CN107254540A - 检测核酸差异的探针形式 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测核酸差异的探针形式。本发明尤其提供了用于检测靶核酸序列的存在或不存在的新探针、方法、反应混合物和试剂盒。

Description

检测核酸差异的探针形式
本申请是申请日为2010年8月13日的中国专利申请201080036004.5“检测核酸差异的探针形式”的分案申请。
技术领域
本申请涉及核酸检测领域。
背景技术
单核苷酸多态性（SNP）是在基因组DNA序列的特定位置上的单个碱基对突变。SNPs负责2个个体之间的大多数DNA变异。SNPs可以使个体倾向于发展发展特定疾病或差异地响应药物。因此，SNPs的检测可以用于监控遗传状况。
基因变异和突变也在病原体例如病毒和细菌中发生。基因变异和突变的检测可以用于区分病原体，并且在某些情况下，可以帮助预测预后和治疗过程。单碱基突变也在体细胞中例如在癌症发展和进展过程中发生。检测这些突变有助于预测对治疗的应答。
发明内容
本发明提供了检测生物学样品中靶核酸序列的存在或不存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括：
a. 使包含锚定物（anchor）核酸结构域和报道物（reporter）核酸结构域的可检测标记的探针与样品接触；和
b. 检测探针与靶核酸的结合的存在或不存在，
其中锚定物结构域和报道物结构域通过非核苷接头连接，并且锚定物结构域和报道物结构域在不存在靶核酸的情况下都不形成茎环；
和其中
（i）探针是不可通过聚合酶延伸的；
（ii）接头在锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与锚定物结构域连接，并且接头在报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与报道物结构域连接，其中锚定物结构域不与可检测标记连接；和/或
（iii）锚定物结构域和报道物结构域各自包含与靶核酸的相同链互补的至少6个核苷酸的邻接序列。
在某些实施方案中，探针是不可通过聚合酶延伸的。
在某些实施方案中，接头在锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与锚定物结构域连接，并且接头在报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与报道物结构域连接，其中锚定物结构域不与可检测标记连接。
在某些实施方案中，锚定物结构域和报道物结构域各自包含与靶核酸的相同链互补的至少10个核苷酸的邻接序列。
在某些实施方案中，检测步骤包含测量在报道物结构域和靶核酸之间形成的复合物的解链温度。
在某些实施方案中，报道物结构域的长度是4 – 20个核苷酸。在某些实施方案中，报道物结构域的长度是6 – 12个核苷酸。
在某些实施方案中，锚定区是6 – 40个核苷酸。
在某些实施方案中，标记是荧光标记。在某些实施方案中，该方法进一步包括使探针和样品与可溶性嵌入猝灭剂接触，从而使得当报道物结构域与靶核酸形成复合物时，猝灭剂改变来自标记的荧光。
在某些实施方案中，靶核酸是病毒或微生物核酸。在某些实施方案中，靶核酸是人核酸。在某些实施方案中，人核酸包含单核苷酸多态性（SNP）或突变，并且报道物结构域与SNP或突变的一个等位基因100％互补。
在某些实施方案中，探针包含至少一个非天然核苷酸，其中与代替非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，非天然核苷酸增加报道物结构域的解链温度。
在某些实施方案中，接头是聚乙二醇。在某些实施方案中，接头是六甘醇(hexa-ethylene glycol)。
本发明还提供了用于检测靶序列的存在或不存在的反应混合物。在某些实施方案中，反应混合物包含：
a. 包含锚定物结合区和报道物结合区的靶核酸，和
b. 包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针，
其中锚定物结构域和报道物结构域通过非核苷接头连接，并且锚定物结构域和报道物结构域在不存在靶核酸的情况下都不形成茎环；和
其中
（i）探针是不可通过聚合酶延伸的；
（ii）接头在锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与锚定物结构域连接，并且接头在报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与报道物结构域连接，其中锚定物结构域不与可检测标记连接；和/或
（iii）锚定物结构域和报道物结构域各自包含与靶核酸的相同链互补的至少6个核苷酸的邻接序列。
在某些实施方案中，反应混合物进一步包含三磷酸核苷、DNA聚合酶和/或寡核苷酸引物。
在某些实施方案中，探针是不可通过聚合酶延伸的。
在某些实施方案中，报道物结构域的长度是4 – 20个核苷酸。在某些实施方案中，报道物结构域的长度是6 – 12个核苷酸。
在某些实施方案中，锚定物结构域是6 – 40个核苷酸。
在某些实施方案中，标记是荧光标记。在某些实施方案中，可溶性嵌入猝灭剂，其中当报道物结构域与靶核酸形成复合物时，猝灭剂改变来自标记的荧光。
在某些实施方案中，靶核酸是病毒或微生物核酸。在某些实施方案中，靶核酸是人核酸。在某些实施方案中，人核酸包含单核苷酸多态性（SNP）或突变，并且报道物结构域与SNP或突变的一个等位基因100％互补。
在某些实施方案中，探针包含至少一个非天然核苷酸，其中与代替非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，非天然核苷酸增加报道物结构域的解链温度。
在某些实施方案中，接头是聚乙二醇。在某些实施方案中，接头是六甘醇。
本发明还提供了包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针，其中：
锚定物结构域和报道物结构域通过非核苷接头连接；
锚定物结构域和报道物结构域在不存在靶核酸的情况下都不形成茎环；和
其中：
（i）探针是不可通过聚合酶延伸的；和/或
（ii）接头在锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与锚定物结构域连接，并且接头在报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与报道物结构域连接，其中锚定物结构域不与可检测标记连接。
在某些实施方案中，探针是不可通过聚合酶延伸的。
在某些实施方案中，接头在锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与锚定物结构域连接，并且接头在报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与报道物结构域连接，其中锚定物结构域不与可检测标记连接。
在某些实施方案中，报道物结构域的长度是4 – 20个核苷酸。在某些实施方案中，报道物结构域的长度是6 – 12个核苷酸。
在某些实施方案中，锚定物结构域是6 – 40个核苷酸。
在某些实施方案中，标记是荧光标记。
在某些实施方案中，探针包含至少一个非天然核苷酸，其中与代替非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，非天然核苷酸增加报道物结构域的解链温度。
在某些实施方案中，接头是聚乙二醇。在某些实施方案中，接头是六甘醇。
本发明还提供了用于检测靶序列的存在或不存在的试剂盒。在某些实施方案中，该试剂盒包含：
a. 包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针，其中：
锚定物结构域和报道物结构域通过非核苷接头连接；
锚定物结构域和报道物结构域在不存在靶核酸的情况下都不形成茎环；和
其中：
（i）探针是不可通过聚合酶延伸的；和/或
（ii）接头在锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与锚定物结构域连接，并且接头在报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与报道物结构域连接，其中锚定物结构域不与可检测标记连接；和
b. 选自盐、缓冲剂、核酸酶抑制剂、三磷酸核苷、DNA聚合酶和/或寡核苷酸引物的一种或多种试剂。
在某些实施方案中，该试剂盒进一步包含可溶性嵌入猝灭剂，从而使得当报道物结构域与靶核酸形成复合物时，猝灭剂改变来自标记的荧光。
在某些实施方案中，探针是不可通过聚合酶延伸的。
在某些实施方案中，报道物结构域的长度是4 – 20个核苷酸。在某些实施方案中，报道物结构域的长度是6 – 12个核苷酸。
在某些实施方案中，锚定物结构域是6 – 40个核苷酸。
在某些实施方案中，标记是荧光标记。
在某些实施方案中，探针包含至少一个非天然核苷酸，其中与代替非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，非天然核苷酸增加报道物结构域的解链温度。
本发明的其他方面将通过阅读本文件的其余部分得以明确。
定义
如本说明书和附加权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参考，除非上下文另有说明。因此，例如，提及“寡核苷酸”包括多个寡核苷酸；提及“探针”包括此类探针的混合物等。
如本文使用的，“生物学样品”指含有或假定含有核酸（例如来自细菌、病毒、活组织检查等）的任何物质。样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得。此类样品可以是从一个或多个个体中分离的组织或液体或其纯化馏分的量，包括但不限于例如皮肤、血浆、血清、全血、脊髓液、唾液、腹膜液、淋巴液、水性或玻璃体液、滑液、尿、泪、血细胞、血液制品、精子、精液、阴道分泌物、肺渗出液、浆膜液、器官、支气管肺泡灌洗、肿瘤、石蜡包埋的组织等。样品还可以包括体外细胞培养物的组成成分和组分，包括但不限于在细胞培养基中的细胞生长产生的条件培养基、重组细胞、细胞组分等。核酸可以通过本领域众所周知的程序得自生物学样品。
“靶核酸序列”指在生物学样品中待检测的多核苷酸序列。靶核酸可以是例如与如本文描述的核酸探针的报道物结构域的杂交区完全或部分互补的核酸区（子序列或序列）。“靶序列”可以是长至少3个核苷酸的任何长度。靶序列可以是更大基因序列或待检测的其他序列的部分。
术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换使用的，并且指核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）聚合物或其类似物的单体的聚合物。这包括核苷酸例如RNA和DNA以及其修饰形式、肽核酸（PNAs）、锁核酸（LNA）等的聚合物。在特定应用中，核酸可以是包括多个单体类型例如RNA和DNA亚单位的聚合物。核酸可以是或包括例如染色体或染色体区段、载体（例如表达载体）、表达盒、裸露DNA或RNA聚合物、扩增子（amplicon）、寡核苷酸、引物、探针等。核酸可以是例如单链或双链、或DNA:RNA杂交物、DNA和RNA嵌合结构。在术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间不存在长度上的有意区分，并且术语在本文中可以互换使用，除非上下文另有说明。
核酸一般是单链或双链的，并且一般将含有磷酸二酯键，尽管在某些情况下，如本文概述的，包括可以具有可替代主链的核酸类似物，包括例如但不限于磷酰胺（Beaucage等人（1993）Tetrahedron 49（10）：1925 和其他的参考文献；Letsinger（1970）J. Org. Chem.35:3800；Sprinzl等人（1977）Eur. J. Biochem. 81:579；Letsinger等人（1986）Nucl. Acids Res. 14：3487；Sawai等人（1984）Chem. Lett. 805；Letsinger等人（1988）J. Am. Chem. Soc. 110:4470；和Pauwels等人（1986）Chemica Scripta 26:1419）、硫代磷酸酯（Mag等人（1991）Nucleic Acids Res. 19:1437和美国专利号5,644,048）、二硫代磷酸酯（Briu等人（1989）J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、邻甲基亚磷酸酰胺键（Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford University Press（1992））、和肽核酸主链和键合（Egholm（1992）J. Am. Chem. Soc. 114:1895；Meier等人（1992）Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008；Nielsen（1993）Nature 365:566；和Carlsson等人（1996）Nature 380:207）。其他类似核酸包括具有下述的那些：带正电主链（Denpcy等人（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097）；非离子主链（美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Angew（1991）Chem. Intl. Ed. English 30：423；Letsinger等人（1988）J. Am. Chem. Soc. 110:4470；Letsinger等人（1994）Nucleoside & Nucleotide 13:1597；第2和3章，ASC Symposium Series 580，"Carbohydrate Modifications in Antisense Research"，Ed. Y. S. Sanghvi和P. DanCook；Mesmaeker等人（1994）Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4：395；Jeffs等人（1994）J. Biomolecular NMR 34:17；Tetrahedron Lett. 37:743（1996）），和非核糖主链包括下述中描述的那些：美国专利号5,235,033和5,034,506，以及第6和7章，ASCSymposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research，Ed. Y.S. Sanghvi和P. Dan Cook。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内（Jenkins等人（1995）Chem. Soc. Rev. 第169-176页）。几种核酸类似物也在例如Rawls，C& E News Jun. 2，1997第35页中描述。完成磷酸核糖主链的这些修饰，可以促进另外部分例如标记部分的添加，或改变此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
除核酸中一般发现的天然存在的杂环碱基（例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）外，核酸类似物还包括具有非天然存在的杂环或其他修饰碱基的那些，其中许多在本文中描述或另外提及。特别地，许多非天然存在的碱基在例如Seela等人（1991）Helv. Chim. Acta 74:1790，Grein等人（1994）Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976，和Seela等人（1999）Helv. Chim. Acta 82:1640中进一步描述。为了进一步举例说明，任选包括在充当解链温度（Tm）修饰剂的核苷酸中使用的特定碱基。例如，这些中的一些包括7-脱氮杂嘌呤（例如7-脱氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤等）、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN（例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等）等。参见例如，名称为"SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2'-DEOXYGUANOSINE NUCLEOTIDES"的美国专利号5,990,303，此专利于1999年11月23日授权给Seela。其他代表性杂环碱基包括例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的7-脱氮杂-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-（羧基羟基甲基）尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D甘露糖queosine、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸（v）、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、3-（3-氨基-3-N-2-羧基丙基）尿嘧啶、（acp3）w、2,6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶等。
修饰碱基和核苷酸的另外例子在例如下述中描述：例如于1996年1月16日授权给Froehler等人的，名称为"OLIGONUCLEOTIDES CONTAINING 5-PROPYNYL PYRIMIDINES"的美国专利号5,484,908，于1997年7月8日授权给Froehler等人的，名称为"ENHANCED TRIPLE-HELIX AND DOUBLE-HELIX FORMATION WITH OLIGOMERS CONTAINING MODIFIEDPYRIMIDNES"的美国专利号5,645,985，于1998年11月3日授权给Froehler等人的，名称为"METHODS OF USING OLIGOMERS CONTAINING MODIFIED PYRIMIDINES"的美国专利号5,830,653，于2003年10月28日授权给Kochkine等人的，名称为"SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLONUCLEOSIDES"的美国专利号6,639,059，于2001年10月16日授权给Skouv的，名称为"ONESTEP SAMPLE PREPARATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS IN COMPLEX BIOLOGICALSAMPLES"的美国专利号6,303,315，于1999年12月14日授权给S. Will的，名称为‘MODIFIEDNUCLEIC ACID AMPLIFICATION PRIMERS”的美国专利号6,001,611，和于2003年5月15日公开的通过Kochkine等人的，名称为"SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLO NUCLEOSIDES"的美国专利申请公开号2003/0092905。
预期本发明不受核酸、多核苷酸或寡核苷酸的来源限制。此类核酸可以来自人或非人哺乳动物，或任何其他生物（例如植物、两栖动物、细菌、病毒、支原体等、组织或细胞系，或衍生自任何重组来源、在体外或通过化学合成进行合成。再次，核酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、锁核酸（LNA）、肽核酸（PNA）、杂交物或上述的任何混合物。核酸可以以双链、单链或部分双链形式存在。本发明的核酸包括以纯化或未纯化形式的核酸及其片段，包括基因、染色体、质粒、生物学材料例如微生物的基因组，例如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人、支原体等。
“引物的延伸”指掺入核苷酸的生物催化剂例如聚合酶以模板特异性方式将核苷酸加入引物的3'末端的能力。引物是不可延伸的，如果例如引物的3'末端是被封闭的。
“聚合酶链反应延伸条件”指在此条件下与模板核酸杂交的引物通过聚合酶在聚合酶链反应（PCR）退火步骤过程中延伸的条件。本领域技术人员应当理解此类条件可以改变，并且一般受离子强度和温度影响。各种PCR退火条件在例如PCR Strategies（M. A.Innis，D. H. Gelfand和J. J. Sninsky编辑，1995，Academic Press，San Diego，CA）在第14章；PCR Protocols ：A Guide to Methods and Applications（M. A. Innis，D. H.Gelfand，J. J. Sninsky和T. J. White 编辑，Academic Press，NY，1990）中描述。
术语“天然核苷酸”指在细胞DNA中发现的嘌呤和嘧啶型核苷酸（例如胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T））和在细胞RNA中发现的嘌呤和嘧啶型核苷酸（例如胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U））。
短语“非天然核苷酸”或“修饰核苷酸”指在核酸聚合物中的单位，其含有修饰碱基、糖或磷酸基，或在其结构中掺入非天然部分。例如，非天然核苷酸的碱基、糖或磷酸盐可以根据上文对于核酸类似物描述的修饰进行修饰。非天然核苷酸可以通过核苷酸的化学修饰作为核酸聚合物的部分或在修饰核苷酸掺入核酸聚合物内之前产生。在另一种方法中，非天然核苷酸可以通过在扩增反应过程中将修饰的三磷酸核苷掺入聚合物链内产生。作为举例和非限制性的说明，非天然核苷酸的例子包括双脱氧核苷酸，生物素化的、氨基修饰的、烷基化的、荧磷光标记的衍生物或类似物等，并且还包括硫代磷酸酯、亚磷酸盐、环原子修饰的衍生物等等。
当至少一个核酸片段（即至少2个邻接碱基）可以以反向平行结合组合或与另一个核酸的至少子序列杂交以形成双链体时，核酸相对于另一个核酸是“互补的”。反向平行结合可以是分子内的，例如以发夹环的形式在核酸内，或分子间的，例如当2个或更多个单链核酸彼此杂交时。在本发明的背景中，对于与特定序列“完全互补的”寡核苷酸，其每个碱基以反向平行方式与特定序列中的相应碱基互补中。在天然核酸中通常未发现的特定碱基可以包括在本发明的核酸中，并且包括例如肌苷、7-脱氮杂鸟嘌呤（7-deazaguanine）和上文讨论的那些。在某些实施方案中，互补性不是完全的（即核酸可以是“部分互补的”而不是“完全互补的”。稳定双链体例如可以含有错配碱基对或不匹配碱基。“基本上互补的”指与潜在结合序列至少80％（例如至少80、85、90或95％）互补的序列。当未指出时，该术语指跨越潜在结合序列的完整长度的互补性程度。
“引物核酸”或“引物”是这样的核酸，其可以与靶或模板核酸杂交，并且在合适反应条件下使用例如掺入核苷酸的生物催化剂例如聚合酶允许链延伸或延长。此类条件一般包括和在合适温度下在合适缓冲液（“缓冲液”包括其为辅因子，或影响pH、离子强度等的成分（substituents）中，存在一种或多种三磷酸脱氧核糖核苷和掺入核苷酸的生物催化剂。引物核酸一般是天然或合成寡核苷酸（例如单链寡脱氧核苷酸等）。尽管任选利用其他引物核酸长度，但它们一般包含长度范围为约6 – 约100个核苷酸的杂交区。短引物核酸一般要求较低温度，以与模板核酸形成足够稳定的杂交复合物。与模板核酸的子序列至少部分互补的引物核酸一般足以与模板杂交用于延伸发生。用于例如给定靶序列扩增的合适引物的设计是本领域众所周知的，且在本文引用的参考文献中描述。如果需要的话，引物核酸可以通过掺入经由例如分光光度计、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他技术可检测的标记进行标记。为了举例说明，有用标记包括放射性同位素、荧光染料、电子致密（electron-dense）试剂、酶（如ELISAs中通常使用的）、生物素或可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。这些和其他的许多标记在本文中进一步描述和/或是本领域另外已知的。本领域技术人员应认识到在特定实施方案中，引物核酸也可以用作探针核酸。
如本文使用的，术语“探针”指可以与靶核酸的区域（或衍生自此类靶核酸的扩增子）形成双链体结构的寡核苷酸（或其他核酸序列），在合适条件下在探针中的至少一个序列与靶核酸中的序列的部分或全部互补性。如本文定义的，探针可以进一步包含非核苷酸组分，例如非核苷接头。如本文讨论的，探针可以是标记或未标记的。探针的3'末端任选可以设计为抑制探针掺入引物延伸产物内（不可延伸的）。这可以通过使用非互补碱基或通过将化学部分例如生物素或磷酸基加入最后一个核苷酸的3'羟基来达到，这取决于所选部分，通过充当用于后续检测的标记或与标记附着的核酸的捕获，还可以发挥双重目的。抑制延伸还可以通过下述方法来达到：去除3'-OH或使用缺乏3'-OH的核苷酸例如双脱氧核苷酸，或加入通过立体阻碍阻断延伸的填充基团。多核苷酸还可以致使不可延伸的，例如通过例如用磷酸盐或其他部分修饰多核苷酸的2'末端，如例如美国专利申请号10/879,494和11/583,606的任何中描述的。
如本文使用的，术语“茎环”指包含茎部分和不成对环部分的二级结构。依照本发明，茎通过单链核酸的2个互补区形成。茎环的茎部分可以由单个核酸的2个区域形成，其中2个区域之一包含与2个区域中的另一个100％互补的至少3 个（例如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或更多）碱基，从而允许在合适条件下形成茎双链体。在2个区域之间的插入碱基可以形成不成对的环，包含例如至少3个、至少5个、至少7个、至少10个或至少20个或更多碱基。
术语“杂交区”指与多核苷酸完全或基本上互补从而杂交的核酸在长度上至少3个邻接核苷酸区域。
如本文使用的，术语“Tm”指“解链温度”。解链温度是在同型双链体或异型双链体（即完全或部分互补的双链体）中，双链多核苷酸或核碱基寡聚物（例如杂交复合物）群体的一半变得解离成单链（在限定离子强度、pH和核酸浓度下）时的温度。双链体多核苷酸的Tm的预测考虑碱基序列以及其他因素，包括结构和序列特征和寡聚键合的性质。用于预测和实验上测定Tm的方法是本领域已知的。
例如，Tm照常规通过解链曲线进行测定，其中双链体核酸分子在控制温度程序中加热，并且监控双链体中2条单链的结合/解离状态，并且标绘直至达到其中2条链完全解离的温度。Tm由这个解链曲线进行测定。可替代地，Tm可以通过退火曲线进行测定，其中双链体核酸分子加热至其中2条链完全解离的温度。温度随后在控制温度程序中降低，并且监控双链体中2条单链的结合/解离状态，并且标绘直至达到其中2条链完全退火的温度。随后由这个退火曲线测定Tm。
如本文使用的，术语“可检测标记的”或“可检测标记”指可以检测或可以导致可检测应答的化学种类。依照本发明的可检测标记可以与探针直接或间接连接。在某些实施方案中，可检测标记是相互作用的标记对的成员。在某些其他实施方案中，标记对的一个成员是荧光团，并且标记对的另一个成员是猝灭剂。
附图说明
图1：（A）当报道物结构域与靶核酸100％互补时，它在靶核酸上杂交。如该图中所示，靶核酸序列含有单核苷酸多态性（SNP），并且报道物结构域与含有SNP的靶核酸100％互补。
（B）当存在SNP错配时，例如靶核酸序列含有此SNP的变体或可选等位基因时，报道物结构域不在靶核酸上杂交。
图2：本发明的标记探针的另一个实施方案。如该图中所示，荧光染料在报道物结构域的5'末端上附着，并且猝灭染料在锚定物结构域的5'末端上附着。
图3：本发明的标记探针的另一个实施方案。如该图中所示，荧光染料在报道物结构域的5'末端上附着，并且猝灭染料在报道物结构域的3'末端上附着。
图4：本发明的标记探针的另一个实施方案。如该图中所示，荧光染料在报道物结构域的5'末端上附着，并且使用可溶性嵌入猝灭染料。
图5：如下生成含或不含稳定碱基的各种Cobra探针形式：5NS-CBRA-USRV在9碱基报道区中不含有稳定碱基；6ST-CBRA-USRV在9碱基报道区中含有7个稳定碱基；并且7ST-CBRA-USRV在9碱基报道区中含有7个稳定碱基，但在对应于模板中的可变区的报道区中心无稳定碱基。
发明详述
I. 引言
本发明部分基于下述发现：具有弹性接头的2结构域探针允许特异性检测靶核酸序列的存在或不存在。第一个结构域充当驱动探针在靶核酸上的杂交的“锚”。这个结构域与靶核酸稳定杂交，并且能耐受潜在错配，或设计为与靶核酸的互补区内具有低变异性的区域（“锚定物结合”区）形成双链体。第二个结构域充当设计为检测目的序列的“报道物”。“报道物”对于靶核酸的互补区（“报道物结合”区）是高度特异的，并且能够检测靶序列的存在或不存在以及与报道物结合区的匹配/错配的区分。报道物结构域一般与标记这样连接，使得可以区分报道物结构域的杂交和杂交的缺乏，从而检测靶序列的存在或不存在，或检测解链温度中的改变，从而检测探针区中的错配。这种设计的2结构域探针允许其在检测目的靶序列中是高度特异的。
本发明还提供了使用2结构域探针检测靶核酸的方法。相应地，本发明的方法用于许多应用中，包括但不限于分子诊断、农业、食物测试、作物/家畜育种、病原体鉴定、药物开发/发展和药物基因组学。例如，本发明的方法可以用于检测病毒的特定变体或在多种生物中检测包含单核苷酸多态性或点突变的核酸序列。
II. 探针
本发明涉及包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的探针，其进一步包含非核苷接头以连接2个结构域。为了方便起见，锚定物核酸结构域还可以称为“第一个结构域”，并且报道物核酸结构域还可以称为“第二个结构域”。本发明的探针设计为可检测标记的，以检测靶核酸的存在或不存在，即从而使得和报道物不与靶杂交时比较，当报道物结构域与靶杂交时，在来自标记的信号中存在改变。通过检测且测量可检测信号中的改变，靶核酸序列的存在或不存在可以定性地或定量地进行测定。通过检测解链温度中的改变，可以测定靶的突变或改变的存在或不存在。
本发明的锚定物结构域设计为在测定的条件下与靶核酸的“锚定结合”序列杂交。相比之下，报道物结构域可以与其靶“结合区”杂交或不杂交，取决于是否存在精确靶序列。报道物结构域可以例如设计为与靶核酸的“报道物结合”序列互补或至少基本上互补。取决于使用的反应条件，可以区分报道物结构域与靶的杂交和与靶变体序列的杂交。
本发明的探针可以设计为在合适反应条件下使用例如掺入核苷酸的生物催化剂例如聚合酶允许链延伸或延长的引物。可替代地，探针还可以是不可延伸的，从而使得另外的核苷酸无法加入探针中。探针可以例如通过修饰探针的3'末端致使不可延伸的，从而使得羟基不再能够参与延长。3'天然存在的核苷酸的羟基可以简单地由多种官能团进行修饰。例如，探针的3'末端可以通过掺入核苷酸类似物致使不可延伸的，所述核苷酸类似物缺乏3'羟基或无法充当聚合物的底物用于延伸。任选地，探针可以通过在其3'末端上掺入标记致使其不可延伸。
在某些实施方案中，探针可以通过掺入2'-终止子核苷酸（在核苷酸的糖部分的2'-位置上具有封闭基团的核苷酸类似物）来致使其不可延伸。“封闭基团”指一般阻止核酸延伸的化学基团或部分（即，2'-终止子核苷酸一般是不可通过一种或多种掺入核苷酸的生物催化剂延伸的）。即，一旦2'-终止子核苷酸掺入核酸内（例如在核酸的3'末端上），封闭基团就阻止核酸通过至少一个掺入核苷酸的生物催化剂的进一步延伸。示例性掺入核苷酸的生物催化剂包括DNA聚合酶，包括但不限于例如G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329AE678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640GS671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、ΔZO5R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、黄栖热菌（Thermus flavus）聚合酶、TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶、栖热菌属（Thermus）物种SPS-17聚合酶、E615G Taq聚合酶、栖热菌属Z05R聚合酶、T7DNA聚合酶、Kornberg DNA聚合酶 I、Klenow DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、微球菌（Micrococcal）DNA聚合酶、α DNA聚合酶、逆转录酶、AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、大肠杆菌（E. coli）RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、RNA聚合酶 II、末端转移酶、多核苷酸磷酸化酶、掺入核糖核苷酸的DNA聚合酶等。
示例性封闭基团是磷酸基。示例性2'-终止子核苷酸包括2'-单磷酸-3'-羟基-5'-核苷三磷酸和2'-单磷酸-3'-羟基-5'-核苷二磷酸。其他2'-终止子核苷酸在下述中描述：例如通过Bodepudi等人于2004年6月28日提交的，名称为"SYNTHESIS AND COMPOSITIONSOF 2'-TERMINATOR NUCLEOTIDES"的美国专利申请序列号10/879,494，和通过Gelfand等人于2004年6月28日提交的，名称为"2'-TERMINATOR NUCLEOTIDE-RELATED METHODS ANDSYSTEMS"的序列号10/879,493，和通过Gelfand等人于2006年10月18日提交的，名称为“2'-TERMINATOR RELATED PYROPHOSPHOROLYSIS ACTIVATED POLYMERIZATION” 的美国专利申请序列号11/583,606。
根据本发明，锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域通过非核苷接头连接。任何标准技术可以用于将锚定物核酸结构域或报道物核酸结构域与非核苷接头附着。锚定物核酸结构域或报道物核酸结构域可以与非核苷接头直接或间接连接。在某些实施方案中，锚定物核酸结构域或报道物核酸结构域与非核苷接头共价附着。
A. 锚定物核酸结构域
本发明的锚定物核酸结构域设计为在测定条件下结合生物学样品中的靶核酸的“锚定结合”序列。相应地，锚定物核酸结构域可以设计为包含与靶核酸的“锚定结合”序列互补或基本上互补的区域。在本发明的某些实施方案中，锚定物核酸结构域包含与靶核酸内的“锚定结合”序列互补或基本上互补的区域或由这种区域组成。互补区可以具有对于本发明有用的任何长度，包括但不限于至少4、6、8、10、12、14、16、20个或更多核苷酸，例如长3-50、5-20、5-50或8-25个核苷酸。
在本发明的某些实施方案中，锚定物核酸结构域可以包含另外区域，例如用于附着可检测标记的区域。在某些实施方案中，锚定物核酸结构域含有仅一个区域，其与靶核酸的一个“锚定结合”序列互补或基本上互补。在某些实施方案中，锚定物核酸结构域可以含有2个或更多区域，各自与靶核酸内的独特“锚定结合”序列结合。
根据本发明，锚定物核酸结构域（或第一个结构域）设计为驱动探针与靶核酸的杂交。在某些实施方案中，锚定物核酸结构域的组成和长度选择为克服（即尽管在该方法的条件下杂交）在锚定物核酸结构域和“锚定结合”序列之间的潜在错配，这种错配是由于在“锚定结合”序列内存在罕见多态性。根据本发明，锚定物核酸结构域可以具有任何长度，只要在锚定物核酸结构域和“锚定结合”序列之间的亲和力足够大，从而使得它们在反应条件下杂交。在某些实施方案中，锚定物核酸结构域的长度这样进行选择，使得在探针和靶核酸之间存在足够特异性，从而使得它们可以在反应条件下杂交。在某些实施方案中，在锚定物核酸结构域和“锚定结合”序列之间的单独杂交（即无论报道物结构域是否与靶杂交）足以驱动探针在靶核酸的预期位置上的杂交。
在本发明的某些实施方案中，锚定物核酸结构域长度是约5个核苷酸 – 约200个核苷酸。在某些实施方案中，锚定物核酸结构域长度是4 – 50个核苷酸。在某些实施方案中，锚定物核酸结构域长度是6 – 40个核苷酸。在本发明的某些实施方案中，锚定物核酸结构域长度是20 – 40个核苷酸。在本发明的某些实施方案中，锚定物核酸结构域长度是8 –25个核苷酸。在本发明的某些实施方案中，锚定物核酸结构域长度是约30个核苷酸。在本发明的其他实施方案中，锚定物核酸结构域长度是40 – 60个核苷酸。在本发明的某些实施方案中，锚定物核酸结构域长度超过60个核苷酸。优选地，锚定物结构域包含与靶核酸的一条链互补的至少10个核苷酸的邻接序列。
锚定物核酸结构域可以包含天然核苷酸、非天然核苷酸或其组合。示例性核酸包括但不限于常规核糖核酸（RNA）、脱氧核糖核酸（DNA）、和这些分子的化学类似物，例如锁核苷酸类似物（“LNA”）和肽核酸（“PNA”）。本文描述的多种核酸类似物还可以用于锚定物核酸结构域。在本发明的某些实施方案中，与代替非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，非天然核苷酸增加锚定物结构域的解链温度。促成增加的Tm的示例性人工碱基在本领域中描述，包括但不限于例如Lebedev等人，Geneteic Analysis - Biomolecular Engineering 13:15-21（1996）；Xodo,等人，Nucleic Acids Res. 19:5625-5631（1991）；Froehler,等人，Tetrahedron Lett. 33:5307-5310（1992）；Kutyavin,等人，Biochemistry 35:11170- 11176（1996）；Nguyen,等人，Nucleic Acids Res. 25:30599-65（1997）。在本发明的某些实施方案中，非天然核苷酸是丙炔基-dN。在本发明的某些实施方案中，胸腺嘧啶由丙炔基dU替换，胞嘧啶由丙炔基dC替换。
B. 报道物核酸结构域
本发明的报道物核酸结构域设计为检测生物学样品中靶核酸序列的存在或不存在。相应地，报道物核酸结构域可以设计为包含与靶核酸内的“报道物结合”序列互补或至少基本上互补的区域。如本文讨论的，靶的锚定物结合结构域和靶的报道物结合结构域在靶核酸的相同链上。在本发明的某些实施方案中，报道物核酸结构域包括与靶核酸内的“报道物结合”序列互补或基本上互补的区域或由这种区域组成。在本发明的其他实施方案中，报道物核酸结构域包含另外区域，例如用于附着可检测标记的区域。在某些实施方案中，报道物核酸结构域含有仅一个区域，其与靶核酸的一个“报道物结合”序列互补或基本上互补。在某些实施方案中，报道物核酸结构域可以含有2个或更多区域，其各自能够与靶核酸内的独特“报道物结合”序列结合，例如在靶核酸内的多个SNP区。
因为报道物结构域序列设计为对于特定报道物结构域结合序列是有选择性的，所以一般地报道物结构域的区域与报道物结合序列完全互补。可替代地，与反应条件组合，报道物结构域可以这样进行设计，使得报道物结构域与特定靶或特定靶和轻微（例如单个核苷酸）变体杂交，但不与更广泛不同的序列（例如更大的缺失或置换、重排、超过一个错配等）结合。
报道物核酸结构域和可检测标记可以设计为检测任何目的靶核酸的存在或不存在。靶核酸可以来自任何来源。例如，靶核酸可以是病毒或微生物核酸。可替代地，靶核酸还可以是例如动物、哺乳动物、人、真菌或植物核酸。在某些实施方案中，本发明的报道物核酸结构域可以设计为检测在靶核酸内的单核苷酸多态性（SNP）或突变的存在或不存在。相应地，在某些实施方案中，报道物核酸结构域包含与SNP或突变的一个等位基因100％互补，并且探针在允许区分与SNP或野生型序列的一个等位基因和其他可能等位基因结合的条件下使用。
报道物核酸结构域从而可以设计为对于“报道物结合”序列高度特异性的。在某些实施方案中，即使在报道物核酸结构域和“报道物结合”序列之间的单碱基错配可以诱导化学或物理性质上的信号变化，其足够显著以促进匹配（或错配）的检测。信号变化可以是探针的构象变化，即从随机螺旋到在报道物核酸结构域和靶核酸之间形成的双链体。信号变化可以是在物理或化学上可检测的。例如，探针可以以荧光信号可以针对匹配或错配来诱导或改变的方式进行荧光标记。标记和探针可以这样进行设计，使得在报道物核酸结构域和“报道物结合”序列之间的杂交和无杂交之间荧光中的差异被检测到。在某些实施方案中，这个差异不涉及在探针的任一结构域中的茎环（例如在不存在靶的情况下）。信号变化还可以是在报道物核酸结构域和“报道物结合”序列之间形成的杂交双链体的解链温度中的变化。Tm变化可以例如在报道物核酸结构域和“报道物结合”序列之间形成的互补双链体和错配双链体之间进行测量。
在本发明的某些实施方案中，报道物核酸结构域包含与靶核酸内的“报道物结合”序列互补或基本上互补的区域或由这种区域组成。互补区可以具有对于本发明有用的任何长度，包括但不限于至少4、6、8、10、12、14、16、20个或更多核苷酸，例如长3-50、5-20、5-50或8-25个核苷酸。
本发明的报道物核酸结构域可以具有任何合适长度。在某些实施方案中，为了使对于其互补序列的特异性达到最大，本发明的报道物核酸结构域设计为在长度中相对短。在某些实施方案中，报道物结构域的长度是4 - 20个核苷酸；优选地，报道物核酸结构域的靶结合部分的长度是4 - 20个核苷酸。在某些实施方案中，报道物核酸结构域的长度是6 -12个核苷酸。在某些实施方案中，报道物核酸结构域的长度是8 - 25个核苷酸。在某些实施方案中，报道物核酸结构域的长度是6 - 40个核苷酸。在本发明的某些实施方案中，报道物核酸结构域是长度至少6、7、8、9、10、11或12个核苷酸。优选地，报道物结构域包含与靶核酸的一条链互补的至少10个核苷酸的邻接序列。
本发明利用报道物核酸结构域对于“报道物结合”序列的高特异性。相应地，报道物核酸结构域可以包含非天然核苷酸，以增加报道物核酸结构域的结合特异性，并且因此增加在匹配和错配之间的探针区分。在本发明的某些实施方案中，与代替非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，非天然核苷酸增加报道物结构域的解链温度。在本发明的某些实施方案中，非天然核苷酸增加匹配和错配的Tm中的差异。在本发明的某些实施方案中，非天然核苷酸是丙炔基-dN。促成增加的Tm的示例性人工碱基在本领域中描述，包括但不限于例如Lebedev等人，Geneteic Analysis - Biomolecular Engineering 13:15-21（1996）；Xodo,等人，Nucleic Acids Res. 19:5625-5631（1991）；Froehler,等人，Tetrahedron Lett. 33:5307-5310（1992）；Kutyavin,等人，Biochemistry 35:11170-11176（1996）；Nguyen,等人，Nucleic Acids Res. 25:30599-65（1997）。例如，2-氨基A使Tm增加超过A约3℃，5-甲基-C使Tm升高超过C约1.3℃，C-5丙炔基-C使Tm改善超过C约2.8℃，并且C-5丙炔基-U使Tm增加超过T约1.7℃。任选地，报道区将包含一个或多个（例如2、3、4、5、6、7、8、9个或更多）稳定碱基，但报道区的部分中的一个或无稳定（例如非天然）碱基与潜在可变的序列（例如SNP或预期的可能突变）杂交。
锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域在不存在靶核酸的情况下可以采用任何构象。在某些实施方案中，锚定物结构域和报道物结构域都不形成茎环。在本发明的某些实施方案中，锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域设计为不具有特定二级结构（例如随机螺旋）。在本发明的某些实施方案中，这些结构域的某些区域可以彼此杂交。例如，锚定物核酸结构域中的区域可以与报道物核酸结构域中的区域互补或部分互补。在本发明的某些实施方案中，锚定物结构域和报道物结构域小于50％互补。在本发明的某些实施方案中，探针在不存在靶核酸的情况下具有茎环结构，其在锚定物结构域和报道物结构域中的互补或部分互补区域之间形成（至少4个邻接核苷酸的区域）。在本发明的其他实施方案中，锚定物结构域在不存在靶核酸的情况下可以形成茎环。可替代地，报道物结构域在不存在靶核酸的情况下可以形成茎环。
在某些实施方案中，锚定物结构域和报道物结构域都不包含茎环。因此，在某些实施方案中，
1. 报道物结构域不包括具有完全互补的至少3个核苷酸的2个序列，并且其中2个序列具有至少2个核苷酸的介入序列（intervening）；和/或
2. 锚定物结构域不包括具有完全互补的至少3个核苷酸的2个序列，并且其中2个序列具有至少2个核苷酸的介入序列。
如图中举例说明的，在某些实施方案中，锚定物在探针的3'末端，而报道物在探针的5'末端。虽然该图举例说明其中报道与锚定物结构域的5'末端连接的实施方案，但应当理解报道物还可以设计为与锚定物结构域的3'末端连接（使得报道物在探针的3'末端而锚定物在探针的5'末端）。
C. 非核苷接头
“非核苷接头”将锚定物结构域和报道物结构域分隔开。技术人员将认识到可以使用任何合适的非核苷接头。常规实验可以用于测定关于接头的最佳特征。根据本发明，锚定物结构域和报道物结构域设计为与靶核酸中彼此相邻的区域结合。因此，在某些实施方案中，锚定物结构域和报道物结构域可以设计为相对靠近在一起（当报道物结构域和锚定物结构域都与靶杂交时，例如插入不超过1、2、3、4或5核苷酸）。当锚定物与靶中的相邻序列杂交时，连接一般将足够弹性，以允许报道物杂交或不杂交。非核苷接头作用于保持锚定物结构域和报道物结构域之间的间隔。锚定物结构域和报道物结构域之间的间隔因此可以通过使用多种长度的非核苷酸接头进行调整。
非核苷接头可以例如是脂肪族，芳香族，芳基，环状，手性，非手性，肽，碳水化合物，脂质，脂肪酸，三、四、五、六或多聚乙二醇（HEG），或杂环部分。聚乙二醇特别是六甘醇。其他常见的非核苷接头采用同双功能和异双功能交联剂。同双功能试剂携带2个等同官能团，而异双功能试剂含有2个不同的官能团，以连接生物制品与生物粘附剂。绝大多数的异双功能交联剂含有伯胺反应基团和硫醇反应基团。共价交联剂选自能够形成二硫键（S--S）、二醇（--CH（OH）--CH（OH）--）、偶氮（--N=N--）、砜（--S（=O2--）、酯（--C（=O）--O--）或酰胺（--C（=O）--N--）桥的试剂。
本发明的探针设计为具有锚定物核酸结构域、报道物核酸结构域和非核苷接头的不同组合。在某些实施方案中，接头可以与锚定物核酸结构域或报道物核酸结构域的末端附着，例如锚定物核酸结构域或报道物核酸结构域的3’或5’位置。可替代地，接头可以与探针的一个或两个核酸结构域的其他内部位置附着，只要键合或附着不干扰探针的功能，例如探针与预期靶核酸的杂交。例如，接头可以在报道物结构域的3’或5’末端的例如1、2、3、4个或更多核苷酸内与报道物结构域连接。类似地，接头可以在锚定物结构域的3’或5’末端的例如1、2、3、4个或更多核苷酸内与锚定物结构域连接。锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域可以与非核苷接头的多个位置附着。在某些实施方案中，这些核酸结构域与接头的末端附着。任选地，它们可以与接头的不同位置附着。
III. 标记
在本发明的某些实施方案中，锚定物结构域、报道物结构域或非核苷酸接头是可检测标记的，并且其在检测靶序列中具有进一步用途。如先前指出的，标记与探针这样连接，使得报道物结构域（对锚定物结构域不是必需的）的杂交是可检测的。因此，在某些实施方案中，锚定物结构域不与标记连接，而报道物结构域一般将与一种或多种标记连接。在某些实施方案中，可检测标记的探针用于检测且定量某种扩增反应中的靶序列，例如对于实时扩增反应。
广泛多样的可检测标记是已知的。示例性标记包括荧光标记（包括例如猝灭剂或吸附剂）、非荧光标记、比色标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、质量修饰基团、抗体、抗原、生物素、半抗原、酶（包括例如过氧化物酶、磷酸酶）等。标记可以提供通过荧光、放射性、比色法、重力测量法、X射线衍射或吸收、磁学、酶促活性等可检测的信号。标记可以用于提供可检测（和任选地可定量）并且可以与核酸或蛋白质附着的信号。
在本发明的特定实施方案中，标记是荧光染料或荧光团。一般地，特定荧光团在较短波长的光吸收后可以发出特定波长的光。由特定荧光团发出的光的波长是那种荧光特有的。因此，特定荧光团可以通过在用较短波长的光激发荧光团后检测合适波长的光进行检测。荧光标记可以包括带负电的染料，例如荧光素（fluorescein）家族的染料，或在电荷中是中性的染料，例如羧基罗丹明家族的染料，或带正电的染料，例如花青（cyanine）家族或罗丹明（rhodamine）家族的染料。可以用于本发明中的其他染料家族包括例如多聚卤素荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素（coumarin）家族染料、嗪（oxazine）家族染料、噻嗪（thiazine）家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料、ALEXA FLUOR®染料和BODIPY®家族染料。荧光素家族的染料包括例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。羧基罗丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA由Perkin-Elmer（Foster City，Calif.）销售，而Texas Red由Molecular Probes，Inc.（Eugene，Oreg.）销售。花青家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7，并且由Amersham GE Healthcare（Piscataway，N.J.）销售。非荧光猝灭剂包括由Biosearch Technologies，Inc.（Novato，Cal.）销售的BlackHole Quenchers™（BHQ）、由Integrated DNA Tech.，Inc.（Coralville，Iowa）销售的Iowa Black™、和由Berry &Assoc.,（Dexter，Mich.）销售的BlackBerry™ Quencher 650（BBQ-650）。
使用标记的信号系统的各种实施方案可以用于本发明中。标记（例如荧光团、猝灭剂、嵌入染料、荧光素）可以与锚定物结构域、报道物结构域或非核苷接头附着。可以使用一种或多种标记的任何构象，只要它可以检测信号中的差异，取决于报道物与报道物结合靶序列的杂交。本发明的信号系统的例子包括但不限于下述实施方案。
实施方案1
在某些实施方案中，报道物结构域或锚定物结构域与嵌入染料连接，所述嵌入染料能够掺入双链核酸分子的碱基之间，并且当嵌入时产生信号。合适荧光团包括但不限于花青染料（例如由Molecular Probes开发的）（参见例如，Eriksson等人，Nucleic Acids Research 31（21）:6235-6242（2003））、溴化乙啶、Picogreen、SYBR绿、吖啶及其他。
当报道物结构域与靶核酸序列杂交时（匹配），报道物结构域和靶序列形成双链体，并且所附着的染料可以嵌入双链体内，从而生成可检测信号。例如，当报道物结构域与人核酸序列中的SNP或突变的一个等位基因100％互补时，在合适条件下，报道物结构域与靶核酸杂交，并且当与报道物附着的嵌入染料变得嵌入时，它具有改变或增强的荧光。当报道物结构域与靶核酸并非100％互补时，不形成双链体，并且染料具有不同（例如较低）水平的荧光。
根据本发明，当使用嵌入染料时，探针这样进行设计，使得在探针内的任何内部折叠降到最低。这确保不存在锚定物结构域和报道物结构域之间形成的双链体，并且帮助减少任何背景噪声。
实施方案2
在某些实施方案中，探针与荧光染料和猝灭染料连接，其中一种染料与报道物结构域连接，并且一种染料与锚定物结构域连接。当报道物结构域不与靶核酸序列杂交时（例如错配），探针采取这样的构象，使得荧光染料和猝灭染料变得紧密接近，允许猝灭剂猝灭来自荧光染料的信号。当报道物结构域与“报道物结合”序列杂交时（例如在报道物结构域和靶之间的完全互补的匹配），荧光染料与猝灭剂分开，允许探针发荧光。荧光的猝灭可以但无需通过在锚定物结构域和报道物结构域之间形成的茎环结构来达到。然而，猝灭可以无需茎环结构而达到。例如，猝灭可以通过探针的随机螺旋来达到，使荧光染料-猝灭染料对偶然达到接近。荧光染料的例子包括但不限于FAM、TAMRA、TET、ROX。猝灭染料的例子包括但不限于DABCYL。根据本发明，猝灭剂可以是荧光猝灭剂或非荧光猝灭剂。非荧光猝灭剂的例子包括但不限于BHQ、Blackberry Quencher和Iowa Black。
如图2中所示，在某些实施方案中，荧光染料与报道物结构域的5'末端连接，并且猝灭染料在锚定物结构域的5'末端上附着。在某些实施方案中，荧光染料与报道物结构域的3'末端连接，并且猝灭染料在锚定物结构域的3'末端上附着。在其中锚定物结构域在探针的5'末端并且报道物结构域在探针的3'末端的一个替代方案中，荧光染料在报道物结构域的3'末端上，并且猝灭剂在锚定物结构域的3'末端，或荧光染料在报道物结构域的5'末端上，并且猝灭剂在锚定物结构域的5'末端。当报道物不与“报道物结合”序列杂交时，荧光染料在猝灭染料的附近，并且荧光被猝灭。当报道物与“报道物结合”序列杂交时，荧光染料远离猝灭染料的附近，并且因此荧光不再被猝灭。
在本发明的某些实施方案中，报道物结构域一直用染料（荧光染料或猝灭染料）进行标记。荧光-猝灭对的另一种染料可以附着至锚定物结构域或非核苷接头。
这个实施方案的染料还可以是能量转移（例如“FRET”）对或其中信号随着邻近性变化而改变的其他对。当使用染料的能量转移对时，2种染料都是荧光的，第一种是供体荧光团，并且第二种是受体荧光团。当供体和受体达到紧密接近时，能量转移从供体到受体发生。这发出不同波长的信号。可以检测到供体荧光的减少或受体荧光的增加。
实施方案3
在某些实施方案中，探针的报道物结构域用荧光染料和猝灭染料进行标记。在这些实施方案中的某些中，荧光染料和猝灭染料设计为处于紧密接近。当被照射时，激发的荧光染料将能量转移给附近猝灭染料分子而不是发荧光。与荧光-猝灭染料对的紧密接近阻止任何荧光的发出，同时探针完整。
探针设计为与靶核酸杂交。当聚合酶复制探针与之结合的模板时，它的5’-3’外切核酸酶活性切割探针的5'末端，所述5'末端含有荧光染料或猝灭染料。这分开荧光染料与猝灭染料，即携带荧光染料的核酸片段释放到溶液内，并且不再与猝灭染料紧密接近。这终止猝灭剂的活性，并且荧光染料开始发荧光。
当存在错配时，探针的报道物结构域不与靶核酸的“报道物结合”序列杂交。在那种情况下，聚合酶的5’-3’ 外切核酸酶活性不切割探针的5'末端。相反，探针保持完整，荧光染料保持与猝灭染料紧密接近。
在图3中，荧光染料存在于报道物结构域的5'末端上，并且猝灭染料与报道物结构域的3'末端附着。本领域技术人员将认识到猝灭染料可以附着至探针的任何方便位置，例如在非核苷接头上，或锚定物结构域上，只要在与靶杂交前，猝灭染料保持与荧光染料紧密接近。
在某些实施方案中，猝灭染料无需附着至探针共价。在某些情况下，报道物结构域与荧光报道物连接且用于包含可溶性（不与探针连接的）猝灭剂的混合物中。当报道物结构域不与靶结合时，信号通过报道物生成。当报道物结合靶时，嵌入猝灭剂与报道物变得接近，并且信号减少。信号中的减少因此是结合的指示剂。这个方面例如在图4中举例说明。示例性可溶性猝灭剂包括例如New Methylene Blue。
IV. 方法
本发明涉及使用本文描述的探针检测生物学样品中的靶核酸序列的方法。本发明的方法可以用于检测来自各种来源的靶核酸序列，包括但不限于血液样品、粪便样品、尿样品、组织样品或活组织检查。靶核酸可以是人核酸、哺乳动物核酸、植物核酸、动物核酸、病毒核酸、细菌核酸或其他微生物核酸。
本发明的方法用于检测确切靶核酸序列的存在或不存在。靶核酸序列可以是例如潜在插入、缺失或核苷酸置换的位点。靶核酸可以是基因组缺失或罕见基因排列的结果。靶核酸序列的例子包括但不限于包含单核苷酸多态性（SNP）的靶核酸序列、或生物中的罕见体细胞突变、或核糖核酸序列。在本发明的某些实施方案中，本发明的方法涉及包含使用包含与SNP或突变的一个等位基因100％互补的报道物结构域，检测SNP或突变的人核酸。在某些其他实施方案中，本发明的方法用于监控动物（包括但不限于人）或环境中特定病毒或细菌变体的存在或不存在。此类传染剂的例子包括但不限于人免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人乳头状瘤病毒（HPV）。
本发明的方法可以用于多种序列检测技术中。例如，本发明的方法可以用于终点PCR产物检测法，例如基因分型。在某些实施方案中，本发明的方法用于实时PCR技术中。此外，本发明的方法和探针可以用于杂交分析中，例如通过测量解链或退火曲线的解离分析。在本发明的某些实施方案中，靶核酸的检测包含测量通过本发明的探针生成的荧光的改变。在某些实施方案中，不对称PCR（其中一种引物超过第二种引物）用于生成与本发明的探针互补的合适模板链。
在本发明的某些实施方案中，靶核酸的检测包含测量在报道物结构域和“报道物结合”序列之间形成的复合物的解链温度。报道物结构域与靶的解链温度将取决于报道物结构域与其靶如何互补。如果靶是完全互补的，那么解链温度将高于在报道物和靶之间存在一个或多个错配的情况。在其中最可能地靶替代方案是已知的情况下（例如，其中SNP的2个不同等位基因可以存在于靶中），报道序列可以设计为最佳化不同可选方案（options）之间的解链温度差异。例如，报道物结构域可以包括一个或多个稳定碱基，从而使得在报道物结构域和可能（例如可能地）靶序列之间的解链温度中的差异得到强调。在某些例子中，报道物结构域Tm的差异可以是约至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或8℃。在本发明的某些实施方案中，报道物结构域Tm的差异是约10℃或更多。
为了达到匹配和错配之间的更高区分，在匹配和错配之间在报道物结构域的Tm中的差异可以通过用非天然、互补核苷酸替代天然、互补核苷酸得到进一步增加。在本发明的某些实施方案中，选择非天然核苷酸置换的数目和类型，以不仅达到匹配和错配之间的更高区分，还达到错配的不同类型之间的更高区分。例如，使用包含非天然核苷酸的报道物结构域的方法可以用于区分在不同位置的错配。在本发明的某些实施方案中，报道物结构域具有1、2、3、4、5、6个或更多个非天然、互补核苷酸。
V. 反应混合物
本发明还提供了涉及本发明的方法中的反应混合物。示例性反应混合物包括例如来自生物学样品的核酸（例如包含锚定物结合区和报道物结合区的靶核酸序列），和包含锚定物结构域和报道物结构域的如本文描述的可检测标记的探针。为了检测靶核酸的存在或不存在，特别是报道物结合区的存在或不存在，探针这样进行设计，使得报道物结构域包含与报道物结合区互补的序列，并且锚定物结构域包含与锚定物结合区互补的序列。在本发明的某些实施方案中，探针的结构域在不存在靶核酸的情况下都不能形成茎环，并且任选地，探针是不可通过DNA聚合酶延伸的。
在某些实施方案中，本发明的反应混合物可以是用于扩增靶核酸的反应混合物。相应地，反应混合物包含靶核酸、三磷酸核苷（例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、DNA聚合酶和/或寡核苷酸引物中的至少一种或多种。
在本发明的某些实施方案中，本发明的探针是可延伸的，并且充当引物。
VI. 试剂盒
本发明还提供了用于在本发明的方法中使用的试剂盒。本发明的试剂盒可以包括如本文描述的本发明的2结构域探针中的一种或多种，任选与如本文描述的一种或多种其他试剂组合（在相同或另外器皿（vessels）中）。在某些实施方案中，试剂盒是区室化的，易于使用，且含有提供如本文描述的本发明的探针的至少一个容器。还可以包括提供一种或多种另外试剂的一个或多个另外容器。此类另外容器可以包括由技术人员公认用于在依照上文描述的方法的引物延伸程序中使用的任何试剂或其他成分（elements），包括用于在例如核酸扩增步骤（例如PCR、RT-PCR）、DNA测序步骤或DNA标记步骤中使用的试剂。试剂盒可以包含例如含有靶序列的多核苷酸。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括容器，其提供在引物延伸条件下与靶序列可杂交的5'有义引物，和/或包含例如5'有义引物和相应3'反义引物的引物对。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括提供可溶性嵌入猝灭剂的容器。在其他、非相互排斥的变化中，试剂盒包括提供游离核苷酸（常规和/或非常规的）的一个或多个容器。在特定实施方案中，试剂盒包括α-硫代磷酸酯dNTPs、dUTP、dITP和/或标记的dNTPs，例如荧光素-或花青-染料家族dNTPs。在另外其他、非相互排斥的实施方案中，试剂盒包括提供适合于引物延伸反应的缓冲液的一个或多个容器。
提供下述实施例、参考文献和附图，以帮助本发明的理解，所述本发明的真实范围在附加权利要求中阐述。应当理解可以在所述步骤中做出修饰，而不背离本发明的精神。
具体实施方式
VII. 实施例
实验设计为测试命名为“Cobra”探针的许多新探针构建体。Cobra探针具有通过六甘醇（HEG）接头彼此连接的5'（报道物）序列和3'（锚定物）序列。Cobra探针设计为与模板序列杂交，其中Cobra探针的5'（报道物）末端与模板中的靶序列基本上互补。靶序列可以潜在改变，取决于存在何种模板。潜在变异性的区域称为“可变区”。这个方面在下文更详细地讨论。
Cobra探针的3'（锚定）序列设计为与靶序列5'（在模板上）的模板序列互补。如设计的，Cobra探针的锚定序列与实验中使用的任何模板完全互补。
每个Cobra探针在其报道物（在这种情况下5'）末端用荧光素进行标记。猝灭剂由加入反应混合物中的可溶性猝灭剂New Methylene Blue表示。
如下生成含或不含稳定碱基的多种Cobra探针：
5NS-CBRA-USRV 在9碱基报道区中不含有稳定碱基；
6ST-CBRA-USRV 在9碱基报道区中含有7个稳定碱基；和
7ST-CBRA-USRV 在9碱基报道区中含有7个稳定碱基，但在对应于模板中的可变区的报道区中心无稳定碱基。
不对称PCR用于如下扩增来自几种模板来源之一的模板DNA：
pK61WT – 具有生成图5中所示的扩增子的模板（第二条线），包括有下划线的AAC，匹配（与之互补）探针的报道物结构域的序列
pK61C3 – 具有生成图5中所示的扩增子的模板，但其中有下划线的碱基是cAC，与探针的报道物结构域错配的序列
pK61T3 – 具有生成图5中所示的扩增子的模板，但其中有下划线的碱基是tAC，与探针的报道物结构域错配的序列
pK61G2 – 具有生成图5中所示的扩增子的模板，但其中有下划线的碱基是AgC，与探针的报道物结构域错配的序列
pK61T1 – 具有生成图5中所示的扩增子的模板，但其中有下划线的碱基是AAt，与探针的报道物结构域错配的序列
pK61A1 – 具有生成图5中所示的扩增子的模板，但其中有下划线的碱基是AAa，与探针的报道物结构域错配的序列。
扩增反应在21 μM New Methylene Blue和Cobra探针的存在下执行。所得到的报道物/扩增子杂交物的解链温度使用荧光中的变化进行测定（New Methylene Blue猝灭Cobra探针荧光素，但仅当Cobra探针的探针部分与模板杂交时）。结果显示于下表中。
表 在PCR后解链分析中3种COBRA探针相对于WT和突变型扩增子的Tm数据
*5NS-CBRA-USRV具有2个峰，较低（第一个）峰用于这些计算
§更高的第二个峰用于这些计算
*5NS-CBRA-USRV具有2个峰，较低（第一个）峰用于这些计算
§更高的第二个峰用于这些计算
对于这个实验，所获得的最佳结果来自Cobra探针（7ST），其在报道区中包含稳定碱基，但无与靶序列的潜在可变区杂交的稳定碱基。这种探针允许区分“野生型”与突变型，并且还允许在突变型之间进行区分。
6ST探针（具有在报道区中的7个稳定碱基，包括在可变区中的稳定碱基）能够区分“野生型”和“突变型”，但不能在突变型之间进行区分。
5NS探针（缺乏稳定碱基）在这个实验中不能区分野生型和突变型。
应当理解本文描述的实施例和实施方案仅用于举例说明性目的，并且根据其的多种修饰或变化将是由本领域技术人员可想到的，并且应被包括在本申请的精神和范围以及附加权利要求的范围内。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 检测核酸差异的探针形式
<130> 25886 WO
<140> PCT/EP2010/004963
<141> 2010-08-13
<150> 61/234,189
<151> 2009-08-14
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的说明: 合成的
寡核苷酸"
<400> 1
tgtgtcgaga atatccaaga gacaggtttc t 31
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的说明: 合成的
寡核苷酸"
<400> 2
tgatggagaa acctgtctct tggatattct cgacacagca ggtcaagagg agtac 55

Claims (14)

1.包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针在制备用于检测生物学样品中靶核酸序列的存在或不存在的方法中的试剂盒中的用途，所述方法包括：
a. 使所述包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针与所述样品接触；和
b. 检测所述探针与所述靶核酸的结合的存在或不存在，
其中所述锚定物结构域和报道物结构域小于50%互补并通过非核苷接头连接，所述非核苷接头是六甘醇，并且所述锚定物结构域或报道物结构域在不存在所述靶核酸的情况下都不形成茎环；
和其中
（i）所述探针是不可通过聚合酶延伸的；
（ii）所述接头在所述锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与所述锚定物结构域连接，并且所述接头在所述报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与所述报道物结构域连接，其中所述锚定物结构域不与可检测标记连接，并且所述报道物结构域包含一个或多个稳定碱基，从而使得在报道物结构域和可能靶序列之间的解链温度中的差异得到强调；
（iii）所述锚定物结构域和所述报道物结构域各自包含与所述靶核酸的相同链互补的至少6个核苷酸的邻接序列；和/或
（iv）在所述锚定物结构域和所述靶核酸之间的杂交本身足以驱动所述探针在所述靶核酸的预期位置上的杂交。
2.权利要求1的用途，其中所述探针是不可通过聚合酶延伸的。
3.权利要求1的用途，其中所述检测步骤包括测量在所述报道物结构域和所述靶核酸之间形成的复合物的解链温度。
4.权利要求1的用途，其中所述标记是荧光标记，并且进一步包括使所述探针和样品与可溶性嵌入猝灭剂接触，从而使得当所述报道物结构域与所述靶核酸形成复合物时，所述猝灭剂改变来自所述标记的荧光。
5.权利要求1的用途，其中所述靶核酸是包含单核苷酸多态性（SNP）的人核酸，并且所述报道物结构域与所述SNP的一个等位基因100％互补。
6.权利要求1的用途，其中所述探针包含至少一个非天然核苷酸，其中与代替所述非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，所述非天然核苷酸增加所述报道物结构域的解链温度。
7.一种用于检测靶序列的存在或不存在的反应混合物，其包含：
a. 包含锚定物结合区和报道物结合区的靶核酸，和
b. 包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针，
其中所述锚定物结构域和报道物结构域小于50%互补并通过非核苷接头连接，所述非核苷接头是六甘醇，并且所述锚定物结构域或报道物结构域在不存在所述靶核酸的情况下都不形成茎环；和
其中
（i）所述探针是不可通过聚合酶延伸的；
（ii）所述接头在所述锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与所述锚定物结构域连接，并且所述接头在所述报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与所述报道物结构域连接，其中所述锚定物结构域不与可检测标记连接，并且所述报道物结构域包含一个或多个稳定碱基，从而使得在报道物结构域和可能靶序列之间的解链温度中的差异得到强调；
（iii）所述锚定物结构域和所述报道物结构域各自包含与所述靶核酸的相同链互补的至少6个核苷酸的邻接序列；和/或
（iv）在所述锚定物结构域和所述靶核酸之间的杂交本身足以驱动所述探针在所述靶核酸的预期位置上的杂交。
8.权利要求7的反应混合物，其中所述标记是荧光标记，并且进一步包括可溶性嵌入猝灭剂，其中当所述报道物结构域与所述靶核酸形成复合物时，所述猝灭剂改变来自所述标记的荧光。
9.权利要求7的反应混合物，其中所述靶核酸是包含单核苷酸多态性（SNP）的人核酸，并且所述报道物结构域与所述SNP的一个等位基因100％互补。
10.一种可检测标记的探针，其包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域，其中：
所述锚定物结构域和报道物结构域小于50%互补并通过非核苷接头连接，所述非核苷接头是六甘醇；
所述锚定物结构域或报道物结构域在不存在所述靶核酸的情况下都不形成茎环；和
其中
（i）所述探针是不可通过聚合酶延伸的；
（ii）所述接头在所述锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与所述锚定物结构域连接，并且所述接头在所述报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与所述报道物结构域连接，其中所述锚定物结构域不与可检测标记连接，并且所述报道物结构域包含一个或多个稳定碱基，从而使得在报道物结构域和可能靶序列之间的解链温度中的差异得到强调；
（iii）所述锚定物结构域和所述报道物结构域各自包含与所述靶核酸的相同链互补的至少6个核苷酸的邻接序列；和/或
（iv）在所述锚定物结构域和所述靶核酸之间的杂交本身足以驱动所述探针在所述靶核酸的预期位置上的杂交。
11.一种用于检测靶序列的存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包含：
a. 根据权利要求10的探针；和
b. 选自盐、缓冲剂、核酸酶抑制剂、三磷酸核苷、DNA聚合酶和/或寡核苷酸引物的一种或多种试剂。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含可溶性嵌入猝灭剂，从而使得当所述报道物结构域与所述靶核酸形成复合物时，所述猝灭剂改变来自所述标记的荧光。
13.权利要求11的试剂盒，其中所述探针包含至少一个非天然核苷酸，其中与代替所述非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，所述非天然核苷酸增加所述报道物结构域的解链温度。
14.一种检测生物学样品中靶核酸序列的存在或不存在的不用于诊断疾病的方法，所述方法包括：
a. 使包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针与所述样品接触；和
b. 检测所述探针与所述靶核酸的结合的存在或不存在，
其中所述锚定物结构域和报道物结构域小于50%互补并通过非核苷接头连接，所述非核苷接头是六甘醇，并且所述锚定物结构域或报道物结构域在不存在所述靶核酸的情况下都不形成茎环；
和其中
（i）所述探针是不可通过聚合酶延伸的；
（ii）所述接头在所述锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与所述锚定物结构域连接，并且所述接头在所述报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与所述报道物结构域连接，其中所述锚定物结构域不与可检测标记连接，并且所述报道物结构域包含一个或多个稳定碱基，从而使得在报道物结构域和可能靶序列之间的解链温度中的差异得到强调；
（iii）所述锚定物结构域和所述报道物结构域各自包含与所述靶核酸的相同链互补的至少6个核苷酸的邻接序列；和/或
（iv）在所述锚定物结构域和所述靶核酸之间的杂交本身足以驱动所述探针在所述靶核酸的预期位置上的杂交。
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