CN115041143A - 一种磁性聚合物、制备方法、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚合物材料、雌性聚合物材料、磁性聚合物、制备方法、试剂盒及应用，磁性聚合物由粒径200nm～500nm的Fe3O4磁珠、包裹Fe3O4磁珠的聚合物材料以及最外层的氨基修饰层构成，所述聚合物材料为EDC盐酸盐和NHS发生反应生成的聚酰亚胺类聚合物，同时表面连接有NHS活性酯结构；所述氨基修饰物包括乙二胺二盐酸盐；将乙二胺二盐酸盐溶液和磁性聚合物颗粒混合，振荡反应1h，除去溶剂、洗涤，得到氨基修饰的磁性聚合物；将氨基修饰的磁性聚合物应用于检测试剂盒中，用于分离阴离子代谢物，大大减少了基质背景的干扰，提高质谱检测的灵敏度，可以实现对含磷酸或羧酸或硫酸基团代谢物高覆盖和深度分析。

Description

一种磁性聚合物、制备方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及复杂基质体系中代谢物分离技术领域，具体地说是涉及一种 磁性聚合物、制备方法、试剂盒及应用。
背景技术
生物样品基质极其复杂，往往无法对其中代谢物进行直接分析，需要采 用一定的处理方法，尽可能富集待测成分，除去干扰基质。目前最常用的方 法是采用SPE固相萃取柱进行富集和除杂，然后利用(超)高效液相色谱进行 分离，通过质谱等检测器进行定性或者定量分析。然而该技术依然存在明显 的不足，如特异性不足，浓缩干燥等处理过程耗时费力，成本相对较高，很 难满足对大量生物样本的检测需要。
阴离子代谢物，如磷酸化糖、磷酸化羧酸、羧酸盐、磷酸盐、核苷酸类 化合物等，在许多生物代谢过程中发挥重要作用。例如，核苷酸是合成DNA 和RNA的基石；糖酵解途径和戊糖-磷酸途径中存在的磷酸糖和三羧酸循环途 径中存在的有机酸参与中心碳代谢，对能量代谢至关重要。但由于其低电离 效率、以及来自样品基质的离子抑制，从生物样品中检测这些极性代谢物通 常具有挑战性。以磷酸盐代谢物为例，目前可从人血液样品检测仅有ATP、 ADP、AMP、GDP、GMP、IMP等几种核苷酸。
多孔聚合物材料可以从混合样品中分离目标分子，从液体纯化到生物分 子分离均具有广泛的应用。聚合物材料可调的孔径和多样化的表面官能团修 饰极大地促进了生物分子的识别和分离。与传统的均质多孔聚合物材料相比， 具有异质结构孔径的聚合物颗粒可以更有效地从复杂样品中分离出特定的低 丰度生物分子。然而，目前分离小分子代谢物的多孔聚合物材料少有报道。
因此，如何提供一种多孔聚合物材料，并将其应用于阴离子代谢物的分 离中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有珊瑚状多孔磁性聚合物材料，表面修 饰的大量伯胺基团，在温和条件下和阴离子代谢物的磷酸(酯)和/或羧酸基 团形成氢键等非共价键结合，从复杂体系中富集出来，并在相对温和条件下 释放。富集得到的代谢物，大大减少了基质背景的干扰，提高质谱检测的灵 敏度，可以实现对含磷酸或羧酸或硫酸基团代谢物高覆盖和深度分析。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种聚合物材料，所述聚合物材料由为EDC盐酸盐和NHS发生反应生 成的聚酰亚胺类聚合物，同时表面连接有NHS活性酯结构。
一种磁性聚合物材料，所述磁性聚合物材料由粒径200nm～500nm的Fe3O4磁珠和包裹Fe3O4磁珠的聚合物材料组成，所述聚合物材料为权利要求1所述 的聚合物材料。
一种磁性聚合物，由粒径200nm～500nm的Fe3O4磁珠、包裹Fe3O4磁珠 的聚合物材料以及最外层的氨基修饰层构成，所述聚合物材料为EDC盐酸盐 和NHS发生反应生成的聚酰亚胺类聚合物，同时表面连接有NHS活性酯结 构；所述氨基修饰物包括乙二胺二盐酸盐。
采用上述技术方案达到的技术效果是：本发明中利用EDC和NHS为原 料制备的磁性聚合物材料，表面连接有丰富的NHS活泼酯，可用于胺基、巯 基等配体快速偶联。多孔聚合物材料具有高表面积和良好的孔隙率，被广泛 用于生物分子分离。磁性聚合物材料经乙二胺修饰后，得到的珊瑚状多孔氨 基修饰磁性聚合物材料，对磷酸或羧酸或硫酸基团化合物具有很好的富集效 果；同时具有优异的灵敏度，可以从低至10个左右细胞中检测到众多核苷酸 等阴离子代谢物。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种磁性聚合 物的制备方法，过程为：将EDC盐酸盐和NHS溶解在0.02～0.2M的2-(N- 吗啉)-乙磺酸缓冲液中，配置成EDC和NHS浓度均为1.5～2.5M的混合溶液， 然后每1ml混合溶液中加入纳米级Fe3O4磁珠1～10mg，振荡反应30～120min， 收集磁性聚合物颗粒；然后将乙二胺二盐酸盐溶液和磁性聚合物颗粒混合， 振荡反应1h，除去溶剂、洗涤，得到氨基修饰的磁性聚合物。
作为上述技术方案优选的技术方案，EDC和NHS反应浓度为1.5～2.5M， 体积比为1：0.5～2，反应时间为0.6～1.5h，反应温度为20～35℃，缓冲溶液为 50～200mM的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液。
作为上述技术方案优选的技术方案，EDC和NHS浓度为2M，反应比例 为1：1，反应时间为1h，反应温度为25℃，反应溶液为含0.5％吐温的100mM 的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液。
作为上述技术方案优选的技术方案，乙二胺二盐酸盐浓度为0.5～2M，缓 冲溶液为50～200mM2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，以三乙胺调节溶液的pH值，三 乙胺体积比为5～25％。
采用上述技术方案达到的技术效果是：在本发明限定的比例下制得的磁 性聚合物材料，聚合物具有一定的厚度，材料表面连有更高密度的NHS酯， 制得的磁性聚合物材料，其粒径约为10～20微米，表面NHS酯密度最高，后 续用于偶联修饰效率最佳。
作为上述技术方案优选的技术方案，以磁分离的方法除去溶剂；以50％ 乙腈和纯乙腈先后进行振荡洗涤2次。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护上述得到的磁 性聚合物在制备富集复杂体系中含磷酸或羧酸或硫酸基团阴离子代谢物的试 剂盒中的应用。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种用于富集 复杂体系中含磷酸或羧酸或硫酸基团阴离子代谢物的试剂盒，包括所述的磁 性聚合物、富集液和洗脱液。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述富集液为：含0.5～1％甲酸的 50-80％乙腈水溶液；所述洗脱液为：含0.025～0.1％氨水的50-80％乙腈水溶 液。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种采用上述 试剂盒富集含磷酸或羧酸或硫酸基团阴离子代谢物的方法，包括以下步骤：
1)将所述磁性聚合物材料分散于富集液中，加入到待测样本中，振荡富 集含磷酸或羧酸或硫酸基团的阴离子代谢物；
2)将富集液进行磁分离，清洗富集材料3次以上，加入洗脱液，进行振 荡洗脱并进行磁分离，得到阴离子代谢物的富集溶液。
作为上述技术方案优选的技术方案，磁分离方法为采用具有磁性物体对 氨基修饰磁性聚合物材料进行吸附分离；磁性物体可以为钕铁硼强磁、软磁 条、吸铁石等。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种可 以富集阴离子代谢物的磁性聚合物，首次发现了EDC和NHS可发生反应生 成聚合物材料，且表面连接有丰富的NHS活泼酯；与纳米氨基磁珠或二氧化 钛富集法相比，本发明提供的氨基修饰的多孔磁性聚合物材料富集阴离子代 谢物，材料制备简单、富集方法温和、操作便捷。采用本发明提供的材料和 富集方法，可以从10个左右细胞或30μg小鼠组织中检测到众多核苷酸等阴 离子代谢物；可对血清、组织和肿瘤细胞样本中包括核苷酸在内的阴离子代 谢物实现快速、高效、灵敏的分析，为复杂样本中阴离子代谢物的检测和相 关肿瘤标志物的筛查等提供了新材料和新方法，对生物标志物筛查研究及重 大疾病的预警、疾病发展、预后评估等均具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明所述以EDC和NHS为原料制备聚合物微球的方法示 意图；
图2附图为EDC和NHS生成聚合物材料照片；
图3附图为EDC和NHS生成聚合物材料扫描电镜照片；
图4附图为四氧化三铁磁芯的扫描电镜照片；
图5附图为磁性聚合物材料扫描电镜照片；
图6附图为实施例1制备的聚合物材料和实施例3制备的磁性聚合物材 料结构分析图；
图7附图为氨基修饰磁性聚合物材料对293T细胞富集结果质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中的试验结果，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下 说明书中的“％”，如无特殊说明，均代表体积百分含量。
在本发明实施例中：移液器吸头(最大上样体积为200μL)购自Axygen Scientific公司，产品目录号为T-200-Y。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施 例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发 明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
为了对本发明提供的技术方案更加清楚，下面结合实施例给出更加详细 的说明和解释。
实施例1聚合物材料制备
配置100mM的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，加入0.5％吐温，混合均匀，4℃ 冰箱保存备用。
准确称取76.8mgEDC盐酸盐、46mgNHS，混合，加入0.2mL上述2-(N- 吗啉)乙磺酸溶解，混合均匀，置于振荡混匀仪室温振荡1小时。反应完成后， 离心分离出白色固体沉淀，50％乙腈和纯乙腈各洗涤2次，将制备得到的聚合 物微球保存在乙腈中备用(图1和图2)。
实施例2磁性聚合物材料制备
(1)Fe3O4纳米磁珠制备
称取1.08g六水合三氯化铁粉末置于烧杯中，加乙二醇14ml，磁力搅拌 至六水合三氯化铁粉末完全溶解。称取二甘醇26ml，全部转移至烧杯中；称 取醋酸钠4g，慢慢加入烧杯中，加入过程中保持搅拌状态，使勿成凝胶；继 续搅拌1～2h，于反应釜中200℃反应15h。反应结束后将反应釜冷却至室温， 磁分离收集产物。使用水和乙醇多次洗涤收集到的产物，最后将得到的Fe3O4纳米磁珠分散在10mL50％乙醇中备用。
(2)磁性聚合物材料制备
称取1mg上述纳米磁珠，置于1.5ml离心管中，多次加入0.5ml的DMF 清洗磁珠，磁分离除去溶剂，备用。
配置100mM的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，加入0.5％吐温，混合均匀，4℃ 冰箱保存备用。
准确称取76.8mgEDC盐酸盐、46mgNHS，混合，加入0.2mL上述2-(N- 吗啉)乙磺酸溶解，混合均匀。等全部溶解后，转移至含有Fe3O4纳米磁珠的 EP管中，置于振荡混匀仪室温振荡1小时。反应完成后，磁分离除去溶剂， 50％乙腈和纯乙腈各洗涤2次，备用。
实施例3聚合物材料的形貌和结构表征
使用扫描电子显微镜(SEM)对实施例1制备的聚合物材料和实施例2 制备的磁性聚合物材料分别进行观察，见图3-图5，如图3所示，聚合物材料 粒径约为10～20μm，为珊瑚状多孔结构，其内部多中空褶皱，表面有触手状 胶束。Fe3O4纳米磁珠扫描电子显微镜图如图4所示，按实施例3所述制备方 法，Fe3O4纳米磁珠被EDC和NHS生成的聚合物包裹或粘连，制备出磁性聚 合物材料如图5所示，微观结构和实施例1制备的聚合物材料相似，很好的保留了聚合物的本身的珊瑚状多孔结构。
将实施例1制备的聚合物材料和实施例3制备的磁性聚合物材料分别置 于水或碱性溶剂中振摇，其表面均会水解并游离出NHS(如图6A)，证明 EDC和NHS生成的聚合物表面连接有丰富的NHS活泼酯，磁性聚合物材料 很好的保留了聚合物的本身的珊瑚状多孔结构，而且保留了聚合物的本身化 学性能。
为了明确描述合成聚合物材料的结构，通过基质辅助激光解吸/傅立叶变 换离子回旋共振质谱(MALDI-FTICR MS)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR) 和13C固体核磁共振谱(NMR)光谱对聚合物进行了全面表征。如图6B所示， 在正离子模式下质谱图显示了一系列主要的分子离子峰，对强度最高的一系 列聚合物峰的m/z值与重复单元数的关系进行线性回归分析，得到方程的斜 率为71.037，截距为115.027，R2等于1。根据m/z精确值和NHS、EDC可能 发生的反应，推测斜率对应于聚合物单体乙基异氰酸酯(C3H5NO，M＝71.037)， 截距为聚合物末端连接的NHS活泼酯(C4H4NO3，[M+H]+＝115.026)。聚合 物材料的红外光谱进行分析，结果如图6C所示，在3285cm-1附近出现了N-H 键的伸缩振动峰，1210处出现C-N的伸缩振动，在1535和1635cm-1附近出 现了聚酰亚胺的吸收峰。在1780和1735cm-1分别对应NHS酯上C＝O的对称 伸缩振动和非对称伸缩振动。根据这些结果推测，聚合物可能是由单体乙基异氰酸酯聚合生成的聚酰亚胺类聚合物，同时表面连接有NHS酯结构。13C 固体核磁共振谱结果如图6D所示。173.2ppm的宽峰归属于聚合物分子链上 的酰亚胺和末端酰胺基团上的羰基碳a，二者的化学位移接近，低分辨的固体 核磁未能区分二者。甲基和亚甲基的碳原子分配为：37.2ppm的峰归属于和 叔胺相连的亚甲基碳原子b，33.6ppm的峰归属于NHS分子内的两个亚甲基 碳原子c，26.3ppm的峰归属于甲基碳d。13C固体核磁共振谱进一步证实了上述分析得出的结论，该聚合物是由单体化合物乙基异氰酸酯聚合生成的聚酰 亚胺，同时末端连接有NHS酯。
实施例4磁性聚合物材料制备及乙二胺修饰
(1)Fe3O4纳米磁珠制备
称取1.08g六水合三氯化铁粉末置于烧杯中，加乙二醇14ml，磁力搅拌 至六水合三氯化铁粉末完全溶解。称取二甘醇26ml，全部转移至烧杯中；称 取醋酸钠4g，慢慢加入烧杯中，加入过程中保持搅拌状态，使勿成凝胶；继 续搅拌1～2h，于反应釜中200℃反应15h。反应结束后将反应釜冷却至室温， 磁分离收集产物。使用水和乙醇多次洗涤收集到的产物，最后将得到的Fe3O4纳米磁珠分散在10mL50％乙醇中备用。
(2)磁性聚合物材料制备
称取1mg上述纳米磁珠，置于1.5ml离心管中，多次加入0.5ml的DMF 清洗磁珠，磁分离除去溶剂，备用。
配置100mM的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，加入0.5％吐温，混合均匀，4℃ 冰箱保存备用。
准确称取76.8mgEDC盐酸盐、46mgNHS，混合，加入0.2mL上述2-(N- 吗啉)乙磺酸溶解，混合均匀。等全部溶解后，转移至含有Fe3O4纳米磁珠的 EP管中，置于振荡混匀仪室温振荡1小时。反应完成后，磁分离除去溶剂， 50％乙腈和纯乙腈各洗涤2次，备用。
(3)氨基修饰的磁性聚合物材料制备
取180μL上述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，加入26.6mg乙二胺二盐酸盐， 加入20μL三乙胺，混合均匀，加入到上述制备的磁性聚合物材料中，振荡反 应30分钟左右得到表面氨基修饰的磁性聚合物材料。反应完成后，磁分离除 去溶剂，依次用水和乙腈洗涤，备用。实施例5检测限试验-不同浓度生物样 本分析
(1)样品制备
分别取小鼠肾组织研磨后，在80％甲醇水溶液中裂解萃取代谢物。最后 于4℃条件下15000rpm离心20min，取上清抽干。
HepG2细胞系培养于含有10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中。之后，细胞(每个样本106个细胞)用盐 水洗两次，在80％甲醇水溶液中裂解萃取代谢物。最后于4℃条件下15000rpm 离心20min，取上清抽干。
(2)样品梯度稀释
分别加50％乙腈对小鼠肾组织和HepG2细胞样本进行复溶，振摇混匀后 精密吸取一定的量进行富集，小鼠肾组织样本分别为含0.03mg、0.3mg和3mg 组织的梯度样本，HepG2细胞分别为含10、100、1000和10000个细胞的梯 度样本。
(3)氨基修饰的磁性聚合物材料富集不同浓度生物样本中阴离子代谢物
取实施例4所述氨基修饰的磁性聚合物材料，加入含有1％甲酸的200 μL80％乙腈水溶液，转移至不同梯度生物样本中，振摇反应2h。反应完成后， 磁分离除去溶剂，依次用80％乙腈、50％乙腈，水洗、50％乙腈洗涤，备用。
(4)洗脱富集目标物
将上述富集材料中加入含0.05％氨水的50％乙腈水溶液中，振荡1小时。 磁分离，吸取溶液，离心用于后续的质谱检测分析。
(5)质谱分析
对上述梯度样本进行质谱分析。将大量候选特征与人类代谢组数据库 (HMDB)等进行比对，以确定它们的化学结构。分析标准为质谱候选峰信噪比 S/N≥3、精确m/z值误差小于2ppm、代谢物具有一定阴离子特性。根据该标 准分析，从相当于10个Hep G2细胞的稀释样本中，可以检测到总共76个含 磷酸或羧酸基团的代谢物中的36个；从0.03mg小鼠肾组织的样本中检测到93个阴离子代谢物中的50余种。表明该氨基修饰的磁性聚合物材料对阴离子 代谢物灵敏、高效的富集能力。可实现对极少量生物样本的分析。
实施例6从生物样本溶液中富集阴离子代谢物
(1)样品制备
取人混合血清100uL，加冰甲醇400uL混匀涡旋5min，于4℃条件下 15000rpm离心20min，取上清抽干。
取小鼠组织研磨后，在80％甲醇水溶液中裂解萃取代谢物。最后于4℃条 件下15000rpm离心20min，取上清抽干。
293T、HepG2、HT29等细胞系培养于含有10％(v/v)胎牛血清、100U/mL 青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基中。之后，细胞(每个样本106个细胞)用盐水洗两次，在80％甲醇水溶液中裂解萃取代谢物。最后于4℃条 件下15000rpm离心20min，取上清抽干。
(2)氨基修饰的磁性聚合物材料富集生物样本中阴离子代谢物
取实施例4所述氨基修饰的磁性聚合物材料，加入含有1％甲酸的200μL 80％乙腈水溶液，转移至已抽干的生物样本中，振摇反应2h。反应完成后， 磁分离除去溶剂，依次用80％乙腈、50％乙腈，水洗、50％乙腈洗涤，备用。
(3)洗脱富集目标物
将上述富集材料中加入含0.05％氨水的50％乙腈水溶液中，振荡1小时。 磁分离，吸取溶液，离心用于后续的质谱检测分析。
(4)质谱分析
对上述组织样本进行质谱分析。共鉴定了333个代谢物，包括核苷酸、 有机酸、羧酸糖、磷酸糖、环核苷酸、酸性氨基酸及其二肽、胆汁酸及其磷 脂类化合物。该富集材料和方法，富集效率高、覆盖范围广，显著提高了对 磷酸/羧酸基团阴离子代谢物分析的广度和深度。图7所示为293T细胞富集结 果质谱图，质谱图中大部分峰可归属为含磷酸/羧酸/硫酸基团代谢物，极大地 减少了如氨基酸、脂质等背景基质干扰。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都 是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种聚合物材料，其特征在于，所述聚合物材料由为EDC盐酸盐和NHS发生反应生成的聚酰亚胺类聚合物，同时表面连接有NHS活性酯结构。
2.一种磁性聚合物材料，其特征在于，所述磁性聚合物材料由粒径200nm～500nm的Fe3O4磁珠和包裹Fe3O4磁珠的聚合物材料组成，所述聚合物材料为权利要求1所述的聚合物材料。
3.一种磁性聚合物，其特征在于，由粒径200nm～500nm的Fe3O4磁珠、包裹Fe3O4磁珠的聚合物材料以及最外层的氨基修饰层构成，所述聚合物材料为EDC盐酸盐和NHS发生反应生成的聚酰亚胺类聚合物，同时表面连接有NHS活性酯结构；所述氨基修饰物包括乙二胺二盐酸盐。
4.根据权利要求3所述的一种磁性聚合物的制备方法，其特征在于，过程为：将EDC盐酸盐和NHS溶解在0.02～0.2M的2-(N-吗啉)-乙磺酸缓冲液中，配置成EDC和NHS浓度均为1.5～2.5M的混合溶液，然后每1ml混合溶液中加入纳米级Fe3O4磁珠1～10mg，振荡反应30～120min，收集磁性聚合物颗粒；然后将乙二胺二盐酸盐溶液和磁性聚合物颗粒混合，振荡反应1h，除去溶剂、洗涤，得到氨基修饰的磁性聚合物。
5.根据权利要求4所述的一种磁性聚合物的制备方法，其特征在于，EDC和NHS反应浓度为1.5～2.5M，体积比为1：0.5～2，反应时间为0.6～1.5h，反应温度为20～35℃，反应溶液为50～200mM的2-(N-吗啉)-乙磺酸溶液。
6.根据权利要求4所述的一种磁性聚合物的制备方法，其特征在于，乙二胺二盐酸盐浓度为0.5～2M，缓冲溶液为50～200mM 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，以三乙胺调节pH值，三乙胺体积比为5～25％。
7.根据权利要求4所述的一种磁性聚合物的制备方法，其特征在于，以磁分离的方法除去溶剂；50％乙腈和纯乙腈先后进行振荡洗涤2次。
8.权利要求3所述的磁性聚合物或权利要求4-7任一所述的制备方法制备得到的磁性聚合物在制备富集复杂体系中含磷酸或羧酸或硫酸基团阴离子代谢物的试剂盒中的应用。
9.一种用于富集复杂体系中含磷酸或羧酸或硫酸基团阴离子代谢物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的磁性聚合物、富集液和洗脱液；所述富集液为：含0.5～1％甲酸的50-80％乙腈水溶液；所述洗脱液为：含0.025～0.1％氨水的50-80％乙腈水溶液。
10.一种采用上述试剂盒富集含磷酸或羧酸或硫酸基团阴离子代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将所述磁性聚合物材料分散于富集液中，加入到待测样本中，振荡富集含磷酸或羧酸或硫酸基团的阴离子代谢物；
2)将富集液进行磁分离，清洗富集材料3次以上，加入洗脱液，进行振荡洗脱并进行磁分离，得到阴离子代谢物的富集溶液。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006280277A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology 核酸の抽出方法
CN101104526A (zh) * 2007-05-31 2008-01-16 复旦大学 表面固定金属离子的氨基磁性纳米粒子及其制备方法
CN103940894A (zh) * 2013-01-23 2014-07-23 复旦大学 一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法
CN105181662A (zh) * 2015-08-24 2015-12-23 西北大学 一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法
CN108176384A (zh) * 2018-01-17 2018-06-19 四川大学 接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球及其制备方法与应用
CN112626171A (zh) * 2020-12-30 2021-04-09 郑州大学 基于自组装核酸探针信号放大法检测dnmt1的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006280277A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology 核酸の抽出方法
CN101104526A (zh) * 2007-05-31 2008-01-16 复旦大学 表面固定金属离子的氨基磁性纳米粒子及其制备方法
CN103940894A (zh) * 2013-01-23 2014-07-23 复旦大学 一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法
CN105181662A (zh) * 2015-08-24 2015-12-23 西北大学 一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法
CN108176384A (zh) * 2018-01-17 2018-06-19 四川大学 接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球及其制备方法与应用
CN112626171A (zh) * 2020-12-30 2021-04-09 郑州大学 基于自组装核酸探针信号放大法检测dnmt1的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HANZE YING ET AL.: "Dynamic urea bond for the design of reversible and self-healing polymers", 《NATURE COMMUNICATIONS》, vol. 5, pages 3218 *
LINYU MU: "Novel Functionality of Carbodiimide Chemistry as Non-Isocyanate Solution for Addition Polymerization", STAATS-UND UNIVERSITATSBIBLIOTHEK HAMBURG CARL VON OSSIETZKY, pages 15 - 16 *
SHUAI LIU ET AL.: "Coral-like Magnetic Particles for Chemoselective Extraction of Anionic Metabolites", 《ACS APPLIED MATERIALS INTERFACES》, vol. 14, pages 32890 - 32900 *
江丹丹: "功能化磁性纳米材料的制备及其在磷酸化肽分析中的应用", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》, no. 10, pages 25 *
程昌敬等: "氨基功能化磁性Fe3O4纳米粒子去除Cu(Ⅱ)离子的研究", 《西南民族大学学报（自然科学版）》, vol. 37, no. 3, pages 441 - 446 *
闫妍等: "羧基磁流体制备和牛血清白蛋白表面修饰", 《科技导报》, vol. 28, no. 19, pages 73 - 76 *

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