CN112626171A - 基于自组装核酸探针信号放大法检测dnmt1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法，主要利用EDC/sulfo‑NHS活化法构建免疫磁珠，且免疫磁珠上的McAbDNMT1能特异性捕获样品中的DNMT1；依次形成双抗夹心免疫磁珠和生物素化的双抗夹心免疫磁珠；利用核酸自组装技术构建信号放大探针Biotin‑聚FAM；通过链霉亲和素能够将所述Biotin‑聚FAM与所述生物素化的双抗夹心免疫磁珠偶联在一起形成荧光复合物；利用所述荧光复合物能发出荧光的特性且荧光强度和DNMT1的浓度之间的线性关系，建立检测DNMT1水平的方法，该方法具有操作简单，准确性好，灵敏度较高，可适用于生物样品中DNMT1水平的检测等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体地涉及一种基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在细胞增殖、机体衰老、癌症的发生以及其他生命活动发挥着重要作用。DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)是甲基化过程中重要的修饰酶，其主要作用是将S－腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基团转移到相应DNA序列的胞嘧啶或腺嘌呤上，从而实现DNA的甲基化。DNMTs还参与了重要的生物学活动，如维持染色体稳定性，胚胎发育，细胞分化等。动物研究表明，DNMT1-/-小鼠发育迟缓并在孕中期死亡，DNMT3a-/-小鼠出生后四周死亡，而DNMT3b-/-小鼠出生前死亡。
相比于DNMT3a和DNMT3b，DNMT1是最重要，也是研究最早的，其可维持DNA正常甲基化，也可以从头甲基化，还具有调节细胞周期和调控肿瘤抑制基因表达的能力。DNMT1的过表达可导致异常的DNA甲基化，这与癌症的发生密切相关。Lin等发现DNMT1的过表达可引起p53/Sp1通路的异常调节，并导致多个TSG的启动子过度甲基化，从而导致非小细胞肺癌的发生和发展以及预后不良。
等证明DNMT1和DNMT3b的过表达可能与胃癌的不同病理症状有关，并且还发现DNMT1或DNMT3b或二者的共表达对肿瘤启动子相关基因的高甲基化有明显不同的作用，其中，两者的共表达与RAR-β2的高甲基化密切相关。Peng等表明DNMT1蛋白表达量在胰腺癌病程的许多阶段均升高，而DNMT1的过表达与胰腺癌的侵袭性相关。此外，2型糖尿病，阿尔茨海默氏病，癫痫病等也与DNMT1异常表达水平密切相关。DNMT1表达水平的异常通常要早于恶性肿瘤其他症状的发生，这表明其有可能作为潜在的肿瘤生物标志物，成为多种肿瘤诊断和治疗过程中的药物作用靶点。
目前，对于生物样品中DNMT1的检测主要从DNMT1活性和DNMT1水平两个方面进行的。大量新的检测方法已经运用到DNMT1活性的检测，如电化学、荧光、化学发光以及比色法等。然而，生物样品中DNMT1活性的检测是在离体条件下进行的，这样检测的结果不能反映体内DNMT1的真实活性。相对而言，DNMT1水平的检测就更有意义。一方面，DNMT1水平的检测是通过直接检测DNMT1来探究生物样品中DNMT1的水平与疾病发生发展之间的关系，而不是像DNMT1活性的检测是通过检测DNMT1的催化产物或其他相关产物来确定的。另一方面，检测的生物样品来自于各有机体，能够真实地反映样品中DNMT1的水平，因而更具有说服力。然而，无论是DNMT1活性还是DNMT1的水平均未被纳入到癌症诊断的指标。因此，确定一种用于癌症诊断或治疗的DNMT1指标以填补当前的临床空缺具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法，该方法主要通过传统的聚合酶链反应(PCR)桥接介质链霉亲和素结合抗原抗体特异性结合系统和核酸自组装技术来检测DNMT1水平，以解决上述问题。
本发明提供一种基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法，包括步骤：
制备信号放大探针
将生物素化的DNA链S1和荧光素标记的DNA链S2混合制备生物素化聚荧光素，其中，所述生物素化的DNA链S1简写为：S1-Biotin，所述荧光素标记的DNA链S2简写为：S2-FAM，所述生物素化聚荧光素简写为：Biotin-聚FAM；
构建免疫磁珠利用碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化法将DNMT1小鼠抗人单克隆抗体固定在羧基磁珠表面上，形成免疫磁珠，其中，所述DNMT1小鼠抗人单克隆抗体简写为：McAbDNMT1；
形成双抗夹心免疫磁珠将所述免疫磁珠、DNMT1溶液和DNMT1多克隆抗体混合形成双抗夹心免疫磁珠，其中，所述DNMT1溶液为含DNMT1的待测样品或含DNMT1的标准溶液；
生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠所述双抗夹心免疫磁珠与生物素化羊抗兔IgG反应生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠，其中，所述生物素化羊抗兔IgG简写为：羊抗兔IgG-Biotin；
形成荧光复合物通过链霉亲和素将所述Biotin-聚FAM与所述生物素化的双抗体夹心免疫磁珠连接，形成荧光复合物；
荧光检测及建立回归方程利用荧光仪检测所述荧光复合物的荧光强度，荧光强度和DNMT1浓度之间的关系，建立检测DNMT1浓度的回归方程。
基于上述，所述制备信号放大探针的步骤包括：将所述S1-Biotin和所述S2-FAM混合后于80℃～100℃水浴加热3～5min，取出冷却至室温，涡旋杂交1～3h自组装形成所述Biotin-聚FAM。
基于上述，所述构建免疫磁珠的步骤包括：先将所述羧基磁珠悬于100μL MES缓冲液中，再加入sulfo-NHS溶液和EDC溶液进行室温振荡反应和磁分离处理，获得活化后的磁珠；随后向所述活化后的磁珠中加入所述McAbDNMT1和PBS缓冲液进行室温震荡反应将所述McAbDNMT1和羧基磁珠进行偶联，磁分离处理去除上清液，制得偶联磁珠；用质量分数0.5％的BSA溶液对所述偶联磁珠进行封闭处理，形成所述免疫磁珠。
基于上述，所述形成双抗夹心免疫磁珠的步骤包括：先将浓度为0～200ng/mL的DNMT1溶液加入所述免疫磁珠中依次进行温育和磁分离处理，然后再加入PcAbDNMT1稀释液依次进行温育、磁分离和清洗处理，制得所述双抗夹心免疫磁珠，其中，所述PcAbDNMT1稀释液用所述质量分数0.5％的BSA溶液稀释PcAbDNMT1制得。
基于上述，所述生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠的步骤包括：用所述质量分数0.5％的BSA溶液按照1:500～1:1000的比例稀释所述羊抗兔IgG-Biotin制得羊抗兔IgG-Biotin稀释液，将所述羊抗兔IgG-Biotin稀释液加入所述双抗夹心免疫磁珠中并进行温育处理，然后进行磁分离和清洗处理，制得所述生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠。
基于上述，所述形成荧光复合物的步骤包括：向所述生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠中加入浓度为0.5～8μg/mL的链霉亲和素，磁分离洗涤后再加入浓度为300～800nmol/L的所述Biotin-聚FAM探针，再次进行磁分离和清洗处理，得到所述荧光复合物。
基于上述，所述荧光检测及建立回归方程的步骤包括：将所述荧光复合物溶于杂交缓冲液中形成荧光复合物溶液，采用荧光仪检测所述荧光复合物溶液的荧光强度F和空白试验荧光强度F0；在DNMT1浓度CDNMT1为2～200nmol/L浓度范围内，建立检测DNMT1的线性回归方程：Y＝0.28814X+0.01782，其中，X为lgCDNMT1，Y为lg(F/F0)，相关系数r＝0.9962。
基于上述，所述DNMT1浓度的检出限为0.05nmol/L。
本发明提供的基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法，主要利用碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)活化法构建免疫磁珠，且免疫磁珠上的McAbDNMT1能特异性捕获样品中的DNMT1；依次形成双抗夹心免疫磁珠和生物素化的双抗夹心免疫磁珠；利用核酸自组装技术构建信号放大探针生物素化聚荧光素(Biotin-聚FAM)；通过桥接介质链霉亲和素能够将所述Biotin-聚FAM与所述生物素化的双抗夹心免疫磁珠偶联在一起形成荧光复合物；利用所述荧光复合物能发出荧光的特性且荧光强度和DNMT1的浓度之间的线性关系，建立检测DNMT1水平的方法，该方法具有操作简单，准确性好，灵敏度较高，可适用于生物样品中DNMT1水平的检测等特点。所以，本发明提供的上述基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法，主要利用磁性纳米颗粒作为固相载体，同时结合核酸自组装信号放大法建立了检测DNMT1水平的新方法，该方法具有检测限低、特异性强的特点，且该方法能应用于实际样品血浆中DNMT1水平的检测，以期为肿瘤的早期诊断提供新思路。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的原理示意图，其中，该图中的(A)免疫磁珠构建的原理，(B)信号放大探针Biotin-聚FAM形成原理，(C)自组装核酸探针信号放大技术检测DNMT1水平的原理图。
图2是本发明实施例构建的Biotin-聚FAM的琼脂糖凝胶电泳图。
图3是本发明实施例采用的羧基磁珠的扫描电镜图。
图4是本发明实施例构建的免疫磁珠的扫描电镜图。
图5是本发明实施例构建的图4所示的免疫磁珠的ELISA表征图。
图6是本发明实施例提供的不同羊抗兔IgG-Bio稀释比与荧光强度关系图。
图7是本发明实施例提供的不同链霉亲和素浓度与荧光强度关系图。
图8是本发明实施例提供的在不同Biotin-聚FAM浓度条件下，检测波长与荧光强度关系图。
图9是本发明实施例提供的不同DNMT1浓度与荧光强度关系图。
图10是根据图9所示的不同DNMT1浓度下的荧光强度构建的检测DNMT1浓度的标准曲线图。
图11是本发明实施例提供的依据图10所示的标准曲线检测DNMT1浓度的特异性柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明实施例中所用的仪器设备见表1，所用的试剂和材料如表2所示，所用核酸均购自上海生工生物工程股份有限公司，核酸序列具体见表3；实验用水均为Milli-Q水(电阻率大于18.2MΩcm)。
表3本发明实施例采用的仪器设备
| 仪器名称 | 型号及生产厂家 |
| 荧光光谱仪 | FS5，英国爱丁堡仪器公司 |
| 电热恒温水槽 | PK-8D，上海精宏实验设备有限公司 |
| pH计 | pH213，意大利HANNA公司 |
| 离心机 | Centrifuge 5418，eppendorf，德国 |
| 恒温振荡器 | CHA-S，常州国华电器有限公司 |
| 磁分离器 | 无锡百迈格生物科技有限公司 |
| 紫外分光光度计 | UV-1601，日本岛津 |
| 涡旋混匀仪 | XH-C，金坛市丹瑞电器厂 |
| 精密电子天平 | FA1204，青岛金科仪器仪表有限公司 |
| 低温冰箱 | BCD-215KS，青岛海尔集团有限公司 |
| 立式超低温保存箱 | DW-86L386，青岛海尔特种电器有限公司 |
| 高压灭菌用蒸汽锅 | HVE-50，日本HIRAYAMA公司 |
| 超纯水装置 | 美国Millipore公司 |
| 扫描电子显微镜 | 蔡司MERLIN Compact |
| 电泳仪 | DYY-7C，北京市六一仪器厂 |
| 可调节移液枪 | Thermo Scientific |
| 超微量紫外分光光度计 | Nano Drop 2000，Thermo Scientific |
| 微波炉 | P70D20TL-D4，佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司 |
| 多功能微孔板读板仪 | SpectraMax M2e，美谷分子仪器有限公司 |
| 凝胶成像仪 | 美国Bio-rad有限公司 |
表2本发明实施例采用的试剂和材料
表3本发明实施例采用的核酸序列
本发明实施例采用的各种溶液
(1)0.01mol/L PBS(pH为7.4)缓冲液：取市售的PBS粉包溶于1000mLMilli-Q水中，转移到2L的容量瓶中，少许Milli-Q水洗3次转移到容量瓶中，定容至2L，混匀，贴好标签存于4℃冰箱备用。
(2)杂交缓冲液：准确称取2.4228g Tris，5.8440g NaCl，2.0330g MgCl2·6H2O溶解于900mL Milli-Q水中，用0.1mol/L HCl调节pH为7.4，定容至1000mL，高压灭菌后使用。
(3)0.01mol/L MES：准确称取1.0000g吗啉乙磺酸一水合化合物，溶解在已经高压灭菌的Milli-Q水中，定容至500mL，用KOH调节pH至6.0，保存于4℃冰箱备用。
(4)PBST洗涤液：0.01mol/L PBS缓冲液中含有0.05％的Tween-20。
(5)0.59mol/L sulfo-NHS溶液：称取0.0260g sulfo-NHS溶于200μL MES缓冲液中，现配现用。
(6)0.31mol/L EDC溶液：称取0.0120g EDC溶于200μL MES缓冲液中，现配现用。
(7)0.5％BSA溶液：准确称取0.0500g BSA溶于10mL 0.05mol/L CBS中，存于4℃冰箱可用1天。
本发明实施例提供一种基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法，该检测DNMT1的方法对应的原理如图1所示。从图1中可以看出：本发明实施例以羧基磁珠为固相载体，首先用EDC/sulfo-NHS活化法将羧基磁珠活化在磁珠表面生成半稳定的氨基反应活性NHS酯中间体，随后加入McAbDNMT1，McAbDNMT1上的-NH2与磁珠表面的NHS酯中间体反应，生成酰胺化合物，从而将McAbDNMT1和羧基磁珠进行偶联；磁分离洗涤后用0.5％的BSA溶液对羧基磁珠未偶联抗体的位点进行封闭，形成免疫磁珠。当待测样品中存在DNMT1时，McAbDNMT1会特异性捕获样品的DNMT1，磁分离洗涤后，加入PcAbDNMT1，形成双抗夹心免疫磁珠，磁分离后洗去未结合的PcAbDNMT1；加入羊抗兔IgG-Bio，磁分离洗去未结合的羊抗兔IgG-Biotin；加入桥联介质链霉亲和素，磁分离洗涤后再加入检测探针Biotin-聚FAM，链霉亲和素将修饰有生物素的Biotin-聚FAM和捕获有DNMT1的双抗夹心免疫磁珠连接起来，磁分离洗涤除去未结合的检测探针Biotin-聚FAM；复溶于杂交缓冲液中在荧光仪上检测体系的荧光强度，根据荧光强度和DNMT1的浓度之间的线性关系，实现DNMT1表达水平的定量检测。
具体地，本发明实施例提供的检测DNMT1的方法包括以下步骤：
制备信号放大探针将等体积的S1-Biotin和S2-FAM以摩尔比为1:1进行混合后于95℃水浴加热5min，取出冷却至室温，涡旋杂交2h，两条核酸链在室温下会自组装形成Biotin-聚FAM；
构建免疫磁珠取1.5mL的EP管，用PBST清洗一次；加入100μL50mg/mL的羧基化磁珠，磁分离弃上清后，用500μL的MES缓冲液清洗3次，重悬于100μL MES中；分别加入100μL现配的0.59mol/L sulfo-NHS溶液和0.01mol/L EDC溶液，室温振荡反应10min，磁分离弃上清；向活化后的磁珠中加入8μL 10mg/mL的小鼠抗人McAbDNMT1和595μL PBS缓冲溶液，室温震荡反应2h后，磁分离弃上清；向上述磁珠中加入500μL 0.5％BSA溶液室温涡旋反应30min后，磁分离弃上清；将封闭后的免疫磁珠用PBS缓冲溶液清洗3次后，复溶于500μL PBS缓冲溶液，得到10mg/mL的修饰有DNMT1小鼠抗人单克隆抗体的免疫磁珠，保存在4℃冰箱备用；
形成双抗夹心免疫磁珠50μL 1mg/mL免疫磁珠加入到用PBST洗涤液清洗过1次的低吸附离心管中，磁分离弃上清；接着加入20μL不同浓度的DNMT1溶液，混匀后于37℃恒温振荡箱中振荡反应1h，磁分离弃上清，PBST洗涤液清洗3次；之后，滴加100μL PcAbDNMT1于37℃恒温振荡箱中振荡反应1h形成双抗夹心免疫磁珠，磁分离，得到形成有双抗夹心免疫磁珠的离心管；
生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠用所述质量分数0.5％的BSA溶液按照1:500～1:1000的比例稀释所述羊抗兔IgG-Biotin制得羊抗兔IgG-Biotin稀释液，向形成有双抗夹心免疫磁珠的离心管中加100μL羊抗兔IgG-Biotin于37℃恒温振荡箱中振荡反应1h构成生物素化的双抗夹心免疫磁珠，磁分离弃上清，PBST洗涤液清洗3次，得到形成有生物素化的双抗夹心免疫磁珠的离心管；
形成荧光复合物将100μL浓度为0.5～8μg/mL的链霉亲和素加入形成有生物素化的双抗夹心免疫磁珠的离心管中，先在37℃恒温振荡箱中振荡反应0.5h，再加入30μL浓度为300～800nmol/L的Biotin-聚FAM，并37℃恒温振荡箱中振荡反应0.5h，磁分离弃上清，PBST清洗3次，得到荧光复合物；
荧光检测及建立回归方程采用200μL杂交缓冲液复溶所述荧光复合物，形成荧光复合物溶液；然后利用荧光仪在475nm激发波长下测定所述荧光复合物溶液的荧光强度，依据荧光强度和DNMT1浓度之间的线性关系，建立检测DNMT1浓度的回归方程，实现DNMT1表达水平的定量检测。
由此可见，本发明提供的一种上述基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法主要涉及核酸自组装信号放大法、免疫磁珠、桥接介质链霉亲和素以及荧光检测法等方面。下面就这几方面对检测结果的影响，进一步阐述本发明。
1、Biotin-聚FAM的影响
由于溶液中两条核酸单链S1-Biotin和S2-FAM的杂交循环次数不同，形成的双链Biotin-聚FAM中的FAM的数量也不同，Biotin-聚FAM上的FAM越多，信号放大的作用就越强。所以，将由本发明实施例提供的检测DNMT1的方法中的步骤“制备信号放大探针”制备探针Biotin-聚FAM，进行2％的琼脂糖凝胶电泳表征，以判断自组装形成的Biotin-聚FAM的DNA双螺旋结构。所述探针Biotin-聚FAM的琼脂糖凝胶电泳表征结果如图2所示。其中，图2中的泳道1为5μmol/L S1-Biotin、泳道2为5μmol/L S2-FAM；泳道3为5μmol/L Biotin-聚FAM。
从图2中可以看出：S1-Biotin和S2-FAM杂交形成了带有多个FAM的长短不一的DNA双链结构，最长可达到500bp，这说明自组装形成的Biotin-聚FAM中每条DNA双链中带有多个FAM，可以初步说明Biotin-聚FAM能实现信号放大的作用。
2、免疫磁珠的影响
由本发明实施例提供的检测DNMT1的方法中的步骤“构建免疫磁珠”采用的羟基化磁珠和制备出的免疫磁珠的扫描电镜图分别如图3和图4所示。对比图3和图4可知：修饰了抗体的磁珠表面由于存在McAbDNMT1蛋白而较为粗糙，初步表明抗体修饰到了羧基磁珠表面，免疫磁珠构建成功。
免疫磁珠的免疫活性对本发明实施例提供的上述检测DNMT1的方法的检测结果有重要影响。其中免疫磁珠的免疫活性试验如下：
1)取酶标板，每孔加入300μL 0.5％BSA溶液，于37℃温育60min，磁分离后用PBST洗涤液清洗3次；
2)取构建好的修饰有DNMT1小鼠抗人单克隆抗体的免疫磁珠，用PBS缓冲溶液稀释至1mg/mL，分别以每孔25、50、75μL的用量加入封闭好的酶标板中，每个用量设置3个复孔，磁分离弃上清；
3)用PBS缓冲溶液将DNMT1稀释至不同浓度0、25、50、100ng/mL，以每孔50μL的用量加入酶标板中，每个浓度3个平行，于37℃温育60min，磁分离弃上清，PBST清洗3次，每次1min；
4)用0.5％BSA溶液将PcAbDNMT1稀释2000倍，每孔100μL加入酶标板中，于37℃温育60min，形成双抗夹心免疫磁珠，磁分离弃上清，PBST洗涤液清洗3次，每次1min，得到形成有所述双抗夹心免疫磁珠的酶标板；
5)用0.5％BSA溶液将羊抗兔IgG-HRP稀释8000倍，每孔100μL加入形成有所述双抗夹心免疫磁珠的酶标板中，于37℃温育60min，形成生物素化的双抗夹心免疫磁珠，磁分离弃上清，PBST清洗8次，每次1min，得到形成有生物素化的双抗夹心免疫磁珠的酶标板；
6)向形成有生物素化的双抗夹心免疫磁珠的酶标板中，每孔加入100μL TMB单组分显色液，37℃避光温育20min进行显色反应；
7)在向每孔中加入50μL 2mol/L H2SO4的终止液，终止反应，得到形成有荧光复合物的酶标板；
8)将形成有荧光复合物的酶标板置于荧光仪中，检测450nm处所述荧光复合物的荧光强度OD值。
利用抗原抗体特异性结合的原理，对由本发明实施例提供的步骤“构建免疫磁珠”制备出的免疫磁珠的免疫活性进行ELISA表征，表征结果如图5所示。随着免疫磁珠用量的增加，同一DNMT1浓度下的吸光度值在逐渐增加；同一免疫磁珠用量下，随着目标物DNMT1浓度的增加，吸光度值也在逐渐增大，这说明McAbDNMT1被成功偶联到羧基磁珠表面，并且构建的免疫磁珠保留了抗体的活性，能与目标物进行特异性结合，可以用于后续实验。
3、参数条件的优化
羊抗兔IgG-Bio、链霉亲和素以及Biotin-聚FAM等物质的用量对本发明实施例提供的基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法的检测结果有重要影响，下面按照本发明实施例提供的上述检测DNMT1的方法进行参数条件的优化实验。
3.1羊抗兔IgG-Biotin稀释比
羊抗兔IgG-Biotin连接PcAbDNMT1和链霉亲和素，若用量过多，一方面会使下一步清洗困难，造成非特异性吸附，产生假阳性；另一方面会造成浪费，若其用量过少会使检测的信号偏低。因此，在其他条件相同的情况下，设置6个稀释比1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000对羊抗兔IgG-Bio进行单因素优化实验，实验结果如图6所示。
从如图6中可以看出：随着羊抗兔IgG-Biotin的稀释比的降低，荧光强度出现先上升后降低的趋势。当稀释比为1:500时，荧光强度反而低于1:600，这主要是由于稀释比较大时，抗体浓度较大，抗体蛋白分子之间彼此黏连，可能会遮蔽生物素和链霉亲和素的结合，从而导致荧光信号值较低；而当稀释比较大时，溶液中的抗体浓度过低，则影响本发明实施例提供的检测方法的准确度和灵敏性。因此，羊抗兔IgG-Biotin的最佳稀释比为1:600。
3.2链霉亲和素浓度
链霉亲和素作为桥联介质，将抗原抗体反应系统和检测信号探针连接起来，其用量对实验结果影响很大，直接关系实验的检测信号强弱。因此，在其他条件相同的情况下，设置6个浓度0.5、1、2、4、6、8μg/ml对链霉亲和素的浓度进行单因素优化实验，实验结果如图7所示。
从图7中看出：随着链霉亲和素浓度的增大，荧光强度逐渐增大，因此，选择实验范围内荧光强度最大时所对应的链霉亲和素浓度8μmol/L为本发明实施例提供的方法中的链霉亲和素最佳浓度。
3.3 Biotin-聚FAM浓度优化
Biotin-聚FAM是信号放大物质，本发明实施例提供的上述方法中的荧光信号全部来源于Biotin-聚FAM，其能直接反应上述方法中待测物质DNMT1的真实含量，因此，在其他条件相同的情况下，设置6个浓度梯度300、400、500、600、700、800nmol/L对Biotin-聚FAM进行单因素优化实验，实验结果如图8所示。
从图8中可以看到：随着Biotin-聚FAM的浓度的增大，荧光强度先增加后出现减弱的趋势，在700nmol/L时荧光强度达到最大值，因此，Biotin-聚FAM的最佳浓度为700nmol/L。
4、方法学评价
4.1标准曲线的建立
按照本发明实施例提供的上述检测DNMT1的方法，在优化条件下，测定不同DNMT1浓度2、4、8、16、32、64、128、200nmol/L的荧光强度，荧光强度检测结果如图9所示，根据实验结果进行线性拟合，从而得到如图10所示的检测DNMT1水平的标准曲线。
从图10中可以看出：DNMT1浓度在2～200nmol/L范围内，lg(F/F0)与lgC有较好的线性关系，对应的标准曲线为Y＝0.28814X+0.01782(X为lgCDNMT1，Y为lg(F/F0))，r＝0.9962。
4.2检出限
按照本发明实施例提供的上述检测DNMT1的方法，在优化条件下，测定低于DNMT1溶液线性范围下限的4个不同浓度溶液的荧光强度，结果如表4所示，同时测定4个空白溶液的荧光强度，计算得到空白溶液荧光强度的平均值
标准偏差SD＝156，
表4低浓度DNMT1检测结果(n＝3)
从表4中能够看出：当DNMT1浓度为0.05nmol/L时，其对应的荧光强度值大于
因此，本发明实施例所建立的DNMT1水平检测方法的检出限为0.05nmol/L。
4.3精密度和加标回收率
按照本发明实施例提供的上述检测DNMT1的方法，分别测定高、中、低三个浓度150、25、5nmol/L水平下溶液的荧光强度，进而求出SD值和RSD，即所建立方法的精密度。利用下列公式求出方法的加标回收率。其中，实验精密度和加标回收率的结果如表5所示。
表5检测DNMT1水平的精密度和回收率(n＝3)
由表5可知：由本发明实施例提供的上述检测方法建立的标准曲线的精密度范围为4.89％～16.27％，在低浓度和高浓度时方法的精密度较好；低、中、高三个浓度的加标回收率分别为140.0％、94.0％、101.3％。
4.4特异性
实际样品的成分复杂，有多种与待测物质DNMT1结构相似的蛋白存在，AluI、DNMT3a、DNMT3b都是与DNMT1作用相似的DNA甲基转移酶，其结构与DNMT1有很大的相似度，如此，就需要所建立的方法具有很强的特异性。因此，本发明实施例选择AluI、DNMT3a、DNMT3b作为特异性实验的检测目标物。采用本发明实施例所建立的检测DNMT1的方法分别检测250、500U/ml的AluI甲基转移酶，40nmol/L的DNMT1，40nmol/L的DNMT3a和40nmol/L的DNMT3b甲基转移酶水平，比较各个检测溶液的荧光信号值，检测DNMT1水平的特异性，实验结果如图11所示。
从图11中可以看出：随着AluI浓度的增加，荧光强度大小基本没有变化，相同浓度的DNMT3a和DNMT3b作为目标物时的荧光信号也较低；而检测目标物为DNMT1时，荧光强度值有明显的增大，如此说明本发明实施例提供的上述检测DNMT1的方法对于AluI甲基转移酶、DNMT3a和DNMT3b的选择性较低，相较于DNMT1其作用可以近似忽略，所以，本发明实施例所建立的检测DNMT1水平方法的特异性较强。
5、样品分析
为了进一步证明本发明实施例提供的上述检测DNMT1的方法在实际应用中的潜力，将该方法用于人血浆中DNMT1水平的检测。制备20μL包含不同浓度DNMT1的人血浆样品(来自于郑州大学第一附属医院)，然后按照本发明实施例提供的上述检测DNMT1的方法检测上述人血浆样品，并通过比较确定的DNMT1的含量与DNMT1的添加量来计算回收率，结果见表6。
表6血浆样品中DNMT1水平的检测结果
| 加入量(nmol/L) | 实测量(nmol/L) | 回收率(％) |
| 3 | 3.18±0.08 | 106.0 |
| 13 | 13.17±0.09 | 101.3 |
| 90 | 91.41±3.68 | 101.6 |
根据表6可知：低、中和高浓度血浆溶液中DNMT1的回收率分别为106.0％、101.3％和101.6％，从而证实了本发明实施例所建立的上述检测方法DNMT1的实用性。
因此，本发明实施例提供的上述基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法，主要利用磁性纳米颗粒作为固相载体，同时结合核酸自组装信号放大法建立了检测DNMT1水平的新方法，该方法具有检测限低、特异性强的特点，且该方法成功应用于实际样品血浆中DNMT1水平的检测，期望为癌症的临床诊断和治疗提供新的指标。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
Claims (8)
1.一种基于自组装核酸探针信号放大法检测DNMT1的方法，包括步骤：
制备信号放大探针将生物素化的DNA链S1和荧光素标记的DNA链S2混合制备生物素化聚荧光素，其中，所述生物素化的DNA链S1简写为：S1-Biotin，所述荧光素标记的DNA链S2简写为：S2-FAM，所述生物素化聚荧光素简写为：Biotin-聚FAM；
构建免疫磁珠利用碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化法将DNMT1小鼠抗人单克隆抗体固定在羧基磁珠表面上，形成免疫磁珠，其中，所述DNMT1小鼠抗人单克隆抗体简写为：McAbDNMT1；
形成双抗夹心免疫磁珠将所述免疫磁珠、DNMT1溶液和DNMT1多克隆抗体混合形成双抗夹心免疫磁珠，其中，所述DNMT1溶液为含DNMT1的待测样品或含DNMT1的标准溶液，所述DNMT1多克隆抗体简写为：PcAbDNMT1；
生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠所述双抗夹心免疫磁珠与生物素化羊抗兔IgG反应生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠，其中，所述生物素化羊抗兔IgG简写为：羊抗兔IgG-Biotin；
形成荧光复合物通过链霉亲和素将所述Biotin-聚FAM与所述生物素化的双抗体夹心免疫磁珠连接，形成荧光复合物；
荧光检测及建立回归方程利用荧光仪检测所述荧光复合物的荧光强度，荧光强度和DNMT1浓度之间的关系，建立检测DNMT1浓度的回归方程。
2. 根据权利要求1所述的检测DNMT1的方法，其特征在于，所述制备信号放大探针的步骤包括：将所述S1-Biotin和所述S2-FAM混合后于80℃～100℃水浴加热3～5 min，取出冷却至室温，涡旋杂交1～3 h自组装形成所述Biotin-聚FAM。
3. 根据权利要求2所述的检测DNMT1的方法，其特征在于，所述构建免疫磁珠的步骤包括：先将所述羧基磁珠悬于100 μL MES缓冲液中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺盐酸盐溶液进行室温振荡反应和磁分离处理，获得活化后的磁珠；随后向所述活化后的磁珠中加入所述McAbDNMT1和PBS缓冲液进行室温震荡反应将所述McAbDNMT1和所述羧基磁珠进行偶联，磁分离处理去除上清液，制得偶联磁珠；用质量分数0.5%的BSA溶液对所述偶联磁珠进行封闭处理，形成所述免疫磁珠。
4. 根据权利要求3所述的检测DNMT1的方法，其特征在于，所述形成双抗夹心免疫磁珠的步骤包括：先将浓度为0～200 ng/mL的DNMT1溶液加入所述免疫磁珠中依次进行温育和磁分离处理，然后再加入PcAbDNMT1稀释液依次进行温育、磁分离和清洗处理，制得所述双抗夹心免疫磁珠，其中，所述PcAbDNMT1稀释液用所述质量分数0.5%的BSA溶液稀释PcAbDNMT1制得。
5.根据权利要求4所述的检测DNMT1的方法，其特征在于，所述生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠的步骤包括：用所述质量分数0.5%的BSA溶液按照1:500～1:1000的比例稀释所述羊抗兔IgG-Biotin制得羊抗兔IgG-Biotin稀释液，将所述羊抗兔IgG-Biotin稀释液加入所述双抗夹心免疫磁珠中并进行温育处理，然后进行磁分离和清洗处理，制得所述生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠。
6. 根据权利要求5所述的检测DNMT1的方法，其特征在于，所述形成荧光复合物的步骤包括：向所述生成生物素化的双抗夹心免疫磁珠中加入浓度为0.5～8 μg/mL的链霉亲和素，磁分离洗涤后再加入浓度为300～800 nmol/L的所述Biotin-聚FAM探针，再次进行磁分离和清洗处理，得到所述荧光复合物。
7. 根据权利要求6所述的检测DNMT1的方法，其特征在于，所述荧光检测及建立回归方程的步骤包括：将所述荧光复合物溶于杂交缓冲液中形成荧光复合物溶液，采用荧光仪检测所述荧光复合物溶液的荧光强度F和空白试验荧光强度F0；在DNMT1浓度CDNMT1为2～200nmol/L浓度范围内，建立检测DNMT1的线性回归方程：Y=0.28814X+0.01782，其中，X为lgCDNMT1，Y为lg（F/F0），相关系数r=0.9962。
8.根据权利要求7所述的检测DNMT1的方法，其特征在于，所述DNMT1浓度的检出限为0.05 nmol/L。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114018892A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-08 | 江苏科技大学 | 磁性单滴微萃取荧光开关结合pda涂层囊泡检测gst的方法 |
| CN114280016A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-04-05 | 广州兆瑞医学生物科技有限公司 | 一种外泌体检测方法 |
| CN115041143A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-09-13 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种磁性聚合物、制备方法、试剂盒及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002355081A (ja) * | 2001-03-21 | 2002-12-10 | Sanko Junyaku Kk | オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法及び遺伝子の検出方法 |
| CN102703584A (zh) * | 2012-04-20 | 2012-10-03 | 中国人民解放军第四军医大学 | 自组装聚合分支dna探针的制备方法 |
| CN107764804A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-03-06 | 郑州大学 | 一种自组装聚hrp探针、制备方法、试剂盒及其应用 |
| CN109406772A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-03-01 | 郑州大学 | 基于磁性分离的化学发光酶联免疫检测dnmt1的方法 |
-
2020
- 2020-12-30 CN CN202011607002.9A patent/CN112626171A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002355081A (ja) * | 2001-03-21 | 2002-12-10 | Sanko Junyaku Kk | オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法及び遺伝子の検出方法 |
| CN102703584A (zh) * | 2012-04-20 | 2012-10-03 | 中国人民解放军第四军医大学 | 自组装聚合分支dna探针的制备方法 |
| CN107764804A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-03-06 | 郑州大学 | 一种自组装聚hrp探针、制备方法、试剂盒及其应用 |
| CN109406772A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-03-01 | 郑州大学 | 基于磁性分离的化学发光酶联免疫检测dnmt1的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ZHENZHEN WAN等: ""Detection of the level of DNMT1 based on self-assembled probe signal amplification technique in plasma"", 《SPECTROCHIMICA ACTA PART A: MOLECULAR AND BIOMOLECULAR SPECTROSCOPY》 * |
| 巩芳芳: ""基于自组装核酸探针信号放大技术检测DNMT1的活性和水平"", 《中国学位论文全文数据库》 * |
| 毛艳华: ""基于MoS2纳米片荧光检测血浆外泌体中microRNA-21含量"", 《中国学位论文全文数据库》 * |
| 白雪娇等: ""基于甲基化核酸内切酶的甲基转移酶活性的电化学检测研究"", 《化学研究与应用》 * |
| 陈怡雪等: ""基于磁微粒的荧光免疫分析法测定人血清中DNA甲基转移酶１"", 《光谱学与光谱分析》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114018892A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-08 | 江苏科技大学 | 磁性单滴微萃取荧光开关结合pda涂层囊泡检测gst的方法 |
| CN114018892B (zh) * | 2021-11-19 | 2024-01-30 | 江苏科技大学 | 磁性单滴微萃取荧光开关结合pda涂层囊泡检测gst的方法 |
| CN114280016A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-04-05 | 广州兆瑞医学生物科技有限公司 | 一种外泌体检测方法 |
| CN115041143A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-09-13 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种磁性聚合物、制备方法、试剂盒及应用 |
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