DE102005048503A1

DE102005048503A1 - Verfahren zur Steuerung der abschnittsweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge

Info

Publication number: DE102005048503A1
Application number: DE102005048503A
Authority: DE
Inventors: Peter Bendzko; Stephen Heymann; Hans Joos; Beate Kraffert; Ralf Bergmann; Matthias Leiser
Original assignee: Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Current assignee: Invitek Molecular De GmbH
Priority date: 2005-10-07
Filing date: 2005-10-07
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2025-10-08
Also published as: WO2007042003A2; WO2007042003A3; US20070082343A1; EP1941056A2; DE102005048503B4

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung, bei denen synthetische Oligonukleotide eingesetzt werden, die einen oder mehrere Bausteine mit unnatürlicher chemischer Beschaffenheit enthalten. Durch den Einsatz dieser Bausteine wird die enzymatische Synthese derjenigen Nukleinsäurestränge verhindert, die komplementär zu Abschnitten sind, die diese Bausteine enthalten. Unter anderem erlauben die erfindungsgemäßen Verfahren die Detektion alternativer Spleißformen von Genen, die Detektion von Nukleinsäurevarianten, die Herstellung markierter Nukleinsäuremoleküle, die unmittelbare Herstellung von Nukleinsäure-Doppelstrangprodukten mit einzelsträngigen Überhängen für anschließende Ligationsreaktionen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind verschiedenste Bereiche der Forschung, die biomedizinische Praxis, die Nukleinsäure-basierte Analytik, insbesondere von Biotechnologie-, Agrar- und Lebensmittelprodukten, sowie die Kriminalistik.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Steuerung der Abschnittweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Forschung, die medizinische Praxis, die genbasierte Analytik von Biotechnologie-, Agrar- und Lebensmittelprodukten, sowie die Kriminalistik.

Die DNA-Analytik hat im Verlaufe des letzten Jahrzehnts für Forschung und medizinische Praxis ständig an Bedeutung gewonnen und durchdringt zunehmend andere Bereiche menschlicher Erwerbstätigkeit. Stellvertretend für den Bedarf und das wachsende Repertoire an DNA-Analysetechniken seien hier Zahlen aus der Humangenetik angeführt: Wurden im Jahre 2002 weltweit Tests für ca. 750 polymorphe Loci im Humangenom angeboten (EPF 2002), so stehen gegenwärtig ca. 1870 derartige Service-Angebote bzw. Nachweisbestecke zur Verfügung (OMIM). Der Eindeutigkeit des Kausalzusammenhangs und damit des Aussagewerts wegen bilden Allel-Diagnostika für monogen bedingte Erbkrankheiten die größte und umsatzstärkste Gruppe. Dagegen gestaltet sich die Findung von Kombinationen erblicher Prädispositionen und somatischer Mutationen im Falle komplexer Pathologien bzw. Anfälligkeiten für solche naturgemäß weitaus schwieriger: Es gibt auf den heutigen Tag noch keine Obermenge korrelierter DNA-Varianten, die zusammen genommen die überwiegende Anzahl entsprechender Krankheitsfälle komplett abdeckten und überdies zu befriedigenden Therapieempfehlungen befähigten. Im Wesentlichen unterscheiden sich die Diagnostik-Anforderungen der Zukunft vom heutigen Stand der Technik hinsichtlich Komplexität (Anzahl und Art der simultan zu detektierenden Aberrationen), Sensitivität (extrem kleines Mutanten-Wildtyp-Verhältnis) und Robustheit.

Diese Sachlage trifft analog auch für die methoden- und verfahrensorientierten Bereiche der DNA-Rekombinatentechnik, sowie der Bio- und Feinchemikalienindustrie zu: Kosten- und aufwandssparende Innovationen heizen den weltweiten Wettbewerb an. Diesbezügliche Neuerungen erlauben es bspw., Genklonierungsaufgaben im Hochdurchsatzverfahren zu bewältigen.

Die Neu- und Weiterentwicklung universeller Methoden der Gen-, Genom- und Genexpressionsforschung erfasst gleichermaßen den Komplex der RNA-Analytik, inklusive der Spleiß- und Reifungsprozesse der mRNA, RNA-basierter Enzyme und bioaktiver Werkzeuge der Expressionsregulation bis hin zu ersten Therapeutika.

Um den Facettenreichtum des aktuellen Standes der Technik annähernd adäquat darzulegen, bedarf es des Umfangs mehrerer Standardwerke der modernen Molekularbiologie, die ungebrochen als Generator der Methodenentwicklung zu bezeichnen ist. Verwiesen sei hier auf die Lehrbücher von Seyffert² und Lewin³. Der erfindungsrelevante Auszug wird im folgenden anhand dreier repräsentativer Basisfälle dargelegt. Bis zu einem gewissen Grade gehen viele etablierte Techniken auf diese Basisfälle zurück:

Basisfall 1

Im folgenden wird auf die Detektion eines krankheitsätiologierelevanten somatischen Einzelnukleotidaustauschs eingegangen. Er begegnet uns in einer Vielzahl monogenspezifischer Diagnostik-Aufgaben, vornehmlich in der Onkologie, und kehrt in komplexeren Fragestellungen wieder:
Gegeben sei die isolierte DNA einer biologischen Quelle, bestehend aus k Haplogenomäquivalenten. Bekannt sei die Referenzsequenz des fraglichen chromosomalen DNA-Abschnitts S. Die Sequenz von S sei im gegebenen Isolat hinreichend unikal. Bekannt seien Position und Art (bspw. A zu C) des fraglichen Austauschs in S. Der mutierte DNA-Abschnitt S' kann stark unterrepräsentiert sein, muss aber nicht.

Die gängigen Verfahren zur Unterscheidung von Wildtyp und Mutante machen sich im Wesentlichen Mismatch-Effekte synthetischer Primer, Substrate, Markierungen und Sonden auf Enzym- und Hybridisationsreaktionen und die se lektive Spaltbarkeit von Sequenzen mit Restriktasen zu Nutze, die in sequenziellen Assay-Schritten zum Tragen kommen. Genutzt werden unterschiedliche Nukleotidderivate und biochemische Wandlungsmöglichkeiten in zahlreichen Spielarten, die in aller Regel zur Herstellung der Rechtmängelfreiheit entwickelt wurden. Sie lassen sich wie folgt klassifizieren:

1. Erhöhung der Kopienzahl durch Amplifikation von S und S' mit Hilfe von Polymerasen (PCR)⁴ und Ligasen (LCR)⁵,
2. positionsspezifischer Einbau markierter und/oder terminierender Substratanaloga (Sequenziertechnik nach Sanger⁶, Pyrosequencing⁷),
3. template-abhängige Ligation bündiger Halbsonden (OLA) oder Zirkularisierung (isotherme RCA oder – umgekehrt – Padlocking)⁸,
4. Beacon- und Scorpion-basierte Techniken⁹,
5. Primäre (Fänger) oder sekundäre (Reaktionsprodukt) Immobilisation an festen Phasen (Chip-Technologien)¹⁰,
6. Einzelstrang-Rückfaltung (SSCP)¹¹.
7. Nutzung der unterschiedlichen Schmelztemperatur von Doppelhelix und Heteroduplices gleicher Sequenz (DNA/RNA, DNA/DNA* mit * = strukturell versteifter Zucker [locked DNA] oder substituiertem Zucker-Phosphat-Gerüst [PNA])¹²

Dabei erfüllen die Nukleotidderivate die Funktion von Substraten der Polymerasen bzw. Ligasen, von Primern der Polymerase-Kettenreaktion und von Sonden in den Assaysystemen. Im einzelnen ergibt die grobe Zuordnung folgendes Bild:

1. Etliche Triphosphat-Analoga werden von der Polymerase als Substrat akzeptiert und eingebaut. Auf diese Art und Weise werden Markierungen (fluoreszierende, terminierende, affine, (bio)chemisch wandelbare bzw. inerte Gruppen) und Bindungen (hydrolysierbar bzw. hydrolyseresistent, B-Form-Störungen) durch enzymatische Kondensation entwe der in die Kopien von S oder von S' eingeführt, wodurch diese diskriminiert werden können.
2. Endständige und interne Modifikationen in Primern beeinflussen die Selektierbarkeit von S vs. S' infolge • Aufprägung/Inaktivierung von Restriktionsorten; • Veränderung der Annealingtemperatur (Mismatches); • Herstellung der Ligationsfähigkeit (5'-p); • Zyklisierbarkeit, • Ermöglichung/Ausschluss der nukleolytischen Spaltbarkeit (Proofreading, Displacement, Chimärenspaltung).
3. Endständige Modifikationen in Sonden dienen selektiven Detektionszwecken auf der Basis von • Fluoreszenzquenchern/Verstärkern; • Affinen Gruppen zur Immobilisierung und zum Nachweis (Biotin, FITC).

Zunehmend werden mehrere der vorgenannten Eigenschaften und Zwecke in Kombination eingesetzt. Beispielsweise kombinieren Scorpions (Sigma-Aldrich) Primer- und Sondenfunktion. In chip-basierten Detektionssystemen (Asper) werden Substratanaloga-Einbau mit der Folge der Fragmentierbarkeit, Primerverlängerung mit Synthesestopp und Fluoreszenzmarkereinbau zu einem technologischen Ablauf vereint. Im Spezialfalls der Detektion mutierter, krebsrelevanten k-ras Minorkomponenten werden entweder Wildtyp-Spaltung und differenzielle Sonden-Thermostabilität zum sensitiven Mutanten-Nachweis über DNA-Elisa (Invitek GmbH) oder PCR plus SSCP (Nordiag SA) nacheinander ausgeführt.

Bei systematischer Betrachtung fällt auf, dass sich unter allen etablierten Kombinationen bisher kein Literaturhinweis oder Schutzrecht auf die Ausnutzung von Nukleotid-Modifikationen zur Steuerung der Polymerase-Aktivität über das Template fand. Es ist lediglich bekannt, dass Thymidin-Dimere (unter dem Einfluss von UV-Strahlung durch Zykloaddition benachbarter Desoxythymidine entstandene Strukturverwerfungen) nur den Einbau eines dAs zulassen, mit anschließender Termination der Synthese.

Es stellt sich die Frage, ob ein Primer, der zu einem SNP-Ort 100% passfähig ist, gleichzeitig den Zweck erfüllen kann, in einem PCR-Ansatz die Gegenstrangsynthese effektiv zu hemmen, sodass es nur zu einer gebremsten oder zu gar keiner exponentiellen Amplifikation kommt.

Basisfall 2

Direkte Klonierungsverfahren für PCR-Produkte

Gängige Klonierungsverfahren für amplifizierte dsDNA Fragmente basieren entweder

1. konventionell auf der Nutzung von Hilfsklonierungsorten, die als Oligonukleotidverlängerungen von vornherein beim Primerdesign angehängt werden, anschließender Restriktionsspaltung des PCR-Produkts und Insertion in einen entsprechend vorbereiteten Vektor¹³ oder
2. auf der T/A Komplementarität überhängender 3'-Enden von Insert bzw. Vektor oder ¹⁴
3. auf der Ligaseaktivität der Topoisomerase I, die ein glattes oder 3'-dA-geschwänztes PCR-Produkt äußerst rapide in einen speziell vorbereiteten kommerziellen Klonierungsvektor inseriert ^{15,16,17,18,19,20,21}

Der Grundgedanke ist, eine PCR-Produkt-Fraktion zu erzeugen, die gleich bei ihrer Entstehung die Vektor-komplementären Überhänge erhält.

Der gespaltene Vektor habe zwei Vierer-Einrückungen. Entsprechend werden die Amplifikationsprimer 5'-seitig mit den vier komplementären Basen ausgestattet, z. B. der Hinprimer mit den inneren vier Basen AATT der EcoR I Erkennungssequenz, der Rückprimer mit den inneren vier Basen TCGA der Hind III Erkennungssequenz.

Die Modifikation wird nur bei einer Fraktion (etwa 1/10 bis 1/100) des Primers eingefügt sein dadurch soll einerseits normale exponentielle Amplifikation des Fragments zwischen den Primern stattfinden. Die 'normalen' Amplifikate entziehen sich der Klonierung durch Nichtpassfähigkeit der Enden zum Vektor. Die durch gelegentlichen Einbau von Stopp-Varianten der Primer erzeugten Amplifikat-Abkömmliche haben die gewünschten kohäsiven Enden.

Basisfall 3

Zahlreiche Gene liefern auf dem Wege des alternativen Spleißens mehr als eine reife mRNA und die dazugehörige Aminosäuresequenz. Die akkumulierte Verteilungsstatistik der Anzahl der experimentell und bioinformatisch (durch EST-Alignierung) belegten Transkripte und Exons pro Gen in Abhängigkeit von der Genlänge wird für humane Gene laufend aktualisiert (Ensembl V.32 ff)²².

In der Praxis zeigt sich immer wieder, dass etliche mRNAs fälschlich für das kanonische Transkript des betreffenden Gens gehalten werden. Tatsächlich sind sie aber eine tumorassoziierte Sonderspleißform dieses Gens (Xu und Lee 2003)²³. Der Grund besteht darin, dass vor der chromosomenweiten DNA-Sequenzierung im Rahmen des Humangenomprojekts die cDNA-Klonierung und -sequenzierung das Mittel der Wahl zur Erforschung der Genexpression aus humanem Gewebe war, und hierfür wurde eben sehr häufig chirurgisch entferntes Tumormaterial benutzt.

Im alternativen Spleißgeschehen kehren im Wesentlichen folgende Stereotypen immer wieder: Exon-Skipping, multiples Exon-Skipping, Skipping sich gegenseitig ausschließender Exons, kryptische Exons, fakultative Promotoren, Spleißsignalatenuierung, Verbleib von Introns, Kaskadenspleißvorgänge – auch Kombinationen der genannten Typen.

In einer großangelegten maschinenexperimentellen Studie (Hiller et al. 2004)²⁴ wurde gezeigt, dass für viele Gene eine weit größere Anzahl putativer Spleißformen funktionell bedeutsam sein kann. Das molekulare 'Feintuning' des Spleißgeschehens ist bekanntlich gewebsabhängig, mutations-, zustands- und kontextsensitiv. Die Spleißformensimulation im Computer abstrahiert von diesen vielen Freiheitsgraden und eröffnete mithin einen Weg, biologische Argumente für die Existenz weiterer Spleißformen zu sammeln, nach denen dann gezielt gefahndet werden kann, auch gerade wenn es sich um extreme Minorkomponenten handelt, die in cDNA- und EST-Bibliotheken wahrscheinlichkeitsbedingt unterrepräsentiert sind und daher noch seltener gefunden werden, als sie ohnehin schon im mRNA-Pool einer biologischen Quelle vertreten sind. Diese Analyse hat also Vorhersagewert.

Die Verifikation der vorhergesagten alternativen Spleißformen erfolgt üblicherweise laborexperimentell über Northern Blots oder bioinformatisch, sofern sich in den verfügbaren Sequenzdaten hochgradig homologe Sequenzen finden; Nichtauffindung solcher Homologa bedeutet bei Weitem nicht Sicherheit bzgl. der Nicht-Existenz einer Spleißform. Dafür ist die Datenlage immer noch zu lückenhaft. Hier besteht also erheblicher Verbesserungsbedarf.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein robustes und schnelles Verfahren zur Steuerung der Abschnittweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung zu entwickeln, welches unter anderem für die Analyse alternativer Spleißformen, bei der Detektion von Nukleinsäuresequenzvarianten und Genklonierung gebraucht wird.

Die Erfindung wird gemäß Hauptanspruch realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

(1) In molekularbiologischen Routineexperimenten der Erfinder kommen in einem völlig anderen als dem erfindungsgemäßen Zusammenhang und Zweck so genannte chimäre Oligonukleotide der Form 5' N_kXN_l 3' zum Einsatz. In 5' N_kXN_l 3' steht N für ein beliebiges der natürlichen Desoxyribonukleotide dA, dC, dG, dT, X für ein beliebiges der natürlichen Ribonukleotide A, C, G, T; k und l sind die Monomerzahlen der Desoxyribonukleotidabschnitte im synthetischen chimären Oligonukleotid. Dabei ergab sich, zunächst im Ergebnis eines missglückten Experiments, bei dem die 2' Schutzgruppe des Ribonukleotidbausteins X fälschlicherweise nicht entfernt worden war, die überraschende Beobachtung, dass diese Besonderheit eine drastische Reduktion der exponentiellen DNA-Amplifikation nach sich zog, wenn man dieses chimäre Oligonukleotid mit der 2'-Schutzgruppe am X zusammen mit einem zweiten, nicht schutzgruppenbehafteten Oligonukleotid als Primerpaar in einem üblichen PCR-Ansatz zur Amplifikation eines 348 Basenpaare langen Abschnitts humaner genomischer DNA einsetzte. Dieser unerwartete Hemmeffekt ist in 1 dargestellt. Als 2'-Stopp-Funktion wurde verwendet:
Der Hemmeffekt erwies sich in Wiederholungsexperimenten als reproduzierbar und führte schließlich zur Grundidee der Erfindung.
(2) Es zeigt sich, dass der erfindungsgemäße Hemmeffekt in der Tendenz stärker wurde, je mehr Ribonukleotidbausteine mit 2'-Schutzgruppe in chimäre Oligonukleotide gleicher Länge und Sequenz eingebaut werden, z.B. 5' N_k–1X₂N_l 3', 5' N_k–2X₃N_l 3', 5' N_k–3X₄N_l 3' usw. Bei geradzahligen Ribonukleotidbausteinen mit 2'-Schutzgruppe erwies sich der Hemmeffekt sogar als quantitativ (s. Ausführungsbeispiel 1). Damit war die Grundlage für die erfindungsgemäße subtile Steuerung der Abschnittweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung gelegt. Tatsächlich konnte bei der Feinanalyse des erfindungsgemäßen Steuerungseingriffs in den Prozess der selektiven Vervielfältigung vorgelegter DNA-Abschnitte gezeigt werden, dass die Erststrangsynthese am DNA-Template, für die das chimäre Oligonukleotid mit schutzgruppenbehafteten Ribonukleotidbausteinen als Primer fungiert, in keiner Weise beeinträchtigt wird. Als Grund für die hemmende Wirkung wurde der Abbruch der Komplementärstrangsynthese im darauffolgenden Zyklus der PCR-Reaktion erkannt. Mithin fällt dieser inkomplette Komplentärstrang als Template für die erneute Initiation der Hin- und Rückstrangsynthese in allen nachfolgenden Zyklen aus, weil der Teilabschnitt N_l des chimären Oligonukleotids bei gegebener Annealingtemperatur zu kurz für eine komplementäre Bindung an die inkompletten Syntheseprodukte vorangegangener Zyklen ist. Im Ergebnis kommt es zur partiellen Hemmung bzw. sogar zur vollständigen Unterbindung der exponentiellen DNA-Amplifikation. Beide Effekte – partielle und totale Hemmung – sind für unterschiedliche Anwendungen der Erfindung auf die Basisfälle 1 bis 3 von ausschlaggebender Bedeutung, worauf weiter unten gesondert eingegangen wird.
(3) In der weiteren Ausgestaltung der Erfindung wurden andere sperrige Anhängsel in 2'-Position der Ribonukleotidbausteine im Bestand chimärer Oligonukleotide ebenfalls als geeignet befunden, die unter (2) beschriebenen Steuerungswirkung herbeizuführen, z. B. 2'-O-Triisopropylsilyl-Gruppen, 2'-O-Alkyl-Gruppen und andere.
(4) Nukleotidbausteine verfügen bekanntlich über weitere reaktionsfähige Gruppen, die in chemischen und biochemischen Stoffwandlungsprozessen verändert werden können. Die unter (2) beschriebenen erfindungsgemäßen Effekte treten in unterschiedlich intensiver Ausprägung auch dann ein, wenn a) die natürlichen Zucker Ribose oder Desoxyribose durch Arabinose ersetzt werden, b) die natürlichen Phosphodiesterbindungen durch Modifikationen verändert werden, die sie hydrolysestabil machen, c) das Zucker-Phosphat-Rückgrat der synthetischen Oligonukleotide durch Zwischenbasenbrücken anderer chemischer Beschaffenheit mit Stoppwirkung auf die Komplementärstrangsynthese ersetzt wird, d) an den Stickstoffbasen chemische Veränderungen vorgenommen werden, die zwar die Ausbildung der komplementären Basenpaare A-T und G-C nicht beeinträchtigen, von der Polymerase jedoch nicht als Templatebestandteil akzeptiert/toleriert werden, e) zwischen den Bausteinen des synthetischen Oligonukleotids zusätzliche chemische Bindungen bestehen, die Strukturverwerfungen bewirken und f) im synthetischen Oligonukleotid gemischte Veränderungen der Typen (2), (3) und (4a-e) vorliegen.
(5) Allen Ausführungen zur vorliegenden Erfindung unter (1) bis (4) ist gemein, dass das Wesen das erfindungsgemäßen Steuerung der Abschnittweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge auf der bisher unbekannten oder unbeachtet geblieben Stopp-Wirkung der synthetischen Oligonukleotide auf die Polymerase-kettenreaktion weder auf veränderter Primerfunktion, noch auf Substrat-, Sonden- oder Klemmenwirkung beruht, sondern sich einzig und allein auf die Doppelrolle beim Start der Hinreaktion, durch die ein synthetisches Oligonukleotid der oben beschriebenen Beschaffenheit Bestandteil der Nukleinsäurekopien wird, und beim Abbruch der nachfolgenden Synthese von Komplentärsträngen gründet. Das ist das wichtigste Abgrenzungskriterium der Erfindung und macht sie von allen üblichen Ausprägungen und Spezialanwendungen der Polymerasekettenreaktion zu Nachweis-, Klonierungs- und Diskriminierungszwecken von Nukleinsäuren eindeutig unterscheidbar.
(6) Aus (1) bis (5) leitet sich zwingend ab, dass bei erfindungsgemäßer Steuerung der Abschnittweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge gar keine kompletten DNA-Doppelhelices entstehen oder sich komplette Doppelhelices im Gemisch mit definiertinkompletten bilden. Das grenzt die Erfindung von den üblichen Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäurekopien mit stochastischer Längenverteilung infolge Synthesetermination mittels Didesoxyribonukleotid-Triphosphaten (Sanger-Methode) ab. Der Syntheseabbruch im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt an definierter, vorgegebener Position. Das wiederum ermöglicht es, Nukleinsäurekopien mit kohäsiven Enden ohne den üblichen Aufwand der Restriktionsspaltung von Hilfsklonierungssequenzen zu erzeugen, die dann in entsprechend vorbereitete Klonierungsvektoren oder rekombinante Konstrukte einligiert werden können. Damit wird ein erheblicher Fortschritt gegenüber dem Repertoire üblicher Klonierungstechniken realisiert (vgl. Basisfall 2).
(7) Der Einsatz der erfindungsgemäßen Oligonukleotide mit Stopp-Funktion ermöglicht erstmalig die selektive Amplifikation von alternativen Spleißformen. Das wird am besten aus der folgenden 2 deutlich. Das Schema illustriert die Vorgehensweise exemplarisch an einem dreiexonischen Gen, von dem der Anschaulichkeit halber postuliert wird, dass seine lange Spleißform (die so genannte Holoform, oben) durch Einschluss aller drei Exons in die reife mRNA entsteht, während die kurze Spleißform durch Auslassung ('Skipping') des mittleren Exons im extremen stöchiometrischen Unterschuss zu Stande kommt (2).

Auswahl und Einsatz der Primer geschehen nun wie folgt: Die beiden Spleißformen werden aus der Gesamt-RNA mit dem 3'-Primer (P2) in cDNA umgeschrieben und mit dem Primerpaar P1/P2 amplifiziert. Wir erwarten vom elektrophoretischen Bild nur eine Bande für die lange Spleißform; die kurze ist vorgabegemäß eine Minorkomponente und allenfalls als Schatten zu sehen.

Mischen wir jedoch PCR-Ansatz zusätzlich den Exon-2-spezifischen Stopp-Primer (P3) bei, so wird die exponentielle Vervielfältigung der langen Spleißform ausgeschaltet, und es entsteht – nach entsprechender Anpassung der Zyklenzahl – das Amplifikat der kurzen Spleißform (vgl. Basisfall 3).

Vorteile:
In Bezug auf Basisfall 1

• Ablösung der bisherigen Mehrschritt-Verfahren durch eine rechtmängelfreie Einschritt-Methode durch Wegfall • der verschachtelten (nested) PCR-Schritte; • der Restriktionsspaltung; • des DNA-Elisas mit einer eigenen Klasse von DNA-basierten Nachweisbestecken geringerer Fehleranfälligkeit
• Einsparung von spezifischem Arbeitsaufwand sowie kostenintensiven Zubehörs (Enzyme, Streptavidin-Platten, Konjugat)
• Ggf. höhere Sensitivität (noch frühere Früherkennung)
• Rückwärtskompatibilität (jederzeitige Aufsatzmöglichkeit des bisherigen Elisas oder SSCP)
• Anwendbarkeit im Sinne des Massen-Screenings, ggf. zur Vorselektion
• Automatisierbarkeit

In Bezug auf Basisfall 2

• Wegfall des zusätzlichen Verfahrensschritts der Restriktionsspaltung von Amplifikaten mit angehängten Hilfsklonierungsorten
• Wegfall der Gefahr der unerwünschten Fragmentierung bei langen Amplifikaten unbekannter Sequenz
• Wegfall des Angewiesenseins auf käuflichen Erwerb vorgefertigter Vektoren

In Bezug auf Basisfall 3

• Prozessintegration von bioinformatischer Vorhersage alternativer Spleißformen und gezielter experimenteller Verifikation ihrer Existenz im untersuchten Gewebe
• Vermeidung schädlicher Substanzen (Formamid) durch Wegfall herkömmlicher Northern Blot Prozeduren
• Auffindbarkeit von Minorkomponenten-Spleißformen

1. Basisfall 1 wird erfindungsgemäß durch folgenden Absatz realisiert: In parallelen PCR-Ansätzen zu je 25 μl Reaktionsvolumen werden je 50 ng isolierter genomischer DNA aus SW620 Zellen in einem Eppendorf Mastercycler gradient der Amplifikation nach folgendem Programm unterzogen: 94°C/5' zur Erstdenaturation des genomischen Templates; 94°C/30'' für den Denaturationsschritt in jedem Zyklus; 61±10°C/30'' zum Annealing von je 12 identischen Reaktionsaliquots bei variabler Temperatur im Bereich von 51 bis 71°C bei einer konstanten Temperaturerhöhungs- bzw. Abkühlrate von 3°C pro Sekunde; 72°C/1' zur Primerelongation; 35 Zyklen, 72°C/5' zur finalen Synthesekomplettierung; Abkühlung auf 4°C zur Aufbewahrung bis zur gelelektrophoretischen Analyse. Zur Sicherstellung identischer Reaktantenkonzentrationen wurde mit einem Mastermix gearbeitet. Dieser enthielt 0,76 × PCR-Standardpuffer, 1,5 mM MgCl₂, 1,5 μg/ml BSA; 76 μM jedes der vier Desoxyribonukleotid-Triphosphate, 0,5 Einheiten Taq-Polymerase bezogen auf jedes Ansatzaliquot; 15 pmol des gemeinsamen Rückprimers 5' TACCCTCTCACGAAACTCTG 3' bezogen auf jedes Ansatzaliquot. Dieser Primer ist spezifisch für einen Abschnitt in Exon 1 des humanen k-ras Gens. Fünf Teilmengen des Mastermixes, die für je 12 Ansatzaliquots ausreichend sind, wurden separat versetzt mit 15 pmol der nachfolgend gelisteten Hinprimer bezogen auf jedes Ansatzaliquot, deren Sequenz identisch ist und spezifisch für den genomischen Bereich um Kodon 12/13 des humanen k-ras Gens. Gemeinsam überspannen Hin- und Rückprimer 348 Basenpaare auf der genomischen DNA:

1.1 5' TTGGAGCTGGTGGCGTAGG 3', spezifisch für das k-ras Wildtypallel in SW620;
1.2 5' TTGGAGCTGG*TGGCGTAGG 3', spezifisch für das k-ras Wildtypallel in SW620, G* bedeutet das 2'-O-tertButyl-Dimethyl-Silyl Derivat des Guanosinribonukleotids;
1.3 5' TTGGAGCTG*G*TGGCGTAGG 3', spezifisch für das k-ras Wildtypallel in SW620, G* bedeutet das 2'-O-tertButyl-Dimethyl-Silyl Derivat des Guanosinribonukleotids;
1.4 5' TTGGAGCU*G*G*TGGCGTAGG 3', spezifisch für das k-ras Wildtypallel in SW620, G* bedeutet das 2'-O-tertButyl-Dimethyl-Silyl Derivat des Guanosinribonukleotids und U* das 2'-O-tertButyl-Dimethyl-Silyl Derivat des Uridinribonukleotids;
1.5 5' TTGGAGC*U*G*G*TGGCGTAGG 3', spezifisch für das k-ras Wildtypallel in SW620, G* bedeutet das 2'-O-tertButyl-Dimethyl-Silyl Derivat des Guanosinribonukleotids, U* das 2'-O-tertButyl-Dimethyl-Silyl Derivat des Uridinribonukleotids und C* das Cytidinarabinosid;

Eine sechste identische Teilmenge des Mastermixes, die ebenfalls für 12 Ansatzaliquots ausreichend ist, wurde mit einem Hinprimer versetzt (wiederum 15 pmol bezogen auf jedes Ansatzaliquot), der an derselben genomischen Position im k-ras Gen wie die Primer 1.1 bis 1.5, aber im Unterschied zu diesen spezifisch ist für das Chromosom in SW620, das in Kodon 12 des k-ras Gens eine Glyzin-zu-Valin-Mutation (G12V) aufweist.
1.6 5' TTGGAGCTGTTGGCGTAGG 3', spezifisch für die somatisch mutierte (G12V) DNA in SW620.
Nach erfolgter PCR wurden je 6 μl jedes Reaktionsansatzes auf übliche Weise mit Orange G in Glycerin/H₂O versetzt und auf ein horizontales Agarosegel (1,5 % in TAE Puffer plus 0,1 μg/ml Ethidiumbromid) aufgetragen. Die Auftragereihenfolge ist die Folgende: Obere Reihe v.l.n.r – Serie 1.1, 1.2, 1.3; untere Reihe v.l.n.r. – Serie 1.4, 1.5, 1.6, jeweils begrenzt durch einen DNA-Standard mit Fragmenten bekannter Länge. An das Elektrophoresegel im Submarin Modus wurde eine Gleichspannung von 7V/cm angelegt. Die Auftrennung dauerte 45 Minuten. Eine Photographie dieses Gels unter UV-Licht ist in 3 zu sehen.
Beobachtung:
Quantitative Hemmung wird bei geradzahligen Reihungen von Stoppfunktionen (2 und 4) beobachtet, während ungeradzahlige Reihungen (1 und 3) eine partielle Hemmung bewirken. Die Intensität der Wildtyp- und Mutanten-Amplifikate aus Parallelansätzen mit Primern ohne jede Stopp-Funktion (links oben und rechts unten) dient dem Mengenvergleich.
Legende zu den Abbildungen
1 Partialhemmung gemäß Erfindung. Die Amplifikatmenge bei Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids mit Stopp-Funktion (untere Reihe) ist gegenüber der Kontrolle (obere Reihe) verringert.
2 Prinzipschema der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf den Nachweis alternativer Spleißformen.
3 Repräsentatives Elektrophoresebild zum Basisfall 1 des Verfahrens zur Steuerung der Abschnittweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge.
Referenzen und erläuternde Bemerkungen:

¹ OMIM: Online Mendelian Inheritance in Men, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM
² Seyffert (Hrsg), Lehrbuch der Genetik, mit Beitr. von Rudi Balling u.a., 2. Aufl.. – Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akad. Verl., 2003, ISBN 3-8274-1022-3
³ Benjamin Lewin, Genes VIII, Prentice Hall, 2004, ISBN: 0 1314 3981 2
⁴ Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H., Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263-73
⁵ Barany F., The ligase chain reaction in a PCR world, PCR Methods Appl. 1991 Aug;1(1):5-16
⁶ Sanger F, Nicklen S, Coulson AR, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA. 1977 Dec;74(12):5463-7
⁷ M. Ronaghi, M. Uhlén and P. Nyrén, A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 281 (1998), p. 363
⁸ Coutelle C., New DNA-analysis techniques, Biomed Biochim Acta. 1991;50(1):3-10. (minireview)
⁹ Leone G, van Schijndel H, van Gemen B, Kramer FR, Schoen CD, Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogeneous, real-time detection of RNA, Nucleic Acids Res. 1998 May 1;26(9):2150-5
¹⁰ Gilles PN, Wu DJ, Foster CB, Dillon PJ, Chanock SJ., Single nucleotide polymorphic discrimination by an electronic dot blot assay on semiconductor microchips, Nat Biotechnol. 1999 Apr;17(4):365-70
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¹² Petersen M, Wengel J.,LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics, Trends Biotechnol. 2003 Feb;21(2):74-81. Review
¹³ Gewöhnlich besteht der angehängte Hilfsklonierungsort aus der entsprechenden Erkennungssequenz der gewählten Restriktase plus 3–4 beliebigen Nukleotiden, die zur Sicherstellung der vollen endonukleolytischen Wirkung des Restriktionsenzyms gebraucht werden. Diese Methode hat den gravierenden Nachteil, dass die Hilfsklonierungsorte im PCR-Produkt unikal sein müssen, sonst wird das Amplifikat fragmentiert. Die Unikalität ist insbesondere bei langen Amplifikaten unbekannter Sequenz ein Problem.
¹⁴ Non-Proofreading Polymerasen hängen nach Art der Nukleotidyltransferasen zusätzliche 1–3 Nukleotide an das 3'-Ende eines eben synthetisierten Komplementarstrangs an. Als Faustregel gilt: über 90 % der 3'Enden tragen ein überstehendes Nukleotid, das zu 85 % dA ist; ein zweites Nukleotid (ebenfalls meist dA) findet sich in ca. 1 % der Syntheseprodukte, ein drittes in 0,01 %. Thermostabile Polymerasen, die ionenabhängig (Mn²⁺/Mg²⁺) eine höhere Template-Toleranz gegenüber RNA zeigen, neigen erfahrungsgemäß stärker zur Produktverlängerung mit zusätzlichen Nukleotiden. Das erklärt, warum es absolut unbefriedigend gelingt, rohe PCR-Produkte in einen Vektor mit glatten Enden einzubringen. Partiell schaffen hier 3'-T-geschwänzte Vektoren Abhilfe.
¹⁵ Grundsätzliche und weiterführende Erklärungen zu dieser sehr zeit- und aufwandsparenden Methodik, sowie ihren Anwendungen für Expression u.a. siehe die nachfolgenden 6 Zitate.
¹⁶ Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269: 32678–32684
¹⁷ Clark, J.M. (1988) Nuc. Acids Res. 16: 9677–9678
¹⁸ Mead, D. et al. (1991) Bio/Techniques 9: 657–663
¹⁹ Bernard, P. and Couturier, M. (1992) J. Mol. Biol. 226: 735–745
²⁰ Bernard, P. et al. (1993) J. Mol. Biol. 234: 534–541
²¹ Rand, K.N. (1996) Elsevier Trends Technical Tips Online
²² s. http://www.ensembl.org
²³ Xu, Q. and Lee, C. (2003). Discovery of novel splice forms and functional analysis of cancer-specific alternative splicing in human expressed sequences. Nucleic Acids Res. 31, 5635–5643
²⁴ M. Hiller, R. Backofen, S. Heymann, A. Busch, T. M. Gläßer and J.-C. Freytag Efficient prediction of alternative splice forms using protein domain homology, In Silico Biology 4, 0017, 2004

Claims

Verfahren zur Steuerung der Abschnittweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstrangsynthese, dadurch gekennzeichnet, dass die in vitro Synthese von DNA-Doppelhelices ohne Verwendung terminierender Substratanaloga vor ihrer Vollendung gestoppt wird, wobei dieser Stopp der Polymeraseaktivität während der Komplementärstrangsynthese durch Unterbindung der durchgängigen Ablesbarkeit des Templates an vorbestimmten Stellen im Template veranlasst wird, und wobei diese Unterbindung der durchgängigen Ablesbarkeit des Templates an vorherbestimmten Stellen im Template durch die Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden mit eingebauten Nukleotidmonomeren unnatürlicher chemischer Beschaffenheit bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die unnatürliche chemische Beschaffenheit der eingebauten Nukleotidmonomere deren Basenpaarungsfähigkeit an komplementäre Nukleinsäureabschnitte nicht beeinträchtigt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die unnatürliche chemische Beschaffenheit der eingebauten Nukleotidmonomere die Primerwirkung der synthetischen Oligonukleotide für Polymerasereaktionen nicht beeinträchtigt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die unnatürlichen Nukleotidmonomere im Bestand der synthetischen Oligonukleotide Abkömmlinge an sich bekannter Zucker enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die unnatürlichen Nukleotidmonomere im Bestand der synthetischen Oligonukleotide hydrolyseresistente Zwischenzuckerbindungen enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass manche Monomere im Bestand der synthetischen Oligonukleotide nicht über Phosphodiesterbindungen verknüpft sind.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die unnatürlichen Nukleotidmonomere im Bestand der synthetischen Oligonukleotide zusätzliche Bindungen zu benachbarten Nukleotiden eingegangen sind.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die unnatürlichen Nukleotidmonomere im Bestand der synthetischen Oligonukleotide zusätzliche funktionelle Gruppen an den paarungsfähigen Basen enthalten.
Verfahren nach den Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide zusätzliche Bindungen zwischen zwei oder je zwei benachbarten Nukleotidmonomeren enthalten.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzlichen Bindungen durch gleichzeitigen Einbau benachbarter, vorab zykloaddierter Basen herbeigeführt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzlichen Bindungen nachträglich durch Zykloaddition der Basen herbeigeführt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Zucker Pentosen oder Abkömmlinge von Pentosen sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Pentosen modifizierte Desoxyribosen oder modifizierte Ribosen Verwendung finden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Pentose die Arabinose Verwendung findet.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierten Ribosen am 2'-Kohlenstoffatom sperrige Zusatzgruppen enthalten.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, 12, 13 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass die sperrigen Zusatzgruppen am 2'-Kohlenstoffatom über O verknüpfte Triisopropylsilylgruppen sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, 12, 13 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass die sperrigen Zusatzgruppen am 2'-Kohlenstoffatom über O verknüpfte tertButyl-Dimethylsilylgruppen sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, 12, 13 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass die sperrigen Zusatzgruppen am 2'-Kohlenstoffatom über O verknüpfte Alkylgruppen sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide Mischpolymere aus natürlichen Desoxyribonukleotiden und den bezeichneten Abkömmlingen sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischpolymere ein oder mehrere Nukleotidderivate der bezeichneten Typen enthalten.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, 9 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass Position und Reihung der bezeichneten Nukleotidderivate im synthetischen Oligonukleotid von dessen Sequenz abgeleitet werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide für die Detektion von Nukleinsäuresequenzvariationen eingesetzt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide für die Detektion von Nukleinsäureminorkomponenten in komplexen Gemischen eingesetzt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide für die Herstellung von DNA-Molekülen mit definierten Einzel- und Doppelstrangabschnitten verwendet werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21 und 23, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide für die Herstellung von DNA-Molekülen verwendet werden, die vorgegebene Einzelstrangüberhänge aufweisen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide für die Herstellung von DNA- Molekülen verwendet werden, die affine Bindungen mit mobilen oder ortsfesten Reaktanten eingehen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide für die Herstellung von DNA-Molekülen verwendet werden, die chemische Bindungen mit mobilen oder ortsfesten Reaktanten eingehen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21, 25 und 26, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide für die Herstellung von markierten DNA-Molekülen verwendet werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Oligonukleotide für die Detektion von alternativen Spleißformen verwendet werden.