DE60320319T2

DE60320319T2 - Nukleinsäurenachweis

Info

Publication number: DE60320319T2
Application number: DE60320319T
Authority: DE
Inventors: Gerd LÜBKE
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2003-11-17
Filing date: 2003-11-17
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2023-11-18
Also published as: EP1687442A1; WO2005049859A1; AU2003300569A1; EP1687442B1; DE60320319D1; US20080311668A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis einer Nukleinsäuresequenz in einer Mischung verschiedener Nukleinsäuren sowie ein Kit zu diesem Zweck.
In WO 01/57258 A werden ein direkter Nachweis und eine quantitative Bestimmung von RNS oder DNS in einer Probe beschrieben, die durch Kapillarelektrophorese der mit einer DNS- oder RNS-Sonde mit einer komplementären Sequenz hybridisierten RNS oder DNS gewonnen und durch die Kombination eines an die Sonde terminal angedockten fluoreszierenden Moleküls (Fluorophor) und eines in den so gebildeten RNS-DNS- oder DNS-RNS-Hybrid eingelagerten Farbstoffs stabilisiert wurde.
Derselbe Anmelder beschreibt in EP 1 186 673 A das Kalibrieren verschiedener Messsignaltypen einer Molekülmischung oder das Kalibrieren von Messsignalen verschiedener Molekülmischungen durch Verwenden von Kalibriersonden, die Signale erzeugen, welche den Gesamtkonzentrationen markierter Zielmoleküle, auf welche die Sonden der Molekülmischung abzielen, über einen ganzen Bereich von Probenlösungen proportional sind, und durch Verwenden von Molekülmischungen, die Sätze von Kalibriersonden in sich vereinigen.
Das Southern Blot für DNS und das Northern Blot für RNS stellen weitverbreitete herkömmliche Tüpfelverfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen dar. Bei diesen Verfahren werden zuerst die Nukleinsäuregemische unter Verwendung der Gelelektrophorese, zum Beispiel in einem Agarose- oder Polyacrylamidgel, nach ihrer Masse in die Nukleinsäuren aufgetrennt. Nach der Gelelektrophorese werden die verschiedenen Nukleinsäuren vorzugsweise in Einzelstränge von Nukleinsäuren umgewandelt. Die Einzelstränge der Nukleinsäuren werden dann auf einen Mikrocellulose- oder Nylonfilter übertragen und mittels Wärme oder UV-Strahlung mit der Membran vernetzt. Die Membran wird dann mit einem Blocker gesperrt, um alle unspezifischen Bindungsplätze der Membran zu sättigen. Anschließend werden die auf der Membran fixierten Nukleinsäuren mit einer markierten Nukleinsäuresonde hybridisiert, der eine Primärsequenz beinhaltet, welche der Primärsequenz der Ziel- Nukleinsäuresequenz komplementär ist. Markiert ist die Nukleinsäuresonde oft mit ³²P-markierten Phosphaten, die aufgrund ihrer Radioaktivität (siehe Beispiel von 1) nachgewiesen können. Die beiden Tüpfelverfahren (Northern oder Southern Blot) erfordern daher zahlreiche verschiedene Schritte, z. B. Gelelektrophorese, Tüpfeln auf eine Membran und Nachweisen durch Hybridisierung, die zeitraubend und kompliziert zu bewerkstelligen sind. Für das Southern Blot und das Northern Blot werden verschiedene Medien verwendet (Gele für die Gelelektrophorese und Membranen zum Tüpfeln), sodass zahlreiche verschiedene und zumindest teilweise teure Materialien verwendet werden.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Deshalb besteht ein Bedarf an einem neuen Verfahren für den Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einem Gemisch verschiedener Nukleinsäuren, das einen schnellen und sicheren Nachweis einer Ziel-Nukleinsäure unter Umgehung der Tüpfelverfahren erlaubt. Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch das Bereitstellen eines Verfahrens für den Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz gemäß Hauptanspruch 1. Bevorzugte Ausführungsarten des Verfahrens der Erfindung sowie ein Kit für den Nachweis der Ziel-Nukleinsäuresequenz sind Gegenstand der Unteransprüche.
Ausführungsarten der Erfindung stellen ein schnelles und einfach zu handhabendes Verfahren für den Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz bereit, bei dem die Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäuresequenz mit der Sonde in der Flüssigphase erfolgt. Die Prozedur in Schritt A) vermeidet daher den komplizierten, zeitraubenden sowie materialaufwändigen Verfahrensschritt des Übertragens der Nukleinsäuren auf eine Membran. Außerdem braucht ein Laborant beim Durchführen der Ausführungsarten der Erfindung in der Regel nicht so geschickt zu sein wie beim Northern oder Southern Blot. Nach dem Hybridisieren der Ziel-Nukleinsäuresequenz mit der markierten Sonde in Schritt A) und dem Bilden eines zumindest teilweise doppelten Hybridstrangs zwischen der Ziel-Nukleinsäuresequenz und der Sonde werden die verschiedenen Nukleinsäuren und die Ziel-Nukleinsäuresequenz anschließend in Schritt B) getrennt, sodass im folgenden Schritt C) die Ziel-Nukleinsäuresequenz nachgewiesen werden kann. Deshalb erfordert das Nachweisverfahren vor der Trennung der Nukleinsäuren das Hybridisieren der Sonde mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz. Diese Verfahrensschritte erfolgen im Unterschied zum Northern und Southern Blot, bei denen die Nukleinsäuren zuerst getrennt und dann mit der markierten Sonde hybridisiert werden, in umgekehrter Reihenfolge.
In Schritt A) werden die zusätzlichen Bindungsplätze mit Einzelsträngen von Nukleinsäuren hybridisiert, deren Primärsequenzen in der Flüssigphase nach dem Zufallsprinzip geordnet sind. Die zusätzlichen Bindungsplätze der Nukleinsäuren, die nach Schritt A) noch vorhanden sind, bestehen oft aus ungepaarten Basen in Bereichen der Nukleinsäuren, die nur aus einem Einzelstrang bestehen.
Bei den aus einem Einzelstrang bestehenden Nukleinsäuren kann es sich um Basenpaare mit Einzelstrangteilen verschiedener Nukleinsäuren in der Nukleinsäuremischung und gegebenenfalls auch mit Einzelstrangteilen der Ziel-Nukleinsäuresequenz handeln, die Doppelstränge von Nukleinsäuren bilden. Deshalb liegen die Nukleinsäuren in der Nukleinsäuremischung nach dem Schritt A1) vorwiegend in Form von Doppelsträngen vor, was die Trennung der verschiedenen Nukleinsäuren im nachfolgenden Schritt B) vereinfacht. Aufgrund von Schritt A1) wird der Doppelstrang-Hybrid zwischen der Sonde und der Ziel-Nukleinsäuresequenz im Vergleich zu den anderen Nukleinsäuren während der Trennung in Schritt B) nicht verzögert. Wenn sich in der Nukleinsäuremischung noch Einzelstränge von Nukleinsäuren befinden, die ebenfalls der Gelelektrophorese unterzogen werden, kommt es während der Gelelektrophorese normalerweise zu einer Verzögerung des Doppelstrang-Hybrids, sodass die wichtige Informationen über die Größe der Zielsequenz verloren gehen. In der Praxis dient die Information über die Größe der Zielsequenz oft zur Prüfung, ob die Hybridisierung zwischen der Zielsequenz und der Sonde ordnungsgemäß verlaufen ist.
Vorteilhafterweise werden in Schritt A1) zum Umwandeln der Einzelstrangteile der Nukleinsäuremischung in Doppelstränge kurze Nukleinsäuren mit einer nach dem Zufallsprinzip geordneten Primärsequenz mit einer Länge von 6 bis 14 Nukleotiden bereitgestellt. Diese kurzen Oligonukleotide lassen sich leicht herstellen und sind in Schritt A1) leicht zu handhaben. Aufgrund ihrer geringen Größe treten diese Oligonukleotide sicher in Wechselwirkung mit Einzelstrangbereichen in der Nukleinsäuremischung.
Bei einer anderen Variante wird die Hybridisierung in Schritt A1) ungefähr bei Raumtemperatur und die Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz in Schritt A) bei einer Temperatur zwischen 30°C und 72°C, vorzugsweise zwischen 56°C und 72°C, durchgeführt. Auch eine Temperatur zwischen 30°C und 48°C kann geeignet sein. Als weitere bevorzugte Bedingung für das Hybridisieren in Schritt A) kommt ein pH-Bereich zwischen 6 und 8,5 infrage, vorzugsweise im schwach alkalischen Bereich, zum Beispiel bei pH 7,5 (z. B. TRIS EDTA-Puffer mit pH 7,5).
Aufgrund der niedrigen Temperatur wirken sich während der Hybridisierung in Schritt A1) fehlerhafte Basenpaarzuordnungen nicht auf die Wechselwirkung zwischen Einzelstrangbereichen der verschiedenen Nukleinsäuren in den Mischungen und den Oligonukleotiden mit der nach dem Zufallsprinzip geordneten Primärsequenz aus. Im Gegensatz zu der niedrigen Temperatur in Schritt A1) wird in Schritt A) eine höhere Temperatur angewendet, um für die Hybridisierung eine schärfere Bedingung zu schaffen, damit während des Nachweises der Ziel-Nukleinsäuresequenz durch die Sonde eine hohe Selektivität erreicht wird und Fehlsignale verringert werden.
Als Sonde kann eine Nukleinsäure verwendet werden, die mindestens zweimal so lang ist wie die Oligonukleotide mit der nach dem Zufallsprinzip geordneten Primärsequenz. Wenn die Sonde größer als die Oligonukleotide mit der nach dem Zufallsprinzip geordneten Sequenz ist, können die beiden Schritte A1) und A) gleichzeitig ausgeführt werden. Aufgrund zusammenwirkender Faktoren kann die große Sonde dennoch mit der richtigen Zielsequenz Wechselwirken und auch kurze Oligonukleotide mit der nach dem Zufallsprinzip geordneten Primärsequenz ersetzen, die bereits an die Ziel-Nukleinsäuresequenz gebunden sind. Diese Variante ermöglicht somit die Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäuresequenz mit der Sonde und die Umwandlung der Einzelstrangbereiche der Nukleinsäure in Doppelstränge von Nukleinsäuren in einem Schritt. Durch dieses Vorgehen wird die Anzahl der Verfahrensschritte verringert, sodass der Nachweis der Ziel-Nukleinsäuresequenz schneller und einfacher erfolgen kann.
Vorteilhafterweise werden in Schritt A1) mit einer zweiten Markierung markierte Nukleinsäuren verwendet, wobei die zweite Markierung von der ersten Markierung verschieden ist.
Aufgrund der verschiedenen Markierungen für die Sonde und die Nukleinsäuren mit nach dem Zufallsprinzip geordneten Primärsequenzen können die Menge und die Größe der Ziel-Nukleinsäuresequenz und die Gesamtmenge der Nukleinsäuren in der Mischung unter Verwendung verschiedener Nachweisverfahren ermittelt werden.
Darüber hinaus können die zum Hybridisieren in Schritt A1) verwendeten Nukleinsäuren mit der nach dem Zufallsprinzip geordneten Primärsequenz anschließend mit einer zweiten Markierung markiert werden, die wiederum von der ersten Markierung verschieden ist. Eine solche nachträgliche Markierung der Nukleinsäuren kann zum Beispiel unter Verwendung von Farbstoffen wie beispielsweise Ethidiumbromid, Acridinorange, Proflavin oder Sybr Green^® erfolgen. Diese eingelagerten Substanzen werden normalerweise zum Anfärben von Doppelsträngen oder Einzelsträngen von Nukleinsäuren verwendet.
Ferner können die in Schritt A1) verwendeten Oligonukleotide mit der nach dem Zufallsprinzip geordneten Primärsequenz nach einem von Feinberg und Vogelstein (Feinberg, A. P., Vogelstein, B., Anal. Biochem. 137, S. 266 bis 267, 1984) entwickelten Markierungsverfahren für nach dem Zufallsprinzip geordnete Oligonukleotide markiert werden. Bei diesem Verfahren können zur Synthese von komplementären Strängen von Muster-Nukleinsäuren nach dem Zufallsprinzip geordnete Dekanukleotid-Primer verwendet werden. Die komplementären Stränge werden vom 3'-Ende der nach dem Zufallsprinzip geordneten Dekanukleotid-Primer synthetisiert, wobei zum Beispiel das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I verwendet wird. In Anwesenheit von Nukleotiden, die zum Beispiel mit Biotin oder ³²P markiert sind, werden markierte Oligonukleotide für den Schritt A1) synthetisiert.
Vorteilhafterweise wird die Mischung verschiedener Nukleinsäuren vor Schritt A) in Schritt A2) denaturiert.
Durch die Denaturierung werden die Nukleinsäuren vorteilhaft zum Beispiel von Doppelsträngen in Einzelstränge umgewandelt, sodass die Hybridisierung im folgenden Schritt A) ohne größere Schwierigkeiten erfolgen kann. Die Denaturierung kann zum Beispiel durch Erwärmen der Nukleinsäuremischung für eine gewisse Zeit, z. B. fünf Minuten, auf hohe Temperaturen, zum Beispiel auf 90°C bis 99°C, vorzugsweise auf 95°C bis 99°C, und anschließend sofortige Temperaturverringerung, z. B. durch Kühlen in Eis, erfolgen.
Vorzugsweise wird in Schritt A) als Sonde eine Nukleinsäure mit einer Länge von 18 bis 25 Nukleotiden verwendet, die eine Hybridisierung mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz eingehen können, wobei die Reihenfolge in der Sequenz zu mindestens 80% mit der komplementären Sequenz der Ziel-Nukleinsäuresequenz übereinstimmt. Alternativ kann die Nukleinsäuresonde mindestens 12 Nukleotide nacheinander aufweisen, die zur Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär sind, um eine gute und sichere Hybridisierung zwischen der Ziel-Nukleinsäuresequenz und er Sonde zu gewährleisten. Solche Nukleinsäuresonden können die Ziel-Nukleinsäure selbst in einer Mischung verschiedener anderer Nukleinsäuren selektiv nachweisen.
Bei einer anderen Ausführungsart werden die Nukleinsäuren in Schritt B) unter Verwendung einer Gelelektrophorese nach ihrer Masse getrennt. Die Gelelektrophorese kann zum Beispiel in einem Polyacrylamidgel oder in einem Agarosegel durchgeführt werden. Dieses Trennverfahren eignet sich besonders für die sichere Trennung der Nukleinsäuren innerhalb kurzer Zeit.
In Schritt B) wird zur Trennung vorzugsweise ein Mikrofluid-Chip verwendet, dessen Kapillaren für die Elektrophorese von Nukleinsäuren geeignet sind. Der Mikrofluid-Chip kann zum Beispiel eine Glas- oder Siliciumplatte aufweisen, in die Kapillaren geätzt sind. Die Kapillaren können mit einem Medium für die Elektrophorese gefüllt sein, zum Beispiel mit Polyacrylamid oder Agarose, und die Nukleinsäuremischung kann durch elektrophoretische und elektroosmotische Kräfte durch diese Kapillaren befördert werden. Unter Verwendung dieser Mikrofluid-Chips können kleine Volumina sehr schnell analysiert werden. Deshalb eignen sich Mikrofluid-Chips sehr gut zur Arbeitszeiteinsparung und zur Verringerung der Materialausgaben.
Vorzugsweise gehören die erste und die zweite Markierung zur folgenden Gruppe:

– radioaktive Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Chemolumineszenz-, Biolumineszenz-, magnetische und Antigenmarkierungen.

Diese Markierungsarten eignen sich besonders für die Markierung von Nukleinsäuren und können unter Verwendung von Standardnachweisverfahren wie beispielsweise Autoradiografie, Fluoreszenznachweis oder Antikörper leicht überwacht werden.
Vorzugsweise werden als erste und gegebenenfalls als zweite Markierung Fluoreszenzmarkierungen verwendet, wobei die Fluoreszenzmarkierungen der ersten und der zweiten Markierung Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen emittieren. Unter Verwendung dieser Variante kann der Nachweis sowohl der Ziel-Nukleinsäuresequenz als auch der anderen verschiedenen Nukleinsäuren in der Mischung einfach durchgeführt werden.
Wenn als erste und zweite Markierung Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden, emittieren die beiden Fluoreszenzmarkierungen Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen, und die Menge und die Größe der Ziel-Nukleinsäuresequenz sowie die Menge der verschiedenen anderen Nukleinsäuren in der Mischung können in Schritt C) unter Verwendung eines Spektrometers zum Nachweis der beiden Markierungen anhand der ersten und der zweiten Markierung ermittelt werden. Diese Ausführungsart ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis sowohl der Ziel-Nukleinsäuresequenz als auch der anderen Nukleinsäuren in der Mischung, indem einfach ein Spektrometer, z. B. ein Bioanalysator, verwendet wird.
Ein Fachmann kann je nach der nachzuweisenden Ziel-Nukleinsäuresequenz verschiedene Arten von Nukleinsäuresonden synthetisieren. Wenn zum Beispiel in einer menschlichen Gewebeprobe das HI-Virus nachgewiesen werden soll, kann ein Fachmann eine Nukleinsäuresonde synthetisieren, die eine hohe Komplementarität zu einem gut erhaltenen Abschnitt des HIV-Genoms aufweist. Diese Nukleinsäuresonde kann noch einige falsche Basenpaarungen tolerieren, zum Beispiel in Bereichen mit hoher Variabilität zwischen verschiedenen Unterarten des HIV, und so den Nachweis des HIV unabhängig von seinen Unterarten ermöglichen. Außerdem kann ein Fachmann auch weitere Nukleinsäuresonden für den HIV-Nachweis synthetisieren, die eine hohe Komplementarität sogar zu Bereichen mit hoher Variabiliät im HIV-Genom aufweisen, und so die Unterscheidung zwischen verschiedenen Unterarten des HIV ermöglichen.
Im Folgenden werden Ausführungsarten der Erfindung ausführlicher beschrieben. Alle Figuren zeigen lediglich vereinfachte schematische Darstellungen, die nur zur Veranschaulichung dienen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den Ablauf von Trennung und Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz eines standardmäßigen Northern oder Southern Blot.
Die 2 und 3 zeigen schematisch den Ablauf der Verfahrensschritte bei verschiedenen Ausführungsarten der Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSARTEN DER ERFINDUNG
1 zeigt von links nach rechts den Ablauf der Verfahrensschritte eines herkömmlichen Southern oder Northern Blot. Zu Beginn eines Standardverfahrens für den Nukleinsäurenachweis werden die Nukleinsäuren durch Gelelektrophorese in die Reihe 100 auf dem Geistreifen aufgetrennt (links auf der Seite dargestellt). Gleichzeitig kann auf den Gelstreifen in der Reihe 110 eine DNS-Skala 60 aufgebracht werden, um die Ermittlung der Größe der Nukleinsäure in der Mischung zu vereinfachen. Normalerweise sind nach dem Anfärben, z. B. mit Ethidiumbromid, nur in großen Mengen vorkommende Nukleinsäuren sichtbar, beispielsweise die beiden Banden 70, welche ribosomale RNS darstellen. Nach der Trennung der Nukleinsäuren werden diese auf einen Nitrocellulose- oder Nylonfilter 80 übertragen und mit der Membran vernetzt, was in der Mitte von 1 dargestellt ist. Die Übertragung beinhaltet normalerweise auch die Behandlung des Gelstreifens mit NaOH, um die Doppelstränge der Nukleinsäuren in Einzelstränge umzuwandeln, die mit einer Nukleinsäuresonde hybridisiert werden können. Das Übertragen der Nukleinsäuren vom Gelstreifen auf die Membran ist normalerweise sehr zeitraubend und erfordert große Materialmengen, zum Beispiel Pufferlösungen. Nach der Übertragung wird die Membran mit den Einzelsträngen der Nukleinsäuren oft mit einem Blocker gesperrt, um alle unspezifischen Bindungsplätze auf der Membran zu sättigen. Dieser Sperrvorgang erfolgt normalerweise durch Behandeln mit handelsüblichen Blockern, z. B. mit Denhart-Lösung, Magermilch oder der DNS von Lachssperma. Anschließend wird die Membran mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine Nukleinsäuresonde 15 mit einer Markierung 20 enthält, siehe linke Seite. Normalerweise wird für das Northern oder Southern Blot eine ³²P-Markierung verwendet. Dann kann die markierte Nukleinsäuresonde mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die Membran gewaschen und das Signal, z. B. durch Autoradiografie, nachgewiesen werden.
2 zeigt eine Ausführungsart. Der folgende Arbeitsablauf ist in 2 von links nach rechts dargestellt. Zunächst wird eine Mischung von Nukleinsäuren verwendet, die verschiedene Doppelstränge von Nukleinsäuren 5 sowie einen Doppelstrang einer Nukleinsäure enthält, der die Ziel-Nukleinsäuresequenz 1A und deren komplementäre Sequenz 1B enthält, die beide fett gedruckt dargestellt sind. In Schritt A2) werden die Doppelstränge der Nukleinsäuren in der Mischung in Einzelstränge umgewandelt, indem zum Beispiel die Mischung der Nukleinsäuren kurze Zeit stark erwärmt wird (zum Beispiel fünf Minuten lang auf 95°C). Anschließend enthält die Mischung überwiegend Einzelstränge der Nukleinsäuren sowie der Ziel-Nukleinsäuresequenz 1A. Anschließend wird in Schritt A) ein Einzelstrang einer Nukleinsäuresonde 15 mit einer ersten Markierung 20 zugegeben, und die Sonde 15 kann mit dem Einzelstrang der Nukleinsäure 1A hybridisieren und ein Hybrid zwischen der Sonde 15 und der Ziel-Nukleinsäuresequenz 1A bilden. Der Hauptvorteil dieser Ausführungsart gegenüber herkömmlichen Verfahren besteht darin, dass die Schritte A2) und A) in der Flüssigphase erfolgen und deshalb leichter ausgeführt werden können als die in 1 gezeigten Standardübertragungsverfahren durch Tüpfeln. Anschließend kann die Mischung der Nukleinsäuren in Schritt B) zum Beispiel durch Gelelektrophorese in einem Gel 50 getrennt werden. In Schritt C) kann der Hybrid 1A, 15 zwischen der Ziel-Nukleinsäuresequenz 1A und der Sonde 15 zum Beispiel unter Verwendung eines Spektrometers mit der Wellenlänge λ₁ nachgewiesen werden, wenn eine Fluoreszenzmarkierung zum Markieren verwendet wurde. In diesem Fall leuchtet der Streifen, der den Hybrid 1A, 15 enthält, auf und kann dadurch nachgewiesen werden.
Wenn in einer Mischung von Doppelsträngen eines DNS-Moleküls ein Doppelstrang einer DNS-Ziel-Nukleinsäuresequenz nachgewiesen werden soll, muss die Mischung der Nukleinsäuren in Schritt A2) unbedingt denaturiert werden. 2 zeigt deutlich, dass sowohl die Trennung der Mischung der Nukleinsäuren in Schritt B) als auch der Nachweis der Ziel-Nukleinsäuresequenz in Schritt C) im Gelstreifen 50 erfolgen und deshalb keine Übertragung auf eine Membran erforderlich ist.
3 zeigt von links nach rechts eine weitere Ausführungsart. In diesem Fall enthält die Mischung Einzelstränge der Nukleinsäuren 5 mit weiteren Bindungsplätzen 10 sowie einen Einzelstrang einer Ziel-Nukleinsäuresequenz 1A, die ebenfalls fett gedruckt dargestellt ist. In anderen Fällen kann der Denaturierung selbst bei Mischungen von Einzelsträngen der Nukleinsäuren der Vorzug gegeben werden, um eine ordnungsgemäße Zuordnung der Basenpaare zwischen der Sonde und der Ziel-Nukleinsäuresequenz sicherzustellen. In Schritt A) dieser Ausführungsart wird der Einzelstrang der Ziel-Nukleinsäuresequenz 1A mit der Nukleinsäuresonde 15 hybridisiert, die mit einer ersten Markierung 20 markiert ist. Im nachfolgenden Schritt A1) werden die Oligonukleotide 25 mit einer zufällig geordneten Primärsequenz und einer zweiten Markierung 30 mit den Einzelsträngen der Nukleinsäuren 5 in der Mischung behandelt, um an die zusätzlichen Bindungsplätze 10 anzudocken und dadurch nahezu alle Einzelstränge der Nukleinsäuren 5 in Doppelstränge umzuwandeln. In Schritt A1) können mehrere Oligonukleotide 25 an einen Einzelstrang der Nukleinsäure 5 andocken und diese in einen Doppelstrang umwandeln. Außerdem können die Oligonukleotide 25 an Einzelstrangbereiche des Hybrids zwischen der Sonde 15 und dem Einzelstrang der Ziel-Nukleinsäuresequenz 1A andocken. In Schritt A1) werden fast alle Einzelstränge der Nukleinsäuren in Doppelstränge umgewandelt, sodass die Doppelstränge der Nukleinsäuren im nachfolgenden Schritt B) genau nach ihrer Masse getrennt werden können. Die Trennung kann auch hier in einem Gelstreifen 50 erfolgen. Aufgrund der Umwandlung in Schritt A1) kommt es während der Trennung der Nukleinsäuren in Schritt B) nicht zur Verschiebung der Signalbande des Hybrids 1A, 25, 15, sodass die Größe der Ziel-Nukleinsäuresequenz ermittelt werden kann. Wenn für die erste Markierung 20 und die zweite Markierung 30 verschiedene Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden, kann der Hybrid zwischen der Ziel-Nukleinsäuresequenz 1A, der Sonde 15 und den Oligonukleotiden 25 in Schritt C) unter Verwendung eines Spektrometers mit verschiedenen Wellenlängen λ₁ und λ₂ gleichzeitig mit den anderen Nukleinsäuren 5 nachgewiesen werden. Diese spezielle Ausführungsart ermöglicht die Ermittlung der Menge und der Größe der Ziel-Nukleinsäuresequenz sowie die Ermittlung der Menge der anderen Nukleinsäuren 5 in der Mischung der Nukleinsäuren.
AUSFÜHRUNGSARTEN
Zum Testen der Eignung von Ausführungsarten der Erfindung wurde in einem Experiment das Gen der menschlichen Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GADPH) in der gesamten Blut-DNS einer weiblichen Person nachgewiesen.
Zuerst wurde die gesamte Blut-DNS der weiblichen Person unter Verwendung des Restriktionsenzyms Dra 1 aufgeschlossen. Anschließend wurde die DNS durch Abscheidung mittels Natriumacetat konzentriert. 15 μl 5M Natriumacetat und 175 μl Ethanol wurden zugegeben und gemischt. Anschließend wurde die DNS eine Stunde lang auf Eis abgeschieden. Die DNS wurde durch 50-minütiges Zentrifugieren bei maximaler Drehzahl verdichtet, und das DNA-Präzipität wurde in 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und wieder mit 5 μl TE-Puffer (10 mM TRIS, 0,01 mM EDTA) suspendiert. Anschließend wurde die aufgeschlossene DNS in Schritt A2) durch 5-minütiges Erwärmen auf 99°C denaturiert, um die DNS-Moleküle in Einzelstränge von Nukleinsäuren umzuwandeln. Dann wurde die Mischung auf Eis gekühlt. Die Sonde für das GADPH-Gen, die mit dem Fluoreszenzfarbstoff BODIPY^® 650/665 (erhältlich bei Molecular Probes) markiert war, und Dekamere mit nach dem Zufallsprinzip geordneter Primärsequenz (erhältlich bei Ambion) wurden in getrennten Gefäßen durch fünfminütiges Erwärmen auf 99°C denaturiert und auf Eis gekühlt. Dann wurde in Schritt A) die gesamte Blut-DNS der weiblichen Person mit der markierten Sonde gemischt, 5 Minuten auf 99°C erwärmt, auf 65°C abgekühlt und weitere fünf Minuten bei 65°C stehen gelassen. Danach wurde die Mischung auf Eis gekühlt. Anschließend wurden in Schritt A1) die Dekamere mit der nach dem Zufallsprinzip geordneten Primärsequenz zugegeben und fünf Minuten mit der DNS stehen gelassen und wieder auf Eis gestellt. Die markierte GADPH-Sonde bestand aus einer Mischung verschiedener Sonden mit einer durchschnittlichen Größe von 200 bis 500 Nukleotiden, die zum größten Teil mit dem GADPH-Gen komplementär waren und sich über das gesamte Gen erstreckten. Die Sonden wurden unter Verwendung von Hexanukleotiden als zufällig geordnete Primer durch die Primerreaktion nach Feinberg und Vogelstein synthetisiert. Nach Schritt A1) wurde in Schritt B) die Trennung der Nukleinsäuren durchgeführt, indem die Mischung der Nukleinsäuren auf einen Mikrofluid-Chip DNA 12000 (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) übertragen wurde, dessen Gelmatrix als zweite Markierung 20 μM SYTO 16^® (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) als spezifischen Nukleinsäurefarbstoff enthielt. Unter Verwendung eines Spektrometers konnten sowohl die Signale für den Hybrid zwischen der Sonde und der Ziel-Nukleinsäuresequenz als auch die Signale für die anderen Nukleinsäuren ermittelt werden.
Der Geltungsbereich der Erfindung ist nicht auf die in den Figuren dargestellten Ausführungsarten beschränkt. Vielmehr sind Variationen in Bezug auf die Kombination verschiedener wählbarer Merkmale des Verfahrens sowie Variationen in Bezug auf die Beschaffenheit der Nukleinsäuresonde möglich.

Claims

Verfahren zum Nachweisen einer Ziel-Nukleinsäuresequenz (1A) in einer Mischung verschiedener Nukleinsäuren (5) mit weiteren Bindungsplätzen (10), wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: A) Hybridisieren der Ziel-Nukleinsäuresequenz mit einer Sonde (15) in der Flüssigphase, wobei die Sonde eine erste Markierung (20) aufweist, A1) Hybridisieren der weiteren Bindungsplätze (10) unter Verwendung von Einzelsträngen von Nukleinsäuren (25) in der Flüssigphase, deren Primärsequenzen nach dem Zufallsprinzip angeordnet sind, B) Trennen der verschiedenen Nukleinsäuren (1A, 5), C) Nachweisen der Zielnukleinsäure (1A) unter Verwendung der markierten Sonde (15).
Verfahren nach Anspruch 1, – bei dem in A1) zum Hybridisieren kurze Nukleinsäuren mit einer Länge von 6 bis 12 Nukleotiden bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der obigen Ansprüche, – bei dem das Hybridisieren in A1) ungefähr bei Raumtemperatur durchgeführt wird, und – das Hybridisieren in A) bei einer Temperatur zwischen 56°C und 72°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der obigen Ansprüche, – bei dem als Sonde (15) eine Nukleinsäure verwendet wird, die zehnmal so lang ist wie die Einzelstränge von Nukleinsäuren (25), deren Primärsequenzen nach dem Zufallsprinzip angeordnet sind, – wobei die Schritte A1) und A) gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 2 oder einem der obigen Ansprüche, – bei dem in Schritt A1) zum Hybridisieren Nukleinsäuren (25) verwendet werden, die mit einer zweiten Markierung (30) markiert sind, – wobei die zweite Markierung (30) von der ersten Markierung (20) verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder einem der obigen Ansprüche, – bei dem die in Schritt A1) zum Hybridisieren verwendeten Nukleinsäuren (25) nach dem Schritt A1) mit einer zweiten Markierung (30) markiert werden, – wobei die zweite Markierung von der ersten Markierung verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der obigen Ansprüche, wobei das Verfahren mindestens einen der folgenden Schritte aufweist: – Denaturieren der Verbindung verschiedener Nukleinsäuren in einem Schritt A2) vor Schritt A); – Verwenden einer Nukleinsäure als Sonde (15) in Schritt A), die eine Folge von 18 bis 25 Nukleotiden aufweist, die mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz (1A) eine Hybridisierung eingehen können, wobei die Sequenz dieser Folge zu mindestens 80% zu der komplementären Folge der Ziel-Nukleinsäuresequenz passt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der obigen Ansprüche, wobei das Verfahren mindestens einen der folgenden Schritte aufweist: – Trennen der Nukleinsäuren in Schritt B) nach ihrer Masse unter Verwendung einer Gelelektrophorese; – Verwenden eines Mikrofluid-Chips in Schritt B) zur Trennung, der für die Elektrophorese von Nukleinsäuren geeignete Kapillaren aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der obigen Ansprüche, – bei dem eine erste und gegebenenfalls eine zweite Markierung verwendet wird, die jeweils aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: – radioaktive Markierungen, Fluoreszenz-, Chemolumineszenz-, Biolumineszenzmarkierungen, magnetische und Antigenmarkierungen.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, – bei dem die Fluoreszenzmarkierungen als erste und gegebenenfalls als zweite Markierung verwendet werden, – wobei die Fluoreszenzmarkierungen der ersten und der zweiten Markierung eine Strahlung bei verschiedenen Wellenlängen emittieren.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, – bei dem in Schritt C) die Menge und die Größe des hybridisierten Strangs der Zielnukleinsäure (1A) und der Sonde (15) anhand der ersten Markierung (20) und, wenn die zweite Markierung vorhanden ist, die Menge der anderen verschiedenen Nukleinsäuren (5) in der Mischung anhand der zweiten Markierung (30) ermittelt werden, – wobei zum Nachweis der beiden Markierungen ein Spektrometer verwendet wird.