMING A SIGNAL CONDUCTOR POLYMER |
WO2008027452A2 (en) * | 2006-08-29 | 2008-03-06 | R. Crea And Company | Self-assembling oligonucleotides and methods |
US9222936B2 (en) | 2007-04-18 | 2015-12-29 | Solulink, Inc. | Methods and/or use of oligonucleotide conjugates for suppressing background due to cross-hybridization |
EP2180063B1 (en) | 2007-08-14 | 2013-01-09 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method of detecting target substance |
KR20100085923A (ko) * | 2007-10-24 | 2010-07-29 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 핵산프로브 및 프로브폴리머의 형성방법 |
US20110171639A1 (en) | 2007-10-31 | 2011-07-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Polymer for detection of target substance, and method for detection of target substance |
JP2012070635A (ja) * | 2009-01-29 | 2012-04-12 | Eisai R & D Management Co Ltd | 核酸の検出方法 |
WO2011125833A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-13 | 学校法人 慶應義塾 | 生体分子相互作用解析ツールの構成とそれを用いた解析方法 |
US20140349879A1 (en) | 2011-12-09 | 2014-11-27 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | Method for detecting nucleotide mutation, and detection kit |
US20150299788A1 (en) | 2012-05-15 | 2015-10-22 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Rna detection method and detection kit |
EP3874067B1 (en) * | 2018-10-30 | 2024-04-03 | Institut National De La Recherche Scientifique | Self-assembling nucleic acid surfaces for biosensor applications |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5175270A (en) | 1986-09-10 | 1992-12-29 | Polyprobe, Inc. | Reagents for detecting and assaying nucleic acid sequences |
CA2039517C (en) | 1990-04-03 | 2006-11-07 | David Segev | Dna probe signal amplification |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
WO1999006595A1 (en) * | 1997-07-29 | 1999-02-11 | Polyprobe, Inc. | Dendritic nucleic acids exhibiting maximal self-assembly |
JP3267576B2 (ja) | 1998-11-09 | 2002-03-18 | 三光純薬株式会社 | プローブ高分子の形成方法 |
-
2001
- 2001-10-05 WO PCT/JP2001/008806 patent/WO2002031192A1/ja active IP Right Grant
- 2001-10-05 DE DE60123626T patent/DE60123626T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-05 EP EP01974720A patent/EP1304386B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-05 US US10/149,187 patent/US7122310B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-05 AU AU2001294199A patent/AU2001294199A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-05 JP JP2002534557A patent/JP3912595B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-05 AT AT01974720T patent/ATE341647T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-05 ES ES01974720T patent/ES2273892T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE60123626T2 (de) | 2007-01-18 |
DE60123626D1 (de) | 2006-11-16 |
EP1304386B1 (en) | 2006-10-04 |
EP1304386A1 (en) | 2003-04-23 |
US20030087262A1 (en) | 2003-05-08 |
JPWO2002031192A1 (ja) | 2004-02-19 |
AU2001294199A1 (en) | 2002-04-22 |
ATE341647T1 (de) | 2006-10-15 |
EP1304386A4 (en) | 2005-01-19 |
WO2002031192A1 (fr) | 2002-04-18 |
US7122310B2 (en) | 2006-10-17 |
ES2273892T3 (es) | 2007-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3912595B2 (ja) | プローブ自己集合体の作製方法 | |
JP3892450B2 (ja) | バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイ | |
US6013456A (en) | Methods of sequencing polynucleotides by ligation of multiple oligomers | |
US6261846B1 (en) | Gene amplifying method | |
US7005261B1 (en) | Method for detecting nucleic acid target sequences involving in vitro transcription from an RNA polymerase promoter | |
KR100446358B1 (ko) | 프로우브 중합체 제작용 프로우브, 프로우브 중합체의 제작방법 및 그 이용 | |
JPH11510709A (ja) | 最適蛍光オリゴヌクレオチド | |
JPH02501532A (ja) | 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅 | |
JP2010521142A (ja) | 遺伝子発現アッセイ | |
WO2000004192A1 (en) | Methods for detecting and mapping genes, mutations and variant polynucleotide sequences | |
US7393636B2 (en) | Method for forming self-assembly substance using oligonucleotide synthesized by gene amplification reaction, self-assembly substance and method for detecting gene | |
JP4121757B2 (ja) | オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法及び遺伝子の検出方法 | |
JP4351210B2 (ja) | 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 | |
EP0857791B1 (en) | Method of analysis using signal amplification | |
JP5289315B2 (ja) | 標的物質の検出方法 | |
US6020132A (en) | Method of analysis using signal amplification | |
JP2005304489A (ja) | 標的物質検出用プローブセット及び標的物質検出方法。 | |
US7306915B2 (en) | Probe set for detection of target substance and detection method using the same | |
JP5289314B2 (ja) | 標的物質の検出方法 | |
JPWO2009054320A1 (ja) | 核酸プローブ及びプローブポリマーの形成方法 | |
AU779591B2 (en) | Method for detecting nucleic acid target sequences involving in vitro transcription from an RNA polymerase promoter | |
US20130084562A1 (en) | Tethered enzyme mediated nucleic acid detection | |
JP5194459B2 (ja) | 一本鎖dna増幅方法 | |
JP2004242585A (ja) | Rna断片を用いたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法、自己集合体及び遺伝子の検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050524 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050725 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050822 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051014 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061108 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070124 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070124 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100209 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110209 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110209 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120209 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120209 Year of fee payment: 5 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120209 Year of fee payment: 5 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120209 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130209 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130209 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140209 Year of fee payment: 7 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |