DE69837711T2

DE69837711T2 - Leistungstarke verknüpfung von nukleinsäuresegmenten

Info

Publication number: DE69837711T2
Application number: DE69837711T
Authority: DE
Inventors: Qiang Arcadia LIU
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-25
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2018-09-26
Also published as: EP1019540A1; US6204025B1; DE69837711D1; AU9577998A; EP1019540B1; ATE361377T1; JP2001518310A; CA2303420A1; WO1999016904A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur wirksamen Amplifizierung von Ziel-DNA-Segmenten, das insbesondere für solche Zielgene vorteilhaft ist, die viele kleine Exons enthalten. Speziell umfasst das Verfahren ein schnelles Polymerase-Kettenreaktionsverfahren zum Verknüpfen mehrerer Gensegmente von einem einzigen oder mehreren Genen zu einem großen, zur weiteren Analyse geeigneten DNA-Molekül.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Die als Polymerasekettenreaktion (PCR) bekannte Technik ist ein Verfahren zur Amplifizierung genomischer DNA (Saiki et al., Science: 1350–1354 (1985)). Typischerweise verwendet das Verfahren zwei Oligonukleotid-Primer zur millionenfachen Amplifizierung eines einzelnen DNA-Segments. Jeder Zyklus der DNA-Replikation von dem/n ursprünglichen Primer(n) erzeugt ein Produkt, das als Template zur weiteren primer-abhängigen Replikation dient. Diese Eigenschaft des Verfahrens führt zu einer exponentiellen Zunahme des gewünschten DNA-Produktes mit jeder Replikationsrunde und einer raschen Akkumulation von DNA. Als ein inzwischen automatisiertes, unter Verwendung eines Thermozyklers und thermostabilen DNA-Polymerasen durchgeführtes Verfahren, wird die PCR von Molekularbiologen zur Herstellung großer Mengen synthetischer DNA umfassend verwendet.
Dieses revolutionäre Verfahren ist in einer großen Vielfalt von molekularbiologischen Gebieten eingesetzt worden und hat die rasche Identifizierung von krankheitsassoziierten Genen möglich gemacht. Durch Verwendung von PCR sind die Diagnose von Erbkrankheiten und von Krankheitsanfälligkeit auf molekularer Ebene ermöglicht worden. Dennoch sind einige Nachteile und Einschränkungen des Verfahrens und seiner Anwendung auf bestimmte Gene erkannt worden.
Üblicherweise wird bei der Anwendung von PCR zur Amplifizierung genomischer DNA jedes Gensegment einzeln amplifiziert und dann analysiert. Wenn das Gen von Interesse mehr als ein Exon enthält, muss jedes Exon individuell unter Verwendung einer separaten PCR amplifiziert und dann zur Bildung eines langen, das gesamte Gen repräsentierenden DNA-Moleküls mit den anderen verknüpft werden (Ho, et al., 1989; Horton et al., 1989). Je mehr Exons das Gen von Interesse enthält, umso mehr separate Amplifizierungen müssen einzeln durchgeführt werden und umso mehr PCR-Reaktionen werden zur Verknüpfung der Segmente miteinander benötigt, da in jeder Verknüpfungs-PCR nicht mehr als zwei Gensegmente miteinander verknüpft werden können. Für Gene, die eine Menge kleiner Exons enthalten, kann die Herstellung eines einzelnen Gens zur Analyse in untragbarer Weise arbeitsintensiv werden und, insbesondere wenn die kleinen Zielexons einzeln auf Mutationen und Polymorphismen überprüft werden müssen, sehr viel Zeit erfordern.
Es ist gezeigt worden, dass die gleichzeitige Amplifizierung von mehr als einem Gensegment unter Verwendung von Primern, an die eine nicht verwandte Sequenz von 20 Nukleotiden des Bakteriophagen M13mp18 angehängt ist, mit einer Multiplex-PCR erzielt werden kann (Shuber et al., 1995). Die mit Primern ohne diese 20 Nukleotide amplifizierten Produkte wurden jedoch aufgrund der Unterschiede bei den Hybridisierungskinetiken zwischen den Primern nicht zuverlässig hergestellt. Deshalb ist es unter Anwendung des Standes der Technik zur Erzielung wirksamer Amplifizierung multipler Sequenzen erforderlich, an jeden Primer eine Sequenz von 20 identischen Nukleotiden anzuhängen. Dieses Verfahren nach dem Stand der Technik gestattet somit multiple Amplifizierungen, aber die Amplifizierungsprodukte enthalten alle identische, nicht verwandte Sequenzen, die entweder entfernt oder verlängert werden müssten, bevor sie miteinander zur Bildung eines langen, alle Anteile des interessierenden Gens enthaltenden DNA-Moleküls verknüpft werden könnten.
Nachdem die einzelnen Gensegmente separat amplifiziert wurden, sind weitere unabhängige Schritte zur Rekonstruktion der vollständigen, gewünschten Gensequenz aus den kleinen Segmenten erforderlich, mit oder ohne eine eingeführte Mutation, bevor das Gesamtgen zur Analyse bereit ist. Verfahren aus dem Stand der Technik zur Verknüpfung von DNA-Abschnitten unter Verwendung von PCR umfassend das Verknüpfen von zwei Segmenten zur gleichen Zeit, wobei jeder PCR ein Reinigungsschritt folgt (Ho et al., 1989; Kim et al., 1996). Das Verknüpfen mehrerer Gensegmente miteinander erfordert deshalb mehrere PCRs und mehrere Reinigungsschritte. Zum Beispiel würde das Verknüpfen von vier Exons zur Bildung eines vollständigen Gens unter Verwendung dieser Verfahren aus dem Stand der Technik vier separate Amplifizierungs-PCRs, vier separate Reinigungen der Produkte und drei Verknüpfungs-PCRs erfordern. Jedes zusätzliche DNA-Segment in dem Gen würde eine zusätzliche PCR für seine Verknüpfung mit den anderen erfordern, was unter Verwendung der Verfahren nach dem Stand der Technik sowohl die Zeit als auch die Kosten zur Herstellung der DNA zur Analyse erhöht.
Zusammengefasst haben die Verfahren aus dem Stand der Technik zur Herstellung einer amplifizierten Kopie eines aus mehreren, verknüpften Exons zusammengesetzten Gesamtgens oder eine amplifizierte Kopie eines aus Gensegmenten von mehr als einem Gen zusammengesetzten langen DNA-Moleküls den Nachteil, dass im Allgemeinen bei jedem Schritt mehrere PCRs erforderlich sind. Bisher ist es nicht möglich gewesen, mehrere Gensegmente in effizienter Weise in einer einzigen PCR zu amplifizieren, um Produkte zu erhalten, die für eine einfache, rasche Verknüpfung in einer zweiten Einzel-PCR geeignete, komplementäre Enden hatten.
Folglich hat ein Bedarf auf dem Gebiet eines, das einfache und schnelle Amplifizieren von mehreren verknüpften, in nicht benachbarten Bereichen der Ziel-DNA auftretenden DNA-Segmenten gestattenden Verfahrens bestanden. Es besteht Bedarf an einem Verfahren, durch das ein, ein gesamtes Gen mit verknüpften Exons aus genomischer DNA enthaltendes amplifiziertes DNA-Molekül hergestellt werden kann, z.B. für die DNA-Diagnose.
Die WO 92/07075 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines chimären Antikörpers, bei dem die CDR eines ersten Antikörpers zwischen die Framework-Regionen eines zweiten Antikörpers durch Splicen eingefügt wird. Das Verfahren wird unter Verwendung eines Templates umfassend die beiden Framework-Regionen AB und CD, und zwischen diesen die durch die Donor-CDR zu ersetzende CDR duchgeführt. Die Primer A und B werden zur Amplifizierung der Framework-Region AB verwendet und die Primer C und D zur Amplifizierung der Framework-Region CD. Die Primer B und C enthalten jedoch an ihren 5'-Enden eine zusätzliche, der gesamten oder mindestens einem Teil der Donor-CDR-Sequenz entsprechende Sequenz. Die Primer B und C überlappen an ihren 5'-Enden mit einer für die Ermöglichung des Annealings ihrer 5'-Enden ausreichenden Länge unter Bedingungen, die die Durchführung einer Polymerasekettenreaktion und dadurch den Einbau der gesamten CDR-Donor-Sequenz gestatten. Die amplifizierten Regionen AB und CD können zur Herstellung des chimären Produkts in einer einzigen Reaktion das Splicen und eine Überlappungsverlängerung durchlaufen.
Die US 5023171 betrifft ein Verfahren zum Verknüpfen von zwei DNA-Molekülen in der Weise, dass sie zuerst mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden, die an jedem Molekül unter Verwendung von Oligonukleotidprimern durchgeführt wird, die in der Weise entwickelt wurden, dass die Enden der resultierenden PCR-Produkte komplementäre Sequenzen enthalten. Wenn die zwei PCR-Produkte gemischt, denaturiert und erneut einer Annealing-Reaktion unterworfen werden, werden die einzelsträngigen DNA-Stränge mit komplementären Sequenzen an ihren 3'-Enden durch Annealing verbunden und wirken dann als Primer füreinander. Die Verlängerung des durch Annealing verbundenen Bereichs durch DNA-Polymerase erzeugt ein doppelsträngiges DNA-Molekül, bei dem die ursprünglichen Moleküle durch Splicen verbunden werden.
Die WO 95/16028 stellt neue Zusammensetzungen bereit, enthaltend eine Mischung von (a) einem Enzym, das eine beträchtliche 3'-5'-Exonuklease-Aktivität hat; (b) einer DNA-Polymerase mit weniger 3'-5'-Exonuklease-Aktivität als das Enzym mit beträchtlicher 3'-5'-Exonuklase-Aktivität. Vorzugsweise ist die DNA-Polymerase zum Einschluss in diese Zusammensetzungen eine DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität fehlt. Es werden ebenfalls Verfahren zur Synthese von Polynukleotiden, typischerweise DNA, unter Verwendung der Zusammensetzungen a) und b) bereit gestellt. Ein weiterer Aspekt umfasst die Verwendung dieses Verfahrens der Polynukleotid-Synthese zur Durchführung des Syntheseschritts in einem Polymerasekettenreaktions-Experiment.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verknüpfung von mindestens drei in nicht benachbarten Ziel-DNA-Bereichen auftretenden DNA-Segmenten durch PCR bereit, worin jedes DNA-Segment eine zu einer Sequenz in dem DNA-Segment oder den DNA-Segmenten, mit dem/denen es verknüpft werden soll, komplementäre Sequenz enthält, umfassend das Unterwerfen von mindestens drei DNA-Sequenzen einer Verknüpfung durch PCR unter Verwendung eines ersten zu dem Antisense-Strang des ersten zu verknüpfenden DNA-Segments komplementären Primers und eines zweiten zu dem Sense-Strang des letzten zu verknüpfenden DNA-Segments komplementären Primers und mindestens einer Polymerase mit fehlender 3'-5'-Exonuklease-Aktivität und mindestens einer, die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltenden Polymerase.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Amplifizierung von mindestens drei verknüpfte, in nicht benachbarten Bereichen der Ziel-DNA auftretende DNA-Segmente enthaltender DNA bereit, umfassend a) Bereitstellung eines ersten Primers und eines zweiten Primers für jedes zu amplifizierende DNA-Segment, wobei i) der erste Primer (als D Primer bezeichnet) einen zu dem 3'-Ende des Antisense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einen zu einer Sequenz innerhalb des vorangehenden DNA-Segments komplementären 5'-Endbereich hat, ii) der zweite Primer (als U Primer bezeichnet) einen zu dem 3'-Ende des Sense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einen zu einer Sequenz innerhalb des nachfolgenden Segments komplementären 5'-Endbereich hat, b) Amplifizieren der mindestens drei DNA-Segmente durch Multiplex-PCR unter Verwendung des Paars von erstem und zweitem Primer, und c) Unterwerfen der mindestens drei amplifizierten DNA-Segmente einer Verknüpfung durch PCR unter Verwendung eines zu dem Antisense-Strang des ersten zu verknüpfenden Segments komplementären Sense-Primers und eines zu dem Sense- Strang des letzten zu verknüpfenden Segments komplementären Antisense-Primers und Verwendung von mindestens einer Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität und mindestens einer die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität enthaltenden Polymerase.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A ist eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Multiplex- und Verknüpfungs-PCR-Schritte. Vier Regionen des p53-Gens wurden durch Multiplex-PCR mit den 4 Primer-Paaren D₁/U₁, D₂/U₂, D₃/U₃ und D₄/U₄ amplifiziert. Jeder Primer enthält einen GC-reichen Endbereich und einen sequenzspezifischen Bereich. Der Endbereich eines U-Primers ist komplementär zu dem Endbereich des nachfolgenden D-Primers. Nach einem einfachen Reinigungsschritt werden die vier durch PCR amplifizierten DNAs (D₁/U₁, D₂/U₂, D₃/U₃ und D₄/U₄ ₎ verknüpft und durch ineinander geschachtelte P- und Q-Primer amplifiziert.
1B stellt ein Beispiel bereit, das zwei Typen von Endbereichen zeigt, die erfindungsgemäß verwendet werden können. Der Typ I-Endbereich des D₃-Primers überlappt nicht mit dem sequenzspezifischen Bereich des U₂-Primers, während der Typ II-Endbereich von 4 Basen überlappt wird. Sense(SEQ ID Nr. 21)- und Anti-Sense(SEQ ID Nr. 22)-Sequenzen des p53-Gens und Sense(SEQ ID Nr. 23)- und Anti-Sense(SEQ ID Nr. 24)-Sequenzen des F9-Gens sind im Endbereich eingeschlossen.
1C. Dieses schematische Diagramm veranschaulicht die Verwendung des Typ III-Endbereichs, bei dem die Endbereichssequenz zu einem internen Bereich der zu verknüpfenden DNA komplementär ist.
2A zeigt die relativen Ausbeuten an PCR-Produkt des p53-Gens mit verschiedenen Mengen von Vent- und festgelegten Mengen an Tth-, Taq- oder Tfl-Enzymen. Festgelegte Mengen von Tth, Taq oder Tfl und steigende Mengen von Vent wurden zur Verknüpfung und Amplifizierung der Segmente des p53-Gens verwendet. Die relativen Ausbeuten des verknüpften PQ-Produkts wurden unter Verwendung eines PhosphorImager (Molecular Dynamics) nach 15 Zyklen quantifiziert.
2B zeigt die relativen Ausbeuten an PCR-Produkt des F9-Gen mit variierenden Verhältnissen an Tth- und Vent-Enzymen. Steigende Mengen an Tth und Vent werden zur Verknüpfung und Amplifizierung der Segmente des F9-Gens verwendet. Weiterhin werden relative Ausbeuten des verknüpften PQ-Produkts unter Verwendung ein PhosphorImager nach 15 Zyklen quantifiziert (M = 120 ng, ϕX174/Hae III-DNA-Marker).
3 zeigt die Auswirkung verschiedener Mengen an DNA-Template auf die Ausbeute an PCR-Produkt. In 3A wurde das p53-Gen unter Verwendung von Tth/Vent-DNA-Polymerasen amplifiziert. Die Tth/Vent-DNA Polymerasen wurden auf steigende Mengen an Template-DNA angewandt und das p53-PQ-Produkt quantifiziert. In 3B wurden Tth/Vent-, Taq/Pfu- oder Tfl/Vent-DNA-Polymerasen auf das F9-Gen angewandt. Tth/Vent, Taq/Pfu oder Tfl/Vent wurden auf das F9-Gen angewandt.
4 stellt die relativen Ausbeuten und die Akkumulation des PCR-Produkts dar. Aliquots identisch radioaktiv markierter Verknüpfungs-PCR-Mischungen wurden nach jeweils 3 Zyklen vom 9. bis 30. Zyklus aus dem Thermocycler entnommen und die PQ-PCR-Produkte quantifiziert. 40 ng (4A), 20 ng (4B) oder 10 ng (4c) der p53-DNA-Templates pro 25 μl Reaktion wurden verwendet.
5 gibt die relativen Ausbeuten der PCR-Produkte der p53- und F9-Gene bei verschiedenen Annealing-Temperaturen an.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Das erfindungsgemäße Amplifizierungsverfahren kann große, aus mehreren Exons zusammengesetzte DNA-Mengen oder aus nicht benachbarten DNA-Segmenten oder aus verschiedenen Genen zusammengesetzte DNA erzeugen, ohne dass die zeitaufwendige Amplifizierung jedes einzelnen Gensegments erforderlich ist. Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil ist die leichte Verknüpfung der Gensegmente in einem Schritt und die Amplifizierung des verknüpften Produkts.
Die Erfindung hat mehrere Verwendungen, die die folgenden beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein: i) effizientes Scannen auf Mutationen durch Verfahren wie den genetischen Fingerabdruck durch Restriktionsendonukleasen, wenn genomische DNA aus Genen analysiert wird, bei denen mehrere kurze Exons durch lange Introns getrennt sind; ii) Verknüpfen verschiedener Protein-Domänen zur Erzeugung eines rekombinanten Gens/einer rekombinanten RNA mit neuen Eigenschaften, und iii) Verknüpfung von RNAs durch Erzeugung von cDNA, Verknüpfen der cDNA mit dem eine RNA-Promotor-Sequenz enthaltenden Primer und nach Verknüpfung Transkription des verknüpften Segments zur Erzeugung von RNA.
Multiplex-PCR
Multiplex-PCR ist die Amplifizierung der gewünschten Bereiche (zum Beispiel Exons) des genetischen Materials unter Verwendung eines Primerpaars für jeden einzelnen Bereich. 1 veranschaulicht in schematischer Form die Amplifizierung von 4 Exons gleichzeitig mit vier Primer-Paaren vor dem Verknüpfungsschritt. Die Primer-Paare werden als D₁/U₁, D₂/U₂, ... D₈/U₈ bezeichnet. Jeder Primer enthält einen GC-reichen Endbereich und einen sequenzspezifischen Bereich und der Endbereich eines jeden U-Primers ist komplementär zu dem Endbereich des nachfolgenden D-Primers. Drei Typen von Primer-Endbereichen kommen zur Verwendung bei dieser Erfindung in Betracht. Bei den Typ-I-Primern überlappt der Endbereich des D-Primers nicht mit dem sequenzspezifischen Bereich des vorangehenden U-Primers.
Bei Typ-II-Primern überlappt der Endbereich des D-Primers den sequenzspezifischen, dem vorangehenden U-Primer benachbarten Bereich (vgl. 1B). Typ-III-Primer enthalten einen Endbereichsabschnitt, der zu einer internen Sequenz des vorangehenden Gensegments komplementär ist (vgl. 1C als Beispiel in schematischer Form).
Die Primer wurden mit der Oligo-5-Software (National Biosciences, Inc.) und dem GCG-Programm (Genetic Computer Group, Inc.) gestaltet. Oligo-5 berechnet die Schmelztemperatur (T_m) des Primers mit dem Nachbarschaftsanalyse-Verfahren (nearest neighbour method) bei 50 mM KCl und 250 pM DNA. Der T_m-Wert jeder PCR-DNA wurde nach der Wetmur-Formel bewertet
(T_m ^Produkt = 81,5 + 16,6log[K⁺] + 0,41(%G + %C) – 675/Länge (Wetmur, 1991).
Typ-I-Endbereiche überlappen nicht den sequenzspezifischen Bereich des komplementären Primers, während Typ-II-Endbereiche den sequenzspezifischen Bereich mit vier Basen überlappen. Mit mehr oder mit weniger Basen überlappende Endbereiche sind ebenfalls zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet. Die Typ-III-Endbereiche sind zu einer internen Sequenz innerhalb des vorangehenden Gensegments komplementär.
RICHTLINIEN FÜR DIE PRIMER-GESTALTUNG
Die Gestaltung geeigneter Primer ist ein kritischer Schritt bei der Durchführung der Verknüpfungs-PCR. Auf der Grundlage dieser Arbeit, aufbauend auf weiteren, Multiplex-PCR verwendenden Studien (Liu et al., 1997) wurden die folgenden Richtlinien zur Primergestaltung entwickelt und erfolgreich angewandt.
a) Sequenzspezifischer Bereich
Der sequenzspezifische Bereich wirkt sich auf die Ausbeuten und Genauigkeit der Multiplex-PCR aus. Die Kriterien werden wie folgt festgelegt:

1. Der T_m-Wert sollte etwa 35°C unter dem durchschnittlichen T_m-Wert für die Zielbereiche liegen. Ein T_m-Wert unter diesem kann zu niedrigen PCR-Ausbeuten führen, insbesondere falls der Bereich des zu amplifizierenden Gensegments einen prozentual hohen GC-Gehalt hat.
2. Die Stringenz für die Dimer- oder Haarnadelstruktur-Bildung am 3'-Ende sollte vorzugsweise auf ≤ 4 Basenpaare für alle Primer festgelegt werden. Dies führt bei der Multiplex-PCR zu einem größeren Potential von Problemen als bei der normalen, nur 2 Primer verwendenden PCR.
3. Die Stringenz für Stellen falschen Primings am 3'-Ende sollte vorzugsweise auf ≤ 6 Basenpaare für alle Stränge und alle Bereiche festgelegt werden.
4. Interne Stabilität kann auf der Grundlage der Anweisungen des Oligo-5-Software-Packets ausgewählt werden.

b. Endbereich
Der Endbereich ist kurz (vorzugsweise weniger als 20 Basen) und enthält einen hohen Prozentsatz von GC-Basen und seine Funktion ist, konsistente und ausgewogene hohe Ausbeuten an Multiplex-PCR-Produkten und ein effizientes und spezifisches Verknüpfungsstück (linker) für die Verknüpfungs-PCR bereitzustellen. Die Kriterien sollten wie nachfolgend festgelegt werden:

1. Der GC-Gehalt sollte vorzugsweise zwischen 60 bis 70% liegen.
2. Die Größe des Endbereichs ist vorzugsweise von 10 bis 15 Basen lang und insbesondere bevorzugt 12 Basen lang.
3. Die Stringenz für falsches Priming der Anti-Sense-Sequenz des Primers an seinem 3'-Ende sollte vorzugsweise ≤ 6 Basen für jeden Strang und jede Zielsequenz betragen.
4. Ein Type-II-Endbereich ist bevorzugt.

Optimierung der Multiplex-PCR
Die Parameter der PCR können nach Shuber et al. (Shuber et al., 1995) oder wie empirisch ermittelt festgelegt werden. Für die folgenden Beispiele wurde der Optimierungs-Strategie von Shuber et al. (Shuber et al., 1995) gefolgt, außer bei der Annealing-Temperatur. Die optimale Annealing-Temperatur wurde empirisch bestimmt und von ihr wurde erwartet, etwa 20–25°C unter der Durchschnitts-T_m der amplifizierten Genbereiche zu liegen (Liu et al., 1997). Eine bevorzugte Strategie zur Optimierung des Multiplex-PCR-Schritts ist wie folgt:
a. Test jeder PCR:
Die Konzentrationen an Primer, Mg, DMSO und die Menge der TaqGold-DNA-Polymerase sollte für jede Polymerasekettenreaktion optimiert werden. Die optimale Annealing-Temperatur sollte etwa 20–25°C niedriger sein als die Durchschnitts-T_m für die zu amplifizierenden Bereiche, sollte aber letztendlich empirisch bestimmt werden. Falls ein Bereich nicht effizient amplifiziert wird, kann das Hinzufügen von ein oder zwei Basen zu dem sequenzspezifischen Bereich des Primers die Ausbeute erhöhen.
b. Test der Multiplex-PCR:
Die üblichen Parameter jeder PCR sollten so gewählt sein, dass sie ausgewogene, hohe Ausbeuten des spezifisch gewünschten Multiplex-PCR-Produkts erzeugen. Die Taq-DNA-Polymerase kann in Mengen vorliegen, die so groß wie 2 bis 6 Units pro 25 μl Reaktion sind. In seltenen Fällen kann die Primer-Konzentration einer weiteren Anpassung bedürfen, um gleichmäßige, ausgewogene Ausbeuten für jedes DNA-Segment zu erzielen. Falls immer noch keine befriedigenden Ergebnisse erzielt werden, kann eine Änderung in der Primer-Sequenz erforderlich sein.
Der Start bei hohen Temperaturen (hot start) mit TaqGold wurde zum Vermeiden der Primer-Dimer-Bildung und falschen Primings für wichtig befunden. Eine potentielle Schwierigkeit bei dem p53-Gen waren die Amplifizierungen der Exons 10 und 11, die durch ein Intron von 800 Basenpaaren getrennt sind. Unsere Ergebnisse zeigten jedoch keine großen PCR-DNA-Produkte, die die beiden Exons überspannen, wenn die T_m für die sequenzspezifischen Bereiche der U₃- und D₄-Primer erhöht wurde und deren relative Konzentrationen gemäß dem bevorzugten Optimierungsschema angepasst wurden.
Verknüpfungs-PCR
Durch Multiplex-PCR oder ein anderes geeignetes Verfahren hergestellte amplifizierte DNA-Segmente können mit dem PCR-Verknüpfungs-Verfahren mit oder ohne vorherige Reinigung zur Entfernung nicht eingebauter Primer verknüpft werden. Zuerst werden die Anti-Sense-Stränge der U₁- und D₂-Endbereiche, der U₂- und D₃-Endbereiche und der U₃- und D₄-Endbereiche der Annealing-Reaktion unterworfen und verlängert, so dass die vier D₁U₁-, D₂U₂-, D₃U₃- und D₄U₄-DNAs in numerischer Reihenfolge zu einem D₁U₄-Molekül miteinander verknüpft werden. Falls die Primer zu einem anderen Bereich des zu verknüpfenden DNA-Segments komplementär sind, werden die komplementären Bereiche einer Annealing-Reaktion unterworfen und verlängert. Als Zweites amplifiziert die PCR die verknüpften Templates mit den ineinander geschachtelten Primern wie zum Beispiel P und Q (1A).
Endbereiche von 12 Basen arbeiten effizient, obwohl Endbereiche von 10 bis 15 Basen oder ein größerer Bereich ebenfalls geeignet sind. Die Endbereiche der Primer P und Q verhindern „Megapriming", das auftritt, wenn ein in einem früheren Zyklus erzeugtes PQ-Produkt als Primer für ein längeres D₁U₄-Template in einem nachfolgenden Zyklus wirkt (Sarkar und Sommer, 1992; Sarkar und Sommer, 1990). Der Endbereich wirkt ebenfalls als ein Umschalter von niedriger Amplifikations-Effizienz zu hoher Effizienz in Abhängigkeit davon, an welches Template von D₁U₄ oder PQ der Primer im Zuge der Annealing-Reaktion bindet (Liu et al., 1997).
Eine der drei DNA-Polymerasen mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität (Tth, Taq (Boehringer Mannheim) und Tfl (Promega)) wurde mit einem von zwei 3'→5'-Exonuklease-Aktivität besitzenden Enzymen [(Vent (New England BioLabs) oder Pfu (Stratagene)] zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kombiniert. Bezüglich der Wirkung des Enzyms, dem die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität fehlt, wird gemutmaßt, dass es die potentielle zusätzliche, nicht dem Template entsprechende Base A am 3'-Ende des PCR-Produkts entfernt (Wu et al., 1989). Der Fachmann wird erkennen, dass weitere Enzyme bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wie zum Beispiel Pwo und Plo, aber es ist entscheidend, dass die Polymerase-Aktivität auf einem (oder mehren) Enzym(en) ohne 3'→5'-Exonuklease-Aktivität und auf einem (oder mehreren) Enzym(en) mit 3'→5'–Exonuklease-Aktivität beruht. Diese Enzyme und Enzym-Kombinationen dienen nur als Beispiel zum Zweck der Veranschaulichung und sind nicht als die Erfindung einschränkend zu verstehen.
Ein fester oder flüssiger makromolekularer Zusatzstoff kann in der PCR-Verknüpfungsmischung verwendet werden. Makromolekulare Zusatzstoffe wie zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG) können die Menge des zum Erhalten eines zufrieden stellenden Ergebnisses benötigten Templates reduzieren.
Optimierung der Verknüpfungs-PCR
Die folgenden bevorzugten Parameter sind nicht als die Erfindung einschränkend zu verstehen. Der erfahrene Molekularbiologe wird erkennen, dass verschiedene Parameter erfindungsgemäß verwendet werden können.
a) Primer
Die ineinander geschachtelten Primer P und Q sollten unter Anwendung derselben Kriterien und Verfahren gestaltet werden, wie sie oben für die Primer D und U beschrieben sind, außer dass die T_m der sequenzspezifischen Bereiche vorzugsweise etwa 35 bis 40°C niedriger ist als für das D₁U₄-Produkt.
b. Polymerasen
Tth/Vent-DNA-Polymerasen liegen vorzugsweise mit etwa 1U/0,1U oder 1U/0,05U pro 25 μl Reaktion vor.
c. Verknüpfungseffizienz

Die Verknüpfung einzelner DNA-Segmente wird vorzugsweise durch Messung der Verknüpfungseffizienzen aller Bereiche, deren Verknüpfung gewünscht wird und aller kürzeren verknüpften Segmente getestet. Zum Beispiel würde die Verknüpfungseffizienz von 4, 3 und 2 Segmenten mit den geeigneten Primer-Paaren gemessen, falls die gewünschte vollständige DNA-Sequenz aus 4 Segmenten zusammengesetzt ist. Tabelle 1 veranschaulicht dieses vorgeschlagene Verfahren. TABELLE 1. Relative Mol-Verhältnisse von PCR-Produkten mit verschiedenen Primer-Paaren

Gen	Template-Menge	Primer-Paar
Gen	Template-Menge	D₁/U₂	D₂/U₃	D₃/U₄	D₁/U₃	D₂/U₄	D₁/U₄	P/Q	Keins
p53	40 ng	10,85	8,10	9,09	6,73	7,27	4,81	5,31	0,22
	20 ng	7,74	4,56	7,60	0,98	3,19	0,57	1,00	0,17
	10 ng	8,54	4,44	7,08	1,07	0,56	0,09	0,13	0
F9	40 ng	18,54	18,58	17,60	14,43	14,27	8,77	4,87	0,16
F9	10 ng	17,78	17,60	16,85	8,18	8,58	3,61	1,00	0

Das Mol-Verhältnis von D₁U₂, D₂U₃, D₃U₄, D₁U₃, D₂U₃ und keinem Primer bis D₁U₄-Primer wird durch Vereinheitlichung der relativen Ausbeute durch die potentielle Menge eingebauten, radioaktiven ³²P-dCTP erhalten.
d. Annealing-Temperatur
Die optimale Annealing-Temperatur sollte unter Verwendung großer Mengen an DNA-Template bestimmt werden und ist im Allgemeinen mit dem prozentualen Anteil der GC-Basen im Template assoziiert (vgl. 5).
e. DNA-Template-Konzentration
Die bevorzugte DNA-Template-Konzentration wird wie in 3 gezeigt bestimmt und ist abhängig davon, wie viel DNA-Segmente miteinander zu verknüpfen sind.
f. Anzahl der Zyklen
Die optimale Anzahl der Zyklen sollte für jede Verknüpfungs-PCR bestimmt werden. Routinemäßig sind meistens 20 bis 25 Zyklen am effizientesten und ergeben das beste Produkt.
g. Qualitätskontrolle
Die Identität und Qualität des Verknüpfungs-PCR-Produktes wird vorzugsweise durch direkte Sequenzierung bestätigt. Falls das Produkt nicht der korrekten Sequenz entspricht, sollten die Primer des Multiplex-Schrittes und die P- und Q-Primer erneut geprüft werden.
BEISPIELE
1. Multiplex-PCR der p53-Gen-Exons
Jedes der vier Primer-Paare von D₁U₁, D₂U₂, D₃U₄, D₃U₃ und D₄U₄ (Tabelle 1A) wurde zu Amplizierung der Exons 1, 2–4, 10 und 11 in dem p53-Gen verwendet. Jeder Primer enthält einen GC-reichen Endbereich und einen sequenzspezifischen Bereich. Die Endbereiche der U-Primer waren zu dem Endbereich jedes nachfolgenden D-Primers komplementär. Dieses Beispiel verwendet einen Typ-I-Endbereich, bei dem der Endbereich des D₃-Primers nicht mit dem sequenzspezifischen Bereich des U₂-Primers überlappt (Tabelle 1A, 1A). Ein Reaktionsstart bei 92°C (hot start) während 10 min wurde zur Enzymaktivierung eingeschlossen. Die Denaturierung erfolgte bei 94°C während 15 sec und die Annealing-Reaktion wurde bei 55°C während 30 sec durchgeführt, gefolgt von der Verlängerung bei 72°C während 2 min für insgesamt 35 Zyklen mit einem Perkin Elmer Model 9600-Thermozykler. Die PCR-Mischung enthielt 50 mM KCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 200 μM von jeder dNTP, 5% DMSO, 3–4 U TaqGold-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) und 250 ng genomischer DNA pro 25 μl Reaktionsvolumen. Nach der Reinigung in einem Centricon^®-100-Mikrokonzentrator (Amicon) wurde die Menge an DNA durch ein Spektrometer bei 260 nm bestimmt. Die vier erwarteten DNA-Produkte wurden in ähnlichen molekularen Verhältnissen erhalten und die komplementären Endbereiche verursachten keine offensichtlichen Probleme.
2. Multiplex-PCR des F9-Gen-Exons
Jedes der vier Primer-Paare von D₁U₁, D₂U₂, D₃U₃ und D₄U₄ (Tabelle 1B) wurde zum Amplifizieren der Exons 1, 2–3, 4 und 5 des F9-Gens verwendet. Wie in dem obigen Beispiel enthält jeder Primer einen GC-reichen Endbereich und einen sequenzspezifischen Bereich und die Endbereiche des U-Primers waren zu den Endbereichen jedes nachfolgenden D-Primers komplementär. In diesem Beispiel wird ein Typ-II-Endbereich verwendet, bei dem der Endbereich der D₁-, D₂- und D₃-Primer um vier Basen den sequenzspezifischen Bereich des entsprechenden U-Primers überlappt (Tabelle 1B, 1B). Die PCR-Mischung und die Reaktions-Parameter waren dieselben wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme, dass die 5% DMSO in der Reaktionsmischung weggelassen wurden. TABELLE 1: PRIMER

^aDie PCR-Produkte des p53-Gens sind D₁U₁ (270 bp, 58% G + C), D₂U₂ (736 bp, 59% G + C), D₃U₃ (286 bp, 55% G + C), D₄U₄ (235 bp, 54% G + C) und PQ (1433 bp, 57% G + C). Das Nummerierungssystem basiert auf der Genbank-Zugangsnummer: X54156. Die PCR-Produkte des F9-Gen sind D₁U₁ (367 bp, 40,6% G + C), D₂U₂ (784 bp, 31,4% G + C), D₃U₃ (371 bp, 39,9% G + C), D₄U₄ (330 bp, 36,4% G + C) und PQ (1702 bp, 35% G + C). Das Nummerierungssystem ist wie in Yoshitake et al. beschrieben (Yoshitake et al., 1985). Die Schlüssel für die Primer-Namen sind die folgenden: 5'UT gibt an, dass der Primer am 5'-Ende des nicht translatierten Bereichs beginnt; der Buchstabe I gefolgt von einer Zahl gibt an, dass der Primer an diesem Intron beginnt; die Zahl in Klammer gibt das Nukleotid an, an dem die Sequenz beginnt; die folgende Zahl gibt die Sequenzlänge an und der Buchstabe D (downstream) oder U (upstream) gibt einen stromabwärts oder stromaufwärts gerichteten Primer an.
^bDer unterstrichene Bereich des Endbereichs und der in Großbuchstaben angegebene Bereich ist der sequenzspezifische Bereich.
^ctT_m und cT_m geben die T_m-Werte des Endbereichs bzw. für den sequenzspezifischen Bereich eines Primers an.
^dDie Anti-Sense-Sequenz des Primers Nr. 4 hat 7 bp einer falschen Priming-Stelle am 3'-Ende.

3. Verknüpfungs-PCR
Die Verknüpfungs-PCR wurde wie folgt durchgeführt:
Die Denaturierung verlief bei 94°C während 15 sec, die Annealing-Reaktion bei 55°C während 30 sec mit Verschiebung auf 72°C innerhalb einer Minute und die Verlängerungs-Reaktion bei 72°C während 2–3 min bei insgesamt 15 Zyklen. Die Reaktionsmischung enthielt 100 mM KCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8,9, 1,5 mM MgCl₂, 50 μg/ml BSA, 0,05% (vol/vol) Tween 20, 200 μM jedes dNTPs, 1 U Tth (Boehringer Mannheim) und 0,1 U Vent (New England Biolabs) DNA-Polymerase, 20 ng von jeder der 4 DNAs und 5 μCi α-³²P-dCTP (300 Ci mMol, Amersham) pro 25 μl Reaktion soweit nicht anders erwähnt. Die PCR-Produkte wurden über ein 2%iges Agarose-Gel getrennt, das dann mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht mit einer AlphaImager^TM 2000 CCD-Kamera (Alpha Inntoech) fotografiert wurde. Die PCR wurde dann mit dem PhosphorImager mit der ImageQuant-Software (Molecular Dynamics) quantifiziert, nachdem das getrocknete Gel während 30 min exponiert wurde. Die PCR-Ausbeuten wurden als „willkürlichen Einheiten" quantifiziert, d.h. als Anzahl der Pixel in der PCR-Bande minus Hintergrund.
Zur Quantifizierung der Akkumulation verknüpfter PQ-PCR-Produkte wurden Aliquots aus dem Verknüpfungs-PCR-Reaktionsgemisch im Thermozykler nach jeweils drei Zyklen von Zyklus 9 bis Zyklus 30 entnommen. 40 ng, 20 ng und 10 ng der vier p53-DNA-Templates pro 25 μl Reaktionsvolumen (4) enthaltende Reaktionsansätze wurden verwendet. Das erste Auftreten eines schwachen PQ-Produktes war abhängig von der Menge an DNA-Template in der Reaktionsmischung, was das Vorliegen von Verknüpfungs-Kinetiken für 4 Komponenten bestätigt. Während der späten Zyklen akkumulierte das PQ-PCR-Produkt in beträchtlichem Ausmaß und erreichte einen Sättigungspunkt. Der Punkt, bei dem die Sättigung erreicht wurde, war ebenfalls abhängig von der ursprünglich der Reaktion zugesetzten Menge an DNA-Template. Darüber hinaus war das relative Vorliegen von Zwischenprodukten nach 20 Zyklen stark reduziert (4). Ein ähnliches Ergebnis wurde mit dem F9-Gen erhalten.
4. Optimierung der Verknüpfungs-PCR-Parameter
a. Enzymtyp, Konzentration und Verhältnis
Wie in 2A zu sehen, wurden 1 U Tth, Taq oder Tfl mit 0–0,2 U Vent gemischt, um die mit dem PhosphorImager nach 15 Zyklen unter verschiedenen Enzym-Bedingungen quantifizierten Ausbeute des PCR-Produkts des p53-Gens zu testen. Die Ergebnisse zeigen, dass Tth/Vent in Verhältnissen von 1:0,1 und 1:0,05 (Bahnen 2 und 3) die höchsten Ausbeuten erzeugten. Die relativen PCR-Verknüpfungseffizienzen waren Tth/Vent oder Tfl/Vent > Tfl/Pfu > Taq/Pfu > Tth/Pfu > Tth/Vent. Jedes einzelne Enzym allein arbeitete nicht optimal.
Weitere Tests mit Tth und Vent wurden bei der Verknüpfung der Exons des F9-Gens durchgeführt, wobei sowohl die Mengen als auch die Verhältnisse der beiden Enzyme in der Mischung verändert wurden (2B). Die Mengen von Tth lagen im Bereich von 0,125 U bis 0,4 U und die Mengen von Vent lagen im Bereich von 0,0125 U bis 0,4 U, wobei 4 U Tth und 0,1 U Vent die höchsten Ausbeuten ergaben (Bahn 7). Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die absolute Menge der beiden Enzyme als auch das Verhältnis die Effizienz der Verknüpfungs-Polymerasekettenreaktion beeinflussen. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Verknüpfungs-PCR mit 15 Basen komplementäre Sequenz enthaltenden Segmenten durchgeführt wurde und wenn 49 ng Template-DNA verwendet wurden.
b. DNA-Template-Konzentration
Unter Verwendung steigender Mengen jeder der vier DNA-Templates (D₁U₁, D₂U₂, D₃U₃ und D₄U₄) mit einer konstanten Menge an Tth/Vent wurde ein „Schwellenwert" zwischen 10 und 20 ng Template-DNA pro 25 μl Reaktionsvolumen beobachtet (Bahnen 4 und 5). Die Verdopplung der Template-Konzentration führte zu einem 14–16fachen Anstieg bei dem verknüpften p53-Produkt. Die Ausbeute an verknüpftem Produkt ist deshalb die Template-Konzentration zur vierten Potenz [Ausbeute = (Gesamtmenge aller Templates)⁴]. Dies wurde durch Wiederholung des Experiments unter Verwendung von separaten Schritten für die Verknüpfung und für die nachfolgende Amplifizierung bestätigt. Zusätzlich ergab ein Experiment unter Verwendung von DNA-Template mit Endbereichen von mehr als 15 Basen denselben Effekt. Ähnliche „Schwellenwert"-Effekte traten auf, wenn Taq/Pfu- und Tfl/Vent-Enzyme bei dem F9-Gen einsetzt wurden (eher 40% GC-Gehalt als 57% GC-Gehalt wie bei dem p53-Gen), was anzeigt, dass der Effekt weder von den Enzymen noch von den speziellen verwendeten DNA-Templates abhängt (3B).
C. Verknüpfung mit verschiedenen Primer-Paaren
Außer den Primer-Paaren von P/Q wurden weitere Primer verglichen: D₁U₂, D₂U₃ und D₃U₄ amplifizierten zwei verknüpfte Regionen; D₁U₃ bzw. D₂U₃ amplifizierten drei verknüpfte Regionen und D₁U₄ amplifizierten vier verknüpfte Templates. Das Mol-Verhältnis von D₁U₂, D₂U₃ und D₃U₄; von D₁U₃, D₂U₃ und D₁U₄ (die vereinheitliche relative Ausbeute oder Anzahl von potentiell eingebautem radioaktiven ³²P-dCTP) spiegelt die relativen Verknüpfungseffizienzen der Zwei-, Drei- und Vier-Template-Reaktionen. Tabelle 2 zeigt, dass zwei Templates verknüpfende Verknüpfungs-PCRs viel effizienter sind als diejenigen, die vier Templates verknüpfen.
Zwei Templates verknüpfende Verknüpfungs-PCRs sind auch viel weniger abhängig von der Template-Menge.
d. Länge des Endbereichs
Mit einem 60 bis 70%igen GC-Gehalt gestaltete Endbereiche von 10, 12 oder 15 Basen wurden bei der Verknüpfung der Exons des F9-Gens getestet. 12 Basen enthaltende Endbereiche waren am effizientesten bei der Verknüpfung. Weitere Experimente mit Endbereichen von 12 bis 15-Basen im p53-Gen (T_m liegt im Bereich von 21,6°C bis 44,1°C) und Endbereiche im F9-Gen ergaben dieselben Ergebnisse: Endbereiche von 12 Basen waren am effizientesten.
e. Annealing-Temperatur
Die Auswirkungen der Annealing-Temperatur wurden unter Verwendung eines Gradient Robocyclers (Stratagene) untersucht. Für das p53-Gen wurde unter Verwendung von 4 Templates mit Endbereichen von 12 Basen ein verknüpftes Produkt mit hohen Ausbeuten bei Annealing-Temperaturen von 50°C bis zu 58°C gebildet. Für das F9-Gen wurden unter denselben Bedingungen hohe Ausbeuten verknüpften Produkts bei Annealing-Temperaturen von 47°C bis 55°C gebildet. Die optimale Annealing-Temperatur ist relativ niedrig und erstreckt sich über einen weiten Bereich. Die optimale Annealing-Temperatur ist ebenfalls mit dem GC-Gehalt des Templates assoziiert.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Verknüpfung von mindestens drei in nicht benachbarten Ziel-DNA-Bereichen auftretenden DNA-Segmenten durch PCR, worin jedes DNA-Segment eine zu einer Sequenz in dem DNA-Segment oder den DNA-Segmenten, mit dem/denen es verknüpft werden soll, komplementäre Sequenz enthält, umfassend das Unterwerfen von mindestens drei DNA-Sequenzen einer Verknüpfung durch PCR unter Verwendung a. eines ersten zu dem Antisense-Strang des ersten zu verknüpfenden DNA-Segments komplementären Primers und eines zweiten zu dem Sense-Strang des letzten zu verknüpfenden DNA-Segments komplementären Primers und b. mindestens einer Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität und mindestens einer, die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltenden Polymerase.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität aus der Gruppe Tth, Taq und Tfl ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine, die 3'→5 Exonuklease-Aktivität enthaltende Polymerase aus der Gruppe Pfu, Plo und Pwo ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität in einer Konzentration von etwa 0,125 U bis etwa 4 U pro 25 μl Reaktionsgemisch vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität in einer Konzentration von 4 U pro 25 μl Reaktionsgemisch vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine, die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltende Polymerase in einer Konzentration von etwa 0,0125 U bis etwa 0,4 U pro 25 μl Reaktionsgemisch vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine, die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltende Polymerase in einer Konzentration von etwa 0,1 U pro 25 μl Reaktionsgemisch vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine Polymerase mit fehlender 3'-5'-Exonuklease-Aktivität und die mindestens eine, die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltende Polymerase in einem Verhältnis von etwa 1:0,0125 bis etwa 1:0,2 vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität und die mindestens eine, die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltende Polymerase in einem Verhältnis von 1:0,05 vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität und die mindestens eine, die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltende Polymerase in einem Verhältnis von 1:0,1 vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente unter Verwendung eines ersten Primers mit einem zu dem 3'-Ende des Antisense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einem zu dem 5'-Ende des zweiten Primers für das vorangehende DNA-Segment komplementären 5'-Endbereich und eines zweiten Primers mit einem zu dem 3'-Ende des Sense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einem zu dem 5'-Ende des ersten Primers für das nachfolgende Segment komplementären 5'-Endbereich amplifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente unter Verwendung eines ersten Primers mit einem zu dem 3'-Ende des Antisense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einem zu einer Sequenz innerhalb des vorangehenden DNA-Segments komplementären 5'-Endbereich und eines zweiten Primers mit einem zu dem 3'-Ende des Sense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einem zu einer Sequenz innerhalb des nachfolgenden Segments komplementären 5'-Endbereich amplifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente Exons eines einzigen Gens sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente Exons verschiedener Gene sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente nicht kodierende Bereiche eines einzigen Gens sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente nicht kodierende Bereiche verschiedener Gene sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente aus Organismen derselben Spezies stammen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente aus Organismen einer oder mehrerer verschiedener Spezies stammen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Segmente zu den Endbereichen der benachbarten DNA-Segmente komplementäre Endbereiche enthalten.
Verfahren zum Herstellen und Amplifizieren von mindestens drei miteinander verknüpfte, in nicht benachbarten Ziel-DNA-Bereichen auftretende DNA-Segmente enthaltender DNA, umfassend a. Bereitstellung eines ersten Primers und eines zweiten Primers für jedes zu amplifizierende DNA-Segment, wobei i. der erste Primer (als D Primer bezeichnet) einen zu dem 3'-Ende des Antisense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einen zu dem 5'-Ende des zweiten Primers für das vorangehende DNA-Segment komplementären 5'-Endbereich hat, ii. der zweite Primer (als U Primer bezeichnet) einen zu dem 3'-Ende des Sense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einen zu dem 5'-Ende des ersten Primers für das nachfolgende Segment komplementären 5'-Endbereich hat, b. Amplifizieren der mindestens drei DNA-Segmente durch Multiplex-PCR unter Verwendung des Paars von erstem und zweitem Primer, und c. Unterwerfen der mindestens drei amplifizierten DNA-Segmente einer Verknüpfung durch PCR unter Verwendung eines zu dem Antisense-Strang des ersten zu verknüpfenden Segments komplementären Sense-Primers und eines zu dem Sense-Strang des letzten zu verknüpfenden Segments komplementären Antisense-Primers und Verwendung von mindestens einer Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität und mindestens einer, die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltenden Polymerase.
Verfahren zum Herstellen und Amplifizieren von mindestens drei miteinander verknüpfte, in nicht benachbarten Ziel-DNA-Bereichen auftretende DNA-Segmente enthaltender DNA, umfassend a. Bereitstellung eines ersten Primers und eines zweiten Primers für jedes zu amplifizierende DNA-Segment, wobei i. der erste Primer (als D Primer bezeichnet) einen zu dem 3'-Ende des Antisense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'- Bereich und einen zu einer Sequenz innerhalb des vorangehenden DNA-Segments komplementären 5'-Endbereich hat, ii. der zweite Primer (als U Primer bezeichnet) einen zu dem 3'-Ende des Sense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich und einen zu einer Sequenz innerhalb des nachfolgenden Segments komplementären 5'-Endbereich hat, b. Amplifizieren der mindestens drei DNA-Segmente durch Multiplex-PCR unter Verwendung des Paars von erstem und zweitem Primer, und c. Unterwerfen der mindestens drei amplifizierten DNA-Segmente einer Verknüpfung durch PCR unter Verwendung eines zu dem Antisense-Strang des ersten zu verknüpfenden Segments komplementären Sense-Primers und eines zu dem Sense-Strang des letzten zu verknüpfenden Segments komplementären Antisense-Primers und Verwendung von mindestens einer Polymerase mit fehlender 3'→5'-Exonuklease-Aktivität und mindestens einer die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität enthaltenden Polymerase.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, worin nach Schritt b und vor Schritt c nicht eingebaute Primer aus dem Amplifizierungsreaktionsgemisch entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die 5'-Endbereiche nicht mit dem zu dem 3'-Ende des Sense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich überlappen.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die 5'-Endbereiche mit dem zu dem 3'-Ende des Sense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich überlappen.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die 5'-Endbereiche den zu dem 3'-Ende des Sense-Strangs des DNA-Segments komplementären 3'-Bereich um 4 Nukleotide überlappen.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die 5'-Endbereiche GC-reich sind.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die 5'-Endbereiche etwa 60% bis etwa 70% G- und C-Nukleotide enthalten.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die 5'-Endbereiche etwa 10 bis etwa 15 Nukleotide lang sind.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die 5'-Endbereiche 12 Nukleotide lang sind.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die DNA-Segmente Exons sind.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die DNA-Segmente Exons eines einzigen Gens sind.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die DNA-Segmente Exons verschiedener Gene sind.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die DNA-Segmente nicht kodierende Bereiche eines einzigen Gens sind.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die DNA-Segmente nicht kodierende Bereiche verschiedener Gene sind.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die DNA-Segmente von Organismen derselben Spezies stammen.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die DNA-Segmente von Organismen einer oder mehrerer verschiedener Spezies stammen.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin das verknüpfte DNA-Produkt eine Genkopie mit fehlenden großen Introns ist.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin das verknüpfte DNA-Produkt eine Mutation enthält.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die verknüpfende Polymeraseketten-Reaktionsmischung einen festen oder flüssigen makromolekularen Zusatzstoff enthält.
Verfahren nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin der makromolekulare Zusatzstoff Polyethylenglycol ist.