ES2317893T3

ES2317893T3 - Sondas para construir polimeros de sondas, procedimiento para construir un polimero de sondas y uso del mismo.

Info

Publication number: ES2317893T3
Application number: ES01917537T
Authority: ES
Inventors: Mitsugu Usui; Chikako Hakii; Mari Mitsuka
Original assignee: Sanko Junyaku Co Ltd
Current assignee: Sanko Junyaku Co Ltd
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: EP1188841A4; JP3310662B2; KR20020033599A; CA2387755C; CN1364199B; DK1188841T3; AU4458301A; CA2387755A1; KR100446358B1; DE60137104D1; AU747848B2; PT1188841E; EP1188841B1; WO2001075157A1; US20030008294A1; US7060814B2; ATE418620T1; EP1188841A1; CN1364199A

Abstract

Un par de primera y segunda sonda de ácido nucleico que tiene las siguientes características (a), (b) y (c): (a) un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico cada una compuesta por n (n = 3) regiones de secuencias de bases complementarias entre sí, en el que una región X1, una región X2, una región X3, ..., una región X n, proporcionadas en este orden desde el terminal 5'' de la primera sonda de ácido nucleico, tienen secuencias de bases complementarias, respectivamente, a una región X'' 1, una región X'' 2, una región X'' 3, ..., una región X'' n proporcionadas en este orden desde el terminal 5'' de la segunda sonda de ácido nucleico; (b) cuando un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico reaccionan entre sí, la región X1 sólo se hibrida con la región X'' 1, la región X 2 sólo se hibrida con la región X'' 2, la región X 3 sólo se hibrida con la región X''3, ... y la región Xn sólo se hibrida con la región X''n, y cuando ambas sondas se unen, se hibridan entre sí en una cualquiera de las regiones de una sonda, y una pluralidad de pares de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico unidas en esa una región se hibridan entre sí para formar un polímero de sondas; y (c) al menos una G (guanina) o una C (citosina) está dispuesta en ambos terminales de cada una de las regiones de secuencias de bases complementarias en un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, y tras la hibridación de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, se forma al menos un enlace C-G en todos los terminales de las regiones complementarias.

Description

Sondas para construir polímeros de sondas, procedimiento para construir un polímero de sondas y uso del mismo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un par de sondas formadoras de polímeros de sondas cada una compuesta por n (n \geq 3) partes de secuencias de bases complementarias entre sí, a un procedimiento para formar un polímero de sondas mediante el uso de las sondas y a un procedimiento para detectar un gen diana mediante el uso del anterior procedimiento.

Técnica anterior

Los procedimientos para analizar el ADN en el campo de la ingeniería genética son procedimientos muy útiles para buscar nuevos genes y genes patógenos, así como para diagnosticar enfermedades genéticas, enfermedades cancerígenas, enfermedades infecciosas, etcétera. Como procedimiento para la amplificación y el análisis de un gen diana, se usa ampliamente el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (USP 4683195; 4683202). Como procedimientos alternativos están un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa ("A RT-PCR method", Trends in Biotechnology, 10, 146-152, 1992), un procedimiento de reacción inversa de la ligasa (LCR, EP 320308), etcétera. Debido a que estas técnicas implican etapas tales como una separación de cadenas de ADN bicatenario en cadenas simples, la síntesis de cadenas complementarias a partir de cebadores, etc., que requieren la repetición múltiple de reacciones a alta y baja temperatura; es necesario un controlador de la temperatura riguroso, suponiendo los largos períodos de tiempo para el ajuste de la temperatura una pérdida de tiempo. Además, las técnicas anteriores requieren una enzima costosa.

A partir de entonces, se desarrolló un procedimiento de amplificación del ADN en condiciones isotérmicas para solventar el problema del control de la temperatura. Por ejemplo, existe un procedimiento de amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA, Nucleic Acid Res., 20, 1691-1696, 1992), un procedimiento de amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA, Nature, 350, 91-92, 1991) y un procedimiento de la replicasa Q\beta (BioTechnology, 6, 1197-1202, 1988). Estos procedimientos se pueden llevar a cabo ventajosamente en condiciones isotérmicas, pero requieren enzimas costosas tales como ADN polimerasa, endonucleasas de restricción, etc.

Estos procedimientos isotérmicos de amplificación basada en ácidos nucleicos presentan algunos problemas en cuanto al número de cebadores y al funcionamiento, y existe la demanda de establecer un procedimiento de amplificación basada en ácidos nucleicos y un procedimiento de detección de ácidos nucleicos de técnicas sencillas a un bajo coste sin el uso de enzimas.

Por otro lado, la amplificación de genes mediante el procedimiento con sondas de ADN ramificado implica sintetizar anteriormente una sonda de ADN monocatenario de polímero ramificado e hibridarla con un gen diana para detectar el gen diana. Sin embargo, la hibridación de la sonda de ADN monocatenario de polímero ramificado con el gen diana requiere mucho tiempo, porque la sonda de ADN ramificado es un polímero. Además, el ADN monocatenario de polímero ramificado tiene un tamaño limitado, por lo que la detección del gen diana también es limitada.

En vista de los problemas descritos anteriormente, el presente solicitante propuso previamente un nuevo procedimiento isotérmico de amplificación basada en ácidos nucleicos (un procedimiento para formar un polímero de sondas) sin el uso de enzimas (EP 1002877A). Este procedimiento propuesto hace uso de un par de sondas cada una compuesta por tres partes (Sonda HoneyComb, denominada en lo sucesivo HCP), estando las tres partes de la primera sonda compuestas por secuencias de bases complementarias entre sí, y estando las secuencias de bases de ambas sondas diseñadas tal que tras la reacción, las tres regiones de una sonda se hibriden sólo con tales regiones de la otra sonda. Mediante este procedimiento, se hace posible la hibridación entre sí de una pluralidad de pares de sondas tras la reacción para formar un polímero de las sondas (una reacción de auto-ensamblaje de enlaces con alternancia de sondas, denominado en lo sucesivo procedimiento PALSAR).

Este procedimiento propuesto para formar un polímero de sondas se puede usar para detectar un gen diana en una muestra y lleva a cabo una técnica sencilla y barata, que marca un hito, mediante su funcionamiento isotérmico sin el uso de enzimas.

Revelación de la invención

Los presentes inventores han seguido investigando sobre el procedimiento anteriormente propuesto para formar un polímero de sondas, haciendo un polímero de sondas más estable en la presente invención para mejorar más aún la técnica.

Como resultado del minucioso estudio de los inventores para resolver el problema descrito anteriormente, se ha descubierto que una pluralidad de pares de sondas, cada una compuesta por tres o más partes complementarias entre sí, se hibridan tal que se cruzan alternativamente, mediante lo que es posible formar fácilmente un polímero bicatenario en condiciones isotérmicas, y han descubierto además que, en un par de sondas usado en el procedimiento PALSAR, una secuencia de bases de ambos extremos de cada una de las regiones de secuencias de bases complementarias (ambos terminales) esta diseñada para que sea un enlace G (guanina) - C (citosina), mediante lo que la fuerza de enlace entre el par de bases del punto ramificado de cada región se hace mayor que mediante el enlace de A (adenina) - T (timina), fortaleciendo así aún más la interacción especial causada por los electrones \pi de las bases en el conjunto de esta región, completándose así la presente invención.

La presente invención proporciona sondas formadoras de polímeros de sondas, un procedimiento para formar un polímero de sondas mediante el uso de las sondas, un polímero de sondas formado mediante el procedimiento, un procedimiento para medir un gen diana mediante el uso del polímero de sondas y un reactivo para la detección de un gen diana mediante el uso del polímero de sondas, siendo posible producir un polímero de sondas más estable mediante el aumento de la fuerza de enlace entre los pares de bases de los puntos ramificados de cada región, pudiendo ser la sonda eficazmente polimerizada en condiciones isotérmicas para formar un polímero de sondas sin el uso de ADN polimerasas ni ADN ramificado, teniendo además el apilamiento de bases del polímero formado una estructura de orden superior regular que provoca un efecto hipocrómico denominado "hipocromismo", reduciéndose la intensidad de una banda de absorción a 260 nm en la región ultravioleta, mediante lo que es posible confirmar el estado del polímero, pudiéndose además insertar un material fluorescente económico entre las bases apiladas del polímero para producir un cambio en la intensidad de la fluorescencia, mediante lo que es posible confirmar el estado del polímero, con el resultado de poder detectar un gen diana fácilmente a un coste más bajo.

Las sondas formadoras de un polímero de sondas según la presente invención comprenden, en un primer aspecto, un par de una primera y una segunda sonda que tiene las siguientes características (a), (b) y (c):

(a) un par de la primera y la segunda sonda cada una compuesta por n (n \geq 3) regiones de secuencias de bases complementarias entre sí, en el que una región X_{1}, una región X_{2}, una región X_{3}, ..., una región X_{n}, proporcionadas en este orden desde el terminal 5' de la primera sonda, tienen secuencias de bases complementarias, respectivamente, a una región X'_{1}, una región X'_{2}, una región X'_{3}, ..., una región X'_{n}, proporcionadas en este orden desde el terminal 5' de la segunda sonda;

(b) cuando un par de la primera y la segunda sonda reaccionan entre sí, la región X_{1} sólo se hibrida con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se hibrida con la región X'_{2}, la región X_{3} sólo se hibrida con la región X'_{3}, ... y la región X_{n} sólo se hibrida con la región X'_{n}, y cuando ambas sondas se unen, se hibridan entre sí en una cualquiera de las regiones de una sonda, y una pluralidad de pares de la primera y la segunda sonda unidos en esa región se hibridan entre sí para formar un polímero de sondas; y

(c) al menos una G (guanina) o una C (citosina) está dispuesta en ambos terminales de cada una de las regiones de secuencias de bases complementarias de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, y tras la hibridación de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, se forma al menos un enlace C-G en todos los terminales de las regiones complementarias.

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El procedimiento de formación del polímero de sondas de la presente invención comprende polimerizar una pluralidad de pares de la primera y la segunda sonda que tienen las características anteriormente descritas (a), (b) y (c) para formar un polímero de sondas.

Además, la presente invención comprende disponer G (guanina) y C (citosina) en los puntos ramificados (ambos terminales) de las regiones complementarias de un par de las sondas usado y formar enlaces de G-C tras la hibridación, conduciendo así a una interacción especial causada por los electrones \pi de las bases debido al apilamiento de las bases para formar un polímero bicatenario estable.

El polímero de sondas de la presente invención se obtiene mediante la polimerización de una pluralidad de pares de la primera y la segunda sonda que tienen las características (a), (b) y (c) anteriormente descritas.

Además, la presente invención cubre un procedimiento para medir una cantidad traza de un gen diana en una muestra usando el procedimiento de formación de un polímero de sondas.

El procedimiento para medir un gen diana según la presente invención comprende, en un primer aspecto, las siguientes etapas (1), (2) y (3):

(1) con un par de primera y segunda sonda que tiene las características (a), (b) y (c) anteriormente descritas como sondas de polimerización, hacer reaccionar una cualquiera de las sondas que tenga una región de secuencia de bases complementaria a una parte de un gen diana con una muestra para que la sonda frente al gen diana esté presente en la muestra;

(2) hacer reaccionar una pluralidad de las sondas de polimerización anteriores entre sí para formar un complejo de gen diana-polímero de sondas; y

(3) lavar las sondas sin reaccionar de las sondas de polimerización usadas y medir la cantidad del complejo de gen diana-polímero de sondas formado.

El procedimiento para medir un gen diana según la presente invención comprende, en un segundo aspecto, las siguientes etapas (1), (2) y (3):

(1) con un par de primera y segunda sonda que tiene las características (a), (b) y (c) anteriormente descritas como sondas de polimerización, hacer reaccionar al menos una sonda de captura del gen diana con una muestra para unir la sonda de captura con un gen diana, estando la sonda de captura del gen diana compuesta por dos regiones, una región de las cuales es una región de secuencia de bases complementaria a una parte del gen diana y la otra región de las cuales es una región de secuencia de bases complementaria a una región de una cualquiera de las dos sondas de polimerización;

(2) luego hacer reaccionar las sondas de polimerización entre sí para unir la sonda de captura con las sondas de polimerización para formar un complejo de gen diana-polímero de sondas; y

En el procedimiento para medir un gen diana según la presente invención, es preferible que la cantidad de polímero de sondas se mida mediante la unión de un material fluorescente con el polímero de sondas para medir la fluorescencia resultante de la emisión del material fluorescente o mediante el uso de un cambio de la absorción óptica hacia los rayos ultravioletas.

El reactivo para detectar un gen diana según la presente invención comprende, en un primer aspecto, un par de la primera y la segunda sonda que tiene las características (a), (b) y (c) anteriormente descritas, y además la siguiente característica (d) como sondas de polimerización y elementos esenciales:

(d) una de las regiones de secuencia de bases complementaria de una cualquiera de la primera o la segunda sonda anteriormente descrita tiene una región que tiene una secuencia de bases complementaria a una parte de un gen diana.

El reactivo para detectar un gen diana según la presente invención comprende, en un segundo aspecto, una pluralidad de pares de la primera y la segunda sonda que tienen las características (a), (b) y (c) anteriormente descritas como sondas de polimerización; y al menos una sonda de captura de un gen diana compuesta por al menos dos regiones, siendo una región de las cuales una región de secuencia de bases complementaria a una parte de un gen diana y siendo la otra región de las cuales una región de secuencia de bases complementaria a una región de una cualquiera de las dos sondas de polimerización como elementos esenciales.

El número (n) de regiones de secuencias de bases complementarias de cada una de la primera y la segunda sonda es preferiblemente de 3, 4, 5 ó 6. El número de bases de cada una de las regiones de secuencias de bases complementaria es de preferiblemente al menos 8. La primera y la segunda sonda están compuestas por bases seleccionadas entre ADN, ARN o ANP.

En la presente invención, la "secuencia de bases complementaria" cubre una secuencia de bases completamente complementaria, incluyendo una secuencia de bases capaz de hibridarse en condiciones restrictivas para formar un polímero de sondas.

Las bases de un par de las sondas de la presente invención están constituidas tal que en tres o más regiones de secuencias de bases complementarias, sólo una región de una sonda se hibrida específicamente con una región correspondiente a la misma de la otra sonda tras una hibridación de una con la otra.

La Fig. 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN que tienen tres regiones de secuencias de bases complementarias. En la Fig. 1, una sonda de ADN n.º 1 tiene una región X_{1}, una región X_{2} y una región X_{3}, mientras que una sonda de ADN n.º 2 tiene una región X'_{1}, una región X'_{2} y una región X'_{3}. Las sondas de ADN n.º 1 y 2 están constituidas tal que cuando se hibridan, la región X_{1} sólo se une con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se une con la región X'_{2} y la región X_{3} sólo se une con la región X'_{3} (Fig. 2).

En otras palabras, con un par de sondas de ADN de la invención, cada una compuesta por tres partes complementarias entre sí, cuando se hibridan tal que se cruzan alternativamente, la región X_{1} sólo se une con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se une con la región X'_{2} y la región X_{3} sólo se une con la región X'_{3} según lo mostrado en la fig. 2, tal que un par de las sondas se hibrida alternativamente en tres patrones de unión.

De este modo, mediante el uso de las sondas constituidas según lo mencionado anteriormente, las dos sondas se unen alternativamente. En concreto, la sonda de ADN n.º 1 y la sonda de ADN n.º 2 se unen de alternativamente en tres dimensiones para producir un polímero de sondas según lo ilustrado en la Fig. 3. Por consiguiente, una pluralidad de pares de sondas, que han sido hibridadas alternativamente en los tres patrones de unión mostrados en la Fig. 2, pueden formar un polímero de sondas bicatenario, ilustrándose un ejemplo de los cuales esquemáticamente en la Fig. 3. La Fig. 4 ilustra un ejemplo de una estructura conceptual tridimensional del diagrama esquemático de la Fig. 3. La Fig. 5 es un diagrama esquemático que ilustra una pluralidad de pares de sondas de ADN que han sido hibridadas en diferentes patrones de unión de la Fig. 3. La Fig. 6 ilustra un ejemplo de una estructura conceptual tridimensional del diagrama esquemático de la Fig. 5.

La Fig. 7 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN compuestas por cuatro partes complementarias entres sí. En la Fig. 7, una sonda de ADN n.º 3 tiene una región X_{1}, una región X_{2}, una región X_{3} y una región X_{4}, mientras que una sonda de ADN n.º 4 tiene una región X'_{1}, una región X'_{2}, una región X'_{3} y una región X'_{4}. Las sondas de ADN n.º 3 y 4 están constituidas tal que cuando se hibridan, la región X_{1} sólo se une con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se une con la región X'_{2}, la región X_{3} sólo se une con la región X'_{3} y la región X_{4} sólo se une con la región X'_{4} (Fig. 8).

En otras palabras, con un par de sondas de ADN de la invención, cada una compuesta por cuatro partes complementarias entre sí, cuando se hibridan tal que se cruzan alternativamente, la región X_{1} sólo se une con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se une con la región X'_{2}, la región X_{3} sólo se une con la región X'_{3} y la región X_{4} sólo se une con la región X'_{4}, según lo mostrado en la fig. 8, tal que un par de las sondas se hibrida alternativamente en cuatro patrones de unión.

De este modo, mediante el uso de las sondas constituidas según lo mencionado anteriormente, las dos sondas se unen alternativamente. En concreto, la sonda de ADN n.º 3 y la sonda de ADN n.º 4 se unen alternativamente en tres dimensiones para producir un polímero de sondas según lo ilustrado en la Fig. 9.

En el procedimiento de hibridación de un par de sondas que tienen 4, 5 y 6 partes complementarias entre sí según lo mostrado en las Fig. 8, 11 y 13, teóricamente, es posible aumentar aún más el número de regiones de secuencias de bases complementarias.

La Fig. 14 es un diagrama esquemático que muestra otro ejemplo de un par de sondas de ADN cada una compuesta por "n" partes (n \geq 3) complementarias a tales partes de la otra sonda de ADN. En la Fig. 14, una sonda de ADN n.º 9 tiene una región X_{1}, una región X_{2}, una región X_{3}...una región X_{n-1} y una región X_{n}, mientras que una sonda de ADN n.º 10 tiene una región X'_{1}, una región X'_{2}, una región X'_{3}, ... una región X'_{n-1} y una región X'_{n}.

Las sondas de ADN n.º 9 y 10 están constituidas tal que cuando se hibridan, la región X_{1} sólo se une con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se une con la región X'_{2}, la región X_{3} sólo se une con la región X'_{3} ... la región X_{n-1} sólo se une con la región X'_{n-1} y la región X'_{n} sólo se une con la región X'_{n} (Fig. 14).

En otras palabras, con un par de sondas de ADN de la invención, cada una compuesta por "n" partes complementarias entre sí, cuando se hibridan tal que se cruzan alternativamente, la región X_{1} sólo se une con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se une con la región X'_{2}, la región X_{3} sólo se une con la región X'_{3} ... la región X_{n-1} sólo se une con la región X'_{n-1} y la región X'_{n} sólo se une con la región X'_{n} según lo mostrado en la Fig. 14, tal que el par de sondas se hibrida alternativamente en "n" patrones de unión.

El mismo principio de hibridación para las dos sondas de ADN ilustradas en las Fig. 8, 11, 13 y 14 se aplica a la hibridación de una sonda de ADN con una sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP, una sonda de ANP y una sonda de ADN o una sonda de ANP y una sonda de ARN.

El número (n) de regiones de secuencias de bases complementarias de una sonda no está particularmente limitado en la medida en que un par de las sondas se puede polimerizar para formar un polímero de sondas, pero es preferible que "n" sea de 3 a 5 en consideración de los costes y la eficacia.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento para formar un polímero bicatenario estable, en el que en un par de las sondas usadas en el procedimiento PALSAR, un par de bases de un punto ramificado de cada parte complementaria, cuando se hibridan alternativamente entre sí, está diseñado para que sea un enlace de G (guanina) - C (citosina), conduciendo así a la interacción especial causada por electrones \pi de bases debida al apilamiento de las bases para formar un polímero bicatenario estable.

Las bases están presentes en torno al centro de la estructura de doble hélice del ADN o el oligonucleótido, en el que A (adenina) y T (timina) o G (guanina) y C (citosina) están unidos específicamente mediante enlaces de hidrógeno para formar un par de bases. Como resulta evidente a partir de los resultados obtenidos usando los parámetros termodinámicos del vecino más próximo creados por Hatim T. Allawi et al. (Biochemistry, 36, 10581-10594, 1997) mostrados en la Fig. 16, la unión entre el enlace de G y C por medio de 3 enlaces de hidrógeno [Fig. 15(b)] es más fuerte que la unión entre el enlace de A y T por medio de 2 enlaces de hidrógeno [Fig. 15(a)], tal que para hibridarse teóricamente en tres regiones en el procedimiento PALSAR según lo mostrado en la Fig. 17(a) y 17(b), los puntos rodeados por un círculo que se cruzan alternativamente de los varios pares usados de sondas están unidos por enlaces de G-C para estabilizar la formación del polímero.

Además, este par de bases forma un plano en forma de una placa casi rectangular en su conjunto, estando este plano dispuesto en un ángulo casi recto con respecto al eje de la doble hélice. Por consiguiente, los pares de bases respectivos están todos dispuestos en paralelo entre sí a intervalos de 3,4 \ring{A} [Fig. 15(c)].

Además, con el apilamiento de las bases sobre los planos de estos pares de bases a intervalos de 3,4 \ring{A}, se produce una interacción especial atribuible a los electrones \pi de las bases, y esto es un factor significativo para la estabilización de la estructura de doble hélice. Es más, se sabe que el apilamiento de las bases da lugar a un efecto hipocrómico denominado "hipocromismo", en el que la intensidad de una banda de absorción en la región ultravioleta del ADN o del oligonucleótido a 260 nm se ve disminuida en un 30%.

En el procedimiento PALSAR, los inventores han averiguado que cuando la fuerza del enlace en los puntos ramificados de cada región es débil, la hibridación de la región que se encuentra entre los puntos ramificados es desestabilizada; por tanto, el efecto del apilamiento de las bases que resulta de la interacción especial ejercida por los electrones \pi de las bases en el conjunto de la región aumenta para reforzar la reacción de hibridación en cada región cruzada alternativamente mediante el procedimiento PALSAR.

Además, el apilamiento de las bases en el polímero formado mediante el procedimiento PALSAR tiene una estructura de orden superior regular, y de ahí que se puedan llevar a cabo los siguientes procedimientos: se genera un efecto hipocrómico denominado "hipocromismo" que causa una disminución de la intensidad de una banda de absorción en la región ultravioleta a 260 nm para confirmar el estado del polímero y además se inserta un material fluorescente entre las bases apiladas del polímero para producir un cambio en la intensidad de la fluorescencia con el fin de confirmar el estado del polímero.

Según lo mostrado en la Fig. 18, la región en la que un par de sondas usadas en el procedimiento PALSAR se hibrida en cruzamiento alternativo entre sí tiene aproximadamente 20 bases, y se estima que el efecto de apilamiento se aumenta mediante el refuerzo de los enlaces de los puntos ramificados rodeados con un círculo, lo que resulta en la estabilización de la hibridación de la región de 20 bases que se encuentra entre los puntos ramificados.

El número de C o G dispuestas en cada uno de los puntos ramificados de la región complementaria anteriormente descrita puede ser de al menos una base, siendo aplicable una pluralidad de bases. En cuanto a la secuencia de bases de cada región complementaria, el número de tales bases se puede seleccionar adecuadamente. Si se van a disponer dos o más C y G, C y G se pueden combinar arbitrariamente y disponer en cualquier orden según lo mostrado en la Fig. 19. Además, si se usa una secuencia de bases complementaria a una parte de un gen diana como una región de una sonda en el procedimiento para detectar un gen diana según lo descrito más adelante, es posible seleccionar C o G como una base dispuesta en el terminal de la región complementaria.

Mediante el uso de las sondas de polimerización anteriormente descritas, se puede detectar una cantidad traza de un gen diana en una muestra. Por ejemplo, cuando se usa una secuencia de bases complementaria a una parte de un gen diana como una región complementaria de un par de sondas de polimerización, se hace reaccionar la sonda con una muestra y luego con otro par de sondas. Luego, se mide la cantidad de polímero de sondas resultante unido al gen diana, por medio de lo cual se puede medir el gen diana.

En un procedimiento alternativo, se puede medir la cantidad de un gen diana de la misma manera descrita anteriormente a excepción del uso de una sonda de captura compuesta por, p. ej., dos regiones, es decir, una región que tenga una secuencia de bases complementaria a una parte del gen diana y una región que tenga una secuencia de bases complementaria a una región de la sonda de polimerización. Se debería usar por lo menos un tipo de sonda de captura, pudiéndose usar varios tipos de sondas de captura en función de la selección de varios puntos complementarios del gen diana.

Mediante este procedimiento, no sólo es posible detectar directamente un gen diana, sino que también se puede medir indirectamente un material diana. Es decir, una vez unido un nucleótido a un material para la medición al cual se haya unido el gen diana (un material diana), se puede medir el nucleótido como el gen diana de la misma manera descrita anteriormente.

Como para las sondas descritas anteriormente, la sonda de ADN es un fragmento monocatenario compuesto por grupos fosfato, azúcares y bases (adenina, timina, guanina y citosina), mientras que la sonda de ARN es un fragmento monocatenario cuyas bases son adenina, uracilo, guanina y citosina. El ANP es idéntico al ADN y al ARN en los tipos de bases, pero se diferencia en la estructura, en tanto en cuanto el esqueleto del "azúcar-fosfato" en el ADN está reemplazado por "derivados de N-(2-aminoetil)glicina".

El ácido nucleico que constituye la sonda de polimerización (HCP) está habitualmente compuesto por ADN o ARN, pero puede ser un análogo de ácido nucleico. El análogo de ácido nucleico incluye, por ejemplo, ácido nucleico peptídico (ANP, WO 92/20702). Además, un par de sondas está habitualmente compuesto por el mismo tipo de ácidos nucleicos, pero se puede usar un par de sondas de ADN y ARN. Es decir, el tipo de ácidos nucleicos de las sondas se puede seleccionar entre ADN, ARN o análogos de ácido nucleico (p. ej., ANP). Además, no es necesario que la composición de los ácidos nucleicos de una sonda esté constituida únicamente por un tipo de ácido nucleico (p. ej., sólo ADN), y si fuera necesario, por ejemplo, se puede usar una sonda (una sonda quimera) compuesta por ADN y ARN, que pertenece al ámbito de la presente invención.

La longitud de cada región de secuencia de bases complementaria de las sondas es de al menos 5 bases en términos del número de bases, preferiblemente, de al menos 8 bases, más preferiblemente, de 10 a 100 bases, y lo más preferible, de 15 a 30 bases.

Estas sondas pueden ser sintetizadas mediante procedimientos conocidos. Por ejemplo, se puede sintetizar una sonda de ADN mediante el procedimiento con fosfoamidita mediante el uso del modelo 394 de sintetizador de ADN de Applied Biosystems Inc. Otros procedimientos alternativos incluyen el procedimiento con fosfotriéster, el procedimiento con H-fosfonato, etc., pero se puede usar cualquier procedimiento para preparar las sondas.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN.

La Fig. 2 es un diagrama esquemático de un ejemplo que muestra cómo se unen un par de sondas de ADN.

La Fig. 3 es un diagrama esquemático que muestra la formación de un polímero en el que un par de sondas de ADN se hibridan alternativamente.

La Fig. 4 es un diagrama esquemático que ilustra un ejemplo de una estructura conceptual tridimensional del diagrama esquemático mostrado en la Fig. 3.

La Fig. 5 es un diagrama esquemático que ilustra un par de sondas de ADN que se hibridan en patrones de unión diferentes de aquéllos de la Fig. 3.

La Fig. 6 ilustra un ejemplo de una estructura conceptual tridimensional del diagrama esquemático de la Fig. 5.

La Fig. 7 es un diagrama esquemático de un ejemplo que muestra un par de sondas de ADN cuando n es 4.

La Fig. 8 es un diagrama esquemático de un ejemplo que muestra cómo se une un par de sondas de ADN mostrado en la Fig. 7.

La Fig. 9 es un diagrama esquemático de un ejemplo que muestra la formación de un polímero en el que un par de sondas de ADN se hibridan alternativamente cuando n es 4.

La Fig. 10 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN cuando n es 5.

La Fig. 11 es un diagrama esquemático que muestra cómo se une un par de sondas de ADN mostrado en la Fig. 10.

La Fig. 12 es un diagrama esquemático de un ejemplo que muestra la formación de un polímero en el que un par de sondas de ADN se hibrida alternativamente cuando n es 5.

La Fig. 13 es un diagrama esquemático que muestra cómo se une un par de sondas de ADN cuando n es 6.

La Fig. 14 es un diagrama esquemático que muestra cómo se une un par de sondas de ADN cuando el número de partes complementarias es n.

La Fig. 15 es un dibujo que muestra el estado de los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases en un oligonucleótido bicatenario.

La Fig. 16 es una tabla que muestra los parámetros termodinámicos del vecino más próximo realizados por Hatim T. Allawi et al. (Biochemistry, 36, 10581-10594, 1997).

La Fig. 17 es un diagrama esquemático que muestra el principio de estabilización de la formación de polímeros mediante el efecto de apilamiento.

La Fig. 18 es un diagrama esquemático que muestra el principio de estabilización de la hibridación mediante el efecto de apilamiento.

La Fig. 19 es un diagrama esquemático que muestra la síntesis de HCP (en la que se reemplazó al menos una base) mediante el uso del efecto de apilamiento.

La Fig. 20 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN, cada una compuesta por partes complementarias entre sí de longitud diferente.

La Fig. 21 es un diagrama esquemático que ilustra la formación de un polímero en el que un par de sondas de ADN mostrado en la Fig. 20 se hibrida alternativamente.

La Fig. 22 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN en el que se insertan partes escindidas con una enzima de restricción.

La Fig. 23 es un diagrama esquemático que ilustra un ejemplo en el que las sondas son unidas tridimensionalmente de manera alterna para formar un polímero que posteriormente es escindido con una enzima de restricción.

La Fig. 24 es un diagrama esquemático que muestra un procedimiento para detectar directamente un gen diana usando un par de sondas de ADN según la presente invención, en el que una sonda que tiene regiones complementarias a un gen diana y el par de sondas de ADN según la presente invención (sondas de polimerización de la figura) se hibrida con el gen diana, y luego el par de sondas de ADN según la presente invención (sondas de polimerización 1 y 2 de la figura) se añaden para formar un polímero bicatenario en el estado en el que el par de sondas de ADN según la presente invención se hibrida con el gen diana, tal que el gen diana pueda ser detectado con facilidad.

La Fig. 25 es un diagrama esquemático que muestra un procedimiento para detectar un gen diana en el que, con un par de sondas de ADN en el que n es 4, siendo una de las cuales una sonda de ADN (una sonda de polimerización 1 de la figura) constituida tal que un gen de una parte de la misma es complementario a un gen diana, y siendo la otra de las cuales una sonda de ADN (una sonda de polimerización 2 de la figura) que forma un par con la sonda de ADN anterior, se hibridan una pluralidad de los pares de sondas y la sonda diana para formar un polímero bicatenario, mediante lo cual se detecta el gen diana.

La Fig. 26 es un diagrama esquemático que muestra un procedimiento para detectar un gen diana en el que, con un par de sondas de ADN, siendo una de las cuales una sonda de ADN (una sonda de polimerización 1 de la figura) constituida tal que un gen de una parte de la misma es complementario a un gen diana, y siendo la otra de las cuales una sonda de ADN (una sonda de polimerización 2 de la figura) que forma un par con la sonda de ADN anterior, se hibridan una pluralidad de los pares de sondas y la sonda diana para formar un polímero bicatenario, mediante lo cual se detecta el gen diana.

La Fig. 27 es una fotografía que muestra los resultados del ejemplo 1.

La Fig. 28 es una fotografía que muestra los resultados del ejemplo 2.

La Fig. 29 es una fotografía que muestra los resultados del ejemplo 3.

La Fig. 30 es una fotografía que muestra los resultados del ejemplo 5.

La Fig. 31 es una fotografía que muestra los resultados del ejemplo 6.

La Fig. 32 es un diagrama esquemático que muestra la síntesis de HCP mediante el uso del efecto de apilamiento.

La Fig. 33 es una fotografía que muestra la influencia de una temperatura de reacción en la formación de un polímero a partir de HCP mediante el uso del efecto de apilamiento.

La Fig. 34 es una fotografía que muestra la influencia de un tiempo de reacción en la formación de un polímero a partir de HCP mediante el uso del efecto de apilamiento.

La Fig. 35 es una fotografía que muestra la influencia de una concentración de HCP en la formación de un polímero a partir de HCP mediante el uso del efecto de apilamiento.

La Fig. 36 es una fotografía que muestra la influencia de una concentración de HCP en un tiempo de reacción corto sobre la formación de un polímero a partir de HCP mediante el uso del efecto de apilamiento.

La Fig. 37 es un diagrama que muestra un cambio fotoquímico de cada polímero tras su exposición a rayos ultravioletas.

La Fig. 38 es un diagrama que muestra los casos en los que cada polímero que tiene un material fluorescente intercalado en su interior fue detectado mediante el cambio fotoquímico del material fluorescente hacia el polímero.

La Fig. 39 es un diagrama que muestra los casos en los que cada polímero que tiene un material fluorescente intercalado en su interior y que luego es sometido a purificación con EtOH fue detectado mediante el cambio fotoquímico del material fluorescente hacia el polímero.

La Fig. 40 es un diagrama esquemático que muestra la síntesis de HCP (en la que se reemplazó una base) mediante el uso del efecto de apilamiento.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

En la presente invención, con un par de sondas que tiene "n (n \geq 3)" regiones de secuencias de bases complementarias entre sí, se hacen reaccionar ambas sondas entre sí en condiciones isotérmicas en ausencia de enzimas para formar un polímero de sondas. El número de sondas por usar no está particularmente limitado, pero lo preferible es que esté en el intervalo de 10^{2} a 10^{15} sondas. La composición y la concentración de la solución tampón usada en la reacción no está particularmente limitada, pudiéndose emplear preferiblemente una solución tampón comúnmente usada en una técnica de amplificación de ácidos nucleicos. El pH también puede ser adecuado en el intervalo común, preferiblemente, en el intervalo de pH 7,0 a pH 9,0. La temperatura de reacción es de 40 a 80ºC, preferiblemente, de 55 a 65ºC. Estas condiciones no están particularmente limitadas.

Este procedimiento para formar un polímero de sondas se puede aplicar a la detección de un gen diana en una muestra.

Para ilustrar la constitución de la presente invención mediante el uso de un ejemplo más específico, las longitudes (el número de bases) de las regiones de secuencias de bases complementarias de una sonda pueden ser las mismas o diferentes. Por ejemplo, en el caso de sondas de ADN como las mostradas en la Fig. 20, cuando se hibridan las sondas de ADN n.º 11 y n.º 12, una región X_{1} y una región X'_{1} se hibridan con 24 bases, una región X_{2} y una región X'_{2} se hibridan con 22 bases, y una región X_{3} y una región X'_{3} se hibridan con 20 bases para formar un polímero de sondas (Fig. 21).

Para ilustrar la constitución de la presente invención mediante el uso de un ejemplo más específico, la hibridación de dos sondas de ADN como las mostradas en (1) en la Fig. 19 se puede realizar tal que cuando se hibridan una sonda n.º 13 y una sonda n.º 14, se forman sitios escindidos por una enzima de restricción (las partes subrayadas son escindidas por una enzima denominada "Hae III") según lo mostrado en la Fig. 22.

En otras palabras, una vez unidas alternativamente las sondas en tres dimensiones para formar un polímero, se puede usar una enzima de restricción para evitar al polímero una contaminación cruzada en otra operación experimental posterior distinta (Fig. 23).

En el procedimiento de la presente invención, las secuencias de bases de los puntos ramificados rodeados con un círculo en la Fig. 17 están diseñadas para formar enlaces de G (guanina) - C (citosina) tras una hibridación alterna, generándose así la interacción especial ejercida por los electrones \pi de las bases atribuible al apilamiento de las bases para formar un polímero bicatenario estable. A modo de ejemplo, la Fig. 17 ilustra un par de sondas cada una compuesta por tres regiones de secuencias de bases complementarias que están hibridadas alternativamente tal que la región X_{1} se hibrida con la región X'_{1}, la región X_{2} se hibrida con la región X'_{2} y la región X_{3} se hibrida con la región X'_{3}.

La Fig. 40(a) muestra un polímero de sondas que se usa en un procedimiento (el procedimiento PALSAR) para formar un polímero de sondas bicatenario y el uso del mismo en el que una pluralidad de pares de sondas (HCP) cada una compuesta por "n (n \geq 3)" partes complementarias entre sí se hibridan de manera alterna en un estado de cruzamiento para formar un polímero bicatenario.

Es decir, según lo mostrado en la Fig. 40 (b), las bases de los puntos ramificados están diseñadas para formar enlaces de G-C, estabilizando así la formación de un polímero. Además, el tipo y el número de enlaces C-G de cada punto ramificado están constituidos arbitrariamente según lo mostrado de (1) a (5) en la Fig. 19, y no están particularmente limitados en la medida en que se produzcan enlaces de G-C.

Como se muestra, por ejemplo, en las Fig. 24 y 25, el procedimiento de detección de un gen diana según la presente invención comprende, en un primer aspecto, las etapas de: proporcionar un par de sondas, una de las cuales está constituida tal que una secuencia de bases de una región complementaria de la sonda sea complementaria a una parte de un gen diana; hacer reaccionar dicha sonda con el gen diana; y luego hibridar una pluralidad de los pares de sondas entre sí para formar un complejo de gen diana-polímero de sondas. Tras separar el complejo mediante técnicas adecuadas, se puede medir la cantidad de polímero de sondas para determinar la cantidad de gen diana.

Como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 26, el procedimiento de detección de un gen diana según la presente invención comprende, en un segundo aspecto, las etapas de: proporcionar un par de sondas y otra sonda (una sonda de captura) compuesta por la misma secuencia de bases en una parte de una cualquiera de las sondas del par de sondas y una secuencia de bases complementaria a una parte de un gen diana; hibridar previamente la sonda de captura con el gen diana; e hibridar una pluralidad de los pares de sondas con la misma mediante el procedimiento de polimerización de sondas anteriormente descrito para formar un polímero bicatenario que se detecta mediante la amplificación de las sondas.

La sonda de captura usada en la detección del gen diana está compuesta por al menos dos regiones, es decir, una región que tiene una secuencia de bases complementaria a una parte del gen diana y una región que tiene una secuencia de bases complementaria a una región de la sonda de polimerización, pero, p. ej., pudiéndose añadir otras regiones de secuencias de bases complementarias de la sonda de polimerización a la misma. Sin embargo, la función de la sonda de captura no debería ser deteriorada por tal adición. Para detectar el gen diana, se debería usar al menos una sonda de captura y, si fuera necesario, también se pueden usar varios tipos de sondas de captura mediante la selección de una pluralidad de secuencias de bases cada una complementaria a una parte del gen diana.

En el procedimiento de detección de un gen diana anterior, se puede medir el polímero de sondas formado mediante los siguientes procedimientos. Por ejemplo, se pueden unir tintes intercalantes tales como bromuro de etidio, Oligreen, SYBR Green I o similares con el polímero de sondas obtenido para detectar un polímero amplificado a través de la fluorescencia.

Como materiales marcados para la detección, se pueden añadir previamente radioisótopo tal como ^{125}I, ^{32}P o similares; sustancias luminiscentes y colorantes tales como digoxigenina, éster de acridinio o similares, biotina para utilizar sustancias fluorescentes, luminiscentes o colorantes, o similares unidas a avidita, y un tinte fluorescente donante y un tinte fluorescente aceptor que utilicen la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), a un par de sondas de polimerización para detectar el gen diana. El material marcado no está particularmente limitado.

El par de sondas puede ser dos sondas de ADN, una sonda de ADN y una sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP, una sonda de ANP y una sonda de ADN, o una sonda de ANP y una sonda de ARN.

Además, las bases constituyentes de una sonda no se limitan a un tipo de base tal como ADN o ARN, pudiéndose usar, por ejemplo, una sonda quimera constituida tanto por ADN como por ANP en la presente invención.

Se pueden seleccionar arbitrariamente aquellos tipos de bases complementarias entre sí entre el par de sondas anteriormente descrito entre C (citosina), T (timina), G (guanina), A (adenina), U (uracilo), etcétera, no estando particularmente limitados. Además, las longitudes de las regiones complementarias de una sonda pueden ser las mismas o diferentes. El número de sondas usado en la hibridación para formar un polímero bicatenario está preferiblemente en el intervalo de 10^{2} a 10^{15}.

El procedimiento específico de la presente invención para detectar un gen diana comprende, p. ej., hacer reaccionar primero al menos un tipo de sonda de captura con una muestra para unir el gen diana a la sonda de captura. En esta etapa, se usa al menos un tipo de sonda de captura biotinizada. De un par de sondas de polimerización, se añade luego una sonda y se hace reaccionar, y después se hace reaccionar la otra sonda de polimerización para formar un complejo de gen diana-polímero de sondas. Entonces, se hacen reaccionar partículas magnéticas unidas a avidina (perlas magnéticas) y se unen al complejo, y mediante el uso de las propiedades de las perlas, se separa el complejo de los materiales sin reaccionar. Finalmente, se hace reaccionar bromuro de etidio con el mismo y se cuantifica la cantidad de polímero de sondas mediante radiación ultravioleta, mediante lo que se mide la cantidad de gen diana de la muestra. Para facilitar la separación del polímero de sondas formado, también se pueden usar perlas
magnéticas.

Otro procedimiento puede hacer uso de, p. ej., un pocillo en el que se ha solidificado un oligonucleótido que contiene una secuencia de bases complementaria a una parte de un gen diana. En primer lugar, se pone una muestra sobre el pocillo tal que un gen diana de la muestra se una con el oligonucleótido solidificado que contiene una secuencia de bases complementaria a una parte del gen diana. Luego, se añaden sucesivamente las sondas de polimerización según el procedimiento anteriormente descrito, mediante lo que se forma un polímero de sondas y se une sobre el pocillo. La separación del mismo de los materiales sin reaccionar se puede efectuar fácilmente mediante el lavado del pocillo, y finalmente, se puede medir la cantidad de polímero de sondas para medir el gen diana.

Este procedimiento también se puede aplicar a virutas de ADN.

Una muestra que contenga un gen diana (ADN o ARN) por medir en la presente invención puede ser cualquier muestra que pueda contener el ácido nucleico. El gen diana se puede preparar o aislar de la muestra según lo necesario, no estando esto particularmente limitado. Por ejemplo, existen muestras ilustradas derivadas de organismos vivos, tales como sangre, suero, orina, heces, fluido cerebroespinal, fluido tisular, cultivos celulares, etcétera, y muestras sospechosas de contener, o infectadas con, virus, bacterias, hongos, etcétera. Además, también se pueden usar ácidos nucleicos tales como ADN o ARN en un gen diana de una muestra amplificada mediante un procedimiento conocido. Cuando el gen diana es ADN bicatenario, se puede usar pasándolo a monocatenario mediante un procedimiento conocido.

La presente invención también proporciona un equipo para detectar un gen diana mediante el uso del procedimiento de la presente invención. Como ejemplo, este equipo comprende al menos una sonda de captura de un gen diana (que contiene al menos una sonda de captura biotinizada), un par de sondas de polimerización, perlas magnéticas unidas a avidina y bromuro de etidio como elementos esenciales. Si se usan las sondas de polimerización que contienen una secuencia de bases complementaria al gen diana, se puede omitir la sonda de captura.

En otro ejemplo, se puede usar como elemento esencial un cuerpo sólido (p. ej., un pocillo) sobre el que se haya solidificado un oligonucleótido que contenga una secuencia de bases complementaria a una parte del gen diana. Aparte de esto, pueden estar contenidos arbitrariamente sin ninguna limitación particular, un reactivo para la detección de un polímero de sondas, un tampón de reacción, un fluido diluyente, una muestra estándar y un inhibidor de la adsorción o similares.

Los ejemplos de materiales vehículo sólidos incluyen vidrio, plásticos (p. ej., poliestireno, poliamida, polietileno, polipropileno, etc.), metales o similares, y el vehículo puede estar en forma de copa, placa o similar, sin ninguna limitación particular.

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Ejemplos

De aquí en adelante, la presente invención se describe más detalladamente en referencia a ejemplos que no pretenden limitar la presente invención.

1. Sondas de ADN usadas en los ejemplos 1 y 2.

Sonda 1:

5'-TgA CTT ACT TAA CCg gAA ACA T \bullet AAg CAg gAT CCT CTA AgC CTg A \bullet CgA AgT ATT TAA Cgg Tgg TAT g-3'

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Sonda 2:

3'-gCT TCA TAA ATT gCC ACC ATA C \bullet TTC gTC CTA ggA gAT TCg gAc T \bullet ACT gAA TgA ATT ggC CTT TgT A-5'

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda 3:

5'-TgC CgA CCg gCg AgC g \bullet TAg CAT ggC CCT CTA g \bullet CTT ATC ggC CTC gAg A-3'

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda 4:

3'-gAA TAg CCg gAg CTC T \bullet ATC gTA CCg ggA gAT C \bullet ACg gCT ggC CgC TCg C-5'

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2. ARN del VHC sintético y una variedad de sondas de ADN usadas en los ejemplos 3 y 4

ARN del VHC que sintetiza una región no codificante de 5' del virus de la hepatitis C (abreviado de aquí en adelante como ARN del VHC)

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Sonda de captura de ARN del VHC A:

5'(fosforilado)-TAg AgC gTg CAg ATA gTC gAT \bullet CCT CAC Agg ggA gTg ATT CAT ggT-3'

(una secuencia de bases sin significado)

\hskip0.5cm

(una secuencia de bases complementaria al ARN del VHC)

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Sonda de captura de ARN del VHC B:

5'(marcado con biotina)-TAg AgC gTg CAg ATA gTC gAT \bullet CCT CAC Agg ggA gTg ATT CAT ggT-3'

(una secuencia de bases sin significado)

\hskip0.5cm

(una secuencia de bases complementaria al ARN del VHC)

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda de captura C:

3'-TAC TTA gTg Agg ggA CAC TCC \bullet gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

(una secuencia de bases complementaria al ARN del VHC)

\hskip0.5cm

(una secuencia de bases complementaria a la sonda 5)

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda de captura D:

3'-gCC CAg gAA AgA ACC TAg TTg \bullet gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

(una secuencia de bases complementaria al ARN del VHC)

\hskip0.5cm

(una secuencia de bases complementaria a la sonda 5)

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda de captura E:

3'-gCC CAg gAA AgA ACC TAg TTg \bullet gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

(una secuencia de bases complementaria al ARN del VHC)

\hskip0.5cm

(una secuencia de bases complementaria a la sonda 5)

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda 5:

5'-CTT ATT CAg TAT CgA gTA \bullet TAg CAg gAT CCC TCT Aag \bullet TgC Cgg ACC AgC gAg Cgg-3'

(una secuencia de bases complementaria a las sondas de captura B, C, D)

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Sonda 6:

3'-ACg gCC Tgg TCg CTC gCC \bullet ATC gTC CTA ggg AgA TCC \bullet gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

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Sonda 7:

3'-(biotinizada)-ACg gCC Tgg TCg CTC gCC \bullet ATC gTC CTA ggg AgA TTC \bullet gAA TAA Gtc ATA gCT CAT-5'

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Ejemplo 1 1. Objetivo

Se probó el efecto de la polimerización con respecto a la temperatura de hibridación usando sondas de polimerización que son un par de sondas de ADN según la presente invención.

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2. Materiales

1): Se usaron las sondas 1 y 2 en la polimerización.

2): Se usó 20 x SSC (NaCl 3M; C_{6}H_{5}O_{7}Na_{3}\cdot2H_{2}O 0,3M, pH 7,0) como una solución tampón.

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3. Procedimiento

Se añadieron 5 \mul de sondas 1 y 2 cada una preparada para ser 10^{13} copias/\mul en microtubos esterilizados de 0,2 ml respectivamente, luego se añadieron 40 \mul de 20 x SSC y se taparon aquellos tubos. Luego, se hirvieron aquellos tubos a 94ºC durante 30 segundos y se calentaron a 50ºC, 52ºC, 54ºC, 56ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 64ºC, 66ºC, 68ºC y 70ºC durante 30 minutos respectivamente.

Tras calentar, se realizó una electroforesis usando gel de agarosa al 0,5% para confirmar el efecto de la polimerización a través de una tinción con bromuro de etidio.

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4. Resultados

La Fig. 27 es una fotografía que muestra los resultados del ejemplo 1 con una electroforesis a 100 V durante 30 minutos usando gel de agarosa al 0,5%.

El gel de agarosa es un gel que puede dividir moléculas de ADN según el tamaño, y el gel de agarosa al 0,5% se usa generalmente para separar moléculas de ADN de 30.000 a 40.000 pares de bases.

La fotografía de la Fig. 27 muestra un polímero que ha crecido tanto con temperaturas crecientes que ya no puede emigrar con gel de agarosa al 0,5% como resultado del hecho de que se ha formado un polímero bicatenario exacta y alternativamente mediante un par de sondas de ADN en función de la temperatura de hibridación.

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Ejemplo 2 1. Objetivo

Se probó que un polímero polimerizado mediante sondas de polimerización, i.e., un par de sondas de ADN según la presente invención, puede ser escindido mediante una enzima de restricción.

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2. Materiales

1): Se usaron las sondas 3 y 4 en la polimerización.

2): Se usó Hae III (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) como enzima de restricción.

3): Se usó tampón M-Buffer (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) como solución tampón para la enzima de restricción.

4): Se usó 20 x SSC como una solución de tamponamiento.

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3. Procedimiento

Se añadieron 5 \mul de sondas 3 y 4 cada una preparada para ser 10^{13} copias/\mul en un microtubo esterilizado de 0,2 ml respectivamente, luego se añadieron 5 \mul de 20 x SSC y 35 \mul de agua destilada esterilizada para producir una solución de reacción A, y se tapó el microtubo. De manera similar a la solución de reacción A, se añadieron 2,5 \mul de sondas 3 y 4 cada una preparada para ser 10^{13} copias/\mul en un microtubo esterilizado de 0,2 ml respectivamente, luego se añadieron 5 \mul de 20 x SSC y 40 \mul de agua destilada esterilizada para producir una solución de reacción B, y se tapó el microtubo. Se hirvieron las soluciones A y B a 94ºC durante 30 segundos y se calentaron a 62ºC durante 30 minutos respectivamente.

Tras calentar, se añadieron 5 \mul de tampón M-Buffer y 5 \mul de Hae III a cada 40 \mul de soluciones de reacción A y B para la reacción a 37ºC durante 24 horas, y se realizó una electroforesis usando gel de agarosa al 2% para confirmar la escisión de un polímero polimerizado por la enzima de restricción a través de la tinción con bromuro de etidio.

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4. Resultados

La Fig. 28 es una fotografía que muestra los resultados del ejemplo 2 con una electroforesis a 100 V durante 30 minutos usando gel de agarosa al 2,0%.

La fotografía muestra que un par de sondas de ADN que forman exacta y alternativamente un polímero bicatenario fue escindido hasta unidades mínimas mediante la enzima de restricción.

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Ejemplo 3 1. Materiales

1): Se usaron las sondas 5 y 6 en la polimerización.

2): Se usaron perlas magnéticas unidas con estreptavidina (nombre del producto: Streptavidin MagneSphere fabricadas por Promega, Inc.) para una fase sólida para la separación B/F.

3): Se usó 20 x SSC y 0,5 x SSC (diluyente 40 veces de 20 x SSC) como soluciones de tampón.

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2. Procedimiento

Se añadieron 10 \mul de cada uno de los ARN del VHC sintéticos preparados para que fueran 10^{1} copias/10 \mul, 10^{2} copias/10 \mul, 10^{3} copias/10 \mul, 10^{4} copias/10 \mul, 10^{5} copias/10 \mul, 10^{6} copias/10 \mul, 10^{7} copias/10 \mul, 10^{8} copias/10 \mul, 10^{9} copias/10 \mul y 10^{10} copias/10 \mul en un microtubo esterilizado de 0,2 ml, respectivamente. Luego se añadió 1 \mul de cada una de las sondas B, C, D y E de captura de ARN del VHC preparadas para que fueran 10^{13} copias/10 \mul, 10 \mul de la sonda 5 preparada para que fuera 10^{13} copias/10 \mul y 25 \mul de 20 x SSC respectivamente. Se taparon los microtubos respectivamente, y se mezclaron los ingredientes con un mezclador y se calentaron a 62ºC durante 60 minutos.

Una vez que la temperatura descendió a la temperatura ambiente, se añadieron 5 \mul de la sonda 6 preparada para que fuera 10^{13} copias/10 \mul a cada uno de aquellos microtubos. Luego, se tapó cada uno de aquellos microtubos, y se mezclaron los ingredientes con un mezclador y se calentaron a 62ºC durante 60 minutos.

Una vez que la temperatura descendió a la temperatura ambiente, se añadieron 10 \mul de estreptavidina
MagneSphere (denominadas en lo sucesivo "perlas magnéticas") a cada uno de los microtubos para la reacción a 37ºC durante 30 minutos. Tras la reacción, se atraparon las perlas magnéticas usando un imán y se retiró el sobrenadante. Luego se prepararon 50 \mul de 0,5 x SSC y 10 \mul de bromuro de etidio (fabricado por Wako Junyaku Co., Ltd.) preparados para que fueran 100 \mug/ml para la reacción a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Tras la reacción, se atraparon las perlas magnéticas usando un imán y se eliminó el sobrenadante. Luego se añadieron 50 \mul de 0,5 x SSC. Inmediatamente después, se atraparon las perlas magnéticas usando un imán y se eliminó el sobrenadante. Luego se añadieron 50 \mul de 0,5 x SSC y se transfirieron todos los ingredientes a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se emitieron rayos ultravioletas desde el fondo de la placa de 96 pocillos y se fotografió un polímero de sondas que acabó emitiendo una fluorescencia mediante la intercalación de bromuro de etidio.

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3. Resultados

La Fig. 29 es una fotografía que muestra la fluorescencia mediante bromuro de etidio producida por la radiación de rayos ultravioleta desde el fondo de una placa de 96 pocillos.

Como se puede observar en la Fig. 29, la mayor fluorescencia se encontró a 10^{10} copias/10 \mul, y la fluorescencia se fue haciendo gradualmente más débil en función de la cantidad de ARN del VHC sintético.

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Ejemplo 4 1. Materiales

1): Se usaron las sondas 5 y 7 en la polimerización.

2): Se usó una placa de 96 pocillos (nombre del producto: NucleoLink^{TM} fabricada por Nunc Inc.) para una fase sólida para la separación B/F.

3): Se usó "Estreptavidina con HRP" fabricada por los laboratorios ZYMED, Inc. como estreptavidina conjugada con peroxidasa.

4): Se usó "un equipo colorante T para la peroxidasa" fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd. como un reactivo colorante.

5): Se usó H_{2}SO_{4} 2N como solución de detención de la reacción enzimática.

6): Se usaron 20 x SSC y 0,5 x SSC como soluciones tampón.

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2. Procedimiento

Se añadieron 10 \mul de cada uno de los ARN del VHC sintéticos preparados para que fueran 0 copias/10 \mul, 10^{3} copias/10 \mul, 10^{4} copias/10 \mul, 10^{5} copias/10 \mul, 10^{6} copias/10 \mul y 10^{7} copias/10 \mul a cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos (NucleoLink^{TM} fabricado por Nunc, Inc.) unidos previamente con la sonda de captura de ARN del VHC A (no se aplicó un bloqueo especial). Luego se añadieron 10 \mul de cada una de las sondas de captura C, sonda de captura D y sonda de captura E preparadas para que fueran 10^{11} copias/\mul, 10 \mul de la sonda 5 preparada para que fuera 10^{11} copias/\mul y 60 \mul de 20 x SSC respectivamente.

Tras mezclar los ingredientes con una pipeta, se calentaron a 94ºC durante 30 segundos y se calentaron a 62ºC durante 60 minutos.

Una vez que la temperatura descendió hasta la temperatura ambiente, se añadieron 10 \mul de la sonda 5 preparada para que fuera 10^{11} copias/\mul y 20 \mul de la sonda 7 a cada uno de aquellos microtubos. Se mezclaron con una pipeta y se calentaron a 94ºC durante 30 segundos y a 62ºC durante 60 minutos.

Una vez que la temperatura descendió a la temperatura ambiente, se lavó cada pocillo cuatro veces con 0,5 x SSC que contenía Tween 20 al 0,1%. Se añadieron 100 \mul de "estreptavidina con HRP" a cada pocillo y se calentaron a 37ºC durante 20 minutos. Tras retirar la solución de cada pocillo mediante succión, se lavó cada pocillo 4 veces con 0,5 x SSC que contenía Tween 20 al 0,1%.

Se añadieron 100 \mul de equipo colorante T para la peroxidasa a cada pocillo para la reacción en una habitación oscura (a temperatura ambiente) durante 10 minutos. Tras la reacción, se añadieron 100 \mul de solución de detención de la reacción enzimática, y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm.

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3. Resultados

Los resultados del ejemplo 4 se muestran en la tabla 1.

El desarrollo del color se confirmó según la cantidad de ARN del VHC sintetizado añadido en el intervalo de 10^{3} a 10^{7} copias a partir del hecho de que se observó el desarrollo de color en estreptavidina conjugada con peroxidasa marcada en uno de un par de sondas de ADN que fueron hibridadas alternativamente para formar un polímero bicatenario.

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TABLA 1

1

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Ejemplo 5 1. Objeto

Se probó el efecto de polimerización con respecto a la temperatura de hibridación usando un par de sondas de ADN cada una compuesta por cuatro partes complementarias entre sí según la presente invención.

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2. Materiales

En la polimerización, se usaron las siguientes sondas 8 y 9:

Sonda 8:

5'-CGGGTCCTTTCTTGG-CATCACAACCCAGCG-TTCCTGACCAGCGAG-AGCAGGATCCC TCT-3'

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Sonda 9:

5'-CCAAGAAAGGACCCG-CGCTGGGTTGTGATG-CTCGCTGGTCAGGAA-AGAGGGATCCTGCTA-3'

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Se usó 20 x SSC como solución tampón.

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3. Procedimiento

Se añadieron 5 \mul de sondas 8 y 9 cada una preparada para que fuera 10^{13} copias/\mul a microtubos esterilizados de 0,2 ml, luego se añadieron 40 \mul de 20 x SSC y se taparon aquellos tubos, y se calentaron los ingredientes a 54ºC, 56ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 64ºC, 66ºC y 70ºC respectivamente durante 30 minutos.

Tras calentar, se realizó una electroforesis usando gel de agarosa al 0,5% para confirmar el efecto de la temperatura sobre la polimerización a través de una tinción con bromuro de etidio.

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4. Resultados

La Fig. 30 muestra los resultados del ejemplo 5 mediante electroforesis a 100 V durante 30 minutos usando gel de agarosa al 0,5%. Se confirmó la formación de un polímero bicatenario en función de las respectivas temperaturas.

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Ejemplo 6 1. Objeto

Se probó el efecto de la polimerización con respecto a la temperatura de hibridación usando un par de sondas de ADN cada una compuesta por cinco partes complementarias entre sí según la presente invención.

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2. Materiales

Se usaron las sondas 10 y 11 en la polimerización:

Sonda 10:

5'-CGGGTCCTTTCTTGG-CATCACAACCCAGCG-TTCCTGACCAGCGAG-TAGCAGGATCCCTCT-CTTAT
TCAGTATCGA-3'

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Sonda 11:

5'-CCAAGAAAGGACCCG-CGCTGGGTTGTGATG-CTCGCTGGTCAGGAA-AGAGGGATCCTGCTA-TCG
ATACTGAATAAG-3'

Se usó 20 x SSC como solución tampón.

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3. Procedimiento

Se añadieron 5 \mul de cada sonda 10 y 11 preparada para que fuera 10^{13} copias/\mul en microtubos esterilizados de 0,2 ml, luego se añadieron 40 \mul de 20 x SSC y se taparon aquellos tubos, y se calentaron los ingredientes a 54ºC, 56ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 64ºC, 66ºC y 70ºC respectivamente durante 30 minutos. Tras calentar, se realizó una electroforesis usando gel de agarosa al 0,5% para confirmar el efecto de la polimerización a través de una tinción con bromuro de etidio.

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4. Resultados

La Fig. 31 muestra los resultados del ejemplo 6 mediante electroforesis a 100 V durante 30 minutos usando gel de agarosa al 0,5%. Se confirmó la formación de un polímero bicatenario en función de las respectivas temperaturas.

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Ejemplo de síntesis 1

Se sintetizaron sondas de oligonucleótido que tenían las secuencias de bases mostradas en la Fig. 32 mediante un procedimiento habitual.

Estos pares de sondas de oligonucleótido sintetizadas cada una compuesta por tres regiones complementarias entre sí fueron diseñadas desde la parte superior a la inferior de la Fig. 32 para que tuvieran ambos enlaces G-C, un enlace G-C y ambos enlaces A-T como un par de bases en dos puntos ramificados de cada región, y fueron denominadas HCP-1, HCP-2 y HCP-3, respectivamente.

Se disolvió cada sonda a una concentración de 100 pmoles/\mul en agua ultra-pura esterilizada y se usó en los siguientes experimentos.

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Ejemplo 7 1. Procedimiento

Se añadió 1 \mul de un par de oligonucleótidos de HCP-1 (100 pmoles/\mul), 1 \mul de un par de oligonucleótidos de HCP-2 (100 pmoles/\mul) y 1 \mul de un par de oligonucleótidos de HCP-3 (100 pmoles/\mul) a tubos de 0,2 ml, respectivamente, y se añadieron 12 \mul de 20 x SSC y 6 \mul de agua bidestilada esterilizada a cada tubo de reacción para proporcionar una solución con un volumen total de 20 \mul, que luego fue mezclada mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se prepararon cinco soluciones mezcladas de esta manera de cada tipo de HCP y se hicieron reaccionar "a 94ºC durante 10 segundos y a 62ºC durante 30 minutos", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 30 minutos", "a 94ºC durante 10 segundos y a 66ºC durante 30 minutos", "a 94ºC durante 10 segundos y a 68ºC durante 30 minutos" y "a 94ºC durante 10 segundos y a 70ºC durante 30 minutos", respectivamente.

Tras la reacción, se enfrió cada tubo de reacción calentado finalmente hasta 15ºC y se reservó a 4ºC antes de la electroforesis.

Se mezclaron 10 \mul de soluciones de reacción con 2 \mul de BPB (Azul de bromotimol) como solución de tinción, y se sometieron a electroforesis aquellas muestras a 100 V durante 35 minutos usando gel de agarosa al 0,5% (Nusive-3:1, producido por Takara Co., Ltd.).

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2. Resultados

A la temperatura de reacción de 62ºC, HCP-1 ya ha iniciado la formación de polímero, mientras que HCP-2 muestra una mayor cantidad de productos en escalera, indicando una formación insuficiente de polímero. A la temperatura de reacción de 62ºC, HCP-3 muestra un estado en escalera en una pista completa debido a la presencia de enlace inespecífico.

Por consiguiente, como se muestra en la fotografía de la Fig. 33, se confirmó la formación de un polímero bicatenario estable de manera eficaz a una temperatura de reacción más baja en la HCP-1 que tenía ambos enlaces G (guanina) - C (citosina) como secuencias de bases en dos puntos ramificados de cada región cuando se hibridan de forma cruzada y alternativamente.

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Ejemplo 8 1. Procedimiento

Se añadieron 1,5 \mul de un par de oligonucleótidos de HCP-1 (100 pmoles/\mul), 1,5 \mul de un par de oligonucleótidos de HCP-2 (100 pmoles/\mul) y 1,5 \mul de un par de oligonucleótidos de HCP-3 (100 pmoles/\mul) a tubos de 0,2 ml, respectivamente, y se añadieron 36 \mul de 20 x SSC y 21 \mul de agua bidestilada esterilizada a cada tubo de reacción para proporcionar una solución con un volumen total de 60 \mul, que luego fue mezclada mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se prepararon cinco soluciones mezcladas de esta manera de cada tipo de HCP y se hicieron reaccionar "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 0 horas (sobre hielo)", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 0,5 horas", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 3 horas", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 16 horas" y "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 16 horas (vibración)", respectivamente, para formar un polímero.

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2. Resultados

HCP-1 ya ha iniciado la formación de polímero en el tiempo de reacción de 0,5 horas, y muestra una cantidad muy baja de sonda sin reaccionar (bandas en una parte inferior de la pista) en el tiempo de reacción de 3 horas, lo que indica que la mayoría de la HCP-1 se ha consumido en la formación del polímero. Por otro lado, HCP-2 muestra una gran cantidad de productos en forma de escalera e indica una formación insuficiente de polímero en el tiempo de reacción de 0,5 horas. Además, HCP-3 no forma ningún polímero en el tiempo de reacción de 0,5 horas.

Por consiguiente, como se muestra en la fotografía de la Fig. 34, se confirmó la formación de un polímero bicatenario estable de manera eficaz en un tiempo de reacción más corto en la HCP-1 que tenía ambos enlaces G (guanina) - C (citosina) como secuencias de bases en dos puntos ramificados de cada región cuando se hibridan alternativamente.

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Ejemplo 9 1. Procedimiento

Se pusieron 2 \mul de un par de oligonucleótidos de HCP-1, HCP-2 y HCP-3 en tubos de reacción de 0,2 ml a concentraciones de sonda de oligonucleótido de "10 pmoles/\mul", "5,0 pmoles/\mul" y "2,5 pmoles/\mul", respectivamente, y se añadieron 12 \mul de 20 x SSC y 6 \mul de agua bidestilada esterilizada a cada tubo de reacción para proporcionar una solución con un volumen total de 20 \mul, que luego fue mezclada mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se hicieron reaccionar aquellas soluciones mezcladas "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 30 minutos".

Tras ello, se enfrió cada solución de reacción finalmente hasta 15ºC y se reservó a 4ºC antes de la electroforesis.

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2. Resultados

A la concentración de sonda más baja de "2,5 pmoles/\mul", HCP-1 ya ha iniciado la formación de polímero, mientras que HCP-2 muestra productos en forma de escalera, indicando una formación de polímero insuficiente. Además, HCP-3 no forma ningún polímero a la concentración de sonda de "2,5 pmoles/\mul".

Por consiguiente, como se muestra en la fotografía de la Fig. 35, se confirmó la formación de un polímero bicatenario estable de manera eficaz a una concentración de sonda más baja en la HCP-1 que tenía ambos enlaces G (guanina) - C (citosina) como secuencias de bases en dos puntos ramificados de cada región cuando se hibridan alternativamente.

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Ejemplo 10 1. Procedimiento

Se puso 1 \mul de un par de oligonucleótidos de HCP-1, HCP-2 y HCP-3 en tubos de reacción de 0,2 ml a concentraciones de sonda de oligonucleótido de "2,5 pmoles/\mul", respectivamente, y se añadieron 12 \mul de 20 x SSC y 7 \mul de agua bidestilada esterilizada a cada tubo de reacción para proporcionar una solución con un volumen total de 20 \mul, que luego fue mezclada mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se hicieron reaccionar aquellas soluciones mezcladas "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 10 minutos".

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2. Resultados

En el tiempo de reacción más corto de 10 minutos y a la concentración de sonda baja de "2,5 pmoles/\mul", HCP-1 ya ha iniciado la formación de polímero, mientras que HCP-2 muestra una gran cantidad de productos en forma de escalera, indicando una formación de polímero insuficiente. Además HCP-3 muestra en conjunto una pista en escalera, sin formar un polímero.

Por consiguiente, como se muestra en la fotografía de la Fig. 36, se confirmó la formación de un polímero bicatenario estable de manera eficaz incluso en un tiempo de reacción corto y a una concentración de sonda baja en la HCP-1 que tenía ambos enlaces G (guanina) - C (citosina) como secuencias de bases en dos puntos ramificados de cada región cuando se hibridan alternativamente.

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Ejemplo 11 1. Procedimiento

Se pusieron 1,5 \mul de HCP-1 (100 pmoles/\mul), HCP-2 (100 pmoles/\mul) y HCP-3 (100 pmoles/\mul) en tubos de 0,2 ml, respectivamente, y se añadieron 36 \mul de 20 x SSC y 21 \mul de DW2 a cada tubo de reacción para proporcionar una solución con un volumen total de 60 \mul, que luego fue mezclada mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se prepararon nueve soluciones mezcladas de esta manera a partir de cada tipo de HCP y se dividieron en 3 grupos que luego se hicieron reaccionar "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 0 horas (sobre hielo)", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 3 horas", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 16 horas", respectivamente, para formar un polímero.

Tras la reacción a 64ºC, se enfrió cada solución de reacción finalmente hasta 15ºC y se reservó a 4ºC antes de la electroforesis.

Tras la reacción, se midió la absorción ultravioleta mediante un espectrofotómetro con agua bidestilada esterilizada como blanco.

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2. Resultados

Cambiando el tiempo de reacción a 64ºC, disminuyó la absorbancia a 260 nm en el intervalo ultravioleta a medida que aumentaba el tiempo de reacción y aumentaba el grado de formación del polímero. Esto es debido a un efecto hipocrómico denominado "hipocromismo" que causa una disminución de la intensidad de una banda de absorción de ADN o un oligonucleótido a 260 nm en la región ultravioleta, lo que es causado por el hecho de que el apilamiento de las bases tiene una estructura de orden superior regular. Por consiguiente, la reducción significativa de la absorbancia de HCP-1 en el intervalo ultravioleta tras la reacción "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 16 horas" mediante la que se formó un mayor número de polímeros, indica la formación de polímero de orden superior más regular y estabilizado mediante el uso de HCP-1, pudiéndose simultáneamente confirmar el estado del polímero mediante el cambio en la absorción ultravioleta.

Por consiguiente, el procedimiento para detectar el polímero mediante la utilización del cambio de la absorción óptica del polímero a los rayos ultravioleta se demuestra según lo mostrado en la Fig. 37.

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Ejemplo 12 1. Procedimiento (1) Formación de un polímero

Se pusieron 2,5 \mul de HCP-1 (100 pmoles/\mul), HCP-2 (100 pmoles/\mul) y HCP-3 (100 pmoles/\mul) en tubos de reacción de 0,2 ml, respectivamente, y se añadieron 60 \mul de 20 x SSC y 35 \mul de agua bidestilada esterilizada a cada tubo de reacción para proporcionar una solución con un volumen total de 100 \mul, que luego fue mezclada mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se prepararon dieciocho soluciones mezcladas de esta manera a partir de cada tipo de HCP y se dividieron en 6 grupos que luego se hicieron reaccionar "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 0 horas (sobre hielo)", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante0,5 horas", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 1 hora", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 3 horas", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 5 horas", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 16 horas", respectivamente, para formar un polímero.

Tras la reacción a 64ºC, se enfrió cada solución de reacción finalmente hasta 15ºC y se reservó a 4ºC.

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(2) Tinción con SYBR Green I

Se disolvió 1 \mul de SYBR Green I auto-fluorescente (Takara Co., Ltd.) que tenía la propiedad de ser insertado en un espacio de 3,4 \ring{A} entre los planos de pares de bases en 10 ml de tampón TE (10mM, 1mM, pH 8,0) para preparar una solución diluida a 1/10.000. Se añadieron 5 \mul de las soluciones de SYBR Green I (diluidas a 1/1000) a cada tubo que contenía un polímero formado en el apartado (1) anterior, y luego se mezclaron mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se dejó cada muestra en una habitación oscura durante 1,5 horas para que reaccionara con el material fluorescente.

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2. Resultados

Las tablas y las gráficas de la Fig. 38 muestran que cuando se cambió el tiempo de reacción a 64ºC, a mayor grado de formación de una cadena bicatenaria, mayor intensidad de la fluorescencia. Este fenómeno apareció en HCP-1 para el tiempo más corto. Esto indica que a una etapa de tiempo de reacción temprana, se formó una cadena bicatenaria de HCP-1 más eficazmente [Fig. 38(a), (b) y (c)].

Por consiguiente, el estado del polímero podría confirmarse mediante la intercalación de material fluorescente SYBR Green I entre las bases apiladas en la cadena bicatenaria formada.

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Ejemplo 13 1. Procedimiento (1) Formación de un polímero

Se añadieron 1,5 \mul de HCP-1 (100 pmoles/\mul), HCP-2 (100 pmoles/\mul) y HCP-3 (100 pmoles/\mul), 36 \mul de 20 x SSC y 21 \mul de agua bidestilada esterilizada a tubos de reacción de 0,2 ml para proporcionar soluciones con un volumen total de 60 \mul, que luego fueron mezcladas mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se prepararon dieciséis soluciones mezcladas de esta manera a partir de cada tipo de HCP y se dividieron en 4 grupos que luego se hicieron reaccionar "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 0 horas (sobre hielo)", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 0,5 horas", "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 3 horas" y "a 94ºC durante 10 segundos y a 64ºC durante 16 horas", respectivamente, para formar un polímero.

De los cuatro tubos de cada grupo, se usó un tubo para la electroforesis, y se usaron 3 tubos a "n = 3" para un lector de la fluorescencia.

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(2) Confirmación mediante electroforesis

Se mezclaron 10 \mul de soluciones de reacción con 2 \mul de BPB (Azul de bromotimol) como una solución de tinción, y se sometieron a electroforesis aquellas muestras a 100 V durante 35 minutos usando gel de agarosa al 0,5% (Nusive -3:1, producido por Takara Co., Ltd.).

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(3) Tinción con SYBR Green I

Se disolvió 1 \mul de SYBR Green I (Takara Co., Ltd.) usado en el ejemplo 12 en 0,5 ml de agua bidestilada esterilizada para preparar una solución diluida a 1/500. Se añadieron 5 \mul de esta solución (una solución diluida a 1/500) de SYBR Green I (Takara Co., Ltd.) a cada tubo que contenía un polímero formado en el apartado (1) anterior, y luego se mezclaron mediante un movimiento vorticial y giratorio hacia abajo.

Se dejó cada tubo en una habitación oscura durante 0,5 a 1 hora para que reaccionara con el material fluorescente, se transfirió cada muestra a un tubo de 1,5 ml, se hizo precipitar de una manera habitual con etanol y se dejó durante una noche a -20ºC.

Tras dejar aquellas muestras toda la noche, volvieron a la temperatura ambiente y se centrifugaron a 12.000 rpm x 15 minutos (temperatura ambiente), y una vez eliminado el sobrenadante, se secaron al aire los sedimentos, se disolvieron en 60 \mul de agua bidestilada esterilizada y se midieron con un lector de la fluorescencia.

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2. Resultados

El "SYBR Green I" es un tinte fluorescente que se intercala entre los pares de bases de la hélice bicatenaria de ácidos nucleicos, siendo posible eliminar el tinte unido a los ácidos nucleicos mediante la precipitación con etanol.

Los datos mostrados en la Fig. 38 se obtuvieron midiendo la muestra con un lector de la fluorescencia directamente sin la precipitación con etanol, mientras que los datos de la Fig. 39 se obtuvieron tras la intercalación del material fluorescente y la posterior purificación del polímero mediante la precipitación con etanol.

La Fig. 39 muestra que al cambiar el tiempo de reacción a 64ºC, a mayor grado de formación del polímero, mayor intensidad de la fluorescencia en HCP-1. Esto indica que como el polímero de HCP-1 tiene una estructura de orden superior regular, el material fluorescente es más difícil de eliminar del mismo incluso mediante la precipitación con etanol, y que a medida que aumenta el grado de formación del polímero, se forma una estructura de orden más superior para hacer que el material fluorescente sea más difícil de eliminar del mismo.

Por un lado, la intensidad de fluorescencia de HCP-3 no dependió del tiempo de reacción. Esto indica que HCP-3 forma un polímero irregular que tiene una cadena simple parcialmente en lugar de una cadena doble, tal que tras intercalar el material fluorescente y la posterior precipitación con etanol, el polímero está en un estado tan inestable que el material fluorescente se puede eliminar fácilmente.

Así fue como se demostró que, tras permitir que el material fluorescente se intercale en el polímero y tras purificar el polímero con etanol, se puede confirmar el estado del polímero mediante la medición del mismo con un lector de la fluorescencia.

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Capacidad de explotación industrial

Según la presente invención como se describe anteriormente, es posible producir un polímero de sondas estable mediante el aumento de la fuerza de enlace entre los pares de bases de ambos terminales de cada una de las regiones de secuencias de bases complementarias de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, se puede detectar un gen diana eficazmente sin usar ADN polimerasa ni ADN ramificado y, además, el apilamiento de bases del polímero formado tiene una estructura de orden superior regular que genera un efecto hipocrómico denominado "hipocromismo" que reduce la intensidad de una banda de absorción a 260 nm en la región ultravioleta, mediante lo que es posible confirmar el estado del polímero, pudiéndose además insertar un material fluorescente económico entre las bases apiladas del polímero para producir un cambio en la intensidad de la fluorescencia, mediante lo que se puede confirmar el estado del polímero, demostrando así el efecto significativo de poder detectar un gen diana fácilmente y a un coste bajo sin precedentes.

<110> Sanko Junyaku Co., Ltd.

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<120> Sondas de formación un polímero de sondas, procedimiento para la formación del polímero de sondas y uso del mismo

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<130> EP22915-031

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<140> PCT/JP01/02554

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<141> 28-03-2001

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<150> JP 2000-098797

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 31-03-2000

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<150> JP 2000-309959

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<151> 10-10-2000

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<160> 36

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<210> 1

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<211> 66

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 1

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<400> 1

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\hskip1cm

2

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<210> 2

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<211> 66

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 2

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<400> 2

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\hskip1cm

3

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<210> 3

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 3

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<400> 3

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\hskip1cm

4

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<210> 4

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 4

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<400>4

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\hskip1cm

5

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<210> 5

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> misc feature

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<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido fosfórico unido por el extremo 5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> etiqueta de biotina unida por el extremo 5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210>7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 5

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> etiqueta de biotina unida por el extremo 5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada HPL-1-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada HPL-1-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada HPL-2-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada HPL-2-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada HPL-3-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada HPL-3-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 1-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 1-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 2-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 2-2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 3-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 3-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 4-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 4-2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 5-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda sintetizada 5-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda n.º 1 sintetizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda n.º 2 sintetizada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda n.º 11 sintetizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda n.º 12 sintetizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

Claims

1. Un par de primera y segunda sonda de ácido nucleico que tiene las siguientes características (a), (b) y (c):

(a) un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico cada una compuesta por n (n \geq 3) regiones de secuencias de bases complementarias entre sí, en el que una región X_{1}, una región X_{2}, una región X_{3}, ..., una región X_{n}, proporcionadas en este orden desde el terminal 5' de la primera sonda de ácido nucleico, tienen secuencias de bases complementarias, respectivamente, a una región X'_{1}, una región X'_{2}, una región X'_{3}, ..., una región X'_{n} proporcionadas en este orden desde el terminal 5' de la segunda sonda de ácido nucleico;

(b) cuando un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico reaccionan entre sí, la región X_{1} sólo se hibrida con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se hibrida con la región X'_{2}, la región X_{3} sólo se hibrida con la región X'_{3}, ... y la región X_{n} sólo se hibrida con la región X'_{n}, y cuando ambas sondas se unen, se hibridan entre sí en una cualquiera de las regiones de una sonda, y una pluralidad de pares de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico unidas en esa una región se hibridan entre sí para formar un polímero de sondas; y

(c) al menos una G (guanina) o una C (citosina) está dispuesta en ambos terminales de cada una de las regiones de secuencias de bases complementarias en un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, y tras la hibridación de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, se forma al menos un enlace C-G en todos los terminales de las regiones complementarias.

2. Las sondas según la reivindicación 1, en la que el número (n) de regiones de secuencias de bases complementarias en cada una de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico es 3, 4, 5 ó 6,

3. Las sondas según la reivindicación 1 ó 2, en la que el número de bases de cada región de secuencias de bases complementarias en cada una de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico es al menos 8.

4. Las sondas según la reivindicación 1 ó 2, en la que un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico está compuesto por bases seleccionadas entre ADN, ARN o APN.

5. Un procedimiento para formar un polímero de sondas mediante la polimerización de una pluralidad de pares de primera y segunda sonda de ácido nucleico que tiene las siguientes características (a), (b) y (c):

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el número (n) de regiones de secuencias de bases complementarias en cada una de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico es 3, 4, 5 ó 6,

7. El procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, en el que el número de bases de cada región de secuencias de bases complementarias en cada una de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico es al menos 8.

8. El procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, en el que un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico está compuesto por bases seleccionadas entre ADN, ARN o APN.

9. Un polímero de sondas obtenido mediante la polimerización de una pluralidad de pares de primera y segunda sonda de ácido nucleico que tiene las siguientes características (a), (b) y (c):

10. El polímero de sondas según la reivindicación 9, en el que el número (n) de regiones de secuencias de bases complementarias en cada una de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico es 3, 4, 5 ó 6,

11. El polímero de sondas según la reivindicación 9 ó 10, en el que el número de bases de cada región de secuencias de bases complementarias en cada una de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico es al menos 8.

12. El polímero de sondas según la reivindicación 9 ó 10, en el que un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico está compuesto por bases seleccionadas entre ADN, ARN o APN.

13. Un procedimiento para medir un gen diana en una muestra mediante el uso de sondas de polimerización, que comprende las siguientes etapas (1), (2) y (3):

(1) con un par de primera y segunda sonda de ácido nucleico que tiene las características (a), (b) y (c) como sondas de polimerización, hacer reaccionar una cualquiera de las sondas que tenga una región de secuencia de bases complementaria a una parte de un gen diana con una muestra para unir la sonda con el gen diana en la muestra,

(a): un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico cada una compuesta por n (n \geq 3) regiones de secuencias de bases complementarias entre sí, en el que una región X_{1}, una región X_{2}, una región X_{3}, ..., una región X_{n}, proporcionadas en este orden desde el terminal 5' de la primera sonda de ácido nucleico, tienen secuencias de bases complementarias, respectivamente, a una región X'_{1}, una región X'_{2}, una región X'_{3}, ..., una región X'_{n} proporcionadas en este orden desde el terminal 5' de la segunda sonda de ácido nucleico;

(b): cuando un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico reaccionan entre sí, la región X_{1} sólo se hibrida con la región X'_{1}, la región X_{2} sólo se hibrida con la región X'_{2}, la región X_{3} sólo se hibrida con la región X'_{3}, ... y la región X_{n} sólo se hibrida con la región X'_{n}, y cuando ambas sondas se unen, se hibridan entre sí en una cualquiera de las regiones de una sonda, y una pluralidad de pares de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico unidas en esa una región se hibridan entre sí para formar un polímero de sondas; y

(c): al menos una G (guanina) o una C (citosina) está dispuesta en ambos terminales de cada una de las regiones de secuencias de bases complementarias en un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, y tras la hibridación de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico, se forma al menos un enlace C-G en todos los terminales de las regiones complementarias.

(2) hacer reaccionar una pluralidad de las sondas de polimerización entre sí para formar un complejo de gen diana-polímero de sondas; y

14. Un procedimiento para medir un gen diana en una muestra mediante el uso de sondas de polimerización, que comprende las siguientes etapas (1), (2) y (3):

(1) con un par de primera y segunda sonda de ácido nucleico que tiene las siguientes características (a), (b) y (c) como sondas de polimerización, hacer reaccionar al menos una sonda de captura de un gen diana con una muestra para unir la sonda de captura con un gen diana, estando la sonda de captura del gen diana compuesta por dos regiones, una región de la cuales es una región de secuencia de bases complementaria a una parte del gen diana y la otra región de las cuales es una región de secuencia de bases complementaria a una región de una cualquiera de las sondas de polimerización,

(2) luego hacer reaccionar las sondas de polimerización entre sí para unir la sonda de captura con las sondas de polimerización y formar un complejo de gen diana-polímero de sondas; y

15. El procedimiento para medir un gen diana según la reivindicación 13 ó 14, en el que la cantidad de polímero de sondas es medida mediante la unión de un material fluorescente al polímero de sondas y la medición de la fluorescencia resultante de la emisión del material fluorescente.

16. El procedimiento para medir un gen diana según la reivindicación 13 ó 14, en el que la cantidad de polímero de sondas es medida mediante la utilización de un cambio en la absorción óptica a los rayos ultravioleta.

17. El procedimiento para medir un gen diana según la reivindicación 13 ó 14, en el que el número (n) de regiones de secuencias de bases complementarias en cada sonda de polimerización es 3, 4, 5 ó 6.

18. Un reactivo para detectar un gen diana en una muestra, que comprende un par de primera y segunda sonda de ácido nucleico como sondas de polimerización que tienen las siguientes características (a), (b), (c) y (d) como elementos esenciales:

(d) una de las regiones de secuencia de bases complementaria de una cualquiera de la primera o la segunda sonda de ácido nucleico tiene una región que tiene una secuencia de bases complementaria a una parte del gen diana.

19. Un reactivo para detectar un gen diana en una muestra, que comprende: un par de primera y segunda sonda de ácido nucleico como sondas de polimerización que tienen las siguientes características (a), (b) y (c); y al menos una sonda de captura de un gen diana compuesta por al menos dos regiones, siendo una región de las cuales una región de secuencia de bases complementaria a una parte del gen diana y siendo otra región de las cuales una región de secuencia de bases complementaria a una región de una cualquiera de las dos sondas de polimerización como elementos esenciales,

20. El reactivo para detectar un gen diana según la reivindicación 18 ó 19, en el que el número (n) de regiones de secuencias de bases complementarias en cada una de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico es 3, 4, 5 ó 6,

21. El reactivo para detectar un gen diana según la reivindicación 18 ó 19, en el que el número de bases de cada región de secuencias de bases complementarias en cada una de un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico es al menos 8.

22. El reactivo para detectar un gen diana según la reivindicación 18 ó 19, en el que un par de la primera y la segunda sonda de ácido nucleico está compuesto por bases seleccionadas entre ADN, ARN o APN.