ES2608455T3 - Formato de sondas para detectar diferencias de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Método de detección de la presencia o de la ausencia de una secuencia diana de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica, comprendiendo el método: 5 a. poner en contacto una sonda marcada detectablemente que comprende un dominio de ácidos nucleicos de anclaje y un dominio de ácidos nucleicos informador con la muestra, y b. detectar la presencia o la ausencia de unión de la sonda al ácido nucleico diana, en el que los dominios de anclaje e informador presentan una complementariedad inferior a 50% y están unidos mediante un conector no nucleósido y ni el dominio de anclaje ni el dominio informador forman una estructura de tallo-bucle en ausencia del ácido nucleico diana,y en el que (i) la sonda no es extensible por una polimerasa, (ii) el conector está unido al dominio de anclaje a 2 o menos nucleótidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector está unido al dominio informador a 2 o menos nucleótidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no está unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o más bases estabilizadoras, de manera que la diferencia en la temperatura de fusión entre el dominio informador y las posibles secuencias diana se acentúa, (iii) el dominio de anclaje y el dominio informado comprenden, cada uno, una secuencia contigua de por lo menos 6 nucleótidos complementarios a la misma cadena del ácido nucleico diana, y (iv) en el que la hibridación entre el dominio de anclaje y el ácido nucleico diana por sí mismo resulta suficiente para regular la hibridación de la sonda en la localización deseada del ácido nucleico diana.

Description

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DESCRIPCION

Formato de sondas para detectar diferencias de acidos nucleicos ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Un polimorfismo de nucleotido unico (PNU) es una mutacion de un solo par de bases en un sitio especffico en una secuencia de ADN genomico. Los PNU son responsables de la mayorfa de las variaciones en el ADN entre dos individuos cualesquiera. Los PNU pueden predisponer a un individuo a desarrollar una determinada enfermedad o a responder a un farmaco de manera diferente. Por lo tanto, puede utilizarse la deteccion de los PNU para monitorizar condiciones geneticas.

Tambien se producen variaciones genicas y mutaciones en los patogenos, tales como los virus y las bacterias. La deteccion de las variaciones genicas y las mutaciones puede utilizarse para distinguir patogenos y, en algunos casos, puede ayudar a realizar un pronostico y a predecir el curso de tratamiento. En las celulas somaticas tambien se producen mutaciones en bases individuales, por ejemplo durante el desarrollo y progresion del cancer. La deteccion de estas mutaciones ayuda a predecir la respuesta a la terapia.

BREVE DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona metodos de deteccion de la presencia o la ausencia de una secuencia de acidos nucleicos diana en una muestra biologica. Un metodo segun la presente invencion comprende:

a. poner en contacto una sonda marcada detectablemente que comprende un dominio de acidos nucleicos de anclaje y un dominio de acidos nucleicos informador con la muestra, y

b. detectar la presencia o la ausencia de union de la sonda al acido nucleico diana,

en el que los dominios de anclaje e informador presentan una complementariedad inferior a 50% y estan unidos mediante un conector no nucleosido y ni el dominio de anclaje ni el dominio informador forman una estructura de tallo-bucle en ausencia del acido nucleico diana,y en el que

(i) la sonda no es extensible por una polimerasa,

(ii) el conector esta unido al dominio de anclaje a 2 o menos nucleotidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector esta unido al dominio informador a 2 o menos nucleotidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no esta unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras,

(iii) el dominio de anclaje y el dominio informado comprenden, cada uno, una secuencia contigua de por lo menos 6 nucleotidos complementarios a la misma cadena del acido nucleico diana, y

(iv) en el que la hibridacion entre el dominio de anclaje y el acido nucleico diana por si mismo resulta suficiente para regular la hibridacion de la sonda en la localizacion deseada del acido nucleico diana.

Segun una realizacion de la presente invencion, el conector esta unido al dominio de anclaje a 2o menos nucleotidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector esta unido al dominio informador a 2 o menos nucleotidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no esta unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras, y el dominio de anclaje y el dominio informador comprenden, cada uno, una secuencia contigua de por lo menos 10 nucleotidos complementaria a una cadena del acido nucleico diana.

En algunas realizaciones, la etapa de deteccion comprende medir la temperatura de fusion de un complejo formado entre el dominio informador y el acido nucleico diana.

En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 4 y 20 nucleotidos. En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 6 y 12 nucleotidos.

En algunas realizaciones, la region de anclaje es de entre 6 y 40 nucleotidos.

En algunas realizaciones, el marcaje es un marcaje fluorescente. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas poner en contacto la sonda y la muestra con un inhibidor intercalante soluble de manera que el inhibidor altera la fluorescencia del marcaje al formar el dominio informador un complejo con el acido nucleico diana.

En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es un acido nucleico vfrico o microbiano. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es un acido nucleico humano. En algunas realizaciones, el acido nucleico humano

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comprende un polimorfismo de nucleotido unico (PNU) o una mutacion y el dominio informador es 100% complementario a un alelo del PNU o de la mutacion.

En algunas realizaciones, la sonda comprende por lo menos un nucleotido no natural, en el que el nucleotido no natural incrementa la temperatura de fusion del dominio informador respecto a la de un nucleotido natural correspondiente en el lugar del nucleotido no natural.

En algunas realizaciones, el conector es polietilenglicol. En algunas realizaciones, el conector es hexaetilenglicol.

La presente invencion proporciona ademas mezclas de reaccion para la deteccion de la presencia o la ausencia de una secuencia diana. Una mezcla de reaccion segun la presente invencion comprende:

a. un acido nucleico diana que comprende una region de union a anclaje y una region de union a informador, y

b. una sonda marcada detectablemente que comprende un dominio de acidos nucleicos de anclaje y un dominio de acidos nucleicos informador,

en el que los dominios de anclaje e informador presentan una complementariedad inferior a 50% y estan unidos mediante un conector no nucleosido y ni el dominio de anclaje ni el dominio informador forman una estructura de tallo-bucle en ausencia del acido nucleico diana, y en el que:

(i) la sonda no es extensible por una polimerasa,

(ii) el conector esta unido al dominio de anclaje a 2 o menos nucleotidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector esta unido al dominio informador a 2 o menos nucleotidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no esta unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras,

(iii) el dominio de anclaje y el dominio informado comprenden, cada uno, una secuencia contigua de por lo menos 6 nucleotidos complementarios a la misma cadena del acido nucleico diana, y

(iv) en el que la hibridacion entre el dominio de anclaje y el acido nucleico diana por si mismo resulta suficiente para regular la hibridacion de la sonda en la localizacion deseada del acido nucleico diana.

En algunas realizaciones, la mezcla de reaccion comprende ademas nucleosidos trifosfato, una ADN polimerasa y/o un cebador oligonucleotido.

En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 4 y 20 nucleotidos. En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 6 y 12 nucleotidos.

En algunas realizaciones, el dominio de anclaje es de entre 6 y 40 nucleotidos.

En algunas realizaciones, el marcaje es un marcaje fluorescente. En algunas realizaciones, un inhibidor intercalante soluble en el que el inhibidor altera la fluorescencia del marcaje al formar el dominio informador un complejo con el acido nucleico diana.

En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es un acido nucleico vfrico o microbiano. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es un acido nucleico humano. En algunas realizaciones, el acido nucleico humano comprende un polimorfismo de nucleotido unico (PNU) o una mutacion y el dominio informador es 100% complementario a un alelo del PNU o de la mutacion.

En algunas realizaciones, la sonda comprende por lo menos un nucleotido no natural, en el que el nucleotido no natural incrementa la temperatura de fusion del dominio informador respecto a la de un nucleotido natural correspondiente en el lugar del nucleotido no natural.

En algunas realizaciones, el conector es polietilenglicol. En algunas realizaciones, el conector es hexaetilenglicol.

La presente invencion se refiere ademas a una sonda marcada detectablemente que comprende un dominio de acidos nucleicos de anclaje y un dominio de acidos nucleicos informador, en la que:

los dominios de anclaje e informador presentan una complementariedad inferior al 50% y estan unidos mediante un conector no nucleosido,

ni el dominio de anclaje ni el dominio informador forman una estructura de tallo-bucle en ausencia del acido nucleico diana, y

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en la que:

(i) la sonda no es extensible por una polimerasa, y

(ii) el conector esta unido al dominio de anclaje a 2 o menos nucleotidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector esta unido al dominio informador a 2o menos nucleotidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no esta unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras,

En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 4 y 20 nucleotidos. En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 6 y 12 nucleotidos.

En algunas realizaciones, el dominio de anclaje es de entre 6 y 40 nucleotidos.

En algunas realizaciones, el marcaje es un marcaje fluorescente.

En algunas realizaciones, la sonda comprende por lo menos un nucleotido no natural, en el que el nucleotido no natural incrementa la temperatura de fusion del dominio informador respecto a la de un nucleotido natural correspondiente en el lugar del nucleotido no natural.

En algunas realizaciones, el conector es polietilenglicol. En algunas realizaciones, el conector es hexaetilenglicol.

La presente invencion proporciona ademas un kit para la deteccion de la presencia o la ausencia de una secuencia diana. El kit segun la presente invencion comprende:

a. una sonda marcada detectablemente que comprende un dominio de acidos nucleicos de anclaje y un dominio de acidos nucleicos informador, en la que:

los dominios de anclaje e informador estan unidos mediante un conector no nucleosido,

ni el dominio de anclaje ni el dominio informador forman una estructura de tallo-bucle en ausencia del acido nucleico diana, y

en la que:

(i) la sonda no es extensible por una polimerasa,

(ii) el conector esta unido al dominio de anclaje a 2 o menos nucleotidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector esta unido al dominio informador a 2 o menos nucleotidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no esta unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras,

(iii) el dominio de anclaje y el dominio informado comprenden, cada uno, una secuencia contigua de por lo menos 6 nucleotidos complementarios a la misma cadena del acido nucleico diana, y

(iv) en el que la hibridacion entre el dominio de anclaje y el acido nucleico diana por si mismo resulta suficiente para regular la hibridacion de la sonda en la localizacion deseada del acido nucleico diana.

b. uno o mas reactivos seleccionados de entre el grupo que consiste de una sal, un tampon, un inhibidor de nucleasa, nucleosidos trifosfato, una ADN polimerasa y/o un cebador oligonucleotido.

En algunas realizaciones, el kit comprende ademas un inhibidor intercalante soluble de manera que el inhibidor altera la fluorescencia procedente del marcaje al formar el dominio informador un complejo con el acido nucleico diana.

En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 4 y 20 nucleotidos. En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 6 y 12 nucleotidos.

En algunas realizaciones, el dominio de anclaje es de entre 6 y 40 nucleotidos.

En algunas realizaciones, el marcaje es un marcaje fluorescente.

En algunas realizaciones, la sonda comprende por lo menos un nucleotido no natural, en el que el nucleotido no natural incrementa la temperatura de fusion del dominio informador respecto a la de un nucleotido natural correspondiente en el lugar del nucleotido no natural.

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DEFINICIONES

Tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” o “la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un oligonucleotido" incluye una pluralidad de oligonucleotidos; la referencia a "una sonda" incluye mezclas de dichas sondas, y similares.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una "muestra biologica" se refiere a cualquier sustancia que contiene o que se cree que contiene acidos nucleicos (por ejemplo de una bacteria, virus, biopsia de tejido, etc.). La muestra puede obtenerse por cualesquiera medios conocidos por el experto en la materia. Dicha muestra puede ser una cantidad de tejido o lfquido, o una fraccion purificada del mismo, aislada a partir de uno o mas individuos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo, piel, plasma, suero, sangre completa, lfquido espinal, saliva, lfquido peritoneal, lfquido linfatico, humor acuoso o vftreo, lfquido sinovial, orina, lagrimas, celulas sangufneas, productos sangufneos, semen, lfquido seminal, lfquidos vaginales, efusion pulmonar, lfquido seroso, lavado bronquioalveolar, tumores, tejidos incluidos en parafina, etc. Las muestras tambien pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos in vitro, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, medio condicionado resultante del crecimiento de celulas en el medio de cultivo celular, celulas recombinantes, componentes celulares, etc. Puede obtenerse un acido nucleico a partir de una muestra biologica mediante procedimientos bien conocidos de la tecnica. Una "secuencia diana de acidos nucleicos" se refiere a una secuencia polinucleotida que debe detectarse en una muestra biologica. El acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, la region (una subsecuencia o secuencia) de un acido nucleico que es total o parcialmente complementaria a la region hibridante de un dominio informado de una sonda de acidos nucleicos tal como se indica en la presente memoria. La "secuencia diana" puede presentar cualquier longitud de por lo menos 3 nucleotidos. La secuencia diana puede ser una parte de una secuencia genica mas grande u otra secuencia que debe detectarse.

Las expresiones "acido nucleico" y "polinucleotido" se utilizan intercambiablemente y se refieren a un polfmero de monomeros de acidos nucleicos de ribosa (ARN) o de acidos nucleicos de desoxirribosa (ADN), o analogos de los mismos. Lo anterior incluye polfmeros de nucleotidos, tales como ARN y ADN, asf como formas modificadas de los mismos, acidos peptido nucleicos (APN), acidos nucleicos bloqueados (ANB) y similares. En determinadas aplicaciones, el acido nucleico puede ser un polfmero que incluye multiples tipos de monomero, por ejemplo subunidades de tanto ARN como ADN. Un acido nucleico puede ser o puede incluir, por ejemplo, un cromosoma o segmento cromosomico (por ejemplo, un vector de expresion), un casete de expresion, un polfmero de ADN o ARN desnudo, un amplicon, un oligonucleotido, un cebador, una sonda, etc. Un acido nucleico puede ser, por ejemplo, de cadena sencilla o de doble cadena, o hfbridos ADN:ARN, o estructuras quimericas de aDn y ARN. No se pretende realizar ninguna distincion de longitud entre la expresion "acido nucleico", "polinucleotido" y "oligonucleotido", y las expresiones pueden utilizarse intercambiablemente en la presente memoria a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Un acido nucleico es tfpicamente de cadena sencilla o de doble cadena y generalmente contiene enlaces fosfodiester, aunque en algunos casos, tal como se indica de manera general en la presente memoria, se incluyen analogos de acidos nucleicos que pueden presentar esqueletos alternativos, incluyendo, por ejemplo y sin limitacion, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925, 1993, y referencias citadas en la misma, Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800, 1970; Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579, 1977, Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487, 1986; Sawai et al., Chem. Lett. 805, 1984; Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988; y Pauwels et al., Chemica Scripta 26:1419, 1986), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437, 1991, y la patente US n° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321, 1989), enlaces O-metilfosforoamidita (Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press, 1992), y esqueletos y enlaces de acido peptido-nucleico (Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895, 1992; Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008, 1992; Nielsen, Nature 365:566, 1993, y Carlsson et al., Nature 380:207, 1996). Entre otros analogos de acidos nucleicos se incluyen aquellos con esqueletos cargados positivamente (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097, 1995), esqueletos no ionicos (patentes US n° 5.386.023, n° 5.637.684, n° 5.602.240, n° 5.216.141 y n° 4.469.863; Angew Chem. Intl. Ed. English 30: 423, 1991; Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988; Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597, 1994; capftulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghvi y P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395, 1994; Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17, 1994; Tetrahedron Lett. 37:743, 1996) y esqueletos no ribosfdicos, incluyendo los indicados en las patentes US n° 5.235.033 y n° 5.034.506, y los capftulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ed. Y.S. Sanghvi y P. Dan Cook. Los acidos nucleicos que contienen uno o mas azucares carbocfclicos tambien se encuentran incluidos en la definicion de acidos nucleicos (Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., paginas 169 a 176, 1995). Tambien se describen varios analogos de acidos nucleicos en, por ejemplo, Rawls C. y E. News, 2 de junio de 1997, pagina 35. Estas modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato pueden llevarse a cabo para facilitar la adicion de fracciones adicionales, tales como marcajes, o para alterar la estabilidad y semivida de dichas moleculas en medios fisiologicos.

Ademas, de dichas bases heterocfclicas naturales que se observan tfpicamente en los acidos nucleicos (por ejemplo adenina, guanina, timina, citosina y uracilo), entre los analogos de acidos nucleicos tambien se incluyen los que

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presentan bases heterocfclicas no naturales u otras bases modificadas, muchas de las cuales se indican, o se hace referenda a ellas de otra manera, en la presente memoria. En particular, se describen en mayor detalle muchas bases no naturales en, por ejemplo, Seela et al., Helv. Chim. Acta 74:1790, 1991; Grein et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, 1994; y Seela et al., Helv. Chim. Acta 82:1640, 1999. A tftulo ilustrativo adicional, se incluyen opcionalmente determinadas bases utilizadas en nucleotidos que actuan como modificadores de la temperatura de fusion (Tf). Por ejemplo, entre algunas de ellas se incluyen las 7-deazapurinas (por ejemplo 7-deazaguanina, 7- deazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo propinil-dU, propinil-dC, etc.) y similares. Ver, por ejemplo, patente US n° 5.990.303, titulada "Synthesis of 7-deaza-2'-deoxyguanosine nucleotides" [Sfntesis de nucleotidos 7-deaza-2'-desoxiguanosina], concedida el 23 de nov. de 1999 a Seela. Entre otras bases heterocfclicas representativas se incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina, derivados 8-aza de 2- aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6- azacitosina; 5-fluorocitosina; 5-clorocitosina; 5-yodocitosina; 5-bromocitosina; 5-metilcitosina; 5-propinilcitosina; 5- bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-

metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5-propiniluracilo, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina,

inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 7-deazaadenina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 7-deazaguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5- metoxiuracilo, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, acido uracil-5-oxiacetico (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil-ester de acido uracil-5-oxiacetico, 3-(3- amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina y 5-propinilpirimidina y similares.

Tambien se indican ejemplos adicionales de bases y nucleotidos modificados en, por ejemplo, la patente US n° 5.484.908, titulada "Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines" [Oligonucleotidos que contienen 5-propinil- pirimidinas], concedida el 16 de enero de 1996 a Froehler et al.; la patente US n° 5.645.985, titulada "Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines [Formacion potenciada de triple helice y de doble helice con oligomeros que contienen pirimidinas modificadas], concedida el 3 de nov. de 1998 a Froehler et al.; la patente US n° 6.639.059, titulada "Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides" [Sfntesis de [2.2.1]biciclo-nucleosidos], concedida el 28 de oct. de 2003 a Kochkine et al.; la patente US n° 6.303.315, titulada "One step sample preparation and detection of nucleic acids in complex biological samples" [Preparacion de muestra y deteccion de acidos nucleicos en una sola etapa en muestras biologicas complejas], concedida el 16 de oct. de 2001 a Skouv; patente US n° 6.001.611, titulada "Modified nucleic acid amplification primers" [Cebadores modificados de amplificacion de acidos nucleicos], concedida el 14 de dic. de 1999 a S. Will, y la publicacion de patente US n° 2003/0092905, titulada "Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides" [Sfntesis de [2.2.1]biciclo-nucleosido], de Kochkine et al., publicada el 15 de mayo de 2003.

No se pretende que la presente invencion se encuentre limitada por la fuente de los acidos nucleicos, polinucleotidos u oligonucleotidos. Dichos acidos nucleicos pueden proceder de un mamffero humano o no humano, o de cualquier otro organismo (por ejemplo planta, anfibio, bacteria, virus, micoplasma, etc.), tejido o lfnea celular o derivado procedente de cualquier fuente recombinante, sintetizado in vitro o mediante sfntesis qufmica. Nuevamente el acido nucleico puede ser de ADN, ARN, ADNc, ADN-ARN, acidos nucleicos bloqueados (ANB), acidos peptidos nucleicos (APN), un hfbrido o cualquier mezcla de los anteriores. Los acidos nucleicos pueden encontrarse presentes en una forma de doble cadena, de cadena sencilla o parcialmente de doble cadena. Entre los acidos nucleicos de la invencion se incluyen ambos acidos nucleicos y fragmentos de los mismos, en formas purificadas o no purificadas, incluyendo genes, cromosomas, plasmidos, los genomas de material biologico tal como microorganismos, por ejemplo bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, seres humanos, micoplasmas y similares.

La expresion "extension de un cebador" se refiere a la capacidad de un biocatalizador incorporador de nucleotidos, tal como una polimerasa, de anadir nucleotidos al extremo 3' de un cebador de una manera especffica de molde. Un cebador es no extensible en el caso de que, por ejemplo, el extremo 3' del cebador se encuentre bloqueado.

La expresion "condiciones de extension de la reaccion en cadena de la polimerasa" se refiere a condiciones bajo las que los cebadores que se hibridan con un acido nucleico molde son extendidos por una polimerasa durante una etapa de hibridacion de reaccion en cadena de polimerasa (PCR). El experto en la materia apreciara que dichas condiciones pueden variar y estan generalmente influidas por la fuerza ionica y la temperatura. Se describen diversas condiciones de hibridacion por PCR, en por ejemplo, PCR Strategies (M.A. Innis, D.H. Gelfand y J.J. Sninsky, editores, Academic Press, San Diego, CA, 1995) en el capftulo 14: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky y T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990).

La expresion "nucleotido natural" se refiere a nucleotidos de tipo purina y pirimidina presentes en el ADN celular (por ejemplo citosina (C), adenina (A), guanina (G) y timina (T)) y en el ARN celular (por ejemplo citosina (C), adenina (A), guanina (G) y uracilo (U)).

La expresion "nucleotido no natural" o "nucleotido modificado" se refiere a una unidad en un polfmero de acidos

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nucleicos que contiene una base modificada, un grupo sacarido o fosfato, o que incorpora una fraccion no natural en su estructura. Por ejemplo, la base, sacarido o fosfato de un nucleotido no natural puede modificarse segun las modificaciones indicadas anteriormente para analogos de acidos nucleicos. El nucleotido no natural puede producirse mediante una modificacion qufmica del nucleotido como parte del polfmero de acidos nucleicos o antes de la incorporacion del nucleotido modificado en el polfmero de acidos nucleicos. En otro enfoque, puede producirse un nucleotido no natural mediante la incorporacion de un nucleosido trifosfato modificado en la cadena de polfmero durante una reaccion de amplificacion. Entre los ejemplos de nucleotidos no naturales, a tftulo ilustrativo y no limitativo, se incluyen dideoxinucleotidos, derivados o analogos que estan biotinilados, modificados con amina, alquilados, marcados con fluoroforo y similares, y entre ellos tambien se incluyen fosforotioato, fosfito, derivados en atomos anulares, y similares.

Un acido nucleico es "complementario" en relacion a otro acido nucleico en el caso de que por lo menos un segmento de acidos nucleicos (es decir, por lo menos dos bases contiguas) pueda combinarse en una asociacion antiparalela o hibridarse con por lo menos una subsecuencia de otro acido nucleico para formar un duplex. La asociacion antiparalela puede ser intramolecular, por ejemplo en forma de un bucle de horquilla dentro de un acido nucleico, o intermolecular, tal como en el caso de que dos o mas acidos nucleicos de cadena sencilla se hibriden entre sf. En el contexto de la presente invencion, para un oligonucleotido que es "totalmente complementario" a una secuencia particular, cada base del oligonucleotido es complementario a las bases correspondientes en la secuencia particular de una manera antiparalela. Pueden incluirse en los acidos nucleicos de la presente invencion determinadas bases no observadas comunmente en los acidos nucleicos naturales y entre las cuales se incluyen, por ejemplo, 7-deazaguanina y los comentados anteriormente. En algunas realizaciones, la complementariedad no es perfecta (es decir, los acidos nucleicos pueden ser "parcialmente complementarios" y no "totalmente complementarios"). Los duplex estables, por ejemplo, pueden contener pares de bases incorrectamente apareados o bases no apareadas. La expresion "sustancialmente complementario" se refiere a una secuencia que es por lo menos 80% complementario (por ejemplo por lo menos 80%, 85%, 90% o 95%) respecto a una secuencia de union potencial. En donde no se indique, la expresion se refiere al grado de complementariedad en toda la longitud de la secuencia de union potencial.

Un "acido nucleico cebador" o "cebador" es un acido nucleico que puede hibridarse con un acido nucleico diana o molde y permitir la extension o elongacion de cadena utilizando, por ejemplo, un biocatalizador que incorpora nucleotidos, tal como una polimerasa bajo condiciones de reaccion apropiadas. Entre dichas condiciones tfpicamente se incluyen la presencia de uno o mas desoxirribonucleosidos trifosfato y el biocatalizador incorporador de nucleotidos ene un tampon adecuado ("tampon" incluye sustituyentes que son cofactores, o que afectan al pH, fuerza ionica, etc.) y a una temperatura adecuada. Un acido nucleico cebador tfpicamente es un oligonucleotido natural o sintetico (por ejemplo un oligodesoxirribonucleotido de cadena sencilla, etc.). Aunque se utilizan opcionalmente otras longitudes de acido nucleico cebador, tfpicamente comprenden regiones hibridantes de longitudes de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 nucleotidos. Los acidos nucleicos de cebadores cortos generalmente requieren temperaturas mas bajas para formar complejos hfbridos suficientemente estables con acidos nucleicos de molde. Un acido nucleico cebador que es por lo menos parcialmente complementario a una subsecuencia de un acido nucleico molde tfpicamente resulta suficiente para hibridarse con el molde para que pueda producirse la extension. El diseno de cebadores adecuados para, por ejemplo, la amplificacion de una secuencia diana dada es bien conocido de la tecnica y se describe en la literatura citada en la presente memoria. Un acido nucleico cebador puede marcarse, si se desea, mediante la incorporacion de un marcaje detectable mediante, por ejemplo, medios espectroscopicos, fotoqufmicos, bioqufmicos, inmunoqufmicos o qufmicos, u otras tecnicas. A tftulo ilustrativo, entre los marcajes se incluyen isotopos radioactivos, pigmentos fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (tales como los utilizados comunmente en los ensayos de ELISA), biotina o haptenos y protefnas para los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales. Muchos de dichos marcajes y otros marcajes se describen adicionalmente en la presente memoria y/ conocidos de otra manera en la tecnica. El experto en la materia reconocera que, en determinadas realizaciones, los acidos nucleicos cebadores tambien pueden utilizarse como acidos nucleicos sonda.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "sonda" se refiere a un oligonucleotido (u otra secuencia de acidos nucleicos) que puede formar una estructura duplex con una region de un acido nucleico diana (o amplicon derivado de dicho acido nucleico diana) debido a la complementariedad parcial o completa de por lo menos una secuencia en la sonda con una secuencia en el acido nucleico diana bajo condiciones adecuadas. Tal como se define en la presente memoria, la sonda puede comprender ademas componentes no nucleotidos, por ejemplo un conector no nucleosido. Tal como se comenta en la presente memoria, la sonda puede utilizarse con marcaje o sin marcaje. El extremo 3'-terminal de la sonda opcionalmente puede disenarse para prohibir la incorporacion de la sonda en un producto de extension de cebador (no extensible). Lo anterior puede conseguirse mediante la utilizacion de bases no complementarias o mediante la adicion de una fraccion qufmica, tal como biotina o un grupo fosfato, al grupo 3'-hidroxilo del ultimo nucleotido, que puede, dependiendo de la fraccion seleccionada, servir a un doble proposito, al actuar tambien como marcaje para la deteccion o captura posterior del acido nucleico unido al marcaje. La prohibicion de la extension tambien puede conseguirse eliminando el grupo 3'-OH o mediante la utilizacion de un nucleotido que no presenta un 3'-OH, tal como un dideoxinucleotido, o mediante la adicion de un grupo voluminoso que bloquee la extension mediante un impedimento esterico. Los polinucleotidos tambien pueden convertirse en no extensibles, por ejemplo mediante la modificacion del extremo 2' del polinucleotido, por ejemplo con un fosfato u otra

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fraccion, tal como se indica en, por ejemplo, cualquiera de las publicaciones de patente US n° 2005/0037991 y n° 2007/0154914.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "tallo-bucle" se refiere a una estructura secundaria que comprende una parte de tallo y una parte de bucle no apareada. Segun la presente invencion, el tallo esta formado por dos regiones complementarias de un acido nucleico de cadena sencilla. La parte tallo de un tallo-bucle puede estar formada de dos regiones de un unico acido nucleico, en el que una de las 2 regiones comprende por lo menos 3 (por ejemplo por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7 o mas) bases 100% complementarias a la otra de las dos regiones, permitiendo de esta manera la formacion del duplex tallo bajo condiciones apropiadas. Las bases intermedias entre las dos regiones pueden formar un bucle no apareado, que comprende, por ejemplo, por lo menos tres, por lo menos cinco, por lo menos siete, por lo menos diez o por lo menos 20 o mas bases.

La expresion "region hibridante" se refiere a aquella region de por lo menos 3 nucleotidos contiguos de longitud de un acido nucleico que es exacta o sustancialmente complementario a, y que por lo tanto se hibrida con, un polinucleotido.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "Tf" se refiere a la "temperatura de fusion". La temperatura de fusion es la temperatura a la que la mitad de una poblacion de polinucleotidos u oligomeros nucleobases de doble cadena (por ejemplo complejos de hibridacion), en homoduplex o heteroduplex (es decir, duplex que son completa o parcialmente complementarios), se disocian en cadenas sencillas (bajo fuerza ionica, pH y concentracion de acidos nucleicos definidos). La prediccion de la Tf de un polinucleotido duplex considera que la secuencia de bases, asf como otros factores, incluyendo las caracterfsticas estructurales y de secuencia y la naturaleza de los enlaces oligomericos. Los metodos para predecir y determinar experimentalmente la Tf son conocidos de la tecnica.

Por ejemplo, tradicionalmente se determina la Tf mediante una curva de fusion, en la que se calienta una molecula duplex de acidos nucleicos en un programa de temperatura controlada, y se realiza un seguimiento y se representa graficamente del estado de asociacion/disociacion de las dos cadenas sencillas hasta alcanzar una temperatura a la que las dos cadenas estan completamente disociadas. Se determina la Tf a partir de dicha curva de fusion. Alternativamente, puede determinarse la Tf con una curva de hibridacion, en la que se calienta una molecula duplex de acidos nucleicos hasta una temperatura a la que las dos cadenas se encuentran completamente disociadas. A continuacion, se baja la temperatura en un programa de temperatura controlada, y se realiza un seguimiento y se representa graficamente el estado de asociacion/disociacion de las dos cadenas sencillas en el duplex hasta alcanzar una temperatura a la que las dos cadenas se encuentran completamente apareadas. A continuacion, se determina la Tf a partir de dicha curva de hibridacion.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "marcado detectablemente" o "marcaje detectable" se refiere a una especie qufmica que puede detectarse o que puede conducir a una respuesta detectable. Los marcajes detectables segun la invencion pueden unirse a una sonda directa o indirectamente. En algunas realizaciones, los marcajes detectables son elementos de una pareja de marcajes interactiva. En algunas otras realizaciones, un elemento de la pareja de marcaje es un fluoroforo y el otro elemento de la pareja de marcaje es un inhibidor.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

FIG. 1:

(A) en el caso de que el dominio informador sea 100% complementario al acido nucleico diana, se hibrida al acido nucleico diana. Tal como se muestra en la figura, la secuencia del acido nucleico diana contiene un polimorfismo de nucleotido unico (PNU) y el dominio informar es 100% complementario a la secuencia diana que contiene el PNU.

(B) En el caso de un apareamiento incorrecto de PNU, por ejemplo la secuencia diana de acidos nucleicos contiene alelos variantes o alternativos del PNU, el dominio informador no se hibrida con el acido nucleico diana.

FIG. 2: otra realizacion de la sonda marcada de la presente invencion. Tal como se muestra en la figura, se une un pigmento fluorescente al extremo 5'-terminal del dominio informador y se une un pigmento inhibidor al extremo 5' del dominio de anclaje.

FIG. 3: otra realizacion de la sonda marcada de la presente invencion. Tal como se muestra en la figura, se une un pigmento fluorescente al extremo 5'-terminal del dominio informador y se une un pigmento inhibidor al extremo 3' del dominio informador.

FIG. 4: otra realizacion de la sonda marcada de la presente invencion. Tal como se muestra en la figura, se une un pigmento fluorescente al extremo 5'-terminal del dominio informador y se utiliza un pigmento inhibidor intercalante soluble.

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FIG. 5: se generaron diversas versiones de la sonda Cobra con o sin bases estabilizadoras, de la manera siguiente: 5NS-CBRA-USRV no contiene bases estabilizadoras en la region informadora de 9 bases; 6ST-CBRA- USRV contiene 7 bases estabilizadoras en la region informadora de 9 bases, y 7ST-CBRA-USRV contiene 7 bases estabilizadoras en la region informadora de 9 bases pero ninguna base estabilizadora en el centro de la region informadora correspondiente a la region variable en el molde.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

I. Introduccion

La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que una sonda de dos dominios que presenta un conector flexible permite la deteccion especffica de la presencia o ausencia de una secuencia diana de acidos nucleicos. El primer dominio sirve como "anclaje" que controla la hibridacion de la sonda en el acido nucleico diana. Dicho dominio se hibrida con el acido nucleico diana establemente y es tolerante a potenciales apareamientos incorrectos, o se disena para formar un duplex con una region que presenta baja variabilidad dentro de la region complementaria (region de "union a anclaje") del acido nucleico diana. El segundo dominio sirve como "informador" que esta disenado para detectar la secuencia de interes. El "informador" es altamente especffico para la region complementaria del acido nucleico diana (region "de union a informador") y es capaz de detectar la presencia o la ausencia de la secuencia diana, asf como de diferenciar la correspondencia/no correspondencia con la region de union a informador. El dominio informador generalmente se une a un marcaje de manera que puede distinguirse la hibridacion y la falta de hibridacion del dominio informador, detectando de esta manera la presencia o la ausencia de la secuencia diana, o detectando alteraciones de la temperatura de fusion, detectando de esta manera los apareamientos incorrectos en la region de la sonda. La sonda de dos dominios de dicho diseno permite una deteccion altamente especffica de una secuencia diana de interes.

La presente invencion proporciona ademas metodos para detectar un acido nucleico diana con las sondas de dos dominios. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los metodos de la presente invencion resultan utiles en numerosas aplicaciones, incluyendo, aunque sin limitacion a ellos, diagnosticos moleculares, agricultura, ensayo de alimentos, cultivos/crfa de ganado, identificacion de patogenos, identificacion/desarrollo de farmacos y farmacogenomica. Por ejemplo, los metodos de la presente invencion pueden utilizarse en la deteccion de variantes particulares de un virus o la deteccion de una secuencia de acidos nucleicos que comprenden un polimorfismo de nucleotido unico o una mutacion puntual en diversos organismos.

Los metodos de la tecnica anterior apropiados para detectar la presencia o la ausencia de una secuencia diana de acidos nucleicos en una muestra biologica habitualmente comprenden poner en contacto la muestra con una sonda detectablemente marcada que comprende un dominio de acidos nucleicos de anclaje (dominio de union a diana) y un dominio de acidos nucleicos informador (dominio de cierre de diana), en el que los dominios de anclaje e informador son sustancialmente complementarios entre si y, por lo tanto, deben formar una estructura de tallo-bucle entre si en ausencia del acido nucleico diana y, de esta manera, se reduce la union de la sonda a la diana (documentos n° US 2005/0123988, n° WO 207/070542). El documento n° WO 2004/098386 describe sondas que comprenden un dominio de anclaje y un dominio de union unidos mediante un dominio de puente que contiene bases universales y/o otras bases no naturales y/o bases naturales para detectar los PNU. Se indica ademas que el dominio de puente puede contener un conector no de acidos nucleicos, tal como un espaciador 9, espaciador 18 o espaciador C3. Las sondas que comprenden dicho conector no de acidos nucleicos, sin embargo, funcionan peor que las sondas que comprenden bases universales en el dominio de puente. Las sondas que contienen un dominio complementario a otra sonda pero no la misma cadena del acido nucleico diana se describen, por ejemplo, en el documento n° WO 02/02817.

El documento n° WO 2008/066730 describe la utilizacion de una sonda marcada en combinacion con un oligomero de ADN-ADN que comprende un conector amino C6, un conector no nucleosido, que une el APN con el oligomero de ADN. Sin embargo, los oligomeros de APN-ADN indicados ni comprenden un marcaje ni una secuencia contigua de por lo menos 6 nucleotidos complementarios a la misma cadena del acido nucleico diana adecuado para permitir la union selectiva a una forma de un PNU. Los oligomeros de APN-ADN indicados son extensibles or una polimerasa al hibridarse con el acido nucleico diana.

II. Sondas

La presente invencion se refiere a una sonda que comprende un dominio de acidos nucleicos informador y un dominio de acidos nucleicos informador que presenta una complementariedad inferior al 50% y que comprende ademas un conector no nucleosido para unir los dos dominios. Por conveniencia, el dominio de acidos nucleicos de anclaje tambien puede denominarse "primer dominio" y el dominio de acidos nucleicos informador tambien puede denominarse "segundo dominio". La sonda de la presente invencion se disena para marcarse detectablemente con el fin de detectar la presencia o la ausencia de un acido nucleico diana, es decir, de manera que se produce un cambio de senal procedente del marcaje al hibridarse el dominio informador con la diana, en comparacion con la no hibridacion del informador con la diana. Mediante la deteccion y la medicion del cambio de la senal detectable, la

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presencia o la ausencia de la secuencia diana de acidos nucleicos puede determinarse cualitativa o cuantitativamente. Mediante la deteccion de alteraciones de la temperature de fusion, puede determinarse la presencia o la ausencia de mutaciones o alteraciones de la diana.

El dominio de anclaje de la invencion esta disenado para hibridarse con una secuencia "de union a anclaje" del acido nucleico diana bajo las condiciones del ensayo. En contraste, el dominio informador puede hibridarse o no con su "region de union" diana dependiendo de si se encuentra presente la secuencia diana exacta. El dominio informador puede disenarse para que, por ejemplo, sea complementario o por lo menos sustancialmente complementario a una secuencia "de union a informador" de un acido nucleico diana. Dependiendo de las condiciones de reaccion utilizadas, puede distinguirse la hibridacion del dominio informador con la diana frente a la hibridacion con una secuencia variante diana.

La sonda utilizada segun la presente invencion se convierte en no extensible de manera que no pueden anadirse nucleotidos adicionales a la sonda. La sonda puede convertirse en no extensible, por ejemplo mediante la modificacion del extremo 3' de la sonda de manera que el grupo hidroxilo ya no es capaz de participar en la elongacion. El grupo hidroxilo de un nucleotido natural 3' simplemente puede modificarse con una diversidad de grupos funcionales. Por ejemplo, el extremo 3' de la sonda puede convertirse en no extensible mediante la incorporacion de un analogo de nucleotido que no presenta un grupo 3'-hidroxilo o no puede funcionar como sustrato de una polimerasa para la extension. Opcionalmente, la sonda puede convertirse en no extensible mediante la incorporacion de un marcaje en su extremo 3'.

En algunas realizaciones, la sonda puede convertirse en no extensible mediante la incorporacion de un nucleotido terminador 2', un analogo de nucleotido que presenta un grupo de bloqueo en la posicion 2' de la fraccion sacarida del nucleotido. Un "grupo de bloqueo" se refiere a un grupo o fraccion qufmica que tfpicamente impide la extension de un acido nucleico (es decir, un nucleotido terminador 2' tfpicamente es no extensible por uno o mas biocatalizadores incorporadores de nucleotidos). Es decir, tras incorporar un nucleotido terminador 2' en un acido nucleico (por ejemplo en el extremo 3' del acido nucleico), el grupo de bloqueo evita la extension adicional de un acido nucleico por como mfnimo un biocatalizador que incorpora nucleotidos. Entre los biocatalizadores incorporadores de nucleotidos ejemplares se incluyen ADN polimerasas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo, una ADN polimerasa G46E E678G CS5, una AdN polimerasa G46E L329A E678G CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G CS5, una ADN polimerasa G46E E678G CS6, una polimerasa AZO5R, una ADN polimerasa Taq E615G, una polimerasa de Thermus flavus, una polimerasa TMA-25, una polimerasa TMA-30, una ADN polimerasa Tth, una polimerasa SPS-17 de especie de Thermus, una polimerasa Taq E615G, una polimerasa de Thermus Z05R, una ADN polimerasa de T7, una ADN polimerasa I Kornberg, una ADN polimerasa Klenow, una ADN polimerasa Taq, una ADN polimerasa micrococica, una ADN polimerasa alfa, una transcriptasa inversa, una transcriptasa inversa del VMA, una transcriptasa inversa del VLMu-M, una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una ARN polimerasa de E. coli, una ARN polimerasa SP6, una ARN polimerasa T3, una ADN polimerasa de T4, una ARN polimerasa de T7, una ARN polimerasa II, una transferasa terminal, una polinucleotido fosforilasa, una ADN polimerasa incorporadora de ribonucleotidos, y similares.

Un grupo de bloqueo ejemplar es un grupo fosfato. Entre los nucleotidos terminadores 2' ejemplares se incluyen los nucleosidos 2'-monofosfato-3'-hidroxil-5'-trifosfato y los nucleosidos 2'-monofosfato-3'-hidroxil-5'-difosfato. Se indican otros nucleotidos terminadores 2' en, por ejemplo, las solicitudes publicadas de patente US n° 2005/0037991, titulada "Synthesis and compositions of 2'-terminator nucleotides" [Sfntesis y composiciones de nucleotidos terminadores 2'], la publicacion n° 2005/0037398, titulada "2'-Terminator nucleotide-related methods and systems" [Metodos y sistemas relacionados con nucleotidos terminadores 2'] y la solicitud publicada de patente US n° 2007/0154914, titulada "2'-Terminator related pyrophosphorolysis activated polymerization" [Polimerizacion activada mediante pirofosforolisis relacionada con terminadores 2'].

Segun la presente invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje y el dominio de acidos nucleicos informador estan unidos mediante un conector no nucleosido. Puede utilizarse cualquier tecnica estandar para unir el dominio de acidos nucleicos de anclaje o el dominio de acidos nucleicos informador al conector no nucleosido. El dominio de acidos nucleicos de anclaje o el dominio de acidos nucleicos informador pueden unirse al conector no nucleosido directa o indirectamente. En algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos de anclaje o el dominio de acidos nucleicos informador se unen covalentemente al conector no nucleosido.

A. El dominio de acidos nucleicos de anclaje

El dominio de acidos nucleicos de anclaje de la presente invencion esta disenado para unirse a una secuencia "de union a anclaje" del acido nucleico diana en una muestra biologica bajo las condiciones del ensayo. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el dominio de acidos nucleicos de anclaje puede disenarse para que comprenda una region que es complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia "de union a anclaje" del acido nucleico diana. En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje comprende o consiste de una region que es complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia "de union a anclaje" dentro del acido nucleico diana. Las regiones complementarias pueden presentar cualquier longitud util para

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la invencion, incluyendo, aunque sin limitacion, por lo menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 o mas nucleotidos, por ejemplo de una longitud de entre 3 y 50, de entre 5 y 20, de entre 5 y 50 o de entre 8 y 25 nucleotidos.

En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje puede comprender regiones adicionales, por ejemplo una region para la union de marcajes detectables. En algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos de anclaje contiene unicamente una region que es complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia "de union a anclaje" del acido nucleico diana. En algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos de anclaje puede contener dos o mas regiones, cada una se une a una secuencia "de union a anclaje" diferente dentro del acido nucleico diana.

Segun la presente invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje (o primer dominio) esta disenado para controlar la hibridacion de la sonda al acido nucleico diana. En algunas realizaciones, la composicion y la longitud del dominio de acidos nucleicos de anclaje se selecciona para superior (es decir, se hibrida bajo las condiciones del metodo a pesar de potenciales apareamientos incorrectos entre el dominio de acidos nucleicos de anclaje y la seucneica "de union a anclaje" debido a polimorfismos infrecuentes dentro de la secuencia "de union a anclaje". Segun la presente invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje puede ser de cualquier longitud con la condicion de que las afinidades entre el dominio de acidos nucleicos de anclaje y la secuencia "de union a anclaje" resulte suficientemente grande para que se hibriden bajo las condiciones de reaccion. En algunas realizaciones, la longitud del dominio de acidos nucleicos de anclaje se selecciona para que exista suficiente especificidad entre la sonda y el acido nucleico diana de manera que se hibriden bajo las condiciones de reaccion. Segun la presente invencion, la hibridacion entre el dominio de acidos nucleicos de anclaje y la secuencia "de union a anclaje" por si sola (es decir, se hibride o no el dominio informador con la diana) resulta suficiente para controlar la hibridacion de la sonda con la localizacion deseada del acido nucleico diana.

En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje presenta una longitud de entre aproximadamente cinco nucleotidos y aproximadamente 200 nucleotidos. En algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos de anclaje presenta una longitud de entre 4 y 50 nucleotidos. En algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos de anclaje presenta una longitud de entre 6 y 40 nucleotidos. En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje presenta una longitud de entre 20 y 40 nucleotidos. En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje presenta una longitud de entre 8 y 25 nucleotidos. En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje presenta una longitud de aproximadamente 30 nucleotidos. En otras realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje presenta una longitud de entre 40 y 60 nucleotidos. En algunas otras realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje presenta una longitud superior a 60 nucleotidos. Preferentemente, el dominio de anclaje comprende una secuencia contigua con por lo menos 10 nucleotidos complementarios a una cadena del acido nucleico diana.

El dominio de acidos nucleicos de anclaje puede comprender nucleotidos naturales, nucleotidos no naturales o combinaciones de los mismos. Entre los acidos nucleicos ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, acido ribonucleico (ARN) convencional, acido desoxirribonucleico (ADN) y analogos qufmicos de dichas moleculas, tales como un analogo de nucleotido bloqueado ("ANB") y un acido peptido nucleico ("APN"). Diversos analogos de acidos nucleicos descritos en la presente memoria tambien pueden utilizarse para el dominio de acidos nucleicos de anclaje. En algunas realizaciones de la invencion, el nucleotido no natural incrementa la temperatura de fusion del dominio de anclaje en comparacion con un nucleotido natural correspondiente en lugar del nucleotido no natural. Se indican en la tecnica bases artificiales ejemplares que contribuyen a una Tf incrementada, incluyendo, aunque sin limitacion, por ejemplo Lebedev et al., Genetic Analysis-Biomolecular Engineering 13:15-21, 1996; Xodo et al., Nucleic Acids Res. 19:5625-5631, 1991); Froehler et al., Tetrahedron Lett. 33:5307-5310, 1992; Kutyavin et al., Biochemistry 35:11170-11176, 1996; Nguyen, et al., Nucleic Acids Res. 25:30599-65, 1997. En algunas realizaciones de la invencion, los nucleotidos no naturales son propinil-dN. En algunas realizaciones de la invencion, se sustituye la timina por propinil-dU; la citosina se sustituye por propinil-dC.

B. El dominio de acidos nucleicos informador

El dominio de acidos nucleicos informador de la presente invencion esta disenado para la deteccion de la presencia o la ausencia de una secuencia de acidos nucleicos diana en una muestra biologica. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el dominio de acidos nucleicos informador puede disenarse para que comprenda una region que es complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia "de union a informador" del acido nucleico diana. Tal como se comenta en la presente memoria, el dominio de union a anclaje de la diana y el dominio de union a informador de la diana se encuentran en la misma diana del acido nucleico diana. En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos informador comprende o consiste de una region que es complementaria o sustancialmente complementaria a una secuencia "de union a informador" dentro del acido nucleico diana. En otras realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos informador comprende regiones adicionales, por ejemplo una region para la union de marcajes detectables. En algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos informador contiene unicamente una region que es complementaria o sustancialmente complementaria a una secuencia "de union a informador" del acido nucleico diana. En algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos informador puede contener dos o mas regiones, cada una de las cuales es capaz de hibridarse con una secuencia

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"de union a informador" diferente del acido nucleico diana, por ejemplo multiples regiones de PNU dentro del acido nucleico diana.

Debido a que la secuencia del dominio informador esta disenada para ser selectiva para una secuencia especffica de union a dominio informador, generalmente la region del dominio informador es completamente complementary a la secuencia de union a informador. Alternativamente, el dominio informador, en combinacion con las condiciones de reaccion, puede disenarse de manera que el dominio informador se hibride con una diana especffica o con la diana especffica y con ligeras variantes (por ejemplo de un unico nucleotido), pero que no se una a secuencias mas ampliamente diferentes (por ejemplo deleciones o sustituciones mas grandes, reorganizaciones, desapareamientos superiores a un solo nucleotido, etc.).

El dominio de acidos nucleicos informador y el marcaje detectable pueden disenarse para detectar la presencia o la ausencia de cualquier acido nucleico diana de interes. El acido nucleico diana puede ser de cualquier origen. Por ejemplo, el acido nucleico diana es un acido nucleico vfrico o microbiano. Alternativamente, el acido nucleico diana tambien puede ser, por ejemplo, un acido nucleico animal, de mamffero, humano, fungico o vegetal. En algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos informador de la presente invencion puede disenarse para detectar la presencia o la ausencia de un polimorfismo de nucleotido unico (PNU) o una mutacion dentro del acido nucleico diana. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en algunas realizaciones, el dominio de acidos nucleicos informador comprende una region de union que es 100% complementario a un alelo del PNU o la mutacion y la sonda se utiliza bajo condiciones que permitan distinguir entre la union al alelo y otros posibles alelos del PNU o la secuencia de tipo salvaje.

De esta manera, puede disenarse el dominio de acidos nucleicos informador para que resulte altamente especffico para la secuencia "de union a informador". En algunas realizaciones, incluso un desapareamiento de bases individuales entre el dominio de acidos nucleicos informador y la secuencia "de union a informador" puede inducir un cambio de senal, de naturaleza qufmica o ffsica, suficientemente significativa para facilitar la deteccion del apareamiento (o desapareamiento). El cambio de senal puede ser un cambio conformacional de la sonda, es decir, de una helice aleatoria a un duplex formado entre el dominio de acidos nucleicos informador y el acido nucleico diana. El cambio de senal puede ser ffsica o qufmicamente detectable. Por ejemplo, la sonda puede marcarse fluorescentemente de manera que la senal de fluorescencia pueda inducirse o modificarse con un apareamiento o desapareamiento. El marcaje y la sonda puede disenarse de manera que se detecta una diferencia de fluorescencia entre la hibridacion y la no hibridacion entre el dominio de acidos nucleicos informador y la secuencia "de union a informador". En algunas realizaciones, dicha diferencia no implica un tallo-bucle en cualquiera de los dominios de la sonda (por ejemplo en ausencia de diana). Dicho cambio de senal tambien puede ser un cambio en la temperatura de fusion del duplex hibridante formado entre el dominio de acidos nucleicos informador y la secuencia "de union a informador". Puede medirse el cambio de la Tf, por ejemplo entre un duplex complementario y un duplex incorrectamente apareado formado entre el dominio de acidos nucleicos informador y la secuencia "de union a informador".

En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos informador comprende o consiste de una region que es complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia "de union a informador" dentro del acido nucleico diana. Las regiones complementarias pueden presentar cualquier longitud util para la invencion, incluyendo, aunque sin limitacion, por lo menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 o mas nucleotidos, por ejemplo de una longitud de entre 3 y 50, de entre 5 y 20, de entre 5 y 50 o de entre 8 y 25 nucleotidos.

El dominio de acidos nucleicos informador de la presente invencion puede presentar cualquier longitud adecuada. En algunas realizaciones, con el fin de maximizar la especificidad de su secuencia complementaria, el dominio de acidos nucleicos informador de la presente invencion esta disenado para ser de longitud relativamente corta. En algunas realizaciones, la longitud del dominio informador es de entre 4 y 20 nucleotidos; preferentemente, la longitud de la parte de union a diana del dominio de acidos nucleicos informador es de entre 4 y 20 nucleotidos. En algunas realizaciones, la longitud del dominio de acidos nucleicos informador es de entre 6 y 12 nucleotidos. En algunas

realizaciones, la longitud del dominio de acidos nucleicos informador es de entre 8 y 25 nucleotidos. En algunas

realizaciones, la longitud del dominio de acidos nucleicos informador es de entre 6 y 40 nucleotidos. En algunas

realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos informador presenta una longitud de por lo menos 6, 7,

8, 9, 10, 11 o 12 nucleotidos. Preferentemente, el dominio informador comprende una secuencia contigua con por lo menos 10 nucleotidos complementarios a una cadena del acido nucleico diana.

La presente invencion se beneficia de la elevada especificidad del dominio de acidos nucleicos informador para la secuencia "de union a informador". De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el dominio de acidos nucleicos informador puede comprender un nucleotido no natural para incrementar la especificidad de union del dominio de acidos nucleicos informador y por lo tanto incrementar la diferenciacion entre un apareamiento y una no correspondencia. En algunas realizaciones de la invencion, el nucleotido no natural incrementa la temperatura de fusion del dominio informador en comparacion con un nucleotido natural correspondiente en lugar del nucleotido no natural. En algunas realizaciones de la invencion, el nucleotido no natural incrementa la diferencia de Tf de un apareamiento y una no correspondencia. En algunas realizaciones de la invencion, los nucleotidos no naturales son propinil-dN. Se indican en la tecnica bases artificiales ejemplares que contribuyen a una Tf incrementada, incluyendo,

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aunque sin limitacion, por ejemplo Lebedev et al., Genetic Analysis-Biomolecular Engineering 13:15-21, 1996; Xodo et al., Nucleic Acids Res. 19:5625-5631, 1991); Froehler et al., Tetrahedron Lett. 33:5307-5310, 1992; Kutyavin et al., Biochemistry 35:11170-11176, 1996; Nguyen, et al., Nucleic Acids Res. 25:30599-65 (1997). Por ejemplo, la 2- amino-A incrementa la Tf en aproximadamente 3°C respecto a la A, la 5-metil-C incrementa la Tf en aproximadamente 1,3°C respecto a la C, la C-5-propinil-C mejora la Tf en aproximadamente 2,8°C respecto a la C y el C-5-propinil-U incrementa la Tf aproximadamente 1,7°C respecto a la T. Opcionalmente, la region informadora comprende una o mas bases estabilizadoras (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o mas) pero una o ninguna base estabilizadora (por ejemplo no naturales) en la parte de la region informadora que se hibridara con una secuencia potencialmente variable (por ejemplo un PNU o posible mutacion esperada).

El dominio de acidos nucleicos de anclaje y el dominio de acidos nucleicos informador no forman un tallo-bucle en ausencia de un acido nucleico diana. En algunas realizaciones de la invencion, el dominio de acidos nucleicos de anclaje y el dominio de acidos nucleicos informador estan disenados para que no presenten ninguna estructura secundaria particular (por ejemplo una helice aleatoria). Algunas regiones de dichos dominios pueden hibridarse entre si. Por ejemplo, una region en el dominio de acidos nucleicos de anclaje puede ser complementaria o parcialmente complementaria a una region en el dominio de acidos nucleicos informador; los dominios de anclaje e informador segun la presente invencion presentan una complementariedad inferior al 50%. Otras sondas pueden presentar una estructura de tallo-bucle en ausencia de un acido nucleico diana, formada entre regiones complementarias o parcialmente complementarias (por ejemplo regiones de por lo menos 4 nucleotidos contiguos) en el dominio de anclaje y/o el dominio informador.

Segun la invencion, ni el dominio de anclaje ni el dominio informador comprenden un tallo-bucle. De esta manera,

1. El dominio informador no incluye dos secuencias de por lo menos tres nucleotidos que son totalmente

complementarias y en las que las dos secuencias presentan por lo menos dos nucleotidos intermedios, y/o

2. El dominio de anclaje no incluye dos secuencias de por lo menos tres nucleotidos que son totalmente

complementarias y en las que las dos secuencias presentan por lo menos dos nucleotidos intermedios.

Tal como se ilustra en las figuras, el anclaje se encuentra en el extremo 3' de la sonda y el informador se encuentra en el extremo 5' de la sonda. Aunque las figuras ilustran realizaciones en las que el informador esta unido al extremo 5' del dominio de anclaje, debe apreciarse que el informador tambien puede disenarse para la union al extremo 3' del dominio de anclaje (generando el informador en el extremo 3' d ela sonda y el anclaje en el extremo 5' de la sonda).

C. El conector no nucleosido

Un "conector no nucleosido" separa el dominio de anclaje y el dominio informador. El experto en la materia reconocera que puede utilizarse cualquier conector no nucleosido. Puede utilizarse experimentos rutinarios para determinar las caracterfsticas optimas para el conector. Segun la presente invencion, el dominio de anclaje y el dominio informador estan disenados para unirse a regiones en el acido nucleico diana contiguas entre si. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el dominio de anclaje y el dominio informador pueden disenarse para encontrarse relativamente proximas entre si (por ejemplo con no mas de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleotidos intermedios al hibridarse los dominios informador y de anclaje con la diana). El conector generalmente sera suficientemente flexible para permitir la hibridacion del informador, o para no permitirla, en el caso de que el anclaje se hibride con una secuencia contigua en la diana. El conector no nucleosido funciona manteniendo el espaciado entre el dominio de anclaje y el dominio informador. Por lo tanto, el espaciado entre el dominio de anclaje y el dominio informador puede ajustarse mediante la utilizacion de un conector no nucleotido de diversas longitudes.

El conector no nucleosido puede ser, por ejemplo, alifatico, aromatico, arilo, cfclico, quiral, aquiral, un peptido, un carbohidrato, un lfpido, un acido graso, tri-, tetra-, penta-, hexa- o poli-polietilenglicol (HEG) o una fraccion heterocfclica. El polietilenglicol en particular es un hexaetilenglicol. Otros conectores no nucleosidos convencionales utilizan agentes entrecruzantes homobifuncionales y heterobifuncionales. Los reactivos homobifuncionales portan dos grupos funcionales identicos, mientras que los reactivos heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales diferentes para unir los compuestos biologicos al bioadhesivo. Una amplia mayorfa de los agentes entrecruzantes heterobifuncionales contienen un grupo reactivo con amina primaria y un grupo reactivo con tiol. Los agentes entrecruzantes covalentes se seleccionan de entre los reactivos capaces de formar puentes disulfuro (S--S), glicol (-- CH(OH)--CH(OH)--), azo (-N=N--), sulfona (--S(=O2--), ester (--C(=O)--O--), o amida (--C(=O)--N--).

La sonda utilizada segun la presente invencion esta disenada para presentar diferentes combinaciones del dominio de acidos nucleicos de anclaje, el dominio de acidos nucleicos informador y el conector no nucleosido. En algunas realizaciones, el conector puede unirse al extremo del dominio de acidos nucleicos de anclaje o del dominio de acidos nucleicos informador, por ejemplo en posicion 3' o 5' del dominio de acidos nucleicos de anclaje o el dominio de acidos nucleicos informador. Alternativamente, el conector puede unirse a otras posiciones internas de uno o ambos dominios de acidos nucleicos de la sonda, con la condicion de que el enlace o la union no interfiera con las funciones de la sonda, por ejemplo la hibridacion de la sonda con el acido nucleico diana deseado. Por ejemplo, el conector puede unirse al dominio informador a, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o mas nucleotidos del extremo 3' o 5' del

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dominio informador. De manera similar, el conector puede unirse al dominio de anclaje a, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o mas nucleotidos del extremo 3' o 5' del dominio de anclaje. El dominio de acidos nucleicos de anclaje o el dominio de acidos nucleicos informador pueden unirse en diversas posiciones del conector no nucleosido. En algunas realizaciones, dichos dominios de acidos nucleicos se unen al extremo del conector. Opcionalmente pueden unirse a diferentes posiciones del conector.

III. Marcajes

En algunas realizaciones, el dominio de anclaje, el dominio informador o el conector no nucleotido se marcan detectablemente y, de esta manera, resultan de uso adicional en la deteccion de la secuencia diana. Tal como se ha indicado anteriormente, segun la invencion, el marcaje se une a la sonda de manera que resulta detectable la hibridacion del dominio informador (no del dominio de anclaje). De esta manera, segun la invencion, el dominio de anclaje no se une a un marcaje mientras que el dominio informador generalmente se une a uno o mas marcajes. Ademas, el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras. En algunas realizaciones, la sonda detectablemente marcada se utiliza para detectar y cuantificar la secuencia diana en una reaccion de amplificacion, por ejemplo ene una reaccion de amplificacion en tiempo real.

Se conoce una amplia diversidad de marcajes detectables. Entre los marcajes ejemplares se incluyen marcajes fluorescentes (incluyendo, por ejemplo inhibidores o absorbedores), marcajes no fluorescentes, marcajes colorimetricos, marcajes quimioluminiscentes, marcajes bioluminiscentes, marcajes radioactivos, grupos modificadores de masa, anticuerpos, antfgenos, biotina, haptenos, enzimas (incluyendo peroxidasa, fosfatasa, etc.) y similares. Los marcajes pueden proporcionar senales detectables mediante fluorescencia, radioactividad, colorimetrfa, gravimetrfa, difraccion o absorcion de rayos X, magnetismo, actividad enzimatica y similares. Pueden utilizarse marcajes para proporcionar una senal detectable (y opcionalmente cuantificable) y que puede unirse a un acido nucleico o protefna.

En determinadas realizaciones de la invencion, un marcaje es un pigmento fluorescente o fluoroforo. Tfpicamente, un fluoroforo particular puede emitir luz de una longitud de onda particular tras absorber luz de longitud de onda mas corta. La longitud de onda de la luz emitida por un fluoroforo particular es caracterfstica de dicho fluoroforo. De esta manera, puede detectarse un fluoroforo particular mediante la deteccion de luz de una longitud de onda apropiada tras la excitacion del fluoroforo con luz de longitud de onda mas corta. Entre los marcajes fluorescentes pueden incluirse pigmentos con carga negativa, tales como pigmentos de la familia de la fluorescefna, o pigmentos de carga neutra, tales como pigmentos de la familia de la carboxirrodamina, o pigmentos con carga positiva, tales como los pigmentos de la familia de la cianina o de la familia de la rodamina. Entre otras familias de pigmentos que pueden utilizarse en la invencion se incluyen, por ejemplo, pigmentos de la familia de la polihalofluorescefna, pigmentos de la familia de la hexaclorofluorescefna, pigmentos de la familia de la coumarina, pigmentos de familia de la oxazina, pigmentos de la familia de la tiazina, pigmentos de la familia de la escuarafna, pigmentos de la familia de lantanidos quelados, pigmentos ALEXA FLUOR® y pigmentos de la familia BODIPY®. Entre los pigmentos de la familia de la fluorescefna se incluyen, por ejemplo, FAm, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Entre los pigmentos de la familia de la carboxirrodamina se incluyen rojo Texas, ROX, R110, R6G y TAMRA. FAM, HEX, TeT, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G y TAMRA son comercializados por Perkin-Elmer (Foster City, Calif.) mientras que el rojo Texas es comercializado por Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg.). Entre los pigmentos de la familia de la cianina se incluyen Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7 son comercializados por Amersham GE Healthcare (Piscataway, N.J.). Entre los inhibidores no fluorescentes se incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), comercializados por Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Cal.), Iowa Black™, comercializados por Integrated DNA Tech., Inc. (Coralville, Iowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), comercializados por Berry & Assoc. (Dexter, Mich.).

Pueden utilizarse en la presente invencion diversas realizaciones de sistemas de senalizacion utilizando un marcaje. Puede unirse un marcaje (por ejemplo un fluoroforo, un inhibidor, un pigmento intercalante, una fluorescefna) al dominio de anclaje, el dominio informador o el conector no nucleosido. Puede utilizarse cualquier conformacion de uno o mas marcajes, con la condicion de que resulte posible detectar una diferencia de senal dependiendo de la hibridacion del informador con la secuencia diana ligante del informador. Entre los ejemplos de los sistemas de senalizacion de la presente invencion se incluyen, aunque sin limitacion, las realizaciones siguientes.

Realizacion 1

En algunas realizaciones, el dominio informador o el dominio de anclaje se une a un pigmento intercalante que es capaz de ser incorporado entre las bases de una molecula de acidos nucleicos de doble cadena y que produce una senal al intercalado. Entre los fluoroforos adecuados se incluyen, aunque sin limitacion, los pigmentos de cianina (por ejemplo los desarrollados por Molecular Probes) (ver, por ejemplo, Eriksson et al., Nucleic Acids Research 31(21):6235-6242, 2003), bromuro de etidio, Picogreen, verde SYbR, acridina y otros.

En el caso de que el dominio informador se hibride con la secuencia diana de acidos nucleicos (correspondiente), el dominio informador y la secuencia diana forman un duplex y el pigmento unido pueden intercalarse dentro del duplex, generando de esta manera una senal detectable. Por ejemplo, en el caso de que el dominio informador sea 100% complementario a un alelo del PNU o una mutacion en una secuencia de acidos nucleicos humana, bajo

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condiciones adecuadas, el dominio informador se hibrida con el acido nucleico diana y el pigmento intercalante unido al informador presenta una fluorescencia modificada o incrementada al resultar intercalado. En el caso de que el dominio informador no sea 100% complementario respecto al acido nucleico diana, no se forma un duplex, y el pigmento presenta un nivel de fluorescencia diferente (por ejemplo inferior).

Segun la presente invencion, en el caso de que se utilice un pigmento intercalante, la sonda se disena de manera que se minimice cualquier pliegue interno dentro de la sonda. Lo anterior sirve para garantizar la ausencia de un duplex formado entre el dominio de anclaje y el dominio informador y para ayudar a reducir cualquier ruido de fondo.

Realizacion 2

En algunas realizaciones, la sonda se une con un pigmento fluorescente y un pigmento inhibidor, en el que un pigmento se une al dominio informador y un pigmento se une al dominio de anclaje. En el caso de que el dominio informador no se hibride con la secuencia diana de acidos nucleicos (por ejemplo una no correspondencia), la sonda asume una conformacion en la que el pigmento fluorescente y el pigmento inhibidor se situan en estrecha proximidad, permitiendo que el inhibidor inhiba la senal procedente del pigmento fluorescente. En el caso de que el dominio informador se hibride con la secuencia "de union a informador" (por ejemplo una correspondencia totalmente complementaria entre el dominio informador y la diana), el pigmento fluorescente se separa del inhibidor, permitiendo que la sonda emita fluorescencia. La inhibicion de la fluorescencia puede conseguirse, aunque no necesariamente, con una estructura de tallo-bucle formada entre el dominio de anclaje y el dominio informador. Sin embargo, la inhibicion puede conseguirse sin una estructura de tallo-bucle. Por ejemplo, la inhibicion puede conseguirse al aproximar al azar el arrollado aleatorio de la sonda la pareja de pigmento fluorescente-pigmento inhibidor. Entre los ejemplos de un pigmento fluorescente se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, FAM, TAMRA, TET y ROX. Entre los ejemplos de un pigmento inhibidor se incluyen, aunque sin limitacion, DABCYL. Segun la presente invencion, el inhibidor puede ser un inhibidor fluorescente o un inhibidor no fluorescente. Entre los ejemplos de un inhibidor no fluorescente se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, BHQ, Blackberry Quencher y negro Iowa.

Tal como se muestra en la figura 2, en algunas realizaciones, se une un pigmento fluorescente al extremo 5' del dominio informador y se une un pigmento inhibidor al extremo 5' del dominio de anclaje. En algunas realizaciones, se une un pigmento fluorescente al extremo 3' del dominio informador y se une un pigmento inhibidor al extremo 3' del dominio de anclaje. En una alternativa en la que el dominio de anclaje se encuentra en el extremo 5' de la sonda y el dominio informador se encuentra en el extremo 3' de la sonda, el pigmento fluorescente se encuentra en el extremo 3' del dominio informador y el inhibidor se encuentra en el extremo 3' del dominio de anclaje, o el pigmento fluorescente se encuentra en el extremo 5' del dominio informador y el inhibidor se encuentra en el extremo 5' del dominio de anclaje. En el caso de que el informador no se hibride con la secuencia "de union a informador", el pigmento fluorescente queda proximo al pigmento inhibidor y la fluorescencia resulta inhibida. En el caso de que el informador se hibride con la secuencia "de union a informador", el pigmento fluorescente es alejado del espacio proximo al pigmento inhibidor y, por lo tanto, la fluorescencia ya resulta inhibida.

En algunas realizaciones de la invencion, el dominio informador en todos los casos se marca con un pigmento, sea el pigmento fluorescente o el pigmento inhibidor. El otro pigmento de la pareja inhibidora de fluorescencia puede unirse al dominio de anclaje o al conector no nucleosido.

Los pigmentos de dicha realizacion tambien pueden ser una pareja de transferencia de energfa (por ejemplo "FRET") u otra pareja en la que la senal cambia como funcion de la proximidad. En el caso de que se utilice una pareja de pigmentos de transferencia de energfa, ambos pigmentos son fluorescentes, el primero es un fluoroforo donante y el segundo es un fluoroforo aceptor. En el caso de que el donante y el aceptor se lleven a encontrarse en estrecha proximidad, se produce una transferencia de energfa entre el donante y el aceptor, que emite una senal de una longitud de onda diferente. Puede detectarse la reduccion de fluorescencia del donante o el incremento de fluorescencia del aceptor.

Realizacion 3

En algunas realizaciones, el dominio informador de la sonda se marca con un pigmento fluorescente y un pigmento inhibidor. En algunas de dichas realizaciones, el pigmento fluorescente y el pigmento inhibidor estan disenados para encontrarse en estrecha proximidad. Al irradiarlos, el pigmento fluorescente excitado transfiere energfa a la molecula de pigmento inhibidor proxima en lugar de emitir fluorescencia. La estrecha proximidad respecto a la pareja de pigmento fluorescente-inhibidor evita la emision de ninguna fluorescencia mientras se encuentre intacta la sonda.

La sonda esta disenada para hibridarse con un acido nucleico diana. En el caso de que la polimerasa replique un molde al que se encuentra unido la sonda, la actividad de exonucleasa 5'-3' de la misma corta el extremo 5' de la sonda que contiene un pigmento fluorescente o un pigmento inhibidor. Lo anterior separada el pigmento fluorescente dele pigmento inhibidor, es decir, el fragmento de acidos nucleicos portador del pigmento fluorescente resulta liberado a la solucion y ya no se encuentra en estrecha proximidad al pigmento inhibidor. Ello anula la actividad del inhibidor de manera que el pigmento fluorescente empieza a emitir fluorescencia.

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En el caso de que exista un desapareamiento, el dominio informador de la sonda no se hibrida con la secuencia "de union a informador" de los acidos nucleicos diana. En este caso, la actividad de exonucleasa 5'-3' de la polimerasa no corta el extremo 5' de la sonda. En consecuencia, la sonda permanece intacta, el pigmento fluorescente permanece en estrecha proximidad al pigmento inhibidor.

En la figura 3, se encuentra presente un pigmento fluorescente al extremo 5' del dominio informador y se une un pigmento inhibidor al extremo 3' del dominio informador. Un experto en la materia reconocera que el pigmento inhibidor puede unirse a cualquier localizacion conveniente de la sonda, tal como al conector no nucleosido, o al dominio de anclaje, con la condicion de que se mantenga el pigmento inhibidor en estrecha proximidad al pigmento fluorescente antes de la hibridacion con la diana.

En algunas realizaciones, el pigmento inhibidor no necesita unirse covalentemente a la sonda. En algunos casos, el dominio informador se une a un informador fluorescente y se utiliza en una mezcla que comprende un inhibidor soluble (no unido a la sonda). El informador genera una senal en el caso de que el dominio informador no se encuentre unido a la diana. Al unirse el informador a una diana, el inhibidor intercalante se aproxima al informador y se reduce la senal. Por lo tanto, la reduccion de la senal es un indicador de union. Dicho aspecto se ilustra en, por ejemplo, la figura 4. Entre los inhibidores solubles ejemplares se incluyen, por ejemplo nuevo azul de metileno.

IV. Metodos

La presente invencion se refiere a metodos de detectar secuencias diana de acidos nucleicos en una muestra biologica utilizando las sondas tal como se indican en las reivindicaciones. Los metodos de la invencion pueden utilizarse para detectar una secuencia diana de acidos nucleicos de diversas fuentes, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, una muestra de sangre, una muestra de heces, una muestra de orina, una muestra de tejido o una biopsia. Los acidos nucleicos diana pueden ser un acido nucleico humano, un acido nucleico de mamffero, un acido nucleico vegetal, un acido nucleico animal, un acido nucleico vfrico, un acido nucleico bacteriano u otros acidos nucleicos microbianos.

Los metodos de la presente invencion resultan utiles para detectar la presencia o la ausencia de una secuencia diana de acidos nucleicos exacta. La secuencia diana de acidos nucleicos puede ser, por ejemplo, un sitio de una potencial insercion, una delecion o una sustitucion de nucleotido. El acido nucleico diana puede ser el resultado de una delecion de genoma o una reorganizacion genica rara. Entre los ejemplos de una secuencia diana de acidos nucleicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, una secuencia diana de acidos nucleicos que comprende un polimorfismo de nucleotido unico (PNU) o una mutacion somatica rara en un organismo, o una secuencia de acidos ribonucleicos. En algunas realizaciones de la invencion, los metodos de la invencion se refieren a la deteccion de un acido nucleico humano que comprende una PNU o una mutacion, utilizando una sonda que comprende un dominio informador que es 100% complementario a un alelo de la PNU o la mutacion. En algunas otras realizaciones, los metodos de la invencion resultan utiles para realizar el seguimiento de la presencia o la ausencia de variantes vfricas o bacterianas particulares en un animal (incluyendo, aunque sin limitacion, un ser humano) o en el medio. Entre los ejemplos de dichos agentes infecciosos se incluyen, aunque sin limitacion, el virus de la inmunodeficiencia humana (VlH), virus de la hepatitis C (VHC) y virus del papiloma humano (VPH).

Los metodos de la invencion pueden utilizarse en diversas tecnicas de deteccion de secuencias. Por ejemplo, los metodos de la invencion pueden utilizarse en metodos de deteccion de producto de PCR de punto final, tal como el genotipado. En algunas realizaciones, los metodos de la invencion se utilizan en tecnicas de PCR en tiempo real. Ademas, los metodos y sondas de la invencion pueden utilizarse en el analisis de hibridacion, por ejemplo el analisis de disociacion, mediante la medicion de la curva de fusion o de hibridacion. En algunas realizaciones de la invencion, la deteccion del acido nucleico diana comprende medir la alteracion de la fluorescencia generada por las sondas de la invencion. En algunas realizaciones, se utiliza PCR asimetrica (en la que un cebador se encuentra en exceso respecto a un segundo cebador) para generar la cadena molde apropiada que es complementaria a la sonda de la invencion.

En algunas realizaciones de la invencion, la deteccion del acido nucleico diana comprende medir la temperatura de fusion de un complejo formado entre el dominio informador y la secuencia "de union a informador". La temperatura de fusion del dominio informador del dominio informador con una diana dependera del grado de complementariedad del dominio informador con su diana. En el caso de que la diana sea totalmente complementaria, la temperatura de fusion sera mas alta que si existe uno o mas desapareamientos entre el informador y la diana. En los casos en que se conozcan las alternativas de diana mas probables (por ejemplo en los que pueden encontrarse presentes dos alelos diferentes de un PNU en la diana), puede disenarse la secuencia del informador para optimizar la diferencia de temperatura de fusion entre las diferentes opciones. Por ejemplo, el dominio informador puede incluir una o mas bases estabilizadoras de manera que la diferencia de temperatura de fusion entre dominio informador y posibles (por ejemplo probables) secuencias diana se acentue. En algunos ejemplos, la diferencia de Tf del dominio informador puede ser de aproximadamente por lo menos 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C o 8°C. En algunas realizaciones de la invencion, la diferencia de Tf del dominio informador es de aproximadamente 10°C o superior.

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Para conseguir una mayor diferenciacion de correspondencia y no correspondencia, la diferencia de Tf del dominio informador entre correspondencia y no correspondencia puede incrementarse adicionalmente mediante la sustitucion de nucleotidos complementarios naturales por nucleotidos complementarios no naturales. En algunas realizaciones de la invencion, el numero y tipos de sustituciones de nucleotido no natural se seleccionan para conseguir no solo una mayor diferenciacion entre correspondencia y no correspondencia, sino tambien una mayor diferenciacion entre diferentes tipos de no correspondencia. Por ejemplo, pueden utilizarse metodos de utilizacion de un dominio informador que comprende nucleotidos no naturales para diferenciar entre no correspondencias en diferentes posiciones. En algunas realizaciones de la invencion, el dominio informador presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas nucleotidos complementarios no naturales.

V. Mezclas de reaccion

La presente invencion se refiere ademas a mezclas de reaccion incluidas en los metodos de la invencion. Una mezcla de reaccion ejemplar comprende, por ejemplo, un acido nucleico de una muestra biologica (por ejemplo una secuencia diana de acidos nucleicos que comprende una region de union de anclaje y una region de union a informador) y una sonda marcada detectablemente tal como se indica en las reivindicaciones. Para detectar la presencia o la ausencia del acido nucleico diana, particularmente la presencia o la ausencia de la region de union a informador, la sonda se disena de manera que el dominio informador comprenda una secuencia complementaria a la region de union a informador, y el dominio de anclaje comprende una secuencia complementaria a la region de union a anclaje. Ninguno de los dominios de la sonda forma un tallo-bucle en ausencia de un acido nucleico diana y la sonda no es extensible por una ADN polimerasa.

En algunas realizaciones, la mezcla de reaccion utilizada segun la presente invencion puede ser una mezcla de reaccion para la amplificacion del acido nucleico diana. De acuerdo con lo anterior, la mezcla de reaccion comprende por lo menos uno o mas de entre acido nucleico diana, nucleosidos trifosfato (por ejemplo dATP, dTTP, dCTP, dGTP), una ADN polimerasa y/o un cebador oligonucleotido.

VI. Kjts

La presente invencion se refiere ademas a kits para la utilizacion en los metodos de la invencion. Los kits de la invencion pueden incluir una o mas de las sondas de dos dominios de la invencion tal como se indica en las reivindicaciones, opcionalmente en combinacion (en el mismo recipiente o en un recipiente adicional) con otro u otros reactivos tal como se indica en la presente memoria. En algunas realizaciones, el kit se encuentra compartimentalizado para facilitar el uso y contiene por lo menos un recipiente que proporciona una sonda de la presente invencion tal como se indica en la presente memoria. Tambien puede incluirse uno o mas recipientes adicionales que proporcionan uno o mas reactivos adicionales. Dichos recipientes adicionales pueden incluir cualesquiera reactivos u otros elementos reconocidos por el experto en la materia para la utilizacion en procedimientos de extension de cebador de acuerdo con los metodos indicados anteriormente, incluyendo reactivos para la utilizacion en, por ejemplo, procedimientos de amplificacion de acidos nucleicos (por ejemplo PCR y RT- PCR), procedimientos de secuenciacion del ADN o procedimientos de marcaje del ADN. El kit puede comprender, por ejemplo, un polinucleotido que comprende una secuencia diana. En algunas realizaciones, el kit incluye ademas un recipiente que proporciona un cebador de sentido 5' hibridable, bajo condiciones de extension de cebador, a la secuencia diana y/o una pareja de cebadores que comprende, por ejemplo, un cebador de sentido 5' y un cebador antisentido 3' correspondiente. En algunas realizaciones, el kit incluye ademas un recipiente que proporciona un inhibidor intercalante soluble. En otras variaciones no mutuamente excluyentes, el kit incluye uno o mas recipientes que proporcionan nucleotidos libres (convencionales y/o no convencionales). En realizaciones especfficas, el kit incluye dNTP alfa-fosforotioato, dUTP, dITP y/o dNTP marcados tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de los pigmentos de la familia de la fluorescefna o de la cianina. En todavfa otras realizaciones no mutuamente excluyentes, el kit incluye uno o mas recipientes que proporcionan un tampon adecuado para una reaccion de extension de cebador.

Los ejemplos, referencias y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprension de la presente invencion, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas.

VII. Ejemplos

Se diseno un experimento para someter a ensayo varios nuevos constructos de sonda denominados sondas "Cobra". Las sondas Cobra presenta una secuencia 5' (informadora) y una secuencia 3' (de anclaje) unidas entre si mediante un conector hexaetilenglicol (HEG). Las sondas Cobra se disenaron para hibridarse a una secuencia de molde en la que el extremo 5' (informador) de la sonda Cobra es sustancialmente complementario a una secuencia diana en el molde. La secuencia diana puede variar potencialmente, dependiendo del molde que se encuentre presente. El area de variabilidad potencial se denomina "region variable". Dicho aspecto se comenta en mayor detalle posteriormente.

La secuencia 3' (de anclaje) de la sonda Cobra esta disenada para ser complementaria a una secuencia del molde

17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

situada en el lado 5' (en el molde) respecto a la secuencia diana. Segun el diseno, la secuencia del anclaje de la sonda Cobra es totalmente complementaria a cualquiera de los moldes utilizados en el experimento.

Cada sonda Cobra esta marcada en el extremo de su informador (en el presente caso, 5') con fluorescefna. El inhibidor esta representado por nuevo azul de metileno, un inhibidor soluble anadido a la mezcla de reaccion.

Se generaron diversas versiones de la sonda Cobra con o sin bases estabilizadoras, de la manera siguiente:

5NS-CBRA-USRV no contenfa bases estabilizadoras en la region informadora de 9 bases;

6ST-CBRA-USRV contenfa 7 bases estabilizadoras en la region informadora de 9 bases y

7ST-CBRA-USRV contenfa 7 bases estabilizadoras en la region informadora de 9 bases pero ninguna base estabilizadora en el centro de la region informadora correspondiente a la region variable en el molde.

Se utilizo una PCR asimetrica para amplificar el ADN molde a partir de uno de entre varios moldes, de la manera siguiente:

pK61WT - que presenta el molde para generar un amplicon mostrado en la figura 5 (segunda lfnea), incluyendo AAC subrayado, con una secuencia correspondiente (complementaria) al dominio informador de la sonda.

pK61C3 - que presenta molde para generar un amplicon mostrado en la figura 5 pero en el que las bases subrayadas son cAC, secuencia desapareada con el dominio informador de la sonda.

pK61T3 - que presenta molde para generar un amplicon mostrado en la figura 5 pero en el que las bases subrayadas son tAC, secuencia desapareada con el dominio informador de la sonda.

pK61G2 - que presenta molde para generar un amplicon mostrado en la figura 5 pero en el que las bases subrayadas son AgC, secuencia desapareada con el dominio informador de la sonda.

pK61T1 - que presenta molde para generar un amplicon mostrado en la figura 5 pero en el que las bases subrayadas son AAt, secuencia desapareada con el dominio informador de la sonda.

pK61A1 - que presenta molde para generar un amplicon mostrado en la figura 5 pero en el que las bases subrayadas son AAa, secuencia desapareada con el dominio informador de la sonda.

Las reacciones de amplificacion se llevaron a cabo en presencia de 21 pM de nuevo azul de metileno y las sondas Cobra. Las temperaturas de fusion de los hfbridos de informador/amplicon resultantes se determinaron utilizando el cambio de fluorescencia (el nuevo azul de metileno inhibe la fluorescefna de la sonda Cobra pero solo en el caso de que la parte sonda de la sonda Cobra se encuentre hibridada con el molde). Se muestran los resultados en las tablas, a continuacion.

Tabla Datos de Tf para las 3 sondas COBRA vs. amplicones de tipo salvaje y mutantes en el analisis de curvas de fusion post-PCR ________________________________________________________________________

Tf promedio

pKWT pK61C3 pK61T3 pK61G2 pK61G1 pK61T1 pK61A1 Blanco

5NS-CBRA- USRV*

46,7 47,7 50,7 49,7 48,7 49,1 48,5 48,8

5NS-CBRA- USRV§

61,5 47,7 50,7 49,7 48,7 49,1 48,5 48,8

6ST-CBRA- USRV

69,0 66,1 66,3 66,7 66,1 66,3 66,3 59,7

7ST-CBRA- USRV

68,1 65,9 65,9 66,3 60,7 60,8 60,7 58,0

*5NS-CBRA-USRV presenta dos picos, el pico mas bajo (primero) fue el utilizado para estos calculos § El segundo pico, mas alto, se utilizo para estos calculos

Tf Desv. est.

pKWT pK61C3 pK61T3 pK61G2 pK61G1 pK61T1 pK61A1 Blanco

5NS-CBRA-USRV*

0,2 0,7 0,2 1,0 0,0 0,0 0,2 0,2

6ST-CBRA-USRV

0,2 0,2 0,0 0,0 0,2 0,0 0,0 0,5

7ST-CBRA-USRV

0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 0,5

Diferencia de Tf mutante vs tipo salvaje

pKWT pK61C3 pK61T3 pK61G2 pK61G1 pK61T1 pK61A1 Blanco

5NS-CBRA-USRV*

- 1,0 4,0 3,0 2,0 2,4 1,9 2,1

5NS-CBRA-USRV§

- -13,5 -10,8 -11,8 -12,8 -12,4 -13,0 -12,7

6ST-CBRA-USRV

- -2,9 -2,7 -2,3 -2,9 -2,7 -2,7 -9,3

7ST-CBRA-USRV

- -2,3 -2,3 -1,9 -7,4 -7,3 -7,4 -10,2

*SNS-CBRA-USRV presenta dos picos, el mas bajo (primero) se utilizo para estos calculos §el segundo pico, mas alto, se utilizo para estos calculos

Para el presente experimento los mejores resultados obtenidos fueron los de la sonda Cobra (7ST), que comprende bases estabilizadoras en la region informadora, pero ninguna base estabilizadora que se hibride con la region potencialmente variable de la secuencia diana. Dicha sonda permitio distinguir el "tipo salvaje" de los mutantes y 5 tambien permitio distinguir entre los mutantes.

La sonda 6ST (que presenta 7 bases estabilizadoras en la region informadora, incluyendo bases estabilizadoras en la region variable) fue capaz de distinguir entre "tipo salvaje" y "mutante", pero no pudo distinguir entre mutantes.

10 La sonda 5NS (sin bases estabilizadoras) no pudo distinguir entre tipo salvaje y mutante en el presente experimento.

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Metodo de deteccion de la presencia o de la ausencia de una secuencia diana de acidos nucleicos diana en una muestra biologica, comprendiendo el metodo:

   a. poner en contacto una sonda marcada detectablemente que comprende un dominio de acidos nucleicos de anclaje y un dominio de acidos nucleicos informador con la muestra, y

   b. detectar la presencia o la ausencia de union de la sonda al acido nucleico diana,

   en el que los dominios de anclaje e informador presentan una complementariedad inferior a 50% y estan unidos mediante un conector no nucleosido y ni el dominio de anclaje ni el dominio informador forman una estructura de tallo-bucle en ausencia del acido nucleico diana,y en el que

   (i) la sonda no es extensible por una polimerasa,

   (ii) el conector esta unido al dominio de anclaje a 2 o menos nucleotidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector esta unido al dominio informador a 2 o menos nucleotidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no esta unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras, de manera que la diferencia en la temperatura de fusion entre el dominio informador y las posibles secuencias diana se acentua,

   (iii) el dominio de anclaje y el dominio informado comprenden, cada uno, una secuencia contigua de por lo menos 6 nucleotidos complementarios a la misma cadena del acido nucleico diana, y

   (iv) en el que la hibridacion entre el dominio de anclaje y el acido nucleico diana por si mismo resulta suficiente para regular la hibridacion de la sonda en la localizacion deseada del acido nucleico diana.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de deteccion comprende medir la temperatura de fusion de un complejo formado entre el dominio informador y el acido nucleico diana.
3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el marcaje es un marcaje fluorescente y que comprende

   ademas poner en contacto la sonda y la muestra con un inhibidor intercalante soluble de manera que el inhibidor

   altera la fluorescencia del marcaje al formar el dominio informador un complejo con el acido nucleico diana.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el acido nucleico diana es un acido nucleico humano que comprende un polimorfismo de nucleotido unico (PNU) y el dominio informador es complementario 100% respecto a un alelo del PNU.
5. 5. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la sonda comprende por lo menos un nucleotido no natural, en el que el nucleotido no natural incrementa la temperatura de fusion del dominio informador en comparacion con un nucleotido natural correspondiente en el lugar del nucleotido no natural.
6. 6. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el conector es polietilenglicol.
7. 7. Mezcla de reaccion para la deteccion de la presencia o de la ausencia de una secuencia diana, que

   comprende:

   a. un acido nucleico diana que comprende una region de union a anclaje y una region de union a informador, y

   b. una sonda marcada detectablemente que comprende un dominio de acidos nucleicos de anclaje y un dominio de acidos nucleicos informador,

   en el que los dominios de anclaje e informador presentan una complementariedad inferior a 50% y estan unidos mediante un conector no nucleosido y ni el dominio de anclaje ni el dominio informador forman una estructura de tallo-bucle en ausencia del acido nucleico diana,y en el que:

   (i) la sonda no es extensible por una polimerasa,

   (ii) el conector esta unido al dominio de anclaje a 2 o menos nucleotidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector esta unido al dominio informador a 2 o menos nucleotidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no esta unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras, de manera que la diferencia en la temperatura de fusion entre el dominio informador y las posibles secuencias diana se acentua,

   (iii) el dominio de anclaje y el dominio informado comprenden, cada uno, una secuencia contigua de por lo menos 6 nucleotidos complementarios a la misma cadena del acido nucleico diana, y

   (iv) en el que la hibridacion entre el dominio de anclaje y el acido nucleico diana por si mismo resulta suficiente para regular la hibridacion de la sonda en la localizacion deseada del acido nucleico diana.
8. 8. Mezcla de reaccion segun la reivindicacion 7, en la que el marcaje es un marcaje fluorescente y que comprende ademas un inhibidor intercalante soluble, en el que el inhibidor altera la fluorescencia del marcaje al

   20

   5

   10

   15

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   40

   formar el dominio informador un complejo con el acido nucleico diana.
9. 9. Mezcla de reaccion segun la reivindicacion 7, en el que el acido nucleico diana es un acido nucleico humano que comprende un polimorfismo de nucleotido unico (PNU) y el dominio informador es complementario 100% respecto a un alelo del PNU.
10. 10. Mezcla de reaccion segun la reivindicacion 9, en la que el conector es polietilenglicol.
11. 11. Kit para la deteccion de la presencia o de la ausencia de una secuencia diana, comprendiendo el kit:

    a. una sonda marcada detectablemente que comprende un dominio de acidos nucleicos de anclaje y un dominio de acidos nucleicos informador, en la que:

    los dominios de anclaje e informador presentan una complementariedad inferior al 50% y estan unidos mediante un conector no nucleosido,

    ni el dominio de anclaje ni el dominio informador forman una estructura de tallo-bucle en ausencia del acido nucleico diana, y en la que:

    (i) la sonda no es extensible por una polimerasa,

    (ii) el conector esta unido al dominio de anclaje a 2 o menos nucleotidos del extremo 3' del dominio de anclaje y el conector esta unido al dominio informador a 2 o menos nucleotidos del extremo 5' del dominio informador, en el que el dominio de anclaje no esta unido a un marcaje detectable y el dominio informador comprende una o mas bases estabilizadoras, de manera que la diferencia en la temperatura de fusion entre el dominio informador y las posibles secuencias diana se acentua,

    (iii) el dominio de anclaje y el dominio informado comprenden, cada uno, una secuencia contigua de por lo menos 6 nucleotidos complementarios a la misma cadena del acido nucleico diana, y

    (iv) en el que la hibridacion entre el dominio de anclaje y el acido nucleico diana por si mismo resulta suficiente para regular la hibridacion de la sonda en la localizacion deseada del acido nucleico diana, y

    b. uno o mas reactivos seleccionados de entre el grupo que consiste de una sal, un tampon, un inhibidor de nucleasa, nucleosidos trifosfato, una ADN polimerasa y/o un cebador oligonucleotido.
12. 12. Kit segun la reivindicacion 11, en el que el kit comprende ademas un inhibidor intercalante soluble de manera que el inhibidor altera la fluorescencia procedente del marcaje al formar el dominio informador un complejo con el acido nucleico diana.
13. 13. Kit segun la reivindicacion 11, en el que la sonda comprende por lo menos un nucleotido no natural, en el que el nucleotido no natural incrementa la temperatura de fusion del dominio informador en comparacion con un nucleotido natural correspondiente en el lugar del nucleotido no natural.