JP2014533506A - 高度に相同的なゲノム領域での突然変異の検出 - Google Patents
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-
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Abstract
Description
本出願は、2011年11月16日に出願の米国特許仮出願第61/560,799号の優先権を主張し、その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、例示として提供され、本発明を限定するものでは決してない以下の実施例を参照することによって説明される。当技術分野で周知である標準技術、または下で具体的に記載される技術を利用した。
Claims (50)
- 第2のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上の変異体を同定する方法であって、
(a)前記核酸のアリコートを、限定的プライマー、過剰プライマー、および前記核酸の標的鎖上の対象の前記遺伝子座とハイブリダイズするように設計されるプローブと一緒にインキュベートすることと、
(b)前記アリコートを用いて非対称PCRを実施して、プローブとハイブリダイズする標的鎖に対応する過剰のアンプリコンを生成し、それによってプローブ−アンプリコンエレメントを生成することと、
(c)混合液を加熱したときの色素からの蛍光を測定することによって、飽和結合色素との混合液中のプローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成することと、
(d)融解曲線を分析して変異体が存在するかどうか判定することと
を含む方法。 - 対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖が増幅され、第2のゲノム領域は増幅されない、請求項1に記載の方法。
- プローブが非標識である、請求項1または2に記載の方法。
- プローブがその3’末端でブロックされる、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが遺伝子の野生型配列に相補的である配列を有する、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- プローブのTmは過剰プライマーおよび限定的プライマーの最も低いTmより約5℃未満低い、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
- 過剰プライマーが、対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上で独特である配列にアニールし、限定的プライマーが、第2のゲノム領域に実質的に相同的である配列にアニールし、高い遺伝子タイピング感度のためにアンプリコンサイズを最小にするために変異体の近くに設定される、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- 変異体がCFTR遺伝子のA455Eである、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- 変異体がCFTR遺伝子の1461ins4である、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- 過剰プライマーが5’−gggccatgtgcttttcaaact−3’(配列番号5)のヌクレオチド配列を有する、請求項8または9に記載の方法。
- 限定的プライマーが5’−gaactaccttgcctgctcca−3’(配列番号6)のヌクレオチド配列を有する、請求項8または9に記載の方法。
- プローブが5’−aaccgccaacaactgtcctctttctat−3’(配列番号7)のヌクレオチド配列を有し、その3’末端でブロックされる、請求項8または9に記載の方法。
- 患者の遺伝子型、および疾患または障害と関連する疾患または障害を引き起こす変異体遺伝子配列についての先験的な知識に基づいて、前記患者の前記疾患または障害を検出する方法であって、変異体遺伝子配列は、第2のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖の上にあり、
(a)対象の遺伝子座を有する核酸分子および対象の遺伝子座に実質的に相同的である第2のゲノム領域を含有する生体試料を患者から得ることと、
(b)生体試料の一部を、限定的プライマー、過剰プライマーおよびプローブを含む非対称PCRにかけて、プローブ−アンプリコンエレメントを生成することと、
(c)前記プローブ−アンプリコン融解エレメントを高分解能熱融解分析にかけることによって融解曲線を生成することと、
(d)融解曲線を分析して患者が疾患または障害を引き起こす変異体を有するかどうか判定することと
を含む方法。 - 対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖が増幅され、第2のゲノム領域は増幅されない、請求項13に記載の方法。
- プローブが非標識である、請求項13または14に記載の方法。
- プローブがその3’末端でブロックされる、請求項13乃至15のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが遺伝子の野生型配列に相補的である配列を有する、請求項13乃至16のいずれか1項に記載の方法。
- プローブのTmは過剰プライマーおよび限定的プライマーの最も低いTmより約5℃未満低い、請求項13乃至17のいずれか1項に記載の方法。
- 過剰プライマーが、対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上で独特である配列にアニールし、限定的プライマーが、第2のゲノム領域に実質的に相同的である配列にアニールし、高い遺伝子タイピング感度のためにアンプリコンサイズを最小にするために変異体の近くに設定される、請求項13乃至18のいずれか1項に記載の方法。
- 変異体がCFTR遺伝子のA455Eである、請求項13乃至19のいずれか1項に記載の方法。
- 変異体がCFTR遺伝子の1461ins4である、請求項13乃至19のいずれか1項に記載の方法。
- 過剰プライマーが5’−gggccatgtgcttttcaaact−3’(配列番号5)のヌクレオチド配列を有する、請求項20または21に記載の方法。
- 限定的プライマーが5’−gaactaccttgcctgctcca−3’(配列番号6)のヌクレオチド配列を有する、請求項20または21に記載の方法。
- プローブが5’−aaccgccaacaactgtcctctttctat−3’(配列番号7)のヌクレオチド配列を有し、その3’末端でブロックされる、請求項20または21に記載の方法。
- 患者の遺伝子型、および疾患または障害と関連する疾患または障害を引き起こす変異体遺伝子配列についての先験的な知識に基づいて、前記患者の前記疾患または障害を検出する方法であって、変異体遺伝子配列は、第2のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖の上にあり、
(a)対象の遺伝子座を有する核酸分子および対象の遺伝子座に実質的に相同的である第2のゲノム領域を含有する生体試料を患者から得ることと、
(b)生体試料の一部について非対称PCRを実施してアンプリコンを生成することと、
(c)前記一部を非標識プローブアッセイにかけて融解曲線を生成することと、
(d)融解曲線を分析して患者が疾患または障害を引き起こす変異体を有するかどうか判定することと
を含む方法。 - 非標識プローブアッセイが、非標識プローブをアンプリコン上の対象の遺伝子座とハイブリダイズさせてプローブ−アンプリコンエレメントを形成することと、飽和色素をプローブ−アンプリコンエレメントに加えて混合液を形成することと、混合液を加熱したときの前記色素からの蛍光を測定することによって、プローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成することとを含む、請求項25に記載の方法。
- 対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖が増幅され、第2のゲノム領域は増幅されない、請求項25または26に記載の方法。
- プローブが非標識である、請求項25乃至27のいずれか1項に記載の方法。
- プローブがその3’末端でブロックされる、請求項25乃至28のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが遺伝子の野生型配列に相補的である配列を有する、請求項25乃至29のいずれか1項に記載の方法。
- プローブのTmは過剰プライマーおよび限定的プライマーの最も低いTmより約5℃未満低い、請求項25乃至30のいずれか1項に記載の方法。
- 過剰プライマーが、対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上で独特である配列にアニールし、限定的プライマーが、第2のゲノム領域に実質的に相同的である配列にアニールし、高い遺伝子タイピング感度のためにアンプリコンサイズを最小にするために変異体の近くに設定される、請求項25乃至31のいずれか1項に記載の方法。
- 変異体がCFTR遺伝子のA455Eである、請求項25乃至32のいずれか1項に記載の方法。
- 変異体がCFTR遺伝子の1461ins4である、請求項25乃至32のいずれか1項に記載の方法。
- 過剰プライマーが5’−gggccatgtgcttttcaaact−3’(配列番号5)のヌクレオチド配列を有する、請求項33または34に記載の方法。
- 限定的プライマーが5’−gaactaccttgcctgctcca−3’(配列番号6)のヌクレオチド配列を有する、請求項33または34に記載の方法。
- プローブが5’−aaccgccaacaactgtcctctttctat−3’(配列番号7)のヌクレオチド配列を有する、請求項33または34に記載の方法。
- (a)5’−gggccatgtgcttttcaaact−3’(配列番号5)のヌクレオチド配列を有するプライマー、
(b) 5’−gaactaccttgcctgctcca−3’(配列番号6)のヌクレオチド配列を有するプライマー、
(c)5’−aaccgccaacaactgtcctctttctat−3’(配列番号7)のヌクレオチド配列を有するプローブ、および
(d)患者からの生体試料を用いて嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子第9エクソン変異体を検出するための診断検査を実施するための説明書
を含むキット。 - プローブがその3’末端でブロックされる、請求項38に記載のキット。
- 疾患または障害を引き起こす変異体を含有し、第2のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有する核酸の熱融解分析に有用であるプライマーおよびプローブを設計する方法であって、
(a)疾患または障害を引き起こす変異体を有し、第2のゲノム領域に実質的に相同的である核酸の上にある、疾患の対象の遺伝子座を選択することと、
(b)適切にプログラムされたコンピュータを用いて非対称PCRで使用するためのプライマー対を設計することであって、一方のプライマーは、対象の遺伝子座の独特な非相同領域とハイブリダイズし、第2のゲノム領域とハイブリダイズしないようにコンピュータを用いて設計され、他方のプライマーは、アンプリコンサイズを最小にするために、対象の遺伝子座の変異体の可能な限り近くにハイブリダイズするようにコンピュータを用いて設計されることと、
(c)適切にプログラムされたコンピュータを用いて対象の遺伝子座の1つの鎖にハイブリダイズするためのプローブを設計することであって、プローブのヌクレオチド配列は、核酸の野生型配列または変異体配列に相補的であることと
を含む方法。 - プローブが核酸の野生型配列に相補的である、請求項40に記載の方法。
- 独特な非相同領域とハイブリダイズするプライマーが過剰プライマーであり、相同領域とハイブリダイズするプライマーが限定的プライマーである、請求項40または41に記載の方法。
- プローブがその3’末端でブロックされる、請求項40乃至42のいずれか1項に記載の方法。
- 第2のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上の変異体を検出する方法であって、
(a)前記核酸のアンプリコンであり、第2のゲノム領域のアンプリコンでない、対象の遺伝子座を有するアンプリコンを提供することと、
(b)非標識プローブをアンプリコンとハイブリダイズさせてプローブ−アンプリコンエレメントを生成することと、
(c)混合液を加熱したときの色素からの蛍光を測定することによって、飽和結合色素との混合液中のプローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成することと、
(d)融解曲線を分析して変異体が核酸中に存在するかどうか判定することと
を含む方法。 - プローブがその3’末端でブロックされる、請求項44に記載の方法。
- プローブが遺伝子の野生型配列に相補的である配列を有する、請求項44または45に記載の方法。
- 変異体がCFTR遺伝子のA455Eである、請求項44乃至46のいずれか1項に記載の方法。
- 変異体がCFTR遺伝子の1461ins4である、請求項44乃至46のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが5’−aaccgccaacaactgtcctctttctat−3’(配列番号7)のヌクレオチド配列を有し、その3’末端でブロックされる、請求項47または48に記載の方法。
- 第2のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上の変異体を同定する系であって、
(a)複数の試料負荷ゾーンを含み、前記試料負荷ゾーンがそれぞれ、対象の遺伝子座を有する核酸を用いる別々の非対称PCRを収容するように構成されている微流動デバイスであって、
限定的プライマー、過剰プライマーおよび非標識プローブを負荷される少なくとも1つの試料負荷ゾーンを含む微流動デバイスと、
(b)前記試料負荷ゾーンで非対称PCRから得られるプローブ−アンプリコンエレメントを熱融解し、前記プローブ−アンプリコンエレメントの蛍光導関数融解曲線を生成するように構成された、加熱エレメント、蛍光励起光源および蛍光捕集口を含むHRMAデバイスと、
(c)第2のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上の変異体を同定するように、前記HRMAデバイスによって生成される融解曲線を分析するように構成されている、蛍光導関数融解曲線分析デバイスと
を含む系。
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