JP7242526B2 - 高速核酸融解分析 - Google Patents
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Description
図4A~図4F及び図5A~図5Fは、PCR反応で得られた因子2のDNAの融解(解離、変性)分析に関する。図4A~図4Fはそれぞれ、微小流体チップ(すなわち、図2の反応チップ204)の8個のチャネルにおいて融解された異なる因子の2DNA試料に対するDNA融解曲線(変性曲線又は解離曲線とも称される)の例示的なマイナスの微分を明示する。微小流体チップの各チャネルについて、上昇速度1℃/秒(図4A)、5℃/秒(図4B)、10℃/秒(図4C)、15℃/秒(図4D)、及び20℃/秒(図4F)で試料温度を上昇させることにより、因子2のDNA試料に対して複数の融解反応が行われる。したがって、その後、1℃/秒、5℃/秒、10℃/秒、15℃/秒、及び20℃/秒の速度で各チャネルの試料を融解させる。
図6A~図6Cは、20℃/秒の速度で試料温度を上昇させることによって融解された因子5、MTHFR 677及びMTHFR 1298のDNAの融解分析に関する。微小流体チップは、それぞれが図形402によって示される野生型、ホモ接合、及びヘテロ接合の試料の1つを有し得る8個のチャネルを有する。
図7Aは、因子2のDNA試料に対する温度に応じて正規化された蛍光Fを表す融解曲線を明示する。図7Bは、因子2のDNA試料に対する温度に応じて正規化された蛍光のマイナスの微分-d(F)/dTを示す。試料中の二本鎖DNAの解離を達成するため、試料温度は50℃/秒の速度で上昇する。図形402によって示されるように、微小流体チップのチャネル1~チャネル3及びチャネル6は野生型因子2のDNAを有し(黒色の曲線)、チャネル5は、ホモ接合突然変異を含む因子2のDNAを有し(青色の曲線)、チャネル7及びチャネル8はヘテロ接合突然変異を含む因子2のDNAを有する(赤色の曲線)。
図8Aは、MTHFR 677のDNA試料に対する温度に応じて正規化された蛍光Fを明示する。図8Bは、MTHFR 677のDNA試料に対する温度に応じて正規化された蛍光のマイナスの微分-d(F)/dTを示す。試料中の二本鎖DNAの解離を達成するため、試料温度は50℃/秒の速度で上昇する。微小流体チップのチャネル1、チャネル2、チャネル4及びチャネル6は野生型MTHFR 677のDNAを有し(黒色の曲線)、チャネル3はホモ接合突然変異を含むMTHFR 677のDNAを有し(青色の曲線)、チャネル5、チャネル7及びチャネル8はヘテロ接合突然変異を含むMTHFR 677のDNAを有する(赤色の曲線)。
標準ホスホラミダイト化学(Integrated DNA Technologies)によってプライマー、コントロール及び検量用試料を合成し、それらの配列を表1に示す。
非限定的な一実施形態では、F2 c.*97G>A、F5 c.1601G>A、MTHFR c.665C>T及びMTHFR c.1286A>Cに対する遺伝子型決定アッセイを図1A、図2及び図3に記載される測定器で行った。最初に384ウェルプレート(すなわち114、図1B)に、各アッセイに対するプライマー混合物及び分析される各試料に対するテンプレート混合物を含む試薬を手作業で充填した。各プライマー混合物は、2つのプライマーと、二本鎖内部温度コントロールを構成する2つのオリゴヌクレオチドと、dNTPと、Tris、KCl、MgCl2、ベタイン、DMSO及びTween 20を含む一般的なバッファー試薬とを含んだ。各テンプレート混合物は、抗Taq抗体を含むTaq DNAポリメラーゼの変異体(例として、限定せずに、Titanium(商標)Taq、Takara Bio USA)と、LCGreen Plus色素(BioFire Defense)と、ウシ血清アルブミン(BSA)と、上に列挙される一般的なバッファー成分と、テンプレートDNAとを含んだ。合成テンプレート(ホモ接合野生型、ホモ接合突然変異体、又はヘテロ接合)、ヒトゲノムDNA(4つの遺伝子座のそれぞれで野生型)、又は水(テンプレートなしコントロールのため)のいずれかからなる各テンプレート混合物にテンプレートDNAを最後に添加した。PCRの直前までテンプレート混合物(ポリメラーゼ/抗体、BSA、色素及びテンプレート)からプライマー混合物(プライマー、内部温度コントロール、dNTP)を分離することにより、非特異的増幅を制限した。
チャネル1:野生型ゲノムDNA
チャネル2:野生型合成テンプレート
チャネル3:ヘテロ接合合成テンプレート
チャネル4:ホモ接合突然変異体合成テンプレート
チャネル5:ヘテロ接合合成テンプレート
チャネル6:野生型合成テンプレート
チャネル7:ホモ接合突然変異体合成テンプレート
チャネル8:テンプレートなしのコントロール
PCRの後、1秒当たり30フレームのカメラ取込み率で65℃~95℃で行われるHSMのため、同じ微小流体チャネル位置に試料は留まった。最も低速で開始して最も高速まで進行する、又は最も高速で開始して最も低速まで進行するいずれかで、0.13℃/秒、0.25℃/秒、0.5℃/秒、1℃/秒、2℃/秒、4℃/秒、8℃/秒、16℃/秒及び32℃/秒で各生成物を9回融解した。対応する融解時間及びデータ取得密度を表3に与える。
図13A~図13Iは、単一ヌクレオチド変異体を含むPCR産物融解曲線に対する融解速度の効果を明示する。一実施形態では、MTHFR c.1286A>C遺伝子座を包含する46bpのPCR産物を増幅し、内部温度コントロール(ITC)と共に異なる速度で繰り返し融解した。チャネル間の任意の温度変化を補正するため、指数関数的バックグラウンド除去、正規化、及び内部温度コントロールに対する線形温度調整によって融解データを処理した。各融解速度の融解曲線のマイナスの微分プロットは、黒色線として2つの野生型試料(WT)、青色線として2つのホモ接合変異体(HOM)、及び赤色線として2つのヘテロ接合体(HET)を示す。PCR産物はおよそ70℃~83℃で融解するのに対し、内部温度コントロールはより高いおよそ83℃~87℃で融解する。見かけ上の融解温度は、融解速度に伴って上昇する(図20Aを参照されたい)。重複遺伝子型は明確にクラスター化し、より低温のヘテロ二本鎖ピークは上昇速度が増すにつれて、高さが増し、より高いピークにより近い高さとなる。32℃/秒において、ヘテロ二本鎖及びホモ二本鎖のピークが、低いデータ密度のため、単一で幅広いピークへと併合する。それにもかかわらず、遺伝子型決定は、全ての速度で明らかに可能である。
図14は、低速(0.13℃/秒)、高速(8℃/秒)及び超高速(32℃/秒)の融解速度で調べた4つのSNV遺伝子座(F2 c.*97G>A、F5 c.1601G>A、MTHFR c.665C>T、及びMTHFR c.1286A>C)の融解曲線のマイナスの微分を明示する。具体的には、バックグラウンド除去、正規化及び内部温度コントロールに対する温度調整(内部温度コントロール(ITC)ピークは図示されない)の後の正規化されたマイナスの微分が3種類の融解速度で示される。各パネルは、野生型(黒色)、ホモ接合変異体(青色)及びヘテロ接合体(赤色)を含む3種類の遺伝子型の合成複製物を含む。0.13℃/秒での小さいヘテロ二本鎖のピークは、8℃/秒ではより大きくなり、ホモ二本鎖のピークの高さに類似するのに対し、ホモ接合ピークはより高くより狭くなる。32℃/秒では、ヘテロ接合二本鎖のピークは、データ収集速度がホモ接合ピークの鋭さを制限することから単一で幅広いピークへと併合するが、全ての遺伝子型は、容易に識別可能のままである。
Claims (34)
- 核酸高速融解分析を行う方法であって、
1以上の核酸試料を有する微小流体デバイスを準備することと、
前記1以上の核酸試料と通信状態にある画像化システムを準備することと、
前記1以上の核酸試料と熱伝達状態にある熱システムを準備することと、
核酸解離を達成するため前記1以上の核酸試料の温度を、1℃/秒~50℃/秒の範囲から選択される上昇速度で前記熱システムによって上昇させることと、
核酸解離中に前記1以上の核酸試料の画像を取得して、各核酸試料に対して融解プロファイルを生成することと、
前記融解プロファイルに基づいて核酸を遺伝子型決定することと、
ここで、遺伝子型が、使用されている融解速度に対してクラス間とクラス内の距離の閾値の比として計算される判別値を使用することによって分類され、
その比は、x軸に沿った各値における2つのクラス間曲線間の差の絶対値の平均をx軸に沿った各値における2つのクラス内曲線間の差の絶対値の平均で割った値として計算され、
前記クラス間距離が遺伝子型間の違いを反映し、前記クラス内距離が同じ遺伝子型の複製物間の違いを反映する、
を含む、方法。 - 前記微小流体デバイスが、微小流体カートリッジ及び反応チップを備える、請求項1に記載の方法。
- 前記反応チップが1以上のマイクロチャネルを備える、請求項2に記載の方法。
- 前記1以上の試料が前記反応チップの前記1以上のマイクロチャネルに存在する場合に、前記核酸高速融解分析が行われる、請求項3に記載の方法。
- 前記核酸高速融解分析が、1℃/秒~8℃/秒の範囲から選択される速度で前記1以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸高速融解分析が、8℃/秒~16℃/秒の範囲から選択される速度で前記1以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1以上の核酸がそれぞれ100bp長未満である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微小流体デバイスが、前記核酸高速融解分析を行う前に準備される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1以上の核酸の増幅が、前記核酸高速融解分析に先行する、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1以上の核酸試料がそれぞれ、核酸の融解温度よりも実質的に高い融解温度を有する少なくとも1つの内部温度コントロール配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 0.13℃/秒~32℃/秒の間の複数の上昇速度で前記1以上の核酸試料について融解曲線を連続して得て、最も高い遺伝子型判別に対応する最適な上昇速度を決定することを更に含み、前記遺伝子型判別が0.13℃/秒~32℃/秒の間の複数の上昇速度に対して計算される、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 使用される前記上昇速度がクラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それがノーコール試料の数、並びにコールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する、請求項1に記載の方法。
- 6より大きいホモ接合体遺伝子型判別値を得ることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 5より大きいヘテロ接合体遺伝子型判別値を得ることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸高速融解分析を行うシステムであって、
1以上の核酸試料を有する微小流体デバイスと、
前記1以上の核酸試料と熱伝達状態にある熱システムであって、前記1以上の核酸試料の温度が、核酸解離を達成するため、1℃/秒~50℃/秒の範囲から選択される速度で前記熱システムによって上昇される、熱システムと、
前記1以上の核酸試料と通信状態にある画像化システムであって、前記画像化システムが、各核酸試料に対して融解プロファイルを生成するとともに、前記融解プロファイルに基づいて核酸の遺伝子型決定をするため、核酸解離中に前記1以上の核酸試料の画像を取得する、画像化システムと、
ここで、遺伝子型が、使用されている融解速度に対してクラス間とクラス内の距離の閾値の比として計算される判別値を使用することによって分類され、
その比は、x軸に沿った各値における2つのクラス間曲線間の差の絶対値の平均をx軸に沿った各値における2つのクラス内曲線間の差の絶対値の平均で割った値として計算され、
前記クラス間距離が遺伝子型間の違いを反映し、前記クラス内距離が同じ遺伝子型の複製物間の違いを反映する、
を備える、システム。 - 前記微小流体デバイスが、微小流体カートリッジ及び反応チップを備える、請求項15に記載のシステム。
- 前記反応チップが1以上のマイクロチャネルを備える、請求項16に記載のシステム。
- 前記1以上の試料が前記反応チップの前記1以上のマイクロチャネルに存在する場合に、前記核酸高速融解分析が行われる、請求項17に記載のシステム。
- 前記核酸高速融解分析が、1℃/秒~8℃/秒の範囲から選択される速度で前記1以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる、請求項15~18のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記核酸高速融解分析が、8℃/秒~16℃/秒の範囲から選択される速度で前記1以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる、請求項15~18のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記1以上の核酸がそれぞれ100bp長未満である、請求項15~20のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記微小流体デバイスが、前記核酸高速融解分析を行う前に準備される、請求項15~21のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記1以上の核酸の増幅が、前記核酸高速融解分析に先行する、請求項15~22のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記1以上の核酸試料がそれぞれ、前記核酸の融解温度よりも実質的に高い融解温度を有する少なくとも1つの内部温度コントロール配列を含む、請求項15~23のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記融解プロファイルが、最も高い遺伝子型判別に対応する最適な上昇速度を決定するため、0.13℃/秒~32℃/秒の間の複数の上昇速度で前記1以上の核酸試料について連続して得られ、前記遺伝子型判別が0.13℃/秒~32℃/秒の間の複数の上昇速度に対して計算される、請求項15~24のいずれか一項に記載のシステム。
- 最適な上昇速度がクラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それがノーコール試料の数、並びにコールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する、請求項15に記載のシステム。
- 6より大きいホモ接合体遺伝子型判別値を得ることを更に含む、請求項15に記載のシステム。
- 5より大きいヘテロ接合体遺伝子型判別値を得ることを更に含む、請求項15に記載のシステム。
- 核酸高速融解分析を行う方法であって、
1以上の核酸試料を有する微小流体デバイスを準備することと、
前記1以上の核酸試料と通信状態にある画像化システムを準備することと、
前記1以上の核酸試料の温度を上昇させて核酸変性を達成するための前記1以上の核酸試料と熱伝達状態にある熱システムを準備することと、
複数の融解速度において前記1以上の核酸試料について複数の融解曲線を連続して得ることと、
各融解速度に対して、クラス間対クラス内の距離の比として前記複数の融解曲線に対して遺伝子型判別を計算することと、
ここで、クラス間対クラス内の距離の比は、x軸に沿った各値における2つのクラス間曲線の差の絶対値をx軸に沿った各値における2つのクラス内曲線の差の絶対値の平均で除した値の平均として計算され、前記クラス間距離が異なる遺伝子型を有する融解曲線間の違いを反映し、前記クラス内距離が同じ遺伝子型の融解曲線間の違いを反映する;
前記遺伝子型判別を最大化する最適な融解速度を同定することと、
を含む、方法。 - 遺伝子型が、使用されている融解速度に対してクラス間及びクラス内の距離の閾値を使用することによって分類される、請求項29に記載の方法。
- 前記融解曲線が、最も高い遺伝子型判別に対応する最適な融解速度を決定するため、0.13℃/秒~32℃/秒の間の複数の融解速度で前記1以上の核酸試料について連続して得られ、前記遺伝子型判別が0.13℃/秒~32℃/秒の間の複数の融解速度に対して計算される、請求項29又は30に記載の方法。
- 前記最適な融解速度がクラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それがノーコール試料の数、並びにコールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する、請求項31に記載の方法。
- 6より大きいホモ接合体遺伝子型判別を得ることを更に含む、請求項29~32のいずれか一項に記載の方法。
- 5より大きいヘテロ接合体遺伝子型判別を得ることを更に含む、請求項29~33のいずれか一項に記載の方法。
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