KR20100085923A - 핵산프로브 및 프로브폴리머의 형성방법 - Google Patents

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에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
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Abstract

핵산프로브의 폴리머가 간편하고 효율적으로 형성될 수 있는 프로브폴리머의 형성방법, 상기 방법으로 형성되는 프로브폴리머, 상기 방법으로 이용되는 신규 핵산프로브 및 고감도인 동시에 간편하게 표적분석물을 검출할 수 있는 표적분석물의 검출방법을 제공한다. 3 이상의 핵산영역을 포함하는 핵산프로브이며, 이 핵산프로브의 각 핵산영역이 제 1영역 및 이 제 1영역에 상보적인 제 2영역을 인접하여 포함한다. 상기 핵산프로브를 반응시킴으로써 상기 핵산프로브의 폴리머가 형성된다.

Description

핵산프로브 및 프로브폴리머의 형성방법{NUCLEIC ACID PROBE, AND METHOD FOR PRODUCTION OF PROBE POLYMER}
본 발명은 신규 핵산프로브, 이 핵산프로브의 자기집합체(폴리머)를 형성시켜 표적분석물의 검출 감도를 향상시킬 수 있는 프로브폴리머의 형성방법, 상기 방법에 의해 형성되는 프로브폴리머 및 상기 방법을 이용한 표적분석물의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 효소를 사용하지 않은 신규한 등온핵산증폭법(等溫核酸增幅法)으로서, 다른 핵산프로브와 상보적인 염기배열을 가지는 복수종의 핵산프로브를 이용하여 프로브의 자기집합반응(Probe alternation link self-assembly reaction)에 의해 핵산프로브의 집합체(폴리머)를 형성하는 방법(이하, 프로브의 자기집합반응에 의한 폴리머의 형성법을 펄서법(PALSAR법)으로 칭한다.)을 제안했다(특허문헌1~4). 또, 본 발명자들은 상기 PALSAR법을 이용하여 타겟 유전자의 검출감도를 향상시키는 방법을 제안하였다(특허문헌 5).
상기 방법에 의해 타겟 유전자를 고감도로 검출하는 것이 가능함에도 불구하고, 신호 프로브폴리머의 형성에 복수종의 핵산프로브를 이용할 필요가 있었다.
특허문헌 1 : 일본특허공보 제3267576호
특허문헌 2 : 일본특허공보 제3310662호
특허문헌 3 : 국제공개공보 제02/31192호
특허문헌 4 : 일본특개 2002-355081호
특허문헌 5 : 국제공개공보 제03/029441호
본 발명은 핵산프로브의 폴리머를 간편하고 효율적으로 형성할 수 있는 프로브폴리머의 형성방법, 상기 방법으로 형성되는 프로브폴리머, 이 방법에서 이용되는 신규 핵산프로브 및 고감도인 동시에 간편하게 표적분석물을 검출할 수 있는 표적분석물의 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 연구를 거듭한 결과, 핵산프로브 1개 영역에 있어서, 그 영역의 중심이 되는 위치를 경계로 하여 대칭적으로 상대하는 염기가 상보적으로 이루어지는 것 같은 경상관계(鏡像關係)(대칭)에 있는 염기배열로 이루어지는 것처럼 구성하는 것에 의해 1종의 핵산프로브만으로 핵산프로브의 폴리머를 형성할 수 있는 것을 찾아냈다.
즉, 본 발명의 핵산프로브는 3이상의 핵산영역을 포함하는 핵산프로브이며, 이 핵산프로브의 각 핵산영역이 제 1영역 및 이 제 1영역에 상보적인 제 2영역을 인접하여 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프로브폴리머의 형성방법은 본 발명의 핵산프로브를 반응시키고, 상기 핵산프로브의 폴리머를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프로브폴리머는 상기 본 발명의 프로브폴리머의 형성방법에 의해 형성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 표적분석물의 검출방법은 상기 본 발명의 프로브폴리머의 형성방법에 의해 프로브폴리머를 형성시켜 이 프로브폴리머를 검출하는 것에 의해 표적분석물을 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 표적분석물의 검출방법에 있어서, 상기 표적분석물과 특이적으로 결합 가능한 동시에 상기 핵산프로브의 일부 또는 전부 같은 염기배열을 포함하는 어시스트프로브를 이용하여 상기 표적분석물과 상기 어시스트프로브와 상기 프로브폴리머를 포함하는 복합체를 형성하고, 이 복합체를 분석하는 것에 의해 상기 표적분석물을 검출하는 것이 바람직하다. 또한, 본원 명세서에 있어서 어시스트프로브는 검출하는 표적분석물과 특이적으로 결합 가능한 부분을 포함하고, 동시에 폴리머 형성에 이용되는 상기 핵산프로브의 일부 또는 전부 같은 염기배열을 포함하는 프로브를 의미하고, 표적분석물과 프로브폴리머를 연결하는 일을 한다.
상기 표적분석물로서 예를 들면 핵산, 항원, 항체, 리셉터(receptor), 합텐(hapten), 효소, 단백질, 펩티드, 폴리머 및 당질에서 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 들 수 있다.
상기 표적분석물이 핵산의 경우, 상기 핵산프로브가 상기 표적핵산(타겟 유전자)의 일부에 상보적인 배열을 가지도록 구성하는 것에 의해 표적핵산과 프로브폴리머를 결합시킬 수 있다.
본 발명에 따르면 1종의 핵산프로브만으로 이 핵산프로브의 폴리머를 형성할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 간편하게 표적분석물을 검출할 수 있고, 표적분석물의 검출 감도를 현저하게 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 핵산프로브의 일례를 나타내는 개략설명도이다.
도 2는 도 1 기재의 핵산프로브의 결합 양식을 나타내는 개략설명도이다.
도 3은 도 1 기재의 핵산프로브에 의해 형성된 프로브폴리머를 나타내는 개략설명도이다.
도 4는 실시예 1의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예 2의 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 실시예 3의 결과를 나타내는 사진이다.
이하에 본 발명의 실시의 형태를 첨부도면에 기초하여 설명하지만, 도시예는 예시적으로 나타내는 것이므로 본 발명의 기술사상에서 일탈하지 않는 한 다양한 변형이 가능한 것은 당연하다.
도 1은 본 발명의 핵산프로브의 일례를 나타내는 개략설명도이다. 도 2는 도 1의 핵산프로브의 결합 태양(態樣)을 나타내는 개략설명도이다. 도 3은 도 1의 핵산프로브에 의해 형성된 자기집합체(프로브폴리머)를 나타내는 개략설명도이다.
본 발명의 핵산프로브는 3 이상의 핵산영역을 포함하는 핵산프로브이며, 이 핵산프로브의 각 핵산영역이 제 1영역 및 이 제 1영역에 상보적인 제 2영역을 인접하여 포함하고 상기 핵산프로브를 반응시키는 것에 의해 상기 핵산프로브의 폴리머를 형성하여 얻는 것을 특징으로 한다. 본원 명세서에 있어서, 핵산프로브의 핵산영역이란 상기 제 1 영역 및 제 2 영역으로 이루어진 영역을 의미한다. 또 각 핵산영역 중 제 1 영역 및 제 2 영역을 각각 상보영역으로 칭한다. 본 발명의 핵산프로브에 포함되는 핵산영역의 수는 3 이상이며, 3 이상 10 이하가 바람직하고, 3 이상 5 이하가 보다 바람직하다.
도 1은 본 발명의 핵산프로브의 일례를 나타내는 개략설명도이며, 3개의 핵산영역을 포함하는 예를 나타낸다. 도 1에 나타낸 것처럼 본 발명의 핵산프로브(10)는 5’단부에서 차례로 핵산영역(10a), 핵산영역(10b) 및 핵산영역(10c)을 가지고, 각 핵산영역(10a), (10b) 및 (10c)는 서로 상보적이고 인접한 2 영역을 포함한다. 즉, 상기 핵산영역(10a)은 상보영역 X 및 이 상보영역 X에 상보적인 염기배열을 가지는 상보영역 X’를 인접하여 포함하고, 상기 핵산영역(10b)은 상보영역 Y 및 이 상보영역 Y에 상보적인 염기배열을 가지는 상보영역 Y’를 인접하여 포함하고, 상기 핵산영역(10c)은 상보영역 Z 및 이 상보영역 Z에 상보적인 염기배열을 가지는 상보영역 Z’를 인접하여 포함하는 것이다.
본 발명의 핵산프로브(10)에 있어서, 상보영역 X와 상보영역 X’, 상보영역 Y와 상보영역 Y’, 상보영역 Z와 상보영역 Z’는 각각 혼성(hybridize) 가능한 상보적 핵산영역이며, 도 2에 나타낸 것처럼 상보영역 X와 상보영역 X’가 결합하고[도 2(a)], 상보영역 Y와 상보영역 Y’가 결합하고[도 (2b)], 상보영역 Z와 상보영역 Z’가 결합한다[도 2(c)]. 도 2에 있어서, 부호(20)는 수소결합을 나타낸다. 또한, 도 1에서는 적합한 예로서 3개의 핵산영역(10a, 10b, 10c)을 가지는 핵산프로브를 나타냈지만, 핵산영역의 수는 3개 이상이면 특히 한정되지 않는 것이다.
본 발명의 핵산프로브(10)를 혼성화(hybridization) 반응시키는 것에 의해 도 3에 나타낸 것처럼 핵산프로브(10)가 자기집합하고, 그 결과 핵산프로브(10)의 자기집합체인 프로브폴리머(30)를 형성시킬 수 있다.
본 발명의 핵산프로브에 있어서, 각 상보영역의 길이는 염기수로 하여 2 염기 이상이 바람직하고, 3염기~50염기가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4염기~15염기이다. 또 핵산프로브 중 각 상보영역의 길이는 같은 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산프로브의 염기배열은 각 핵산영역 중 제 1영역 및 제 2영역이 서로 상보적인 염기배열로 이루어지는 한 특별히 제한되지는 않지만, 각 상보영역의 양말단(兩末端)의 염기가 구아닌(guanine) 또는 시토신(cytosine)인 것이 바람직하다. 각 상보영역의 양말단(兩末端)의 염기를 구아닌 또는 시토신이라면 반응시간을 단축시킬 수 있고, 보다 더 낮은 반응온도로 안정한 프로브폴리머를 형성시킬 수 있고, 작업성 및 검출감도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 핵산프로브는 통상 DNA 또는 RNA로 구성되지만, 핵산유사체(nucleic acid analogs)라도 상관없다. 핵산유사체로서 예를 들면 펩티드핵산(PNA, 국제공개 제92/20702호 공보 등 참조) 이나 Locked Nucleic Acid(LNA, Koshkin AA et al. Tetrahedron1998.54,3607-3630., Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc.1998.120,13252-13253.,Wahlestedt C et al. PNAS.2000.97,5633-5638. 등 참조)을 들 수 있다. 또 핵산프로브 내에서 핵산 조성이 한 종류 예를 들면 DNA만으로 구성될 필요는 없고, 필요에 따라 예를 들면 DNA와 RNA로 구성되는 올리고뉴클레오티드·프로브(키메라프로브)를 사용하는 것도 가능하며, 이러한 올리고뉴클레오티드·프로브는 본 발명에 포함된다.
이러한 프로브는 공지의 방법에 의해 합성할 수 있다. 예를 들면, DNA프로브의 경우 어플라이드바이오시스템사(Applied Biosystems Inc.)의 DNA합성기 394형을 사용해서 포스포아미다이드법에 따라 합성할 수 있다. 또 다른 방법으로서 인산트리에스테르법, H-포스포네이트법, 티오포스포네이트법 등이 있지만 어떤 방법으로 합성한 것이여도 괜찮다.
본 발명의 프로브폴리머의 형성방법은 전술한 본 발명의 핵산프로브를 반응시켜 프로브폴리머를 형성시키는 것에 관한 것이다. 도 3에 나타낸 것처럼 복수의 본 발명의 핵산프로브(10)를 혼성화 반응시키는 것에 의해, 프로브의 농도에 따라, 효율적으로 핵산프로브(10)의 자기집합체인 프로브폴리머(30)를 형성시킬 수 있다.
사용하는 핵산프로브의 수는 특별히 한정되어 있지 않지만, 102~1015의 범위에서 사용될 수 있다. 반응완충액의 조성, 농도는 특히 한정되지 않지만, 핵산증폭에 상용되는 통상의 완충액이 적합하게 사용될 수 있다. pH도 상용의 범위에서 적합하며, 바람직하게는 pH7.0~9.0의 범위에서도 사용할 수 있다. 혼성화 반응의 온도조건도 특히 한정되지 않고 통상의 온도조건이 적당하지만, 반응용액 중에 반응온도 영역을 부분적으로 형성시켜 당해 반응 온도 영역에 있어서 자기집합반응을 실시하게 하도록 하는 것이 바람직하다(국제공개공보 제2005/10631호). 부분적인 반응온도 영역에 적용되는 반응온도는 40~80℃가 바람직하고, 보다 바람직하게는 55~65℃이다.
본 발명의 프로브폴리머의 형성방법을 이용하여 표적분석물을 검출하는 것에 의해 표적분석물을 간편한 동시에 고감도로 검출할 수 있다. 표적분석물의 검출방법은 특별히 한정되지 않고 공지의 방법을 채용할 수 있다.
본 발명의 표적분석물의 검출방법은 상기 본 발명의 프로브폴리머의 형성방법을 이용하여 폴리머를 형성시키고, 상기 폴리머를 검출하는 것에 의해 시료 중 표적분석물의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 상기 표적분석물의 검출방법으로서 구체적으로는 표적분석물과 프로브폴리머의 복합체를 형성시켜 프로브폴리머의 검출에 의해 표적분석물을 검출하는 방법 및 표적분석물이 존재하는 경우에만 폴리머가 형성되는 방법을 이용하여 폴리머를 형성시켜서 폴리머의 검출에 의해 표적분석물을 검출하는 방법(예를 들면, 절단된 핵산프로브를 이용하여 표적분석물이 존재하는 경우만 라이게이션(Ligation)반응에 의해 핵산프로브가 연속되어 폴리머가 형성되는 방법)을 들 수 있다.
본 발명에 있어 표적분석물 측정용 시료는, 이 표적분석물을 포함하는 가능성이 있는 모든 시료를 적용 할 수 있고, 예를 들면 혈액, 혈청, 뇨, 분변, 뇌척수액, 조직액, 객담, 세포배양물 등 생체유래시료, 바이러스, 세균, 곰팡이 등의 함유 또는 감염한 가능성이 있는 시료 등을 들 수 있다.
상기 표적분석물로 예를 들면 핵산, 항원, 항체, 리셉터(receptor), 합텐(hapten), 효소, 단백질, 펩티드, 폴리머, 당질 및 그러한 조합에서 이루어지는 것을 들 수 있다. 이 표적분석물은 시료로부터 적절히 조제되거나 또는 시료로부터 분리된 것도 된다. 또, 시료 중 표적핵산을 공지의 방법으로 증폭한 DNA 또는 RNA 등 핵산도 사용할 수 있다. 상기 표적핵산(타겟 유전자)으로서 단일 가닥의 DNA 및/ 또는 RNA 및 이중 가닥의 DNA 및/또는 RNA를 이용할 수 있다. 또 상기 표적핵산에 SNPs(일염기다형)을 이용할 수 있다.
본 발명의 검출방법에 있어, 본 발명의 핵산프로브의 일부 또는 전부로서 같은 염기배열을 가지는 영역('프로브결합영역'으로 칭한다)을 1 또는 복수를 가지고, 표적분석물에 특이적으로 결합가능한 부분('타겟영역 T'로 칭한다)을 가지는 어시스트프로브를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 어시스트프로브를 이용하여 표적분석물과 어시스트프로브와 폴리머를 포함하는 복합체를 형성하고, 이 복합체를 분석하는 것에 의해 상기 표적분석물을 검출하는 것으로써, 보다 간편하게 표적분석물을 검출할 수 있다. 타겟영역은 어시스트프로브의 단부에 위치하는 것이 바람직하다.
상기 타겟영역은 표적분석물에 따라 적절히 선택 가능하다. 예를 들면 표적분석물이 핵산의 경우, 타겟영역이 표적핵산에 상보적인 염기배열을 가지는 것처럼 구성되고, 표적핵산의 1 영역에 상보적인 배열을 가지는 어시스트프로브를 이용하여 혼성화에 의해 결합시키는 것이 바람직하다.
표적분석물을 항원 등 단백질의 경우는 항체 등 표적분석물과 특이적으로 결합하는 물질을 직접 또는 간접적으로 결합시키는 것이 바람직하다. 또한, 어시스트프로브와 표적분석물의 결합은 양쪽을 직접 결합시켜도 되지만, 다른 물질을 개입하여 간접적으로 결합시켜도 된다. 구체적으로는 화학적 결합에 의해 항체를 결합시킨 어시스트프로브, 예를 들면 미리 항체에 아미노기와 카르복실기 등 결합에 의해 콘주게이트(conjugate)시킨 것을 이용하는 것이 바람직하다. 또, 비오틴화한 항체를 스트렙트아비딘(streptavidin)을 이용하여 결합시킨 어시스트프로브를 이용해도 된다.
상기 어시스트프로브의 프로브 결합영역은 본 발명의 핵산프로브의 상보영역과 동일한 염기배열을 가지는 영역을 1 이상 포함하도록 구성하는 것이 바람직하고, 본 발명의 핵산프로브와 동일한 상보영역을 2종이상 포함하고 어시스트프로브와 본 발명의 핵산프로브가 2 상보영역 이상 연속하여 결합하도록 구성하는 것이 보다 바람직하다. 또 동일한 프로브 결합영역을 복수개 포함하는 어시스트프로브를 이용하고, 1개의 어시스트프로브를 2 이상 핵산프로브와 결합시켜도 된다.
또 표적분석물이 핵산인 경우 본 발명의 핵산프로브를 상기 표적핵산의 일부에 상보적인 배열을 가지도록 구성하고, 이 핵산프로브를 이용하여 표적핵산과 프로브폴리머의 복합체를 형성시켜 프로브폴리머의 검출에 의해 표적핵산을 검출할 수 있다.
또 본 발명의 검출방법에 있어서, 표적분석물 검출용의 반응기재에서 표적분석물을 포착하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명은 표적분석물 검출을 위하여 여러 가지 반응기재에 적용 가능하지만, 특히 DNA칩 또는 DNA마이크로어레이(Marshall,A.,Hodgson,J.DNA chips: an array of possibilities. Nat Biotechnol.16,27-31,1998.등 참조), 마이크로플레이트 및 자성체입자 등으로 적합하게 이용될 수 있다.
표적분석물을 반응기재로 포착하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 표적분석물에 특이적으로 결합 가능한 포착용 물질을 결합시킨 반응기재를 이용하고, 이 포착용 물질과 표적분석물의 결합에 의해 반응기재와 표적분석물을 결합시키는 것이 바람직하다.
이 포착용 물질은 표적분석물에 따라 적절히 선택하면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 표적분석물이 핵산의 경우, 포착용 물질로서 이 표적핵산의 1 영역(어시스트프로브에 상보적인 영역을 제거한다)에 상보적인 염기배열을 가지는 올리고뉴클레오티드(캡처프로브)를 이용하는 것이 바람직하다. 표적분석물이 항원 또는 항체의 경우, 포착용 물질로서 표적분석물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 이용하는 것이 바람직하다. 또 표적분석물이 당질의 경우, 포착용 물질로서 표적분석물에 특이적으로 결합하는 렉틴을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 프로브폴리머의 검출방법에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 상기 핵산프로브를 미리 표지물질로 표지하고, 이 표지물질을 이용하여 검출하는 것이 바람직하다. 상기 표지물질이 아크리지니움에스테르, 방사성동위원소, 비오틴, 디곡시제닌(digoxigenin), 형광물질, 발광물질 또는 색소인 것이 바람직하고, 조작성, 정량성 및 감도의 점에서 아크리지니움에스테르가 특히 바람직하다. 구체적으로는 미리 본 발명의 핵산프로브를 형광물질로 표지하고, 프로브폴리머의 존재를 형광물질의 광화학적인 변화에 의해 검출하는 것이 가능하다. 또한, 미리 본 발명의 핵산프로브를 발색계 효소 또는 발광계 효소로 표지하고, 프로브폴리머의 존재를 광화학적인 변화에 의해 검출하는 것이 가능하다. 게다가, 또 미리 본 발명의 핵산프로브를 라디오아이소토프(방사성동위원소, radioisotope)로 표지하고, 프로브폴리머의 존재를 라디오아이소토프에 의해 검출하는 것이 가능하다.
또, 상기 형성된 프로브폴리머에 대하여 표지프로브를 혼성화시킨 프로브폴리머의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 표지 프로브로서는 발색계효소, 발광계효소 또는 라디오아이소토프 등으로 표지한 것을 이용할 수 있다. 또 상기 형성된 프로브폴리머에 대하여 핵산과 결합하는 성질을 가진 형광물질을 첨가하고, 그 형광물질의 광화학적인 변화에 의해 상기 프로브폴리머의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 형광물질로서는 이중 가닥의 염기쌍 중에 삽입되는 성질을 가진 형광물질이 바람직하다.
또한, 본 발명의 프로브폴리머는 260㎚ 파장에 있어서 자외부의 흡수대의 강도가「하이포크로미즘(hypochromic effect)」이라고 하는 담색효과의 발현으로 지극히 크기 때문에, 파장 260㎚에 있어 자외부 흡수를 측정함으로써 폴리머의 상태를 확인하는 것이 가능하다.
실시예
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 이러한 실시예는 예시적인 것으로서 한정적으로 해석되어서는 아니됨은 당연하다.
(실시예 1)
본 발명의 핵산프로브에 의한 프로브폴리머의 형성 유무를 전기영동에 의해 확인했다.
하기 염기배열을 가지는 핵산프로브 1(배열번호 1)을 2000pmol/mL이 되도록 반응용액[4XSSC]에 용해하고, 프로브용액을 조제했다.
핵산프로브 1의 염기배열(5’-X1(염기수7)X1’(염기수7)-Y1(염기수7)Y1’(염기수7)-Z1(염기수7)Z1’(염기수7)-3’)
5’-CCTGTCT AGACAGG CTTCGGA TCCGAAG GGTAGCA TGCTACC-3’(배열번호 1)
상기 조제한 프로브 용액을 94℃로 1분 가열 후 즉시 얼음상에서 냉각했다. 그 다음에 미리 각 반응온도[35,38,40,43,46,48,50,53,55,57,59,61,64,66,68 또는 70℃]에 도달한 상태로 튜브를 세트하고, 1시간 반응시켰다. 반응 후 샘플을 0.25% 아가로즈겔(agarosegel)에 의해 전기영동을 실시했다. 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4 ~ 도 6에 있어서, M은 분자 사이즈 마커(size marker)이며, 각 숫자는 반응온도 조건을 나타낸다.
도 4에 나타낸 것처럼 55℃~61℃의 반응온도에 있어, 프로브폴리머의 형성이 확인됐다.
(실시예 2)
핵산프로브 1을 대신하여 하기 염기배열을 가지는 핵산프로브 2(배열번호 2)를 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 실험을 실시했다. 결과를 도 5에 나타냈다.
핵산프로브 2의 염기배열(5’-X2(염기수6)X2’(염기수6)-Y2(염기수6)Y2’(염기수6)-Z2(염기수6)Z2’(염기수6)-3’)
5’-CCTGTC GACAGG CTCGGA TCCGAG GGAGCA TGCTCC-3’(배열번호 2)
도 5에 나타낸 것처럼 53℃~61℃의 반응온도에 있어, 프로브폴리머의 형성이 확인됐다.
(실시예 3)
핵산프로브 1을 대신하여 하기 염기배열을 가지는 핵산프로브 3(배열번호 3)을 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 실험을 실시했다. 결과를 도 6에 나타냈다.
핵산프로브 3의 염기배열(5’-X3(염기수5)X3’(염기수5)-Y3(염기수5)Y3’(염기수5)-Z3(염기수5)Z3’(염기수5)-3’)
5’-CCTGC GCAGG CTCGG CCGAG GGACG CGTCC-3’(배열번호 3)
도 6에 나타낸 것처럼 50℃~59℃의 반응온도에 있어, 프로브폴리머의 형성이 확인됐다.
(실시예 4)
본 발명의 핵산프로브에 의한 프로브폴리머의 형성을 이용한 타겟 유전자의 검출을 실시했다.
표적분석물로서 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 rRNA와 같은 염기배열을 가지는 합성DNA(타겟올리고DNA)(배열번호 4)를 이용했다.
타겟올리고DNA의 염기배열
5’-TTCGGGAAACCGGAGCTAATA CCGGATAATATTTTGAACCGC ATGGTTCAAAAGTGAAAGACG GTCTTGCTGTCACTTATAGAT GGATCCGCGCTGCATTAGCTA-3’(배열번호 4)
캡처프로브로서 상기 타겟올리고DNA(배열번호 4)에 상보적인 배열을 가지는 핵산프로브(배열번호 5)를 이용했다.
캡처프로브의 염기배열
5’-CGTCTTTCACTTTTGAACCAT GCGGTTCAAAATATTATCCGG-3’-Amino link(배열번호 5)
상기 캡처프로브를 각각 스트립웰타입(strip well type)의 96웰 마이크로플레이트상에 고정하고, 실험에 이용했다.
프로브폴리머의 형성에 이용되는 핵산프로브로서 실시예 1에 이용한 핵산프로브 1(배열번호 1)의 5’말단이 아크리지니움에스테르(AE)에서 표지된 핵산프로브를 이용했다. 이 AE 표지된 핵산프로브 1을 50pmol/mL이 되도록 용액[100mM-숙신산리튬, 600mM-염화리튬, 2mM-EDTA, 5%-LDS,안정화제]에 용해하고, 제2 혼성화 용액을 조제했다.
어시스트프로브로서 상기 핵산프로브 1의 일부와 같은 염기배열 및 상기 타겟올리고DNA에 상보적인 영역을 가지는 핵산프로브(어시스트프로브 1)(배열번호 6)를 이용했다.
어시스트프로브 1의 염기배열(5’-Y1 ’-X1 -polyT-Y1’-X1-T’-3’)
5’-TCCGAAG CCTGTCT TTTTT TCCGAAG CCTGTCT ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3’(배열번호 6)
상기 어시스트프로브를 25pmol/mL이 되도록 용액[100mM-숙신산리튬, 600mM-염화리튬, 2mM-EDTA, 1%-LDS]에 용해하고, 제1 혼성화 용액을 조제했다.
상기 조제한 스트립웰타입(strip well type)의 96웰 마이크로플레이트에 0 또는 10fmol/mL의 타겟올리고DNA(배열번호 4)를 50μL, 제1 혼성화 용액을 50μL씩 분주(分注)하고, 플레이트실러로 단단히 실(seal)하고, 마이크로플레이트의 상부20℃, 하부55℃로 설정한 조건하에서 45분간 반응시켰다. 반응 후 세정액[50mM-Tris, 0.3M-NaCl, 0.01%-TritonX-100, pH7.0]으로 세정했다.
세정 후 세정액을 잘 자른 96웰 마이크로플레이트에 제2 혼성화 용액을 100μL씩 분주(分注)하고, 플레이트실러로 단단히 실(seal)했다. 마이크로플레이트의 상부20℃, 하부55℃로 설정한 조건하에서 30분간 반응시킨 후 세정액으로 세정했다.
마이크로플레이트웰을 세정 후 발광시약-Ⅰ,Ⅱ(Gen Probe사 제조)측정액-1을 50μL씩 첨가하고, 루미노메타(Centro LB960,Berthod 제조)로 발광강도(RLU)를 측정했다. 발광강도(RLU)의 측정결과를 표 1에 나타냈다.
(실시예 5)
조건을 하기와 같이 변경한 것 이외에는 실시예 4와 동일하게 실험을 실시했다. 결과를 표 1에 나타냈다.
프로브폴리머의 형성에 이용되는 핵산프로브로서 실시예 3에서 이용한 핵산프로브 3(배열번호 3)의 5’말단이 아크리지니움에스테르(AE)로 표지된 핵산프로브를 이용했다.
어시스트프로브로서 상기 핵산프로브 3의 일부와 같은 염기배열 및 상기 타겟올리고DNA에 상보적인 영역을 가지는 핵산프로브(어시스트프로브 2)(배열번호 7)를 이용했다.
어시스트프로브 2의 염기배열(5’-Y3’-X3-X3’-Y3’-X3-X3’-T’-3’)
5’-CCGAG CCTGC GCAGG CCGAG CCTGC GCAGG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3’(배열번호 7)
(비교예 1)
2종의 핵산프로브를 이용한 프로브폴리머의 형성방법을 이용한 타겟 유전자의 검출을 실시했다.
조건을 하기와 같이 변경한 이외에는 실시예 4와 동일하게 실험을 실시했다. 결과를 표 1에 나타냈다.
프로브폴리머의 형성에 이용되는 핵산프로브로서 5’말단이 아크리지니움에스테르(AE)로 표지된 하기 2종의 핵산프로브(제1 및 제2 프로브;배열번호 8 및 9)를 이용했다. 이 AE표지된 2종의 핵산프로브를 각각 25pmol/mL이 되도록 용액[100mM-숙신산리튬, 600mM-염화리튬, 2mM-EDTA, 5%-LDS,안정화제]에 용해하고, 제2 혼성화 용액을 조제했다.
제1 프로브의 염기배열(5’-X4-Y4-Z4-3’)
5’-GATGTCTCGGGATG GCTTCGGAGTTACG CTGGCGGTATCAAC-3’(배열번호 8)
제2 프로브의 염기배열(5’-X4’-Y4’-Z4’-3’)
5’-CATCCCGAGACATC CGTAACTCCGAAGC GTTGATACCGCCAG-3’(배열번호 9)
어시스트프로브로서 상기 제1 프로브의 일부와 같은 염기배열 및 상기 타겟올리고DNA에 상보적인 영역을 가지는 핵산프로브(어시스트프로브 3)(배열번호 10)를 이용했다.
어시스트프로브3의 염기배열(5’-X4-Y4-X4-T’-3’)
5’-GATGTCTCGGGATG GCTTCGGAGTTACG GATGTCTCGGGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3’(배열번호 10)
Figure pct00001
표 1에 나타낸 것처럼 1종의 핵산프로브를 이용한 경우에 있어서도 2종의 핵산프로브를 이용한 경우와 동일하게 타겟을 검출하는 것이 가능했다.
10: 본 발명의 핵산프로브
10a, 10b, 10c: 핵산영역
20: 수소결합
30: 프로브폴리머
SEQUENCE LISTING <110> Eisai R&D Management Co., Ltd. <120> Nucleic acid probe, and method of forming probe-polymer <130> 77547-PCT-KR <140> PCT/JP2008/68849 <141> 2008-10-17 <150> JP 2007-276681 <151> 2007-10-24 <160> 10 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 1 cctgtctaga caggcttcgg atccgaaggg tagcatgcta cc 42 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 2 cctgtcgaca ggctcggatc cgagggagca tgctcc 36 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 3 cctgcgcagg ctcggccgag ggacgcgtcc 30 <210> 4 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 4 ttcgggaaac cggagctaat accggataat attttgaacc gcatggttca aaagtgaaag 60 acggtcttgc tgtcacttat agatggatcc gcgctgcatt agcta 105 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> Aminolink attached at the 3'end <400> 5 cgtctttcac ttttgaacca tgcggttcaa aatattatcc gg 42 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 6 tccgaagcct gtcttttttt ccgaagcctg tctatctata agtgacagca agac 54 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 7 ccgagcctgc gcaggccgag cctgcgcagg atctataagt gacagcaaga c 51 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 8 gatgtctcgg gatggcttcg gagttacgct ggcggtatca ac 42 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 9 catcccgaga catccgtaac tccgaagcgt tgataccgcc ag 42 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 10 gatgtctcgg gatggcttcg gagttacgga tgtctcggga tgatctataa gtgacagcaa 60 gac 63

Claims (7)

  1. 3 이상의 핵산 영역을 포함하는 핵산프로브에 있어서, 상기 핵산프로브의 각 핵산영역이 제 1 영역 및 상기 제 1 영역에 상보적인 제 2 영역을 인접하여 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산프로브.
  2. 제 1항에 따른 핵산프로브를 반응시켜 상기 핵산프로브의 폴리머를 형성하는 것을 특징으로 하는 프로브폴리머의 형성방법.
  3. 제 2항에 따른 방법에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 프로브폴리머.
  4. 제 2항의 방법에 의하여 프로브폴리머를 형성시키고, 상기 프로브폴리머를 검출하는 것에 의해 표적분석물을 검출하는 것을 특징으로 하는 표적분석물의 검출방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 표적분석물과 특이적으로 결합 가능하고 상기 핵산프로브의 일부 또는 전부로서 같은 염기배열을 가지는 어시스트프로브를 이용하고, 상기 표적분석물, 상기 어시스트프로브 및 상기 프로브폴리머를 포함하는 복합체를 형성하고, 상기 복합체를 분석하는 것에 의해 상기 표적분석물을 검출하는 것을 특징으로 하는 표적분석물의 검출방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 표적분석물이 핵산이며 상기 핵산프로브가 상기 표적핵산의 일부에 상보적인 배열을 가지는 것을 특징으로 하는 표적분석물의 검출방법.
  7. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
    상기 표적분석물이 핵산, 항원, 항체, 리셉터, 합텐, 효소, 단백질, 펩티드, 폴리머 및 당질로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 표적분석물의 검출방법.

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