JP2002355081A - オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法及び遺伝子の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】反応時間の短縮、至適反応温度域の拡大、操作
性及び応用性の向上した自己集合体の作製方法並びに該
方法を利用した簡便な遺伝子の検出方法を提供する。 【解決方法】３’側、中央及び５’側領域の３領域から
成り中央領域を互いに相補的且つ３’側及び５’側領域
を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形
成用プローブと、３’側及び５’側領域の２領域から成
り３’側及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列と
した複数対の架橋プローブを用いて、該架橋プローブを
該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架
橋することが可能な塩基配列とし、該プローブをハイブ
リダイゼーションさせることによりオリゴヌクレオチド
が自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させる
ようにした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ダイマーを形成す
る一対のオリゴヌクレオチドの複数対とそのダイマーを
架橋する一対のオリゴヌクレオチドの複数対を使用する
オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法、該方
法により形成された自己集合体、該自己集合体の検出方
法、および該自己集合体の作製方法を利用するターゲッ
ト遺伝子の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一対のオリゴヌクレオチドが相補的塩基
配列に従って正確に結合するハイブリダイゼーション法
（Judy,M.,Geoffrey,W.Hybridization of Nucleic Acid
s Immobilized on Solid Supports.Analytical Biochem
istry,138,267-284,1984）は、サザンブロット法（Sout
hern,E.M.Detection of specific sequences among DNA
fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol.
Biol.,98,503-517,1975）、ノーザンブロット法（Thoma
s,P.S.Hybridization of denatured RNA and small DNA
fragmenta transferred to nitrocellulose. Proc.Nat
l.Acad. Sci.USA, 77,5201-5205,1980）、in situ hibl
ydization法（Jones,K.W.,et al. Chromosomal and nuc
lear location of mouse satellite DNA in individual
cells. Nature. 225,912-915,1970）や近年汎用されて
いるＤＮＡチップ法（Marshall,A., Hodgson,J. DNA ch
ips: an array of possibilities. Nat Biotechnol. 1
6,27-31,1998）などの遺伝子を解析する基本技術として
広く応用されている。

【０００３】また、ターゲット遺伝子の検出感度を上げ
るために開発された耐熱性ＤＮＡリガーゼという酵素を
使って遺伝子を増幅するＬＣＲ法（United States Pate
nt No.5,792,607）や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼという
酵素を使って遺伝子を増幅するＰＣＲ法（Saiki,R.,S.S
charf,F.Faloona,et al.Enzymatic amplification ofβ
-globin genomic sequence and restriction site anal
ysis for diagnosisof sickle cell anemia.Science.23
0,1350-1354(1985)）などの遺伝子増幅法も、基本的に
はこのオリゴヌクレオチドが正確にハイブリダイゼーシ
ョンすることを利用したものである。

【０００４】しかし、サザンブロット法、ノーザンブロ
ット法、in situ hiblydization法、ＤＮＡチップ法で
は、遺伝子を増幅することができないために微量の遺伝
子を検出することが困難であり、また、ＬＣＲ法やＰＣ
Ｒ法では、その増幅操作に加えて検出するための煩雑な
操作が必要なため高コストであった。

【発明が解決しようとする課題】

【０００５】上記の問題点に鑑み、本発明者等は、酵素
を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した（USP6,2
61,846、日本特許３２６７５７６号及びEP1002877A）。
この方法は、３個所の領域から構成される一対のプロー
ブ（HoneyComb Probe、以下ＨＣＰと称する）を用いる
方法であり、第１プローブと第２プローブの各々の３個
所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反
応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする
様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、
複数の一対のプローブを反応させた場合、お互いにハイ
ブリダイズし、プローブの自己集合によりオリゴヌクレ
オチドによる自己集合体を形成させることができる（Pr
obe alternation link self-assembly reaction、以
下、このオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方
法をＰＡＬＳＡＲ法と称する）。

【０００６】本発明は、このＰＡＬＳＡＲ法に検討を加
え、オリゴヌクレオチドの自己集合による自己集合体の
作製において、その二本鎖の規則的な高次構造の形成に
かかる反応時間を短縮し、至適反応温度域を広くし、そ
の操作性と応用性を高くするために更なる改良を試みた
ものである。

【０００７】本発明は、複数対のダイマー形成用プロー
ブで形成した複数のダイマーに対して、複数対の架橋プ
ローブでそのダイマーを架橋することにより、二本鎖の
規則的な高次構造の形成にかかる反応時間を短縮し、ま
た、至適反応温度域を広くし、操作性と応用性を高くす
ることを可能としたオリゴヌクレオチドによる自己集合
体の作製方法、及び得られた自己集合体の性質を利用し
た簡便な遺伝子の検出方法を提供することを目的とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らが報告した酵
素を使用しない新規な上記等温核酸増幅法は、３個所の
領域から構成される一対のプローブを用いる方法である
が、この第１プローブと第２プローブの各々の３個所の
領域はお互いに相補的な塩基配列を有しているため、両
者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイ
ズする様にそれぞれの領域が競い合うようにして反応す
るため、ＰＡＬＳＡＲ法では、厳密な反応温度と３０分
以上の反応時間が必要であった。

【０００９】また、本発明者らは上記したＰＡＬＳＡＲ
法及びライゲーション反応を用いた方法を既に提案した
（特願２０００−２６１６８７）。このライゲーション
反応を利用した方法では、図２（ａ）に示したように、
一対のオリゴヌクレオチドの複数対で形成されるダイマ
ーの中央領域（Ｙ）を特定のターゲット遺伝子と相補的
になるように設定しておき、その相補的な領域をあらか
じめ切断した場合、図２（ｂ）に示したように切断され
た部分は特定のターゲット遺伝子とハイブリダイゼーシ
ョンした後、ライゲーション反応により連結されるが、
一方では特定のターゲット遺伝子とのハイブリダイゼー
ションと同時に、図２（ｃ）に示したようなダイマーの
形成により、図２（ｄ）に示したような複合体を形成す
るために、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーショ
ン効率が低下するという欠点があった。

【００１０】上記した課題を解決するために本発明者ら
は鋭意研究の結果、一対のダイマー形成用プローブで形
成したダイマーに対して、一対の架橋プローブでそのダ
イマーを架橋することにより、ＰＡＬＳＡＲ法における
反応時間を短縮し、また、至適反応温度域を広くするこ
とを見出した。加えて、図１（ａ）に示したように、一
対のオリゴヌクレオチドの複数対で形成されるダイマー
の中央領域（Ｂ）を特定のターゲット遺伝子と相補的に
なるように設定しておき、その相補的な領域をあらかじ
め切断した場合、図１（ｂ）に示したように切断された
部分は特定のターゲット遺伝子とハイブリダイゼーショ
ンした後、ライゲーション反応により連結され、一方、
図１（ｃ）に示したようなダイマーが形成されてもそれ
以上反応しないために複合体が形成されず、ターゲット
遺伝子との高いハイブリダイゼーション効率が得られる
ことを見出し本発明を完成するに至った。

【００１１】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体の作製方法は、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリ
ゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、
中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリ
ゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列と
し、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基
配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１
番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順
番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各
オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つ
の領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び
５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の
架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番
目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系と
を有し、該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブ
より形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配
列とし、該プローブをハイブリダイゼーションさせるこ
とにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の
規則的な高次構造を形成させることを特徴とする。

【００１２】上記自己集合体の作製方法において、ｎ＝
１の場合、第１の系のダイマープローブと第２の系の架
橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り
存在する。ｎ＝1の場合の１例として、上記プローブの
塩基配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド
の３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチ
ドの３’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオ
チドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレ
オチドの５’側領域、第２の系のＮｏ．４−オリゴヌク
レオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌ
クレオチドの３’側領域、第２の系のＮｏ．３−オリゴ
ヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリ
ゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基
配列としたものを用いることができる。

【００１３】ｎ＝1の場合の別の例として、上記プロー
ブの塩基配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオ
チドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌク
レオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌ
クレオチドの５’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴ
ヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリ
ゴヌクレオチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−
オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な
塩基配列としたものを用いることができる。

【００１４】上記自己集合体の作製方法において、ｎ≧
２の場合、第１、第３、・・、第（２ｎ−１）の系のダ
イマー形成用プローブと第２、第４、・・、第２ｎの系
の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２
通り存在する。ｎ≧２の場合の１例として、上記プロー
ブの塩基配列を、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第
（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
の５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域、第（２ｎ−２）番目の
系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第
（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
の３’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の
系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、ダイ
マー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、ダイマー形
成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
ドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−
オリゴヌクレオチドの５’側領域、架橋プローブの最後
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第
１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領
域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレ
オチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴ
ヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配
列としたものを用いることができる。

【００１５】ｎ≧２の場合の別の例として、上記プロー
ブの塩基配列を、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第
（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
の５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域、第（２ｎ−２）番目の
系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第
（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
の３’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の
系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、ダイ
マー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、ダイマー形
成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
ドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの５’側領域、架橋プローブの最後
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第
１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領
域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
オチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴ
ヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配
列としたものを用いることができる。

【００１６】上記ダイマー形成用プローブ及び架橋プロ
ーブ（本明細書において、これらを単にプローブと称す
場合がある）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＬＮＡの
いずれかから選ばれる塩基から構成される。

【００１７】上記プローブのハイブリダイゼーション
は、あらかじめ上記ダイマー形成用プローブからダイマ
ーを形成させた後、上記架橋プローブと該ダイマーをハ
イブリダイゼーションさせることが好ましい。

【００１８】上記複数対のダイマー形成用プローブとし
て、上記中央領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマー形
成用プローブからなるものを用いることができる。

【００１９】上記架橋プローブが、３’側領域と５’側
領域の中央部にダイマー形成用プローブと架橋プローブ
の各領域の塩基配列とは非相補的な領域（以下、フリー
サイト領域（Free site regions）と称す）を有するこ
とが好適である。

【００２０】上記フリーサイト領域は、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びオリゴヌクレオチドと結合でき
るペプチド、ポリマー性粒子、磁性体粒子、またはその
他の化合物から構成されるものを用いることができる。

【００２１】上記一対のダイマー形成用プローブの３’
側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配列と
することも可能である。

【００２２】上記プローブの相補的塩基配列領域の分岐
点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シト
シン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成させることが可能となる。

【００２３】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体（以下、単に自己集合体と称すことがある。）は、
上記方法で形成されたものである。

【００２４】本発明の自己集合体の検出方法の第1の態
様は、上記自己集合体を、オリゴヌクレオチドの二本鎖
に挿入して蛍光を発するインターカレーターを用いて検
出することを特徴とする。

【００２５】本発明の自己集合体の検出方法の第２の態
様は、上記自己集合体を、該自己集合体に蛍光物質を結
合させ、発光により検出することを特徴とする。

【００２６】本発明の自己集合体の検出方法の第３の態
様は、上記自己集合体を、紫外線に対する光学的な吸収
の変化を利用して検出することを特徴とする。

【００２７】本発明の遺伝子の検出方法は、上記オリゴ
ヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いる遺伝
子の検出方法であり、上記ダイマー形成用プローブ及び
／又は架橋プローブのオリゴヌクレオチドを、ターゲッ
ト遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドを含むように構成し、ターゲット遺伝子と相補
的な領域を少なくとも１箇所予め切断しておき、温度制
御により、ハイブリダイゼーション反応、ライゲーショ
ン反応及び解離反応をさせ、該切断されたプローブを連
結させて完全なプローブを形成させ、上記オリゴヌクレ
オチドによる自己集合体の作製方法を用いて自己集合体
を作製させ、該自己集合体を検出することにより、ター
ゲット遺伝子を検出することを特徴とする。

【００２８】上記ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドとして、上記ダイマ
ー形成用プローブを用いて、ダイマー形成用プローブの
オリゴヌクレオチドのうち、少なくとも一つのオリゴヌ
クレオチドの中央領域を、ターゲット遺伝子と相補的な
塩基配列を有する領域となるように構成し、ターゲット
遺伝子と相補的なダイマー形成用プローブの各オリゴヌ
クレオチドの中央領域の片側、または両側の一箇所、ま
たは複数箇所をあらかじめ切断しておくことが好まし
い。

【００２９】上記遺伝子の検出方法は、さらに具体的に
は以下の通りである。上記ライゲーション反応におい
て、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有し、その箇所
を切断されたプローブは、ターゲット遺伝子が存在する
場合、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした
後、ライゲーション反応によって連結され、その後、熱
により二本鎖を解離させる。次に、未だ切断されたまま
のプローブは、ターゲット遺伝子又は連結されたプロー
ブとハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反
応によって連結され、熱により二本鎖が解離される。温
度制御により、上記ハイブリダイゼーション反応→ライ
ゲーション反応→解離反応を繰り返し、プローブを連結
させて完全なプローブを形成させる。連結したプローブ
は上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法
により、二本鎖の自己集合体を形成する。ターゲット遺
伝子が存在しない場合には、切断されたプローブは連結
されず、切断されたプローブでは自己集合体は形成され
ない。故に、自己集合体の形成の有無により、ターゲッ
ト遺伝子を検出することが可能である。

【００３０】自己集合体の形成は、ターゲット遺伝子の
量に依存しており、形成された自己集合体の量を測定す
ることにより、ターゲット遺伝子の量を測定することが
可能である。

【００３１】上記自己集合体は、第一に、オリゴヌクレ
オチドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインターカレー
ターを用いて検出することができる。

【００３２】上記自己集合体は、第二に、該自己集合体
に蛍光物質を結合させ、発光により検出することが可能
である。

【００３３】上記自己集合体は、第三に、紫外線に対す
る光学的な吸収の変化を利用して検出することができ
る。

【００３４】上記ライゲーション反応を、リガーゼ酵
素、耐熱性のリガーゼ酵素、又は酵素を使用しないオー
トライゲーションを用いて行うことが好ましい。

【００３５】上記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及
び／またはＲＮＡを用いることができる。

【００３６】上記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及
び／またはＲＮＡを用いることが可能である。

【００３７】上記あらかじめ切断されたオリゴヌクレオ
チドの切断部分がＳＮＰｓ（一塩基多形）の部分と相補
的になるようにデザインされることができる。

【００３８】上記方法においては、反応温度を制御する
機器を使用することが好適である。

【００３９】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を添付
図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示
的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱
しない限り種種の変形が可能なことはいうまでもない。

【００４０】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体の作製方法は、３’側領域、中央領域、及び５’側
領域の３つの領域からなり、各オリゴヌクレオチドの中
央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び
５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の
ダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２
ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成された
ダイマー形成用プローブ含有系と、３’側領域及び５’
側領域の２つの領域からなり、各オリゴヌクレオチドの
３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列
とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の
系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プ
ローブ含有系とを有し、該架橋プローブを、該ダイマー
形成用プローブより形成されるダイマーを架橋すること
が可能な塩基配列とし、該プローブをハイブリダイゼー
ションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集
合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させるようにし
たことを特徴とする。

【００４１】本発明は、複数対のダイマー形成用プロー
ブで形成された複数のダイマーに対して、複数対の架橋
プローブを等温で酵素不在の条件下で反応させることに
よりオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させる
ものである。使用するプローブの本数は特に限定されな
い。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増
幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨ
も常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜
９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０〜８
０℃、好ましくは５５〜７０℃である。これら条件は特
に限定されない。

【００４２】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体の作製方法において、ｎ＝１、即ち、一組のダイマ
ー形成用プローブ及び一組の架橋プローブを用いる場合
について例示する。一例として、第１の系の一対のオリ
ゴヌクレオチドは、図３（ａ）に示したように、一対の
オリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’
側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域
だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインさ
れているＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成
用プローブ−１）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダ
イマー形成用プローブ−２）から構成されていることか
ら、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションす
るためにダイマーを形成することができる。ただし、そ
の他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうし
に相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了
する。

【００４３】一方、第２の系においては、図３（ｂ）に
示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領
域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、
いずれもの領域においても互いに相補性がないＮｏ．１
−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−１）とＮｏ．２
−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−２）から構成さ
れているために、ハイブリダイゼーションにより結合す
ることなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。

【００４４】次に、図４（ａ）に示したように、ダイマ
ー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２か
ら形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−１と架
橋プローブ−２を加えると、ダイマー形成用プローブ−
１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−１の３’側領域
（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域
（Ａ）と架橋プローブ−１の５’側領域（Ａ’）、ダイ
マー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プ
ローブ−２の３’側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プロー
ブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−２の５’
側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマ
ー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋
プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーショ
ンすることにより、図４（ｂ）に示したように、オリゴ
ヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる
自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００４５】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体の作製方法におけるｎ＝１の場合の別の例として、
図５（ａ）に示した一対の架橋プローブにおける３’側
領域、及び５’側領域の２つの領域は、図５（ｂ）に示
したように、領域の入れ替えが可能である。

【００４６】第１の系の一対のオリゴヌクレオチドは、
図６（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチド
の３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域
に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的
な塩基配列を持つようにデザインされているＮｏ．１−
オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−１）と
Ｎｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プロー
ブ−２）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領
域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを
形成することができる。ただし、その他の領域について
は、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないた
め、反応はダイマーの形成だけで終了する。

【００４７】一方、第２の系においては、図６（ｂ）に
示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領
域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、
いずれもの領域においても互いに相補性がないＮｏ．１
−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−３）とＮｏ．２
−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−４）から構成さ
れているために、ハイブリダイゼーションにより結合す
ることなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。

【００４８】次に、図７（ａ）に示したように、ダイマ
ー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２か
ら形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−３と架
橋プローブ−４を加えると、ダイマー形成用プローブ−
１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−３の３’側領域
（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域
（Ａ）と架橋プローブ−４の５’側領域（Ａ’）、ダイ
マー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プ
ローブ−４の３側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ
−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−３の５’側
領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー
形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プ
ローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーション
することにより、図７（ｂ）に示したように、オリゴヌ
クレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自
己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００４９】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体の作製方法において、ｎ≧２、即ち、二組以上のダ
イマー形成用プローブ及び二組以上の架橋プローブを用
いる場合について例示する。一例として、Ｎｏ．１及び
Ｎｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌク
レオチドを３’側領域、中央領域及び５’側領域の３つ
の領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互い
に相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を
互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成
用プローブをそれぞれ含む第１番目の系から第（２ｎ−
１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数個形
成されたダイマー形成用プローブ含有系と、Ｎｏ．１及
びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌ
クレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に
分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領
域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プロ
ーブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系ま
で順番に複数個形成された架橋プローブ含有系とを有
し、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．
１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−３）
番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオ
チドの５’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２
−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番
目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
ドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの５’側領域、ダイマー形成用プロ
ーブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’
側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌ
クレオチドの３’側領域、ダイマー形成用プローブの最
後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
ドの５’側領域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−
オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、架橋プロー
ブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側
領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列とし、第１番
目の系から第（２ｎ−１）番目の系までにおける複数対
のダイマー形成用プローブから形成される複数のダイマ
ーに対して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までにお
ける複数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリダ
イゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが
自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させるこ
とが可能である。

【００５０】図８及び図９は、本発明の自己集合体の作
製方法のｎ＝２の場合の一例を示す模式図である。二組
のダイマー形成用プローブと二組の架橋プローブを用い
た場合は、一組のダイマー形成用プローブは、図８
（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの
３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に
分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な
塩基配列を持つようにデザインされている第１の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ
−３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成
用プローブ−４）から構成されていることから、Ｂ領域
とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダ
イマーを形成することができる。ただし、その他の領域
については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性が
ないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。

【００５１】もう一組のダイマー形成用プローブは、図
８（ｃ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの
３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に
分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な
塩基配列を持つようにデザインされている第３の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ
−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成
用プローブ−６）から構成されていることから、Ｇ領域
とＧ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダ
イマーを形成することができる。ただし、その他の領域
については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性が
ないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。

【００５２】一方、二組の架橋プローブは、図８
（ｂ）、図８（ｄ）に示したように、一対のオリゴヌク
レオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に
分けられているが、いずれもの領域においても互いに相
補性がない第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド
（架橋プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
（架橋プローブ−６）、および第４の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチド（架橋プローブ−７）とＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチド（架橋プローブ−８）から構成されて
いるために、ハイブリダイゼーションにより結合するこ
となく二本のオリゴヌクレオチドのままである。

【００５３】次に、図９（ａ）に示したように、ダイマ
ー形成用プローブ−３とダイマー形成用プローブ−４か
ら形成されたダイマーと、ダイマー形成用プローブ−５
とダイマー形成用プローブ−６から形成されたダイマー
に対して、架橋プローブ−５、架橋プローブ−６、架橋
プローブ−７、架橋プローブ−８を加えると、ダイマー
形成用プローブ−３の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ
−５の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−
３の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−７の５’側領域
（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−４の３’側領域
（Ｌ’）と架橋プローブ−８の３’側領域（Ｌ）、ダイ
マー形成用プローブ−４の５’側領域（Ｄ’）と架橋プ
ローブ−６の５’側領域（Ｄ）、ダイマー形成用プロー
ブ−５の５’側領域（Ｆ）と架橋プローブ−５の５’側
領域（Ｆ’）、ダイマー形成用プローブ−５の３’側領
域（Ｈ）と架橋プローブ−７の３’側領域（Ｈ’）、ダ
イマー形成用プローブ−６の５’側領域（Ｊ’）と架橋
プローブ−８の５’側領域（Ｊ）、ダイマー形成用プロ
ーブ−６の３’側領域（Ｅ’）と架橋プローブ−６の
３’側領域（Ｅ）、が相補的領域であるために、一対の
ダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに
対して、二組の架橋プローブが次々に架橋するようにハ
イブリダイゼーションすることにより、図９（ｂ）に示
したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴ
ヌクレオチドによる自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ
法が行われる。

【００５４】図１０は、本発明の自己集合体の作製方法
におけるｎ＝４の場合の一例を示す模式図である。図１
０（ａ）に示したように、第１の系、第３の系、第５の
系、第７の系という４個の系を形成するダイマー形成用
プローブ含有系と、第２の系、第４の系、第６の系、第
８の系という４個の系を形成する架橋プローブ含有系を
有し、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’
側領域（Ｃ）と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
ドの３’側領域（Ｃ’）、第１の系のＮｏ．２−オリゴ
ヌクレオチドの５’側領域（Ｄ’）と第２の系のＮｏ．
２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ）、第２の系
のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ）と
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｅ’）、第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｆ’）と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｆ）、第３の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ）と第４の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ’）、第
３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ｊ’）と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｊ）、第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域（Ｋ）と第５の系のＮｏ．２−オリ
ゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ’）、第４の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ’）と第
５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ｌ）、第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｎ）と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域（Ｎ’）、第５の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ’）と第６の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ）、第６
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｑ）と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｑ’）、第６の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｒ’）と第７の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ）、第７の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ）と第８
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｔ’）、第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｕ’）と第８の系のＮｏ．２−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｕ）、第８の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ）と第１の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ’）、第
８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ａ’）と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ａ）、がそれぞれ相補的な塩基配列である
ため、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組
のダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するよ
うにハイブリダイゼーションすることにより、図１０
（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合
してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成され
る。

【００５５】図１０（ｂ）に示したように、ダイマー形
成用プローブの第１の系と第３の系を架橋プローブの第
２の系が、ダイマー形成用プローブの第３の系と第５の
系を架橋プローブの第４の系が、ダイマー形成用プロー
ブの第５の系と第７の系を架橋プローブの第６の系が、
ダイマー形成用プローブの第７の系と第１の系を架橋プ
ローブの第８の系が、それぞれ架橋するようにハイブリ
ダイゼーションすることにより、自己集合体が形成さ
れ、重合の系の並びは、〈・・・７，８，１，２，３，
４，５，６，７，８，１，２，・・・７，８，１，・・
・〉の繰り返しとなり、ｎ＝ｋの場合では、〈・・・２
ｋ−１，２ｋ，１，２，・・・２ｋ−１，２ｋ，１，・
・・〉の並びを繰り返しながら自己集合体を形成する。

【００５６】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体の作製方法におけるｎ≧２の場合の別の例として、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの
各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域及び５’
側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中
央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び
５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の
ダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１番目の系か
ら第（２ｎ−１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順
番に複数個形成されたダイマー形成用プローブ含有系
と、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチ
ドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域
の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領
域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複
数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第
２ｎ番目の系までの順番に複数個形成された架橋プロー
ブ含有系とを有し、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１
−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番
目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
ドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−
オリゴヌクレオチドの５’側領域、第（２ｎ−２）番目
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第
（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
の３’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の
系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、ダイ
マー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、ダイマー形
成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
ドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの５’側領域、架橋プローブの最後
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第
１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領
域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
オチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴ
ヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配
列とし、第１番目の系から第（２ｎ−１）番目の系まで
における複数対のダイマー形成用プローブから形成され
るダイマーに対して、第２番目の系から第２ｎ番目の系
までにおける複数対の架橋プローブが架橋するようにハ
イブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレ
オチドが自己集合し、二本鎖の規則的な自己集合体を形
成させることが可能である。

【００５７】図１１は、本発明の自己集合体の作製方法
のｎ＝２の場合の別の例を示す模式図である。二組のダ
イマー形成用プローブと二組の架橋プローブを用いた場
合は、一組のダイマー形成用プローブは、図１１（ａ）
に示したように、上記したｎ＝２の場合の一例と同様、
一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及
び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中
央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザ
インされている第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
ド（ダイマー形成用プローブ−３）とＮｏ．２−オリゴ
ヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−４）から構成
されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリ
ダイゼーションするためにダイマーを形成することがで
きる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌ
クレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマー
の形成だけで終了する。

【００５８】もう一組のダイマー形成用プローブは、図
１１（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチド
の３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域
に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的
な塩基配列を持つようにデザインされている第３の系の
Ｎｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プロー
ブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形
成用プローブ−６）から構成されていることから、Ｇ領
域とＧ’領域だけがハイブリダイゼーションするために
ダイマーを形成することができる。ただし、その他の領
域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性
がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。

【００５９】一方、二組の架橋プローブは、図１１
（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの
３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられて
いるが、いずれもの領域においても互いに相補性がない
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プロー
ブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プロー
ブ−６）、および第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオ
チド（架橋プローブ−９）とＮｏ．２−オリゴヌクレオ
チド（架橋プローブ−１０）から構成されているため
に、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二
本のオリゴヌクレオチドのままである。

【００６０】次に、図１１（ａ）に示したように、ダイ
マー形成用プローブ−３とダイマー形成用プローブ−４
から形成されたダイマーと、ダイマー形成用プローブ−
５とダイマー形成用プローブ−６から形成されたダイマ
ーに対して、架橋プローブ−５、架橋プローブ−６、架
橋プローブ−９、架橋プローブ−１０を加えると、ダイ
マー形成用プローブ−３の３’側領域（Ｃ）と架橋プロ
ーブ−５の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プロー
ブ−３の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１０の５’
側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−４の３’側
領域（Ｌ’）と架橋プローブ−１０の３’側領域
（Ｌ）、ダイマー形成用プローブ−４の５’側領域
（Ｄ’）と架橋プローブ−６の５’側領域（Ｄ）、ダイ
マー形成用プローブ−５の５’側領域（Ｆ）と架橋プロ
ーブ−５の５’側領域（Ｆ’）、ダイマー形成用プロー
ブ−５の３’側領域（Ｈ）と架橋プローブ−９の３’側
領域（Ｈ’）、ダイマー形成用プローブ−６の５’側領
域（Ｊ’）と架橋プローブ−９の５’側領域（Ｊ）、ダ
イマー形成用プローブ−６の３’側領域（Ｅ’）と架橋
プローブ−６の３’側領域（Ｅ）、が相補的領域である
ために、一対のダイマー形成用プローブで形成された二
組のダイマーに対して、二組の架橋プローブが次々に架
橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、
図１１（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自
己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成
されるＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００６１】図１２は、本発明の自己集合体の作製方法
のｎ＝４の場合の別の例を示す模式図である。図１２
（ａ）に示したように、第１の系、第３の系、第５の
系、第７の系という４個の系を形成するダイマー形成用
プローブ含有系と、第２の系、第４の系、第６の系、第
８の系という４個の系を形成する架橋プローブ含有系を
有し、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’
側領域（Ｃ）と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
ドの３’側領域（Ｃ’）、第１の系のＮｏ．２−オリゴ
ヌクレオチドの５’側領域（Ｄ’）と第２の系のＮｏ．
２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ）、第２の系
のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ）と
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｅ’）、第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｆ’）と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｆ）、第３の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ）と第４の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ’）、第
３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ｊ’）と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｊ）、第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域（Ｋ）と第５の系のＮｏ．２−オリ
ゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ’）、第４の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ’）と第
５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ｌ）、第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｎ）と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域（Ｎ’）、第５の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ’）と第６の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ）、第６
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｑ）と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｑ’）、第６の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｒ’）と第７の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ）、第７の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ）と第８
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｔ’）、第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｕ’）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｕ）、第８の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ）と第１の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ’）、第
８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ａ’）と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ａ）、がそれぞれ相補的な塩基配列である
ため、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組
のダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するよ
うにハイブリダイゼーションすることにより、図１２
（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合
してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成される
ＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００６２】図１２（ｂ）に示したように、ダイマー形
成用プローブの第１の系と第３の系を架橋プローブの第
２の系が、ダイマー形成用プローブの第３の系と第５の
系を架橋プローブの第４の系が、ダイマー形成用プロー
ブの第５の系と第７の系を架橋プローブの第６の系が、
ダイマー形成用プローブの第１の系同士を架橋プローブ
の第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドが、ダイマ
ー形成用プローブの第７の系同士を架橋プローブの第８
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドが、それぞれ架橋
するようにハイブリダイゼーションすることにより、自
己集合体が形成され、重合の系の並びは、〈・・・７，
８のＮｏ．１（８₁），７，６，５，４，３，２，１，
８のＮｏ．１（８₂），１，２，３，４，５，６，７，
８₁，７・・・〉の繰り返しとなり、ｎ＝ｋの場合で
は、〈・・・２ｋ−１，２ｋ₁，２ｋ−１，２ｋ−２・
・・３，２，１，２ｋ₂，１，２，３・・・２ｋ−２，
２ｋ−１，２ｋ₁，２ｋ−１，２ｋ−２・・・〉の並び
を繰り返しながら自己集合体を形成する。

【００６３】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体の作製方法においては、図１３に示すように、架橋
プローブにおける２領域の中央にフリーサイト領域を有
する架橋プローブを用いて、上記オリゴヌクレオチドに
よる自己集合体の作製方法に従い、オリゴヌクレオチド
による自己集合体を形成させることができる。例えば、
ｎ＝１の場合、一組のダイマー形成用プローブは、図１
３（ａ）に示したように、上記ｎ＝１の第１の系で用い
たダイマー形成用プローブと同じダイマー形成用プロー
ブ１とダイマー形成用プローブ２から構成されている。

【００６４】一方、架橋プローブは、図１３（ｂ）に示
したように、上記ｎ＝１の一例の第２の系で用いた架橋
プローブの領域の中央にフリーサイト領域を有する架橋
プローブ−１１と架橋プローブ−１２から構成されてい
る。

【００６５】次に、図１４（ａ）に示したように、ダイ
マー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２
から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−１１
と架橋プローブ−１２を加えると、ダイマー形成用プロ
ーブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−１１の
３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の
５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１１の５’側領域
（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域
（Ｆ’）と架橋プローブ−１２の３’側領域（Ｆ）、ダ
イマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋
プローブ−１２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域である
ために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダ
イマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するように
ハイブリダイゼーションすることにより、図１４（ｂ）
に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合して自
己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００６６】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集
合体の作製方法において、非相補的な塩基配列とは、お
互いにハイブリダイズしない塩基配列であれば、いかな
るものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列
に含まれるものである。例えば、図１５に示すように、
一対のダイマー形成用プローブの３’側領域及び／又は
５’側領域を互いに同一な塩基配列としたダイマー形成
用プローブを用いて、上記自己集合体の作製方法に従
い、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させる
ことができる。ｎ＝１の場合、図１５（ａ）及び（ｂ）
に示したように、中央領域をお互いに相補的な配列と
し、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な
塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領域＝Ｄ’領域）とし
た、ダイマー形成用プローブ−１及びダイマー形成用プ
ローブ−１１を一対のダイマー形成用プローブとして用
いることができる。この場合、一対の架橋プローブは、
図１６（ｂ）に示した如く、同一なオリゴヌクレオチド
となる。図１７に示す如く、上記一対のダイマー形成用
プローブで形成されたダイマーに対して、上記架橋プロ
ーブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションす
ることにより、図１７（ｂ）に示したように、オリゴヌ
クレオチドが自己集合して自己集合体を形成するＰＡＬ
ＳＡＲ法が行われる。

【００６７】本発明に係る自己集合体の作製方法におい
て、ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させる
時期は、ダイマー形成前のダイマー形成用プローブと架
橋プローブを同時に反応させても良く、あらかじめダイ
マー形成用プローブによりダイマーを形成させた後に架
橋プローブと反応させても良く、特に限定されないが、
あらかじめダイマーを形成させた後、架橋プローブと反
応させ、自己集合体を形成させる方がより好適である。

【００６８】上記ダイマー形成用プローブの構成は、各
系のダイマー形成用プローブが１種類のものでもよく、
１つの系に中央領域の異なる数種類のダイマー形成用プ
ローブを含んでいてもよく、特に限定されない。更には
お互いに完全に相補性のないダイマー形成用プローブ及
び架橋プローブのセットを、２組以上同時におこなって
もよい。

【００６９】上記自己集合体の作製方法で用いられるプ
ローブを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成
されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体とし
て、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、WO 92/20702）やL
ocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetr
ahedron 1998.54,3607-3630., Koshkin AA et al. J. A
m. Chem. Soc. 1998.120,13252-13253., Wahlestedt C
et al. PNAS. 2000.97,5633-5638.）が挙げられる。ま
た、一対のプローブは、通常、同じ種類の核酸で構成さ
れるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一
対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種
類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡ
やＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプ
ローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみか
ら構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、Ｄ
ＮＡとＲＮＡから構成されるプローブ（キメラプロー
ブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。

【００７０】上記プローブの各相補的塩基配列領域の長
さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好まし
くは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩
基である。

【００７１】上記プローブは公知の方法により合成する
ことができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプラ
イドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）の
ＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダ
イド法により合成することができる。また、別法として
リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホス
ホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたもの
であってもよい。

【００７２】本発明の自己集合体の作製方法において、
使用するプローブの相補的塩基配列領域の端部に、少な
くとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配
置させ、プローブがハイブリダイズした際に少なくとも
１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成さ
せることにより、塩基の積み重ね（stacking of base）
により塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、より
安定した二本鎖の自己集合体を形成させることができ
る。

【００７３】図１８の矢印に示したように、互い違いに
交差してハイブリダイゼーションする時の各領域の末端
部分の塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）にす
ることにより、図１９（ａ）に示したように、塩基の積
み重ね（stacking of base）によりπ電子の特殊な相互
作用を生じさせ、図１９（ｂ）に示したように安定した
２本鎖の自己集合体が形成される。

【００７４】上記ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い形成され
る自己集合体は、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの２６
０ｎｍにおける紫外部の吸収度の強度が減ずる「ハイポ
クロミズム」という淡色効果を発現する特徴を有する、
塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとるものである。
従って、淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認
し、さらには、自己集合体の塩基の積み重ねの間に蛍光
物質を挿入させて、その蛍光強度の変化から自己集合体
の状態を確認することが可能である。

【００７５】ＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対のダイマー
形成用プローブと架橋プローブの互い違いに交差してハ
イブリダイゼーションする時の領域はおよそ２０塩基
（20 bases）であるが、図１９（ｂ）の円形で示した各
領域の末端部分の結合を強固にすることによって、積み
重ね効果（stacking effect）が増し、結果的にその末
端部分にはさまれている２０塩基の領域のハイブリダイ
ゼーションが安定すると考えられる。

【００７６】上記の相補領域末端部分に配置されるＣま
たはＧの数は少なくとも１塩基であり、複数個であって
も差し支えない。各相補領域の塩基配列を考慮して適宜
選択することができる。複数個のＣまたはＧを配置させ
る場合、Ｃ、Ｇの順序は特に限定されず自由に組み合わ
せることができる。また、下記に記載されるターゲット
遺伝子の検出法において、ターゲット遺伝子の一部と相
補的な塩基配列をプローブの一領域として採用する場合
も、相補領域の端部にＣまたはＧを配置するように選択
することが可能である。

【００７７】本発明のオリゴヌクレオチド自己集合体の
作製方法を利用して、試料中のターゲット遺伝子の検出
が可能である。

【００７８】本発明の遺伝子の検出方法におけるターゲ
ット遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）測定用試料は、該核
酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ター
ゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したもので
もよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、
尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来
試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可
能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲ
ット遺伝子を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ
等の核酸も使用できる。

【００７９】以下に本発明のオリゴヌクレオチドによる
自己集合体の作製方法を用いた、遺伝子の検出方法を具
体的に示す。下記ライゲーション反応は、Ligase（リガ
ーゼ）酵素を使用する方法と酵素を使わず特殊なオリゴ
ヌクレオチドを使用する方法のいずれにも限定されない
方法である。

【００８０】以下に本発明のオリゴヌクレオチドによる
自己集合体の作製方法において、ｎ＝１の場合の一例と
して述べたプローブを用いた場合のターゲット遺伝子の
検出方法の一例について述べる。図２０〜図２３は、一
対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブを
用いたライゲーション反応による２本鎖のターゲット遺
伝子の検出の一例を示す模式図である。

【００８１】本発明のターゲット遺伝子の検出の一例と
して、ＰＡＬＳＡＲ法で使用するオリゴヌクレオチド
は、第１の系においては、図２０（ａ）に示したよう
に、ｎ＝１の場合の第１の系で用いたダイマー形成用プ
ローブと同じダイマー形成用プローブ−１とダイマー形
成用プローブ−２から構成されているが、中央のＢ領
域、Ｂ’領域は相補的な塩基配列であると同時にターゲ
ット遺伝子とも相補的な塩基配列である。そして、この
Ｂ領域の中央部分を切断してできた５’側の部分がダイ
マー形成用プローブ−７、３’側の部分がダイマー形成
用プローブ−８である。同様にして、Ｂ’領域の中央部
分を切断してできた３’側の部分がダイマー形成用プロ
ーブ−９、５’側の部分がダイマー形成用プローブ−１
０である。

【００８２】一方、架橋プローブは、図２０（ｂ）に示
したように、ｎ＝１の場合の一例における第２の系と同
じ架橋プローブ−１と架橋プローブ−２から構成されて
いるために、ハイブリダイゼーションにより結合するこ
となく二本のオリゴヌクレオチドのままである。

【００８３】次に、図２１（ａ）に示したターゲット遺
伝子のＢ領域、Ｂ’領域に対して、図２１（ｂ）に示し
たダイマー形成用プローブ−７、ダイマー形成用プロー
ブ−８、ダイマー形成用プローブ−９、ダイマー形成用
プローブ−１０がハイブリダイズする。

【００８４】図２１（ｃ）に示したように、ダイマー形
成用プローブ−７とダイマー形成用プローブ−８，ダイ
マー形成用プローブ−９とダイマー形成用プローブ−１
０は、それぞれが隣接してハイブリダイズするために、
図２１（ｄ）に示したように、ライゲーション反応によ
って隣接した部分が連結され、完全な形のダイマー形成
用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２が完成す
る。

【００８５】解離後、図２２（ｅ）に示した完成したダ
イマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−
２は、図２２（ｆ）に示したように、連結していない未
反応なダイマー形成用プローブ−７とダイマー形成用プ
ローブ−８、ダイマー形成用プローブ−９とダイマー形
成用プローブ−１０の新しいターゲット遺伝子となるた
め、図２２（ｇ）のようにハイブリダイズして、図２２
（ｈ）に示したように、ライゲーション反応によって隣
接した部分が連結され、温度コントロールにより解離と
ハイブリダイゼーションとライゲーション反応を繰り返
すことにより、完全な形のダイマー形成用プローブ−１
とダイマー形成用プローブ−２が次々に完成する。

【００８６】このライゲーション反応でできたダイマー
形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から
形成されたダイマーに対して、図２３（ｉ）に示した架
橋プローブ−１と架橋プローブ−２を加えると、ダイマ
ー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プロー
ブ−１の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ
−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１の５’側領
域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域
（Ｆ’）と架橋プローブ−２の３’側領域（Ｆ）、ダイ
マー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プ
ローブ−２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるため
に、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマ
ーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイ
ブリダイゼーションすることにより、図２３（ｊ）に示
したように、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集
合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００８７】ターゲット遺伝子が存在しない場合には、
切断されたダイマー形成用プローブは連結されず、切断
されたダイマー形成用プローブでは自己集合体は形成さ
れない。故に、自己集合体の形成により、ターゲット遺
伝子を検出することが可能である。なお、一対のダイマ
ー形成用プローブの一方のみを相補領域で切断したもの
を使用し、ライゲーション反応後に切断されていないも
う一方のダイマー形成用プローブを加えることも可能で
ある。また、ターゲット遺伝子に相補的な領域を２箇所
以上作製し、その箇所をそれぞれ切断したプローブを用
いることも可能である。

【００８８】次に、ｎ＝１の場合のプローブを用いた本
発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法
を利用したターゲット遺伝子の検出方法の別の例につい
て述べる。図２４及び図２５は、それぞれ切断される中
央領域が異なる２組の一対のダイマー形成用プローブ及
び一対の架橋プローブを用いて、切断されたダイマー形
成用プローブのライゲーション反応による２本鎖のター
ゲット遺伝子の検出の一例を示す模式図である。

【００８９】図２４（ａ）〜（ｃ）に示すように、ター
ゲット遺伝子とそれぞれ相補的な領域（α及びα’領
域、β及びβ’領域）を有し、その箇所を切断されたダ
イマー形成用プローブは、ターゲット遺伝子が存在する
場合、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした
後（図２４（ｄ）（ｅ））、ライゲーション反応によっ
て連結され、その後、熱により二本鎖を解離させる。次
に、未だ切断されたままのダイマー形成用プローブは、
ターゲット遺伝子又は連結されたダイマー形成用プロー
ブとハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反
応によって連結され、熱により二本鎖が解離される。９
５℃〜２５℃の範囲の温度コントロールにより、上記ハ
イブリダイゼーション反応→ライゲーション反応→解離
反応を繰り返し、プローブを連結させて完全なダイマー
形成用プローブを形成させる。

【００９０】連結したダイマー形成用プローブから形成
されたダイマー［図２５（ｆ）（ｇ）］に対して、図２
５（ｈ）に示した架橋プローブ−１と架橋プローブ−２
を加えると、一対のダイマー形成用プローブで形成され
たダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するよ
うにハイブリダイゼーションすることにより、図２５
（ｉ）に示したように、プローブが自己集合して二本鎖
の自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００９１】ターゲット遺伝子が存在しない場合には、
切断されたダイマー形成用プローブは連結されず、切断
されたダイマー形成用プローブでは自己集合体は形成さ
れない。故に、自己集合体の形成により、ターゲット遺
伝子を検出することが可能である。なお、一対のプロー
ブの一方のみを相補領域で切断したものを使用し、ライ
ゲーション反応後に切断されていないもう一方のプロー
ブを加えることも可能である。また、ターゲット遺伝子
に相補的な領域を２箇所以上作製し、その箇所をそれぞ
れ切断したプローブを用いることも可能である。

【００９２】上記方法では、ダイマー形成用プローブの
中央領域をターゲット遺伝子と相補的となるように構成
したが、５’側領域や３’側領域をターゲット遺伝子と
相補的な領域とし、その領域をあらかじめ切断してお
き、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。ま
た、ダイマー形成用プローブの代わりに、架橋プローブ
を、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有するように構
成し、あらかじめ架橋プローブのターゲット遺伝子と相
補的な領域を有する部分を切断し、ライゲーション反応
によりターゲット遺伝子を検出することもできる。

【００９３】上記の方法を応用することにより、１本鎖
のターゲット遺伝子や、ＳＮＰｓの検出が可能である。
１本鎖のターゲット遺伝子の検出の場合は、ターゲット
遺伝子と相補的な領域を一箇所以上切断したプローブを
用いること等により検出可能である。ＳＮＰｓの検出の
場合は、ＳＮＰｓを含む領域が相補的な領域となるよう
なプローブを作製し、その箇所を切断したプローブを用
いること等により、検出可能である。

【００９４】ターゲット遺伝子を検出する別の具体的手
法としては、たとえば、まず最初に検体試料と少なくと
も１種類の捕捉用プローブを反応させ、ターゲット遺伝
子と捕捉用プローブを結合させる。この際、少なくとも
一種類のビオチン化捕捉用プローブを使用する。次い
で、自己集合体を形成する一対のプローブの一方を添加
し反応させた後、もう一方のプローブを反応させてター
ゲット遺伝子・自己集合体複合体を形成させる。次い
で、アビジン化磁性体粒子（磁性体ビーズ）を反応させ
該複合体と結合させ、ビーズの性質を利用して該複合体
を未反応物質から分離する。最後に、エチジウムブロマ
イドやＳＹＢＲ^TMＧｒｅｅｎＩのようなインターカレー
ター色素を反応させ、紫外線照射により自己集合体の量
を定量することにより、検体試料中のターゲット遺伝子
量を測定する。形成させた自己集合体の分離を容易にす
るために、磁気ビーズを使用することもできる。

【００９５】別の手法としては、たとえば、ターゲット
遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレ
オチドを固相化したウェルを使用することができる。ま
ず検体試料をウェルに添加し試料中のターゲット遺伝子
と、固相化したターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチドを結合させる。次い
で、上記の方法に準じて、自己集合体を形成するプロー
ブを順次添加することにより、自己集合体が形成され結
合することになる。未反応物質との分離は、ウェルを洗
浄することにより容易にでき、自己集合体量を測定する
ことによりターゲット遺伝子を測定できる。

【００９６】この手法に準じれば、ＤＮＡチップへの応
用も可能である。

【００９７】

【実施例】以下に、本発明の実施例を挙げて説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないこ
とは勿論である。

【００９８】以下に、実施例１〜実施例１３で使用した
ダイマー形成用プローブと架橋プローブの塩基配列を記
す。 ［１］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）：5’-GTG
CTG ACT TAA CCG GAT AC ・G AAC AGG ATC CTA GAC CTA
G ・CA TAG TACAGT CCG ATG GTG-3’ ［２］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）：5’-CCT
CAA GAC GCA TGT CTT TC ・C TAG GTC TAG GAT CCT GTT
C ・CT AGA ACGGAC TGT ACT TCG-3’ ［３］架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）：5’-GTA TCC GGT
TAA GTC AGC AC ・C ACC ATC GGA CTG TAC TAT G-3’ ［４］架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）：5’-GAA AGA CAT
GCG TCT TGA GG ・C GAA GTA CAG TCC GTT CTA G-3’ ［５］架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）：5’-GAA AG
A CAT GCG TCT TGA GG ・T CGA CT ・ C GAA GTA CAG TCC
GTT CTA G-3’ ［６］架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）：5’-GTA TC
C GGT TAA GTC AGC AC ・T CAG CT ・ C ACC ATC GGA CTG
TAC TAT G-3’

【００９９】以下に、実施例１４で使用したターゲット
遺伝子とダイマー形成用プローブと架橋プローブの塩基
配列を記す。 ［７］ターゲット遺伝子：5’-GGA TCC TAG ACC TAG ・
TG TTT GAG GGT GGA TAG CAG TAC CTG AGC CAT ・ CTA G
GT CTA GGA TCC-3’ ［８］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）：5’-G
CTG ACT TAA CCG GAT AC ・ ATG GCT CAG GTA CTG C-3’ ［９］ダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）：(P)
5’-TAT CCA CCC TCA AAC A ・G ATT GGT ACT GCG AGA T
A-3’

【０１００】以下に、実施例１５及び１６で使用したダ
イマー形成用プローブと架橋プローブの塩基配列を記
す。 ［１０］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３）：5’-GT
G CTG ACT TAA CCG GAT AC ・G ATT ATG GCT CAG GTA CT
G C-3’（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な
塩基配列） ［１１］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３Ｐ）：(P)
5’-TAT CCA CCC TCA AAC AGG TG・GATTGGT ACT GCG AGA
TAG G-3’（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的
な塩基配列） ［１２］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−４）：5’-GA
C GCT TTC TGC GTG TAT AG ・C ACC TGT TTG AGG GTG GA
T A-3’（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な
塩基配列） ［１３］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−４Ｐ）：(P)
5’-G CAG TAC CTG AGC CAT AAT C ・CT AGA ACG GAT CG
T ACT TCG-3’（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相
補的な塩基配列） ［１４］架橋プローブ−（Ａ−５）：5’-GTA TCC GGT
TAA GTC AGC AC ・C CTA TCT CGC AGT ACC AAT C-3’ ［１５］架橋プローブ−（Ａ−６）：5’-CTA TAC ACG
CAG AAA GCG TC ・C GAA GTA CGA TCC GTT CTA G-3’

【０１０１】（実施例１及び比較例１） １．目的 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを
用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。

【０１０２】２．方法 ２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成
用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイ
マー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ ₂Ｏを８
μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱
後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷さ
せてダイマー溶液を作製した。

【０１０３】図２６に示したように、このダイマー溶液
に５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μ
Ｌ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μ
Ｌ加え、６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急
冷させて、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認し
た。対照として、上記ダイマー溶液に５０ｐｍｏｌの架
橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）のみを１μＬ加えた場合を同
様に行った（比較例１）。

【０１０４】３．結果 図２７のアガロースゲル電気泳動の写真（矢印の部分）
に示したように、ダイマー形成用プローブで形成された
ダイマーに対して、架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）と架橋
プローブ−（Ａ−ＡＺ）の両方を加えたものにおいての
み、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認でき
た（実施例１）。ダイマー形成用プローブで形成された
ダイマーの５’側と３’側（ダイマー形成用プローブ−
（Ａ−１））とだけに相補的な領域を持つ架橋プローブ
−（Ａ−ＸＢ）だけでは、オリゴヌクレオチドの自己集
合反応であるＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体は形成さ
れなかった（比較例１）。

【０１０５】（比較例２〜４） １．目的 １本のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを
用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。

【０１０６】２．方法 比較例２において、図２８に示したように、２０×ＳＳ
Ｃを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ
−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−
（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−
（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、Ｈ₂Ｏを７μＬ（計２０μ
Ｌ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に６４℃で３
０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％
のアガロースゲル電気泳動で確認した。

【０１０７】比較例３において、架橋プローブ−（Ａ−
ＸＢ）を添加しない以外は比較例２と同様の手順及び条
件にて反応させた。比較例４において、架橋プローブ−
（Ａ−ＡＺ）を添加しない以外は比較例２と同様の手順
及び条件にて反応させた。

【０１０８】３．結果 図２９のアガロースゲル電気泳動の写真に示したよう
に、比較例２〜４のいずれにおいても、自己集合体は検
出されず、一本のダイマー形成用プローブに対して、一
対の架橋プローブを加えても自己集合反応であるＰＡＬ
ＳＡＲ法によるオリゴヌクレオチドによる自己集合体は
形成されなかった。

【０１０９】（実施例２〜５及び比較例５） １．目的 一対のダイマー形成用プローブと濃度を変えた一対の架
橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の
形成。

【０１１０】２．方法 ２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成
用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイ
マー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ ₂Ｏを８
μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱
後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷さ
せてダイマー溶液を作製した。

【０１１１】図３０に示したように、このダイマー溶液
に５０ｐｍｏｌ（実施例２）、２５ｐｍｏｌ（実施例
３）、５ｐｍｏｌ（実施例４）、０．５ｐｍｏｌ（実施
例５）の架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）と架橋プローブ−
（Ａ−ＡＺ）をそれぞれ１μＬずつ加え、６４℃で３０
分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％の
アガロースゲル電気泳動で確認した。対照として、架橋
プローブ−（Ａ−ＸＢ）及び架橋プローブ−（Ａ−Ａ
Ｚ）を添加しない場合についても同様に行った（比較例
５）。

【０１１２】３．結果 図３１のアガロースゲル電気泳動の写真（矢印の部分）
に示したように、ダイマー形成用プローブで形成された
ダイマーに対して、５ｐｍｏｌ以上の架橋プローブ−
（Ａ−ＸＢ）と架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）の両方を加
えたものにおいて、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の
形成が確認できた（実施例２〜４）。

【０１１３】（実施例６） １．目的 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを
用いたＰＡＬＳＡＲ法の反応温度の違いによる自己集合
体の形成。

【０１１４】２．方法 ２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成
用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイ
マー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ ₂Ｏを８
μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱
後に６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷さ
せて図３２（ａ）に示したように、ダイマー溶液を作製
した。

【０１１５】次に、このダイマー溶液に図３２（ｂ）に
示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１
μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１
μＬ加え、各反応温度（５４、５６、５８、６０、６
２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、
反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のア
ガロースゲル電気泳動で確認した。

【０１１６】３．結果 図３３に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写
真と図３４に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動
の写真結果から、ダイマー形成用プローブと架橋プロー
ブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成は、
一対のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（EP 1
002877A等）に比べて、幅広い反応温度で自己集合体を
形成できることが確認できた。

【０１１７】（実施例７） １．目的 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを
用いたＰＡＬＳＡＲ法の反応時間の違いによる自己集合
体の形成。

【０１１８】２．方法 ２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成
用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイ
マ用ープローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ₂Ｏを８μＬ
（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に
４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて
図３５（ａ）に示したように、ダイマー溶液を作製し
た。

【０１１９】次に、このダイマー溶液に図３５（ｂ）に
示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１
μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１
μＬ加え、６４℃で各反応時間（０、１０秒、３０秒、
１分、１０分及び３０分）で反応させ、反応終了後氷上
で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電
気泳動で確認した。

【０１２０】３．結果 図３６に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写
真と図３７に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動
の写真結果から、ダイマー形成用プローブと架橋プロー
ブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成は、
一対のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（EP 1
002877A等）に比べて、きわめて短時間に自己集合体を
形成することが確認できた。

【０１２１】（実施例８） １．目的 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを
同時に反応させた場合のＰＡＬＳＡＲ法による自己集合
体の形成。

【０１２２】２．方法 図３８に示したように、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０
ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μ
Ｌ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−
２）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−Ｘ
Ｂ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−Ａ
Ｚ）を１μＬ、Ｈ₂Ｏを６μＬ（計２０μＬ）の反応溶
液を、９４℃で３０秒加熱後に各反応温度（５４、５
６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）
で３０分反応させ、０．５％と２．０％のアガロースゲ
ル電気泳動で確認した。

【０１２３】３．結果 図３９に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写
真と図４０に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動
の写真結果から、予め一対のダイマー形成用プローブで
ダイマーを形成させた後に架橋プローブを加えた場合と
異なり、６４℃以下の反応温度では未完全に自己集合体
を形成することができなかった。

【０１２４】（実施例９及び１０） １．目的 予め一対のダイマー形成用プローブを作製した後に一対
の架橋プローブを反応させた場合（実施例９）と一対の
ダイマー形成用プローブと架橋プローブを同時に反応さ
せた場合（実施例１０）のインターカレーター（ＳＹＢ
Ｒ^TMＧｒｅｅｎＩ）の蛍光測定による自己集合体の検
出。

【０１２５】２．方法 （実施例９）：予め一対のダイマー形成用プローブを作
製した後に一対の架橋プローブを反応させた場合。

【０１２６】Tsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×
Incubation bufferを２μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー
形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの
ダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、ＳＹＢ
Ｒ^TMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の
５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した
溶液）を１μＬ、Ｈ₂Ｏを１５μＬ（計２０μＬ）の反
応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応
させ、反応終了後氷上で急冷させて図４１（ａ）に示し
たように、ダイマー溶液を作製した。

【０１２７】次に、このダイマー溶液に図４１（ｂ）に
示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１
μＬと５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１
μＬ、２０×ＳＳＣを１０μＬ、Ｈ₂Ｏを８μＬ（計２
０μＬ）の反応溶液を各反応温度（５４、５６、５８、
６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反
応させ、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した
［図４１（ｃ）］。更に、反応温度５６℃の場合（図４
１（ｃ）の写真の○印の温度）について、反応開始から
３０秒、５分、１５分、３０分後にそれぞれＡＲＶＯ−
ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で蛍光強度を測定した。

【０１２８】（実施例１０）：一対のダイマー形成用プ
ローブと架橋プローブを同時に反応させた場合

【０１２９】図４２（ａ）に示したように、Tsc Ligase
（日本ロシュ）に添付の１０×Incubation bufferを２
μＬ、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマ
ー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌ
のダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、５０
ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０
ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ、ＳＹ
ＢＲ^TMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０
の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈し
た溶液）を１μＬ、Ｈ₂Ｏを２３μＬ（計４０μＬ）の
反応溶液を各反応温度（５４、５６、５８、６０、６
２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、
０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した［図４２
（ｃ）］。更に、反応温度５６℃の場合（図４２（ｃ）
の写真の○印の温度）について、反応開始から、３０
秒、５分、１５分、３０分秒にＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌ
ｌａｃ社）で蛍光強度を測定した。

【０１３０】３．結果 図４３に示したように、予め一対のダイマー形成用プロ
ーブでダイマーを形成させた後に架橋プローブを加えた
場合（実施例９）は、反応と同時に２本鎖の形成に挿入
されたインターカレーターにより強い蛍光強度が認めら
れ、その後は時間の経過とともに減少した。

【０１３１】また、一対のダイマー形成用プローブと一
対の架橋プローブを同時に反応させた場合（実施例１
０）は、反応時間による蛍光強度に変化は見られなかっ
た。

【０１３２】このことから、同時に一対のダイマー形成
用プローブと一対の架橋プローブを反応させた場合、規
則的な二本鎖の形成ではなく、凝集に似た状態で反応が
進行するものと思われる。

【０１３３】（実施例１１） １．目的 一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリー
サイト領域が挿入された一対の架橋プローブを用いた各
反応温度におけるＰＡＬＳＡＲによる自己集合体の形
成。

【０１３４】２．方法 ２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成
用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイ
マー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ ₂Ｏを８
μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱
後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷さ
せて図４４（ａ）に示したダイマー溶液を作製した。

【０１３５】このダイマー溶液に対して、図４４（ｂ）
に示した２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された
５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）を１
μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔ
ｔ）を１μＬ加え、各反応温度各（５２、５４、５６、
５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３
０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％
と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。

【０１３６】３．結果 図４５に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写
真と図４６に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動
の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿
入された架橋プローブの場合、幅広い反応温度域でＰＡ
ＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認された。

【０１３７】（実施例１２） １．目的 一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリー
サイト領域が挿入された一対の架橋プローブを用いた各
反応時間におけるＰＡＬＳＡＲによる自己集合体の形
成。

【０１３８】２．方法 ２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成
用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイ
マー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ ₂Ｏを８
μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱
後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷さ
せて図４７（ａ）に示したダイマー溶液を作製した。

【０１３９】このダイマー溶液に対して、図４７（ｂ）
に示した２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された
５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）を１
μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔ
ｔ）を１μＬ加え、６４℃における各反応時間（０、１
０秒、３０秒、１分、１０分及び３０分）後に氷上で急
冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳
動で確認した。

【０１４０】３．結果 図４８に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写
真と図４９に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動
の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿
入された架橋プローブの場合、短時間でＰＡＬＳＡＲ法
による自己集合体の形成か確認された。

【０１４１】（実施例１３） １．目的 一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリー
サイト領域が挿入された一対の架橋プローブを同時に反
応させた場合のＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形
成。

【０１４２】２．方法 図５０に示したように、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０
ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μ
Ｌ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−
２）を１μＬ、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入
された５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔ
ｔ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−Ａ
Ｚ−ｔｔ）を１μＬ、Ｈ₂Ｏを６μＬ（計２０μＬ）を
各反応温度（５２、５４、５６、５８、６０、６２、６
４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、反応終
了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロー
スゲル電気泳動で確認した。

【０１４３】３．結果 図５１に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写
真と図５２に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動
の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿
入された架橋プローブを一対のダイマー形成用プローブ
と同時に反応させた場合、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集
合体の形成は阻害された。

【０１４４】（実施例１４及び比較例６） １．目的 ターゲット遺伝子とダイマー形成用プローブによるライ
ゲーション反応の確認。

【０１４５】２．方法 図５３（ｂ）に示したダイマー形成用プローブ−（Ｂ−
３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）の１６
塩基の領域と相補的な３２塩基の塩基配列を持つ図５３
（ａ）に示した１００ｐｍｏｌのターゲット遺伝子を１
μＬ、T4 Ligase用の１０×Ligation bufferを２μＬ、
T4 Ligaseを１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プ
ローブ−（Ｂ−３４）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマ
ー形成用プローブ−（Ａ−３４）を１μＬ、Ｈ₂Ｏを１
４μＬ（計２０μＬ）を３８℃で９０分間、６０分間、
３０分間または１５分間反応（図５３（ｃ）（ｄ））さ
せた後、１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で確
認した。対照として、T4 Ligaseを添加しない場合も同
様に行った（比較例６）。

【０１４６】３．結果 図５４に示した１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果から、６２塩基のターゲット遺伝子（）、未
反応な３４塩基のダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３
４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）（）、
ターゲット遺伝子にダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３
４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）がハイブ
リダイゼーションした１３０塩基のバンド（）が確認
された。

【０１４７】また、図５５に示したライゲーション反応
後に９５℃で１０分間の熱処理をした場合の１２％のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、図５４のバ
ンドに加えて、ターゲット遺伝子にハイブリダイゼーシ
ョンして、ライゲーション反応により連結されたダイマ
ー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プロ
ーブ−（Ａ−３４）の６８塩基のバンド（）が確認さ
れた。

【０１４８】以上のことから、両端に余分な塩基配列を
有するダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマ
ー形成用プローブ−（Ａ−３４）におけるライゲーショ
ン反応が確認された。

【０１４９】（実施例１５及び比較例７） １．目的 ＭＲＳＡ ＤＮＡとダイマー形成用プローブによるライ
ゲーション反応（第１ステップ）、及び架橋プローブに
よる重合反応とインターカレーター（ＳＹＢＲＧｒｅｅ
ｎ Ｉ）による検出（第２ステップ）。

【０１５０】２．方法 図５６（ａ）に示したように、第１ステップの系として
ＭＲＳＡのＤＮＡ（ｍｅｃＡ）と相補的な塩基配列を有
する５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−
３）を１μＬと５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ
−（Ａ−３Ｐ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成
用プローブ−（Ａ−４）を１μＬと５０ｐｍｏｌのダイ
マー形成用プローブ−（Ａ−４Ｐ）を１μＬ、１０⁴個
のＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを５μＬ、Tsc-Ligase用
のTsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Ligation b
ufferを３μＬ、Tsc-Ligase（日本ロシュ社）を１μ
Ｌ、ＳＹＢＲ^TMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐ
Ｈ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍
に希釈した溶液））を１μＬ、Ｈ₂Ｏを１６μＬ（計３
０μＬ）の反応溶液を、図５６（ｂ）に示したように、
Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用
いて、９５℃で３０秒間加熱後、４５℃で９０秒間と９
５℃で１０秒間のサーマルサイクリングを４５回行い、
９５℃で１０分間の熱処理によりTsc-Ligaseを失活させ
た後、４５℃で３０分間反応させてライゲーション溶液
とする。対照には、第１ステップの反応液に用いたＭＲ
ＳＡの代わりに、１０４cellｌｓ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ
から抽出したＤＮＡを用いた（比較例７）。

【０１５１】次に、図５７（ａ）に示したように、第２
ステップの系として５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ
−５）を１μＬと５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−
６）を１μＬ、２０×ＳＳＣを１５μＬ、Ｈ₂Ｏを１３
μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を上記したライゲーショ
ン溶液に加え、図５７（ｂ）に示したように、Ｇｅｎｅ
Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥ社
製）を用いた５８℃の各反応時間（０、５、１５及び３
０分）における重合反応の蛍光強度をＡＲＶＯ−ＳＸ
（Ｗａｌｌａｃ社）で測定した。

【０１５２】また、各反応時間における自己集合体の形
成を０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。

【０１５３】３．結果 図５８（ｂ）に示した架橋プローブの添加と同時に重合
反応が開始され、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形
成が確認された（図５８（ａ））。

【０１５４】また、各反応時間における蛍光強度では、
ＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを用いた系（実施例１５）
においてのみ架橋プローブの添加と同時に高い蛍光強度
が得られ、時間の経過とともに蛍光は減少した。一方、
Ｅ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた系（比較例
７）では、時間の経過による蛍光強度に変化は認められ
なかった（図５９（ａ）、（ｂ））。

【０１５５】（実施例１６及び比較例８） １．目的 ダイマー形成用プローブによるライゲーション反応、及
び架橋プローブによる重合反応とインターカレーター
（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）によるＭＲＳＡの検出限
界試験。

【０１５６】２．方法 第１ステップの系として、ターゲット遺伝子に１０１ce
llｌｓ／ｍＬ、１０２cellｌｓ／ｍＬ、１０３cellｌｓ
／ｍＬ、１０４cellｌｓ／ｍＬのＭＲＳＡから抽出した
ＤＮＡ（clinical isolate）を１０μＬ、ダイマー形成
用プローブのＡ−３、Ａ−３Ｐ、Ａ−４、Ａ−４Ｐを１
μＬずつ、Tsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Li
gation bufferを３μＬ、Tsc-Ligase（日本ロシュ社）
を１μＬ、ＳＹＢＲ^TMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProduct
s，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００
００倍に希釈した溶液）を１μＬ、Ｈ₂Ｏを１４μＬ
（計３０μＬ）の反応溶液を９５℃で３０秒間加熱後、
実施例１５と同様、４５℃で９０秒間と９５℃で１０秒
間のサーマルサイクリングを４５回行い、９５℃で１０
分間の熱処理によりTsc-Ligaseを失活させた後、４５℃
で３０分間反応させライゲーション溶液とする。対照に
は、第１ステップの反応液に用いたＭＲＳＡの代わり
に、１０１cellｌｓ／ｍＬ、１０２cellｌｓ／ｍＬ、１
０３cellｌｓ／ｍＬ、１０４cellｌｓ／ｍＬのＥ．ｃｏ
ｌｉから抽出したＤＮＡを用いた（比較例８）。

【０１５７】次に、第２ステップの系として５０ｐｍｏ
ｌの架橋プローブ−（Ａ−５）を１μＬと５０ｐｍｏｌ
の架橋プローブ−（Ａ−６）を１μＬ、２０×ＳＳＣを
１５μＬ、Ｈ₂Ｏを１３μＬ（計３０μＬ）の反応溶液
を上記したライゲーション溶液に加え、５８℃で３０秒
間、重合反応させた時の蛍光強度をＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗ
ａｌｌａｃ社）で測定した。

【０１５８】３．結果 図６０に示したようにＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを用
いた系（実施例１６）において、ＭＲＳＡの菌量に依存
した強い蛍光強度を確認した。また、Ｅ．ｃｏｌｉから
抽出したＤＮＡを用いた系（比較例８）においては、い
ずれの菌量においても蛍光の増加は認められなかった。

【０１５９】

【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己
集合体の作製方法により、核酸合成酵素や枝分かれした
ＤＮＡを用いずに、効率よくターゲット遺伝子の検出を
行うことができる。また、本発明の自己集合体の安定化
方法、及びその自己集合体の検出方法は、形成される自
己集合体の塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとるこ
とから、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減
じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させて
自己集合体の状態を確認することが可能である。さらに
は、自己集合体の塩基の積み重ねの間に安価な蛍光物質
を挿入させて、その蛍光強度の変化から自己集合体の状
態を確認できるために、今までになく低コストでしかも
簡便に遺伝子を検出することができるという顕著な効果
を奏する。

【０１６０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sanko Junyaku Co., Ltd. <120> Method for Forming Self-Assembled Oligonucleotides And Method For Detecting Gene <130> 76106-P2 <150> JP 2001-081222 <151> 2001-03-21 <160> 15 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 1 gtgctgactt aaccggatac gaacaggatc ctagacctag catagtacag tccgatggtg 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 2 cctcaagacg catgtctttc ctaggtctag gatcctgttc ctagaacgga ctgtacttcg 60 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 3 gtatccggtt aagtcagcac caccatcgga ctgtactatg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 4 gaaagacatg cgtcttgagg cgaagtacag tccgttctag 40 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 5 gaaagacatg cgtcttgagg tcgactcgaa gtacagtccg ttctag 46 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 6 gtatccggtt aagtcagcac tcagctcacc atcggactgt actatg 46 <210> 7 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 7 ggatcctaga cctagtgttt gagggtggat agcagtacct gagccatcta ggtctaggat 60 cc 62 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 8 gctgacttaa ccggatacat ggctcaggta ctgc 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> Phosphoric acid attached at the 5' end <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 9 tatccaccct caaacagatt ggtactgcga gata 34 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 10 gtgctgactt aaccggatac gattatggct caggtactgc 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> Phosphoric acid attached at the 5' end <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 11 tatccaccct caaacaggtg gattggtact gcgagatagg 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 12 gacgctttct gcgtgtatag cacctgtttg agggtggata 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> Phosphoric acid attached at the 5' end <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 13 gcagtacctg agccataatc ctagaacgga tcgtacttcg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 14 gtatccggtt aagtcagcac cctatctcgc agtaccaatc 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 15 ctatacacgc agaaagcgtc cgaagtacga tccgttctag 40

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の為の改良したＨＣＰプローブ（ダイ
マー形成用プローブ）によるライゲーション反応を示す
模式図であり、（ａ）は切断された一対のダイマー形成
用プローブ、（ｂ）は連結された一対のダイマー形成用
プローブにより形成されたダイマー、及び（ｃ）は切断
された一対のダイマー形成用プローブにより形成された
ダイマーをそれぞれ示す。

【図２】 ＨＣＰプローブによるライゲーション反応を
示す模式図であり、（ａ）は切断されたＨＣＰ、（ｂ）
は連結されたＨＣＰにより形成されたダイマー、（ｃ）
は切断されたＨＣＰにより形成されたダイマー、及び
（ｄ）は（ｃ）より形成される複合体である。

【図３】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場
合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一対
のオリゴヌクレオチド、（ｂ）は第２の系の一対のオリ
ゴヌクレオチドをそれぞれ示す。

【図４】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場
合の一例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー
形成用プローブより形成されるダイマー及び一対の架橋
プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。

【図５】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１にお
ける架橋プローブの例を示す模式図であり、（ａ）は一
対の架橋プローブの一例、（ｂ）は一対の架橋プローブ
の別の例をそれぞれ示す。

【図６】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場
合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一
対のオリゴヌクレオチド、（ｂ）は第２の系の一対のオ
リゴヌクレオチドをそれぞれ示す。

【図７】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場
合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマ
ー形成用プローブより形成されるダイマー及び一対の架
橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示
す。

【図８】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場
合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一対
のオリゴヌクレオチド及び形成されるダイマー、（ｂ）
は第２の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｃ）は第３
の系の一対のオリゴヌクレオチド及び形成されるダイマ
ー、及び（ｄ）は第４の系の一対のオリゴヌクレオチド
をそれぞれ示す。

【図９】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場
合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１及び第３の
系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイ
マー並びに第２及び第４の系の一対の架橋プローブ、
（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。

【図１０】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝４の
場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１、第３、
第５及び第７の系の一対のダイマー形成用プローブより
形成されるダイマー並びに第２、第４、第６及び第８の
系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成を
それぞれ示す。

【図１１】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の
場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１及び第
３の系の一対のダイマー形成用プローブより形成される
ダイマー並びに第２及び第４の系の一対の架橋プロー
ブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。

【図１２】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝４の
場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１、第
３、第５及び第７の系の一対のダイマー形成用プローブ
より形成されるダイマー並びに第２、第４、第６及び第
８の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形
成をそれぞれ示す。

【図１３】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の
場合において、フリーサイト領域を有する架橋プローブ
を用いた例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマ
ー形成用プローブ及び形成されるダイマー、（ｂ）はフ
リーサイト領域を有する一対の架橋プローブをそれぞれ
示す。

【図１４】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の
場合において、フリーサイト領域を有する架橋プローブ
を用いた例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマ
ー形成用プローブより形成されるダイマー及びフリーサ
イト領域を有する一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集
合体の形成をそれぞれ示す。

【図１５】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の
場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互
いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模
式図であり、（ａ）はｎ＝１における一対のダイマー形
成用プローブ、（ｂ）は３’側領域及び５’側領域をそ
れぞれ互いに同一な塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領
域＝Ｄ’領域）とした、一対のダイマー形成用プローブ
をそれぞれ示す。

【図１６】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の
場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互
いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模
式図であり、（ａ）はｎ＝１における一対の架橋プロー
ブの一例、（ｂ）は３’側領域及び５’側領域をそれぞ
れ互いに同一な塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領域＝
Ｄ’領域）とした、一対の架橋プローブをそれぞれ示
す。

【図１７】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の
場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互
いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模
式図であり、（ａ）は図１５で示したダイマー形成用プ
ローブから形成されるダイマー及び図１６に示した架橋
プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。

【図１８】 スタッキング効果を利用した一対のダイマ
ー形成用プローブ及び一対の架橋プローブの一例を示す
模式図である。

【図１９】 ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブ
より形成される自己集合体におけるスタッキング効果に
よる自己集合体の形成の安定化の原理を示す模式図であ
り、（ａ）はハイブリダイゼーションの安定化、（ｂ）
は自己集合体の安定化をそれぞれ示す。

【図２０】 ターゲット遺伝子の検出に用いるプローブ
の模式図であり、（ａ）はターゲット遺伝子と相補的な
領域が切断された一対のダイマー形成用プローブ、
（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示す。

【図２１】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架
橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図
であり、（ａ）は二本鎖のターゲット遺伝子、（ｂ）は
ターゲット遺伝子と相補的な領域を１箇所切断された一
対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）はターゲット遺伝
子と切断されたダイマー形成用プローブのハイブリダイ
ゼーション反応、（ｄ）は切断されたダイマー形成用プ
ローブのライゲーション反応をそれぞれ示す。

【図２２】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架
橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図
であり、（ｅ）は連結されたダイマー形成用プローブ、
（ｆ）は切断されたダイマー形成用プローブ、（ｇ）は
連結されたダイマー形成用プローブと切断されたダイマ
ー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応、
（ｈ）は切断されたダイマー形成用プローブのライゲー
ション反応をそれぞれ示す。

【図２３】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架
橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図
であり、（ｉ）は一対の架橋プローブ、（ｊ）は自己集
合体の形成をそれぞれ示す。

【図２４】 中央領域の異なる２組の一対のダイマー形
成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺
伝子の検出を示す模式図であり、（ａ）は二本鎖のター
ゲット遺伝子、（ｂ）及び（ｃ）はターゲット遺伝子と
相補的な領域を１箇所切断された一対のダイマー形成用
プローブ、（ｄ）及び（ｅ）はターゲット遺伝子と切断
されたダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーショ
ン反応をそれぞれ示す。

【図２５】 中央領域の異なる２組の一対のダイマー形
成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺
伝子の検出を示す模式図であり、（ｆ）及び（ｇ）は連
結されたダイマー形成用プローブより形成されるダイマ
ー、（ｈ）は一対の架橋プローブ、（ｉ）は自己集合体
の形成をそれぞれ示す。

【図２６】 実施例１を模式的に示す説明図である。

【図２７】 実施例１及び比較例１の結果を示す写真で
ある。

【図２８】 比較例２を模式的に示す説明図である。

【図２９】 比較例２〜４の結果を示す写真である。

【図３０】 実施例２〜５を模式的に示す説明図であ
る。

【図３１】 実施例２〜５及び比較例５の結果を示す写
真である。

【図３２】 実施例６を模式的に示す説明図であり、
（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成された
ダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示
す。

【図３３】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例６
の結果を示す写真である。

【図３４】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例６
の結果を示す写真である。

【図３５】 実施例７を模式的に示す説明図であり、
（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成された
ダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示
す。

【図３６】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例７
の結果を示す写真である。

【図３７】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例７
の結果を示す写真である。

【図３８】 実施例８を模式的に示す説明図である。

【図３９】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例８
の結果を示す写真である。

【図４０】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例８
の結果を示す写真である。

【図４１】 実施例９を模式的に示す説明図であり、
（ａ）は予め一対のダイマー形成用プローブより作製さ
れたダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブ、（ｃ）は
アガロースゲル電気泳動法写真をそれぞれ示す。

【図４２】 実施例１０を模式的に示す説明図であり、
（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋
プローブ、（ｂ）はアガロースゲル電気泳動法写真をそ
れぞれ示す。

【図４３】 実施例９及び実施例１０の結果を示すグラ
フである。

【図４４】 実施例１１を模式的に示す説明図であり、
（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成された
ダイマー、（ｂ）フリーサイト領域を有する一対の架橋
プローブをそれぞれ示す。

【図４５】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１
１の結果を示す写真である。

【図４６】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１
１の結果を示す写真である。

【図４７】 実施例１２を模式的に示す説明図であり、
（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成された
ダイマー、（ｂ）フリーサイト領域を有する一対の架橋
プローブをそれぞれ示す。

【図４８】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１
２の結果を示す写真である。

【図４９】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１
２の結果を示す写真である。

【図５０】 実施例１３を模式的に示す説明図である。

【図５１】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１
３の結果を示す写真である。

【図５２】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１
３の結果を示す写真である。

【図５３】 実施例１４を模式的に示す説明図であり、
（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）は切断されたダイマ
ー形成用プローブ、（ｃ）はターゲット遺伝子とダイマ
ー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応、及び
（ｄ）は切断されたダイマー形成用プローブのライゲー
ション反応をそれぞれ示す。

【図５４】 熱処理を行なわない実施例１４の結果を示
す写真である。

【図５５】 熱処理後の実施例１４の結果を示す写真で
ある。

【図５６】 実施例１５の第１ステップ（ライゲーショ
ン反応）を模式的に示す説明図（ａ）及びグラフ（ｂ）
である。

【図５７】 実施例１５の第２ステップ（重合反応）を
模式的に示す説明図（ａ）及びグラフ（ｂ）である。

【図５８】 実施例１５及び比較例７の結果を示す電気
泳動法写真（ａ）及び自己集合体形成のグラフ（ｂ）で
ある。

【図５９】 実施例１５及び比較例７の結果を示す電気
泳動法写真（ａ）及び蛍光強度のグラフ（ｂ）である。

【図６０】 実施例１６及び比較例８の結果を示すグラ
フである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 21/33 // Ｇ０１Ｎ 21/33 21/64 Ｆ 21/64 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 EA01 GA28 GB28 2G045 BA13 DA12 DA13 DA14 FA27 FB02 FB05 FB07 FB12 GC10 GC15 2G059 AA05 BB12 CC16 DD03 EE01 HH03 HH06 4B024 AA11 CA05 CA09 CA11 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR20 QR32 QR56 QS22 QS34 QS36 QX02

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌ
   クレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央
   領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌ
   クレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、
   ３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列
   とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目
   の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番に
   ｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、 Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各
   オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つ
   の領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び
   ５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の
   架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番
   目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系と
   を有し、該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブ
   より形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配
   列とし、該プローブをハイブリダイゼーションさせるこ
   とにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の
   規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴ
   ヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
2. 【請求項２】 前記ｎ＝１であり、前記プローブの塩基
   配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
   ３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチド
   の３’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオ
   チドの５’側領域、第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレ
   オチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌク
   レオチドの３’側領域、第２の系のＮｏ．３−オリゴヌ
   クレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴ
   ヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配
   列とすることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレ
   オチドによる自己集合体の作製方法。
3. 【請求項３】 前記ｎ＝１であり、前記プローブの塩基
   配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
   ３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチド
   の３’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオ
   チドの５’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
   オチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌク
   レオチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌ
   クレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴ
   ヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配
   列とすることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレ
   オチドによる自己集合体の作製方法。
4. 【請求項４】 前記ｎ≧２であり、前記プローブの塩基
   配列を、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌ
   クレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮ
   ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−
   ３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側
   領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌク
   レオチドの５’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮ
   ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−
   １）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側
   領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌク
   レオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮ
   ｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、ダイマー形
   成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
   ドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−
   オリゴヌクレオチドの３’側領域、ダイマー形成用プロ
   ーブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’
   側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌ
   クレオチドの５’側領域、架橋プローブの最後の系のＮ
   ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の
   系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、架橋
   プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
   ５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオ
   チドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列とする
   ことを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチドに
   よる自己集合体の作製方法。
5. 【請求項５】 前記ｎ≧２であり、前記プローブの塩基
   配列を、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌ
   クレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮ
   ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−
   ３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側
   領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌク
   レオチドの５’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮ
   ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−
   １）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側
   領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌク
   レオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮ
   ｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、ダイマー形
   成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
   ドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−
   オリゴヌクレオチドの３’側領域、ダイマー形成用プロ
   ーブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’
   側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌ
   クレオチドの５’側領域、架橋プローブの最後の系のＮ
   ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の
   系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、架橋
   プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
   ５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオ
   チドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列とする
   ことを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチドに
   よる自己集合体の作製方法。
6. 【請求項６】 前記プローブのハイブリダイゼーション
   が、あらかじめ前記ダイマー形成用プローブからダイマ
   ーを形成させた後、前記架橋プローブと該ダイマーをハ
   イブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項１
   〜５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自
   己集合体の作製方法。
7. 【請求項７】 前記複数対のダイマー形成用プローブ
   が、前記中央領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマー形
   成用プローブからなることを特徴とする請求項１〜６の
   いずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合
   体の作製方法。
8. 【請求項８】 前記架橋プローブが、３’側領域と５’
   側領域の中央部にダイマー形成用プローブと架橋プロー
   ブの各領域の塩基配列とは非相補的な領域を有すること
   を特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載のオリゴ
   ヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
9. 【請求項９】 請求項８記載のフリーサイト領域が、Ｄ
   ＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びオリゴヌクレオチド
   と結合できるペプチド、ポリマー性粒子、磁性体粒子、
   またはその他の化合物であることを特徴とする請求項７
   記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方
   法。
10. 【請求項１０】 前記一対のダイマー形成用プローブの
    ３’側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配
    列とすることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項
    記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方
    法。
11. 【請求項１１】 前記プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｐ
    ＮＡ又はＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成さ
    れることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記
    載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
12. 【請求項１２】 前記プローブの相補的塩基配列領域の
    分岐点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ
    （シトシン）を配置させ、プローブがハイブリダイズし
    た際に少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領
    域の端部に形成させることを特徴とする請求項１〜１１
    のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集
    合体の作製方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項記載の
    方法で形成された自己集合体。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載の自己集合体をオリゴ
    ヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインター
    カレーターを用いて検出することを特徴とする自己集合
    体の検出方法。
15. 【請求項１５】 請求項１３記載の自己集合体を、該自
    己集合体に蛍光物質を結合させ、発光により検出するこ
    とを特徴とする自己集合体の検出方法。
16. 【請求項１６】 請求項１３記載の自己集合体を、紫外
    線に対する光学的な吸収の変化を利用して検出すること
    を特徴とする自己集合体の検出方法。
17. 【請求項１７】 請求項１〜１２のいずれか１項記載の
    オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用い
    る遺伝子の検出方法であり、前記ダイマー形成用プロー
    ブ及び／又は架橋プローブのオリゴヌクレオチドを、タ
    ーゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリ
    ゴヌクレオチドを含むように構成し、ターゲット遺伝子
    と相補的な領域を少なくとも１箇所予め切断しておき、
    温度制御により、ハイブリダイゼーション反応、ライゲ
    ーション反応及び解離反応をさせ、該切断されたプロー
    ブを連結させて完全なプローブを形成させ、前記オリゴ
    ヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いて自己
    集合体を作製させ、該自己集合体を検出することによ
    り、ターゲット遺伝子を検出することを特徴とする遺伝
    子の検出方法。
18. 【請求項１８】 前記ターゲット遺伝子の一部と相補的
    な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、前記ダイマ
    ー形成用プローブであり、該ダイマー形成用プローブの
    オリゴヌクレオチドのうち、少なくとも一つのオリゴヌ
    クレオチドの中央領域を、ターゲット遺伝子と相補的な
    塩基配列を有する領域となるように構成し、ターゲット
    遺伝子と相補的なダイマー形成用プローブの各オリゴヌ
    クレオチドの中央領域の片側、または両側の一箇所、ま
    たは複数箇所をあらかじめ切断しておくことを特徴とす
    る請求項１７記載の遺伝子の検出方法。
19. 【請求項１９】 前記ライゲーション反応をリガーゼ酵
    素、耐熱性のリガーゼ酵素、又は酵素を使用しないオー
    トライゲーションを用いて行うことを特徴とする請求項
    １７又は１８記載の遺伝子の検出方法。
20. 【請求項２０】 前記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮ
    Ａ及び／またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項
    １７〜１９のいずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
21. 【請求項２１】 前記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮ
    Ａ及び／またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項
    １７〜１９のいずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
22. 【請求項２２】 前記あらかじめ切断されたオリゴヌク
    レオチドの切断部分がＳＮＰｓ（一塩基多形）の部分と
    相補的になるようにデザインされることを特徴とする請
    求項１７〜２１のいずれか１項記載の遺伝子の検出方
    法。
23. 【請求項２３】 前記自己集合体を、オリゴヌクレオチ
    ドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインターカレーター
    を用いて検出することを特徴とする請求項１７〜２２の
    いずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
24. 【請求項２４】 前記自己集合体を、該自己集合体に蛍
    光物質を結合させ、発光により検出することを特徴とす
    る請求項１７〜２２のいずれか１項記載の遺伝子の検出
    方法。
25. 【請求項２５】 前記自己集合体を、紫外線に対する光
    学的な吸収の変化を利用して検出することを特徴とする
    請求項１７〜２２のいずれか１項記載の遺伝子の検出方
    法。