DE112022000534T5

DE112022000534T5 - Verfahren zur Multiplex-Amplifizierung

Info

Publication number: DE112022000534T5
Application number: DE112022000534.3T
Authority: DE
Inventors: Gaolian XU; Hong Xu; Hao Yang; Hongchen Gu
Original assignee: Shanghai Healzone Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Healzone Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2023-10-26
Also published as: CN114717298A; WO2022148388A1

Abstract

In der vorliegenden Anwendung wird ein Verfahren zur Multiplex-Amplifizierung bereitgestellt, das hauptsächlich zwei Prozesse umfasst: eine lineare Amplifizierung, die durch ein Fänger-Oligonukleotid niedriger Konzentration induziert wird, und eine exponentielle Amplifizierung, die durch einen universellen Primer induziert wird. Das Verfahren umfasst: erstens die Verwendung eines spezifischen Fänger-Oligonukleotids mit niedriger Konzentration, um ein Zielmolekül mit eindeutiger 5'-terminaler Sequenzinformation zu binden und eine lineare Amplifizierung zu initiieren; den Erhalt eines Produkts mit einer vollständigen Haarnadelstruktur durch Selbstfaltung und Selbstextension des linearen Amplifizierungsprodukts und dadurch den Erhalt eines Amplifizierungs-Zwischenprodukts mit einer universellen Sequenz, die ein Terminal ist, aber eine Zielsequenz umfasst; und die Durchführung einer äquivalenten Signalamplifizierung an den Amplifizierungs-Zwischenprodukten, die verschiedene Zielsequenzen umfassen, in einer exponentiellen Amplifizierungsweise mittels desselben universellen Primers. Die kombinierte Strategie der linearen Amplifizierung und der exponentiellen Amplifizierung auf Basis des Universalprimers kann schließlich den Zweck der äquivalenten Amplifizierung und des Nachweises mehrerer Zielmoleküle erfüllen.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Anmeldung bezieht sich auf den Bereich der Biotechnologie und auf ein Verfahren zur Multiplex-Amplifizierung.
HINTERGRUND
Die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (MPCR) ist eine Technologie zur gleichzeitigen Vervielfältigung mehrerer Zielprodukte in einer einzigen PCR-Reaktion und zum Nachweis der vervielfältigten Produkte mit bestimmten Nachweismethoden, um den Nachweis mehrerer Zielprodukte zu ermöglichen. Die MPCR wurde eingehend untersucht, da sie sich durch hohe Effizienz, hohen Durchsatz und niedrige Kosten auszeichnet. Sie kann nicht nur die Nachweisleistung erheblich verbessern, sondern auch die Nachweiskosten senken. MPCR wird in vielen Bereichen eingesetzt, darunter Genmutation und - deletion, Genotypisierung und -quantifizierung, Gentests, begleitende Diagnostik und so weiter. Gegenwärtig kann die MPCR in Flüssigphasen-MPCR, mikrofluidische MPCR und Festphasen-Multiplex-PCR unterteilt werden.
Bei der Flüssigphasen-MPCR werden spezifische Primer für mehrere Zielprodukte zur Amplifizierung der verschiedenen Zielprodukte verwendet. Bei dieser Methode werden mehrere Amplifizierungsprimer in einer einzigen Reaktion eingesetzt. Wenn die Zahl der nachzuweisenden Moleküle steigt, verdoppelt sich auch die Zahl der Nukleotidketten im Röhrchen. Unter den Nukleotidketten bilden sich in großem Umfang Dimere oder sogar Multimere, was zu einer unspezifischen Amplifizierung führt, bei der die Amplifizierungseffizienz der Zielmoleküle abnimmt, was eine geringe Empfindlichkeit und Spezifität zur Folge hat, oder sogar zu einer Dominanz der unspezifischen Amplifizierung führt, wodurch die Zielmolekülsamplifizierung scheitert. Gleichzeitig führt diese Art von Design-Methode auch zu dem Problem einer uneinheitlichen Amplifizierungseffizienz für jedes Zielmolekül. Gegenwärtig sind die Multiplex-Ligations-abhängige Sondenamplifizierung (MLPA), eine auf der Haarnadelstruktur basierende Nachweisstrategie ( PCT/US2002/037238 ) und eine Nachweisstrategie mit Zwei-Runden-Amplifizierung ( PCT-Patent WO 96/41012 ) bekannt. Bei der MLPA werden spezifische Ligationsprimer und universelle Amplifizierungsprimer auf der Grundlage der Endinformationen der verschiedenen Targets entwickelt. Diese Technologie erfordert jedoch nicht nur eine Ligationsreaktion, um die Reaktion zu starten, sondern wird auch durch die Spezifität der Ligase, die Schwierigkeiten bei der Herstellung von Ligationsprimern, die Anzahl und Konzentration der Primer usw. beeinträchtigt. PCT/US2002/037238 wendet einen Amplifizierungsmodus an, der auf langen Primern basiert. Obwohl die 5'-Ende-Information im Prinzip nachgewiesen werden kann, erfordert diese Lösung jedoch einen Enzym- oder chemischen Spaltungsschritt und einen komplizierten Preamplifizierungs- und Reinigungsprozess nach dem ersten Amplifizierungsschritt, was nicht nur die Empfindlichkeit der Reaktion verringert, sondern auch die Komplexität des Betriebs erhöht. Das PCT-Patent WO 96/41012 offenbart eine Nachweisstrategie mit zwei Amplifizierungsrunden. Diese Lösung kann jedoch nicht nur die 5'-EndInformationen mehrerer spezifischer Zielsequenzen nicht erkennen, sondern hat auch das Problem einer großen Anzahl von Primern und der Konkurrenz bei der Amplifizierung.
Bei der auf einem mikrofluidischen Chip basierenden MPCR werden verschiedene Primerpaare in Mikroporen des Chips vorgeladen, wodurch jede Amplifizierung auf einen eigenen, unabhängigen Raum beschränkt wird. Aufgrund der einzigartigen Amplifizierungsmethode werden proprietäre Nachweisinstrumente verwendet. Die technische Komplexität dieser Technologie erschwert ihre Umsetzung.
MPCR auf der Grundlage eines Festphasenträgers umfasst hauptsächlich Mehrfachnachweistechnologien auf der Grundlage eines „Flüssigchips“. Der Flüssigchip verwendet kodierte Mikrokugeln als Vorlage für einen Multiplex-Nachweis. Obwohl der Flüssigchip die Eigenschaften des Multi-Flusses und der hohen Effizienz bei der Detektion aufweist, löst er nicht das Problem der Fehlanpassung zwischen zahlreichen Primern und Vorlagen bei der Multiplex-Amplifizierung, da er eine Multiplex-Amplifizierung in der Flüssigphase durchführen muss, bevor kodierte Mikrosphären für die Hybridisierungsidentifizierung verwendet werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MPCR ein breites Anwendungsspektrum hat, dass aber die derzeitige Technologie mit den Problemen einer geringeren Amplifizierungseffizienz, einer uneinheitlichen Amplifizierungseffizienz bei verschiedenen Vorlagen und komplizierten Arbeitsschritten konfrontiert ist. Daher ist es dringend notwendig, eine einfache, bequeme und hocheffiziente Technologie für eine einzige Reaktion und eine gleichwertige Multiplex-Nukleinsäure-Amplifizierung zu entwickeln.
ZUSAMMENFASSUNG
Um die Mängel der traditionellen MPCR-Technologie zu überwinden, wie z.B. reduzierte Amplifizierungseffizienz, uneinheitliche Amplifizierungseffizienz zwischen Vorlagen (synonym „Templates“), komplizierte Arbeitsschritte und ähnliches, bietet die vorliegende Anwendung eine neuartige Methode der Multiplex-Amplifizierung. Das Verfahren umfasst die folgenden zwei Schritte: Schritt 1: Ein Fänger-Oligonukleotid bindet an ein Zielmolekül, und es wird eine spezifische lineare Amplifizierung eingeleitet, um eine Zwischensequenz zu erhalten, die durch einen universellen Primer für exponentielle Amplifizierung eingeleitet werden kann. In Schritt 2 wird die Multiplex-Zwischensequenz, die durch die lineare Amplifizierung des Zielmoleküls in Schritt 1 erhalten wurde, einer exponentiellen Multiplex-Amplifizierung unterzogen, die durch einen Universalprimer initiiert wird. Aufgrund des speziellen molekularen Sequenzdesigns kann das in der vorliegenden Anwendung bereitgestellte Fänger-Oligonukleotid nicht nur die spezifische lineare Amplifizierung des Zielmoleküls gewährleisten, sondern auch sicherstellen, dass das lineare Amplifizierungsprodukt selbstgefaltet und selbstausgedehnt werden kann, um eine universelle Sequenz zu bilden, die durch den universellen Primer für die exponentielle Amplifizierung und eine spezifische Sequenz, die den Multiplex-Zielmolekülen entspricht, initiiert werden kann. Der lineare Amplifizierungsprozess wird mit einer geringen Konzentration (1/20-1/40 der Konzentration eines üblichen Multiplex-PCR-Primers) eines einzigen spezifischen Fänger-Oligonukleotids eingeleitet. Dadurch wird nicht nur die Spezifität der Amplifizierung gewährleistet, sondern auch die Konzentration und die Anzahl der in der MPCR-Reaktion benötigten Primer effektiv reduziert und eine gegenseitige Beeinflussung der Primer vermieden. Die Multiplex-Amplifizierung, die durch einen universellen Primer eingeleitet wird, verbessert nicht nur die Amplifizierungseffizienz erheblich und gewährleistet die Empfindlichkeit der Reaktion, sondern ermöglicht auch die gleichwertige Amplifizierung vieler verschiedener Zielmoleküle. Die Kombination der beiden oben genannten Schritte ermöglicht es der vorliegenden Anwendung, die Hauptprobleme der herkömmlichen MPCR-Amplifizierungstechnologie wirksam zu lösen.
Um dieses Ziel zu erreichen, werden in der vorliegenden Anwendung die nachstehenden technischen Lösungen angewandt.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Anwendung ein Fänger-Oligonukleotid für die Nukleinsäure-Amplifizierung bereit, wobei das Fänger-Oligonukleotid eine erste universelle Sequenz, eine Faltsequenz und eine bindende Fängersequenz in der Reihenfolge vom 5'-Ende zum 3'-Ende enthält;
wobei die Faltsequenz zumindest teilweise mit einer 5'-Endesequenz eines Zielmoleküls übereinstimmt; und
die bindende Fängersequenz ist komplementär zu einer Nicht-5'-Endesequenz des Zielmoleküls.
In der vorliegenden Anwendung umfasst das Fänger-Oligonukleotid hauptsächlich drei Regionen: eine erste universelle Sequenz, eine Faltsequenz und eine bindende Fängersequenz. Das Fänger-Oligonukleotid fängt zunächst ein Zielmolekül mit definierten Sequenzinformationen am 5'-Ende über die bindende Fängersequenz ein. Dann wird eine Verlängerungsreaktion mit dem Zielmolekül als Vorlage durchgeführt. Ein zum Zielmolekül komplementärer Strang wird an das 3'-Ende des Fänger-Oligonukleotids angefügt, um ein verlängertes Fänger-Oligonukleotid zu erhalten. Aufgrund des Vorhandenseins der Faltsequenz und der Sequenz am verlängerten 3'-Ende, die zumindest teilweise komplementär zueinander sind, beginnt das verlängerte Fängerungsoligonukleotid eine intramolekulare Selbstfaltung und wird von der Polymerase weiter verlängert. Ein zur ersten universellen Sequenz komplementärer Strang wird am 3'-Ende hinzugefügt, um ein Produkt mit einer vollständigen Haarnadelstruktur zu erhalten. Der PCR-Amplifizierungsnachweis kann unter Verwendung eines oder mehrerer universeller Primer und/oder eines oder mehrerer zielmolekülspezifischer Primer erfolgen.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Anwendung bezieht sich „eine 5'-Endesequenz eines Zielmoleküls“ auf ein zusammenhängendes Sequenzfragment von Nukleotiden von Position 1 bis Position 4, Nukleotiden von Position 1 bis Position 5, Nukleotiden von Position 1 bis Position 6, Nukleotiden von Position 1 bis Position 7, Nukleotiden von Position 1 bis Position 8, Nukleotiden von Position 1 bis Position 9, Nukleotiden von Position 1 bis Position 10, Nukleotiden von Position 1 bis Position 11, Nukleotide von Position 1 bis Position 12, Nukleotide von Position 1 bis Position 13, Nukleotide von Position 1 bis Position 14, Nukleotide von Position 1 bis Position 15, Nukleotide von Position 1 bis Position 16, Nukleotide von Position 1 bis Position 17, Nukleotide von Position 1 bis Position 18, Nukleotide von Position 1 bis Position 19, Nukleotide von Position 1 bis Position 20, oder Nukleotide von Position 1 bis zu einer größeren Position am 5'-Ende des Zielmoleküls.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung bedeutet „die Faltsequenz ist zumindest teilweise die gleiche wie eine 5'-Endesequenz eines Zielmoleküls“, dass die Faltsequenz die gleiche oder teilweise die gleiche ist wie die 5'-Endesequenz des Zielmoleküls.
In einigen Ausführungsformen ist die Faltsequenz beispielsweise die gleiche wie die 5'-Endesequenz des Zielmoleküls. In einer solchen Ausführungsform ist in dem verlängerten Fänger-Oligonukleotid, das durch Verlängerung mit dem Zielmolekül als Vorlage erhalten wird, die Faltsequenz vollständig komplementär zu der verlängerten 3'-Endesequenz und leitet die intramolekulare Selbstfaltung ein.
In anderen Ausführungsformen ist die Faltsequenz beispielsweise teilweise die gleiche wie die 5'-Endesequenz des Zielmoleküls. In einer solchen Ausführungsform ist in dem verlängerten Fänger-Oligonukleotid, das durch Verlängerung mit dem Zielmolekül als Vorlage erhalten wird, die Faltsequenz teilweise komplementär zu der verlängerten 3'-Endesequenz und leitet die intramolekulare Selbstfaltung ein.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Anwendung bezieht sich „eine Nicht-5'-Endesequenz eines Zielmoleküls“ auf ein Sequenzfragment, das 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder mehr Nukleotide von dem ersten Nukleotid am 5'-Ende des Zielmoleküls entfernt ist.
In der vorliegenden Anwendung ist die erste universelle Sequenz eine künstlich entworfene Sequenz, die von der Sequenz des Zielmoleküls unabhängig ist. Daher müssen beim Nachweis verschiedener Zielmoleküle nur die Faltsequenz und die bindende Fängersequenz des Fänger-Oligonukleotids entsprechend dem Zielmolekül gestaltet werden, während die erste universelle Sequenz unverändert bleibt.
Vorzugsweise enthält das Fänger-Oligonukleotid außerdem eine zweite universelle Sequenz.
Vorzugsweise befindet sich die zweite universelle Sequenz am 5'-Ende der bindenden Fangsequenz.
In der vorliegenden Anwendung ist die zweite universelle Sequenz zwischen der Faltsequenz und der bindenden Fängersequenz angeordnet. Nachdem das Fänger-Oligonukleotid verlängert und selbstgefaltet ist, wird ein Produkt mit einer Haarnadelstruktur erhalten, das durch PCR-Amplifizierung nachgewiesen werden kann, indem universelle Primer, die mit der ersten universellen Sequenz und der zweiten universellen Sequenz identisch oder teilweise identisch sind, als stromaufwärts gelegener Primer bzw. als stromabwärts gelegener Primer verwendet werden, so dass der Effekt der äquivalenten Amplifizierung von Multiplex-Zielmolekülen realisiert werden kann.
Vorzugsweise enthält das Fänger-Oligonukleotid außerdem eine Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle, die sich am 3'-Ende der Faltsequenz befindet, um die bindende Fängersequenz und die Faltsequenz zu blockieren.
Vorzugsweise befindet sich die Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle am 5'-Ende der zweiten universellen Sequenz, um die zweite universelle Sequenz und die Faltsequenz zu blockieren.
In der vorliegenden Anwendung ist die Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle am 3'-Ende der Faltsequenz angeordnet, oder weiter bevorzugt zwischen der zweiten universellen Sequenz und der Faltsequenz. Die Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle beeinträchtigt nicht nur nicht die Selbstfaltung des verlängerten Fänger-Oligonukleotids, sondern ermöglicht auch die anschließende Selbsterweiterung, indem sie selbst als Vorlage verwendet und einen zur ersten universellen Sequenz komplementären Strang am 3'-Ende hinzufügt, der nicht zum Zielmolekül gehört, wodurch ein Produkt mit einer vollständigen Haarnadelstruktur entsteht. Das Produkt mit einer vollständigen Haarnadelstruktur kann als Vorlage für eine exponentielle PCR-Amplifizierung mit einem oder mehreren universellen Primern und/oder einem oder mehreren zielmolekülspezifischen Primern dienen, wodurch die Spezifität und Genauigkeit der Amplifizierung wirksam gewährleistet wird.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle mit einer Substanz modifiziert, die die Verlängerung der DNA (Desoxyribonukleinsäure)-Polymerase blockieren kann. Die Substanz kann die Verlängerung an der Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle beenden, wenn das Produkt mit einer vollständigen Haarnadelstruktur einer PCR-Amplifizierung mit einem universellen Primer und/oder einem zielmolekülspezifischen Primer unterzogen wird, wodurch eine linearisierte Amplifizierungsvorlage für eine anschließende exponentielle Amplifizierung erzeugt und die Effizienz der Amplifizierung verbessert wird.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Substanz, die die Verlängerung der DNA-Polymerase blockieren kann, um eine oder eine Kombination von mindestens zwei der folgenden Substanzen: Abstandhalter (synonym „Spacer“), eine Thiogruppe oder eine Uracil-Base.
Vorzugsweise ist die Faltsequenz mit einem Nukleinsäureanalogon modifiziert.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Anwendung bezieht sich der Abstandshalter auf Polyethylenglykol, vorzugsweise Polyethylenglykol 18.
Es ist erwähnenswert, dass aufgrund der Einschränkungen der bestehenden Oligonukleotid-Synthesetechnologie während der Synthese der Fänger-Oligonukleotide Nebenprodukte mit unvollständigen Sequenzfragmenten entstehen können. Da die Sequenz der Faltungsregion des Fänger-Oligonukleotids jedoch von dem Zielmolekül abgeleitet ist, kann das Vorhandensein der oben genannten Nebenprodukte eine unspezifische Amplifizierung auslösen. Daher wird in der vorliegenden Anwendung, um die Spezifität des Nachweissystems weiter zu verbessern, die Faltsequenz des Fänger-Oligonukleotids mit einem Nukleinsäureanalogon modifiziert, und die Verlängerung der synthetisierten Nebenprodukte der Fänger-Oligonukleotide wird gehemmt, während die normale komplementäre Basenpaarungsfunktion der Faltsequenz sichergestellt wird, wodurch die unspezifische Amplifizierung des ursprünglichen Genfragments oder Genoms blockiert wird, wodurch die Spezifität des Nachweissystems verbessert wird.
Vorzugsweise umfasst das Nukleinsäureanalogon Peptidnukleinsäure(n), geschlossene Nukleinsäure(n), transponierte Base(n), 2'-O,4'-C-Methylenbrücken-RNA (2'-O,4'-C-Methylenbrücken-Ribonukleinsäure), 2'-O-Methyl-RNA oder 2'-Fluor-RNA.
In der vorliegenden Anwendung ist die transponierte Base eine Art von Base mit einer entgegengesetzten Richtung zu einer normalen Base. Das 3'-Ende der transponierten Base bildet eine 3-3-Phosphodiesterbindung mit dem 3'-Ende einer stromaufwärts gelegenen Base und bildet eine 5-5-Phosphodiesterbindung mit dem 5'-Ende einer stromabwärts gelegenen Base, die die Verlängerung einer DNA-Polymerase und den Abbau einer Exonuklease während der Verlängerung hemmen kann.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Anwendung einen Kit für die Nukleinsäureamplifizierung bereit, der das im ersten Aspekt beschriebene Fänger-Oligonukleotid enthält.
Vorzugsweise enthält das Kit außerdem ein Vorbehandlungsreagenz für eine Zielnukleinsäure, das zur Herstellung eines Zielmoleküls mit einer bestimmten Sequenzinformation am 5'-Ende verwendet wird.
Vorzugsweise enthält das Vorbehandlungsreagenz eine oder eine Kombination von mindestens zwei Nuklease zur ortsspezifischen Spaltung, einen Nukleinsäure-Extensionsblocker oder einen spezifischen Primer.
Vorzugsweise hat der spezifische Primer eine modifizierte Gruppe am 5'-Ende.
Vorzugsweise enthält die modifizierte Gruppe eine Phosphatgruppe und/oder eine Thiogruppe.
Vorzugsweise enthält der Bausatz außerdem eine Universalgrundierung.
Vorzugsweise hat der universelle Primer eine Nukleinsäuresequenz, die mit der ersten universellen Sequenz oder der zweiten universellen Sequenz des Fänger-Oligonukleotids identisch oder teilweise identisch ist.
In der vorliegenden Anwendung wird bei der auf dem Universalprimer basierenden Amplifizierungsreaktion ein Zielmolekül mit definierter Sequenzinformation am 5'-Ende als Vorlage verwendet. Bei dem Zielmolekül kann es sich um ein Zielmolekül handeln, das von Natur aus definierte Sequenzinformationen am 5'-Ende aufweist, oder um ein Zielmolekül mit definierten Sequenzinformationen am 5'-Ende, das durch die Behandlung mit einem chemischen Faktor oder ein biologisches Verfahren erzeugt wird.
In der vorliegenden Anwendung umfasst der Typ der Nukleinsäuresequenz mit definierter Sequenzinformation am 5'-Ende eine normale Nukleinsäuresequenz, eine modifizierte Nukleinsäuresequenz, eine Einzelnukleotidmutation, Sequenztransposition, Sequenzdeletion, Sequenzrekombination und andere verschiedene Typen.
Zu den Zielmolekülen, die von Natur aus eine bestimmte Sequenzinformation am 5'-Ende aufweisen, gehören vorzugsweise reife microRNA, microRNA-Vorläufer, cfDNA (zellfreie DNA) usw.
Vorzugsweise kann das Zielmolekül mit definierter Sequenzinformation am 5'-Ende durch Spaltung oder Blockierung mit einem chemischen Faktor erhalten werden, einschließlich einer oder einer Kombination von mindestens zwei der folgenden Ketten: eine kurze Oligonukleotidkette, die komplementär zur Zielsequenz ist und mit einer oder mehreren Polypeptidnukleinsäuren (PNA) modifiziert ist, einer kurzen Oligonukleotidkette, die zur Zielsequenz komplementär und mit einer oder mehreren blockierten Nukleinsäuren (LNA) modifiziert ist, einer kurzen Oligonukleotidkette, die zur Zielsequenz komplementär und mit Methoxyl modifiziert ist eine kurze Oligonukleotidkette, die zur Zielsequenz komplementär und mit RNA modifiziert ist, eine kurze Oligonukleotidkette, die zur Zielsequenz komplementär und mit 2-Fluor modifiziert ist, eine kurze Oligonukleotidkette, die zur Zielsequenz komplementär und mit einer reversen Base modifiziert ist, ein kurzes Oligonukleotid, das zur Zielsequenz komplementär und mit einer Phosphatgruppe modifiziert ist, oder ein kurzes Oligonukleotid, das zur Zielsequenz komplementär und mit einer Thiogruppe modifiziert ist, usw.
Vorzugsweise kann das molekulare Zielzwischenprodukt mit definierter Sequenzinformation am 5'-Ende durch Spaltung oder Blockierung mit einer biologischen Methode erhalten werden, einschließlich einer oder einer Kombination von mindestens zwei der folgenden: AP-Nukleinsäure-Exonuklease, AP-Lyase, Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) einer Nukleinsäure-Restriktionsendonuklease, einer methylierungsabhängigen Nukleinsäure-Restriktionsendonuklease, einer methylierungssensitiven Nukleinsäure-Restriktionsendonuklease, einem Nicking-Enzym, einer Riesennuklease, einer Zinkfingernuklease (ZFN), einer Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornuklease (TALEN) oder CRISPR-Cas, usw.
In der vorliegenden Anwendung kann die Amplifizierungsreaktion nur unter gemeinsamer Beteiligung des Fänger-Oligonukleotids, des Universalprimers und/oder des spezifischen Primers erfolgen, was im Folgenden kurz beschrieben wird. In einem Amplifizierungssystem mit dualen universellen Primern weist der verwendete universelle Primer eine Nukleinsäuresequenz auf, die mit der ersten universellen Sequenz oder der zweiten universellen Sequenz des Fänger-Oligonukleotids identisch oder teilweise identisch ist. Wenn es kein Zielmolekül mit der definierten 5'-Endsequenz gibt, kann die PCR-Amplifizierungsreaktion nicht gestartet werden. Wenn das Zielmolekül mit der definierten 5'-Endsequenz im System vorhanden ist, wird eine Verlängerungsreaktion durch das Fängerungsoligonukleotid eingeleitet, um ein Zwischenprodukt mit einer Haarnadelstruktur zu bilden, das als Vorlage für eine Amplifizierungsreaktion des Universalprimers dient. Gleichzeitig kann sich das verlängerte Fänger-Oligonukleotid nur dann selbst falten und eine Haarnadelstruktur bilden, wenn die durch die Verlängerungsreaktion erzeugte verlängerte Sequenz ein komplementäres Paar mit der Faltsequenz ist, wodurch die Spezifität der Reaktion wirksam gewährleistet wird. Die verlängerte Sequenz und die Faltsequenz können vollständig komplementär oder teilweise komplementär sein.
Vorzugsweise enthält das Kit außerdem einen speziellen Primer.
In der vorliegenden Anwendung werden, wenn das Fänger-Oligonukleotid nur die erste universelle Sequenz, die Faltsequenz und die bindende Fängersequenz, aber keine zweite universelle Sequenz enthält, d. h. in einem einzigen universellen Primer-Amplifizierungssystem, ein universeller Primer und ein zielmolekülspezifischer Primer als stromaufwärts gelegener Primer bzw. als stromabwärts gelegener Primer der PCR verwendet, was die Spezifität und Empfindlichkeit der Reaktion weiter verbessert. Bei der Methode der vorliegenden Anwendung sind die Ct-Werte, die durch den Nachweis von Zielmolekülen mit derselben Konzentration, aber unterschiedlichen Sequenzen erhalten werden, im Wesentlichen gleich, was beweist, dass die Methode die gleiche Amplifizierungsleistung für unterschiedliche Zielmoleküle gewährleisten kann.
Vorzugsweise enthält das Kit außerdem eine Nachweissonde.
Vorzugsweise ist die Nachweissonde mit einer Fluoreszenzgruppe und/oder einer Quenching-Gruppe markiert.
In der vorliegenden Anwendung wird die Nachweissonde, die mit einer fluoreszierenden Gruppe und/oder einer Quenching-Gruppe markiert ist, zur Hybridisierung und Komplementierung eines Amplifizierungsprodukts verwendet, was für die Realisierung eines quantitativen Echtzeit-Nachweises des Amplifizierungsprodukts von Vorteil ist.
Vorzugsweise ist die fluoreszierende Gruppe am 5'-Ende der Nachweissonde markiert.
Vorzugsweise ist die Quenching-Gruppe am 3'-Ende der Nachweissonde markiert.
Vorzugsweise umfasst die fluoreszierende Gruppe eine der folgenden Gruppen: FAM™ (Carboxyfluorescein), VIC™ (grün fluoreszierendes Protein), JOE™ (2,7-Dimethyl-4,5-dichlor-6-6-carboxyfluorescein), TET™ (Tetrachlor-6-carboxyfluorescein), CY™3 (Maleimid 3), CY™5 (Maleimid 5), ROX™ (X-Rhodaminmaleimid), Texas Red™ (Sulforhodamin 101 Säurechlorid) oder LC RED460™.
Vorzugsweise umfasst die Quenchinggruppe eine der Gruppen BHQ1™ (Black Hole Quencher 1), BHQ2™, BHQ3™, Dabcy1 oder Tamra (Carboxyl-Tetramethylrhodamin).
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Anwendung ein Verfahren zum Nukleinsäurenachweis bereit, das die Bindung eines Zielmoleküls an ein Fänger-Oligonukleotid und den Start einer spezifischen linearen Amplifizierung sowie die Durchführung eines Nukleinsäure-Amplifizierungsnachweises auf der Grundlage eines Universalprimers umfasst.
Die Bindung eines Zielmoleküls an ein Fänger-Oligonukleotid und der Beginn der spezifischen linearen Amplifizierung erfolgen vorzugsweise in folgenden Schritten:

(1) Ermöglichen der Bindung eines Zielmoleküls mit einer definierten 5'-Endsequenz an die bindende Fängersequenz eines Fänger-Oligonukleotids;
(2) Unterziehen des Fänger-Oligonukleotids einer Verlängerungsreaktion mit dem Zielmolekül als Vorlage und Hinzufügen von Nukleotiden, die komplementär zu dem Zielmolekül sind, an das 3'-Ende des Fänger-Oligonukleotids, um ein verlängertes Fänger-Oligonukleotid zu bilden;
(3) Ermöglichen der Bindung der verlängerten Sequenz des verlängerten Fänger-Oligonukleotids an die intramolekulare Faltsequenz, um ein Produkt mit einer Semi-Haarnadelstruktur zu bilden; und
(4) Unterziehen des Produkts mit einer Semi-Haarnadelstruktur einer Verlängerungsreaktion und Hinzufügen von Nukleotiden, die komplementär zu der intramolekularen ersten universellen Sequenz am 3'-Ende sind, um ein Produkt mit einer vollständigen Haarnadelstruktur zu bilden.

Vorzugsweise sind die Schritte zur Durchführung des Nukleinsäure-Amplifizierungsnachweises auf der Grundlage eines Universalprimers wie folgt:

Durchführung einer exponentiellen Amplifizierung unter Verwendung des Produkts mit einer vollständigen Haarnadelstruktur als Vorlage und unter Verwendung eines Universalprimers und/oder eines spezifischen Primers, um ein Amplifizierungsprodukt zu erhalten.

Vorzugsweise hat der universelle Primer eine Nukleinsäuresequenz, die mit der ersten universellen Sequenz oder der zweiten universellen Sequenz des Fänger-Oligonukleotids identisch oder teilweise identisch ist.
Vorzugsweise umfasst die exponentielle Amplifizierung eine Polymerase-Kettenreaktion, bei der es sich beispielsweise um eine gewöhnliche PCR, qPCR oder digitale PCR handeln kann.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner einen Schritt der Bindung des Amplifizierungsprodukts an die Nachweissonde und den Nachweis.
Die vorliegende Anmeldung stellt ferner ein Verfahren zur NukleinsäureAmplifizierung bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

(1) Inkontaktbringen eines Zielmoleküls mit einer definierten 5'-Endsequenz mit dem in der Anwendung bereitgestellten Fänger-Oligonukleotid, wodurch die bindende Fängersequenz des Fänger-Oligonukleotids an das Zielmolekül bindet;
(2) Unterziehen des Fänger-Oligonukleotids einer Verlängerungsreaktion mit dem Zielmolekül als Vorlage, wodurch zu dem Zielmolekül komplementäre Nukleotide an das 3'-Ende des Fänger-Oligonukleotids angefügt werden, um ein verlängertes Fänger-Oligonukleotid zu bilden;
(3) Inkubieren des verlängerten Fänger-Oligonukleotids unter einer Bedingung, die eine intramolekulare Selbstfaltung erlaubt, wodurch ein Produkt mit einer Semi-Haarnadelstruktur durch komplementäre Basenpaarung zwischen der verlängerten Sequenz und der Faltsequenz des verlängerten Fänger-Oligonukleotids gebildet wird; und
(4) Unterziehen des Produkts mit einer Semi-Haarnadelstruktur einer Verlängerungsreaktion, wodurch zur ersten universellen Sequenz komplementäre Nukleotide am 3'-Ende hinzugefügt werden, um ein Produkt mit einer vollständigen Haarnadelstruktur zu bilden.

In einigen spezifischen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner: Durchführen einer exponentiellen Amplifizierung unter Verwendung des Produkts mit einer vollständigen Haarnadelstruktur als Vorlage und unter Verwendung eines universellen Primers (von universellen Primern) und/oder eines spezifischen Primers (von spezifischen Primern), um ein Amplifizierungsprodukt zu erhalten. In einigen spezifischeren Ausführungsformen haben die universellen Primer eine Nukleinsäuresequenz, die mit der ersten universellen Sequenz oder der zweiten universellen Sequenz des Fänger-Oligonukleotids identisch oder teilweise identisch ist.
Verglichen mit dem Stand der Technik hat die vorliegende Anwendung die folgenden vorteilhaften Auswirkungen.

(1) Das Kit für den Nukleinsäurenachweis der vorliegenden Anwendung benötigt keine zusätzlichen Schritte wie Ligationsreaktion und chemische Behandlung der Amplifizierungsprodukte und kann eine hohe Spezifität und hohe Empfindlichkeit des Multiplexnachweises von Nukleinsäuren realisieren, solange das Zielmolekül definierte Sequenzinformationen am 5'-Ende aufweist.
(2) In dem Kit für den Nukleinsäurenachweis der vorliegenden Anwendung sind das Fänger-Oligonukleotid und der universelle Primer speziell entworfen und kooperieren miteinander, und in Gegenwart des Zielmoleküls initiiert das Zielmolekül eine Verlängerungsreaktion, die durch das Fänger-Oligonukleotid initiiert wird, um ein Produkt mit einer Haarnadelstruktur zu bilden, das als Vorlage für die Amplifizierungsreaktion des universellen Primers und/oder des spezifischen Primers verwendet wird, so dass das falsch-positive Problem effektiv vermieden wird.
(3) Bei der vorliegenden Anwendung kann das Fänger-Oligonukleotid nur dann zur Selbstfaltung und zur Bildung einer Haarnadelstruktur veranlasst werden, wenn die verlängerte 3'-Endsequenz des Fänger-Oligonukleotids komplementär zur Faltsequenz ist, wodurch die Spezifität der Reaktion wirksam gewährleistet wird.
(4) Beim Nachweis verschiedener Zielmoleküle muss das Kit für den Nukleinsäurenachweis der vorliegenden Anwendung nur die Faltsequenz und die bindende Fängersequenz des Fänger-Oligonukleotids entsprechend dem Zielmolekül entwerfen, während die erste universelle Sequenz unverändert bleibt, wodurch die Interferenz zwischen den Multiplex-Primern für die Amplifizierung mehrerer Ziele stark reduziert und die Amplifizierungsempfindlichkeit verbessert wird.
(5) Das Kit für den Nukleinsäurenachweis der vorliegenden Anwendung erreicht den Zweck der Signalvervielfachung durch den exponentiellen Amplifizierungsprozess. Er kann die Anforderungen an die Empfindlichkeit beim DNA/RNA-Nachweis gut erfüllen. Darüber hinaus wird die exponentielle Amplifizierung nur mit dem erweiterten Fänger-Oligonukleotid und universellen Primern durchgeführt. Damit wird der Zweck einer gleichwertigen Amplifizierung von Multiplex-Zielmolekülen unter der Voraussetzung erreicht, dass die Anzahl und Konzentration der Universalprimer unverändert bleibt. Auf diese Weise wird die durch Sequenzunterschiede verursachte Abweichung der Amplifizierungseffizienz vermieden.
(6) Das Nukleinsäurenachweis-Kit der vorliegenden Anmeldung ist einfach zu bedienen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 (A) zeigt ein schematisches Diagramm der Amplifizierung mit zwei Universalprimern, und 1 (B) zeigt ein schematisches Diagramm der Amplifizierung mit einem einzelnen Universalprimer;
2 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion eines Zielmoleküls mit einer definierten 5'-Endsequenz;
3 zeigt die Ergebnisse des qPCR-Nachweises von miRNA27a und let-7a;
4 zeigt die Ergebnisse des Agarosegel-Nachweises von multiplexen menschlichen Genen;
5 zeigt die Ergebnisse des Nachweises von Rifampicin 526-Resistenzmutationen in Mycobacterium tuberculosis;
6 zeigt die Ergebnisse des qPCR-Nachweises des Septin-9-Gens;
7 zeigt die Ergebnisse des ddPCR-Nachweises des Septin 9-Gens;
8(A) zeigt die Ergebnisse des Empfindlichkeitsnachweises des Septin-9-Gens in methylierten Proben bei unterschiedlichen Konzentrationen, und 8(B) zeigt die Ergebnisse des Empfindlichkeitsnachweises des RASS-F1-Gens in methylierten Proben bei unterschiedlichen Konzentrationen;
9(A) zeigt die Ergebnisse der Nachweisspezifität eines gewöhnlichen Fänger-Oligonukleotids, und 9(B) zeigt die Ergebnisse der Nachweisspezifität eines LNA-modifizierten Fänger-Oligonukleotids; und
10 zeigt die Ergebnisse des qPCR-Nachweises des RASS-F1-Gens.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Zur weiteren Veranschaulichung der in der vorliegenden Anwendung angewandten technischen Methoden und der technischen Auswirkungen wird die vorliegende Anwendung anhand von Ausführungsbeispielen und Zeichnungen näher erläutert. Es versteht sich von selbst, dass die detaillierte Beschreibung hier nur dazu dient, die vorliegende Anwendung zu erläutern, aber nicht dazu, die vorliegende Anwendung einzuschränken.
Ausführungsformen, bei denen keine spezifischen Techniken oder Bedingungen angegeben sind, werden unter Bezugnahme auf die in der anerkannten Fachliteratur oder in der Produktspezifikation beschriebenen Techniken oder Bedingungen ausgeführt. Bei den verwendeten Reagenzien oder Instrumenten, die ohne Angabe des Herstellers verwendet werden, handelt es sich um herkömmliche Produkte, die über die üblichen Kanäle erworben werden können.
Beispiel 1 Grundprinzip der Amplifizierung in der vorliegenden Anwendung
Die vorliegende Anwendung umfasst zwei Ausführungsformen: eine Ausführungsform mit zwei Universal-Primern und eine Ausführungsform mit einem Universal-Primer. Die Mechanismen sind in 1(A) und 1(B) dargestellt.
Bei der Amplifizierung mit dualen Universalprimern umfasst das Fänger-Oligonukleotid vier Regionen: eine erste Universalsequenz U1s, eine Faltsequenz T1s, eine zweite Universalsequenz U2s und eine bindende Fängersequenz T2a. Das Fänger-Oligonukleotid fängt zunächst ein Zielmolekül, das eine bestimmte 5'-Endsequenz aufweist, über die bindende Fängersequenz T2a ein. Dann wird das Fänger-Oligonukleotid einer Verlängerungsreaktion unter Verwendung des Zielmoleküls als Vorlage unterzogen, und ein zur Faltsequenz T1s komplementärer Strang T1a wird am 3'-Ende hinzugefügt, um ein verlängertes Fänger-Oligonukleotid zu erhalten. T1a und T1s sind entweder vollständig oder teilweise komplementär zueinander, solange T1a und T1s eine intramolekulare Selbstfaltung einleiten und ein Produkt mit einer Semi-Haarnadelstruktur bilden können. Das Produkt mit einer Semi-Haarnadelstruktur wird unter den Polymerasen weiter verlängert und ein zur ersten universellen Sequenz U1s komplementärer Strang U1a wird am 3'-Ende hinzugefügt, um ein Produkt mit einer Haarnadelstruktur zu erhalten. Das Produkt wird durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung universeller Primer nachgewiesen, die mit der ersten universellen Sequenz U1s bzw. der zweiten universellen Sequenz U2s identisch oder teilweise identisch sind. Konkret bindet ein universeller Primer U1s (hier wird U1s der Einfachheit halber verwendet, die tatsächliche Sequenz muss nicht genau mit U1s übereinstimmen) an die U1a-Region des Produkts, das in der Temperungs-Phase (Synonym: „Annealing-Phase“) eine Haarnadelstruktur aufweist, und verlängert sich dann. Wenn sich zwischen der zweiten universellen Sequenz und der Faltsequenz des Produkts mit Haarnadelstruktur eine Blockierungsstelle für die Nukleinsäureverlängerung befindet, stoppt die Verlängerung an der Blockierungsstelle für die Nukleinsäureverlängerung, um eine partielle doppelsträngige Struktur zu bilden. Das durch die Verlängerung des Universalprimers U1s gebildete Produkt ist genau die PCR-Vorlage für die Universalprimer U1s und U2s und kann für den anschließenden PCR-Amplifizierungsnachweis verwendet werden. Wenn es keine Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle zwischen der zweiten universellen Sequenz und der Faltsequenz des Produkts mit einer Haarnadelstruktur gibt, verlängert sich der universelle Primer U1s, um eine vollständige doppelsträngige Struktur zu bilden, und ein Teilbereich der neu erzeugten doppelsträngigen Struktur ist die PCR-Vorlage für die universellen Primer U1s und U2s und kann durch nachfolgende PCR-Amplifizierung nachgewiesen werden.
Bei der Amplifizierung mit einem einzigen universellen Primer umfasst das Fänger-Oligonukleotid hauptsächlich drei Regionen: eine erste universelle Sequenz U1s, eine Faltsequenz T1s und eine bindende Fängersequenz T3a. Das Fänger-Oligonukleotid fängt zunächst ein Zielmolekül mit einer bestimmten 5'-Endsequenz über die bindende Fängersequenz T3a ein. Dann wird das Fänger-Oligonukleotid einer Verlängerungsreaktion unter Verwendung des Zielmoleküls als Vorlage unterzogen, und ein zur Faltsequenz T1s komplementärer Strang T1a wird am 3'-Ende hinzugefügt, um ein verlängertes Fänger-Oligonukleotid zu erhalten. T1a und T1s sind entweder vollständig oder teilweise komplementär zueinander, solange T1a und T1s eine intramolekulare Selbstfaltung einleiten und ein Produkt mit einer Semi-Haarnadelstruktur bilden können. Das Produkt mit einer Semi-Haarnadelstruktur wird unter den Polymerasen weiter verlängert, und ein zur ersten universellen Sequenz U1s komplementärer Strang U1a wird am 3'-Ende hinzugefügt, um ein Zwischenprodukt mit einer Haarnadelstruktur zu erhalten. Das Zwischenprodukt wird durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines universellen Primers, der mit der ersten universellen Sequenz U1s identisch oder teilweise identisch ist, und eines für das Zielmolekül spezifischen Primers nachgewiesen. Konkret bindet ein universeller Primer U1s (hier wird der Einfachheit halber U1s verwendet, aber die tatsächliche Sequenz muss nicht genau mit U1s übereinstimmen) an die U1a-Region des Produkts, das in der Annealing-Phase eine Haarnadelstruktur aufweist, und verlängert sich dann. Wenn sich zwischen der bindenden Fangsequenz und der Faltsequenz des Produkts mit Haarnadelstruktur eine Nukleinsäure-Verlängerungsblockierungsstelle befindet, stoppt die Verlängerung an der Nukleinsäure-Verlängerungsblockierungsstelle, um eine partielle doppelsträngige Struktur zu bilden. Das durch die Verlängerung des universellen Primers U1s gebildete Produkt ist genau die PCR-Vorlage für den universellen Primer U1s und den spezifischen Primer T2a und kann durch anschließende PCR-Amplifizierung nachgewiesen werden. Wenn es keine Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle zwischen der zweiten universellen Sequenz und der Faltsequenz des Produkts mit einer Haarnadelstruktur gibt, verlängert sich der universelle Primer U1s, um eine vollständige doppelsträngige Struktur zu bilden, und ein Teilbereich der neu erzeugten doppelsträngigen Struktur ist die PCR-Vorlage für den universellen Primer U1s und den spezifischen Primer T2a und kann durch nachfolgende PCR-Amplifizierung nachgewiesen werden.
Beispiel 2 Herstellung eines Produkts mit einer definierten 5'-Endsequenz
Bei dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung ist eine Probe mit einer definierten 5'-Endsequenz erforderlich, um die durch das Fänger-Oligonukleotid vermittelte Verlängerungsreaktion zu initiieren Eine Strategie zur Herstellung eines Produkts mit einer definierten 5'-Endsequenz ist in 2 gezeigt: (1) zum Beispiel wird die Verlängerung der DNA-Polymerase mit einem Nukleinsäure-Verlängerungsblocker blockiert, der für das Zielmolekül entwickelt wurde, um ein Produkt mit einer definierten 5'-Endesequenz zu erhalten; (2) spezifische Enzymschnittstellen im Zielmolekül werden mit verschiedenen Schneideenzymen verdaut, um ein Produkt mit einer definierten 5'-Endesequenz zu erhalten; (3) oder es wird eine spezifische Amplifizierung unter Verwendung einer niedrigen Konzentration eines spezifischen Primers durchgeführt, der für das Zielmolekül entwickelt wurde, um ein Produkt mit einer definierten 5'-Endesequenz zu erhalten.
Beispiel 3 qPCR-Nachweis von miRNA 27a und let-7a
MicroRNA (miRNA) ist eine endogene, nicht kodierende, einzelsträngige, kleine molekulare RNA mit einer Länge von 19-25 Nukleotiden, die in eukaryontischen Zellen allgegenwärtig ist und die Aktivität von mehr als 50 % der kodierenden Gene steuert.
In diesem Beispiel wurden miRNA27a und let-7a nachgewiesen, und die Schritte sind wie folgt.

(1) MiRNA27a- und let-7a-Sequenzen wurden künstlich synthetisiert.
(2) Fänger-Oligonukleotide, Universalprimer und Nachweissonden des miRNA27a-Gens und des let-7a-Gens wurden gleichzeitig in ein Reaktionssystem gegeben, das die miRNA27a-Sequenz und die let-7a-Sequenz enthielt. miRNA27a und let-7a wurden durch PCR nachgewiesen. Das PCR-Amplifizierungssystem bestand aus: RNA-Vorlage, 5 nM Fänger-Oligonukleotide, 150 nM eines ersten Universalprimers, 150 nM eines zweiten Universalprimers, 150 nM Nachweissonden, 1 U einer reversen Transkriptase, 1 U Taq-Polymerase, 200 µM) dNTP, 4,5 mM MgCl₂ und 2×PCR-Puffer mit einem Endvolumen von 20 µL. Das PCR-Reaktionsverfahren war 42°C für 1 Stunde, Inaktivierung und Vordenaturierung bei 94°C für 15 Minuten; 10 Zyklen von 94°C für 10 s und 66°C für 90 s; und 40 Zyklen von 94°C für 10 s und 65°C für 20 s. Die Echtzeit-PCR wurde auf einem ROCHE-Gerät (480) durchgeführt, und die entsprechenden Fluoreszenzwerte wurden gesammelt.

Die Kombination aus dem universellen Primer, dem Fänger-Oligonukleotid und der Nachweissonde ist enthalten:

erster universeller Primer (SEQ ID NO: 1)
5-GCGATCCGCACCGTCAATTCG;
zweiter universeller Primer (SEQ ID NO: 2)
5-GAGGTCCGATCCATCCAGACC;
für let-7a verwendetes Fänger-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 3)
5-CCGCACCGTCAATTCGTGAGGTAGTAGG-Spacer-CCGATCCATCCAGACCTTTAACTATACAAC;
let-7a-Nachweissonde (SEQ ID NO: 4)
5-FAM-TGAGGTAGTAGGT-MGB;
Fänger-Oligonukleotid für miRNA27a (SEQ ID NO: 5)
5-CCGCACCGTCAATTCGTTCACAGTGGC-Spacer-CCGATCCATCCAGACCTTTGCGGAACTTAG;
miRNA27a-Nachweissonde (SEQ ID NO: 6)
5-ROX-GTTCACAGTGGC-MGB.

Die Nachweisergebnisse sind in 3 dargestellt. Die miRNA27a-Kurve ist die Amplifizierungskurve von miRNA27a, und die let-7a-Kurve ist die Amplifizierungskurve von let-7a. Daraus folgt, dass gemäß der vorliegenden Anwendung miRNA 27a und let-7a gleichzeitig mit universellen Primern nachgewiesen werden können und die Ct-Werte gleich sind, d. h. die äquivalente Amplifizierung der beiden miRNAs ist realisiert.
Beispiel 4 Multiplex-Nachweis eines menschlichen Gens
In diesem Beispiel wurde menschliche Gen-DNA nachgewiesen, und die Schritte sind wie folgt.

(1) Genomische DNA der Hela-Zelllinie wurde extrahiert, durch Gradienten verdünnt und als Vorlage verwendet.
(2) Das Genom wurde einer Enzymverdauungsreaktion mit einer Restriktionsendonuklease Alul unterzogen. Das Reaktionssystem bestand aus 2 µl 10× Enzymverdauungspuffer und verschiedenen Konzentrationen genomischer DNA mit insgesamt 20 µl. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach der Enzymverdauungsreaktion wurde das System auf 85°C erhitzt und 10 Minuten lang inkubiert, um Alul thermisch zu inaktivieren.
(3) Das Fänger-Oligonukleotid für jedes Gen und die universellen Primer wurden jeweils in das Enzymverdauungssystem gegeben. Die PCR-Amplifizierung wurde durchgeführt. Das PCR-Amplifizierungssystem umfasste:
- eine enzymverdaute DNA-Vorlage, 5 nM Fänger-Oligonukleotide, 150 nM eines ersten Universalprimers, 150 nM eines zweiten Universalprimers, 1 U Taq-Polymerase, 200 µM) dNTP, 4,5 mM MgCl₂ und 2×PCR-Puffer mit einem Endvolumen von 20 µL. Das PCR-Reaktionsverfahren war: Vordenaturierung bei 94°C für 5 min; 10 Zyklen von 94°C für 10 s und 66°C für 90 s; und 40 Zyklen von 94°C für 10 s und 65°C für 20 s. Die Echtzeit-PCR wurde auf einem ROCHE-Gerät (480) durchgeführt, und die PCR-Produkte wurden einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen.

Die Kombination aus dem Fänger-Oligonukleotid und dem Universalprimer umfasst:

erster universeller Primer (SEQ ID NO: 7)
5-ACTGGACGAGCTGATTTACG;
zweiter universeller Primer (SEQ ID NO: 8)
5-CGCAATCAGGCAATACCATAGC;
Fänger-Oligonukleotid 1 (SEQ ID NO: 9), verwendet für IL4 (Vorlagen-Länge: 86 bp)
5-ACTGGACGAGCTGATTTACGCTGCTAGAGAAGTTGA-Spacer-CGCAATCAGGCAATACCATAGCGGCTGCCACTGACCACCA;
Fänger-Oligonukleotid 2 (SEQ ID NO: 10), das für GAPDH verwendet wird (Vorlagen-Länge: 104 bp)
5-ACTGGACGAGCTGATTTACGCTGCTTAGACGCTGGA-Spacer-CGCAATCAGGCAATACCATAGCGTCGCGGAGGCTGCT;
Fänger-Oligonukleotid 3 (SEQ ID NO: 11), verwendet für Homo sapiens actin alpha 1 (Vorlagen-Länge: 137 bp)
5-ACTGGACGAGCTGATTTACGCTTCCCGTTCTCAGCCTTGACGCAATCAGGCA ATACCATAGCCATTGACCTCAACTACATGG;
Fänger-Oligonukleotid 4 (SEQ ID NO: 12), verwendet für 18S ribosomal 1 (Vorlagen-Länge: 200 bp)
5-ACTGGACGAGCTGATTTACGCTCTTTCTCGATTCCGTGG-Spacer-ATCAGGCAATACCATAGCGTCCCTCTAAGAAGTTGG;
Fänger-Oligonukleotid 5 (SEQ ID NO: 13), verwendet für 18S ribosomal 2 (Vorlagen-Länge: 300 bp)
5-ACTGGACGAGCTGATTTACGCTACCCGCCCAGAAACTAGA-Spacer-CGCAATCAGGCAATACCATAGCCACCAGGCCGGAGCCATTG;

Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Spur 1 war eine 20 bp-Leiter, Spur 2 war ein Amplifizierungsprodukt des Saimiri Sciurius Interleukin 4 (IL4) Gens, Spur 3 war ein Amplifizierungsprodukt des Homo sapiens Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) Gens, Spur 4 war ein Amplifizierungsprodukt des Homo-sapiens-Aktin-alpha-1-Gens, Spur 5 war ein Amplifizierungsprodukt des 18S-Ribosomal-1-Gens, Spur 6 war ein Amplifizierungsprodukt des 18S-Ribosomal-2-Gens, und Spur 7 war ein Ergebnis der Multiplex-Amplifizierung, wobei alle Ergebnisse positiv waren.
Dies zeigt, dass die vorliegende Anwendung einen empfindlichen und spezifischen Multiplex-Nachweis verschiedener vom Menschen stammender Gene mit universellen Primern ermöglicht.
Beispiel 5 Nachweis von Rifampicin-Resistenzmutationen bei Mycobacterium tuberculosis
Der Multiplex-Nachweis von Multipositions-Resistenzmutationen wurde an Rifampicin-Resistenzmutationen in Mycobacterium tuberculosis (Mutation an Position 526 des rpoB-Gens) in Kombination mit einem Mismatch-Reparatur-Enzym und Universalprimern durchgeführt.
Die einzelnen Schritte sind wie folgt.

(1) 100 nM künstliche Sequenz, die vollständig komplementär zu einem Wildgenom ist, wurde in ein synthetisch hergestelltes Mutantenplasmid von Mycobacterium tuberculosis gegeben. Das System wurde auf 95°C erhitzt und 10 Minuten lang inkubiert. Das System wurde auf 60°C abgekühlt und die Hybridisierungsinkubation wurde für 30 Minuten durchgeführt. Die künstliche Sequenz wurde mit dem mutierten Plasmid hybridisiert, um eine Fehlpaarung zu erzeugen. Das System wurde langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um ein hybridisiertes Produkt aus der künstlichen Sequenz und dem Genom zu erhalten.
(2) Das in Schritt (1) erhaltene hybridisierte Produkt wurde einer Enzymverdauungsreaktion mit einem Mismatch-Enzym T7E1 unterzogen. Das Reaktionssystem bestand aus 2 µl 10× Enzymverdauungspuffer und verschiedenen Konzentrationen des hybridisierten Produkts, insgesamt 20 µl. Die Reaktion wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Nach der Enzymverdauungsreaktion wurde das System auf 85 °C erhitzt und 10 Minuten lang inkubiert, um das Mismatch-Enzym thermisch zu inaktivieren.
(3) Ein entsprechendes Fänger-Oligonukleotid, universelle Primer und eine Nachweissonde wurden in das System der Enzymverdauungsreaktion bzw. in das System des Wildplasmids ohne Enzymverdauungsbehandlung gegeben. Der Mutationsstatus der Position 526 wurde durch PCR nachgewiesen. Das PCR-Amplifizierungssystem umfasste: eine DNA-Vorlage für den Enzymverdau, 5 nM eines Fänger-Oligonukleotids, 150 nM eines ersten Universalprimers, 150 nM eines zweiten Universalprimers, 150 nM einer Detektionssonde, 1 U Taq-Polymerase, 200 µM dNTP, 4,5 mM MgCl₂ und 2×PCR-Puffer mit einem Endvolumen von 20 µL. Das PCR-Reaktionsverfahren bestand aus einer Vordenaturierung bei 94 °C für 5 Minuten, 10 Zyklen von 94 °C für 10 s und 66 °C für 90 s und 40 Zyklen von 94 °C für 10 s und 65 °C für 20 s. Die Echtzeit-PCR wurde auf einem ROCHE-Gerät (480) durchgeführt, und die entsprechenden Fluoreszenzwerte wurden erfasst.

Erster universeller Primer (SEQ ID NO: 8)

5-CGCAATCAGGCAATACCATAGC.
Zweiter universeller Primer (SEQ ID NO: 14)
5-GAGCGCAGGTCGTACTCG.
Fänger-Oligonukleotid für die 526-Mutation (SEQ ID NO: 15)
5-CAGGCAATACCATAGCTTGTGGGTCAACCCCGACAGAGCGCAGGTCGTACT CGTGCACCAGCCAGCTGAG.
Nachweissonde für die Mutation 526 (SEQ ID NO: 16)
5-FAM-CCAATTCATGGACCAGAACAAC-MGB.
Künstliche Sequenz (SEQ ID NO: 17)
5-GGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCG.

Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Kurve A ist eine Amplifizierungskurve des mutierten Plasmids und Kurve a ist eine Amplifizierungskurve des Wild-Plasmids.
Dies deutet darauf hin, dass die vorliegende Anwendung einen empfindlichen und spezifischen Nachweis von Rifampicin-Resistenzmutationen in Mycobacterium tuberculosis durch die Verwendung universeller Primer mit Hilfe geeigneter künstlicher Sequenzen ermöglichen kann.
Beispiel 6 qPCR-Nachweis der Methylierung des menschlichen Septin-9-Gens
Das Septin 9-Gen auf dem Chromosom 17q25.3 ist ein Mitglied der Septin-Genfamilie, die an der Regulierung zellbiologischer Prozesse wie Zytokinese und Zellzyklus beteiligt ist.
Aufgrund der Vielfalt der Zellen ist die DNA biologischer Proben, die mit der bestehenden Technologie gewonnen werden, oft eine Mischung aus nicht methylierter und methylierter DNA. Zu den DNA-Quellen in Krebsgeweben gehören zum Beispiel Krebszellen mit DNA-Methylierung und normale Zellen ohne DNA-Methylierung. Die Hauptquelle der zirkulierenden zellfreien DNA (cfDNA) im peripheren Blut sind normale weiße Blutkörperchen ohne DNA-Methylierung. Aufgrund der Apoptose und des Zerfalls von Krebszellen beträgt der DNA-Gehalt der Krebszellen im peripheren Blut jedoch in der Regel weniger als 0,1 %. Daher muss eine Methode zum Nachweis methylierter DNA des Septin-9-Gens in der Lage sein, methylierte DNA von nicht methylierter DNA zu unterscheiden und methylierte DNA in Proben spezifisch nachzuweisen.
In diesem Beispiel wurde die methylierte DNA des menschlichen Septin 9-Gens nachgewiesen, wobei folgende Schritte durchgeführt wurden

(1) Genomische DNA der Jurkat-Zelllinie und der Hela-Zelllinie wurde extrahiert und der Methylierungsstatus des Septin-9-Gens durch Sequenzierung bestimmt;
(2) Die genomische DNA der Jurkat-Zelllinie, der Hela-Zelllinie und der Negativkontrolle (NK) wurde einer Enzymverdauungsreaktion mit einer methylierungsabhängigen Restriktionsendonuklease Glal unterzogen. Das Reaktionssystem bestand aus 2 µl 10x Enzymverdauungspuffer und verschiedenen Konzentrationen genomischer DNA, insgesamt 20 µl. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Enzymverdauungsreaktion wurde das System auf 85 °C erhitzt und 10 Minuten lang inkubiert, um Glal thermisch zu inaktivieren.
(3) Ein Fänger-Oligonukleotid, ein universeller Primer und eine Nachweissonde für das Septin 9-Gen wurden jeweils in die Reaktionssysteme für den Enzymverdau gegeben. Der Methylierungsstatus des Septin 9-Gens wurde mittels PCR nachgewiesen. Das PCR-Amplifizierungssystem umfasste eine DNA-Vorlage für den Enzymverdau, 5 nM des Fänger-Oligonukleotids, 150 nM des Universalprimers, 150 nM eines spezifischen Primers, 150 nM der Nachweissonde, 1 U Taq-Polymerase, 200 µM dNTP, 4,5 mM MgCl₂ und 2×PCR-Puffer. Das PCR-Reaktionsverfahren bestand aus einer Vordenaturierung bei 94 °C für 5 Minuten; 10 Zyklen von 94 °C für 10 s und 66 °C für 90 s; und 40 Zyklen von 94 °C für 10 s und 65 °C für 20 s. Die Echtzeit-PCR wurde auf einem ROCHE-Gerät (480) durchgeführt, und die entsprechenden Fluoreszenzwerte wurden erfasst.

Die Kombination aus dem Fänger-Oligonukleotid, dem universellen Primer und der Nachweissonde umfasst:

Fänger-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 18)
5-TGTCAGCCAACGGTATTCGTTGACCGCGGGCTCGCCGCTGCCCTCCGC;
universeller Primer (SEQ ID NO: 19)
5-GCCTGTCAGCCAACGGTATTC;
spezifischer Primer (SEQ ID NO: 20)
5-CGACCCGCTGCCCACCAG;
Nachweissonde (SEQ ID NO: 21)
5-FAM-CCATCATGTCGGACCC-MGB;

Das menschliche Septin 9-Gen ist in SEQ ID NO: 22 dargestellt:

5-GCGC//GTTGACCGCGGGGTCCGACATGATGGCTGGTGGGCAGCGGGTCGC GCGGAGGGCAGCGGCGAGGAA;

Durch Sequenzierung wurde festgestellt, dass das Septin 9-Gen im Genom der Jurkat-Zelllinie unmethyliert war, während das Septin 9-Gen im Genom der Hela-Zelllinie methyliert war. Der Methylierungsstatus des Septin 9-Gens in verschiedenen Konzentrationen von methylierten und nicht-methylierten Proben wurde mittels qPCR nachgewiesen. Wie in 6 gezeigt, sind 140 Kopien und 28 Kopien die Amplifizierungskurven der methylierten Septin 9-Proben und sind 140 Kopien/Reaktion bzw. 28 Kopien/Reaktion der Proben mit methyliertem Septin 9-Gen, 16000 Kopien sind die Amplifizierungskurve der unmethylierten Probe und NC ist die Amplifizierungskurve von doppelt destilliertem Wasser (dd H₂O)
Dies zeigt, dass die vorliegende Anwendung einen empfindlichen und spezifischen Nachweis von methylierter DNA im SEPTIN 9-Gen ermöglicht.
Beispiel 7 ddPCR-Nachweis der Methylierung des Septin-9-Gens
Im Vergleich zu Beispiel 6 wurde der Nachweis der Methylierung des Septin 9-Gens auf einem Naica™ crystal digital PCR-Gerät der Firma STILLA mit einer methylierungsabhängigen Restriktionsendonuklease Glal durchgeführt, und die anderen Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 6.
Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt, die die Kopienzahl des Septin-9-Gens in verschiedenen Konzentrationen methylierter Proben zeigt. Das linke Diagramm zeigt ein Streudiagramm mit 100 Kopien/Reaktion, das rechte Diagramm ein Streudiagramm mit 10 Kopien/Reaktion. In 7 sind Streudiagramme oberhalb der gepunkteten Linie positive Tröpfchen, und Streudiagramme unterhalb der gepunkteten Linie sind negative Tröpfchen.
Dies zeigt, dass die vorliegende Anwendung den Nachweis methylierter DNA im Septin 9-Gen mit hoher Sensitivität auf einem digitalen PCR-Instrument realisieren kann.
Beispiel 8 Zweifacher Nachweis der Methylierung des menschlichen Septin-9-Gens und des RASS-F1-Gens
In diesem Beispiel wurde die Jurkat-DNA mit einer Methyltransferase behandelt und als methylierungspositiver Standard verwendet, wobei die CG-Stelle 5mCG war. Es wurde ein dualer Nachweis der Methylierung des menschlichen Septin-9-Gens und der Methylierung des RASS-F1-Gens durchgeführt. Glal wurde als methylierungsabhängige Restriktionsendonuklease verwendet. Nuklease-freies Wasser wurde als Negativkontrolle verwendet. Für das Septin-9-Gen war das Fänger-Oligonukleotid SEQ ID NO: 18, der universelle Primer war SEQ ID NO: 19, der spezifische Primer war SEQ ID NO: 20 und die Nachweissonde war SEQ ID NO: 21. Für das RASS-F1-Gen war das Fänger-Oligonukleotid SEQ ID NO: 23, der universelle Primer war SEQ ID NO: 19, der spezifische Primer war SEQ ID NO: 24 und die Nachweissonde war SEQ ID NO: 25.

Fänger-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 23)
5-TGTCAGCCAACGGTATTCGCCCAGCGGGTGCGAAGCACGGGCCCAAC.
Spezifischer Primer (SEQ ID NO: 24)
5-CCATGTCGGGGGAGCCTG.
Nachweissonde (SEQ ID NO: 21)
5-VIC-CCATCATGTCGGACCC-MGB.
Nachweissonde (SEQ ID NO: 25)
5-FAM-CTCCCGCAGCTCAATG-MGB.

8(A) zeigt die Ergebnisse des empfindlichen Nachweises des Septin-9-Gens in verschiedenen Konzentrationen methylierter Proben. Von links nach rechts sind 140 Kopien/Reaktion bzw. 28 Kopien/Reaktion dargestellt. 8(B) zeigt die Ergebnisse des empfindlichen Nachweises des Gens RASS-F1 in verschiedenen Konzentrationen methylierter Proben. 140 Kopien/Reaktion und 28 Kopien/Reaktion sind jeweils von links nach rechts dargestellt.
Dies deutet darauf hin, dass die vorliegende Anwendung einen sensitiven und spezifischen Nachweis von methylierter DNA im Septin-9-Gen und im RASS-F1-Gen gleichzeitig ermöglicht.
Beispiel 9 Optimierung der Spezifität des Nachweises von Methylierungsstellen im menschlichen Septin 9-Gen
In diesem Beispiel wurde die Jurkat-DNA mit einer Methyltransferase behandelt und als methylierungspositiver Standard für das menschliche Septin 9-Gen verwendet. Jurkat-DNA wurde als methylierungsnegativer Standard des humanen Septin 9-Gens verwendet. Nuklease-freies Wasser wurde als Negativkontrolle (nk) verwendet. Die Probe wurde mit einer methylierungsabhängigen Restriktionsendonuklease Glal verdaut. Für den Amplifizierungsnachweis wurden ein gewöhnliches Fänger-Oligonukleotid bzw. ein LNA-modifiziertes Fänger-Oligonukleotid und ein universeller Primer (SEQ ID NO: 19), ein spezifischer Primer (SEQ ID NO: 20) und eine Detektionssonde (SEQ ID NO: 21) verwendet (der FAM-Kanal wurde für das gewöhnliche Fänger-Oligonukleotid verwendet; der VIC-Kanal wurde für das LNA-modifizierte Fänger-Oligonukleotid verwendet).
Das Fänger-Oligonukleotid enthält:

gemeinsames Fänger-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 26)
5-GCCTGTCAGCCAACGGTATTCGTTGACCGCGGGCTCGCCGCTGCCCTCCG C;
Modifiziertes LNA-Fang-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 27)
5-GCCTGTCAGCCAACGGTATTCGTTGACC+G+CGCTCGCCGCTGCCCTCCGC (die Base nach dem + bedeutet, dass die Base mit einer blockierten Nukleinsäure modifiziert wurde);

Die Ergebnisse sind in 9(A) und 9(B) dargestellt. Beide Fänger-Oligonukleotide zeigten positive Ergebnisse bei 120 Kopien und 12 Kopien positiver Vorlagen. Im System des gemeinsamen Fänger-Oligonukleotids kam es jedoch bei Zugabe des unmethylierten Genoms (Jurkat-DNA) zu 100 ng zu einer unspezifischen Amplifizierung, die auf die Bindung und Verlängerung der synthetischen Nebenprodukte des Fänger-Oligonukleotids an das Zielmolekül zurückzuführen ist. Nachdem die LNA-Modifikation in die Faltsequenz des Fänger-Oligonukleotids eingeführt wurde, war die Amplifizierungseffizienz gewährleistet (120 Kopien und 12 Kopien konnten nachgewiesen werden), und die unspezifische Amplifizierung wurde bei einer hohen Konzentration (100 ng) des unmethylierten Genoms vermieden. Der Mechanismus zur Hemmung der unspezifischen Amplifizierung besteht darin, dass bei einer Modifizierung der Faltsequenz mit einem Nukleinsäureanalogon die Verlängerung des synthetischen Nebenprodukts des Primers gehemmt werden kann, während die komplementäre Basenpaarung in der Faltungsregion sichergestellt wird. Aus den Ergebnissen geht also hervor, dass die Modifikation der Faltsequenz mit einem Nukleinsäureanalogon die Spezifität des Nachweissystems verbessern kann.
Beispiel 10 Amplifizierungsergebnisse für Faltungsbereiche mit nicht exakt gleichen Sequenzen
In diesem Beispiel wurde methylierte DNA des menschlichen RASS-F1-Gens nachgewiesen, und die Schritte sind wie folgt.

(1) Die Jurkat-DNA wurde mit einer Methyltransferase behandelt, um ein vollständig methyliertes positives Genom zu erzeugen, und der Methylierungsstatus des RASS-F1-Gens wurde durch Sequenzierung ermittelt.
(2) Die methylierungspositive genomische Jurkat-DNA und eine Negativkontrolle wurden jeweils einer Enzymverdauungsreaktion mit einer methylierungsabhängigen Restriktionsendonuklease Glal unterzogen. Das Reaktionssystem bestand aus 2 µl 10×Enzymverdauungspuffer und verschiedenen Konzentrationen genomischer DNA, insgesamt 20 µl. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Enzymverdauungsreaktion wurde das System auf 85 °C erhitzt und 10 Minuten lang inkubiert, um Glal thermisch zu inaktivieren.
(3) Ein Fänger-Oligonukleotid, ein Universalprimer, ein spezifischer Rückwärtsprimer und eine Nachweissonde für das RASS-F1-Gen wurden jeweils in das System der Enzymverdauungsreaktion gegeben. Der Methylierungsstatus des RASS-F1-Gens wurde durch PCR nachgewiesen. Das PCR-Amplifizierungssystem umfasste eine DNA-Vorlage für den Enzymverdau, 5 nM des Fänger-Oligonukleotids, 150 nM des Universalprimers, 150 nM des spezifischen Primers, 150 nM der Nachweissonde, 1 U Taq-Polymerase, 200 µM dNTP, 4,5 mM MgCl₂ und 2×PCR-Puffer mit einem Gesamtvolumen von 20 µL. Das PCR-Reaktionsverfahren bestand aus einer Vordenaturierung bei 94 °C für 5 Minuten, 10 Zyklen von 94 °C für 10 s und 66 °C für 90 s und 40 Zyklen von 94 °C für 10 s und 65 °C für 20 s. Die Echtzeit-PCR wurde auf einem ROCHE-Gerät (480) durchgeführt, und die entsprechenden Fluoreszenzwerte wurden erfasst.

Die Kombination aus dem Fänger-Oligonukleotid, dem Universalprimer und der Nachweissonde ist enthalten:

Fänger-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 28)
5-GCCTGTCAGCCAACGGTATTCGCCCAG+C+GGTTTTGCCAG/Spacer 18/GCGAAGCACGGCCCAAC (die Base nach dem + bedeutet, dass die Base mit einer blockierten Nukleinsäure modifiziert ist);
universeller Primer (SEQ ID NO: 19)
5-GCCTGTCAGCCAACGGTATTC;
spezifischer Primer (SEQ ID NO: 29)
5-CCATGTCGGGGGAGCCTGAG;
Nachweissonde (SEQ ID NO: 30)
5-FAM-CTCCCGCAGCTCAATG-MGB;

Das menschliche RASS-F1-Gen ist in SEQ ID NO: 31 dargestellt:

5-GCGC//GCCCAGCGGGTGCCAGCTCCCGCAGCTCAATGAGCTCAGGCTCCC CCGACATGGCCCGGTTGGGCCCGTGCTTCGCTGG;

In diesem Beispiel ist die Faltungsregion des Fänger-Oligonukleotids nicht vollständig identisch mit der 5'-Endsequenz des Zielmoleküls. qPCR wurde durchgeführt, um den Methylierungsstatus des RASS-F1-Gens in verschiedenen Konzentrationen methylierter positiver Proben nachzuweisen. Wie in 10 dargestellt, sind die Kurven 1, 2 und 3 Amplifizierungskurven von methylierten RASS-F1-Proben, die 120 Kopien/Reaktion, 40 Kopien/Reaktion bzw. 28 Kopien/Reaktion betragen, und die negative Kontrolle ist eine Amplifizierungskurve mit ddH₂ O.
Dies zeigt, dass die Faltungsregion des Fänger-Oligonukleotids in der vorliegenden Anwendung nur teilweise mit der 5'-Endsequenz des Zielmoleküls übereinstimmen muss, um die Amplifizierung zu ermöglichen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Anwendung eine Probe mit einer definierten 5'-Endsequenz durch ein speziell entwickeltes Fänger-Oligonukleotid amplifiziert wird, um ein Produkt mit einer Haarnadelstruktur zu bilden, das als Vorlage für eine Amplifizierungsreaktion eines universellen Primers verwendet wird, wodurch der Nachweis verschiedener Zielmoleküle durch Multiplex-PCR-Amplifizierung mit universellen Primern erreicht wird, die Abweichung der Amplifizierungseffizienz, die durch unterschiedliche Sequenzen verursacht wird, vermieden wird, die eine gute Spezifität aufweist und für die Popularisierung und Anwendung geeignet ist.
Der Anmelder erklärt, dass, obwohl die Ausführungsbeispiele in der vorliegenden Anmeldung zur Veranschaulichung der detaillierten Methoden der vorliegenden Anmeldung verwendet werden, die vorliegende Anmeldung nicht auf die detaillierten Methoden beschränkt ist, was bedeutet, dass die vorliegende Anmeldung nicht unbedingt auf die detaillierten Methoden angewiesen ist, um umgesetzt zu werden. Dem Fachmann sollte klar sein, dass jede Verbesserung der vorliegenden Anmeldung, die gleichwertige Substitution jedes Rohstoffs und die Hinzufügung von Hilfskomponenten für das Produkt der vorliegenden Anmeldung oder die Auswahl spezifischer Verfahren usw. in den Schutzbereich und Offenbarungsumfang der vorliegenden Anmeldung fallen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2002037238 PCT [0003]
WO 9641012 PCT [0003]

Claims

Fänger-Oligonukleotid für die Nukleinsäure-Amplifizierung, das eine erste universelle Sequenz, eine Faltsequenz und eine bindende Fängersequenz in der Reihenfolge vom 5'-Ende zum 3'-Ende umfasst; wobei, die Faltsequenz zumindest teilweise mit einer Sequenz am 5'-Ende eines Zielmoleküls übereinstimmt; und die bindende Fängersequenz komplementär zu einer Nicht-5'-Endesequenz des Zielmoleküls ist.
Fänger-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Fänger-Oligonukleotid ferner eine zweite universelle Sequenz umfasst; wobei sich vorzugsweise die zweite universelle Sequenz am 5'-Ende der bindenden Fängersequenz befindet.
Fänger-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Fänger-Oligonukleotid ferner eine Nukleinsäureverlängerungs-Blockierungsstelle umfasst; wobei sich vorzugsweise die Blockierungsstelle für die Nukleinsäureverlängerung am 3'-Ende der Faltsequenz befindet; wobei sich vorzugsweise die Blockierungsstelle für die Nukleinsäureverlängerung am 5'-Ende der zweiten universellen Sequenz befindet; wobei vorzugsweise die Blockierungsstelle für die Nukleinsäureverlängerung mit einer oder einer Kombination von mindestens zwei der folgenden Substanzen modifiziert ist: Abstandhalter, Thiogruppe oder Uracilbase.
Fänger-Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Faltsequenz mit einem Nukleinsäureanalogon modifiziert ist; wobei vorzugsweise das Nukleinsäureanalogon eine oder eine Kombination von mindestens zwei Peptidnukleinsäuren, verriegelten Nukleinsäuren, transponierten Basen, 2'-O,4'-C-Methylen-verbrückter RNA, 2'-O-Methyl-RNA oder 2'-Fluor-RNA umfasst.
Kit zur Nukleinsäure-Amplifizierung, umfassend das Fänger-Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Kit gemäß Anspruch 5, wobei das Kit ferner ein Vorbehandlungsreagenz des Zielmoleküls umfasst; wobei vorzugsweise das Vorbehandlungsreagenz des Zielmoleküls eine oder eine Kombination von mindestens zwei der folgenden Substanzen umfasst: eine ortsspezifische spaltende Nuklease, einen Nukleinsäure-Extensionsblocker oder einen spezifischen Primer; wobei vorzugsweise die ortsspezifische spaltende Nuklease eine Exonuklease und/oder eine Endonuklease umfasst; wobei vorzugsweise die Endonuklease eine beliebige oder eine Kombination von mindestens zwei methylierungsabhängigen Restriktionsendonukleasen, methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen oder Mismatch-Reparaturenzymen umfasst; wobei vorzugsweise der Nukleinsäure-Extensionsblocker Peptidnukleinsäure(n) und/oder geschlossene Nukleinsäure(n) umfasst; wobei vorzugsweise der spezifische Primer eine modifizierte Gruppe am 5'-Ende hat; wobei vorzugsweise die modifizierte Gruppe eine Phosphatgruppe und/oder eine Thiogruppe umfasst.
Kit gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei das Kit ferner einen Universalprimer umfasst; wobei vorzugsweise der universelle Primer eine Nukleinsäuresequenz hat, die mit der ersten universellen Sequenz oder der zweiten universellen Sequenz des Fänger-Oligonukleotids identisch oder teilweise identisch ist; wobei vorzugsweise das Kit ferner einen spezifischen Primer umfasst.
Kit gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Kit ferner eine Nachweissonde umfasst; wobei vorzugsweise die Nachweissonde mit einer Fluoreszenzgruppe und/oder einer Quenching-Gruppe markiert ist; wobei vorzugsweise die fluoreszierende Gruppe am 5'-Ende der Nachweissonde markiert ist; wobei vorzugsweise die Quenching-Gruppe am 3'-Ende der Nachweissonde markiert ist; wobei vorzugsweise die fluoreszierende Gruppe eines der folgenden Elemente umfasst: FAM, VIC, JOE, TET, CY3, CY5, ROX, Texas Red oder LC RED460; wobei vorzugsweise die Quenchinggruppe eine der Gruppen BHQ1, BHQ2, BHQ3, Dabcy1 oder Tamra umfasst.
Verfahren zur Nukleinsäureamplifizierung, umfassend: (1) Inkontaktbringen eines Zielmoleküls mit einer definierten 5'-Endsequenz mit dem Fänger-Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wodurch die bindende Fängersequenz des Fänger-Oligonukleotids an das Zielmolekül bindet; (2) Unterziehen des Fänger-Oligonukleotids einer Verlängerungsreaktion mit dem Zielmolekül als Vorlage, wodurch zu dem Zielmolekül komplementäre Nukleotide an das 3'-Ende des Fänger-Oligonukleotids angefügt werden, um ein verlängertes Fänger-Oligonukleotid zu bilden; (3) Inkubieren des verlängerten Fänger-Oligonukleotids unter einer Bedingung, die eine intramolekulare Selbstfaltung erlaubt, wodurch ein Produkt mit einer Semi-Haarnadelstruktur durch komplementäre Basenpaarung zwischen der verlängerten Sequenz und der Faltsequenz des verlängerten Fänger-Oligonukleotids gebildet wird; und (4) Unterziehen des Produkts mit einer Semi-Haarnadelstruktur einer Verlängerungsreaktion, wodurch zur ersten universellen Sequenz komplementäre Nukleotide am 3'-Ende hinzugefügt werden, um ein Produkt mit einer vollständigen Haarnadelstruktur zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Verfahren ferner umfasst: Durchführen einer exponentiellen Amplifizierung unter Verwendung des Produkts mit einer vollständigen Haarnadelstruktur als Vorlage und unter Verwendung eines Universalprimers und/oder eines spezifischen Primers, um ein Amplifizierungsprodukt zu erhalten; wobei vorzugsweise der universelle Primer eine Nukleinsäuresequenz hat, die mit der ersten universellen Sequenz oder der zweiten universellen Sequenz des Fänger-Oligonukleotids identisch oder teilweise identisch ist; wobei vorzugsweise die exponentielle Amplifizierung eine Polymerase-Kettenreaktion umfasst; wobei vorzugsweise das Verfahren ferner die Schritte umfasst, das Amplifizierungsprodukt an eine Nachweissonde binden zu lassen und nachzuweisen.