JPWO2009022683A1 - 標的物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
パルサー法における検出感度の向上と多遺伝子同時検出を可能とする標的物質の検出方法及び検出用キットを提供する。ダイマープローブを形成する一対のダイマー形成用プローブ又はダイマープローブを１組以上、１種以上の架橋プローブ及び１種以上のアシストプローブを用いてシグナルプローブポリマーを形成させて標的物質を検出する方法であって、ダイマー形成用プローブは５’側領域、中央領域及び３’側領域を含み、架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、ダイマー形成用プローブの５’側領域は架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、ダイマー形成用プローブの３’側領域は架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、アシストプローブは一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な領域、他方の３’側領域に相補的な領域及び標的物質に結合可能なターゲット領域を含むようにした。
Description
本発明は、プローブポリマーを形成するダイマープローブ及び架橋プローブと、新規のアシストプローブとを含む標的物質の検出用キット、該検出用キットを用いた標的物質の検出方法、及びシグナルプローブポリマーの形成方法に関する。
酵素を使用しないシグナル増幅方法として、特許文献１は、下記式（１）の構造を有するダイマープローブと、下記式（２）及び下記式（３）の構造を有する２種の架橋プローブもしくは下記式（４）及び下記式（５）の構造を有する２種の架橋プローブとを用い、該ダイマープローブと架橋プローブの自己集合反応により集合体（ポリマー）を形成させるシグナル増幅方法（以下、パルサー法（ＰＡＬＳＡＲ法）と称する）を開示している。
前記式（１）〜（５）において、領域Ａと領域Ａ’、領域Ｂと領域Ｂ’、領域Ｃと領域Ｃ’、領域Ｄと領域Ｄ’、及び領域Ｆと領域Ｆ’はそれぞれ相補的塩基配列を有し、前記ダイマープローブ及び前記架橋プローブの結合により下記式（６）で示される構造を有する自己集合体が形成される。本願明細書中でシグナルプローブポリマーとは、ダイマープローブ及び架橋プローブにより形成される前記自己集合体を含む核酸プローブのポリマーを言う。
特許文献１は、上記パルサー法を利用した遺伝子の検出方法として、予め切断したダイマー形成用プローブを用い、ライゲーション反応により遺伝子を検出する方法を開示しているが、上記方法は複数サイクルのライゲーション反応を必要とした。
特許文献２及び３は、上記パルサー法を利用してターゲット遺伝子とプローブポリマーの複合体を形成させ、該プローブポリマーを検出することによりターゲット遺伝子を高感度に検出する方法を開示している。ターゲット遺伝子上にシグナルプローブポリマーを形成させる方法として、特許文献２は、ダイマー形成用プローブの末端の一領域をターゲット遺伝子と相補的塩基配列となるようにデザインする方法を開示している。また、特許文献３は、ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列及びポリマー形成に使用するプローブと相補的な塩基配列の両方を別途有するプローブ（アシストプローブ）を用いる方法を開示している。なお、本発明において、アシストプローブとは、検出する標的物質と結合可能な領域、及びポリマー形成に使用するプローブと相補的な配列の両方を有するプローブを言い、標的物質とシグナルプローブポリマーをつなぐ働きをする。アシストプローブを用いた方法は、被験遺伝子と相補的な部分を変えた複数のアシストプローブを準備することにより、同じ複数種のプローブのセットにより複数の遺伝子を同時に検出できるという利点を有している。
特許文献３は、ダイマープローブの１領域と相補的な配列を有するアシストプローブが記載されているが、高感度に標的物質を検出できるアシストプローブに関する検討はなされていない。
特開２００２−３５５０８１号公報
国際公開２００３／０２９４４１号
国際公開２００６／０２８１６２号
特許文献３は、ダイマープローブの１領域と相補的な配列を有するアシストプローブが記載されているが、高感度に標的物質を検出できるアシストプローブに関する検討はなされていない。
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、多種遺伝子同時検出にも対応したパルサー法による検出感度の向上を可能にすべく鋭意研究を重ねてきた。その結果、パルサー法に適したアシストプローブのデザイン方法を見出した。
本発明は、パルサー法における検出感度の向上と多種遺伝子同時検出を可能とする、新規なアシストプローブを用いた標的物質の検出方法、該方法に用いられる検出用キット、並びに該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法により形成されるシグナルプローブポリマーを提供することを目的とする。
本発明は、パルサー法における検出感度の向上と多種遺伝子同時検出を可能とする、新規なアシストプローブを用いた標的物質の検出方法、該方法に用いられる検出用キット、並びに該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法により形成されるシグナルプローブポリマーを提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明者らはアシストプローブのデザインについて鋭意研究を重ねた結果、パルサー法に最適なアシストプローブの設計方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明の標的物質の検出方法は、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、１種以上のアシストプローブと、を用いて、シグナルプローブポリマーを形成させて、標的物質を検出する標的物質の検出方法であって、前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な領域、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を含むことを特徴とする。
即ち、本発明の標的物質の検出方法は、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、１種以上のアシストプローブと、を用いて、シグナルプローブポリマーを形成させて、標的物質を検出する標的物質の検出方法であって、前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な領域、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を含むことを特徴とする。
前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な第１領域と、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な第２領域と、を含む１種以上の結合領域を１以上含み、該結合領域において、前記第１領域の５’側と前記第２領域の３’側は隣接してなることが好ましい。
前記ダイマー形成用プローブが１組の一対のダイマー形成用プローブであり、前記架橋プローブが１組の一対の架橋プローブであり、前記一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域は、前記一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ前記一対の架橋プローブの各５’側領域は、前記一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域は、前記一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ前記一対の架橋プローブの各３’側領域は、前記一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であることが好ましい。
また、前記ダイマー形成用プローブが複数組の一対のダイマー形成用プローブであり、前記架橋プローブが複数組の一対の架橋プローブであり、前記複数組の一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域は、前記複数組の一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ前記複数組の一対の架橋プローブの各５’側領域は、前記複数組の一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記複数組の一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域は、前記複数組の一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ前記複数組の一対の架橋プローブの各３’側領域は、前記複数組の一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であることが好適である。
本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、標的物質、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上、１種以上の架橋プローブ、及び１種以上のアシストプローブを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な領域、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を含むことを特徴とする。
本発明のシグナルプローブポリマーは、前述の本発明方法により形成されることを特徴とする。
本発明の標的物質の検出用キットは、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、１種以上のアシストプローブと、を含む標的物質の検出用キットであって、前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な領域、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を含むことを特徴とする。
本発明によれば、パルサー法を利用した標的物質の検出感度を著しく向上させることができる。また、本発明において、アシストプローブのターゲット領域を変化させる事により複数の標的物質を同時に検出する事が可能である。
１０ａ，１０ｂ：ダイマープローブ、１１ａ〜１１ｄ：ダイマー形成用プローブ、１２ａ〜１２ｄ：架橋プローブ、１３：水素結合、１４ａ〜１４ｃ：アシストプローブ、１６：標的物質、１８：シグナルプローブポリマー、２０ａ，２０ｂ：ダイマープローブ、２１ａ〜２１ｄ：ダイマー形成用プローブ、２２ａ〜２２ｄ：架橋プローブ。
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
図１は本発明の標的物質の検出用キットの第１の例を示す概略説明図である。図２は、図１記載の検出用キットを用いた標的物質の検出方法における、標的物質とアシストプローブとダイマープローブの結合態様の一例を示す概略説明図である。図３は、図１記載の検出用キットを用いた標的物質の検出方法の第１の例を示す概略説明図である。
本発明の標的物質の検出用キットは、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、１種以上のアシストプローブとを含むものである。
図１は、１組の一対のダイマー形成用プローブ、１組の一対の架橋プローブ、及び１種のアシストプローブを用いた場合の第１の例を示した。
図１は、１組の一対のダイマー形成用プローブ、１組の一対の架橋プローブ、及び１種のアシストプローブを用いた場合の第１の例を示した。
図１において、（ａ）は１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ１１ａ，第２ダイマー形成用プローブ１１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ１１ａ，１１ｂから形成されるダイマープローブ１０ａである。
図１（ａ）に示した如く、一対のダイマー形成用プローブは、２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ１１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ１１ｂ）からなり、各ダイマー形成用プローブ１１ａ，１１ｂは、中央領域、該中央領域より５’側に位置する５’側領域、及び該中央領域より３’側に位置する３’側領域の少なくとも３領域を含む。図１中、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示した。第１ダイマー形成用プローブ１１ａと第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの中央領域（領域Ｂ及びＢ’）は互いに相補的であり、第１ダイマー形成用プローブ１１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ１１ｂのそれぞれの５’側領域（領域Ａ及びＤ）及び３’側領域（領域Ｃ及びＦ）の４領域は全て互いに非相補的であり、両者をハイブリダイズさせることにより、１組のダイマープローブ１０ａが形成される。図中、符号１３は水素結合である。
図１（ａ）に示した如く、一対のダイマー形成用プローブは、２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ１１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ１１ｂ）からなり、各ダイマー形成用プローブ１１ａ，１１ｂは、中央領域、該中央領域より５’側に位置する５’側領域、及び該中央領域より３’側に位置する３’側領域の少なくとも３領域を含む。図１中、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示した。第１ダイマー形成用プローブ１１ａと第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの中央領域（領域Ｂ及びＢ’）は互いに相補的であり、第１ダイマー形成用プローブ１１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ１１ｂのそれぞれの５’側領域（領域Ａ及びＤ）及び３’側領域（領域Ｃ及びＦ）の４領域は全て互いに非相補的であり、両者をハイブリダイズさせることにより、１組のダイマープローブ１０ａが形成される。図中、符号１３は水素結合である。
本発明において、予め一対のダイマー形成用プローブをハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブを用いてもよく、ダイマー形成用プローブをそのまま用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。
複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、前述した１組の場合と同様に各組の一対のダイマー形成用プローブを構成する。複数組の一対のダイマー形成用プローブにより同数組のダイマープローブが形成される。
図１２は、２組の一対のダイマー形成用プローブの一例及び該一対のダイマー形成用プローブから形成される２組のダイマープローブを示す概略説明図である。図１２において、（ａ）は１組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ２１ａ，第２ダイマー形成用プローブ２１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ２１ａ，２１ｂから形成されるダイマープローブ２０ａであり、（ｂ）は２組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ２１ｃ，第２ダイマー形成用プローブ２１ｄ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ２１ｃ，２１ｄから形成されるダイマープローブ２０ｂである。
図１２中、１組目の第１ダイマー形成用プローブ２１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、１組目の第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示し、２組目の第１ダイマー形成用プローブ２１ｃの５’側領域を領域Ｇ、中央領域を領域Ｅ、３’側領域を領域Ｈで示し、２組目の第２ダイマー形成用プローブ２１ｄの５’側領域を領域Ｉ、中央領域を領域Ｅ’、３’側領域を領域Ｊで示した。各組の第１及び第２ダイマー形成用プローブの中央領域（領域Ｂ及びＢ’、領域Ｅ及びＥ’）はそれぞれ互いに相補的であり、各一対の第１及び第２ダイマー形成用プローブの５’側領域及び３’側領域の４領域（領域Ａ、Ｃ、Ｄ及びＦ、領域Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ）は全て互いに非相補的であり、各組の一対のダイマー形成用プローブ２１ａ，２１ｂ，２１ｃ，２１ｄをハイブリダイズさせることにより、２組のダイマープローブ２０ａ，２０ｂが形成される。本発明において、用いるダイマー形成用プローブの３’側領域及び５’側領域が全て互いに非相補的であることが好ましい。
図１２中、１組目の第１ダイマー形成用プローブ２１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、１組目の第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示し、２組目の第１ダイマー形成用プローブ２１ｃの５’側領域を領域Ｇ、中央領域を領域Ｅ、３’側領域を領域Ｈで示し、２組目の第２ダイマー形成用プローブ２１ｄの５’側領域を領域Ｉ、中央領域を領域Ｅ’、３’側領域を領域Ｊで示した。各組の第１及び第２ダイマー形成用プローブの中央領域（領域Ｂ及びＢ’、領域Ｅ及びＥ’）はそれぞれ互いに相補的であり、各一対の第１及び第２ダイマー形成用プローブの５’側領域及び３’側領域の４領域（領域Ａ、Ｃ、Ｄ及びＦ、領域Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ）は全て互いに非相補的であり、各組の一対のダイマー形成用プローブ２１ａ，２１ｂ，２１ｃ，２１ｄをハイブリダイズさせることにより、２組のダイマープローブ２０ａ，２０ｂが形成される。本発明において、用いるダイマー形成用プローブの３’側領域及び５’側領域が全て互いに非相補的であることが好ましい。
本発明において、架橋プローブはダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを架橋することができる１種以上の一本鎖核酸プローブであり、少なくとも２領域を含む。該２領域の内、５’側に位置する領域を５’側領域と称し、３’側に位置する領域を３’側領域と称する。本発明において、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的である。該構成とすることにより、架橋プローブは、ダイマー形成用プローブから形成される１種以上の複数のダイマープローブを架橋するように、ダイマー形成用プローブに結合し、プローブの集合体（プローブポリマー）を形成することができる。
１組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、１組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ及び第２ダイマー形成用プローブ）及び１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ及び第２架橋プローブ）は、一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各５’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各３’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成される。
図１（ｂ）は、図１（ａ）記載の一対のダイマー形成用プローブ１１ａ，１１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ１２ａ及び第２架橋プローブ１２ｂ）の一例を示す概略説明図である。
図１（ａ）記載の１組の一対のダイマー形成用プローブ１１ａ，１１ｂと共に用いられる架橋プローブとしては、例えば、図１（ｂ）に示した如く、第１架橋プローブ１２ａの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ１２ａの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的であり、第２架橋プローブ１２ｂの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ１２ｂの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である、一対の架橋プローブが好適である。図１（ａ）記載のダイマー形成用プローブ１１ａ−１１ｂ及び図１（ｂ）記載の架橋プローブ１２ａ−１２ｂをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー１８を形成することができる（図３）。
なお、本発明において、領域Ａ’は領域Ａに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｂ’は領域Ｂに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｃ’は領域Ｃに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｄ’は領域Ｄに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｆ’は領域Ｆに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。
図１（ａ）記載の１組の一対のダイマー形成用プローブ１１ａ，１１ｂと共に用いられる架橋プローブとしては、例えば、図１（ｂ）に示した如く、第１架橋プローブ１２ａの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ１２ａの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的であり、第２架橋プローブ１２ｂの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ１２ｂの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である、一対の架橋プローブが好適である。図１（ａ）記載のダイマー形成用プローブ１１ａ−１１ｂ及び図１（ｂ）記載の架橋プローブ１２ａ−１２ｂをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー１８を形成することができる（図３）。
なお、本発明において、領域Ａ’は領域Ａに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｂ’は領域Ｂに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｃ’は領域Ｃに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｄ’は領域Ｄに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｆ’は領域Ｆに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。
図１では、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第１架橋プローブ１２ａの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第２架橋プローブ１２ｂの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、１つのダイマー形成用プローブの５’側領域が１つの架橋プローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマー形成用プローブの３’側領域が１つの架橋プローブの３’側領域と相補的であればよいものである。
図４は、図１記載の一対のダイマー形成用プローブ１１ａ，１１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ１２ｃ及び第２架橋プローブ１２ｄ）の他の例を示す概略説明図である。
図４に示した如く、一対の架橋プローブの他の例として、第１架橋プローブ１２ｃの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ１２ｃの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的であり、第２架橋プローブ１２ｄの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ１２ｄの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である、一対の架橋プローブが挙げられる。図１（ａ）記載のダイマー形成用プローブ１１ａ−１１ｂ及び図４記載の架橋プローブ１２ｃ−１２ｄをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー１８を形成することができる（図５）。
図４に示した如く、一対の架橋プローブの他の例として、第１架橋プローブ１２ｃの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ１２ｃの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的であり、第２架橋プローブ１２ｄの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ１２ｄの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である、一対の架橋プローブが挙げられる。図１（ａ）記載のダイマー形成用プローブ１１ａ−１１ｂ及び図４記載の架橋プローブ１２ｃ−１２ｄをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー１８を形成することができる（図５）。
複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、同数組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。具体的には、ｎ組（ｎは２以上の整数）の一対のダイマー形成用プローブ（即ち、２ｎ個のダイマー形成用プローブ）及びｎ組の一対の架橋プローブ（即ち、２ｎ個の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの５’側領域は、ダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの３’側領域は、前記ダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成することが好適である。
図１３は、図１２記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ２１ａ−２１ｄと共に用いられる２組の一対の架橋プローブ２２ａ−２２ｄの一例を示す概略説明図である。図１３において、（ａ）は１組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ２２ａ，第２架橋プローブ２２ｂ）であり、（ｂ）は２組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ２２ｃ，第２架橋プローブ２２ｄ）である。
図１３に示した如く、図１２記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ２１ａ−２１ｄと共に用いられる架橋プローブとしては、２組の一対の架橋プローブ（即ち、４種の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域が架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各架橋プローブの５’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域が架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、各架橋プローブの３’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成することが好適である。
図１３に示した如く、図１２記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ２１ａ−２１ｄと共に用いられる架橋プローブとしては、２組の一対の架橋プローブ（即ち、４種の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域が架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各架橋プローブの５’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域が架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、各架橋プローブの３’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成することが好適である。
具体的には、図１３に示した如く、１組目の第１架橋プローブ２２ａの５’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ２１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ２２ｂの５’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ２２ｃの５’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ２１ｃの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ２２ｄの５’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ２１ｄの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、１組目の第１架橋プローブ２２ａの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ２１ａ−２１ｄのいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１３では、領域Ｈと相補的である場合を示した）、１組目の第２架橋プローブ２２ｂの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ２１ａ−２１ｄ中、１組目の第１架橋プローブ２２ａで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１３では、領域Ｊと相補的である場合を示した）、２組目の第１架橋プローブ２２ｃの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ２１ａ−２１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ２２ａ−２２ｂで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１３では、領域Ｃと相補的である場合を示した）、２組目の第２架橋プローブ２２ｄの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ２１ａ−２１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ２２ａ−２２ｂ及び２組目の第１架橋プローブ２２ｃで選択したものを除く１つの３’側領域と相補的である（図１３では、領域Ｆと相補的である場合を示した）、２組の一対の架橋プローブが好適である。図１２記載のダイマー形成用プローブ２１ａ−２１ｄ及び図１３記載の架橋プローブ２２ａ−２２ｄをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー１８を形成することができる。
なお、本発明において、領域Ｅ’は領域Ｅに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｇ’は領域Ｇに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｈ’は領域Ｈに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｉ’は領域Ｉに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｊ’は領域Ｊに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。
なお、本発明において、領域Ｅ’は領域Ｅに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｇ’は領域Ｇに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｈ’は領域Ｈに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｉ’は領域Ｉに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｊ’は領域Ｊに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。
なお、図１３では、１組目の第１架橋プローブ２２ａの３’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ２１ｃの３’側領域と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ２２ｂの３’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの３’側領域と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ２２ｃの３’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ２１ａの３’側領域と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ２２ｄの３’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの３’側領域と相補的である場合を示したが、各架橋プローブの３’側領域と相補的となるダイマー形成用プローブの３側領域の組み合わせに制限はないものである。
ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの各相補的な領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１２〜３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的な領域の長さは同じであることが望ましい。
ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの各領域の塩基配列は、所定の領域が相補的な塩基配列であり且つ所定の領域が非相補的な塩基配列となるように構成されればよく特に制限はないが、各領域の両末端の塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。各領域の両末端の塩基をグアニン又はシトシンとすることにより、反応時間を短縮させることができ、さらにより低い反応温度で安定したプローブポリマーを形成させることができ、作業性及び検出感度を向上させることができる。
本発明において、非相補的な塩基配列とは、互いにハイブリダイズしない塩基配列であればいかなるものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列に含まれるものである。
図６は、本発明に用いられる１組の一対のダイマー形成用プローブ及び１種の一対の架橋プローブの第２の例を示す概略説明図である。図６（ａ）において、符号１０ｂはダイマープローブであり、３’側領域並びに５’側領域をそれぞれ同一の塩基配列とした２種のダイマー形成用プローブ１１ｃ，１１ｄを用いてダイマーを形成した例を示した。即ち、図１のダイマープローブ１０ａにおいて、領域Ａと領域Ｄを同一の塩基配列とし、領域Ｃと領域Ｆを同一の塩基配列としたものである。該構成とすることにより、図６（ｂ）に示した如く、ダイマープローブ１０ｂと共に用いられる一対の架橋プローブは同一となり、１種の架橋プローブ１２ｃが用いられる。図６記載のダイマー形成用プローブ１１ｃ−１１ｄ及び架橋プローブ１２ｃをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー１８を形成することができる（図７）。
図６は、本発明に用いられる１組の一対のダイマー形成用プローブ及び１種の一対の架橋プローブの第２の例を示す概略説明図である。図６（ａ）において、符号１０ｂはダイマープローブであり、３’側領域並びに５’側領域をそれぞれ同一の塩基配列とした２種のダイマー形成用プローブ１１ｃ，１１ｄを用いてダイマーを形成した例を示した。即ち、図１のダイマープローブ１０ａにおいて、領域Ａと領域Ｄを同一の塩基配列とし、領域Ｃと領域Ｆを同一の塩基配列としたものである。該構成とすることにより、図６（ｂ）に示した如く、ダイマープローブ１０ｂと共に用いられる一対の架橋プローブは同一となり、１種の架橋プローブ１２ｃが用いられる。図６記載のダイマー形成用プローブ１１ｃ−１１ｄ及び架橋プローブ１２ｃをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー１８を形成することができる（図７）。
本発明のアシストプローブは、少なくとも１組の一対のダイマー形成用プローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、該一対のダイマー形成用プローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有し、少なくとも１つのダイマープローブの一端の２つの一本鎖領域と結合される。
図１（ｃ）は、図１（ａ）記載の１組の一対のダイマー形成用プローブ１１ａ，１１ｂと共に用いられる本発明のアシストプローブの一例を示す。図１（ｃ）において、１４ａは本発明のアシストプローブの第１の例であり、ダイマープローブ１０ａの第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域（領域Ａ）に相補的な配列を有する領域（領域Ａ’）、ダイマープローブ１０ａの第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域（領域Ｆ）に相補的な配列を有する領域（領域Ｆ’）、及び標的物質に結合可能なターゲット領域（領域Ｔ）を有する。該アシストプローブ１４ａにおいて、領域Ｆ’の３’側と領域Ａ’の５’側は隣接してなる。
本発明のアシストプローブにおいて、各領域の位置関係に特に制限はないが、図１に示した如く、ダイマー形成用プローブと結合する各領域が隣接してなることが好ましい。本発明において、組の一対の一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域（第１領域）と、該一対の他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域（第２領域）と、を含む領域を結合領域と称する。該結合領域において、一対の一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な第１領域（例えば、領域Ａ’）の５’側と、該一対の他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な第２領域（例えば、領域Ｆ’）の３’側が隣接してなることがより好ましい。
具体的には、図１記載のダイマープローブ１０ａを用いる場合、アシストプローブが、領域Ｆ’Ａ’（領域Ｆ’と領域Ａ’とからなり且つ領域Ｆ’の３’側と領域Ａ’の５’側が隣接してなる領域）、及び領域Ｃ’Ｄ’（領域Ｃ’と領域Ｄ’とからなり且つ領域Ｃ’の３’側と領域Ｄ’の５’側が隣接してなる領域）からなる群から選択される１種以上の結合領域を１又は複数回含むことが好ましい。該構成とすることにより、図２に示した如く、アシストプローブは、ダイマープローブの一端の一本鎖の２領域と連続して結合し、標的物質を高感度に検出することができる。
本発明のアシストプローブにおいて、ターゲット領域は標的物質に応じて適宜選択可能である。標的物質が核酸の場合は、ターゲット領域が標的核酸に相補的な塩基配列を有するように構成することが好ましい。標的物質が抗原等のタンパク質の場合は、抗体等の標的物質と特異的に結合する物質を直接又は間接的に結合させることが好ましい。なお、図２では、アシストプローブ１４ａを標的物質１６に直接結合させた例を示したが、アシストプローブ１４ａと標的物質１６を他の核酸プローブ等を介して間接的に結合させてもよい。
ターゲット領域（領域Ｔ）は、アシストプローブの端部に位置することが好ましい。また、ダイマープローブと結合する領域とターゲット領域は隣接してなることが好適である。なお、図１では、３’末端にターゲット領域（領域Ｔ）を設けた例を示したが、５’末端にターゲット領域（領域Ｔ）を設けてもよい。
ターゲット領域（領域Ｔ）は、アシストプローブの端部に位置することが好ましい。また、ダイマープローブと結合する領域とターゲット領域は隣接してなることが好適である。なお、図１では、３’末端にターゲット領域（領域Ｔ）を設けた例を示したが、５’末端にターゲット領域（領域Ｔ）を設けてもよい。
図１記載のダイマープローブ１０ａ、架橋プローブ１２ａ，１２ｂ、アシストプローブ１２ａ、及び標的物質１６を反応させることにより、図３に示した如く、ダイマープローブ１０ａと架橋プローブ１２ａ，１２ｂとから形成されたポリマー、アシストプローブ１４ａ及び標的物質１６を含む複合体からなるシグナルプローブポリマー１８が形成される。
本発明において、ダイマープローブ、架橋プローブ、アシストプローブ、及び標的物質は同時に反応させることもできるが、標的物質とアシストプローブを反応させた後、該反応物にダイマープローブと架橋プローブを反応させることが好ましい。また、ダイマープローブ形成前のダイマー形成用プローブを用い、ダイマー形成用プローブ、架橋プローブ、アシストプローブ及び標的物質を反応させてプローブポリマーを形成させることもできる。
本発明において、ダイマープローブ、架橋プローブ、アシストプローブ、及び標的物質は同時に反応させることもできるが、標的物質とアシストプローブを反応させた後、該反応物にダイマープローブと架橋プローブを反応させることが好ましい。また、ダイマープローブ形成前のダイマー形成用プローブを用い、ダイマー形成用プローブ、架橋プローブ、アシストプローブ及び標的物質を反応させてプローブポリマーを形成させることもできる。
前記形成されたシグナルプローブポリマー１８を検出することにより、標的物質１６を検出することができる。シグナルプローブポリマーの検出方法は特に限定されないが、標識物質で標識したダイマープローブを用い、該標識物質を検出することによりシグナルプローブポリマーを検出することが好適である。標識物質としては、例えば、前記標識物質としては、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。また、形成されたシグナルプローブポリマーに、エチジウムブロマイド、Oligreen、SYBRGreen I等のインターカレーターを結合させて、蛍光等により検出してもよい。
図５は、標的物質の検出方法の第２の例を示す概略説明図であり、図１記載の検出用キットにおいて、架橋プローブとして図４記載の架橋プローブ１２ｃ，１２ｄを用いた場合の例を示した。図７は、標的物質の検出方法の第３の例を示す概略説明図であり、図６記載のダイマープローブ１２ｂ、図６記載の架橋プローブ１２ｃ、及び図１記載のアシストプローブ１４ａを含む検出用キットを用いた場合の例を示した。
本発明の検出用キットにおいて、アシストプローブの配列はダイマープローブの構成及び標的物質に応じて決定される。図１〜図７に示した如く、本発明の検出用キットにおいて、ダイマー形成用プローブや架橋プローブを変更しても、ダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域及び他方のダイマー形成用プローブの３’側領域の構成が同じ場合は、同じアシストプローブ１４ａを用いることができる。
本発明の検出用キットにおいて、アシストプローブの配列はダイマープローブの構成及び標的物質に応じて決定される。図１〜図７に示した如く、本発明の検出用キットにおいて、ダイマー形成用プローブや架橋プローブを変更しても、ダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域及び他方のダイマー形成用プローブの３’側領域の構成が同じ場合は、同じアシストプローブ１４ａを用いることができる。
図８は、図１記載のダイマープローブと共に用いられるアシストプローブの第２の例を示す概略説明図であり、図９は、図８記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。図１０は、図１記載のダイマープローブと共に用いられるアシストプローブの第３の例を示す概略説明図であり、図１１は、図１０記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。
本発明のアシストプローブは、ダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な１領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な１領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域に加えて、形成されるダイマープローブの一本鎖領域に相補的な領域を１以上更に含むことにより、１本のアシストプローブを２個以上のダイマープローブと結合させることができる。
２個のダイマープローブと結合するアシストプローブの例を図８〜図１１に示す。図８〜図１１において、１４ｂ及び１４ｃはアシストプローブであり、図１記載のアシストプローブ１４ａに対してさらにダイマープローブの一本鎖領域（領域Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ）に相補的な追加領域（領域Ａ’，Ｃ’，Ｄ’又はＦ’）を１以上追加した構成、即ち、ダイマープローブ１０ａの一端部の２領域と相補的であり、該２領域と連続して結合可能な領域Ｆ’Ａ’並びに標的物質と結合可能なターゲット領域Ｔに加えて、追加領域を１以上有するように構成され、且つターゲット領域Ｔがアシストプローブの端部に位置するように構成されている。
アシストプローブの追加領域の数及び種類は特に限定されず、例えば、図１０に示した如く、アシストプローブの追加領域を１領域とし、図１１に示した如く、ダイマープローブの１領域と結合させてもよいが、図８に示した如く、アシストプローブの追加領域をダイマープローブの一端の２領域と結合可能な２領域（例えば、領域Ｆ’Ａ’、領域Ｃ’Ｄ’）を１個以上含む２以上の領域とし、図９に示した如く、ダイマープローブの一端の２領域と連続して結合させることが好ましい。アシストプローブと結合させるダイマープローブの端部に制限はなく、図９に示した如く、同一端側で２以上のダイマープローブを結合させてもよく、図１１に示した如く、異なる端部を組み合わせて２以上のダイマープローブを結合させてもよい。また、２組以上のダイマープローブを用いる場合は、２組以上のダイマープローブをアシストプローブと結合させてもよい。
本発明のアシストプローブは、図８及び図９に示した如く、ダイマープローブの一端の２領域に相補的な２領域（例えば、領域Ｆ’及び領域Ａ’）を交互に含むことが好ましい。該構成とすることにより、１本のアシストプローブは、同種のダイマープローブの同一端側の２領域と交互に連続して結合可能となり、標的物質を極めて高感度に検出することができる。ダイマープローブの一端の２領域に相補的な２領域を交互に含む配列において、最初及び最後の領域は該２領域のいずれも選択可能であるが、図８及び図９に示した如く、ダイマープローブの一端の２領域と連続して結合可能な領域（例えば、領域Ｆ’Ａ’、領域Ｃ’Ｄ’）を複数回含む構成とすることが好ましい。
本発明の標的物質の検出方法は、標的物質を捕捉可能な物質を固定化させた担体を用いることが好ましい。例えば、標的物質が核酸の場合は、アシストプローブとの結合部位とは異なる部位に相補的な配列を有する核酸プローブを捕捉用プローブ（キャプチャープローブ）として用い、該捕捉用プローブを表面に固定化させた担体を用いることが好ましい。アシストプローブと捕捉用プローブが隣接する状態で標的核酸に結合するように構成することが好適である。
前記担体としては、例えば、蛍光微小粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板を用いることが好ましい。
前記担体としては、例えば、蛍光微小粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板を用いることが好ましい。
本発明において、ターゲット領域Ｔが異なる複数のアシストプローブを併用することにより、複数種の標的物質を同時に検出することが可能である。複数種の標的物質の同時検出において、ダイマープローブ及び架橋プローブは同一のものが使用可能であり、アシストプローブ及び標的物質を捕捉する担体のみを複数種準備すればよく、作業性に優れ、低コストである。
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
（実施例１）
ダイマープローブ及び架橋プローブとして、図１記載の１種のダイマープローブ及び２種の架橋プローブを用いた。
ダイマープローブの形成に用いられる核酸プローブとして、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する２種のオリゴヌクレオチドプローブ［第１ダイマー形成用プローブ−１，第２ダイマー形成用プローブ−１］を用いた。
第１ダイマー形成用プローブ−１の塩基配列（5'-ABC-3'）
5'-DIG-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG GTTCGCCATAGACG-3'（配列番号１）
第２ダイマー形成用プローブ−１の塩基配列（5'-DB'F-3'）
5'-DIG-GCACATTCACACCG CGACGCAGCCGAGG CCTGACCTCTATGC-3'（配列番号２）
ダイマープローブ及び架橋プローブとして、図１記載の１種のダイマープローブ及び２種の架橋プローブを用いた。
ダイマープローブの形成に用いられる核酸プローブとして、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する２種のオリゴヌクレオチドプローブ［第１ダイマー形成用プローブ−１，第２ダイマー形成用プローブ−１］を用いた。
第１ダイマー形成用プローブ−１の塩基配列（5'-ABC-3'）
5'-DIG-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG GTTCGCCATAGACG-3'（配列番号１）
第２ダイマー形成用プローブ−１の塩基配列（5'-DB'F-3'）
5'-DIG-GCACATTCACACCG CGACGCAGCCGAGG CCTGACCTCTATGC-3'（配列番号２）
前記第１ダイマー形成用プローブ−１及び第２ダイマー形成用プローブ−１を各５００ｐｍｏｌ／ｍＬになるように溶液［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］に溶解した後、該溶液を９４℃で１分加熱後、６０℃で２時間反応させ、ダイマープローブ溶液を調製した。
前記架橋プローブとしては、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する２種のオリゴヌクレオチドプローブ［第１架橋プローブ−１，第２架橋プローブ−１］を用いた。
第１架橋プローブ−１の塩基配列（5'-A'C'-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG CGTCTATGGCGAAC-3'（配列番号３）
第２架橋プローブ−１の塩基配列（5'-D'F'-3'）
5'-CGGTGTGAATGTGC GCATAGAGGTCAGG-3'（配列番号４）
第１架橋プローブ−１の塩基配列（5'-A'C'-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG CGTCTATGGCGAAC-3'（配列番号３）
第２架橋プローブ−１の塩基配列（5'-D'F'-3'）
5'-CGGTGTGAATGTGC GCATAGAGGTCAGG-3'（配列番号４）
前記第１架橋プローブ−１及び第２架橋プローブ−１を各５００ｐｍｏｌ／ｍＬになるように溶液［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］に溶解し、架橋プローブ溶液を調製した。
標的物質として、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のｒＲＮＡと同じ塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ターゲットオリゴＤＮＡ）を用いた。
ターゲットオリゴＤＮＡの塩基配列
5'-TTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGAT GGATCCGCGCTGCATTAGCTA-3'（配列番号５）
ターゲットオリゴＤＮＡの塩基配列
5'-TTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGAT GGATCCGCGCTGCATTAGCTA-3'（配列番号５）
アシストプローブとして、５’側から順に、前記第２ダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、前記第２ダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−１、図１記載のアシストプローブ）を用いた。
アシストプローブ−１の塩基配列（5'-F'A'-T1-3'）
5'-GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号６）
アシストプローブ−１を２５ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］に溶解させ、アシストプローブ溶液を調製した。
アシストプローブ−１の塩基配列（5'-F'A'-T1-3'）
5'-GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号６）
アシストプローブ−１を２５ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］に溶解させ、アシストプローブ溶液を調製した。
キャプチャープローブとして、前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な配列を有する核酸プローブを用いた。
キャプチャープローブの塩基配列
5’-CGTCTTTCACTTTTGAACCATGCGGTTCAAAATATTATCCGG-3’-Amino link（配列番号７）
前記キャプチャープローブを各々ストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレー
ト上に固定し、実験に用いた。
キャプチャープローブの塩基配列
5’-CGTCTTTCACTTTTGAACCATGCGGTTCAAAATATTATCCGG-3’-Amino link（配列番号７）
前記キャプチャープローブを各々ストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレー
ト上に固定し、実験に用いた。
前記調製したストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートに各濃度のターゲットオリゴＤＮＡ（０．１，１又は１０ｆｍｏｌ／ｍＬ）を５０μＬ、アシストプローブ溶液を５０μＬずつ添加し、プレートシーラーでしっかりとシールし、マイクロプレートの上部２０℃、下部５５℃に設定した条件下で４５分間反応させた。反応後、洗浄液［50mM-Tris, 0.3M-NaCl, 0.01％-TritonX-100, pH7.6］で洗浄した。
洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートにダイマープローブ溶液を２５μＬ、架橋プローブ溶液を２５μＬ、溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）］を５０μＬ添加し、プレートシーラーでしっかりとシールした。マイクロプレートの上部２０℃、下部５５℃に設定した条件下で３０分間反応させた後、洗浄液で洗浄した。
マイクロプレートウェルを洗浄後、15mU/mLのALP標識抗ジゴキシゲニン(100mM Tris, pH 7.5)を１００μＬ加え、３７℃のインキュベーターで反応させた。洗浄液で洗浄後、発光基質液（CDP-Star、TROPIX製）を１００μＬ加え、暗所で２０分反応後、ルミノメーター（Centro LB960、Berthold製）で発光強度（RLU）を測定した。結果を表１に示す。
（実施例２）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、下記塩基配列を有するアシストプローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−２の塩基配列（5'-F'A'-F'A'-T1-3'）
5'-GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATG GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATGATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号８）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、下記塩基配列を有するアシストプローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−２の塩基配列（5'-F'A'-F'A'-T1-3'）
5'-GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATG GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATGATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号８）
（実施例３）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、下記塩基配列を有するアシストプローブ−３を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−３の塩基配列（5'-A'-C'D'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG CGTCTATGGCGAAC CGGTGTGAATGTGC ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号９）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、下記塩基配列を有するアシストプローブ−３を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−３の塩基配列（5'-A'-C'D'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG CGTCTATGGCGAAC CGGTGTGAATGTGC ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号９）
（実験例１）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第１ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域と相補的な領域及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−４）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−４の塩基配列（5'-A'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１０）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第１ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域と相補的な領域及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−４）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−４の塩基配列（5'-A'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１０）
（実験例２）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第１ダイマー形成用プローブ−１全てと同じ塩基配列（即ち、第１架橋プローブ−１の５’側領域に相補的な領域、架橋プローブと結合しない領域、及び第１架橋プローブ−１の３’側領域に相補的な領域からなる）及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−５）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−５の塩基配列（5'-ABC-T1-3'）
5'-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG GTTCGCCATAGACG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１１）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第１ダイマー形成用プローブ−１全てと同じ塩基配列（即ち、第１架橋プローブ−１の５’側領域に相補的な領域、架橋プローブと結合しない領域、及び第１架橋プローブ−１の３’側領域に相補的な領域からなる）及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−５）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−５の塩基配列（5'-ABC-T1-3'）
5'-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG GTTCGCCATAGACG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１１）
（実験例３）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第１ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域に相補的な領域、ダイマープローブ及び架橋プローブと結合しない領域、第１ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域に相補的な領域、及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−８）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−８の塩基配列（5'-A'EC'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG GGTGCCGTCGCTGC CGTCTATGGCGAAC ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１２）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第１ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域に相補的な領域、ダイマープローブ及び架橋プローブと結合しない領域、第１ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域に相補的な領域、及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−８）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−８の塩基配列（5'-A'EC'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG GGTGCCGTCGCTGC CGTCTATGGCGAAC ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１２）
（実験例４）
ターゲットオリゴＤＮＡと相補的な配列を有するダイマープローブを用いて実験を行った。
第１ダイマー形成用プローブ−１の代わりに、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する第１ダイマー形成用プローブ−２を用いた以外は実施例１と同様にダイマープローブ溶液を調製した。
第１ダイマー形成用プローブ−２の塩基配列（5'-AB-T2-3'）
5'-DIG-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG AGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１３）
第１架橋プローブ−１の代わりに、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する第１架橋プローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に架橋プローブ溶液を調製した。
第１架橋プローブ−２の塩基配列（5'-A'-T2'-3'）
5'-DIG-GACCAGCAGAGATG GTCTTGCTGTCACT-3'（配列番号１４）
ターゲットオリゴＤＮＡと相補的な配列を有するダイマープローブを用いて実験を行った。
第１ダイマー形成用プローブ−１の代わりに、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する第１ダイマー形成用プローブ−２を用いた以外は実施例１と同様にダイマープローブ溶液を調製した。
第１ダイマー形成用プローブ−２の塩基配列（5'-AB-T2-3'）
5'-DIG-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG AGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１３）
第１架橋プローブ−１の代わりに、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する第１架橋プローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に架橋プローブ溶液を調製した。
第１架橋プローブ−２の塩基配列（5'-A'-T2'-3'）
5'-DIG-GACCAGCAGAGATG GTCTTGCTGTCACT-3'（配列番号１４）
アシストプローブ溶液の代わりに、アシストプローブを含まない溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］を用い、さらに、ダイマープローブ溶液及び架橋プローブ溶液を前述の如く変更した以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
（実験例５）
アシストプローブ溶液の代わりに、実験例４記載の第１ダイマー形成用プローブ−２を２５ｐｍｏｌ／ｍＬ含む溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］を用い、さらに、ダイマープローブ溶液及び架橋プローブ溶液を実験例４と同様に変更した以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ溶液の代わりに、実験例４記載の第１ダイマー形成用プローブ−２を２５ｐｍｏｌ／ｍＬ含む溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］を用い、さらに、ダイマープローブ溶液及び架橋プローブ溶液を実験例４と同様に変更した以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
表１に示した如く、本発明のアシストプローブを用いた実施例１〜３は、検出感度が著しく向上した。
Claims (7)
- 一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、１種以上のアシストプローブと、を用いて、シグナルプローブポリマーを形成させて、標的物質を検出する標的物質の検出方法であって、
前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、
前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、
前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、
前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な領域、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を含むことを特徴とする標的物質の検出方法。 - 前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な第１領域と、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な第２領域と、を含む１種以上の結合領域を１以上含み、該結合領域において、前記第１領域の５’側と前記第２領域の３’側は隣接してなることを特徴とする請求項１記載の標的物質の検出方法。
- 前記ダイマー形成用プローブは、１組の一対のダイマー形成用プローブであり、前記架橋プローブは、１組の一対の架橋プローブであり、
前記一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域は、前記一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ前記一対の架橋プローブの各５’側領域は、前記一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、
前記一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域は、前記一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ前記一対の架橋プローブの各３’側領域は、前記一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であることを特徴とする請求項１又は２記載の標的物質の検出方法。 - 前記ダイマー形成用プローブは、複数組の一対のダイマー形成用プローブであり、前記架橋プローブは、複数組の一対の架橋プローブであり、
前記複数組の一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域は、前記複数組の一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ前記複数組の一対の架橋プローブの各５’側領域は、前記複数組の一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、
前記複数組の一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域は、前記複数組の一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ前記複数組の一対の架橋プローブの各３’側領域は、前記複数組の一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であることを特徴とする請求項１又は２記載の標的物質の検出方法。 - 標的物質、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上、１種以上の架橋プローブ、及び１種以上のアシストプローブを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、
前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、
前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、
前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、
前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な領域、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を含むことを特徴とするシグナルプローブポリマーの形成方法。 - 請求項５記載の方法により形成されることを特徴とするシグナルプローブポリマー。
- 一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、１種以上のアシストプローブと、を含む標的物質の検出用キットであって、
前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、
前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、
前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、
前記アシストプローブは、前記一対のダイマー形成用プローブの一方の５’側領域に相補的な領域、該一対のダイマー形成用プローブの他方の３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を含むことを特徴とする標的物質の検出用キット。
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