JPH09220099A

JPH09220099A - プローブを用いた核酸の検出方法

Info

Publication number: JPH09220099A
Application number: JP8054278A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Shigemori; 康司重森; Jun Fujiwara; 純藤原
Original assignee: AISIN KOSUMOSU KENKYUSHO KK
Current assignee: AISIN KOSUMOSU KENKYUSHO KK
Priority date: 1996-02-15
Filing date: 1996-02-15
Publication date: 1997-08-26

Abstract

(57)【要約】【課題】核酸の正確な情報を得ることができ，核酸に
損傷を与えることなく検出することができる，プローブ
を用いた核酸の検出方法を提供する。【解決手段】既知の特定塩基配列を３’末端及び５’
末端の双方に分断して設けてなり，且つ標識物質１９を
結合させた１本鎖ＤＮＡプローブ１と，ＲｅｃＡ蛋白質
分子３とを混合した溶液に，上記特定塩基配列と相補的
な塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ２を含む被検体ＤＮＡ
を加え，更にライゲース４を加えることにより，２本鎖
ＤＮＡの該塩基配列上に，１本鎖ＤＮＡプローブの両末
端に設けた特定塩基配列１０を重ね合わせると共に，上
記両末端同志を結合させて環状ＤＮＡプローブ１５とな
し，次にＲｅｃＡ蛋白質分子を除去してハイブリッドＤ
ＮＡを得る。その後，標識物質を手掛かりに，ハイブリ
ッドＤＮＡを検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は，１本鎖ＤＮＡプローブを用い
て，特定の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡを検出する方
法に関する。

【０００２】

【従来技術】分子生物学，臨床検査の分野においては，
既知の特定塩基配列を有するプローブを用いて，未知の
塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列を決定することが行
われている。かかる塩基配列決定方法としては，従来，
以下の先行技術が開示されている。第１の先行技術とし
ては，サザンハイブリダイゼーションが挙げられる（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈＶｏ
ｌ．１４，Ｎｏ．２４，ｐｐ．９９４３─９９５４，１
９８６）。この技術は，メンブレン等の固相担体上にあ
る変成した核酸を，該核酸に相補的なポリヌクレオチド
プローブとハイブリダイゼーション反応を行うものであ
る。

【０００３】第２の先行技術としては，被検体ＤＮＡに
オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ，両
者を架橋剤により架橋させることが挙げられる（Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１９７，Ｎｏ．２，ｐｐ．
３４９−３６２，１９８７）。この技術においては，オ
リゴヌクレオチドプローブを³²Ｐ及び二機能性架橋剤Ｈ
ＭＴ（４’−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−４，５’，
８─ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｓｏｒａｌｅｎ）により標識
し，紫外線の照射によりオリゴヌクレオチドプローブを
被検体ＤＮＡに架橋させている。

【０００４】この場合，ハイブリダイゼーションと被検
体ＤＮＡの光固定とは，溶液中で，ハイブリッドの溶融
温度に近い条件下で同時に行う。近紫外光（波長：３２
０〜４００ｎｍ）を照射すると，ハイブリッド複合体に
存在する架橋剤によってハイブリッドが架橋される。過
剰のプローブを除去し，最終的にアルカリ性変成アガロ
ースによってプローブからのシグナルを検出する。

【０００５】第３の先行技術としては，ＲｅｃＡ蛋白質
分子を用いて１本鎖ＤＮＡプローブを被検体ＤＮＡに結
合させて，被検体ＤＮＡの塩基配列を決定する方法が挙
げられる（ＵＳＰ４８８８２７４；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，ｖｏｌ．２６３，Ｎｏ．２９，ｐｐ．１５１１
０−１５１１７，１９８８）。ＲｅｃＡ蛋白質分子はＤ
ＮＡの組み換えに関与している酵素蛋白質で，ＡＴＰの
存在下で一本鎖オリゴヌクレオチドと結合することによ
って，ＤＮＡの組み換えを行う。ＡＴＰの代わりに類似
体であるＡＴＰ─γＳを用いることにより，被検体ＤＮ
Ａとオリゴヌクレオチドとの組み換え中間体が形成され
る。

【０００６】第４の先行技術としては，南京錠型オリゴ
ヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼー
ションが挙げられる（Ｓｃｉｅｎｃｅｖｏｌ．２６
５，ｐｐ．２０８５−２０８８，１９９４）。この技術
は，溶液中で，１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡに，それに部
分的に連続した相補的塩基配列を両端に持つオリゴヌク
レオチドをハイブリダイゼーションさせ，同時にライゲ
ースによるライゲーション反応を行う。

【０００７】このライゲーション反応により，オリゴヌ
クレオチドは南京錠のように被検体ＤＮＡにからまるた
め，その後の変成ゲル電気泳動でも被検体ＤＮＡから離
れることはなく，ハイブリッド複合体を検出することが
できる。

【０００８】

【解決しようとする課題】しかしながら，上記従来の核
酸の検出方法においては，以下の問題点がある。まず，
第１の先行技術においては，極めて低いモル濃度のプロ
ーブを使用するため，その反応速度は極めて遅い。ま
た，プローブが固相担体上に非特異的に付着してしまう
ため，バックグランドのシグナルが高くなり，検出感度
に限界がある。

【０００９】第２の先行技術においては，被検体ＤＮＡ
の電気泳動がアルカリ性変成条件下で行われるため，得
られる情報がＤＮＡの１本鎖ＤＮＡの情報でしかない。
また，被検体としてゲノムＤＮＡを用いる場合，ゲノム
ＤＮＡにはニックが入っていることが多く，変成条件下
でハイブリダイゼーションを行う場合には，被検体ＤＮ
Ａの長さについての正確な情報が得られない可能性があ
る。

【００１０】第３の先行技術においては，オリゴヌクレ
オチドが数十ｍｅｒ以下の短いものである場合には，Ｒ
ｅｃＡ組み換え中間体が不安定となる。かかる場合に
は，オリゴヌクレオチドをＨＭＴで標識することによ
り，組み換え反応中又は反応後に光架橋を行って，組み
換え中間体を固定しなければならず，操作が複雑とな
る。また，光架橋によるＨＭＴオリゴヌクレオチドの，
被検体ＤＮＡへの非特異的結合や，ＤＮＡへの強い紫外
線照射によって，ＤＮＡが切断される等，損傷を受ける
ことがある。

【００１１】第４の先行技術においては，被検体として
は１本鎖の核酸を用いなければならず，２本鎖ＤＮＡの
検出には不向きである。

【００１２】本発明はかかる従来の問題点に鑑み，核酸
の正確な情報を得ることができ，核酸に損傷を与えるこ
となく検出することができる，プローブを用いた核酸の
検出方法を提供しようとするものである。

【００１３】

【課題の解決手段】請求項１に記載の発明は，既知の特
定塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡプローブを用いて，上
記特定塩基配列と相補的な塩基配列を有する２本鎖ＤＮ
Ａを，被検体ＤＮＡの中から検出する方法において，ま
ず，既知の特定塩基配列を３’末端及び５’末端の双方
に分断して設けてなり，且つ標識物質を結合させた１本
鎖ＤＮＡプローブと，ＲｅｃＡ蛋白質分子とを混合した
溶液に，上記塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡを含む被検
体ＤＮＡを加え，更にライゲースを加えることにより，
上記塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡの該塩基配列上に，
上記１本鎖ＤＮＡプローブの３’末端及び５’末端に設
けた特定塩基配列を重ね合わせると共に，上記１本鎖Ｄ
ＮＡプローブの３’末端と５’末端とをリン酸エステル
結合により結合させて環状ＤＮＡプローブとなしてＲｅ
ｃＡ組換中間体を形成し，次に，上記ＲｅｃＡ組換中間
体から上記ＲｅｃＡ蛋白質分子を除去して，上記２本鎖
ＤＮＡの上記塩基配列の上に，環状ＤＮＡプローブに設
けた上記特定塩基配列を重ね合わせてなるハイブリッド
ＤＮＡを形成させ，次に，該ハイブリッドＤＮＡの中の
環状ＤＮＡプローブに結合している上記標識物質を手掛
かりにして，上記ハイブリッドＤＮＡを，被検体ＤＮＡ
の中から検出することを特徴とする核酸の検出方法であ
る。

【００１４】本発明において最も注目すべきことは，Ｒ
ｅｃＡ蛋白質分子により１本鎖ＤＮＡプローブに２本鎖
ＤＮＡをハイブリダイズさせてハイブリッドＤＮＡを形
成させると共に，更にライゲース添加により１本鎖ＤＮ
Ａプローブを環状化させていることである。

【００１５】ここに，ＲｅｃＡ蛋白質分子は，元来ＤＮ
Ａに突然変異を生じた場合に，その変異部位を正常な塩
基配列に組み換えるという組み換え反応に関与する蛋白
質である。この発明においては，ＲｅｃＡ蛋白質分子
を，１本鎖ＤＮＡプローブと２本鎖ＤＮＡとからなるハ
イブリッドＤＮＡの形成に用いる。

【００１６】即ち，図１に示すごとく，１本鎖ＤＮＡプ
ローブ１には予め標識物質１９が結合している。そし
て，１本鎖ＤＮＡプローブ１の特定塩基配列は，３’末
端側と５’末端側とに分断されて分割塩基配列１１，１
２として配置されている。そのため，特定塩基配列１０
を有する２本鎖ＤＮＡ２をＲｅｃＡ蛋白質分子３と共に
加えたとき，１本鎖ＤＮＡプローブ１が２本鎖ＤＮＡ２
の周囲をＣ字状に取り巻くようにして絡み合う。

【００１７】そして，分割塩基配列１１，１２が，３’
末端塩基と５’末端塩基とを介して，連続した上記特定
塩基配列１０を構成する。１本鎖ＤＮＡプローブ１にお
ける該特定塩基配列１０は，ＲｅｃＡ蛋白質分子３のＤ
ＮＡ修復作用により，２本鎖ＤＮＡの特定塩基配列上に
重なり合う。

【００１８】更に，ライゲース４の添加により，Ｃ字状
に湾曲した１本鎖ＤＮＡプローブ１は，その３’末端塩
基と５’末端塩基との間でリン酸エステル結合を形成し
て，２本鎖ＤＮＡ２の周囲を取り囲んで環状ＤＮＡプロ
ーブ１５となる。これにより，環状ＤＮＡプローブ１５
は，もはや２本鎖ＤＮＡ２から取り外すことができなく
なる。従って，このような環状ＤＮＡプローブ１５及び
２本鎖ＤＮＡ２からなるハイブリッドＤＮＡに対して，
熱変性，アルカリ変性等の処理を行っても，両者の結合
状態は破壊されないと考えられる。

【００１９】また，ハイブリッドＤＮＡは，２本鎖ＤＮ
Ａと１本鎖ＤＮＡプローブとの結合体からなる。そのた
め，変成処理の有無によって，ハイブリッドＤＮＡの構
造はかわらない。それ故，ハイブリッドＤＮＡに対して
変成処理を行うことは何ら意味をなさない。そのため，
電気泳動を変成条件下で行う必要はなく，操作が容易で
ある。

【００２０】また，本発明の検出方法においては，２本
鎖ＤＮＡのまま検出するため，２本鎖ＤＮＡ自体の情報
をそのまま得ることができる。また，ニックの入った２
本鎖ＤＮＡについても，正確な情報を得ることができ
る。また，強い紫外線を２本鎖ＤＮＡに照射する光架橋
を形成する必要がないため，ＤＮＡに損傷を与えること
なく検出することができる。そのため，検出された２本
鎖ＤＮＡは，ゲノムサザン分析等への利用が期待でき
る。

【００２１】そして，１本鎖ＤＮＡプローブには予め標
識物質が結合しているため，該１本鎖ＤＮＡプローブを
有する上記ハイブリッドＤＮＡも，標識物質により標識
されることになる。上記標識物質を手掛かりにして，ハ
イブリッドＤＮＡを他の２本鎖ＤＮＡと分離，検出する
ことにより，特定塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡを検出
することができる。

【００２２】また，ＲｅｃＡ蛋白質分子による３本鎖Ｄ
ＮＡの形成，及びライゲースによるライゲーションにお
いては，これらの反応に関与する成分が，すべて溶液中
に存在する。そのため，１本鎖ＤＮＡプローブの濃度を
高くすることができる。従って，反応速度を高くするこ
とができる。

【００２３】また，固相担体を用いることなく，これら
の反応を行うため，後述の電気泳動写真のバックグラン
ドを低くすることができ，２本鎖ＤＮＡをも写真に鮮明
に写し出すことができる。従って，本発明の検出方法に
よれば，僅かな量の２本鎖ＤＮＡであっても検出するこ
とができる。

【００２４】そして，上記ライゲースは，請求項２に記
載のように，ＮＡＤ要求性ライゲースであることが好ま
しい。一般のＡＴＰ依存型ライゲースを用いる場合に
は，反応液中にＡＴＰを添加する必要がある。この場
合，反応液中のＡＴＰがＲｅｃＡ蛋白質分子の組み換え
反応によってＡＤＰとなり，反応液中のＡＤＰ濃度が上
昇する。すると，ＲｅｃＡ蛋白質がハイブリッドＤＮＡ
から解離し，ハイブリッドＤＮＡが解消してしまうおそ
れがある。

【００２５】そのため，ＡＴＰの存在しない反応液にお
いてライゲーション反応を行うことが望ましく，そのた
めには，上記のごとくＡＴＰの代わりにＮＡＤをエネル
ギー物質として要求するＮＡＤ要求性ライゲースを用い
ることが好ましい。かかるＮＡＤ要求性ライゲースとし
ては，例えば耐熱性ライゲースがある。この耐熱性ライ
ゲースは，例えば，好熱細菌から抽出することができ
る。

【００２６】請求項３に記載のように，ＮＡＤ要求性ラ
イゲースによるライゲーション反応は，３７〜５５℃の
温度の溶液中で行うことが好ましい。これにより，１本
鎖ＤＮＡプローブの両末端においてのみリン酸エステル
結合を形成し，１本鎖ＤＮＡプローブの環状化を促進さ
せることができる。

【００２７】一方，３７℃未満の場合には，２本鎖ＤＮ
Ａの切断末端（特に，Ｃｏｈｅｓｉｖｅ末端）同志でア
ニーリングしてしまい，２本鎖ＤＮＡの末端同志でリン
酸エステル結合を形成してしまうおそれがある。また，
ライゲーションの反応速度が低下するおそれがある。一
方，５５℃を越える場合には，１本鎖ＤＮＡプローブが
２本鎖ＤＮＡにアニーリングせず，ハイブリッドＤＮＡ
の形成が困難となるおそれがある。

【００２８】次に，上記ＲｅｃＡ蛋白質分子としては，
例えば，Ｅ．ｃｏｌｉ．等のバクテリアより抽出するこ
とにより得られる，ＲｅｃＡ蛋白質様分子を用いること
ができる。特に，Ｅ．ｃｏｌｉ．から抽出したＲｅｃＡ
蛋白質様分子を用いることが好ましい。抽出が容易かつ
効率的だからである。

【００２９】次に，請求項４に記載のように，上記１本
鎖ＤＮＡプローブが有する既知の特定塩基配列は，４０
塩基数以上であることが好ましい。これにより，１本鎖
ＤＮＡプローブと２本鎖ＤＮＡとが安定して重なり合
い，安定したハイブリッドＤＮＡを作成することができ
る。上記特定塩基配列が多くなればなるほど，ハイブリ
ッドＤＮＡはより安定な構造をとることができ，ハイブ
リッドＤＮＡの生成量も増加して，検出，感度も向上す
る。

【００３０】一方，４０塩基数未満の場合には，１本鎖
ＤＮＡプローブと２本鎖ＤＮＡとの相補的塩基配列の数
が少なく，安定して両者が重なり合うことができずに，
３本鎖ＤＮＡの生成量が低下するおそれがある。

【００３１】上記特定塩基配列は，１本鎖ＤＮＡプロー
ブの３’末端側及び５’末端側の双方に分断されて配置
されて分割塩基配列として配置されている。３’末端側
の分割塩基配列及び５’末端側の分割塩基配列は，いず
れも１本鎖ＤＮＡプローブの３’末端塩基及び５’末端
塩基を含む。５’末端塩基には，リン酸基が付加されて
いる。上記１本鎖プローブは，ライゲーション反応によ
り，その３’−ＯＨ末端と５’−Ｐ末端とをホスホジエ
ステル結合により連結して，環状化される。

【００３２】そして，請求項５に記載のように，１本鎖
ＤＮＡプローブの３′末端及び５′末端の双方には，上
記特定塩基配列を分断した分割塩基配列が，２０塩基数
以上ずつ存在することが好ましい。２０塩基数未満の場
合には，両者が安定して重なり合うことができずに，ハ
イブリッドＤＮＡの生成量が低下するおそれがある。

【００３３】１本鎖ＤＮＡプローブにおける，３’末端
側の分割塩基配列及び５’末端側の分割塩基配列の間に
は，不特定塩基配列を有していてもよい。そして，請求
項６に記載のように，１本鎖ＤＮＡプローブの全塩基数
は，９０塩基数以上であることが好ましい。全塩基数が
９０塩基数以上であれば，塩基数が多くなれば多くなる
ほど安定してハイブリダイズする。一方，９０塩基数未
満の場合には，２本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしないお
それがある。

【００３４】また，標的ＤＮＡとして，ゲノムＤＮＡの
制限酵素による切断断片を用いて，ゲノムサザン分析も
可能であると考えられる。

【００３５】上記１本鎖ＤＮＡプローブに結合させる標
識物質としては，例えば，ラジオアイソトープ，酵素，
蛍光団等を用いることができる。また，１本鎖ＤＮＡプ
ローブに標識物質を結合させる方法としては，例えば，
リン酸基をもつポリヌクレオチドの５’末端を〔γ−³²
Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標
識する方法，抗原と抗体とを介して両者を結合させる抗
原抗体法等の方法がある。

【００３６】

【発明の実施の形態】本発明の実施形態例にかかる核酸
の検出方法について，図１，図２を用いて説明する。本
例の核酸の検出方法は，被検体２本鎖ＤＮＡとしてＭ１
３ｍｐ１８ＤＮＡの制限酵素切断断片を用いて，その中
から特定塩基配列（５’−ＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣ
ＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧ
ＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧ−３’）を有する２本鎖Ｄ
ＮＡを検出する方法である。

【００３７】まず，１本鎖ＤＮＡプローブとしての全塩
基数が９０ｍｅｒ（塩基数）であるオリゴヌクレチドを
ＰＣＲ法により調製した。この９０ｍｅｒオリゴヌクレ
オチドは，Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅの隣り合う２つの配列領域に
相補的な配列を両端に有し，両者がスペーサー配列
（Ｔ）５０で連結されている。

【００３８】９０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの塩基配列
は，５’−ＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴ
ＣＴＡＧＴＴＴＴ・・・ＴＴＴＣＧＧＣＣ
ＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’であ
り，その中の３′末端側塩基２０ｍｅｒと５′末端側塩
基２０ｍｅｒとが上記特定塩基配列を分断した分割塩基
配列である。尚，上記のＴＴＴＴ・・・ＴＴＴは
合計５０個のＴからなるスペーサー配列である。

【００３９】次に，３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．
２），２．５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に，０．５
ｐｍｏｌの³²Ｐ標識１本鎖ＤＮＡプローブと，７．５６
μｇのＲｅｃＡ蛋白質分子とを加え，更にＡＴＰ−γＳ
を最終濃度が０．４８ｍＭとなるように加え，混合し
て，これを溶液Ａとした。

【００４０】また，Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡを，制限酵素
（ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩ）で切断して，直鎖状の切断
断片を調製し，これを被検体ＤＮＡとした。次に，３０
ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２），２．１５ｍＭ酢酸でマ
グネシウム緩衝液中に，４００ｎｇの上記被検体ＤＮＡ
を加え，更にＡＴＰ−γＳを最終濃度が０．４８ｍＭと
なるように加えて混合し，これを溶液Ｂとした。

【００４１】次に，上記溶液Ａと溶液Ｂとをそれぞれ３
７℃で１２分間保温した。次いで，３７℃に保温された
この溶液Ａ１０μｌ及び溶液Ｂ１０μｌとを混ぜ合わせ
て，２０μｌの反応液となし，更に３７℃で１５分間保
温した。これにより，³²Ｐ標識１本鎖ＤＮＡプローブと
特定塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡとより３本鎖ＤＮＡ
の形成を行った。

【００４２】次に，上記反応液２０μｌに，６９μｌの
蒸留水，１０μｌのライゲース反応緩衝液，及び１μｌ
のライゲース（１００ユニット）を加えて全量を１００
μｌにした後，３７℃で１５分，つづいて４５℃で１５
分間保温した。上記ライゲースとしては，ＮＡＤ要求性
の耐熱性ライゲースである，ＥＰＩＣＥＮＴＲＥＴＥ
ＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製のＡｍｐｌｉｇａｓｅＴｈ
ｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡＬｉｇａｓｅ（商品名）
を用いた。

【００４３】次に，上記反応液１００μｌに，ＥＤＴ
Ａ，ＳＤＳ，プロティナーゼＫを加えて，それぞれの最
終濃度が１０ｍＭＥＤＴＡ，０．５％（ｗ／ｖｏ
ｌ．）ＳＤＳ，０．５ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫとな
るようにした。この反応液を３７℃で３０分間保温した
後，フェノール／クロロフォルム抽出を一回，エタノー
ル沈澱を一回行った。沈澱したＤＮＡを１０μｌの蒸留
水に溶かしてＤＮＡ溶液とした。

【００４４】次に，このＤＮＡ溶液の全量について，
０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。
尚，ブランクとして，１本鎖ＤＮＡプローブだけを含む
ＤＮＡ溶液を同時に電気泳動させた。泳動後に，エチジ
ウムブロミド染色を行ない，ゲルの写真を撮った。次
に，撮影したゲルを乾燥させ，オートラジオグラムをと
り，２本鎖ＤＮＡに結合している³²Ｐ標識１本鎖ＤＮＡ
プローブからのシグナルを検出した。

【００４５】その結果，図２に示すごとく，２本鎖ＤＮ
Ａと１本鎖ＤＮＡプローブとがハイブリッドしたハイブ
リッドＤＮＡ６１と，ハイブリッドしていないフリーの
１本鎖ＤＮＡプローブ６２とが検出された。

【００４６】次に，１本鎖ＤＮＡプローブがＲｅｃＡ蛋
白質分子及びライゲースによる反応により環状化して環
状ＤＮＡプローブを形成していることの根拠を示す。ま
ず，表１に示すごとく，ＲｅｃＡ蛋白質分子及びライゲ
ースの有無が，ＤＮＡ溶液の電気泳動に与える影響を調
査した。調査方法は，ＲｅｃＡ蛋白質分子及びライゲー
スの双方とも添加しない場合（試料１），ＲｅｃＡ蛋白
質分子だけ添加した場合（試料２），ライゲースだけ添
加した場合（試料３），ＲｅｃＡ蛋白質分子及びライゲ
ースの双方とも添加する場合（試料４）について，上述
と同様に特定塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡの検出を行
った。

【００４７】その結果，ＲｅｃＡ蛋白質分子及びライゲ
ースの双方とも添加した場合（試料４）だけ，図２に示
すごとく，２本鎖ＤＮＡと１本鎖ＤＮＡプローブとがハ
イブリッドしたハイブリッドＤＮＡ６１が検出された。
このことから，１本鎖ＤＮＡプローブが環状化して環状
ＤＮＡプローブを形成していることが類推される。

【００４８】次に，９０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの代
わりに，４０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを１本鎖ＤＮＡ
プローブとして用いて，上述の特定塩基配列を有する２
本鎖ＤＮＡの検出を行った。

【００４９】その結果，４０ｍｅｒオリゴヌクレオチド
と２本鎖ＤＮＡとがハイブリッドしたハイブリッドＤＮ
Ａは検出されなかった。これは，２本鎖ＤＮＡ（ターゲ
ット）に４０ｍｅｒオリゴヌクレオチド（１本鎖ＤＮＡ
プローブ）が結合する際に，１本鎖ＤＮＡプローブが環
状化せず，１本鎖ＤＮＡプローブと２本鎖ＤＮＡとの複
合体が不安定な状態となり，除蛋白操作（フェノール／
クロフォルム抽出，エタノール沈殿操作）中にこれらの
複合体が解離してしまうためと考えられる。

【００５０】

【表１】

【００５１】

【発明の効果】本発明によれば，核酸の正確な情報を得
ることができ，核酸に損傷を与えることなく検出するこ
とができる，プローブを用いた核酸の検出方法を提供す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の作用を示す説明図。

【図２】実施形態例における，１本鎖ＤＮＡプローブを
２本鎖ＤＮＡにハイブリッドさせてなるハイブリッドＤ
ＮＡの電気泳動結果を示す説明図。

【符号の説明】

１．．．１本鎖ＤＮＡプローブ，１０．．．特定塩基配列，１１，１２．．．分割塩基配列，１５．．．環状ＤＮＡプローブ，３．．．ＲｅｃＡ蛋白質分子，

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】既知の特定塩基配列を有する１本鎖ＤＮ
Ａプローブを用いて，上記特定塩基配列と相補的な塩基
配列を有する２本鎖ＤＮＡを，被検体ＤＮＡの中から検
出する方法において，まず，既知の特定塩基配列を３’
末端及び５’末端の双方に分断して設けてなり，且つ標
識物質を結合させた１本鎖ＤＮＡプローブと，ＲｅｃＡ
蛋白質分子とを混合した溶液に，上記塩基配列を有する
２本鎖ＤＮＡを含む被検体ＤＮＡを加え，更にライゲー
スを加えることにより，上記塩基配列を有する２本鎖Ｄ
ＮＡの該塩基配列上に，上記１本鎖ＤＮＡプローブの
３’末端及び５’末端に設けた特定塩基配列を重ね合わ
せると共に，上記１本鎖ＤＮＡプローブの３’末端と
５’末端とをリン酸エステル結合により結合させて環状
ＤＮＡプローブとなしてＲｅｃＡ組換中間体を形成し，
次に，上記ＲｅｃＡ組換中間体から上記ＲｅｃＡ蛋白質
分子を除去して，上記２本鎖ＤＮＡの上記塩基配列の上
に，環状ＤＮＡプローブに設けた上記特定塩基配列を重
ね合わせてなるハイブリッドＤＮＡを形成させ，次に，
該ハイブリッドＤＮＡの中の環状ＤＮＡプローブに結合
している上記標識物質を手掛かりにして，上記ハイブリ
ッドＤＮＡを，被検体ＤＮＡの中から検出することを特
徴とする核酸の検出方法。
【請求項２】請求項１において，上記ライゲースは，
ＮＡＤ要求性ライゲースであることを特徴とする核酸の
検出方法。
【請求項３】請求項２において，上記ＮＡＤ要求性ラ
イゲースによるライゲーション反応は，３７〜５５℃の
温度の溶液中で行うことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか一項において，
上記１本鎖ＤＮＡプローブが有する既知の特定塩基配列
は，４０塩基数以上であることを特徴とする核酸の検出
方法。
【請求項５】請求項４において，上記１本鎖ＤＮＡプ
ローブの３’末端及び５’末端の双方には，上記特定塩
基配列を分断した分割塩基配列が，２０塩基数以上ずつ
存在することを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか一項において，
上記１本鎖ＤＮＡプローブの全塩基数は９０塩基数以上
であることを特徴とする核酸の検出方法。