EP3759248A1 - Agverfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität - Google Patents

Agverfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität

Info

Publication number
EP3759248A1
EP3759248A1 EP19712690.7A EP19712690A EP3759248A1 EP 3759248 A1 EP3759248 A1 EP 3759248A1 EP 19712690 A EP19712690 A EP 19712690A EP 3759248 A1 EP3759248 A1 EP 3759248A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
primer
amplification
oligonucleotide
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP19712690.7A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dmitry Cherkasov
Christian GRUNWALD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AGCT GmbH
Original Assignee
AGCT GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102018001586.7A external-priority patent/DE102018001586A1/de
Priority claimed from EP18195312.6A external-priority patent/EP3530754A1/de
Application filed by AGCT GmbH filed Critical AGCT GmbH
Publication of EP3759248A1 publication Critical patent/EP3759248A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for the amplification of nucleic acids with improved specificity.
  • PCR nucleic acid chains plays a central role in biotechnology today.
  • Methods such as PCR have significantly advanced both the research landscape and industrial application fields such as diagnostics and the food industry.
  • technologies such as sequencing, real-time detection, microarray technology, microfluidic management etc.
  • Other amplification techniques such as isothermal amplification techniques have also been developed. Their use was especially intended for POCT (point-of-care testing).
  • POCT point-of-care testing
  • the PCR does not control the amplified sequence segments located between the primers.
  • the primer binding is in the focus of optimizations of PCR methods.
  • the initiation of the synthesis of major products and by-products e.g. by non-specific binding or extension of the primer.
  • the unspecifically extended primer is read off as a template, which generally leads to the formation of a complete primer binding site.
  • a transmission of erroneous sequence information from one synthesis cycle to the next occurs, which in sum leads not only to the initial formation, but above all to the exponential multiplication of by-products.
  • Such side reactions can lead to the exponential growth of fragments which interfere with the main reaction (amplification of a target sequence) or lead to interferences in subsequent steps of the analysis.
  • Such by-products typically include left and right primer sequences so that their amplification can occur in parallel with the main reaction.
  • such by-products include another nucleic acid target sequence.
  • the specificity of the PCR amplification is achieved by optimizing the primer binding to target sequences. In this case, for example, additional oligonucleotides can be used, which partially bind to the primer and thus can competitively participate in primer binding to other nucleic acid chains.
  • Such probes typically bind to a sequence portion of the primer and release a single-stranded portion that allows the primer to bind to the target nucleic acid and initiate a synthesis reaction.
  • Primer matrices Mismatches can be competitively displaced by such oligonucleotides, which improves the specificity of the initiation.
  • Such additional oligonucleotides do not interact with the nucleic acid chain to be amplified in portions between the two primers. However, due to a molar excess of the primers, non-specific interactions of primers with templates may occur during amplification, resulting in the formation of a fully functional primer binding site as a result of the synthesis of a complementary strand of the by-product.
  • the side reactions in a PCR increase with the number of synthetic cycles performed, often up to 40 cycles of PCR being performed.
  • other methods can be connected, e.g. Detection, l / bra / y production, cloning, sequencing, etc. These methods can only tolerate to a certain extent the by-products or sequence deviations produced during PCR amplification. In general, the specificity of such methods is also influenced by the problem of side reactions during a PCR.
  • Another object of the invention is to provide a combination of an amplification method with a PCR amplification, wherein the signal acquisition (monitoring or detection), or the amplification of target sequences first by means of controlled amplification using a controller oligonucleotide and corresponding specific primer Sets is carried out and then continued by means of PCR, in particular using PCR-specific primer.
  • Another object of the invention is to reduce the number of PCR synthesis cycles necessary to obtain a sufficient amount of PCR products.
  • Another object of the invention is to provide a novel enzymatic method and components for the synthesis of nucleic acid chains, as well as the amplification of nucleic acid chains, in which a continuous (on-line) signal detection is provided, wherein the signal acquisition (Monitoring / Detection) by sequence-specific oligonucleotide probes.
  • a first aspect of the invention relates to a method for amplifying a nucleic acid, comprising the steps:
  • Hybridizing a first primer oligonucleotide (P1.1) to a nucleic acid to be amplified having a target sequence wherein the first primer oligonucleotide (P1.1) comprises the following ranges:
  • a first region (P1 .1 .1) which can bind sequence-specifically to a region of the nucleic acid to be amplified, wherein the region of the nucleic acid to be amplified comprises at least the 5 ' terminus of the target sequence or in the 5 ' direction of the Target sequence is located;
  • a second region (P1 .1 .2) connected to the 5 'end of the first region or connected via a linker, which second region can be bound by a controller oligonucleotide and for the polymerase used chosen reaction conditions remains essentially unkopiert;
  • a first primer extension product (P1 .1 -Ext) which comprises, in addition to the first primer oligonucleotide (P1 .1), a synthesized region which is substantially is complementary to the nucleic acid to be amplified or to the target sequence, wherein the first primer extension product and the nucleic acid to be amplified are present as a double strand;
  • Binding of a controller oligonucleotide (C1 .1) to the first primer extension product (P1 1 -Ext), wherein the controller oligonucleotide (C1 .1) comprises the following ranges:
  • a second region which is substantially complementary to the first region of the first primer oligonucleotide (P1 .1), and A third region (C1 .1 .3) that is substantially complementary to at least a portion of the synthesized region of the first primer extension product (P1 .1 -Ext); and
  • controller oligonucleotide (C1 .1) does not serve as a template for primer extension of the first primer oligonucleotide (P1 .1) and the first controller oligonucleotide (C1 .1) to the first and second regions of the first primer extension product (P1 .1-Ext) under displacement (of the region complementary to the first and second regions) of the nucleic acid to be amplified;
  • Hybridizing a second primer oligonucleotide (P2.1) to the first primer extension product wherein the second primer oligonucleotide (P2.1) comprises a region (P2.1.1) which is sequence-specifically attached to the synthesized region of the first primer Extension product (P1 .1 -ext) which is at least complementary to the 5 ' terminus of the target sequence or located in the 3 ' direction thereof; Extension of the second primer oligonucleotide (P.2.1) by the first polymerase to obtain a second primer extension product (P2.1 -Ext), which in addition to the second primer oligonucleotide (P2.1) comprises a synthesized region which is substantially identical to the nucleic acid or the target sequence to be amplified, wherein the first primer extension product (P1 .1-Ext) and the second primer extension product (P2.1) form a first double-stranded amplification product; and
  • Extension of the third primer oligonucleotide (P3.1, P3.2) by a second polymerase to give a third primer extension product (P3.1 / 2-Ext) which is next to the third primer oligonucleotide (P3.1, P3. 2) comprises a synthesized region that is substantially complementary to the second primer extension product (P2.1-Ext) or to the target sequence, wherein the second primer extension product (P2.1) and the third primer extension product (P3.1) present as a double strand;
  • a fourth primer extension product (P4.1 / 2-Ext) which comprises, in addition to the fourth primer oligonucleotide, a synthesized region expressed in the Substantially complementary to the first primer extension product (P1 1 -Ext) or identical to the target sequence, wherein the first primer extension product (P1 1-Ext) and the fourth primer extension product (P4.1 / 2-Ext) are in duplex;
  • one aspect of the invention may also be formulated as a method of amplifying a nucleic acid ( Figures 1, 55-56), wherein a sample comprising a first nucleic acid polymer comprising a first target sequence M1 [and the M1 (reverse) complementary sequence M1 ' ], where M in the 5'-3' orientation comprises in direct sequence the sequence segments M1 .5, M1 .4, M1 .3, M1 .2 and M1 .1,
  • a first template-dependent nucleic acid polymerase in particular a DNA polymerase, and also substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase (in particular ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphates) and suitable cofactors, such as Mg salts,
  • a first (right) oligonucleotide primer P1 .1 which in the 5'-3 'orientation directly comprises the sequence segments P1 .1 .2 and P1 .1 .1, P1 .1 .1 having a complement to M1 .1 [ hybridizing] sequence [can bind in a substantially sequence-specific manner] and the P1 .1 .2 sequence portion can not bind to M1 [or a sequence immediately adjacent to M1 .1 with respect to the M1 sequence in 3 '], and P1 .1 (in particular in section P1 .1 .2) modified nucleotide building blocks, so that P1 .1 .2 can not serve as a template for the activity of the first template-dependent nucleic acid polymerase; and iii.
  • a second (left) oligonucleotide primer P2.1 which is (substantially) identical to M1 .5 [and sequence-specifically the reverse complementary sequence of M1 .5 on the opposite strand of M1 or the extension product of P1 .1, P1 1 -ext, there as P1 .1 denotes E1, can bind];
  • C1 .2 in C1 .2.1 comprises modified nucleotide building blocks such that C1 .2.1 can not serve as template for the activity of the template-dependent nucleic acid polymerase;
  • Sequence section 3.1 .1 comprises [or consists essentially of 3.1 .1] that is (reverse) complementary to M1 .1 of M1 [can bind complementarily to P2.1 -hex],
  • Sequence Section 4.1 .1 comprises [or consists essentially of 4.1 .1] that is identical or substantially identical to M1 .5 of M1 [can complementally bind to P1 1 -ext], vii. a second template-dependent nucleic acid polymerase, in particular a DNA
  • Polymerase and optionally substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase (especially ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphates) and suitable cofactors.
  • substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase especially ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphates
  • suitable cofactors especially ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphates
  • a first primer extension product P1 .1-Ext. obtained in 5'-3 'orientation in addition to the sequence regions P1 .1 .2 and P1 .1 .1 comprises a synthesized region in the 5'-3' orientation, the sequence sections P1 .1 E4, P1 .1 E3 , P1 .1 E2 and P1 .1 E1, where P1 .1 E4 to the sequence section M1 .2 of the target sequence M1, P1 .1 E3 to M1 .3, P1 .1 E2 to M1 .4 and P1 .1 E1 to M1 .5 is substantially complementary.
  • a second primer extension product P2.1 -Ext is obtained, which in addition to the sequence area P2.1 .1 a synthesized area P2.1 -Ext. which is substantially identical to the target sequence M1 in the area adjacent to M1 .5 in FIG. 3 '.
  • the reaction conditions and / or the lengths or melting temperatures of P1 .1 .2 and possibly M1 .4, M1 .3, M1 .2 and M1 .1 of the first amplification step are selected such that P1 1-Ext with M1 or with P2.1 -xt can form a double strand, and P1 .1 -Ext can form a double strand with C1 .2 and the formation of the double strand from P1 1 -Ext with C1 .2 compared to the formation of the double strand from P1 1-Ext with P2 .1 text is preferred.
  • the invention may also be formulated as a method of amplifying a nucleic acid wherein a sample comprising a first nucleic acid polymer comprising a first target sequence M1 is contacted in a first amplification step with the following components:
  • a first template-dependent nucleic acid polymerase in particular a first DNA polymerase, and substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase (in particular ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphates) and suitable cofactors,
  • a first (right) oligonucleotide primer P1 .1 comprising, in the 5'-3 'orientation, in direct sequence the sequence segments P1 .1 .2 and P1 .1 .1, at least 3 ' segment of P1 .1 .1 can bind a section of M1 (essentially) sequence-specifically and the sequence section P1 .1 .2 can not bind to M1, and
  • P1 .1 (in particular in section P1 .1 .2) comprises modified nucleotide units, so that P1 .1 .2 can not serve as template for the activity of the first template-dependent nucleic acid polymerase;
  • a second (left) oligonucleotide primer P2.1 comprising at least one 3 ' segment which is (substantially) identical to one in 5' of the binding site of P1 .1.
  • M1 is essentially identical, or a binding site can bind the reverse complementary sequence on the opposite strand of M1 or the extension product of P1 .1 [also referred to as P1 .1-Ext, as P1 .1 E1];
  • a controller oligonucleotide C1 .2 which in the 5'-3 'orientation comprises the sequence sections C1 .2.3, C1 .2.2 and C1 .2.1 in direct sequence:
  • a third region (C1 .2.3) of the controller oligonucleotide which is substantially complementary to at least part of the synthesized region of the extension product of the first primer (P1 1 -Ext) formed in an amplification reaction, in other words the third region being identical to one Is the portion of M1 which is located at 5 'of the binding site of the first primer with respect to the polarity of the strand read [and is read first upon initiation of the polymerase of P1 .1, ie the third region of the controller is at least part of the polymerisation product of the first first primer [P1 .1 -xt],
  • a second region (C1 .2.2) of the controller oligonucleotide which is substantially complementary to the first region of the first primer oligonucleotide (P1 .1) (and identical at least to a portion of the binding site of the first primer on the target sequence M 1) and
  • a first region (C1 .2.1) of the controller oligonucleotide attached to the sequence section P1 .1 .2 of the first primer or the 5 'terminal region of the first primer can bind to an extension product of the first primer (P1 .1-Tex) formed in an amplification reaction, and
  • C1 .2 comprises nucleotide building blocks modified at least in C1 .2.1 C1 .2.3 so that C1 .2.1 can not serve as template for the activity of the template-dependent nucleic acid polymerase;
  • the sample is incubated with the above components under conditions permitting a first amplification to form amplification products comprising primer extension products of the first oligonucleotide primer (P1.1-Tex) and the second oligonucleotide primer (P2.1-Ext) containing the target sequence M or at least their proportions and corresponding complementary sequences include; and wherein the sample is subsequently or simultaneously brought into contact with the following components in a second amplification step:
  • Sequence section 3.1 .1 comprises [or substantially consists of 3.1 .1] which can bind (reversely) complementarily to the amplification product formed in the first amplification step, in other words: the sequence-specifically the 3 'terminal region of the extension product of the extension product of the first amplification reaction can bind second primer,
  • Sequence section 4.1 .1 comprises [or substantially consists of 4.1 .1] which can bind (reversely) complementarily to the amplification product formed in the first amplification step, in other words: the sequence-specifically the 3 'terminal region of the extension product of the extension product of the first amplification reaction can bind first primer,
  • G a second template-dependent nucleic acid polymerase, in particular a DNA
  • Polymerase and optionally substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase (especially ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphate) and suitable cofactors.
  • substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase especially ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphate
  • suitable cofactors especially ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphate
  • the sample is incubated with the above components under conditions permitting a second amplification to form amplification products comprising primer extension products of the third oligonucleotide primer (P3.1-Ext) and the fourth oligonucleotide primer (P4.1-Ext) containing the target sequence M or at least their proportions and corresponding complementary sequences.
  • P3.1-Ext primer extension products of the third oligonucleotide primer
  • P4.1-Ext fourth oligonucleotide primer
  • kits comprising the following components:
  • P1 .1 .2 comprises modified nucleotide units, so that P1 .1 .2 can not serve as template for the activity of a template-dependent nucleic acid polymerase;
  • oligonucleotide primer P2.1 which can sequence-specifically bind a sequence on the opposite strand of the sequence bound by the first oligonucleotide primer
  • C1 .2.3 can bind to the polymerization product of the primer P1 1-Ext]
  • ii. C1 .2.2 is complementary to P1 .1 .1 (and identical to M1 .1)
  • iii. C1 .2.1 is complementary to P1 .1 .2
  • C1 .2 in C1 .2.1 comprises modified nucleotide building blocks such that C1 .2.1 can not serve as template for the activity of the template-dependent nucleic acid polymerase;
  • a first template-dependent nucleic acid polymerase in particular a DNA polymerase, and optionally substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase (in particular ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphates) and suitable cofactors such as Mg salts;
  • a third (right) oligonucleotide primer P3.1 which is different from the first oligonucleotide primer P1 .1, in particular does not have its section P1 .1 .2, and which at the 3 'terminus comprises a sequence section 3.1 .1 [or substantially from 3.1. 1] which is (reverse) complementary to [Section M1.1] of the target sequence [M1];
  • a fourth (left) oligonucleotide primer P4.1 which comprises at the 3 'terminus a sequence segment 4.1 .1 [or consists essentially of 4.1 .1] which can sequence-specifically bind a sequence on the opposite strand of the sequence linked by the third oligonucleotide primer;
  • G a second template-dependent nucleic acid polymerase, in particular a DNA polymerase, and optionally substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase (in particular ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphates) and suitable cofactors.
  • substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase in particular ribonucleoside triphosphates or deoxyribonucleoside triphosphates
  • a further aspect of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid, wherein a sample which contains a nucleic acid comprising a first target sequence M1, in sequence 5'-3 'in immediate sequence, the sequence sections M1 .5, M1 .4, M1 .3, M1 .2 and M1 .1 is brought into contact in a first amplification step with the following components:
  • a first template-dependent nucleic acid polymerase in particular a DNA polymerase, and substrates of the template-dependent nucleic acid polymerase, a first (right) oligonucleotide primer P1 .1, in sequence 5'-3 'in immediate sequence, the sequence sections P1 .1 .2 and P1 .1 .1, wherein P1 .1 .1 has a [hybridizing] sequence complementary to M1 .1 and the sequence segment P1 .1 .2 can not bind to M1, and
  • P1 .1 (in particular in section P1 .1 .2) comprises modified nucleotide units, so that P1 .1 .2 can not serve as template for the activity of the first template-dependent nucleic acid polymerase;
  • oligonucleotide primer P2.1 which is (substantially) identical to M1 .5;
  • a controller oligonucleotide C1 .2, which in the 5'-3 'orientation comprises the sequence sections C1 .2.3, C1 .2.2 and C1 .2.1 in direct succession, C1 .2.3 being identical to a section M1 .2 of M1, which is in the 5 'direction of M1 .1, C1 .2.2 is complementary to P1 .1 .1 (and identical to M1 .1) and C1 .2.1 is complementary to P1 .1 .2,
  • C1 .2 in C1 .2.1 comprises modified nucleotide units such that C1 .2.1 can not serve as template for the activity of the template-dependent nucleic acid polymerase,
  • a. comprises a sequence section which
  • ii. is complementary to a sequence of M1 located on the sequence sections M1 .3 and M1 .4,
  • an aspect of the invention may be formulated as a method comprising the following steps:
  • a first amplification system comprising a first primer oligonucleotide, a second primer oligonucleotide, a controller oligonucleotide, a first DNA polymerase, and first polymerase (dNTPs) substrates and a suitable buffer solution
  • amplification system comprising a third primer oligonucleotide, a fourth primer oligonucleotide, a second thermostable polymerase, and second polymerase (dNTPs) substrates and suitable buffer solution.
  • a detection system is furthermore provided, insofar as the subject matter of the invention also encompasses the detection by the first and / or the second amplification system of amplified nucleic acid fragments, in particular with probes.
  • the reaction conditions of the first amplification used comprise at least one temperature step which permits hybridization and template-dependent primer extension of both primers of the first amplification system and at least one temperature step in which the first primer extension product of the second primer extension product participates of the controller oligonucleotide is separated.
  • the reaction conditions used do not allow spontaneous separation of the first primer Extension product from the second primer extension product in the absence of the controller oligonucleotide.
  • the first amplification is carried out until the desired amount of the first amplification product 1 .1 has been synthesized.
  • the properties of the components of the respective amplification system, the nucleic acid fragment comprising a first target sequence, and the reaction conditions used determine the course of the two amplification reactions.
  • the first amplification takes place with the assistance of the controller oligonucleotide.
  • the separation of the two synthesized primer extension products takes place at least in part depending on the sequence of the first primer extension product and its complementarity with the sequence of the controller oligonucleotide.
  • a second amplification fragment is amplified substantially without the involvement of the controller oligonucleotide.
  • both desired amplification products (amplification fragment 1 .1 and amplification fragment 2.1) can be formed, as well as their intermediates (intermediates).
  • the composition of the intermediates depends essentially on the provided components of the first and second amplification systems.
  • Fig. 1 shows schematically the components of certain embodiments of the amplification method according to the invention in a heterogeneous format; A) of the first amplification system; B) of the second amplification system.
  • Fig. 2 shows schematically the components of certain embodiments of the first
  • FIG. 3 shows a temperature profile of certain embodiments of the method according to the invention in heterogeneous format; An aliquot is transferred after amplification 1 .1 in amplification 2.1. This results in a dilution of the first amplification fragments.
  • FIG. 4 shows a temperature profile of certain embodiments of the method according to the invention in heterogeneous format; Components of the second amplification system are added. There is no significant dilution of fragments generated by A-1.1.
  • Fig. 5 shows the components of certain embodiments of the amplification method according to the invention in a homogeneous format; A) of the first amplification system; B) of the second amplification system.
  • Fig. 6 to 1 1 shows temperature profiles of embodiments of the invention
  • Fig. 12 schematically shows (A) the structure of a first primer oligonucleotide; (B) the complementary binding of the first primer to the nucleic acid chain to be amplified; (C) the complementary binding of the first primer to the nucleic acid chain to be amplified and the extension of the primer.
  • Fig. 14 shows schematically the synthesis of the second primer extension product
  • Fig. 15 shows schematically the synthesis of the third and fourth primer extension products
  • P3.1 -ext part 1 extension product of P3.1 synthesized on P2.1-Ext as template (intermediate);
  • P4.1 -Ext part 1 extension product of P4.1 synthesized on P1.1 -Ext as template (intermediate);
  • P3.1 -Ext extension product of P3.1 synthesized using P4.1 Ext part 1 or at P4.1 -Ext as template;
  • P4.1-Ext extension product of P4.1 synthesized using P3.1 -xt part 1 or as template at the P3.1 -xt
  • Figs. 27 to 31 schematically show the components of various embodiments of the first amplification system; (A) components of the first amplification system; (B) Components of the second amplification system.
  • Figures 27-29 the fourth primer is identical to the second primer, the third primer is different from the first primer. Its binding may be shifted relative to the first primer.
  • Fig. 30 the fourth primer is different from the second primer. 3 ' end of the fourth primer is optionally shifted with respect to the 3 ' end of the second primer.
  • the fourth primer comprises copyable sequence segments which are not complementary to the target sequence or do not bind to P1 .1-Ext.
  • FIG. 31 The third primer comprises copyable sequence segments which are not complementary to the target sequence or do not bind to P2.1-Ext.
  • Fig. 32 shows schematically (A) a first primer oligonucleotide and (B) a nucleic acid to be amplified (P1 1 -Ext and P2.1 -Ext);
  • Fig. 33 shows schematically the strand displacement by a controller oligonucleotide
  • Fig. 34 shows schematically the interactions between components in a reaction of the method according to the invention; The intermediate step of separating the second primer extension product from the double-stranded complex consisting of the first primer extension product and controller oligonucleotide is apparent.
  • Fig. 35 shows schematically an amplification by simultaneous synthesis of two strands and separation of the synthesized amplification fragments
  • Figs. 36 to 49 show the results of example experiments.
  • Figures 50 and 51 schematically show certain embodiments of the preparation of a starting nucleic acid chain starting from genomic DNA.
  • FIGS. 52 to 54 schematically show certain embodiments of the ampification according to the invention.
  • Figures 55 to 57 schematically show certain embodiments of the topography of the components of the first amplification system and the second amplification system.
  • FIGS. 58 to 59 schematically show certain embodiments of the possible localization regions for oligonucleotide probes:
  • Fig. 60 shows schematically certain embodiments of the localization of probe segments, which can bind predominantly complementary to the third (and possibly the first) primer extension product (P3.1 -Ext and P1 .1-Ext).
  • FIG. 61 schematically shows certain embodiments of the localization of probe segments which can bind predominantly complementary to the fourth (and possibly the second) primer extension product (P4.1 -Ext and P2.1-Ext).
  • Figs. 62-67 schematically show certain embodiments of probes.
  • FIGS. 68-71 schematically show certain embodiments of the localization of a target sequence 1-3 in the starting nucleic acid 1.1, an amplification fragment 1.1 (P1 .1-Ext and P2.1-ext), and the second amplification fragment 2.1 (P3. 1-Ext and P4.1 -xt).
  • a method for amplification comprises the steps:
  • first primer oligonucleotide hybridizing a first primer oligonucleotide to the 3 'segment of a template nucleic acid fragment (template strand, starting nucleic acid chain) of a first nucleic acid to be amplified which comprises a target sequence
  • first primer oligonucleotide comprises the following regions: a first region capable of binding sequence-specifically to the 3 'segment of a template strand of the first nucleic acid to be amplified and being complementary to at least a portion of the target sequence;
  • a second region which adjoins the 5 'end of the first region or is linked via a linker, which second region can be bound by a controller oligonucleotide and by a polymerase used for the first amplification under the selected reaction conditions in the Essentially remains uncopied;
  • a second region that is substantially complementary or fully complementary to the first region of the first primer oligonucleotide and / or the first primer extension product
  • a third region which is substantially complementary or fully complementary at least in part to the polymerase-synthesized portion of the first primer extension product
  • controller oligonucleotide does not serve as a template for primer extension of the first primer oligonucleotide
  • the controller oligonucleotide comprises a sequence segment which is identical or substantially identical to a strand of the template strand (the target sequence), and
  • the controller oligonucleotide binds to the first region of the first primer extension product
  • the controller oligonucleotide binds to the second region of the first primer extension product and at least partially to the synthesized region of the first primer extension product displacing complementary portions of the template strand of the first nucleic acid to be amplified; wherein the polymerase synthesized region of the first primer extension product which is the second primer Oligonucleotide complementary segment of the first primer extension product is single-stranded under the reaction conditions;
  • Extension product (obtained in step 2.D, P4.1 -ext part 1), wherein the third primer oligonucleotide comprises a first region substantially sequence-specific to a segment of the fourth primer extension product (P4.1-Ext part 1) can bind; 2.G) extension of the third primer oligonucleotide by a second polymerase using the fourth primer extension product (P4.1-Ext Part 1) as a template to give a complete third primer extension product (P3.1-Ext), the third primer extension product (P3.1 -Ext) and the fourth primer
  • Extension product (P4.1 -Ext part 1) are present as a double strand
  • step 2B P3.1 -ext part 1
  • the fourth primer oligonucleotide comprises a first region capable of substantially sequence-specific binding to the polymerase-synthesized region of the third primer extension product
  • step 2I, P4.1 -Ext hybridizing a third primer oligonucleotide to the complete fourth primer extension product (obtained in step 2I, P4.1 -Ext), wherein the third primer oligonucleotide comprises a first region substantially sequence-specific to a segment of the fourth Primer extension product (P4.1-Ext);
  • this aspect of the invention may also be formulated as a method of amplifying a nucleic acid (Figs. 1, 5):
  • first amplification for the amplification of first amplification fragments 1.1 comprising a target sequence
  • first amplification comprises the following steps: a) hybridization of a first primer oligonucleotide to the 3 'segment of a strand of a nucleic acid to be amplified, the nucleic acid chain to be amplified comprises a target sequence,
  • first primer oligonucleotide comprises the following ranges:
  • a first primer region in the 3 ' segment of the first primer oligonucleotide which can bind sequence-specifically to a strand of a nucleic acid chain to be amplified
  • controller oligonucleotide c) binding of the controller oligonucleotide to the polynucleotide tail of the second region of the first extended primer oligonucleotide, wherein the controller oligonucleotide comprises the following regions:
  • a second single-stranded region which is substantially complementary to the first region of the first primer oligonucleotide and can bind to it
  • a third single-stranded region which is substantially complementary to at least one segment of the polymerase-synthesized extension product of the first primer extension product
  • controller oligonucleotide does not serve as a template for primer extension of the first primer oligonucleotide
  • extension of the second oligonucleotide primer with polymerase to form a second primer extension product, wherein the extension is up to and including the first primer region of the first primer oligonucleotide and this first primer region is copied from the polymerase, wherein the polynucleotide Tail of the second region remains uncopied; h) repeating steps a) -g) until the desired level of amplification is achieved.
  • a second amplification which is carried out by using, in the first amplification reaction, first amplification fragments 1 .1 as templates and using a third primer and a fourth primer and a second polymerase, and suitable cofactors for propagating a second amplification Fragments 2.1 a target sequence or at least a segment of the target sequence (or its complementary sequence), where
  • the third primer oligonucleotide can bind to the second primer extension product and / or to the fourth primer extension product in a substantially sequence-specific manner and can be extended by the second polymerase,
  • the fourth primer oligonucleotide can bind to the first primer extension product and / or to the third primer extension product in a substantially sequence-specific manner and can be extended by the second polymerase,
  • the resulting primer extension products starting from the third and fourth primers can serve as templates for an exponential amplification of the second amplification fragments 2.1.
  • a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that the second amplification is a PCR (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction, also called PCR amplification) and is carried out under such conditions as an amplification of second amplification fragments 2.1 comprehensively allows a target sequence.
  • PCR polymerase chain reaction, polymerase chain reaction, also called PCR amplification
  • a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that at least the second amplification is carried out by PCR amplification in the presence of a detection system comprising an oligonucleotide probe.
  • a method according to any of the above aspects may be characterized in that the second amplification is a PCR amplification and is carried out under conditions which include at least one step in which primers are hybridized and / or extended by polymerase, and at least a step in which the resulting primer extension products are converted into single-stranded form (denatured).
  • a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that the second amplification is a PCR amplification and is carried out until the desired amount of amplification fragments 2.1 are synthesized.
  • a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that the third primer oligonucleotide of the second amplification in the 3 ' segment of the second primer extension product and / or in the 3 ' segment of the fourth primer
  • Extension product and can be extended by a polymerase.
  • a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that the fourth primer oligonucleotide of the second amplification in the 3 ' segment of the first primer extension product and / or in the 3 ' segment of the third primer
  • Extension product and can be extended by a polymerase. Furthermore, a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that the third primer oligonucleotide of the second amplification binds with its 3 ' segment to the second primer extension product and / or the fourth primer extension product and is extended by a polymerase can.
  • a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that the fourth primer oligonucleotide of the second amplification binds with its 3 ' segment to the first primer extension product and / or the third primer extension product and is extended by a polymerase can.
  • a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that the extension product of the third primer oligonucleotide and / or the extension product of the fourth primer oligonucleotide of the second amplification comprises at least one segment of the target sequence or its complementary sequence.
  • the third single-stranded region of the controller oligonucleotide is substantially complementary to the segment of the polymerase-synthesized extension product of the first primer extension product that immediately adjoins the first primer region.
  • a method according to one of the above-mentioned aspects may be characterized in that the displacement of the strand complementary to the first primer extension product of the nucleic acid to be amplified takes place until this complementary strand of the nucleic acid to be amplified is detached from the first primer extension product.
  • step (f) of the method is modified to include hybridizing a second oligonucleotide primer to the first primer extension product, wherein at least a partial displacement of the controller -Oligonukleotides from the bond with the first extension product by strand displacement occurs.
  • step (g) of the method is modified to include displacement of the controller oligonucleotide from binding with the first primer extension product with the participation of the polymerase.
  • a method according to any of the above aspects may be characterized in that step (h) of the method is modified to include binding of the controller oligonucleotide to the uncopied polynucleotide tail of the first extended primer oligonucleotide and displacement of the second Primer extension product from binding to the first primer extension product, with simultaneous formation of a complementary duplex with a segment of the first specific extension product of the first primer oligonucleotide.
  • a method according to any one of the above aspects may be characterized in that the repetition of the steps is carried out under conditions which allow the repetition of steps (a) to (g).
  • a method according to any one of the above aspects may be characterized by comprising simultaneously amplifying the first and second primer extension products in an exponential reaction using the first and second primer oligonucleotides and the controller oligonucleotide, wherein the formed primers Extension products act as templates for mutual synthesis.
  • the yield of individual products and intermediates depends on several factors. For example, higher concentrations of individual primers generally favor the yield of products / intermediates. Furthermore, the formation of products / intermediates can be influenced by the choice of the reaction temperature and the binding affinity of individual reactants to each other (affinity of binding of individual primers to their complementary primer binding sites within template strands): in general, longer oligonucleotides, for example, bind better at higher temperatures as shorter oligonucleotides, CG content may also play a role in complementary sequence segments: CG-richer sequences also bind stronger at higher temperatures than AT-rich sequences. Furthermore, modifications such as MGB or 2-amino-dA or LNA can increase the binding strength of primers to their respective complementary segments, which also results in preferential binding of primers at higher temperatures.
  • Hybridizing a first primer oligonucleotide (P1.1) to a nucleic acid to be amplified with a target sequence (either starting nucleic acid 1 .1 or P2.1-Ext), wherein the first primer oligonucleotide (P1.1) comprises the following ranges:
  • a first region which can bind sequence-specifically to a region of the nucleic acid to be amplified (P2.1 E1),
  • a second region (P1 .1.2) which connects to the 5 'end of the first region or is connected via a linker, wherein the second region can be bound by a controller oligonucleotide, and remains essentially uncoated for the polymerase used under the chosen reaction conditions;
  • first primer extension product (P1 .1-Ext) which comprises a synthesized region in addition to the first primer oligonucleotide (P1.1) (P1.1 E1 to P1 .1 E4), which is substantially complementary to the nucleic acid to be amplified or to the target sequence, wherein the first primer extension product and the nucleic acid to be amplified are present as a double strand;
  • Binding of a controller oligonucleotide (C1 .2) to the first primer extension product (P1.1 -Ext), wherein the controller oligonucleotide (C1.2) comprises the following ranges:
  • a second region (C1.2.2) which is complementary to the first region of the first primer oligonucleotide (P1.1 .1), and
  • controller oligonucleotide (C 1 .1) does not serve as a template for a primer extension of the first primer oligonucleotide (P1 .1), and the controller oligonucleotide (C 1,1) to the first primer extension product (P1.1 E6, P1.1 E5, P1.1 E4) while displacing the region (P2.1 E1, P2.1 E2) which is complementary to this region, of the nucleic acid to be amplified;
  • the invention comprises the following aspects: A method according to aspect 1, wherein the nucleic acid fragment comprising a target sequence is provided in single-stranded form.
  • nucleic acid fragment comprising a target sequence in double stranded form comprising a nucleic acid fragment including a first target sequence, the start nucleic acid chain, and a complementary nucleic acid fragment
  • this double stranded nucleic acid fragment is converted to single stranded form prior to the first amplification.
  • temperatures which allow a predominantly complementary binding of primers to complementary sequence segments of the synthesized strands and a primer extension by the second polymerase.
  • temperature includes ranges from 20 ° C to about 80 ° C.
  • the first primer oligonucleotide comprises in its first region a sequence segment which is capable of complementary binding to the first target sequence in its 3 ' segment.
  • the second primer oligonucleotide comprises in its 3 ' region a sequence segment which is substantially identical to a portion of the first target sequence, said portion being in the 5 ' segment of the target sequence
  • controller oligonucleotide comprises in its second and third regions a sequence segment which is substantially identical to a portion of the target sequence.
  • the third primer oligonucleotide comprises in its 3 ' region a sequence segment which is capable of substantially complementary binding to the second primer extension product of the first amplification fragment 1.1.
  • the third primer oligonucleotide comprises in its 3 ' region a sequence segment which is capable of substantially complementary binding to the second primer extension product of the first amplification fragment 1.1, and further includes that 3 ' region first segment complementary segment.
  • the fourth primer oligonucleotide comprises in its 3 ' region a sequence segment which is capable of substantially complementary binding to the first primer extension product of the first amplification fragment 1.1.
  • the fourth primer oligonucleotide comprises in its 3 ' region a sequence segment which is capable of substantially complementary binding to the first primer extension product of the first amplification fragment 1.1 and further comprising a segment of that 3 ' region which is substantially identical to a portion of the first target sequence, this portion being in the 5 ' region of the target sequence
  • Primer extension products (P4.1 -Ext part 1) and (P4.1 -Ext) are identical.
  • Primer extension products (P4.1-Ext Part 1) and (P4.1 -Ext) are identical, but differ the primer extension product of the second and fourth primer oligonucleotide.
  • Primer extension products (P3.1 -Ext part 1) and (P3.1 -Ext) are identical.
  • the nucleic acid to be amplified in the first amplification comprises a first target sequence.
  • at least one start nucleic acid chain 1.1 is added to the reaction which comprises a target sequence and can serve as template for the synthesis of the first amplification fragment.
  • the synthesized primer extension products of the first amplification (the first amplification fragment 1 .1) comprise the target sequence.
  • This first amplification fragment 1 .1 can serve as start nucleic acid chain 2.1 with a template function for the second amplification.
  • the primer extension products synthesized in the second amplification (P3.1-Ext and P4.1-Ext) (the second amplification fragment 2.1) comprise at least portions of the first target sequence.
  • substantially complementary in the context of the present disclosure means that two nucleic acids, in particular their mutually complementary regions, have not more than 5, 4, 3, 2, or 1 mismatches to one another.
  • the steps of the first amplification are repeated at least twice.
  • the second amplification is based on a copy number of the first amplification fragment (1.1). is started, which is present in the range of 10 to 1 E12, in particular from 100 to 1 E10, in particular from 10E3 to 10E9.
  • the steps of the second amplification are repeated until the amplification fragment (2.1) is present in a copy number in the range from 10E5 to 1E16, in particular from 10E5 to 1E14, in particular 10E6 to 1 E14.
  • the steps of the second amplification are repeated at least twice.
  • the detection system comprises at least one
  • Oligonucleotide probe labeled with a fluorescent reporter Oligonucleotide probe labeled with a fluorescent reporter.
  • the detection system comprises at least one
  • Oligonucleotide probe labeled with a fluorescent reporter and a fluorescence quencher.
  • the detection system comprises at least one
  • An oligonucleotide probe labeled with a donor fluorophore capable of forming a FRET pair with the fluorescent reporter is an oligonucleotide probe labeled with a donor fluorophore capable of forming a FRET pair with the fluorescent reporter.
  • an oligonucleotide probe comprises a sequence segment which is substantially complementary to at least one of the primer extension products formed (P1 .1-Ext, P2.1-Ext, P3.1-Ext, P4.1-Ext) and which is at least hybridize to one of the formed primer extension products under suitable conditions (hybridization conditions).
  • this sequence segment is complementary to the first and / or the third primer extension product.
  • this sequence segment is complementary to the first and / or the third primer extension product, wherein the oligonucleotide probe can bind complementary in the 3 ' segment of the respective primer extension product which is not complementarily bound by the controller oligonucleotide.
  • this sequence segment is complementary to the second and / or the fourth primer extension product.
  • this sequence segment of the oligonucleotide probe comprises a length which is in the range between 10 nucleotides and 50, in particular between 15 and 40, in particular between 15 and 30 nucleotides.
  • this sequence segment of the oligonucleotide probe does not comprise a sequence region that is substantially complementary to the controller oligonucleotide. In a further embodiment, this sequence segment of the oligonucleotide probe comprises a sequence region which is substantially complementary to the controller oligonucleotide, the length of this segment being less than 20 nucleotides, in particular less than 15 nucleotides, in particular less than 10 nucleotides.
  • this sequence segment of the oligonucleotide probe does not comprise a sequence region that is substantially complementary to one of the primer oligonucleotides.
  • this sequence segment of the oligonucleotide probe comprises a sequence region which is substantially complementary to one of the primer oligonucleotides, the length of this segment being less than 20 nucleotides, in particular comprising less than 15 nucleotides, in particular less than 10 nucleotides, in particular less than 5 nucleotides.
  • this sequence segment of the oligonucleotide probe does not comprise a sequence region that is substantially identical to the sequence of the third region of the controller oligonucleotide.
  • this sequence segment of the oligonucleotide probe comprises a sequence region which is substantially identical to the sequence of the third region of the controller oligonucleotide, the length of this segment being less than 20 nucleotides, in particular less than 15 nucleotides, in particular less than 10 nucleotides.
  • the controller oligonucleotide comprises one of the following components (a fluorescence reporter and / or a fluorescence quencher and / or a donor fluorophore), wherein at least one of these components is located in the third region of the controller oligonucleotide.
  • the oligonucleotide probe is at least partially cleavable by a 5 ' -3 ' nuclease.
  • an oligonucleotide probe comprises a sequence segment which is substantially complementary to the target sequence or its portion encompassed by one of the amplification products, the length of this segment being in the range of between 5 and 50 nucleotides, in particular between 10 and 40, in particular between 15 and 30 nucleotides.
  • an oligonucleotide probe does not comprise a sequence segment substantially complementary to the target sequence or its complementary strand.
  • an oligonucleotide probe comprises a sequence segment not substantially complementary to the target sequence or its complementary strand.
  • the binding of the oligonucleotide probe to the respective complementary segment of the primer extension product formed under suitable hybridization conditions leads to formation of a double strand.
  • the hybridization conditions are present during the process.
  • the reaction is illuminated with light of a suitable wavelength for the generation of a fluorescence signal and the detection of the fluorescence signal from the fluorescence reporter, whereby the intensity of the fluorescence signal is measured.
  • the detection of the fluorescence signal is carried out with suitable optical / physical means, in which either the increase of the fluorescence signal or the decrease of the fluorescence signal is measured.
  • suitable sensors By means of suitable sensors, the intensity of the fluorescence signal can be converted into measured values which, after appropriate calibration, make it possible to determine whether a desired target sequence is present in the reaction mixture or not.
  • reporter-quencher pair An essential aspect of the fluorescence detection system is the reporter-quencher pair.
  • the quencher When the quencher is in close proximity to the reporter, no signal is emitted upon exposure to the excitation light.
  • reporter and quencher molecules are held in close proximity due to a complementary star sequence, no fluorescence signal appears even under illumination.
  • reporters and quenchers are placed in a spatial distance that causes the quencher to be so far from the reporter molecule that the reporter molecule will emits fluorescence radiation when the reaction mixture is irradiated with an excitation light source. The distance between reporter and quencher depends on the molecules used.
  • the emission of light after irradiation of the fluorescence reporter is then reduced or almost completely reduced when the quencher and reporter are at a distance of less than 25 nucleotides from each other.
  • This removal can be effected either by the nucleotide sequence or by special spacing molecules, such as linkers or spacers.
  • the fluorescent reporter can form a specific reporter-donor (FRET) pair with a donor fluorophore capable of transmitting the absorbed energy to fluorescent reporters by fluorescence resonance energy transfer (FRET) ,
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a reporter-donor pair comprising a fluorescent reporter and a matching donor fluorophore and forming a fluorescence resonance energy transfer pair may be designed so that only one of the partners of such a FRET pair is coupled to the oligonucleotide probe and the other partner is coupled to the controller oligonucleotide.
  • Both fluorescent reporter and donor fluorophore are derived from the respective oligonucleotide coupled that in the non-hybridized state of the oligonucleotide probe, the donor fluorophore is unable to transfer the absorbed energy to the fluorescent reporter.
  • the controller oligonucleotide is a component of the detection system and comprises a fluorescent reporter and / or a fluorescence quencher and / or a donor fluorophore.
  • a fluorescent reporter and / or a fluorescence quencher and / or a donor fluorophore By simultaneous hybridization of the controller oligonucleotide to the synthesized first or third primer extension product and the oligonucleotide probe to the 3 ' segment of the same first and / or third primer extension product, binding is made to adjacent sequence positions of the first and / or third primer Extension product, resulting in spatial proximity of the donor fluorophore and the fluorescence reporter. This reduces the distance between the fluorescent reporter and donor fluorophore so much that FRET can take place from donor fluorophore to fluorescent reporter. This leads to the generation of a fluorescence signal of the fluorescence reporter and results in a detectable increase in the fluorescence signal of the fluorescence reporter.
  • the distance between the donor fluorophore and the fluorescent reporter after hybridization should be less than 25, in particular less than 15 and in particular less than 5 nucleotides.
  • the wavelength of the light upon excitation is absorbed by the donor fluorophore and transferred to the reporter, thereby emitting light that can be detected.
  • the following embodiments are preferred, wherein either the fluorescence reporter or the fluorescence quencher or the donor fluorophore are coupled either to the controller oligonucleotide, in particular in the third region of the controller oligonucleotide:
  • the coupling to the controller oligonucleotide preferably takes place in the third region of the controller oligonucleotide
  • the coupling to the controller oligonucleotide preferably takes place at the 5 ' end or the third region or in its vicinity, for example 2 to about 10 nucleotides from the 5 ' end of the third region
  • Coupling to the oligonucleotide probe is preferably carried out in the middle region of the oligonucleotide probe,
  • - Coupling to the oligonucleotide probe is preferably carried out in the 3 ' segment of the oligonucleotide probe.
  • the distance between both elements of a hybridized FRET pair of oligonucleotides hybridized to the first primer extension product is less than about 30 nucleotides.
  • the oligonucleotide probe comprising a complementary 3 ' segment to one of the primer extension products is so modified that the polymerase is unable to extend that 3 ' end.
  • the oligonucleotide probe comprising a complementary 3 ' segment to one of the primer extension products so that the polymerase is able to extend that 3 ' end, the oligonucleotide probe serving as a PCR primer.
  • a method for detecting amplification wherein two or more nucleic acid chains are amplified in which a specific detection system is used for each nucleic acid chain to be amplified.
  • Method for detecting amplification wherein two or more nucleic acid chains to be amplified are amplified, in which the detection of the amplification of at least two nucleic acid chains to be amplified is effected by a uniform detection system.
  • the amplification comprises an asymmetric amplification of one of the primer extension products.
  • the excitation of the fluorescence reporter and the measurement of the fluorescence signal of the fluorescence reporter takes place during the amplification.
  • the excitation of the donor fluorophore and the measurement of the fluorescence signal of the fluorescence reporter takes place during the amplification.
  • the excitation of the fluorescence reporter and the measurement of the fluorescence signal of the fluorescence reporter takes place after the amplification.
  • the oligonucleotide probe is a DNA oligonucleotide.
  • the oligonucleotide probe is a DNA oligonucleotide and the 3 ' end is blocked so that the polymerase can not extend it.
  • the oligonucleotide probe comprises a complementary sequence segment to the first and / or the third primer extension product, this sequence segment comprising a length of 8 to about 60 nucleotides.
  • An oligonucleotide probe comprises a complementary sequence segment to the 3 ' segment of the first and / or third primer extension product which is not bound by the controller oligonucleotide, this segment being from 8 to about 40 nucleotides in length.
  • An oligonucleotide probe comprising at least one further Modifkation selected from the following group: linker (such as HEG, C3, C6), phosphate-sugar backbone modifications (such as PTO, 2 '-0-Me, RNA, PNA, LNA modifications) ,
  • the third primer oligonucleotide and / or the fourth primer oligonucleotide have a second region which adjoins the 5 'end of the first region or is linked via a linker, the second Area can not bind complementary to the first primer extension product or to the second primer extension product.
  • the second region of the third and / or fourth primer oligonucleotide lies in the 5 ' direction from the first region of the third and / or fourth primer oligonucleotide.
  • the third primer oligonucleotide and / or the fourth primer oligonucleotide comprises a barcode sequence.
  • the separation of the double strand from the first primer extension product and the fourth primer extension product and the double strand from the second primer extension product and the third primer extension product is carried out by thermal denaturation, in particular in a Temperature in the range of 85 ° C to 105 ° C.
  • the first polymerase is capable of strand displacement during synthesis.
  • the second polymerase is a thermostable polymerase.
  • the first polymerase and the second polymerase are identical.
  • the first primer oligonucleotide and the third primer oligonucleotide are substantially identical.
  • the second primer oligonucleotide (P2.1) and the third primer oligonucleotide (P4.2) are substantially identical.
  • substantially identical in the context of the invention means in particular that two nucleic acid sequences with not more than 5, 4, 3, 2, or 1 Mismatches to each other.
  • the reaction conditions of the first amplification are selected such that no spontaneous dissociation of the first amplification product can occur.
  • the second amplification is carried out at at least two temperatures, wherein at a first temperature the hybridization and extension of the third and / or fourth primer oligonucleotide to the first and / or second and / or third and third or fourth primer extension product, and at a second temperature separation of the resulting duplex.
  • the second amplification is carried out at at least three temperatures, wherein at a first temperature, the hybridization of the third and / or fourth primer oligonucleotide to the first and / or second and / or third and / or fourth primer extension product takes place, at a second temperature the extension of the third and / or fourth primer, and at a third temperature the separation of the resulting double strands.
  • the first amplification and the second amplification are carried out in the same reaction batch.
  • the second polymerase, the third primer oligonucleotide and / or the fourth primer oligonucleotide are activatable, and / or the controller oligonucleotide is deactivatable.
  • Activatable polymerases may be, for example, reversible inactivated polymerases such as thermostable polymerase (hot-start polymerase) or polymerases which are reversibly inactivated by an antibody or a chemical modification.
  • reversible inactivated polymerases such as thermostable polymerase (hot-start polymerase) or polymerases which are reversibly inactivated by an antibody or a chemical modification.
  • Activatable primers may be reversible inactivated primer, for example oligonucleotides with a protected 3 'OH group, wherein the protecting group in particular by a polymerase with 5' - exonuclease activity is removable. It would be advantageous in the first amplification to use a polymerase without 5 ' exonuclease activity.
  • the controller oligonucleotide can be inactivated or cleaved, for example, by a polymerase with 5 ' exonuclease activity.
  • the controller oligonucleotide may also be cleaved and thereby removed by other enzymatic or chemical methods prior to the second amplification.
  • the first polymerase is inactivated before carrying out the second amplification. This can be achieved, for example, by thermal denaturation, when the first polymerase is a non-thermostable polymerase.
  • the first amplification is carried out in a first reaction batch and the second amplification in a second reaction batch.
  • an aliquot of the first reaction mixture is added to the second reaction mixture.
  • the complete first reaction batch is introduced into the second reaction mixture.
  • the third portion of the controller oligonucleotide is substantially complementary to the portion of the synthesized portion of the first primer extension product that immediately adjoins the primer oligonucleotide portion of the first primer extension product.
  • this improves the sequence-specific displacement of the nucleic acid to be amplified.
  • the controller oligonucleotide comprises a fourth region capable of substantially sequence-specific binding to the 3 ' region of the third primer oligonucleotide.
  • the fourth region can lie within the second region and / or the third region of the controller oligonucleotide or include sequence segments of the second and / or third region, wherein the fourth region in particular has a length of 9 to 30 nucleotides, in particular 10 to 20 Nucleotides, or 12 to 16 nucleotides.
  • substantially sequence-specific in the context of the present disclosure means that the mutually complementary regions of the primer oligonucleotide and the nucleic acid to be amplified have not more than 5, 4, 3, 2, or 1 mismatches.
  • the controller oligonucleotide comprises one or more nucleotide modifications designed to prevent the extension of a primer bound to the controller oligonucleotide.
  • nucleotide modifications designed to prevent the extension of a primer bound to the controller oligonucleotide.
  • several 2 '-0-alkyl modification can block or prevent such an extension.
  • the controller oligonucleotide comprises at least 5 such modifications, more preferably at least 10 modifications.
  • the controller oligonucleotide consists entirely of nucleotide modifications.
  • the portion of the polymerase-synthesized portion of the first primer extension product that is substantially complementary to the third portion of the controller nucleotide has a length in the range of 5 nucleotides to 70 nucleotides.
  • the third single-stranded region of the controller oligonucleotide is fully complementary to the 5 ' segment of the first primer extension product, the length of this complementary sequence segment being of at least 3 to 70 nucleotides, or of at least 5 to 50 nucleotides , in particular embodiments of 5 to 40 nucleotides, of 5 to 30 nucleotides, in particular of 5 to 20 nucleotides.
  • the first amplification is carried out essentially isothermally.
  • the second amplification is carried out at three temperatures, wherein at the first temperature the hybridization of the third or fourth primer oligonucleotide and optionally the initial extension of the primer is performed, and at a second temperature the complete Extension of the primers and at a third temperature the separation of formed primer extension products from their respective template strands.
  • the first temperature is in the range of 25 ° C to 65 ° C
  • the second temperature in the range of 65 ° C to 80 ° C
  • the third temperature in the range of 85 ° C to 105 ° C.
  • the nucleic acid to be amplified has a length in the range from 20 nucleotides to 300 nucleotides.
  • the first primer oligonucleotide has a length in the range of 15 nucleotides to 100 nucleotides.
  • the second primer oligonucleotide has a length in the range of 15 nucleotides to 100 nucleotides.
  • the controller oligonucleotide has a length in the range from 20 nucleotides to 100 nucleotides.
  • the third primer oligonucleotide has a length in the range of 15 nucleotides to 60 nucleotides.
  • the fourth primer oligonucleotide has a length in the range of 15 nucleotides to 60 nucleotides.
  • the third primer oligonucleotide has at least one nuclease-resistant nucleotide modification, for example, a PTO (phosphorothioate) or 2 '-0-alkyl modification.
  • the fourth primer oligonucleotide has at least one nuclease-resistant nucleotide modification, for example, a PTO or 2 '-0-alkyl modification.
  • the first primer oligonucleotide in the second region is a modification or several modifications in particular immediately after the first region of the first primer oligonucleotide which stops / prevents the polymerase used from copying the second region.
  • the first primer oligonucleotide in the second region is a modification or several modifications in particular immediately after the first region of the first primer oligonucleotide which stops / prevents the polymerase used from copying the second region.
  • only the first region of the first primer oligonucleotide is thereby copied.
  • nucleotide modifications which, while capable of complementary binding to the first primer extension product, are not accepted by the polymerase as a template.
  • nucleotide modifications set nucleotide compounds with modified phosphate-sugar backbone moieties, for example, 2 '-0-alkyl-RNA modifications (for example, 2 - OMe), LNA modifications or morpholino Modifkationen is generally prevents the. Presence of such modifications in one strand of a DNA-dependent polymerase upon reading such a strand. The number of such modifications may be different, usually few modifications (between 1 and 20) may be sufficient to prevent a polymerase from reading such a strand.
  • nucleotide modifications can be used, for example, at or about the binding site of the first primer oligonucleotide to the controller oligonucleotide and / or as constituents of the second region of the first primer oligonucleotide.
  • kit for carrying out the method according to the invention according to the aspects described above or their specific embodiments or alternatives.
  • the kit according to the invention comprises:
  • a first primer oligonucleotide having the following ranges:
  • a second region connected to the 5 'end of the first region or linked via a linker, wherein the second region can be bound by a first controller oligonucleotide and one for the Amplification used polymerase remains essentially unkopiert under the selected reaction conditions;
  • first primer oligonucleotide can be extended by a polymerase to a first primer extension product comprising a synthesized region in addition to the first primer oligonucleotide;
  • the second primer oligonucleotide comprises a region capable of sequence-specific binding to the synthesized region of the first primer extension product and can be extended from a polymerase to a second primer extension product which is adjacent to the second primer Oligonucleotide comprises a synthesized region
  • controller oligonucleotide comprising the following ranges:
  • a second region which is substantially complementary or complete to the first region of the first primer oligonucleotide
  • a third region that is substantially complementary or fully complementary to at least a portion of the synthesized region of the first primer extension product
  • controller oligonucleotide does not serve as a template for a primer extension of the first primer oligonucleotide, and the controller oligonucleotide is attached to the primer
  • Extension product can bind under displacement of the complementary region of the second primer extension product
  • a third primer oligonucleotide wherein the third primer oligonucleotide comprises a first region capable of sequence-specific binding to a segment of the second primer extension product and can be extended from a polymerase to a third primer extension product (P3.1-Ext) which comprises a synthesized region adjacent to the third primer oligonucleotide; and
  • a fourth primer oligonucleotide wherein the fourth primer oligonucleotide comprises a first region capable of sequence-specific binding to the synthesized region of the first primer extension product, and extendable from a polymerase to a fourth primer extension product which is adjacent to the fourth primer - Oligonucleotide comprises a synthesized region.
  • the kit further comprises at least one polymerase.
  • the kit comprises a first polymerase designed to extend the first and second primer oligonucleotides, and a second polymerase designed to extend the third and fourth primer oligonucleotides.
  • the first polymerase has no 5 ' exonuclease activity and the second polymerase has no 5 ' exonuclease activity.
  • the second polymerase may be a thermostable polymerase.
  • the second polymerase, the third primer oligonucleotide and / or the fourth primer oligonucleotide is activatable, and / or the controller oligonucleotide is deactivatable.
  • kit according to the above aspect for carrying out the method according to the invention according to the above-described aspects or their specific embodiments or alternatives is provided.
  • the combination according to the invention comprises two amplification processes to be carried out in succession.
  • the first partial amplification the first amplification procedure
  • nucleic acid chains comprising a target sequence are amplified.
  • This second partial amplification will in many cases be a conventional PCR.
  • the amplification proceeds from the target nucleic acids or nucleic acids comprising the target nucleic acids which were amplified in the first partial amplification.
  • PCR fragments are amplified.
  • these PCR fragments comprise target sequences or portions of target sequences.
  • target sequences can be flanked by using barcoding primers or detection-specific primers.
  • detection can be detected using PCR probes (e.g., so-called Taqman probes).
  • immobilization of target sequences to the solid phase using immobilized primers can be used during the PCR phase so that the PCR proceeds as solid-phase PCR.
  • the first amplification method according to the invention is intended to be able to synthesize or amplify nucleic acid chains having a defined sequence composition, it being possible for generated products to serve as starting nucleic acid chains with template function for subsequent PCR, and the PCR amplification being carried out using at least one own PCR primer ,
  • An object of the invention is further achieved by providing a first amplification method (a first partial amplification) and corresponding means for carrying it out.
  • a first amplification method (a first partial amplification) and corresponding means for carrying it out.
  • the implementation of this first amplification method has already been described in PCT application PCT / EP2017 / 07101 1 and European application 16185624.0 described.
  • PCT / EP2017 / 07101 1 and European application 16185624.0 described.
  • the skilled person is referred to this application.
  • the second amplification method (the second partial amplification) can be carried out in particular as PCR, wherein at least one of the primers used has a different composition and / or structure than the primers used in the first amplification method. This results in an increase of at least one nucleic acid chain comprising the specific target sequence or its parts.
  • PCR amplification per se is normally capable of generating well-characterized amplification products from the initial template, more specifically in real-time mode, starting from an amount greater than about 1000 copies, more preferably greater than about 100,000 copies Generate signals.
  • the PCR must include more cycles of synthesis, which can increasingly lead to defective amplification products or signals. This is especially the case if the PCR has to amplify a sequence variant (eg a mutation or allelic variant of a sequence) which is present in small amounts in the batch and the PCR amplification in the presence of a large amount of another sequence variant (eg. Sequence or allelic variant).
  • amplification-dependent detection methods can benefit from further enhancement of the specificity of amplification techniques, e.g. in the field of liquid biopsy. Especially in clinical diagnostics there is a need to improve the specificity of measurement methods.
  • the combination of a preceding highly specific amplification method with downstream PCR will be described.
  • the combination makes it possible to increase the initial copy number of nucleic acid chains to be amplified under highly selective amplification conditions of a first amplification method up to the desired amounts, which are then subsequently further amplified under less specific conditions of a PCR amplification.
  • the first amplification method thus has a function of the first amplifier with high specificity.
  • the amount of synthesized copies in the first amplification process will range from about 10 copies to about 1 E 1 1 copies, more preferably from about 100 copies to about 1 .0E 10 copies, preferably from about 1000 to about 10E8 copies.
  • the amount of a target sequence is increased by the first amplification.
  • This increase (based on the starting amount of the target sequence in the batch) is, for example, in the following ranges from about 2 times to about 1 E10. more preferably from about 10 times to about 10E9 times, more preferably from about 10 times to about 10E8 times, preferably from about 10 times to about 10E7 times, more preferably from about 100 times to 10E6 times ,
  • the following concentration ranges are achieved: from about 10 amol / l to about 10 nmol / l, more preferably from about 1 fmol / l to about 1 nmol / l, even better from about 10 fmol / l to about 0.1 nmol / l, in particular from about 10 fmol / l to about 10 pmol / l.
  • the second amplification method plays the role of a second amplifier and allows existing PCR-based methods such as probe insertion or bar coding or sequence coding in NGS-library-preparation or solid phase PCR in combination with specific products of the first amplification.
  • the advantages of the combination are, on the one hand, the reduction in the number of PCR cycles which are necessary for carrying out the amplification up to the desired amount of the end product. This reduces the likelihood or extent of synthesis of products by PCR. The synthesis result can thus have higher specificity than the PCR amplification alone.
  • first the first amplification with required components of the first amplification system takes place in the absence of at least one of the essential components of the second amplification system in the same reaction mixture during the first amplification reaction.
  • PCR primers or a thermostable polymerase are added only prior to PCR amplification.
  • the reaction mixture After completion of the first amplification reaction, the reaction mixture is brought into contact with the components of the second amplification system and PCR amplification is carried out.
  • reaction components of a respective amplification system are present in separate reaction mixtures and / or in separate reaction vessels prior to the start of amplification.
  • the first amplification reaction is carried out in one reaction vessel, and then the synthesis result of this reaction is transferred (completely or partially) to the second reaction vessel, and then the second amplification is carried out.
  • reaction components are added sequentially so that first the components of the first amplification system are added and the first amplification reaction is carried out. Subsequently, the components of the second amplification system are supplied, so that the second amplification can take place. In further embodiments, the addition of the components of the second amplification system to the first amplification approach, so that the reaction is substantially the same Reaction vessel is performed. The sequence of both amplification methods is thus predetermined by the time sequence of the addition of individual components.
  • both reactions can be carried out in particular in a closed system.
  • a closed system may comprise, for example, at least two separate reaction vessels.
  • the transfer of the batch from one reaction vessel to the other also takes place in certain embodiments by means of a closed system.
  • Such separation of the two reactions in a closed reaction vessel system is known, e.g. as separate reaction vessels, which are combined to form a cartridge system or array system or microfluidic system.
  • the first amplification batch comprising the amplified nucleic acids of the first amplification is used for the second amplification without partitioning of the first batch.
  • the first approach is thus essentially completely fed to the second amplification reaction.
  • An amount of synthesized copies from the first amplification process is supplied thereto to the second amplification system and includes, for example, a range from about 10 copies to about 1 E1 1 copies, more preferably from about 100 copies to about 1 E10 copies, preferably from about 1000 to about 10E9 copies , In this case, the amount of a target sequence is increased by the first amplification.
  • This increase (based on the starting amount of the target sequence in the batch) is for example in the following ranges from about 2 times to about 1 E1 1-fold, better from about 10 times to about 1 000 000 000 times, even better of about 10-fold to about 1,00,000,000-fold, preferably from about 10-fold to about 10,000,000-fold, more preferably from about 100-fold to 1,000,000-fold.
  • concentration ranges can be achieved: from about 10 amol / l to about 10 nmol / l, more preferably from about 1 fmol / l to about 1 nmol / l, even better from about 10 fmol / l to about 0 , 1 nmol / l, preferably from about 10 fmol / l to about 10 pmol / l.
  • the second amplification reaction it is preferred to use only a part of the first amplification mixture (an aliquot or a subset) in the second amplification reaction. Due to an amplification by means of the first amplification system, an increase in the amount of nucleic acid chains comprising at least one target sequence takes place. In the second amplification reaction, a portion of this amount may be used as the starting material. This fraction can be added or added to the second reaction mixture, for example. The proportion may for example be relatively low and depends essentially on the requirements of the desired application. Due to the proliferating effect of the PCR, the second amplification can in particular start from more than about 1000 copies of the nucleic acid chains which were amplified sequence-specifically in the first amplification method.
  • the PCR amplification can thus be started when a sufficient amount of the amplified nucleic acid chains has been synthesized in the first amplification process.
  • this amount of synthesized nucleic acid chains may range from, for example, a range of about 10,000 copies to about 1 E11 copies, more preferably from about 10,000 copies to about 1 E10 copies, more preferably from about 10,000 to about 1 E9 copies.
  • the amount of a target sequence is increased as desired by this first amplification.
  • This increase (based on the starting amount of the target sequence in the batch) can be measured as N times the starting amount and is for example in the following ranges from about 2 times to about 1 E1 1-fold, more preferably from about 10 times to about 1 E10-fold, more preferably from about 10 times to about 1 E9-fold, especially from about 10-fold to about 1 E8-fold, especially from about 100-fold to 1 E6-fold.
  • the following concentration ranges are achieved: from about 10 amol / l to about 10 nmol / l, more preferably from about 1 fmol / l to about 1 nmol / l, even better from about 10 fmol / l to about 0.1 nmol / l, in particular from about 10 fmol / l to about 10 pmol / l.
  • a fraction (or aliquot) of this amount can be used for the second amplification reaction.
  • the PCR may start from an amount which includes the following ranges, for example, a range of about 100 copies to about 1 E 1 1 copies, more preferably from about 1,000 copies to about 1 E 10 copies, more preferably from about 1, 000 to about 1 E9 copies. This amount can be considered as a subset of the synthesized nucleic acid sequence containing the target sequence, augmented by the first amplification.
  • the concentration ranges include: from about 10 amol / l to about 100 nmol / l, more preferably from about 1 fmol / l to about 10 nmol / l, more preferably from about 10 fmol / l to about 1 nmol / l, more preferably from about 10 fmol / l to about 10 pmol / l.
  • a PCR amplification can be started starting from these concentrations of the synthesis products of the first amplification.
  • the final concentration of PCR fragments concentration ranges from 0.01 nmol / l up to 5 pmol / l, more preferably from 1 nmol / l to 1 pmol / l comprises ,
  • the first amplification provides an amount of copies which represents a relative excess relative to the necessary amount of copies required or desired as a starting material for the PCR.
  • a portion of the first reaction mixture can be made, for example, by dilution of the first reaction mixture and transfer of a certain volume fraction which contains synthesized nucleic acid chains in the second reaction.
  • the proportion of the amount of specifically synthesized nucleic acid chains transferred thereby, which can serve as a template for generating PCR fragments, may include the following ranges (calculated on the total amount of synthesized products in the first amplification step): from about 1 E-7% from about 1 E-6% to about 90%, more preferably from about 0.0001% to about 50%, more preferably from about 0.001% to about 50%, or from about 0.01% to about 50% %, in particular 0.1% to about 20%.
  • dilution of a controller oligonucleotide may also have a positive effect on the PCR reaction by having this controller oligonucleotide initially present during the second amplification reaction, but its concentration during the second amplification is reduced so that its binding is sufficiently slowed down to the synthesis products or reaction components or the interaction with complementary sequence segments is reduced or occurs insufficiently and thus its effect on the overall reaction process is reduced by this dilution effect.
  • dilution of the reaction components of the first amplification system may also be performed, generally in parallel with dilution of the specific nucleic acid chain provided.
  • the relative amount of components of the first amplification system which are transferred to the second amplification reaction can be represented as a proportion. This proportion refers to the amount of the components used in the first amplification reaction (100%).
  • the transferred proportion of the components of the first amplification system in the second amplification reaction comprises, for example, the following ranges: from about 1 E-7% to about 50%, more preferably from about 1 E-6% to about 30%, even better from about 0.0001% to about 20%, especially from about 0.001% to about 10%, more preferably from about 0.1% to about 10%.
  • the transferred portion of the first reaction mixture may, for example, relate to the concentrations used or to the volume fractions.
  • the transfer of a microliter (1 pl) of the batch comprising the first amplification system (after completion of amplification) to 49 pl of a batch comprising the second amplification system in a 2% (v / v) dilution or dilution of 1:50 result.
  • Higher dilution levels can be prepared accordingly by means of a dilution series.
  • the concentration of the controller oligonucleotide in the first amplification system can be reduced from about 10 pmol / l at a dilution of 1: 1000 to about 10 nmol / l.
  • the transferred share is thus only 0.01%.
  • the same proportion of the synthesized nucleic acid chain comprising a target sequence can be transferred.
  • an amount of about 10,000,000 copies was amplified, and then the amount of products transferred to the PCR reaction at a dilution of 1: 1000 would yield a subset of about 10,000 copies. This initial amount of copies is usually sufficient for the PCR to perform a stable and sufficiently specific amplification reaction.
  • nucleic acid chains e.g. of wild-type molecules or allelic variants.
  • sequence-specific first amplification the specific amplification of target molecules takes place predominantly.
  • Other nucleic acid chains are not or not significantly amplified.
  • the dilution effect also acts on these potentially interfering with the PCR reaction sequences. For example, this reduces the amount of wild-type sequences from 100,000 to about 100. This can have a positive effect on the specificity of the PCR reaction.
  • both methods are performed in one approach (as a "homogeneous assay").
  • the components of both amplification systems must already be present in one batch at the beginning of the first amplification.
  • the required components for both amplification systems are thus supplied to the reaction mixture before the beginning of the first amplification.
  • first the first amplification with required components of the first amplification system takes place in the presence of at least one of the essential components of the second amplification system in the same reaction mixture during the first amplification reaction.
  • the combination of both amplification systems in a reaction mixture may require adaptation of individual components or concentrations and reaction conditions.
  • the length of the 3 ' segment of the third primer which may be complementary to the controller oligonucleotide, is chosen so that this segment does not prevent strand displacement by the controller oligonucleotide. This is essentially achieved by the stability of the double-stranded complex consisting of a controller oligonucleotide and a 3 ' segment of the third primer being sufficiently low under reaction conditions of strand displacement by the controller oligonucleotide (eg 65 ° C. step during the first amplification) in that the binding of the third primer to the controller oligonucleotide is only temporary and does not prevent strand displacement.
  • the length of the 3 ' segment of the third primer may be affected, for example, by the length of the 3 ' segment of the third primer, which would be able to enter such a complex with the controller oligonucleotide.
  • the length of this complex is between 8 and 20 nucleotides.
  • the 3 ' segment of the third primer may have one or more mismatches to the sequence composition of the controller oligonucleotide in the corresponding segment, resulting in destabilization of that complex.
  • one to three mismatches are positioned in position from -10 to -20 with respect to the 3 ' -terminal nucleotide of the third primer. This does not significantly affect the primer function of the third primer while reducing the stability of the complex with the controller oligonucleotide.
  • controller oligonucleotide of both primers and the polymerase of the second amplification system should not be used as a template. This is particularly important for the third oligonucleotide primer, since it comprises a sequence segment which can bind complementarily to the controller oligonucleotide.
  • the structure of the controller oligonucleotides in the segment of its possible complementary binding to the third oligonucleotide primer can therefore be designed to be comparable to that of the first primer of the first set.
  • primer extension of the third oligonucleotide primer is prevented by the controller oligonucleotide, by using nucleotide modifications, preventing the polymerase from extending a third primer bound to the controller oligonucleotide.
  • nucleotide modifications For example, several 2 '-0-alkyl modifications can convey such a blocking effect.
  • the components of the second amplification system may furthermore be advantageous for the components of the second amplification system to be completely or partially in an "inert” or “non-active” or “reversibly inactivated” or “non-reactive” state during the first partial amplification. Only for carrying out the second amplification should such components be converted into an active, i. functional state are transferred.
  • At least one of these PCR components is in a reversibly inactivated form during the first amplification so that this component does not participate in the first amplification reaction or its participation is insignificant.
  • the first amplification then takes place first an activation of these reversibly inactivated components, so that the inactivation is canceled and the components are now in active form in the second amplification reaction and thus can perform their role in the amplification.
  • reversibly inactivated PCR primers or a reversibly inactivated thermostable polymerase are used.
  • hot-start polymerase a reversibly inactivated thermostable polymerase
  • the activation of components occurs continuously under PCR conditions.
  • reversibly inactivated primers are known to the person skilled in the art (for example termolabile primers so-called CleanAmp Primers Trilink Technologies). Such primers can be activated by heating so that the polymerases can start synthesis from this primer.
  • Other examples of reversibly inactivated primers include primers having a 3 '-terminal nucleotide which comprises a modified sugar radical, for example a blocked 3' -OH group (for example, by a C3-linker at the 3 'position or primers having terminal dideoxy Nucleotides, Sambrook et al NAR 1998 p.3073).
  • such primers have a 3 ' -terminal mismatch to template.
  • a polymerase is used for the first amplification, which has no 3 ' -5 ' exonuclease activity (eg Bst polymerase or its modifications).
  • Bst polymerase eg Bst polymerase or its modifications.
  • the activation is usually carried out by enzymatic cleavage of the 3 ' -terminal nucleotide together with the modified sugar residue.
  • primers in combination with a thermostable polymerase comprising 3 ' - 5 ' exonuclease activity (so-called proofreading polymerases).
  • a thermostable polymerase comprising 3 ' - 5 ' exonuclease activity
  • proofreading polymerases thermostable polymerase comprising 3 ' - 5 ' exonuclease activity
  • a terminal mismatch facilitates the function of the polymerase 3 ' -5 ' exonuclease.
  • such "inactive" primers bind to their complementary positions on templates. After binding to the template, terminal nucleotides including a blocking group can be removed by exonuclease activity (which is associated with polymerase).
  • thermostable polymerases may also be modified also cleave terminal nucleotides with a blocked 3 '-OH group, if this to the template are complementary (for example, Vent or Deep Vent polymerases).
  • such primers can comprise a 3 '-5' nuclease non-cleavable bond, such as one or more phosphorothioate modifications (PTO modifications), for example, in positions “minus 2" or “ minus 3 “or from” minus 2 "to” minus 7 ". This prevents excessive degradation of primers.
  • PTO modifications phosphorothioate modifications
  • the reversibly activated polymerases include, for example, those which are reversibly inactivated by means of an antibody or which are reversibly inactivated by means of a chemical modification (AmpliT aq polymerase).
  • AmpliT aq polymerase Several commercial suppliers have developed such "hot-start" polymerases for PCR (Qiagen, Thermofisher, Roche).
  • hot-start polymerases and its modifications in various reversibly inactivated states were offered as so-called hot-start Taq polymerase.
  • hot-start polymerases which are converted into an active form, for example by initial heating of the batch at 95 ° C for 1 min to 10 min.
  • the polymerase which has carried out the exponential amplification of the nucleic acid chain to be amplified in the first amplification reaction is inactivated by heating prior to the start of the second amplification.
  • This inactivation can be achieved, for example, by heating the batch to above 80 ° C., better to above 90 ° C., in particular to 95 ° C., for 1 to 10 min.
  • mesophilic polymerases such as Bst polymerase or Bsm polymerase, or Gst polymerase
  • Such inactivation favors conversion of the process from the first amplification reaction to the second amplification reaction.
  • an inactivation of the polymerase of the first amplification reaction can take place simultaneously and an activation of the polymerase for the second amplification reaction.
  • the primer-template complexes are used in particular by the polymerase, which is to carry out the synthesis in the second amplification step.
  • the other polymerase-associated activities such as strand displacement by Bst Polymerase, "turn off”, or "turn on” 5 ' -3 ' -Exonuklease activity of the Taq polymerase.
  • the 5 ' segment of the controller oligonucleotide hybridized to the first primer extension product can be cleaved by the 5 ' -3 nuclease of the polymerase (eg, 5 ' -3 ' nuclease of a Taq polymerase).
  • the polymerase eg, 5 ' -3 ' nuclease of a Taq polymerase.
  • the polymerase can complementarily extend the fourth PCR primer using the third primer extension product under suitable reaction conditions by incorporation of nucleotides and at the same time enzymatically cleave the controller oligonucleotide in its 5 ' segment of the third region hybridized to the third primer extension product.
  • the polymerase-extended strand forms, in particular, an overlap with the controller oligonucleotide by at least one 3 ' -terminal nucleotide during the synthesis, thereby forming a structure recognizable for 5 ' -3 ' -nuclease activity of the Taq polymerase under used reaction conditions, and this structure can be split.
  • 5 ' -3 ' exonuclease activity cleaves the phosphodiester bonds between nucleotides of the third region of the controller oligonucleotide.
  • the 5 ' -3 ' -exonuclease-related cleavage takes place in particular on the DNA strand, and some sugar-phosphate backbone modifications, such as 2 ' -OMe ribonucleotides or PTO modifications or PNA, can slow down or even prevent this cleavage.
  • the controller oligonucleotide in its 5 'segment of the third Area, predominantly by nuclease cleavable nucleotides or their analogs includes (eg DNA).
  • the length of this 5 ' segment of the controller oligonucleotides comprises, for example, 5 to 50, in particular 10 to 30 nucleotides.
  • a polymerase By degrading the controller oligonucleotide bound to the first primer extension product, a polymerase can also extend the second primer without strand displacement properties and thus synthesize the second primer extension product.
  • the presence of components of the second amplification system during the first amplification is considered as follows:
  • the effect of the components of the second amplification system can be reduced by their reversible inactivation prior to the first amplification.
  • individual sequence elements should not occur as nonspecific templates for primer extension during the first amplification. For this reason, primers of the first and second amplification systems should be checked for the existence of self-complementary structures in order to avoid primer-dimer formation.
  • the third PCR primer typically comprises a sequence segment in its 3 ' segment which comprises regions complementary to the controller oligonucleotide. This allows the third PCR Primer to the controller oligonucleotide complementary bind.
  • the third PCR primer must not prevent strand displacement by the controller oligonucleotide during the first amplification.
  • the sequence length or sequence composition of the 3 ' segment of the third PCR primer is adjusted so that it does not bind significantly to the controller oligonucleotide under reaction conditions of the strand displacement step (eg 65 ° C).
  • Such a third PCR primer may further bind with its 3 ' segment to its template and initiate a primer extension reaction.
  • This may be achieved, for example, by the 3 ' segment of the third PCR primer, which may be complementary to the controller oligonucleotide, comprising in its length regions of between 9 and 30 nucleotides, more preferably between 12 and 20 nucleotides , in particular between 12 and 16 nucleotides.
  • This 3 ' segment of the third PCR primer may comprise one or more mismatches to corresponding positions of the controller oligonucleotide such that the binding strength continues to decrease.
  • the sequence segment of the controller oligonucleotide which can substantially complementarily bind the third PCR primer is referred to as the fourth region of the controller oligonucleotide.
  • This fourth region of the controller oligonucleotide may include sequence segments of the second region and / or the third region.
  • the fourth region of the controller oligonucleotide comprises in its length regions which are between 9 and 30 nucleotides, more preferably between 12 and 20 nucleotides, in particular between 12 and 16 nucleotides.
  • the fourth region of the controller oligonucleotide may include one or more mismatches to the 3 ' segment of the third PCR primer.
  • this fourth region comprises nucleotide modifications that prevent the third PCR primer from being extended by a polymerase of the first and / or second amplification system using the controller oligonucleotide as a template. Such modifications have already been described for the combination of the first primer and the controller oligonucleotide.
  • sequence segments 2 '-0-alkyl modifications comprise sequence segments 2 '-0-alkyl modifications, the length of this segment may be 6 to 30 modifications and the complementary nucleotide of the oligonucleotide to the controller 3' -terminal nucleotide of the third PCR primer particular even such modification and further flanked on both sides by at least three nucleotides with such modifications. This ensures that the controller oligonucleotide from the third and fourth primer and the polymerase of the second amplification system is not used as a template.
  • the creation of the first and second primer extension product of a defined length plays a role in the separation of these two products by means of a controller Oligonucleotide. For this reason, it is advantageous to prevent any premature extension of 3 ' ends (each of the first and second primer extension products) using a third or fourth primer of the second amplification system as a template during the first amplification reaction.
  • a reduction or prevention of any undesired excess extension of the 3 ' end of the first primer extension product using the fourth PCR primer as a template can be achieved in various ways: In certain embodiments, this is achieved by the fourth PCR primers, when attached to the 3 ' segment of the first primer extension product, can not undergo perfect match complementary binding with the 3 ' terminal nucleotide of this synthesized first primer extension product. This is intended to prevent or at least reduce excess extension of the 3 ' - terminal nucleotides of the first primer extension product.
  • this is achieved by virtue of the fourth PCR primer, when bound to the 3 ' segment of the first primer extension product, not undergoing perfect match complementary binding with the at least one of the terminal nucleotides of this synthesized first primer extension product can.
  • the resulting at least one mismatch position is in particular in the position of -1 to -5 relative to the terminal nucleotide of the first primer extension product.
  • a reduction or prevention of a possibly unwanted excess extension of the 3 ' end of the second primer extension product using the third PCR primer as a template can be achieved in various ways: In certain embodiments, this is achieved by the third PCR primer, when bound to the 3 ' segment of the second primer extension product, can not undergo perfect match complementary binding with the 3 ' terminal nucleotide of this synthesized first primer extension product. This should an excessive extension of the 3 '- be prevented or at least reduced terminal nucleotides of the second primer extension product.
  • this is accomplished by the third PCR primer, when bound to the 3 ' segment of the second primer extension product, not undergoing perfect match complementary binding with the at least one of the terminal nucleotides of this synthesized second primer extension product can.
  • the resulting at least one mismatch position is in particular in the position -1 to - 5 relative to the terminal nucleotide of the second primer extension product.
  • the presence of components of the first amplification system during the second amplification is considered as follows: On the one hand, the effect of the components of the first amplification system can be reduced by their dilution prior to the second amplification. On the other hand, individual elements should not occur as nonspecific templates for primer extension during the second amplification. For this reason, the primers of the first and second amplification systems should be checked for the presence of self-complementary structures in order to avoid primer-dimer formation.
  • the second amplification is carried out in the presence of the controller oligonucleotide of the first amplification system. For this reason, the design of the controller oligonucleotide, the primer of the second set, and the reaction conditions must be adjusted so that the second amplification reaction is not significantly disturbed by the presence of the controller oligonucleotide.
  • the controller oligonucleotide from both primers and the polymerase from the second amplification system should not be used as a template. This is particularly important for the third oligonucleotide primer, since it comprises a sequence segment which can bind in a complementary manner to the controller oligonucleotide in the fourth region.
  • the structure of the controller oligonucleotides in the fourth region comprises a modification which prevents a potential primer extension. For example, provide such a synthesis blocking effect of various 2 '-0-alkyl modifications.
  • the controller oligonucleotide may form on the third primer extension product during the second amplification and thus on a complementary strand with the third primer extension product.
  • Such a double-stranded fragment may possibly prevent a polymerase from starting to synthesize the complementary strand to the full extent starting from the fourth PCR primer, up to and including the 5 ' segment of the third primer extension product. Therefore, the choice of polymerase and reaction conditions should be such that binding of the controller oligonucleotides does not prevent synthesis of the fourth primer extension product.
  • the length of the segment of the third primer extension product which can make a complementary bond with the controller oligonucleotide is co-determined, for example, by the positioning of the third primer.
  • the third primer is arranged so that the length of the resulting fully complementary portion of an expected third primer extension product to the controller oligonucleotide is in particular in the following ranges: from about 15 nucleotides to about 60 nucleotides, or from about 20 nucleotides to about 40 nucleotides , especially from about 20 nucleotides to about 30 nucleotides.
  • thermostable polymerase is selected in the second amplification reaction which comprises strand displacement activity, for example, a thermostable polymerase such as Vent Exo minus polymerase or pyrophage polymerase can be used.
  • a thermostable polymerase such as Vent Exo minus polymerase or pyrophage polymerase can be used.
  • a polymerase is selected in the second amplification reaction which is capable of cleaving the controller oligonucleotide by 5 ' -3 ' exonuclease activity of the polymerase, with simultaneous primer extension (see above).
  • a controller oligonucleotide is used, which can be cleaved by a 5 ' -3 ' exonuclease, at least in its 5 ' segment.
  • the degradation progressively leads to a shortening of the hybridized to the third primer extension product controller oligonucleotide, which under appropriate reaction conditions (eg, temperature of about 65 ° C to 75 ° C) to destabilize this bond and finally to a separation of the bond to the third primer extension product leads.
  • appropriate reaction conditions eg, temperature of about 65 ° C to 75 ° C
  • the concentration of the controller oligonucleotide and the concentration of the fourth primer of the second primer set are selected such that primer binding and primer extension are faster under the chosen reaction conditions than binding of the controller oligonucleotides to the third primer extension product.
  • concentrations of the controller oligonucleotide in the range of 0.01 pmol / l to 0.3 pmol / l are used.
  • concentrations of the fourth primer ranging from about 0.5 pmol / L to 2 pmol / L are used.
  • polymerases are used in the second amplification reaction, which have high processivity (for example, Phusion Polymerase). The binding of the primer and its extension are generally faster than the binding of the controller oligonucleotides, so that the primer extension reaction is kinetically advantageous.
  • the primer extension reaction in the second amplification reaction is carried out at at least two temperatures.
  • the first, generally lower temperature, eg in the range of 45 ° C to 65 ° C the complementary binding of the fourth primer to its complementary segment occurs in the 3 ' segment of the third primer extension product, as well as an initial extension by the polymerase .
  • a partially extended primer extension product is generated, which has sufficient stability with the third primer extension product, so that after increasing the temperature of the second region, for example to values of about 70 ° C to about 80 ° C, this partially extended fourth Primer extension product can be extended by the polymerase.
  • the controller oligonucleotide can spontaneously dissociate from its binding with the third primer extension product so that the polymerase can continue the synthesis of the fourth primer extension product, up to and including the 5 ' segment of the third primer extension product from the polymerase becomes.
  • polymerases are used in the second amplification reaction, which have a high processivity (eg, Phusion Polymerase). Processes which work with the composition of the reaction mixture in the "homogeneous format" are particularly suitable, for example, if a division of the first reaction batch is not meaningful or technically very complicated, for example in the case of a "micro- or nanotrottle reaction” (also known as called digital PCR).
  • a solid phase comprising oligonucleotides which are suitable for a specific binding of products formed and / or also occur as immobilized primers, so that a solid phase PCR can be carried out, wherein the primer extension products immobilized on the solid phase.
  • the establishment of contact with a solid phase comprising specific oligonucleotides may occur before, during, or only after the first amplification.
  • the reaction mixture can be divided into a plurality of reaction volumes (partitioning) before the start of the first amplification reaction, so that an amplification of a reaction mixture is simultaneously divided into about 100 or 1000 or more equal volume fractions.
  • This division can take place in the form of droplets (for example as an emulsion).
  • the execution of amplification may be carried out in parallel in this plurality of droplets (e.g., as Digital PCR).
  • sequence of the amplification reactions plays an essential role: the sequence-specific amplification (first amplification) using a controller oligonucleotide takes place in particular before a PCR amplification.
  • the PCR-based amplification takes place only as a second step.
  • no DNA fragments generated by a PCR or another amplification method are used as starting nucleic acid chains for the first amplification reaction.
  • the first amplification method (first partial amplification) and the required components of the first amplification system will first be described schematically, then the second amplification method (second partial amplification) and the components of the second amplification system will be described. Subsequently, the combination of the first and the second amplification method, as well as advantageous embodiments are shown.
  • the second amplification method (also referred to below as PCR) takes place after the first amplification.
  • the first amplification occurs as an exponential amplification in which newly synthesized products of both primers (primer extension products) occur as templates for further synthetic steps.
  • the primer sequences are at least partially copied, so that complementary primer binding sites arise, which immediately after their synthesis are present as sequence segments of a double strand.
  • synthesis steps of both strands and double-strand opening steps of the newly synthesized sequence segments take place alternately. Sufficient double-strand separation after synthesis is an important prerequisite for further synthesis. Overall, such a change from synthesis and double-strand separation steps can lead to exponential amplification.
  • the double-stranded opening of the main products of the amplification takes place inter alia by means of an oligonucleotide, which is referred to herein as a controller oligonucleotide.
  • the controller oligonucleotide in particular comprises sequence segments which correspond to the target sequence.
  • the strand separation according to the invention is achieved by using a controller oligonucleotide, each having a predefined sequence, which in particular separates a newly synthesized double strand consisting of two specific primer extension products by means of a sequence-dependent nucleic acid-mediated strand displacement.
  • the resulting single-stranded segments of the primer extension products comprise the target sequence as well as corresponding primer binding sites, which can serve as binding sites for further primer oligonucleotides, so that an exponential amplification of nucleic acid chains to be amplified is achieved.
  • the primer extension reactions and strand displacement reactions take place simultaneously in the approach.
  • the amplification occurs in particular under reaction conditions which do not allow a spontaneous separation of both specific synthesized primer extension products.
  • a specific exponential first amplification of a nucleic acid sequence comprising a target sequence comprises a repetition of synthesis steps and double-strand opening steps (activation steps for primer binding sites) as a mandatory prerequisite for the amplification of the nucleic acid chain.
  • the opening of synthesized duplexes is implemented as a reaction step which is to be sequence-specifically influenced by the controller oligonucleotide. This opening can be complete, even to dissociation of both complementary primer extension products, or even partial.
  • the controller oligonucleotide comprises sequence segments which can interact with the target sequence and further sequence segments which bring about this interaction or facilitate or favor it.
  • double-stranded sections of the synthesized primer extension products are converted into a single-stranded form via sequence-specific strand displacement. This process is sequence-dependent: only when the sequence of the synthesized double strand has a certain degree of complementarity with the corresponding sequence of the controller oligonucleotide does a sufficient double strand opening occur the sequence sections essential for the continuation of the synthesis, such as primer binding sites, are converted into single-stranded form, which corresponds to an "active state".
  • the controller oligonucleotide thus "specifically" activates the newly synthesized primer extension products comprising the target sequence for further synthetic steps.
  • sequence segments which do not comprise a target sequence are not converted into a single-stranded state and remain as a double strand, which corresponds to an "inactive" state.
  • the potential primer binding sites in such a duplex are less favored or completely hindered from interacting with new primers, so that further synthetic steps on such "non-activated" strands generally do not occur.
  • This lack of or decreased activation (i.e., single stranded state) of synthesized nucleic acid strands following a synthesis step results in the successful conclusion that only a reduced amount of primers can successfully participate in a primer extension reaction in the subsequent synthesis step.
  • synthesis steps and activation steps are combined to an amplification process and carried out as many times or repeated until the desired Amount of the specific nucleic acid chain is provided.
  • reaction conditions e.g., temperature
  • the reaction conditions are designed in the course of the first amplification process so that spontaneous separation of complementary primer extension products in the absence of a controller oligonucleotide is unlikely or significantly slowed.
  • the controller oligonucleotide facilitates this double-stranded separation as a result of matching its sequence segments to given sequence segments of the primer extension products. This match is checked after each synthesis cycle by the controller oligonucleotide.
  • the exponential amplification results from successful repeats of syntheses and sequence-specific strand displacements caused by controller oligonucleotide, i. "Activations" (double-stranded openings / double-stranded separations / strand displacement processes resulting in single-stranded form of corresponding primer binding sites) of newly synthesized primer extension products.
  • controller oligonucleotide thus allows a sequence-dependent review of the contents of the primer extension products between the individual synthetic steps during the exponential amplification and inducing a selection of sequences for subsequent synthetic steps. It is possible to distinguish between "active", single-stranded states of newly synthesized specific primers. Extension products can be distinguished as a result of successful interaction with a controller oligonucleotide, and "inactive" double-stranded states of newly synthesized nonspecific primer extension products as a result of deficient, insufficient, decreased and / or slowed interaction with a controller oligonucleotide.
  • the exponential amplification of nucleic acid chains comprising a target sequence is carried out in a sequence-controlled manner (main reaction). This sequence control occurs after each step in the synthesis and includes sequence segments which are between the primers and comprise the target sequence.
  • the successful verification of the result of the synthesis after each synthesis step results in the separation of the two specific primer extension products, which is the prerequisite for further specific synthesis steps.
  • the method thus makes it possible to check the synthesized sequences in real time, ie without reaction interruption, and thus provides means for the development of homogeneous assays in which all components of the assay are already present in the reaction mixture at the beginning of a reaction.
  • PCR second partial amplification
  • the first amplification process is then terminated or the reaction conditions are changed so that the second amplification process (PCR) can be started.
  • the amplification of the target sequences is carried out using nucleic acid chains prepared in the first amplification method and at least one further, PCR-specific component (for example an oligonucleotide primer and / or a PCR polymerase). Since the number of specific nucleic acid chains is sufficiently high already at the beginning of the second amplification, the PCR process requires fewer cycles until the desired total amount of products is reached. This PCR products are generated, which have fewer errors overall.
  • the components of the first amplification system are different from the components of the second amplification system (PCR).
  • the components of the first amplification system are different from the components of the second amplification system, and the PCR components (of the second amplification system) are at least partially in non-active form (eg, hot) under reaction conditions of the first amplification process. Starting polymerases). Switching from the first amplification to the second amplification thus requires an additional activation step of the PCR components (e.g., polymerase).
  • the PCR components e.g., polymerase
  • the polymerase of the first amplification system is inactivated after completion of the first amplification, so that a different polymerase is used for the second amplification (PCR).
  • the components of the first amplification system are also partially utilized by the second amplification system using at least one additional PCR-specific component (e.g., another primer oligonucleotide or polymerase) that is not part of the first amplification system.
  • at least one additional PCR-specific component e.g., another primer oligonucleotide or polymerase
  • the present invention describes some embodiments of both methods, arrays of oligonucleotide primers, which are advantageous for performing both amplification methods.
  • suitable arrangement of individual elements of the first and the second Amplification system on a nucleic acid chain comprising a target sequence homogeneous assays can be assembled with higher overall specificity.
  • oligonucleotide as used herein with reference to primer, controller oligonucleotide, probes, nucleic acid chain to be amplified refers to a molecule having two or more, in particular more than three deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides and / or nucleotide modifications and / or or non-nucleotide modifications. Its length includes, for example, ranges between 3 to 300 nucleotide units or its analogs, more preferably between 5 to 200 nucleotide units or its analogs. Its exact size depends on many factors, which in turn depend on the ultimate function or use of the oligonucleotides.
  • primer refers to an oligonucleotide, whether naturally occurring e.g. B. occurs in a purified restriction cleavage or was produced synthetically.
  • a primer is capable of acting as the initiation point of the synthesis when used under conditions that induce the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid strand, ie in the presence of nucleotides and an inducing agent such as DNA polymerase a suitable temperature and a suitable pH.
  • the primer is particularly single-stranded for maximum efficiency in amplification.
  • the primer must be long enough to initiate synthesis of the extension product in the presence of the inducing agent.
  • the exact length of the primer will depend on many factors, including the reaction temperature and primer source, and the application of the method. For example, depending on the complexity of the target sequence, the length of the oligonucleotide primer in diagnostic applications is between 5 to 100 nucleotides, in particular 6 to 40 and particularly preferably 7 to 30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower reaction temperatures to perform their primer function to form sufficiently stable complexes with the template, or higher concentrations of other reaction components, such as DNA. Polymerases, so that a sufficient extension of formed primer-template complexes can take place.
  • the primers used herein are selected to be "substantially" complementary to the different strands of each specific sequence to be amplified. That is, the primers must be sufficiently complementary to hybridize with their respective strands and initiate a primer extension reaction. Thus, for example, the primer sequence does not need to reflect the exact sequence of the target sequence.
  • a non-complementary nucleotide fragment may be attached to the 5 'end of the primer, with the remainder of the primer sequence being complementary to the strand.
  • single non-complementary bases or longer non-complementary sequences may be inserted in a primer, provided that the primer sequence has sufficient complementarity with the strand sequence to be amplified to hybridize therewith and thus form a primer template. Complex able to produce the synthesis of the extension product.
  • a primer extension product is generated which is completely complementary to the template strand.
  • the melting temperature of a complementary or partially complementary double strand is generally understood to mean a measured value of a reaction temperature at which approximately half of the strands are in the form of a double strand and the other half is in the form of a single strand.
  • the system association and dissociation of strands is in equilibrium.
  • the determination of the Tm of a nucleic acid to be amplified should take place under the same conditions, like the intended amplification reaction.
  • the melting temperature is understood to mean a value which was measured in the same reaction buffer as the exponential amplification, at concentrations of both complementary components of a double strand of from about 0.1 pmol / l to about 10 pmol / l, in particular in a concentration of about 0.3 pmol / to about 3 pmol / l, in particular about 1 pmol / l.
  • the respective value of the melting temperature is a guideline, which correlates with the stability of a respective double strand.
  • dNTPs deoxyribonucleoside triphosphates
  • dATP deoxyribonucleoside triphosphates
  • dCTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • dGTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • TTP dUTP, or dUTP / TTP mixture
  • dNTP analogue may be added to the synthesis mixture.
  • these dNTP analogs include a characteristic label (eg, biotin or fluorescent dye) that can be incorporated into the nucleic acid strand.
  • this dNTP analogs include at least one modification of the sugar phosphate moiety of the nucleotide, for example, alpha-phosphorothioate-2 '-Desoxyribonukleosid- triphosphates (or other modifications which impart a nucleic acid strand, a nuclease resistance), 2', 3 'dideoxy-ribonucleoside triphosphates, Azyklo nucleoside triphosphates (or other leading to the termination of a synthetic modifications).
  • alpha-phosphorothioate-2 '-Desoxyribonukleosid- triphosphates or other modifications which impart a nucleic acid strand, a nuclease resistance
  • 2', 3 'dideoxy-ribonucleoside triphosphates or other leading to the termination of a synthetic modifications.
  • these dNTP analogs include at least one modification of nucleobase, eg, iso-cytosines, iso-guanosines (or other modifications of extended-genetic alphabet nucleobases), 2-amino-adenosines, 2-thiouridines, inosines, 7-deazy adenosines, 7-deaza-guanosines, 5-Me-cytosines, 5-propyl-uridines, 5-propyl-cytosines (or other modifications of nucleobases which can be incorporated into natural nucleobases by a polymerase and alter the strand Lead stability).
  • nucleobase eg, iso-cytosines, iso-guanosines (or other modifications of extended-genetic alphabet nucleobases), 2-amino-adenosines, 2-thiouridines, inosines, 7-deazy adenosines, 7-deaza-guanosines, 5-Me-cytosines, 5-propyl-
  • a dNTP analog comprises both a modification of the nucleobase and a modification of the sugar-phosphate moiety.
  • at least one other type of dNTP analogue is added to the synthesis mixture rather than at least one natural dNTP substrate.
  • the nucleic acid synthesis-inducing agent may be an enzyme or a system that functions to cause synthesis of the primer extension products.
  • Suitable enzymes for the first amplification for this purpose include, but are not limited to, DNA polymerases, e.g. Bst polymerase and its modifications, Vent polymerase and others - particularly heat-stable DNA polymerases which allow the incorporation of the nucleotides in the correct manner, thereby forming the primer extension products that are complementary to any nucleic acid strand synthesized.
  • DNA polymerases e.g. Bst polymerase and its modifications, Vent polymerase and others - particularly heat-stable DNA polymerases which allow the incorporation of the nucleotides in the correct manner, thereby forming the primer extension products that are complementary to any nucleic acid strand synthesized.
  • the synthesis is initiated at the 3 'end of each primer and then proceeds in the 5' direction along the template strand until the synthesis is complete or interrupted.
  • template-dependent strand-displaceable DNA polymerases are used in the first amplification. These include, for example, the large fragment of Bst polymerase or its modifications (eg Bst 2.0 DNA polymerase), the Klenow fragment, Vent exo minus polymerase, Deepvent exo minus DNA polymerase, the large fragment of Bsu DNA polymerase, and the large fragment of Bsm DNA polymerase.
  • polymerases which have no 5 ' -3 ' -Exonuklease activity, or have no 5 ' -3 ' -FFEN activity.
  • thermostable matrix-dependent DNA polymerases are used for the second amplification.
  • Taq polymerase or its modifications eg Ampli-Taq
  • polymerases with proofreading function Pfu and its modifications or Vent Polymerase and its modifications.
  • Pfu and its modifications Pfu and its modifications
  • Vent Polymerase and its modifications Pfu and its modifications
  • polymerases which have been fused with another protein for example Phusion Polymerase.
  • Phusion Polymerase Phusion Polymerase.
  • a variety of polymerases are commercially available.
  • Combinations of polymerases may also be used, e.g. OneTaq polymerase (NEB) is a combination of a Taq polymerase and Vent polymerase. Such combinations of polymerases can contribute to higher synthesis accuracy in the second amplification.
  • NEB OneTaq polymerase
  • At least two different polymerases are used, for example, polymerases capable of strand displacement and those having 3 ' -5 ' reproducing activity.
  • polymerases are used with a hot-start function, which can only develop their function when a certain temperature is reached.
  • the first amplification system comprises the components necessary to perform a specific first amplification: the first primer oligonucleotide, the second primer oligonucleotide, the controller oligonucleotide and the first polymerase.
  • nucleotide mixtures and buffer systems may be included to the extent necessary to perform a specific first amplification (e.g., specific buffer systems for the first polymerase).
  • the first amplification system supports the synthesis of the first amplification fragment
  • the first amplification product 1.1 (or of the first amplification product 1.1, also referred to as the nucleic acid sequence of the first amplification to be amplified) during the first amplification (also called the first partial amplification).
  • the second amplification system comprises the components necessary to carry out the specific second amplification: the third primer oligonucleotide, the fourth primer oligonucleotide and the second polymerase.
  • this may include nucleotide mixtures and buffer systems as necessary to perform a specific second amplification (e.g., special buffer systems for the second polymerase).
  • the second amplification system supports synthesis of the second amplification fragment
  • second amplification product 2.1 (or second amplification product 2.1) during the second amplification (also called second partial amplification).
  • First primer oligonucleotide (component of the first amplification system)
  • the first primer oligonucleotide ( Figures 12 to 16) comprises a first primer region and a second region.
  • the first primer region is capable of binding to a substantially complementary sequence within the nucleic acid or its equivalents to be amplified, and a Initiate primer extension reaction.
  • the second region comprises a polynucleotide tail which is capable of binding a controller oligonucleotide and thereby effecting spatial proximity between the controller oligonucleotide and the other portions of the first primer extension product sufficient to induce strand displacement through the controller oligonucleotide.
  • the second region of the first primer oligonucleotide further comprises at least one modification (a nucleotide modification or a non-nucleotide modification) which prevents the polymerase from copying the polynucleotide tail by inhibiting the continuation of the polymerase dependent synthesis.
  • This modification is located, for example, at the junction between the first and second regions of the first primer oligonucleotide.
  • the first primer region of the first primer oligonucleotide is thus replicable by a polymerase so that a complementary sequence to this region can be generated during the synthesis of the second primer extension product (discussed in detail below) from the polymerase.
  • the polynucleotide tail of the second region of the first primer oligonucleotide is not copied by the polymerase. In certain embodiments, this is achieved by the modification in the second region, which stops the polymerase from the polynucleotide tail. In certain embodiments, this is achieved by nucleotide modifications in the second region, where the entire polynucleotide tail consists essentially of such nucleotide modifications and thus is uncopatible to the polymerase.
  • each first primer oligonucleotide is specific for each nucleic acid to be amplified.
  • each first primer oligonucleotide is specific for at least two of the nucleic acids to be amplified, each comprising substantially different sequences.
  • the first primer oligonucleotide is labeled with a characteristic marker, e.g. a fluorescent dye (e.g., TAMRA, fluorescein, Cy3, Cy5) or an affinity tag (e.g., biotin, digoxigenin) or an additional sequence fragment, e.g. for binding a specific oligonucleotide probe for detection or immobilization or barcode labeling.
  • a characteristic marker e.g. a fluorescent dye (e.g., TAMRA, fluorescein, Cy3, Cy5) or an affinity tag (e.g., biotin, digoxigenin) or an additional sequence fragment, e.g. for binding a specific oligonucleotide probe for detection or immobilization or barcode labeling.
  • a first primer oligonucleotide is used in particular in the first amplification as a primer.
  • it may be used as a primer in both the first and second amplifications.
  • Second primer oligonucleotide (component of the first amplification system)
  • primer oligonucleotide capable of binding with its 3 ' segment to a substantially complementary sequence within the nucleic acid or its equivalents to be amplified and initiating a specific second primer extension reaction.
  • primer oligonucleotide is capable of binding to the 3 ' segment of a first specific primer extension product of the first primer oligonucleotide and initiating polymerase-dependent synthesis of a second primer extension product.
  • the length of the second primer oligonucleotide can be between 15 and 100 nucleotides, in particular between 20 and 60 nucleotides, in particular between 30 and 50 nucleotides.
  • every second primer oligonucleotide is specific for each nucleic acid to be amplified.
  • every other primer oligonucleotide is specific for at least two of the nucleic acids to be amplified, each comprising different sequences.
  • the second primer oligonucleotide is labeled with a characteristic marker, e.g. a fluorescent dye (e.g., TAMRA, fluorescein, Cy3, Cy5) or an affinity tag (e.g., biotin, digoxigenin) or an additional sequence fragment, e.g. for binding a specific oligonucleotide probe for detection or immobilization or barcode labeling.
  • a characteristic marker e.g. a fluorescent dye (e.g., TAMRA, fluorescein, Cy3, Cy5) or an affinity tag (e.g., biotin, digoxigenin) or an additional sequence fragment, e.g. for binding a specific oligonucleotide probe for detection or immobilization or barcode labeling.
  • a second primer oligonucleotide is used in particular in the first amplification as a primer. In certain embodiments, it may be used as a primer in both the first and second amplifications.
  • a primer extension product results from enzymatic (polymerase-dependent) extension of a primer oligonucleotide as a result of template-dependent synthesis catalyzed by a polymerase.
  • a primer extension product comprises the sequence of the primer oligonucleotide in its 5 ' segment and the sequence of the extension product (also called extension product) which has been synthesized by a polymerase in a template-dependent form.
  • the extension product synthesized by the polymerase is complementary to the template strand on which it was synthesized.
  • a specific primer extension product (eg P1 .1-Ext and P2.1-Tex) of the first amplification (main product) comprises sequences of the nucleic acid chain to be amplified. It is the result of a specific synthesis or a correct execution of an intended primer extension reaction in which the nucleic acid chain to be specifically amplified serves as a template.
  • the sequence of the synthesized primer extension products coincides completely with the expected sequence of a nucleic acid to be amplified. In another embodiment, deviations in the sequence obtained may be tolerated by the theoretically expected sequence.
  • the degree of agreement of the sequence obtained is due to a Amplification with the sequence of the theoretically expected to be amplified nucleic acid, for example, between 90% and 100%, in particular, the match is over 95%, ideally, the agreement is greater than 98% (measured by the proportion of synthesized bases).
  • the length of the extension product of a specific primer extension product can be between 10 and 300 nucleotides, in particular between 10 and 180 nucleotides, in particular between 20 and 120 nucleotides, in particular between 30 and 80 nucleotides.
  • products of a specific template-dependent primer extension reaction of the third and fourth primers represent the major products or intermediates: the partial third primer extension product (P3.1-Ext Part 1, Figs. 15-18). or the complete primer extension product (P3.1-Ext, FIGS. 15-18), the partial fourth primer extension product (P4.1-Ext Part 1, FIGS. 15-18), or the complete primer Extension product (P4.1 -Ext, Figs. 15-18).
  • These products in certain embodiments, comprise a target sequence or its equivalents.
  • the second primer extension product comprises a target sequence and the first primer extension product comprises equivalents of the target sequence, namely the complementary strand.
  • the fourth primer extension product comprises a target sequence and the third primer extension product comprises equivalents of the target sequence, the complementary strand. In certain embodiments, the fourth primer extension product comprises portions of a target sequence and the third primer extension product comprises equivalents of these portions of the target sequence, namely the complementary strand.
  • the first primer extension product (P1 .1-Ext) and the second primer extension product (P2.1-Ext) together represent the first amplification fragment 1 .1 (also referred to as amplification product 1.1) of the first amplification (Fig . 1 ).
  • the third primer extension product (P3.1 -Ext) and the fourth primer extension product (P4.1-Ext) together constitute the second amplification fragment 2.1 (also referred to as the second amplification product 2.1) of the second amplification (Fig . 1 ).
  • the third primer extension product (P3.1 Ext) may also be referred to as a complete third primer extension product. This product is made using the fourth primer extension product (P4.1-Ext) as template.
  • the fourth primer extension product (P4.1-Ext) may also be referred to as a complete fourth primer extension product. This product is formed using the third primer extension product (P3.1-Ext) as template ( Figures 15-18).
  • a non-specific primer extension product includes sequences that have resulted as a result of a nonspecific or improper primer extension reaction. These include, for example, primer extension products that have arisen as a result of a false initiation event (false priming) or as a result of other side reactions, including polymerase-dependent sequence changes such as base substitution, deletion, etc.
  • the level of sequence aberrations of nonspecific primer extension products generally exceeds the ability of controller oligonucleotides to successfully displace such double-stranded by-products from their templates so that amplification of such by-products is slower or completely absent.
  • the extent of acceptance or the tolerance limit for deviations depend, for example, on the reaction temperature and the manner of sequencing deviation.
  • examples of nonspecific primer extension products are primer dimers or sequence variants which do not correspond to the nucleic acid to be amplified, e.g. Sequences which do not comprise a target sequence.
  • the assessment of a sufficient specificity of the amplification is often related to the task. In many amplification methods, some degree of unspecificity of the amplification reaction can be tolerated as long as the desired result can be achieved. In a particular embodiment, the proportion of nucleic acid chains to be amplified in the overall result of the reaction is more than 1%, in particular more than 10%, in particular more than 30%, based on the total amount of newly synthesized strands.
  • the nucleic acid to be amplified (expected result of the first amplification)
  • the nucleic acid to be amplified represents a nucleic acid chain which is to be amplified sequence-specifically or at least predominantly sequence-specifically by means of the first amplification using primers and controller oligonucleotide by the polymerase.
  • the nucleic acid to be amplified comprises both strands of the first amplification fragment 1 .1 (also referred to as first amplification product 1.1) (FIG. 1). It can be used as starting nucleic acid chain 2.1, wherein at least one of its strands can be used to initiate the second amplification.
  • the length of the nucleic acid to be amplified may be between 20 and 300 nucleotides, in particular between 30 and 200 nucleotides, in particular between 40 and 150 nucleotides, in particular between 50 and 100 nucleotides.
  • the nucleic acid sequence to be amplified may comprise one or more target sequences or their equivalents.
  • a nucleic acid to be amplified may comprise the sequences substantially complementary to a target sequence, which are propagated with similar efficiency as a target sequence in an amplification reaction and the target sequence or its Sections include.
  • the nucleic acid to be amplified may include additional sequence segments, for example, primer sequences, sequences with primer binding sites and / or sequence segments for binding of detection probes, and / or sequence segments for sequence encoding of strands by barcode sequences and / or sequence segments for binding to a solid phase.
  • the primer sequences or their sequence portions, as well as primer binding sites or their sequence portions may for example belong to sequence sections of a target sequence.
  • the nucleic acid to be amplified corresponds to the target sequence.
  • the target sequence forms part of the sequence of the nucleic acid sequence of the first amplification to be amplified.
  • a target sequence may be flanked by 3 ' side and / or 5 ' side of further sequences.
  • These further sequences may include, for example, binding sites for primers or their moieties, and / or comprising primer sequences or their moieties, and / or binding sites for detection probes, and / or adapter sequences for complementary binding to a solid phase (eg, Im Frame of microarrays, or bead-based analyzes) and / or include barcoding sequences for a digital signature of sequences.
  • a nucleic acid chain In order for the amplification to start, a nucleic acid chain must be added to the reaction mixture at the beginning of the reaction, which occurs as an initial template for the synthesis of the nucleic acid chain to be amplified. This nucleic acid chain is called the start nucleic acid chain. This start nucleic acid chain predetermines the arrangement of individual sequence elements which are important for the formation / synthesis / exponential amplification of a nucleic acid chain to be amplified.
  • the initial template (starting nucleic acid chain), which is supplied to an amplification reaction at the beginning, or which is added to the reaction mixture, corresponds to the sequence composition of the nucleic acid chain to be amplified.
  • the respective primers bind to the corresponding binding sites in the starting nucleic acid chain and initiate the synthesis of specific primer extension products.
  • specific primer extension products accumulate exponentially in the course of amplification and increasingly assume the role of templates for the synthesis of complementary primer extension products in exponential amplification.
  • the nucleic acid chain to be amplified is thus formed.
  • the major product of the reaction (the nucleic acid to be amplified) may be predominantly single-stranded or predominantly a complementary duplex. This can be done, for example, by the relative Concentrations of both primers and corresponding reaction conditions can be determined.
  • nucleic acid to be amplified include nucleic acids having substantially identical information content.
  • complementary strands of a nucleic acid to be amplified have identical information content and can be said to be equivalent.
  • a target sequence is a segment of a nucleic acid chain to be amplified which can serve as a characteristic sequence of the nucleic acid to be amplified. This target sequence can serve as a marker for the presence or absence of another nucleic acid.
  • This other nucleic acid thus serves as the source of the target sequence and can be for example a genomic DNA or RNA or parts of the genomic DNA or RNA (eg mRNA), or equivalents of the genomic DNA or RNA of an organism (eg cDNA, modified RNA such as rRNA, tRNA, microRNA, etc.), or defined changes in the genomic DNA or RNA of an organism, for example mutations (eg deletions, insertions, substitutions, additions, sequence amplification, eg repeat propagation in the context of microsatellite instability), splice variants, rearrangement variants (eg, T cell receptor variants), etc.
  • mutations eg deletions, insertions, substitutions, additions, sequence amplification, eg repeat propagation in the context of microsatellite instability
  • splice variants eg, rearrangement variants (eg, T cell receptor variants), etc.
  • the individual target sequences may represent a phenotypic trait, such as antibiotic resistance or prognostic information, and thus be of interest for diagnostic assays / assays.
  • a source / origin of a target sequence such a nucleic acid may comprise, for example, the target sequence as a sequence element of its strand.
  • a target sequence can thus serve as a characteristic marker for a particular sequence content of another nucleic acid.
  • the target sequence can be single-stranded or double-stranded. It may be substantially identical to the nucleic acid of the first amplification to be amplified or may be only part of the nucleic acid to be amplified.
  • Equivalents of the target sequence include nucleic acids with substantially identical information content.
  • complementary strands of a target sequence have identical informational content and can be said to be equivalent;
  • RNA and DNA variants of a sequence are also examples of equivalent informational content.
  • such a target sequence can be isolated from its original sequence environment and prepared for the amplification reaction.
  • a nucleic acid to be amplified comprises a target sequence.
  • the target sequence corresponds to the nucleic acid to be amplified.
  • a startup Nucleic acid chain 1 .1 a target sequence.
  • the target sequence corresponds to a starting nucleic acid chain 1 .1
  • the target sequence may be fully or partially included during the first amplification as part of the first amplification fragment 1 .1.
  • the second primer extension product comprises the target sequence or its portions and the second primer extension product thus comprises the strand complementary to this target sequence.
  • This strand has an equivalent information content.
  • the target sequence may be wholly or partially included during the second amplification as part of the second amplification fragment 2.1.
  • the fourth primer extension product comprises the target sequence or its portions, and the third primer extension product thus comprises the strand complementary to this target sequence.
  • This strand has an equivalent information content.
  • a nucleic acid chain In order for the first amplification to start, a nucleic acid chain must be added to the reaction mixture at the beginning of the reaction which occurs as an initial template for the synthesis of the nucleic acid chain to be amplified (FIG. 1).
  • This nucleic acid chain is referred to as the starting nucleic acid chain of the first amplification (starting nucleic acid chain 1.1).
  • This start nucleic acid chain predetermines the arrangement of individual sequence elements which are important for the formation / synthesis / exponential amplification of a nucleic acid chain to be amplified.
  • Such a starting nucleic acid chain can be present in single-stranded or double-stranded form at the beginning of the reaction.
  • the complementary strands of the starting nucleic acid chain are separated, regardless of whether the nucleic acid was originally double- or single-stranded, the strands can serve as a template for the synthesis of specific complementary primer extension products.
  • the starting nucleic acid chain 1 .1 comprises, in certain embodiments, a target sequence.
  • a start nucleic acid chain furthermore comprises at least one predominantly single-stranded sequence segment, to which at least one of the primers of the amplification system can bind predominantly complementarily with its 3 ' segment, so that the polymerase used contains such a primer, when hybridized to the starting nucleic acid chain, may extend template-specific incorporation of dNTPs.
  • the start-up nucleic acid chain may also comprise segments which are not the target sequence but which can bind primers.
  • a nucleic acid chain In order for the second amplification to start, at the beginning of the second amplification reaction, a nucleic acid chain must be present in the reaction mixture or be added thereto, which occurs as an initial template for the synthesis of the second amplification fragment (FIG. 1).
  • This nucleic acid chain is referred to as the starting nucleic acid chain of the second amplification (starting nucleic acid chain 2.1).
  • This start nucleic acid chain 2.1 specifies the arrangement of individual sequence elements which are important for the formation / synthesis / exponential amplification of a nucleic acid chain to be amplified.
  • the first amplification fragment 1.1 generated during the first amplification serves as starting nucleic acid chain 2.1 for the second amplification.
  • This start nucleic acid chain 2.1 thus comprises or consists of the first primer extension product produced in the first amplification.
  • the starting nucleic acid chain 2.1 comprises in certain embodiments a target sequence.
  • PCR amplification also called second amplification
  • PCR is a polymerase chain reaction which generally serves to amplify DNA fragments. Many variants of a PCR reaction are known in the art. Among other things, allel-specific PCR, genotyping PCR, assymetric PCR, solid-phase PCR, digital PCR (partitioning / microdroplet PCR), multiplex PCR, real-time PCR using probes or intercalating dyes (eg Molecular beacons or 5 ' -3 ' exonuclease or two oligonucleotide probes with FRET pairs), clamp PCR using blocking probes, quantitative PCR, nested PCR, etc.
  • probes or intercalating dyes eg Molecular beacons or 5 ' -3 ' exonuclease or two oligonucleotide probes with FRET pairs
  • clamp PCR using blocking probes
  • quantitative PCR quantitative PCR
  • nested PCR etc.
  • a low temperature temperature range for binding of primers to their predominantly specific sequence segments and extension to form a complementary strand at least one temperature range involving predominantly sequence-unselective separation of Strands are made so that freshly synthesized primer extension products separate from their templates.
  • PCR can be performed in liquid phase using PCR tubes / microtiter plates or on a solid phase or in microfluidic systems or in situ.
  • PCR primer pair (the third and the fourth primer oligonucleotide)
  • a PCR primer pair typically includes two oligonucleotides capable of supporting amplification of a nucleic acid fragment by a PCR method.
  • a PCR primer pair comprises a third and a fourth primer oligonucleotide.
  • Such primers are known in the art.
  • PCR primers are generally referred to herein as P3 and P4 (as opposed to a controller Abhangige Amplification P1 and P2).
  • PCR primers are known to a person skilled in the art. Typically, they are oligonucleotides of about 15 to about 60 nucleotides in length, which comprise at least in their 3 ' segment sequences capable of binding to complementary segments of a target sequence and using this target sequence as a template to initiate template-dependent synthesis by means of a polymerase.
  • PCR primers may be used in solution or also coupled to a solid phase (e.g., beads, micrititer plates). These variants are also well known to a person skilled in the art.
  • the controller oligonucleotide ( Figure 1, C1. 1) is a single-stranded nucleic acid chain which includes a predefined substantially complementary sequence in a portion of the first primer extension product which is specifically generated in the amplification of the nucleic acid to be amplified (first amplification ). This allows the controller oligonucleotide to bind substantially complementary to the first primer oligonucleotide and at least to the 5 ' segment of the specific extension product of the first primer oligonucleotide.
  • the controller oligonucleotide in its inner sequence segment comprises nucleotide modifications that prevent the polymerase from synthesizing a complementary strand using the controller oligonucleotide as a template when the first and / or third primer oligonucleotide is attached to the controller Oligonucleotide is bound complementarily.
  • the controller oligonucleotide consists entirely of modified nucleotides that block its template function.
  • it is advantageous if the controller oligonucleotide consists only in part of modified nucleotides that block its template function.
  • the controller oligonucleotide is further capable of completely or partially displacing the second specific primer extension product from binding with the first specific primer extension product under strand reaction under the chosen reaction conditions.
  • the controller oligonucleotide with its complementary regions attaches itself to the first specific primer extension product.
  • this leads to recovery of a single-stranded state of the 3 ' segment of the second specific primer extension product suitable for binding the first primer oligonucleotide so that a new primer extension reaction can take place.
  • the controller oligonucleotide may be separated from binding with the first primer extension product by strand displacement, for example, by polymerase and / or by the second primer oligonucleotide.
  • a detection system comprises at least one oligonucleotide probe and at least one fluorescent reporter (a fluorophore).
  • the detection system should be capable of carrying out the synthesis of the first and / or the second and / or the third and / or the fourth primer extension product (P1 1-Ext, P2.1-Ext, P3.1-Ext, P4. 1-text). This is done by using oligonucleotide probes, which are able to bind to the respective primer extension product and thereby generate a specific signal, or bring about a change in the signal. This change may be an increase or decrease in fluorescence intensity.
  • a detection system may further comprise additional components. Such components include in particular fluorescence quencher and / or donor fluorophore.
  • the detection system may also include the controller oligonucleotide.
  • the array of fluorescent reporter, fluorescence quencher, donor fluorophore on the oligonucleotide probe or on the pair comprising oligonucleotide probe and controller oligonucleotide makes it possible to detect the binding events to the first primer extension product.
  • a fluorophore is a chemical compound or molecule which, when excited by electromagnetic radiation, is capable of emitting electromagnetic radiation (light) (emission). This radiation emitted by the fluorophore (emission) can be detected as a fluorescence signal by suitable technical means.
  • a reporter can be covalently bound to an oligonucleotide.
  • fluorophores are known which can be coupled to oligonucleotides (e.g., FAM, TAMRA, HEX, ROX, Cy dyes, Alexa dyes).
  • a quencher is a chemical compound / molecule capable of reducing the emission of a fluorophore by direct contact (contact quenching) or by energy transfer (eg, FRET).
  • a quencher must be placed in close proximity to the fluorophore for significant signal attenuation.
  • Advantageous for a significant signal reduction of a fluorescence reporter by a quencher are distances between the reporter and quencher of less than 25 nucleotides, in particular of less than 15 nucleotides, in particular of less than 5 nucleotides.
  • the distance between these components must be increased accordingly, it is advantageous if the distance between the reporter and quencher of more than 15 nucleotides, in particular more than 20 nucleotides, in particular more than 40 nucleotides is increased.
  • the distance caused by the nucleotide sequence must be due to an extended nucleotide sequence. For example, if hairpin structures form, spatial distance may no longer exist.
  • fluorophore-quencher pairs are preferred which have more than 25% spectral overlap. (e.g., FAM / TAMRA).
  • Donor fluorophores are chemical compounds / molecules that are capable of absorbing electromagnetic radiation and transferring it to another fluorophore (acceptor) through energy transfer (eg, as FRET) to excite this fluorophore, and as a result, itself Light emission generated. Upon emission, a fluorescence signal is generated. As a rule, the donor and the acceptor form a fluorescence resonance energy transfer pair (a FRET pair). In general, a donor must be placed in close proximity to the acceptor (fluorophore) for this signal generation to occur to any significant extent.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer pair
  • distances between the reporter and donor are distances between the reporter and donor of less than 25 nucleotides, in particular less than 15 nucleotides, in particular less than 5 nucleotides.
  • the removal of the FRET effect from donor to acceptor is usually achieved by increasing the distance between both partners of a FRET pair. It is advantageous if the distance between the reporter and donor is increased to more than 15 nucleotides, in particular to more than 20 nucleotides, in particular to more than 40 nucleotides.
  • the spatial distance between the individual components is brought about, in particular, by connecting two components via a nucleotide sequence which can hybridize with a specific part of the target sequence.
  • a suitable agent leads to a complete or partial separation of a first double strand (consisting for example of A1 and B1 strand) and for the simultaneous / parallel formation of a new second double strand, wherein at least one of the strands ( A1 or B1) is involved in the formation of this new second strand.
  • the formation of a new second duplex may be accomplished using an already existing complementary strand which is generally in single-stranded form at the beginning of the reaction.
  • the means of strand displacement for example, a preformed single-stranded strand C1, which has a complementary sequence to the strand A1, acts on the first already formed double strand (A1 and B1) and enters into a complementary bond with the strand A1, whereby the strand B1 aus
  • the displacement of B1 is completed, the result of the C1 action is a new duplex (A1: C1) and a single strand B1.
  • the displacement of B1 is incomplete, it depends
  • a complex of partially double-stranded A1: B1 and A1: C1 may be present as an intermediate.
  • the formation of a new second duplex may occur under concurrent enzymatic synthesis of the complementary strand, with one strand of the first preformed duplex appearing as a template for synthesis by the polymerase.
  • the means of strand displacement acts on the first already preformed duplex (A1 and B1) and synthesizes a complementary to strand A1 complementary strand D 1, wherein at the same time the strand B1 from the bond with the strand A1 is displaced.
  • nucleic acid mediated strand displacement is meant a sum / series of intermediate steps which can be in equilibrium with one another and, as a result, the temporary or permanent opening of a first preformed duplex (consisting of complementary strands A1 and B1) and formation of a new one second duplex (consisting of complementary strands A1 and C1), wherein A1 and C1 are complementary to each other.
  • an essential structural prerequisite for the initiation of strand displacement is the creation of a spatial proximity between a duplex end (preformed first duplex of A1 and B1) and a single-stranded strand (C1) which initiates strand displacement (where A1 and C1 can form a complementary strand).
  • Such spatial proximity can be brought about in particular by means of a single-stranded overhang (in the literature examples are known with short overhangs, referred to in English as "Toehold", see above), which binds the single-stranded strand (C1) temporarily or permanently complementary, and thus brings complementary Segqmente the strand C1 and A1 sufficiently close, so that a successful strand displacement of the strand B1 can be initiated.
  • the efficiency of initiation of nucleic acid-mediated strand displacement is generally greater the closer the complementary segments of strand A1 and C1 are positioned to each other.
  • nucleic acid-mediated strand displacement in internal segments Another essential structural prerequisite for efficiently continuing nucleic acid-mediated strand displacement in internal segments is high complementarity between strands (e.g., between A1 and C1) which must form a new duplex.
  • strands e.g., between A1 and C1
  • single nucleotide mutations in C1 can lead to the disruption of strand displacement (described, for example, for branch migration).
  • the present invention makes use of the ability of complementary nucleic acids to sequence-dependent nucleic acid-mediated strand displacement.
  • Reaction conditions include, but are not limited to, buffer conditions, temperature conditions, duration of reaction, and concentrations of respective reaction components.
  • the amount of specific produced nucleic acids to be amplified accumulates in an exponential manner.
  • the reaction comprising the synthesis of the extension products can be carried out for as long as necessary to produce the desired amount of the specific nucleic acid sequence.
  • the inventive method is carried out in particular continuously.
  • the amplification reaction proceeds at the same reaction temperature, wherein the temperature is in particular between 50 ° C and 70 ° C.
  • the reaction temperature can also be controlled variably, so that individual steps of the amplification run at respectively different temperatures.
  • reagents required for the exponential amplification are in particular already present at the beginning of a reaction in the same batch.
  • reagents may also be added at later stages of the process.
  • no helicases or recombinases are used in the reaction mixture to separate the newly synthesized duplexes of the nucleic acid to be amplified.
  • the reaction mixture does not include biochemical energy-donating compounds such as ATP.
  • the amount of nucleic acid to be amplified at the beginning of the reaction can be between a few copies and several billion copies in one run.
  • the amount of nucleic acid chain to be amplified may be unknown.
  • the reaction may also contain other nucleic acids which are not to be amplified. These nucleic acids may be derived from natural DNA or RNA or their equivalents. In certain embodiments, control sequences are in the same approach, which should also be amplified in parallel to the nucleic acid to be amplified.
  • a molar excess of about 10 3 : 1 to about 10 15 : 1 (primer: template ratio) of the primers used and the controller oligonucleotide is added to the reaction mixture, which comprises template strands for the synthesis of the nucleic acid sequence to be amplified.
  • the amount of target nucleic acids may not be known if the method of the invention is used in diagnostic applications, so that the relative amount of the primer and the controller oligonucleotide relative to the complementary strand can not be determined with certainty.
  • the amount of primer added will generally be present in molar excess relative to the amount of complementary strand (template) when the sequence to be amplified is contained in a mixture of complicated long-chain nucleic acid strands. A large molar excess is preferred to improve the efficiency of the process.
  • the concentrations of primer 1, primer 2 and controller oligonucleotides used are, for example, in the range between 0.01 pmol / l and 100 pmol / l, in particular between 0.1 pmol / l and 100 pmol / l, in particular between 0, 1 pmol / l and 50 pmol / l, in particular between 0.1 pmol / l and 20 pmol / l.
  • the high concentration of components can increase the rate of amplification.
  • the respective concentrations of individual components can be varied independently of one another in order to achieve the desired reaction result.
  • the concentration of polymerase ranges between 0.001 pmol / l and 50 pmol / l, in particular between 0.01 pmol / l and 20 pmol / l, in particular between 0.1 pmol / l and 10 pmol / l.
  • the concentration of individual dNTP substrates is in the range between 10 pmol / l and 10 mmol / l, in particular between 50 pmol / l and 2 mmol / l, in particular between 100 pmol / l and 1 mmol / l.
  • the concentration of dNTP can affect the concentration of divalent metal cations. If necessary, this will be adjusted accordingly.
  • divalent metal cations Mg2 +, for example, are used.
  • As a corresponding anion for example, CI, acetate, sulfate, glutamate, etc. can be used.
  • the concentration of divalent metal cations is adapted, for example, to the optimum range for the particular polymerase and comprises ranges between 0.1 mmol / l and 50 mmol / l, more preferably between 0.5 mmol / l and 20 mmol / l, more preferably between 1 mmol / l and 15 mmol / l.
  • the enzymatic synthesis is generally carried out in a buffered aqueous solution.
  • buffer solutions dissolved conventional buffer substances, such as Tris-HCl, Tris-acetate, potassium glutamate, HEPES buffer, sodium glutamate in conventional concentrations can be used.
  • the pH of these solutions is usually between 7 and 9.5, in particular about 8 to 8.5.
  • the buffer conditions can be adapted, for example, according to the recommendation of the manufacturer of the polymerase used.
  • Tm depressants e.g., DMSO, betaines, TPAC
  • Tm depressors e.g., DMSO, betaines, TPAC
  • Tween 20 or T riton 100 can also be added in conventional amounts to the buffer.
  • EDTA or EGTA can be added to complex heavy metals in conventional amounts.
  • Polymerase stabilizing substances such as trehalose or PEG 6000 may also be added to the reaction mixture.
  • the reaction mixture contains no inhibitors of the strand displacement reaction and no inhibitors of polymerase-dependent primer extension.
  • the reaction mixture contains DNA-binding dyes, especially intercalating dyes, such as e.g. EvaGreen or SybrGreen.
  • intercalating dyes such as e.g. EvaGreen or SybrGreen.
  • Such dyes may possibly enable the detection of the formation of new nucleic acid chains.
  • the reaction mixture can furthermore contain proteins or other substances which, for example, originate from an original material and which do not influence the amplification.
  • the temperature has a significant influence on the stability of the double strands.
  • no temperature conditions are used during the amplification reaction, which essentially result in the separation of double strands of the nucleic acid to be amplified in the absence of controller oligonucleotide. This is to ensure that the double-stranded separation of nucleic acid chains to be amplified is dependent on the presence of the controller oligonucleotide throughout the course of the amplification.
  • the reaction temperature may be around the melting temperature (i.e., Tm plus / minus 3 ° to 5 ° C) of the nucleic acid to be amplified.
  • Tm melting temperature
  • the reaction temperature may be around the melting temperature (i.e., Tm plus / minus 3 ° to 5 ° C) of the nucleic acid to be amplified.
  • sequence differences between the controller oligonucleotide and the synthesized primer extension product can generally be well tolerated in a strand displacement reaction.
  • controller oligonucleotide On the sequence specificity of the nucleic acid to be amplified is higher than at temperature conditions around the melting temperature (Tm) of the nucleic acid chain to be amplified.
  • primer duplexes may spontaneously decay at the extension temperature under the conditions mentioned; without sequence-dependent strand displacement by controller oligonucleotide.
  • the reaction temperature with a reduced sequence-specific amplification in ranges between about (Tm minus 3 ° C) and about (Tm minus 10 ° C), in particular between about (Tm minus 5 ° C) and about (Tm minus 10 ° C). At such temperature, sequence differences between controller oligonucleotide and the synthesized primer extension product are less tolerated in a strand displacement reaction.
  • a high sequence specificity of the amplification of the method is achieved, in particular, when the newly synthesized strands of the nucleic acid to be amplified can not spontaneously dissociate into single strands under reaction conditions.
  • the sequence-specific strand displacement by controller oligonucleotide plays a crucial role in sequence-specific strand separation and is significantly responsible for the sequence specificity of the amplification reaction. This can generally be achieved if the reaction temperature is well below the melting temperature of both strands of the nucleic acid to be amplified and no further components are used for strand separation, for example no helicases or recombinases.
  • the reaction temperature in a sequence-specific amplification in ranges between about (Tm minus 10 ° C) and about (Tm minus 50 ° C), in particular between about (Tm minus 15 ° C) and about (Tm minus 40 ° C), in particular between about (Tm minus 15 ° C) and about (Tm minus 30 ° C).
  • the maximum reaction temperature in the course of the entire amplification reaction is not increased above the melting temperature of the nucleic acid chain to be amplified.
  • the reaction temperature may be raised at least once above the melting temperature of the nucleic acid chains to be amplified.
  • the increase in temperature can be carried out, for example, at the beginning of the amplification reaction and lead to the denaturation of double strands of a genomic DNA. It should be noted that during such a step, the dependence of the double strand separation on the effect of the controller oligonucleotide is canceled or at least significantly reduced.
  • the reaction temperatures of the individual steps of the amplification reaction can be in the range of about 15 ° C to about 85 ° C, more preferably in the range of about 15 ° C to about 75 ° C, in particular in the range of about 25 ° C to about 70 ° C.
  • a reaction temperature of the amplification reaction of 65 ° C was used, wherein the Tm of the nucleic acids to be amplified between about 75 ° C and about 80 ° C.
  • the duplex of the nucleic acid to be amplified was stable under reaction conditions and the amplification reaction sequence-specific.
  • the reaction temperature can be optimally adjusted for each individual reaction step, so that such a temperature is brought about for each reaction step.
  • the amplification reaction thus comprises a repetitive change of temperatures, which are repeated cyclically.
  • reaction conditions are standardized for a plurality of reaction steps, so that the number of temperature steps is less than the number of reaction steps.
  • at least one of the steps of the amplification takes place at a reaction temperature which differs from the reaction temperature of other steps of the amplification. The reaction is thus not isothermal, but the reaction temperature is changed cyclically.
  • the lower temperature range includes, for example, temperatures between 25 ° C and 60 ° C, in particular between 35 ° C and 60 ° C, in particular between 50 ° C and 60 ° C and the upper temperature range includes, for example, temperatures between 60 ° C and 75 ° C, especially between 60 ° C and 70 ° C.
  • the lower temperature range includes, for example, temperatures between 15 ° C and 50 ° C, in particular between 25 ° C and 50 ° C, in particular between 30 ° C and 50 ° C and the upper temperature range includes, for example, temperatures between 50 ° C and 75 ° C, in particular between 50 ° C and 65 ° C.
  • the lower temperature range includes, for example, temperatures between 15 ° C and 40 ° C, in particular between 25 ° C and 40 ° C, in particular between 30 ° C and 40 ° C and the upper temperature range includes, for example, temperatures between 40 ° C and 75 ° C, especially between 40 ° C and 65 ° C.
  • the temperature can be kept constant in the respective range or can be changed as a temperature gradient (decreasing or rising).
  • Any induced temperature can be maintained for a period of time, resulting in an incubation step.
  • the reaction mixture may thus be incubated for a period of time during amplification at a selected temperature. This time may be different for the particular incubation step and may be responsive to the progress of the particular reaction at a given temperature (e.g., primer extension or strand displacement, etc.).
  • the time of an incubation step may comprise the following ranges: between 0.1 sec and 10,000 sec, in particular between 0.1 sec and 1000 sec, in particular between 1 sec and 300 sec, in particular between 1 sec and 100 sec.
  • a temperature change By means of such a temperature change, individual reaction steps can be carried out, in particular at a selected temperature. As a result, yields of a particular reaction step can be improved.
  • temperature changes or temperature changes between individual temperature ranges may be required several times.
  • a synthesis cycle may thus comprise at least one temperature change. Such a temperature change can be performed routinely, for example, in a PCR device / thermocycler as a time program.
  • an amplification method is preferred in which at least one of the steps comprising strand displacement and at least one of the steps comprising primer extension reactions take place simultaneously and in parallel and under the same reaction conditions.
  • a primer extension reaction of at least one primer oligonucleotide e.g., of the first primer oligonucleotide
  • the strand displacement is carried out with the aid of controller oligonucleotide and the one further primer extension reaction (for example, by the second primer oligonucleotide), in particular in the reaction step in the upper temperature range.
  • an amplification method is preferred in which at least one of the steps comprising strand displacement by the controller oligonucleotide and at least one of the steps comprising primer extension reaction is included performed different temperatures.
  • primer extension reactions of at least one primer oligonucleotide eg, of the first primer oligonucleotide and / or of the second primer oligonucleotide
  • the strand displacement takes place with the assistance of controller oligonucleotide, in particular in the reaction step in the upper temperature range.
  • the steps of an amplification reaction proceed under identical reaction conditions.
  • the amplification process may be carried out under isothermal conditions, i. that no temperature changes are required to carry out the process.
  • the entire amplification reaction is carried out under constant temperature, i. the reaction is isothermal.
  • the time of such a reaction comprises, for example, the following ranges: between 100 sec and 30,000 sec, in particular between 100 sec and 10,000 sec, in particular between 100 sec and 1000 sec.
  • a synthesis cycle The sum of all process steps, which leads to a doubling of the amount of a nucleic acid chain to be amplified, can be referred to as a synthesis cycle.
  • Such a cycle can be correspondingly isothermal or else characterized by changes in the temperature in its course. The temperature changes can be repeated from cycle to cycle and made identical.
  • amplification methods in which the maximum achievable temperature essentially only permits a strand separation with the aid of controller oligonucleotide if more than 5 nucleotides of the third region of the controller oligonucleotide can form a complementary bond with the first primer extension product especially if more than 10, especially if more than 20 nucleotides of the controller oligonucleotide bind with the first primer extension product.
  • the desired level of specificity can be determined.
  • a process step can be carried out at its constant temperature repetition over the entire duration of the process or at different temperatures. Individual process steps can each be carried out in succession by adding individual components. In a particular embodiment, all reaction components necessary for the execution of an amplification are present at the beginning of an amplification in a reaction mixture.
  • the start of an amplification reaction can be carried out by adding a component, e.g. by adding a nucleic acid chain comprising a target sequence (e.g., a starting nucleic acid chain), or a polymerase or divalent metal ions, or also by providing reaction conditions necessary for amplification, e.g. Setting a required reaction temperature for one or more process steps.
  • a component e.g. by adding a nucleic acid chain comprising a target sequence (e.g., a starting nucleic acid chain), or a polymerase or divalent metal ions, or also by providing reaction conditions necessary for amplification, e.g. Setting a required reaction temperature for one or more process steps.
  • the amplification can be carried out until the desired amount of nucleic acid to be amplified is reached.
  • the amplification reaction is carried out for a time which would have been sufficient in the presence of a nucleic acid to be amplified in order to obtain a sufficient amount.
  • the amplification reaction is carried out over a sufficient number of synthesis cycles (doubling times) which would have been sufficient in the presence of a nucleic acid to be amplified in order to obtain a sufficient amount.
  • the reaction can be stopped by various interventions. For example, by changing the temperature (e.g., cooling or heating, whereby, for example, polymerase is impaired in its function) or by adding a substance which stops a polymerase reaction, e.g. EDTA or formamide.
  • a temperature e.g., cooling or heating, whereby, for example, polymerase is impaired in its function
  • a substance which stops a polymerase reaction e.g. EDTA or formamide.
  • the amplified nucleic acid chain can be used for further analysis.
  • synthesized nucleic acid chains can be analyzed by various detection methods. For example, fluorescence-labeled oligonucleotide probes can be used or sequencing methods (Sanger sequencing or Next-Generation sequencing), solid-phase analyzes such as microarray or bead-array analyzes, etc.
  • the synthesized nucleic acid chain can be used as a substrate / template in further primer extension reactions become.
  • the progress of the synthesis reaction is monitored during the reaction. This can be done, for example, by using intercalating dyes, e.g. Sybrgreen or Evagreen, or using labeled primers (e.g., Lux primer or Scorpion primer) or using fluorescently labeled oligonucleotide probes.
  • intercalating dyes e.g. Sybrgreen or Evagreen
  • labeled primers e.g., Lux primer or Scorpion primer
  • fluorescently labeled oligonucleotide probes e.g., fluorescently labeled oligonucleotide probes.
  • the detection of the change in fluorescence during amplification is implemented in a detection step of the method.
  • the temperature and the duration of this step can be adapted to the respective requirements of the oligonucleotide probe.
  • the temperatures of the detection step include, for example, ranges between 20 ° C and 75 ° C, in particular between 40 and 70 ° C, in particular between 55 and 70 ° C.
  • the reaction is illuminated with light of a wavelength which is capable of excitation into a used fluorophore of the detection system (a donor or a fluorescent reporter).
  • the signal detection is usually parallel to excitation, whereby the specific fluorescence signal is detected and its intensity is quantified.
  • the amplification method can be used to verify the presence of a target nucleic acid chain in a biological material or diagnostic material as part of a diagnostic procedure.
  • reaction conditions of a PCR are well known to a person skilled in the art.
  • temperatures shown in FIGS. 3-11 include the following ranges:
  • T1 55 ° C (+/- 5 ° C)
  • T2 65 ° C (+/- 5 ° C)
  • T3 95 ° C (+/- 5 ° C)
  • T4 45 ° C (+/- 5 ° C)
  • T5 70 ° C (+/- 5 ° C)
  • temperatures shown in FIGS. 3-11 include the following ranges:
  • T1 55 ° C (+/- 10 ° C)
  • T2 65 ° C (+/- 10 ° C)
  • T3 95 ° C (+/- 10 ° C)
  • T4 45 ° C (+/- 10 ° C)
  • T5 70 ° C (+/- 10 ° C)
  • temperatures shown in FIGS. 3-11 include the following ranges:
  • T1 55 ° C (+/- 15 ° C)
  • T2 65 ° C (+/- 10 ° C)
  • T3 95 ° C (+/- 10 ° C)
  • T4 45 ° C (+/- 20 ° C)
  • T5 70 ° C (+/- 10 ° C)
  • the temperatures shown in FIGS. 3-11 include the following ranges:
  • T1 55 ° C (+/- 5 ° C)
  • T2 65 ° C (+/- 3 ° C)
  • T3 95 ° C (+/- 10 ° C)
  • T4 45 ° C (+/- 5 ° C)
  • T5 70 ° C (+/- 3 ° C)
  • the time of incubation during individual temperature steps may, in some embodiments, be between 0.1 sec and 60 min, in particular between 1 sec and 10 min, in particular between 1 sec and 5 min.
  • PCR cycles The cyclic temperature changes are often referred to as PCR cycles.
  • a PCR cycle involves a complete change in temperature from T1, T2 to T3.
  • the temperature ranges used are primarily intended to support the following steps of the second amplification:
  • T1, T2, T4 and T5 Temperatures Hybridization of the third and fourth primers to their complementary segments in the respective template strands and extension of a third and fourth primer extension product.
  • T3 temperature is used to separate double strands comprising at least one of the primer extension products. All double-stranded nucleic acid chains (eg double-stranded target sequences, first amplification fragments 1 .1, second amplification fragments 2. 1) and intermediates comprising P1 .1-ext and P4.1-Ext-part 1 or P2 and P3.1 -Ext part 1) converted by the action of temperature in the single-stranded form.
  • All double-stranded nucleic acid chains eg double-stranded target sequences, first amplification fragments 1 .1, second amplification fragments 2.
  • intermediates comprising P1 .1-ext and P4.1-Ext-part 1 or P2 and P3.1 -Ext part
  • T3 temperature may serve to activate hot-start forms of the second polymerases (e.g., templates inactivated by an antibody) or to inactivate a first polymerase.
  • thermolabile controller oligonucleotides can be cleaved by this temperature (T3).
  • thermoactivatable primers three and four can be activated.
  • reaction temperatures in combination with respective PCR primers can influence the production of products / formation of intermediates during the second amplification.
  • the amount of yields of individual products and intermediates depends on several factors. For example, higher concentrations of individual primers generally favor the yields of products / intermediates. Furthermore, the formation of products / intermediates can be influenced by the reaction temperature and the binding / affinity of individual reactants to each other (affinity of the binding of individual For example, longer oligonucleotides generally bind better than shorter oligonucleotides at higher temperatures, and CG content may also play a role in complementary sequence segments: CG-richer sequences also bind more strongly than AT-rich at higher temperatures sequences. Furthermore, modifications such as MGB or 2-amino-dA or LNA can increase the binding strength of primers to their respective complementary segments, which also results in preferential binding of primers at higher temperatures.
  • longer primers are used for the PCR (e.g., between 25 and 60 nucleotides, with a CG content of over 40%) having a relatively higher Tm with their complementary regions (e.g., 60-70 ° C).
  • This allows hybridization steps and primer extension steps of the second amplification to be performed at higher temperatures (e.g., T2 or T5).
  • the reaction in combination with relatively short first and second primers (from the first amplification), the reaction can be controlled to preferentially form primer extension products P4.1-Ext and P3.1-Ext and co-amplify primer extension products starting from P1 .1 and P2.1 during the PCR amplification can be largely suppressed.
  • third and fourth primers including, for example, only a short 3 ' segment capable of binding to the target sequence or its equivalents (eg, this segment is between 6 and 15 nucleotides in length)
  • this segment is between 6 and 15 nucleotides in length
  • PCR primers which comprise, for example, mismatches to only essentially complementary first amplification fragment 1 .1.
  • primer binding of the third and / or fourth primer to their complementary segments of the first amplification fragment occurs such that, despite a small length of the complementary segment and / or mismatch, the polymerase starting from these primers hybridized to individual strands of the first amplification fragment can perform a template-dependent primer extension and primer extension products comprising a third and fourth primer oligonucleotide can be synthesized.
  • the enzymatic synthesis also takes place in the second amplification generally in a buffered aqueous solution.
  • buffer solutions dissolved conventional buffer substances, such as Tris-HCl, Tris-acetate, potassium glutamate, HEPES buffer, sodium glutamate in conventional concentrations can be used.
  • the pH of these solutions is usually between 7 and 9.5, in particular about 8 to 8.5.
  • the buffer conditions can be adapted, for example, according to the recommendation of the manufacturer of the polymerase used.
  • Tm depressants e.g., DMSO, betaines, TPAC
  • Tm depressors e.g., DMSO, betaines, TPAC
  • Tween 20 or T riton 100 can also be added in conventional amounts to the buffer.
  • EDTA or EGTA can be added to complex heavy metals in conventional amounts.
  • Polymerase stabilizing substances such as trehalose or PEG 6000 may also be added to the reaction mixture.
  • the nucleic acid chain used or to be used at the beginning of an amplification reaction can be referred to as a starting nucleic acid chain (FIG. 1).
  • a starting nucleic acid chain comprises a target sequence.
  • primer extension reactions By binding primers to their corresponding primer binding sites (PBS 1 and PBS 2) and initiating appropriate primer extension reactions, this is done by generating first primer extension products. These are synthesized as specific copies of the nucleic acid chain present at the beginning of the reaction.
  • this nucleic acid chain (starting nucleic acid chain) to be used in the reaction mixture prior to the beginning of the amplification reaction may be identical to the nucleic acid chain to be amplified.
  • the amplification reaction only increases the amount of such a nucleic acid chain.
  • the nucleic acid to be amplified and the starting nucleic acid chain differ in that the starting nucleic acid chain differs from the arrangement individual sequence elements of the nucleic acid sequence to be amplified, but the sequence composition of the starting nucleic acid chain may differ from the sequence of the nucleic acid chain to be amplified.
  • new sequence contents based on starting nucleic acid chain
  • sequence elements of a nucleic acid chain to be amplified may differ from such sequence elements of a starting nucleic acid chain in their sequence composition (eg primer binding sites or primer sequences).
  • the starting nucleic acid serves only as an initial template for the specific synthesis of the nucleic acid chain to be amplified. This initial template may remain in the reaction mixture until the end of the amplification. Due to the exponential nature of the amplification, however, the amount of nucleic acid chain to be amplified at the end of an amplification reaction is greater than the amount of starting nucleic acid chain added to the reaction.
  • the startup nucleic acid chain may comprise at least one sequence segment which is not amplified. Such a start nucleic acid chain is thus not identical to the sequence to be amplified. Such sections which are not to be amplified may represent, for example as a consequence of sequence preparation steps or as a consequence of previous sequence manipulation steps, a sequence section of a starting nucleic acid chain.
  • the starting nucleic acid sequence to be inserted into the reaction mixture prior to initiation of the reaction includes at least one target sequence.
  • such a starting nucleic acid chain includes at least one target sequence and still other non-target sequence sequences.
  • sequence segments comprising the target sequence are multiplied exponentially and other sequence segments are either not or only partially exponentially propagated.
  • An example of such a start nucleic acid chain is a nucleic acid sequence which includes a target sequence and which comprises a Sequence Fragment-A and comprises a Sequence Fragment-B.
  • Sequence fragment-A of the starting nucleic acid chain comprises a sequence which has significant homology with the sequence of one of the two primers used in the amplification or is substantially identical to the copiable portion of the 3 ' segment of the one primer. Upon synthesis of a complementary strand to this segment, a complementary sequence is generated which represents a corresponding primer binding site.
  • sequence fragment B of the starting nucleic acid chain comprises a sequence which is complementary to the binding of a corresponding further primer or its 3 ' segment is suitable for forming an extension-capable primer-template complex, wherein sequence fragment A and sequence fragment B are predominantly non-complementary in relation to each other.
  • the reaction mixture of an amplification process is given a starting nucleic acid chain which has the following properties:
  • sequence fragment-A is located in the 5 ' segment of the starting nucleic acid chain.
  • this sequence fragment-A forms a restriction of the nucleic acid chain strand in the 5 ' direction.
  • sequence fragment-B lies in the 3 'direction, relative to the binding site of the first primer and relative to the polarity of the first primer ("downstream"), from sequence fragment-A.
  • this sequence fragment-B forms a restriction of the nucleic acid chain strand in the 3 ' direction.
  • this sequence fragment-B does not represent a 3 ' -chain boundary of the nucleic acid chain strand, but is flanked by further sequences from the 3 ' side.
  • these sequences are not targeting sequences and do not participate in exponential amplification.
  • the target sequence comprises at least one of either Sequence Fragment A or Sequence Fragment B. In certain embodiments, the target sequence is between sequence fragment A and sequence fragment B.
  • such a starting nucleic acid chain can serve as a template for the synthesis of a first primer extension product.
  • the starting nucleic acid chain can be provided, for example, in the context of a primer extension reaction using the second primer oligonucleotide as a sequence segment of a longer starting nucleic acid chain during a preparatory step before the exponential amplification and converted into a single-stranded form.
  • the starting nucleic acid chain may be, for example, a genomic DNA or RNA and serves as a source of the target sequence.
  • the start nucleic acid chain comprises in the 5 ' segment of the nucleic acid chain a segment 1 comprising sequence sections of the second primer oligonucleotide and limiting in the 5 ' direction, a segment 2 comprising a target sequence or its parts, a segment 3, which comprises a primer binding site for the first primer oligonucleotide and a segment 4 which locates a non-target sequence in the 3 ' segment of the starting nucleic acid chain and thus flanks segment 3 on the 3 ' side.
  • the first primer can bind to such a starting nucleic acid chain in segment 3 at least with the 3 ' segment of its first region and can be correspondingly extended in the presence of a polymerase and nucleotides. This results in a first primer extension product which is complementary to the template strand of the starting nucleic acid chain and is limited in its length.
  • a such primer extension product via the oligonucleotide controller are separated from its template strand sequence-specific, so that corresponding sequence sections in the 3 ' segment of the now synthesized first primer extension product are available as a binding site for the second primer oligonucleotide.
  • a starting nucleic acid chain thus comprises the following sequence fragments (FIG. 50):
  • Sequence segment-1 (labeled segment 1) which comprises a sequence which has significant homology with the sequence of the second primer or is substantially identical to the copiable portion of the 3 ' segment of the second primer. This sequence segment-1 is located in the 5 ' segment of the starting nucleic acid chain, in particular this sequence segment-1 forms a boundary of the nucleic acid chain strand in the 5 ' direction.
  • sequence segment-3 (labeled segment 3), which comprises a sequence which is suitable for complementary binding of the first region of the first primer or its 3 ' segment to form an extension-capable primer-template complex.
  • sequence segment-3 is in the 3 'direction, ("upstream") of the sequence segment-1.
  • Target sequence which lies partially or completely between segment 1 and segment 3 (this portion of the target sequence is referred to as segment 2).
  • the target sequence comprises segment 2, as well as at least one of segment 1 and / or segment 3.
  • the start nucleic acid chain in the 3 ' segment comprises flanking sequence segments (termed segment 4) which are not amplified.
  • a starting nucleic acid chain may serve as a template for the synthesis of a second primer extension product.
  • the starting nucleic acid chain can be provided, for example, in the context of a primer extension reaction using the first primer oligonucleotide as a sequence segment of a longer starting nucleic acid chain during a preparatory step before the exponential amplification and converted into a single-stranded form.
  • the starting nucleic acid chain may be, for example, a genomic DNA or RNA and serves as the source of the target sequence (shown schematically as a double strand).
  • the start nucleic acid chain comprises in the 5 ' segment of the nucleic acid chain a segment 5 comprising sequence segments of the first primer oligonucleotide and limiting in the 5 ' direction, a segment 6 comprising a target sequence or its moieties, a segment 7, what comprises a primer binding site for the second primer oligonucleotide and a segment 8 which locates a non-target sequence in the 3 ' segment of the starting nucleic acid chain and thus flanks segment 7 on the 3 ' side.
  • the second primer can bind at least to the 3 ' segment of its first region to such a starting nucleic acid chain in segment 7 and in the presence of a polymerase and nucleotides correspondingly up to the stop segment of the first primer oligonucleotide be extended. This results in a second primer extension product which is complementary to the template strand of the starting nucleic acid chain and is limited in its length.
  • such a primer extension product can be detached from its template strand sequence-specific via the controller oligonucleotide so that corresponding sequence segments in the 3 ' segment of the now synthesized second primer extension product are available as a binding site for the first primer oligonucleotide.
  • a start nucleic acid chain comprises the following sequence fragments ( Figure 51):
  • segment 5 comprising a sequence having significant homology with the sequence of the first region of the first primer or being substantially identical to the copiable portion of the first region of the first primer.
  • This segment-5 lies in the 5 ' segment of the starting nucleic acid chain and is flanked by a non-copyable oligonucleotide tail (analogous to the first primer oligonucleotide), in particular this segment forms a boundary of the copiable nucleic acid chain strand in 5 ' .
  • a non-copyable oligonucleotide tail analogous to the first primer oligonucleotide
  • segment 7 The sequence fragment-7 (called segment 7), which comprises a sequence which is suitable for the complementary binding of a second primer or its 3 ' segment to form an extension-capable primer-template complex.
  • the segment 7 lies in the 3 'direction ("upstream") of the segment 5.
  • Target sequence which lies partially or completely between segment 5 and segment 7 (this portion of the target sequence is referred to as segment 6).
  • the target sequence comprises segment 6 and at least one of segment 5 and / or segment 7.
  • the starting nucleic acid chain includes flanking 3 ' segments
  • the starting nucleic acid chain serves as a template for the initial generation of respective primer extension products. It thus represents the starting template for the nucleic acid chain to be amplified.
  • the starting nucleic acid chain does not necessarily have to be identical to the nucleic acid chain to be amplified.
  • non-denaturing reaction conditions are maintained for a duplex during the exponential amplification process. Therefore, it is advantageous if the starting nucleic acid chain has a restriction in its polymerase-extendable 5 ' sequence segment, resulting in a stop in the enzymatic extension of a corresponding primer. This limits the length of the primer extension fragments generated under reaction conditions. This can have an advantageous effect on the strand displacement by the controller oligonucleotide and lead to a dissociation of the respective strand, so that primer binding sites are converted into the single-stranded state and thus become accessible for a recapture of primers.
  • the first primer oligonucleotide (primer-1) is a nucleic acid chain which includes at least the following regions ( Figures 12-14):
  • a first primer region in the 3 ' segment of the first primer oligonucleotide capable of substantially sequence-specific binding to a strand of nucleic acid chain to be amplified
  • a second region, coupled directly or via a linker, to the 5 ' end of the first primer region of the first primer oligonucleotide comprising a polynucleotide tail capable of binding a controller oligonucleotide and promoting strand displacement step c). by controller oligonucleotide, wherein the polynucleotide tail remains substantially single-stranded under reaction conditions, ie does not form a stable hairpin structure or ds-structures, and in particular is not copied by the polymerase.
  • the total length of the first primer oligonucleotide is between 10 and 80, more preferably between 15 and 50, more preferably between 20 and 30 nucleotides or their equivalents (e.g., nucleotide modifications).
  • the structure of the first primer oligonucleotide is adapted to undergo reversible binding to the controller oligonucleotide under selected reaction conditions. Furthermore, the structure of the first primer oligonucleotide is adapted to its primer function. Furthermore, the structure is adapted so that a strand displacement can be performed by means of controller oligonucleotide. Overall, structures of the first and second regions are matched to each other so that exponential amplification can be performed.
  • the first and the second region of the primer are coupled in a conventional 5 ' -3 ' arrangement.
  • the coupling of both sections takes place via a 5 ' -5 ' bond, so that the second region has a reverse direction than the first region.
  • the coupling between the first and second regions is a conventional DNA for 5'-3 '-Phosphodiester coupling. In certain embodiments, it is a 5 '-5' -Phosphodiester coupling. In certain embodiments, it is a 5 '-3' - phosphodiester linkage, wherein between adjacent terminal nucleotides or nucleotide modifications of the two regions at least one linker (eg, a C3, C6, C12 or HEG linker or abasic modification) is positioned.
  • linker eg, a C3, C6, C12 or HEG linker or abasic modification
  • nucleotide modifications may include different nucleotide modifications.
  • individual elements of nucleotides can be modified: nucleobase and backbone (sugar content and / or phosphate content).
  • modifications may be used which lack or are modified at least one component of the standard nucleotide building blocks, e.g. PNA.
  • a second portion of the first primer oligonucleotide includes additional sequences that do not bind to the controller oligonucleotide. These sequences can be used for other purposes, such as binding to the solid phase. These sequences are located in particular at the 5 ' end of the polynucleotide tail.
  • a first primer oligonucleotide may include characteristic label.
  • characteristic label are dyes (e.g., FAM, TAMRA, Cy3, Alexa 488, etc.) or biotin or other groups which can be specifically bound, e.g. Digoxigenin.
  • the sequence length is between about 3-30 nucleotides, in particular between 5 and 20 nucleotides, the sequence being predominantly complementary to the 3 ' segment of a strand of the nucleic acid chain to be amplified.
  • this primer region must be able to specifically bind to the complementary 3 ' segment of a second primer extension product.
  • This first area should be copied in reverse synthesis and also serves as a template for 2nd strand.
  • the nucleotide building blocks are in particular linked to each other via conventional 5 'to 3' Phosphodie bond or Phosphothioester bond.
  • the first primer region preferably includes nucleotide monomers which do not or only insignificantly affect the function of the polymerase, for example:
  • the first primer region serves as the initiator of the synthesis of the first primer extension product in the amplification.
  • the first region comprises at least one phosphorothioate compound, so that no degradation of the 3 ' end of the primer by 3 ' exonuclease activity of polymerases can take place.
  • sequence of the first region of the first primer oligonucleotide and the sequence of the second region of the controller oligonucleotide are in particular complementary to one another.
  • the first primer region or its 3 ' segment can bind to sequence segments of a target sequence.
  • the second region of the first primer oligonucleotide is a nucleic acid sequence comprising at least one polynucleotide tail, which in particular remains uncoupled from the polymerase during the synthesis reaction and which is capable of binding to the first region of the controller oligonucleotide.
  • the segment of the second region, which predominantly undergoes this binding with the controller oligonucleotide, may be referred to as the polynucleotide tail.
  • the second region of the first primer oligonucleotide must not only specifically bind the controller oligonucleotide under reaction conditions, but also participate in the process of strand displacement by means of controller oligonucleotide.
  • the structure of the second region must therefore be suitable for bringing about spatial proximity between the controller oligonucleotide and the corresponding duplex end (in particular, the 3 ' end of the second primer extension product).
  • the design of the structure of the second region of the first primer oligonucleotide is shown in more detail in several embodiments. In this case, the arrangement of the oligonucleotide segments and used modifications are taken into account, which lead to a stop in the polymerase-catalyzed synthesis.
  • the length of the second region is between 3 and 60, in particular between 5 and 40, in particular between 6 and 15 nucleotides or their equivalents.
  • the sequence of the second area may be chosen arbitrarily. In particular, it is not complementary with the nucleic acid to be amplified and / or with the second primer oligonucleotide and / or with the first region of the first primer oligonucleotide. Furthermore, it contains in particular no self-complementary segments, such as hairpins or Stemmloops.
  • the sequence of the second region is particularly matched to the sequence of the first region of the controller oligonucleotide, so that both sequences can bind under reaction conditions.
  • this bond is under Reaction conditions reversible: there is thus a balance between components bound together and unbound components.
  • the sequence of the second region of the first primer oligonucleotide is chosen in particular such that the number of complementary bases which can bind to the first region of the controller oligonucleotide is between 1 and 40, in particular between 3 and 20, in particular between 6 and 15 lies.
  • the function of the second area is, inter alia, the binding of the controller oligonucleotide. In certain embodiments, this binding is particularly specific so that a second region of a first primer oligonucleotide can bind a specific controller oligonucleotide. In another embodiment, a second region may bind more than one controller oligonucleotide under reaction conditions.
  • the degree of complementarity between the second region of the first primer oligonucleotide and the first region of the controller oligonucleotide may be between 20% and 100%, in particular between 50% and 100%, in particular between 80% and 100%.
  • the respective complementary regions may be positioned immediately adjacent to each other or may comprise non-complementary sequence segments therebetween.
  • the second region of the first primer oligonucleotide may, in certain embodiments, include at least one Tm modifying modification.
  • Tm enhancing modifications nucleotide modifications or non-nucleotide modifications
  • Tm-lowering modifications may also be used, such as inosine nucleotide.
  • linkers e.g., C3, C6, HEG linkers
  • the controller oligonucleotide For strand displacement, the controller oligonucleotide must be placed in close proximity to the double-stranded end of the nucleic acid to be amplified.
  • This double-stranded end consists of segments of the first primer region of the first primer extension product and a correspondingly complementary thereto 3 ' segment of the second primer extension product.
  • the polynucleotide tail predominantly complements the controller oligonucleotide under reaction conditions, thereby causing a transient approach of the second region of the controller oligonucleotide and the first region of an extended primer. Extension product, so that a complementary bond between these elements can be initiated as part of a strand displacement process.
  • binding of the controller oligonucleotide to the polynucleotide tail of the first primer oligonucleotide immediately results in such contact.
  • the polynucleotide tail and the first primer region of the first primer oligonucleotide must be directly coupled to each other. Thanks to such an arrangement, after a binding of a controller oligonucleotide in its first region, contact can be made directly between complementary bases of the second region of the controller oligonucleotide and corresponding bases of the first primer region, so that strand displacement can be initiated.
  • structures of the second region of the first primer oligonucleotide are located between structures of the polynucleotide tail and the first primer region. After binding of a controller oligonucleotide to the polynucleotide tail, it is thus not positioned directly at the first primer region, but at a certain distance from it.
  • the structures between the uncopiable polynucleotide tail and the copiable first primer region of the primer oligonucleotide can generate such a spacing.
  • This distance has a value which is between 0.1 and 20 nm, in particular between 0.1 and 5 nm, in particular between 0.1 and 1 nm.
  • Such structures are, for example, linkers (e.g., C3 or C6 or HEG linkers) or non-controller oligonucleotide complementary segments (e.g., in the form of non-complementary, non-copyable nucleotide modifications).
  • the length of these structures can generally be measured in chain atoms. This length is between 1 and 200 atoms, in particular between 1 and 50 chain atoms, preferably between 1 and 10 chain atoms.
  • the second region of the first primer oligonucleotide generally comprises sequence structures which cause the polymerase to stop in the synthesis of the second primer extension product after the polymerase releases the polymerase first primer area has been successfully copied. These structures are said to prevent copying of the polynucleotide tail of the second region. The polynucleotide tail thus remains uncoated, in particular, by the polymerase.
  • such structures are between the first primer region and the polynucleotide tail.
  • the sequence of the polynucleotide tail may include nucleotide modifications that result in the termination of the polymerase.
  • a sequence segment of the second region of the first primer oligonucleotide may comprise both functions: it is both a polynucleotide tail and a polymerase-terminating sequence of nucleotide modifications. Modifications in the second region of the first primer oligonucleotide which result in a synthetic stop and thus leave the polynucleotide tail uncopyable are summarized in this application by the term "first blocking moiety or a stop region".
  • oligonucleotide synthesis Several building blocks in oligonucleotide synthesis are known which prevent the polymerase from reading the template and lead to the termination of polymerase synthesis.
  • non-copyable nucleotide modifications or non-nucleotide modifications are known.
  • There are also synthetic types / arrangements of nucleotide monomers within an oligonucleotide which result in the termination of the polymerase eg, 5 'to 5 ' or 3 'to 3 ' ).
  • Primer oligonucleotides with a non-copyable polynucleotide tail are also known in the art (eg Scorpion primer structures or primers for binding to the solid phase).
  • Both primer variants describe primer oligonucleotide structures which are able to initiate the synthesis of a strand on the one hand so that a primer extension reaction can take place.
  • the result is a first strand, which also integrates the primer structure with tail in the primer extension product.
  • the second strand is extended to the "blocking moiety / stop structure" of the primer structure.
  • Both described primer structures are designed in such a way that the 5 ' portion of the primer oligonucleotide remains single-stranded and is not copied by the polymerase.
  • the second region of the primer oligonucleotide comprises a polynucleotide tail that has a conventional 5 ' to 3 ' array in its entire length and includes non-copyable nucleotide modifications.
  • non-copyable nucleotide modifications include, for example, 2 '-0-alkyl-RNA modifications, PNA, morpholino. These modifications may be distributed differently in the second primer region.
  • the proportion of non-copyable nucleotide modifications may be between 20% and 100% in the polynucleotide tail, in particular more than 50% of the nucleotide building blocks.
  • these nucleotide modifications are in the 3 ' segment of the second region and thus adjacent to the first region of the first primer oligonucleotide.
  • sequence of non-copyable nucleotide modifications is at least partially complementary to the sequence in the template strand such that primer binding to the template occurs involving at least a portion of these nucleotide modifications. In certain embodiments, the sequence of non-copyable nucleotide modifications is non-complementary to the sequence in the template strand.
  • the non-copyable nucleotide modifications are in particular covalently coupled to each other and thus represent a sequence segment in the second region.
  • the length of this Segment comprises between 1 and 40, in particular between 1 and 20 nucleotide modifications, in particular between 3 and 10 nucleotide modifications.
  • the second region of the first primer oligonucleotide comprising a polynucleotide tail, which 'has and non-copyable nucleotide modifications include (for example 2' in its entire length, a conventional arrangement of 5'-3 -0-alkyl modifications ) and at least one non-nucleotide linker (eg, C3, C6, HEG linker).
  • a non-nucleotide linker has the function of covalently linking adjacent nucleotides or nucleotide modifications while at the same time site-specifically disrupting the synthesis function of the polymerase.
  • non-nucleotide linker should not remove the structures of the polynucleotide tail and the first primer region too far apart. Rather, the polynucleotide tail should be in close proximity to the first primer region.
  • a non-nucleotide linker is taken to mean modifications which do not have a length of more than 200 chain atoms, in particular not more than 50 chain atoms, in particular not more than 10 chain atoms. The minimum length of such a linker can be one atom.
  • An example of such non-nucleotide linkers are straight or branched alkyl linkers with an alkyl chain which include at least one carbon atom, more preferably at least 2 to 30, especially 4 to 18.
  • Such linkers are in oligonucleotide chemistry are well known (eg, C3, C6, or C12 linkers) and can be introduced during solid phase synthesis of oligonucleotides between the sequence of the polynucleotide tail and the sequence of the first region of the first primer oligonucleotide.
  • Another example of such non-nucleotide linkers is linear or branched polyethylene glycol derivatives.
  • a well-known example in oligonucleotide chemistry is hexaethylene glycol (HEG).
  • HEG hexaethylene glycol
  • Another example of such non-nucleotide linkers are abasic modifications (eg THF modification, as analog of d ribose).
  • modifications are integrated into a second region, they can effectively interfere with a polymerase in its copying function during its synthesis of the second primer extension product, such that segments located in the 3 'direction remain uncopied after such modification.
  • the number of such modifications in the second range can be between 1 and 100, in particular between 1 and 10, in particular between 1 and 3.
  • the position of such a non-nucleotide linker may be at the 3 ' end of the second region, thus representing the transition to the first region and the second region of the primer oligonucleotide.
  • the location of the non-nucleotide linker in the middle segment of the second region may also be used.
  • the 3 ' segment of the polynucleotide tail includes at least one, in particular several, eg between 2 and 20, in particular between 2 and 10 non-limiting copyable nucleotide modifications. These non-copyable nucleotide modifications are in particular at the transition between the first and the second region of the primer oligonucleotide.
  • the second region of the primer oligonucleotide comprises a polynucleotide tail having in its entire length an array of 5 'to 3 ' - and at least one nucleotide monomer in a "reverse" array of 3 'to 5 '- includes and which are positioned at the transition between the first and the second region of the first primer oligonucleotide.
  • the second region of the primer oligonucleotide comprises a polynucleotide tail, such polynucleotide tail consisting entirely of nucleotides which are directly adjacent to the first region of the first primer oligonucleotide in reverse order such that the coupling of the first and second nucleotides of the second area through 5 ' - 5 ' position.
  • the 3 ' -terminal nucleotide of the polynucleotide tail should be blocked at its 3 ' OH end to prevent side reactions.
  • a terminal nucleotide can be used which has no 3 ' -OH group, for example a dideoxy nucleotide.
  • the corresponding nucleotide arrangement is to be adapted in the controller oligonucleotide.
  • the first and the second portion of the controller oligonucleotide in 3 'to 3' arrangement have to be linked.
  • the second region of the primer oligonucleotide comprises a polynucleotide tail having a conventional 5 ' to 3 ' configuration in its entire length and including at least one nucleotide modification which is not a complementary nucleobase for the polymerase, when the synthesis is performed with all natural dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP or dUTP).
  • dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP or dUTP
  • iso-dG or iso-dC nucleotide modifications can be integrated as single, but in particular more (at least 2 to 20) nucleotide modifications in the second region of the first primer oligonucleotide.
  • nucleobase modifications are various modifications of the extended genetic alphabet.
  • such nucleotide modifications do not support complementary base pairing with natural nucleotides such that a polymerase (at least theoretically) does not contain a nucleotide from the series (dATP, dCTP, dGTP, dTTP or dUTP). In reality, rudimentary incorporation may still occur, especially at higher concentrations of dNTP substrates and prolonged incubation times (eg, 60 minutes or longer).
  • nucleotide modifications positioned at adjacent sites are used.
  • the stop of polymerase synthesis is effected by the lack of suitable complementary substrates for these modifications.
  • Oligonucleotides with iso-dC or iso-dG can be synthesized by standard methods and are available from several commercial suppliers (eg Trilink Technologies, Eurogentec, Biomers GmbH).
  • the sequence of the first region of the controller oligonucleotide can also be adapted to the sequence of such a second primer region.
  • complementary nucleobases of the extended genetic alphabet can be integrated into the first region of the controller oligonucleotide accordingly during the chemical synthesis.
  • iso-dG may be integrated in the second region of the first primer nucleotide, its complementary nucleotide (iso-dC-5-Me) may be placed at the appropriate location in the first region of the controller oligonucleotide.
  • the termination of the synthesis of polymerase in the second region can be achieved in various ways.
  • this blockade preferably takes place only when the polymerase has copied the first region of the first primer oligonucleotide. This ensures that a second primer extension product has an appropriate primer binding site in its 3 ' segment. This primer binding site is exposed as part of the strand displacement and is thus available for a new binding of another first primer oligonucleotide.
  • the primer extension reaction remains in front of the polynucleotide tail. Because this polynucleotide tail remains single stranded for interaction with the controller oligonucleotide and thus is available for binding, it promotes the initiation of the strand displacement reaction by the controller oligonucleotide by placing it in the immediate vicinity of the corresponding complementary segments of the controller oligonucleotide Near the matching duplex-end brings. The distance between the complementary part of the controller oligonucleotide (second region) and the complementary part of the extended primer oligonucleotide (first region) is thereby reduced to a minimum. Such spatial proximity facilitates the initiation of strand displacement.
  • a complementary sequence of controller oligonucleotide is now in the immediate vicinity of the appropriate duplex end. This results in competition for binding to the first region of the first primer oligonucleotide between the strand of the controller oligonucleotide and the template strand complementary to the primer.
  • the initiation of the nucleic acid-mediated strand displacement process occurs.
  • distances between the 5 ' segment of the first primer region of the first primer oligonucleotide, which binds to a complementary strand of the template and forms a complementary duplex, and a correspondingly complementary sequence segment in the controller oligonucleotide, when bound to polynucleotide Tail of the second region of the first primer oligonucleotide in the following ranges are: between 0.1 and 20 nm, in particular between 0.1 and 5 nm, in particular between 0.1 and 1 nm. In this particular case, this distance is less than 1 nm.
  • this distance corresponds to a distance of less than 200 atoms, in particular less than 50 atoms, in particular less than 10 atoms. In the special case, this distance is an atom.
  • the distance information is for guidance only and illustrates that shorter distances between these structures are preferred. The measurement of this distance is in many cases only possible by analyzing the exact structures of oligonucleotides and measuring the measurement of sequence distances or of linker lengths.
  • the first primer may also include additional sequence segments that are not required to interact with the controller oligonucleotide or template strand. Such sequence segments may, for example, bind further oligonucleotides which are used as detection probes or immobilization partners when bound to the solid phase.
  • the first primer oligonucleotide can be used in several partial steps. First and foremost, it performs a primer function in the amplification.
  • the primer extension reaction is carried out using the second primer extension product as a template.
  • the first primer oligonucleotide may use the starting nucleic acid chain as a template at the beginning of the amplification reaction.
  • the first primer oligonucleotide may be used in the preparation / provision of a starting nucleic acid chain.
  • the first primer serves as the initiator of the synthesis of the first primer extension product using the second primer extension product as a template.
  • the 3 ' segment of the first primer comprises a sequence which can bind predominantly complementary to the second primer extension product.
  • Enzymatic extension of the first primer oligonucleotide using the second primer extension product as template results in formation of the first primer extension product.
  • a first primer extension product comprises the target sequence or its sequence parts.
  • the sequence of the copyable portion of the first primer oligonucleotide is recognized by the polymerase as a template and a corresponding complementary sequence is synthesized, so that a corresponding primer binding site for the first primer oligonucleotide results.
  • the synthesis of the first primer extension product occurs up to and including the 5 ' segment of the second primer oligonucleotide.
  • this product is bound to the second primer extension product to form a double-stranded complex.
  • the second primer extension product is displaced sequence-specifically from this complex by the controller oligonucleotide.
  • the controller oligonucleotide binds to the first primer extension product.
  • the second primer extension product may itself serve as a template for the synthesis of the first primer extension product.
  • the now vacated 3 ' segment of the first primer extension product can bind another second primer oligonucleotide so that a new synthesis of the second primer extension product can be initiated.
  • the first primer oligonucleotide can serve as the initiator of the synthesis of the first primer extension product starting from the starting nucleic acid chain at the beginning of the amplification.
  • the sequence of the first primer is completely complementary to the corresponding sequence segment of a starting nucleic acid chain.
  • the sequence of the first primer oligonucleotide is only partially complementary to the corresponding sequence segment of a starting nucleic acid chain.
  • this divergent complementarity is not intended to prevent the first primer oligonucleotide from starting a predominantly sequence-specific primer extension reaction.
  • the respective differences in complementarity of the first primer oligonucleotide to the respective position in the starting nucleic acid chain are in particular in the 5 ' segment of the first region of the first primer oligonucleotide, so that in the 3 ' segment predominantly complementary base pairing and initiation of the synthesis is possible .
  • the first 4-10 positions in the 3 ' segment should be fully complementary to the template (starting nucleic acid chain).
  • the remaining nucleotide positions may differ from a perfect complementarity.
  • the extent of perfect complementarity in the remaining 5 ' segment of the first region of the first primer oligonucleotide can range between 50% to 100%, more preferably between 80% and 100%, of the base composition.
  • the first primer oligonucleotide may thus initiate synthesis of a starting nucleic acid chain.
  • replicable sequence segments of the first primer oligonucleotide are copied from the polymerase such that, in subsequent synthesis cycles, a fully complementary primer binding site within the second primer extension product for binding of the first Primer oligonucleotide is formed and is available in subsequent synthesis cycles.
  • the first primer oligonucleotide may be used in the preparation of a starting nucleic acid chain.
  • a first primer oligonucleotide can bind to a nucleic acid (for example a single-stranded genomic DNA or RNA or its equivalents comprising a target sequence) predominantly sequence-specific and initiate a template-dependent primer extension reaction in the presence of a polymerase.
  • the binding position is chosen such that the primer extension product comprises a desired target sequence.
  • the extension of the first primer oligonucleotide results in a nucleic acid strand which has a sequence complementary to the template.
  • Such a strand can be detached from the template (eg by heat or alkali) and thus converted into a single-stranded form.
  • a single-stranded nucleic acid chain can serve as a starting nucleic acid chain at the beginning of the amplification.
  • Such a start nucleic acid chain comprises in its 5 ' segment the sequence portions of the first primer oligonucleotide, furthermore it comprises a target sequence or its equivalents and a primer binding site for the second primer oligonucleotide. Further steps are explained in the section "Starting nucleic acid chain".
  • the synthesis of the first primer extension product is a primer extension reaction and forms a partial step in the amplification.
  • the reaction conditions during this step are adjusted accordingly.
  • the reaction temperature and the reaction time are chosen so that the reaction can take place successfully.
  • the particular preferred temperature in this step depends on the polymerase used and the binding strength of the respective first primer oligonucleotide to its primer binding site and includes, for example, ranges from 15 ° C to 75 ° C, especially from 20 to 65 ° C, in particular from 25 ° C to 65 ° C.
  • the concentration of the first primer oligonucleotide comprises ranges from 0.01 pmol / l to 50 pmol / l, in particular from 0.1 pmol / l to 20 pmol / l, in particular from 0.1 pmol / l to 10 pmol / l.
  • all steps of the amplification proceed under stringent conditions that prevent or slow down the formation of nonspecific products / by-products.
  • stringent conditions include, for example, higher temperatures, in particular above 50 ° C.
  • sequence-specific primer oligonucleotides are preferably used in each case for the amplification of corresponding respective target sequences.
  • sequences of the first, second primer oligonucleotide and the controller oligonucleotide are matched to one another such that side reactions, eg primer-dimer formation, are minimized.
  • the sequence of the first and second primer oligonucleotides are adapted to one another such that both primer oligonucleotides are incapable of undergoing an amplification reaction in the absence of one suitable template and / or a target sequence and / or a start nucleic acid chain to start or support.
  • the second primer oligonucleotide does not comprise a primer binding site for the first primer oligonucleotide and the first primer oligonucleotide does not comprise a primer binding site for the second primer oligonucleotide.
  • the primer sequences comprise extended self-complementary structures (self-complement).
  • the synthesis of the first and second primer extension products proceeds at the same temperature. In certain embodiments, the synthesis of the first and second primer extension products proceeds at different temperatures. In certain embodiments, synthesis of the first primer extension product and strand displacement by controller oligonucleotide proceeds at the same temperature. In certain embodiments, synthesis of the first primer extension product and strand displacement by controller oligonucleotide proceeds at different temperatures.
  • a controller oligonucleotide ( Figures 19-26) comprises:
  • a first single-stranded region which can bind to the polynucleotide tail of the second region of the first primer oligonucleotide
  • a second single-stranded region which can bind to the first region of the first primer oligonucleotide essentially complementary
  • a third single-stranded region which is substantially complementary to at least one segment of the extension product of the first primer extension product
  • controller oligonucleotide does not serve as a template for primer extension of the first or second primer oligonucleotide.
  • the sequence of the third region of the controller oligonucleotide is adapted to the sequence of the nucleic acid to be amplified, since this is a template for the order of the nucleotides in the extension product of a first primer.
  • the sequence of the second region of the controller oligonucleotide is adapted to the sequence of the first primer region.
  • the structure of the first region of the controller oligonucleotide is adapted to the sequence of the second region of the first primer oligonucleotide, especially the nature of the polynucleotide tail.
  • a controller oligonucleotide may also include other sequence segments that do not belong to the first, second or third region. For example, these sequences can be attached as flanking sequences at the 3 ' and 5 ' ends. In particular, these sequence segments do not interfere with the function of the controller oligonucleotide.
  • the structure of the controller oligonucleotide has in particular the following properties:
  • the individual areas are covalently bonded to each other.
  • the binding can be done for example via conventional 5 ' -3 ' bond.
  • a phospho-diester bond or a nuclease-resistant phospho-thioester bond can be used.
  • a controller oligonucleotide may bind by its first region to the polynucleotide tail of the first primer oligonucleotide, which binding is mediated primarily by hybridization of complementary bases.
  • the length of this first region is 3 to 80 nucleotides, in particular 4 to 40 nucleotides, in particular 6 to 20 nucleotides.
  • the degree of sequence match between the sequence of the first region of the controller oligonucleotide and the sequence of the second region of the first primer oligonucleotide may be between 20% and 100%, in particular between 50% and 100%, in particular between 80% and 100%.
  • binding of the first region of the controller oligonucleotide should be specific to the second region of the first primer oligonucleotide under reaction conditions.
  • the sequence of the first region of the controller oligonucleotide is chosen in particular such that the number of complementary bases that can bind to the second region of the first primer oligonucleotide complementary between 1 and 40, in particular between 3 and 20, in particular between 6 and 15 lies.
  • controller oligonucleotide since the controller oligonucleotide is not a template for the polymerase, it may include nucleotide modifications that do not support polymerase function, which may be both base modifications and / or sugar-phosphate backbone modifications.
  • the controller oligonucleotide may include, for example, in its first region, nucleotides and / or nucleotide modifications selected from the following list: DNA, RNA, LNA ("locked nucleic acids” analogues having 2 ' -4 ' bridge linkage in the sugar moiety), UNA ( "unlocked Nucleic acids” without binding between 2 '-3' -atoms of the sugar moiety), PNA ( "peptide nucleic acids” analogs), PTO (phosphorothioate), morpholino analogs, 2 '-0-alkyl-RNA modifications (such as 2 '-OMe, 2' -0 propargyl, 2 '-0- (2-methoxyethyl), 2'
  • nucleotides or Nucleotide modifications are linked together, for example, by conventional 5 ' -3 ' bonding or 5 ' -2 ' bonding.
  • a phospho-diester bond or a nuclease-resistant phospho-thioester bond can be used.
  • the controller oligonucleotide may include nucleotides and / or nucleotide modifications in its first region, the nucleobases being selected from the following list: adenines and their analogs, guanines and its analogs, cytosines and its analogs, uracil and its analogs, thymines and its analogues, inosine or other universal bases (eg nitroindole), 2-amino-adenine and its analogues, iso-cytosines and its analogues, iso-guanines and its analogues.
  • nucleobases being selected from the following list: adenines and their analogs, guanines and its analogs, cytosines and its analogs, uracil and its analogs, thymines and its analogues, inosine or other universal bases (eg nitroindole), 2-amino-adenine and its analogues, iso-cytosines and
  • the controller oligonucleotide may include in its first region non-nucleotide compounds selected from the following list: Intercalators that may affect the binding strength between the controller oligonucleotide and the first primer oligonucleotide, eg, MGB, naphthalene, etc. Like elements can also be used in the second region of the first primer.
  • Intercalators that may affect the binding strength between the controller oligonucleotide and the first primer oligonucleotide, eg, MGB, naphthalene, etc.
  • Like elements can also be used in the second region of the first primer.
  • the controller oligonucleotide may include in its first region non-nucleotide compounds, e.g. Linkers such as C3, C6, HEG linkers which link individual segments of the first region together.
  • non-nucleotide compounds e.g. Linkers such as C3, C6, HEG linkers which link individual segments of the first region together.
  • the controller oligonucleotide may bind by means of its second region to the first primer region of the first primer oligonucleotide, the binding being mediated essentially by hybridization of complementary bases.
  • the length of the second region of the controller oligonucleotide is matched to the length of the first region of the first primer oligonucleotide and is consistent with this in particular. It is between about 3-30 nucleotides, in particular between 5 and 20 nucleotides.
  • the sequence of the second region of controller oligonucleotide is in particular complementary to the first region of the first primer oligonucleotide. The degree of agreement in complementarity is between 80% and 100%, in particular between 95% and 100%, in particular at 100%.
  • the second portion of controller oligonucleotide specifically includes nucleotide modifications of one, which hinder the polymerase in extension of the first primer oligonucleotide, but do not block the formation of complementary double strands, or not substantially prevent, for example, 2 '-0-alkyl RNA analogs (for example, 2 '-0- Me, 2' -0- (2-methoxyethyl), 2 '-0-propyl, 2' -0-propargyl nucleotide modifications), LNA, PNA or morpholino nucleotide modifications.
  • individual nucleotide monomers are linked via 5 ' -3 ' linkage, but the alternative 5 ' -2 ' linkage between nucleotide monomers can also be used.
  • the sequence length and nature of the first and second regions of the controller oligonucleotide are particularly chosen such that the binding of these regions to the first primer oligonucleotide is reversible under reaction conditions, at least in one reaction step of the process. This means that although the controller oligonucleotide and the first primer oligonucleotide can specifically bind to one another, this bond should not lead to the formation of a complex of both elements that is permanently stable under reaction conditions.
  • an equilibrium between a bound complex form of controller oligonucleotide and the first primer oligonucleotide and a free form of individual components under reaction conditions should be sought or made possible at least in one reaction step. This ensures that at least a portion of the first primer oligonucleotides can be in free form under reaction conditions and can interact with the template to initiate a primer extension reaction. On the other hand, it will ensure that corresponding sequence regions of the controller oligonucleotide are available for binding with an extended primer oligonucleotide.
  • the proportion of free, single-stranded and thus reactive components can be influenced: by lowering the temperature, first primer oligonucleotides bind to the controller oligonucleotides, so that both participants bind a complementary double-stranded complex.
  • concentration of single-stranded forms of individual components can be lowered.
  • An increase in temperature can lead to the dissociation of both components into the single-stranded form.
  • the concentration of single-stranded forms in the reaction mixture can thus be influenced.
  • desired reaction conditions can be brought about during corresponding reaction steps. For example, by using temperature ranges approximately at the level of melting temperature of complexes of controller oligonucleotide / first primer oligonucleotide shares of each free forms of individual components can be influenced. In this case, the temperature used destabilizes complexes comprising controller oligonucleotide / first primer oligonucleotide, so that during this reaction step individual complex components are at least temporarily single-stranded and thus able to interact with other reactants.
  • a first sequence region of the controller oligonucleotide may be released from the double-stranded complex with a non-extended first primer, and thus may interact with the second sequence region of an extended first primer oligonucleotide, thereby initiating strand displacement.
  • release of a first, non-extended primer oligonucleotide from a complex comprising controller oligonucleotide / first primer oligonucleotide results in the first primer region becoming single-stranded and thus capable of interacting with the template such that primer extension by a polymerase can be initiated.
  • the temperature used does not have to correspond exactly to the melting temperature of the complex of controller oligonucleotide / first primer oligonucleotide. It is sufficient if the temperature is used in a reaction step, for example in the range of the melting temperature.
  • the temperature in one of the reaction steps comprises ranges of Tm +/- 10 ° C, in particular Tm +/- 5 ° C, in particular Tm +/- 3 ° C of the complex of controller oligonucleotide / first primer oligonucleotide.
  • Such a temperature can be set, for example, in the context of the reaction step, which comprises a sequence-specific strand displacement by the controller oligonucleotide.
  • reaction conditions are maintained over the entire duration of the amplification reaction in which there is equilibrium between a complex of controller oligonucleotide and the first Primer oligonucleotide and a free form of individual components is possible.
  • the ratio between a complex form of controller oligonucleotide and the first primer oligonucleotide and free forms of individual components can be influenced both by reaction conditions (eg temperature and Mg 2+ concentration) and by structures and concentrations of individual components.
  • the sequence length and nature of the first and second regions of the controller oligonucleotide are, in certain embodiments, chosen such that the ratio between a proportion of a free controller oligonucleotide is given under given reaction conditions (eg in the step of strand displacement by the controller oligonucleotide) and a portion of a controller oligonucleotide complexed with a first primer oligonucleotide comprises the following ranges: from 1: 100 to 100: 1, more preferably from 1:30 to 30: 1, more preferably from 1:10 to 10: 1.
  • the ratio between a proportion of a free first primer oligonucleotide and a proportion of a first primer oligonucleotide in complex with a controller oligonucleotide comprises ranges from 1: 100 to 100: 1, in particular from 1: 30 to 30: 1, in particular from 1 : 10 to 10: 1.
  • the concentration of the first primer oligonucleotide is higher than the concentration of the controller oligonucleotide.
  • the concentration of the first primer oligonucleotide is lower than the concentration of the controller oligonucleotide.
  • concentration of the controller oligonucleotide there is an excess of the controller oligonucleotide and the first primer oligonucleotide must be released for its effect of binding to the controller oligonucleotide by choosing an appropriate reaction temperature. In general, this is achieved by an increase in temperature, to sufficient concentrations of free forms of the first primer oligonucleotide.
  • the controller oligonucleotide may bind by means of its third region to at least one segment of the specifically synthesized extension product of the first primer oligonucleotide ( Figures 13 to 35). Binding is preferably by hybridization of complementary bases between the controller oligonucleotide and the extension product synthesized by the polymerase.
  • the sequence of the third region should in particular have a high complementarity to the extension product.
  • the sequence of the third region is 100% complementary to the extension product.
  • the binding of the third region takes place in particular on the segment of the extension product which directly adjoins the first region of the first primer oligonucleotide.
  • the segment of the extension product lies in the 5 ' segment of the entire extension product of the first primer oligonucleotide.
  • the binding of the third region of the controller oligonucleotide does not occur over the entire length of the extension product of the first primer oligonucleotide.
  • a segment remains unbound at the 3 ' end of the extension product. This 3 ' -terminal segment is necessary for the binding of the second primer oligonucleotide.
  • the length of the third region is adjusted to such an extent that the third region firstly binds to the 5 ' -terminal segment of the extension product, but on the other hand does not bind the 3 ' continuous segment of the extension product.
  • the total length of the third region of the controller oligonucleotide is from 2 to 100, in particular from 6 to 60, in particular from 10 to 40 nucleotides or their equivalents.
  • the controller oligonucleotide may enter into a complementary bond with the segment of the extension product over that length, thereby displacing this 5 ' segment of the extension product from binding with its complementary template strand.
  • the length of the 3 ' -terminal segment of the extension product which is not bound by the controller oligonucleotide comprises, for example, ranges between 5 and 100 nucleotides, in particular 5 and 60 nucleotides, in particular between 10 and 40, in particular between 15 and 30 nucleotides.
  • This 3 ' segment of the extension product is not displaced from the controller oligonucleotide from binding with the template strand. Even with the third region of the controller oligonucleotide fully bound to its complementary segment of the extension product, the first primer extension product may remain bound to the template strand via its 3 ' -terminal segment.
  • the bond strength of this complex is chosen in particular such that it can dissociate spontaneously under reaction conditions (step e), for example. This can be achieved, for example, by the melting temperature of this complex being selected from the 3 ' -terminal segment of the extension product of the first primer. Oligonucleotide and its template strand is approximately in the range of the reaction temperature or below the reaction temperature in a corresponding reaction step (reaction step e). With little stability of this complex in the 3 ' segment of the extension product, complete binding of the third region of the controller oligonucleotide to the 5 ' segment of the extension product results in rapid dissociation of the first primer extension product from its template strand.
  • the controller oligonucleotide as a whole has a suitable structure to perform its function: under appropriate reaction conditions, it is capable of sequence-specific displacement of the extended first primer oligonucleotide from binding with the template strand, thereby converting the template strand into single-stranded form, and thus for further binding with a novel first primer oligonucleotide and its target sequence-specific extension by the polymerase.
  • regions one, two and three of the controller oligonucleotide should be predominantly in single-stranded form under reaction conditions. Therefore, double-stranded self-complementary structures (e.g., hairpins) in these regions should be avoided as much as possible since they may degrade the functionality of the controller oligonucleotide.
  • double-stranded self-complementary structures e.g., hairpins
  • the controller oligonucleotide should not appear as a template in the method of the invention, therefore the first primer oligonucleotide, when attached to the controller oligonucleotide under reaction conditions, should not be extended by the polymerase.
  • the 3 ' end of the first primer oligonucleotide does not remain elongated when the first primer oligonucleotide binds to the controller oligonucleotide under reaction conditions.
  • the degree of blockage / inhibition / slowing / aggravation of the reaction may be between complete expression of this property (e.g., 100% blockage under given reaction conditions) and a partial expression of this property (e.g., 30-90% blockade under given reaction conditions).
  • the nucleotide modifications may include base modifications and / or sugar-phosphate-residue modifications.
  • the sugar-phosphate modifications are preferred because any complementary sequence of a controller oligonucleotide can be assembled by combining with conventional nucleobases.
  • the nucleotides with modifications in the sugar-phosphate residue, which can lead to hindrance or blockage of the synthesis of the polymerase include, for example: 2 '-0-alkyl modifications (eg, 2' -0-methyl, 2 '-0- (2- Methoxyethyl), 2 '-0-propyl, 2' -0-propargyl nucleotide modifications), 2 '-amino-2' -Deoxy- nucleotide modifications, 2 'amino-alkyl-2' -deoxy-nucleotide modifications , PNA, morpholino modifications, etc.
  • 2 '-0-alkyl modifications eg, 2' -0-methyl, 2 '-0- (2- Methoxyethyl), 2 '-0-propyl, 2' -0-propargyl nucleotide modifications
  • 2 '-amino-2' -Deoxy- nucleotide modifications e.g, 2 '-alkyl modifications
  • the blockade can be accomplished by either a single nucleotide modification or only by coupling multiple nucleotide modifications in series (e.g., as a sequence fragment consisting of modified nucleotides). For example, at least 2, in particular at least 5, in particular at least 10, of such nucleotide modifications can be coupled side by side in the controller oligonucleotide.
  • a controller oligonucleotide may comprise a uniform type of nucleotide modifications or may comprise at least two different types of nucleotide modification.
  • the location of such nucleotide modifications in the controller oligonucleotide is intended to prevent the polymerase from extending the 3 ' end of a first primer oligonucleotide bound to the controller oligonucleotide.
  • nucleotide modifications are located in the second region of the controller oligonucleotide. In certain embodiments, such nucleotide modifications are located in the third region of the controller oligonucleotide. In certain embodiments, such nucleotide modifications are located in the second and third regions of the controller oligonucleotide.
  • the second region of the controller oligonucleotide consists of at least 20% of its positions from such nucleotide modifications, in particular at least 50%.
  • the third region of the controller oligonucleotide consists of at least 20% of its positions from such nucleotide modifications, in particular at least 50%, in particular at least 90%.
  • the entire third region comprises nucleotide modifications that prevent a polymerase from extending a primer bound to such a region using the controller oligonucleotide as a template.
  • the entire third and second regions include such nucleotide modifications.
  • the entire first, second, and third regions include such nucleotide modifications.
  • the controller oligonucleotide may consist entirely of such nucleotide modifications.
  • Such modified controller oligonucleotides can be used, for example, in multiplex analyzes in which further primers are used. This is to prevent inadvertent primer extension reactions on one or more controller oligonucleotides.
  • sequence of nucleobases from these nucleotide modifications is adapted to the requirements of the sequence in each area.
  • the remaining portion can be made up of natural nucleotides, or nucleotide modifications which do not or only insignificantly prevent the polymerase function, for example DNA nucleotides, PTO nucleotides, LNA nucleotides, RNA nucleotides.
  • further modifications for example base modifications such as 2-amino-adenosine, 2-aminopurines, 5-methyl-cytosines, inosines, 5-nitroindoles, 7-deaza-adenosine, 7-deaza-guanosine, 5-propyl-cytosine, 5 Propyl uridine or non-nucleotide modifications such as dyes, or MGB modifications, etc.
  • the individual nucleotide monomers can be coupled to each other via conventional 5 ' -3 ' bond or else via 5 ' -2 ' bond.
  • a segment of the oligonucleotide controller nucleotide modification which prevents extension of the 3 ' end of a first primer oligonucleotide bound to the controller oligonucleotide by the polymerase is termed a "second blocking moiety".
  • the length of this segment may include between 1 to 50 nuclide modifications, especially between 4 and 30.
  • this segment may be located in the controller oligonucleotide such that the 3 ' end of the bound first primer oligonucleotide is in this segment.
  • this segment can span regions two and three.
  • no linker structures or spacer structures such as C3, C6, HEG linkers are used to prevent the extension of the 3 ' end of a first primer oligonucleotide bound to the controller oligonucleotide.
  • a controller oligonucleotide in its third region comprises at least one component of the detection system (eg, fluorescent reporter or fluorescent quencher or a donor fluorophore).
  • the position of this component is in certain embodiments at the 5 ' end of the controller oligonucleotide. In another embodiment, this component is in the inner sequence segment of the third region.
  • the distance up to the 5 ' end of the controller oligonucleotide may be between 2 to 50 nucleotides, in particular between 2 and 20, in particular between 2 and 10 nucleotides.
  • the controller oligonucleotide may comprise, in addition to regions one, two and three, further sequence segments which, for example, flank the abovementioned regions in the 5 ' segment or 3 ' segment of the controller oligonucleotide.
  • sequence elements can be used, for example, for other functions, such as, for example, interaction with probes, binding to solid phase, etc. In particular, such regions do not disturb the function of regions one to three.
  • the length of these flanking sequences may be, for example, between 1 to 50 nucleotides.
  • a controller oligonucleotide may comprise at least one element for immobilization on a solid phase, eg a biotin residue.
  • a controller oligonucleotide may include at least one element for detection, eg, a fluorine dye.
  • strand displacement of the template strands is affected by newly synthesized strands.
  • the strand displacement and / or separation is either slowed down quantitatively or completely eliminated. It is thus not at all or less often the transfer of primer binding sites in the single-stranded state. Thus, there are no or only few primer binding sites available for a new interaction with primers. Thus, the system of both primer extension products is rarely put into an active state or an active state is not reached.
  • the efficiency of the double-stranded opening of the newly synthesized primer extension products after each individual synthesis step affects the potentially achievable yields in subsequent cycles: the fewer free / single-stranded primer binding sites of a nucleic acid chain to be amplified at the beginning of a synthesis step The lower the number of newly synthesized strands of the nucleic acid chain to be amplified in this step. In other words, the yield of a synthesis cycle is proportional to the amount of primer binding sites available for interaction with corresponding complementary primers. Overall, this can be realized a control circuit.
  • This control circuit corresponds to a real-time / on-line control of synthesized fragments: Sequence control takes place in the reaction mixture while the amplification takes place. This sequence control follows a predetermined pattern and the oligonucleotide system (by the strand-opening action of the controller oligonucleotide) can distinguish between "correct” and "non-correct” states without external interference. In the correct state, the synthesis of sequences is continued; in the incorrect state, the synthesis is either slowed down or completely prevented. The resulting differences in yields of "correct” and “incorrect” sequences after each step affect the entire amplification comprising a variety of such steps. In exponential amplification, this dependence is exponential so that even slight differences in efficiency in a single synthesis cycle due to the sequence differences may signify a significant time delay in total amplification, or cause the complete absence of detectable amplification in a given time frame.
  • the displacement of the second primer extension product from binding with the first primer extension product by means of a sequence-dependent strand displacement by the controller oligonucleotide forms a partial step in the amplification.
  • the reaction conditions during this step are adjusted accordingly.
  • the reaction temperature and the reaction time are chosen so that the reaction can take place successfully.
  • strand displacement by the controller oligonucleotide proceeds until binding / dissociation of the second primer extension product from binding with the first primer extension product.
  • Such dissociation of the 3 ' segment of the first primer extension product from complementary portions of the second primer extension product may occur spontaneously as part of a temperature-dependent / temperature-related separation of both primer extension products.
  • Such dissociation has a favorable effect on the kinetics of the amplification reaction and can be influenced by the choice of reaction conditions, for example by means of temperature conditions. The temperature conditions are therefore chosen such that successful strand displacement by complementary binding of the controller oligonucleotide favors dissociation of the second primer extension product from the 3 ' segment of the first primer extension product.
  • This embodiment is not a "classical" PCR, but the thermally induced dissociation of the 3 'segment runs in temperature ranges well below the typical strand separation inducing reactions of> 90 ° C of classical PCR.
  • the strand displacement by the controller oligonucleotide proceeds until the detachment / dissociation of a 3 ' segment of the second primer extension product (P2.1 -Ext) from the complementary binding with the first primer extension product (P1 .1- Ext), wherein this 3 ' segment of the second primer extension product (P2.1 -Ext) comprises at least a complementary region to the first primer and a complementary segment to the first primer extension product (P1 .1-Ext), which is only in the enzymatic synthesis originated.
  • a new primer oligonucleotide can be linked to its primer binding site of this single stranded sequence segment of the complexed (P2.1 -ext) bind under reaction conditions and thus initiate a synthesis of a new first primer extension product (P1.2-Ext) by a polymerase.
  • this reaction proceeds at a reduced rate, since the 3 ' segment of the P2.1 -Ext is not permanently single-stranded, but is in competitive behavior with the controller oligonucleotide and thus alternately single-stranded and double-stranded states by binding to the P1 1 - Ext.
  • Such dissociation has a favorable effect on the kinetics of the amplification reaction and may be influenced by the choice of reaction conditions, e.g. by means of temperature conditions.
  • the involvement of the polymerase-mediated synthesis-dependent strand displacement in the dissociation of P1.1 -Ext and P2.1 -Ext has a favorable effect on strand separation.
  • the temperature in this step includes, for example, ranges from 15 ° C to 75 ° C, especially from 30 ° C to 70 ° C, especially from 50 ° C to 70 ° C.
  • the controller oligonucleotide may be attached to the first primer. Extend extension product to the 3 ' segment of the first primer extension product and displace the second primer extension product. The second primer extension product thus remains in association with the 3 ' segment of the first primer extension product.
  • This strength of this compound can be influenced by temperature. Upon reaching a critical temperature, this compound can decay and dissociate both primer extension products. The shorter the sequence of the 3 ' segment, the more unstable this compound and the lower the temperature which causes spontaneous dissociation.
  • a spontaneous Disretion can be achieved for example in the temperature range, which is approximately at the melting temperature.
  • the temperature of the strand displacement steps through the controller oligonucleotide is at about the melting temperature (Tm +/- 3 ° C) of the complex comprising the 3 ' segment of the first primer extension product that is not bound by controller oligonucleotide , and the second primer oligonucleotide and the second primer extension product, respectively.
  • the temperature of the strand displacement steps through the controller oligonucleotide is at about the melting temperature (Tm +/- 5 ° C) of the complex comprising the 3 ' segment of the first primer extension product that is not bound by the controller oligonucleotide , and the second primer oligonucleotide and the second primer extension product, respectively.
  • the temperature of the steps of strand displacement by the controller oligonucleotide is above the melting temperature of the complex comprising the 3 ' segment of the first primer extension product that is not bound by the controller oligonucleotide and the second primer oligonucleotide second primer extension product.
  • a temperature includes temperature ranges from about Tm + 5 ° C to Tm + 20 ° C, especially from Tm + 5 ° C to Tm + 10 ° C.
  • a first primer extension product comprises a 3 ' segment which is not bound by the controller oligonucleotide, and which
  • a spontaneous dissociation is usually already achieved at temperature ranges between 40 ° C and 65 ° C. Higher temperatures also lead to dissociation.
  • a first primer extension product comprises a 3 ' segment which is not bound by the controller oligonucleotide, and which
  • Sequence lengths from 15 to about 25 nucleotides.
  • a spontaneous dissociation usually already be achieved at temperature ranges between 50 ° C and 70 ° C. Higher temperatures also lead to dissociation.
  • a first primer extension product comprises a 3 ' segment that is not bound by the controller oligonucleotide and that has sequence lengths of from 20 to about 40 nucleotides.
  • a spontaneous dissociation usually already at temperature ranges between 50 ° C and 75 ° C can be achieved. Higher temperatures also lead to dissociation.
  • composition of the 3 ' segment of the first primer extension product and optionally an introduction of melting temperature-influencing oligonucleotide modifications (eg MGB) or reaction conditions (eg TPAC, betaine)) can influence the choice of temperature.
  • An appropriate adaptation can therefore be made.
  • all steps of the amplification proceed under stringent conditions that prevent or slow down the formation of nonspecific products / by-products.
  • stringent conditions include, for example, higher temperatures, for example above 50 ° C.
  • the single steps of strand displacement by controller oligonucleotides proceed at the same temperature as the synthesis of the first and second primer extension products.
  • the individual steps of strand displacement by controller oligonucleotides occur at temperature that differs from the temperature of the respective synthesis of the first and second primer extension products.
  • synthesis of the first primer extension product and strand displacement by controller oligonucleotide proceeds at the same temperature.
  • synthesis of the second primer extension product and strand displacement by controller oligonucleotide proceeds at the same temperature.
  • the concentration of the controller oligonucleotide comprises ranges from 0.01 pmol / l to 50 pmol / l, in particular from 0.1 pmol / l to 20 pmol / l, in particular from 0.1 pmol / l to 10 pmol / l.
  • An oligonucleotide capable of binding with its 3 ' segment to a substantially complementary sequence within the nucleic acid or its equivalents to be amplified and initiating a specific second primer extension reaction (Figs. 14, 27 to 29, 55, 68 to 71).
  • This second primer oligonucleotide is thus capable of binding to the 3 ' segment of a first specific primer extension product of the first primer oligonucleotide and initiating polymerase-dependent synthesis of a second primer extension product.
  • every second primer oligonucleotide is specific for each nucleic acid to be amplified.
  • the second primer oligonucleotide should be able to be copied in the reverse synthesis and also serves as a template for the synthesis of the first primer extension product.
  • the length of the second primer oligonucleotide can be between 15 and 100 nucleotides, in particular between 20 and 60 nucleotides, in particular between 30 and 50 nucleotides.
  • the nucleotide building blocks are in particular linked to each other via conventional 5'-3 'bond or Phosphonick- Phosphothioester bond.
  • Such a primer oligonucleotide can be chemically synthesized in the desired form.
  • the second primer oligonucleotide may include nucleotide monomers that do not or only slightly affect the function of the polymerase, including, for example:
  • Modified nucleotides 2-amino-dA, 2-thio-dT or other nucleotide modifications with aberrant base pairing (e.g., universal base pairs such as inosine 5-nitroindole).
  • aberrant base pairing e.g., universal base pairs such as inosine 5-nitroindole.
  • the 3 'OH end of this range in particular free of modifications and has a functional 3' -OH group, that can be recognized by the polymerase, and matrizenabphasenig extended.
  • the 3 ' segment of the second primer comprises at least one phosphorothioate compound such that no degradation from the 3 ' end of the primer by the 3 ' exonuclease activity of polymerases can occur.
  • the second primer oligonucleotide can be used in several partial steps. First and foremost, it performs a primer function in the amplification.
  • the primer extension reaction is carried out using the first primer extension product as a template.
  • the second primer oligonucleotide may use the starting nucleic acid chain as a template at the beginning of the amplification reaction.
  • the second primer oligonucleotide may be used in the preparation / provision of a starting nucleic acid chain.
  • the second primer serves as the initiator of the synthesis of the second primer extension product using the first primer extension product as template.
  • the 3 ' segment of the second primer comprises a sequence which can bind predominantly complementary to the first primer extension product.
  • Enzymatic extension of the second primer oligonucleotide using the first primer extension product as template results in the formation of the second primer extension product.
  • Such synthesis typically occurs in parallel with displacement of the controller oligonucleotide from its binding with the first primer extension product. This displacement is predominantly due to the polymerase and may be partially due to the second Primer oligonucleotide take place.
  • Such a second extension product comprises the target sequence or its segments.
  • the sequence of the copiable portion of the first primer oligonucleotide is recognized by the polymerase as a template and a corresponding complementary sequence is synthesized.
  • This sequence is located in the 3 ' segment of the second primer extension product and comprises the primer binding site for the first primer oligonucleotide.
  • the synthesis of the second primer extension product occurs until the stop position in the first primer oligonucleotide.
  • this product is bound to the first primer extension product to form a double-stranded complex.
  • the second primer extension product is sequence-specifically displaced from this complex by the controller oligonucleotide. Again, after successful strand displacement by the controller oligonucleotide, the second primer extension product can itself serve as a template for the synthesis of the first primer extension product.
  • the second primer oligonucleotide can serve as the initiator of the synthesis of the second primer extension product starting from the starting nucleic acid chain at the beginning of the amplification.
  • the sequence of the second primer is completely complementary to the corresponding sequence segment of a starting nucleic acid chain.
  • the sequence of the second primer oligonucleotide is only partially complementary to the corresponding sequence segment of a starting nucleic acid chain. However, this aberrant complementarity is not intended to prevent the second primer oligonucleotide from starting a predominantly sequence-specific primer extension reaction.
  • the respective differences in complementarity of the second primer oligonucleotide to the respective position in the starting nucleic acid chain are in particular in the 5 ' segment of the second primer oligonucleotide, so that in the 3 ' segment a predominantly complementary base pairing and initiation of the synthesis is possible.
  • the first 4-10 positions in the 3 ' segment should be fully complementary to the template (starting nucleic acid chain).
  • the remaining nucleotide positions may differ from a perfect complementarity.
  • the extent of perfect complementarity in the 5 ' segment can range between 10% to 100%, especially between 30% and 100% of the base composition.
  • this deviation encompasses a complete complementarity in the 5 ' segment of 1 to 40, in particular 1 to 20 nucleotide positions.
  • the second primer oligonucleotide binds only to its 3 ' segment to the starting nucleic acid chain, but not to its 5 ' segment.
  • the length of such a 3 ' - segment of the second primer oligonucleotide fully complementary to the starting nucleic acid chain comprises regions between 6 and 40 nucleotides, in particular between 6 and 30 nucleotides, in particular between 6 and 20.
  • the length of a corresponding, not complementary to the starting nucleic acid chain 5 ' segment of the second primer oligonucleotide comprises regions between 5 and 60, in particular between 10 and 40 Nucleotides.
  • the second primer oligonucleotide can thus initiate synthesis of a starting nucleic acid.
  • sequence sections of the second primer oligonucleotide are copied from the polymerase so that again in subsequent synthesis cycles, a fully complementary primer binding site is formed within the first primer extension product for binding of the second primer oligonucleotide and is available in subsequent synthesis cycles.
  • the second primer oligonucleotide may be used in the preparation of a starting nucleic acid chain.
  • a second primer oligonucleotide can bind to a nucleic acid (for example a single-stranded genomic DNA or RNA or its equivalents comprising a target sequence) predominantly / preferably sequence-specifically and initiate a template-dependent primer extension reaction in the presence of a polymerase.
  • the binding position is chosen such that the primer extension product comprises a desired target sequence.
  • the extension of the second primer oligonucleotide results in a strand which has a sequence complementary to the template.
  • Such a strand can be detached from the template (eg by heat or alkali) and thus converted into a single-stranded form.
  • a single-stranded nucleic acid chain can serve as a starting nucleic acid chain at the beginning of the amplification.
  • Such a start nucleic acid chain comprises in its 5 ' segment the sequence parts of the second primer oligonucleotide, furthermore it comprises a target sequence or its equivalents and a primer binding site for the first primer oligonucleotide. Further steps are explained in the section "Starting nucleic acid chain".
  • the second primer oligonucleotide comprises sequence portions which can bind complementarily and sequence specifically to a sequence segment of a target sequence and initiate / support a successful primer extension reaction by the polymerase.
  • the length of such a sequence segment comprises regions of 6 and 40 nucleotides, in particular of 8 to 30 nucleotides, in particular of 10 to 25 nucleotides.
  • the second primer oligonucleotide comprises copyable sequence segments in its 3 ' and 5 ' segments which are copied from the polymerase upon synthesis of the first primer extension product.
  • all sequence sections of the second primer are copied from the polymerase. This results in the formation of a primer binding site in the 3 ' segment of the first primer extension product.
  • the second primer oligonucleotide corresponds in length to the 3 ' segment of the first primer extension product that is not bound by the controller oligonucleotide.
  • the 3 ' end of such a second primer oligonucleotide is adjacent to the controller oligonucleotide which is adjacent to the first oligonucleotide Primer extension product is bound.
  • Extension of such a primer is done using the first primer extension product as a template. Upon extension of such a primer, the displacement of the controller oligonucleotide from binding with the first primer extension product occurs via polymerase-dependent strand displacement.
  • the second primer oligonucleotide with its copiable sequence portions is shorter than the 3 ' segment of the first primer extension product that is not bound by the controller oligonucleotide.
  • the complex comprising the second primer oligonucleotide and the first primer extension product, there is a single-stranded portion of the first primer extension product between the 3 ' end of such primer and the controller oligonucleotide bound to the first primer extension product.
  • Extension of such a primer is done using the first primer extension product as a template. Upon extension of such a primer, the displacement of the controller oligonucleotide from binding with the first primer extension product occurs via polymerase-dependent strand displacement.
  • the second primer oligonucleotide with its copatible portions is longer than the 3 ' segment of the first primer extension product that is not bound by the controller oligonucleotide.
  • the 3 ' segment of the second primer and the 5 ' segment of the controller oligonucleotide compete for binding to the first primer extension product.
  • the binding of the 3 ' segment of the second primer to the first primer extension product required for initiation of the synthesis takes place with simultaneous partial displacement of the 5 ' segment of the controller oligonucleotide.
  • the extension of such a primer is performed using the first primer extension product as a template.
  • the displacement of the controller oligonucleotide from binding with the first primer extension product occurs via polymerase-dependent strand displacement.
  • the sequence length of the 3 ' segment of the second primer oligonucleotide which displaces the 5 ' segment of the controller oligonucleotide may comprise the following ranges: 1 to 50 nucleotides, in particular 3 to 30 nucleotides, in particular 5 to 20 nucleotides.
  • second primer oligonucleotides of greater length which exceeds the length of the 3 ' segment of the first primer extension product, is advantageous in some embodiments.
  • Such embodiments include, for example, a first primer extension product having a 3 ' segment that is not bound by the controller oligonucleotide, having a length of 5 to 40 nucleotides, more preferably 10 to 30 nucleotides.
  • a longer second primer oligonucleotide provides improved sequence specificity upon initiation of the synthesis.
  • the binding strength of the second primer oligonucleotide to its primer binding site depends on the length of the primer. In general, longer second primer oligonucleotides can be used at higher reaction temperatures.
  • sequences of the first, second primer oligonucleotide and the controller oligonucleotide are matched to one another such that side reactions, e.g. Primer-dimer formation, minimized.
  • sequence of the first and second primer oligonucleotides are adapted to each other such that both primer oligonucleotides are incapable of undergoing an amplification reaction in the absence of an appropriate template and / or target sequence and / or starting sequence. Start nucleic acid chain.
  • the second primer oligonucleotide does not comprise a primer binding site for the first primer oligonucleotide and the first primer oligonucleotide does not comprise a primer binding site for the second primer oligonucleotide.
  • the primer sequences comprise extended self-complementary structures (self-complement).
  • the synthesis of the second primer extension product is a primer extension reaction and forms a substep in the first amplification.
  • the reaction conditions during this step are adjusted accordingly.
  • the reaction temperature and the reaction time are chosen so that the reaction can take place successfully.
  • the particular preferred temperature in this step depends on the polymerase used and the binding strength of the respective second primer oligonucleotide to its primer binding site and includes, for example, ranges from 15 ° C to 75 ° C, especially from 20 to 65 ° C, in particular from 25 ° C to 65 ° C.
  • the concentration of the second primer oligonucleotide comprises ranges from 0.01 pmol / l to 50 pmol / l, in particular from 0.1 pmol / l to 20 pmol / l, in particular from 0.1 pmol / l to 10 pmol / l.
  • all steps of the amplification proceed under stringent conditions that prevent or slow down the formation of nonspecific products / by-products.
  • stringent conditions include, for example, higher temperatures, for example above 50 ° C.
  • sequence-specific primer oligonucleotides are preferably used in each case for the amplification of corresponding respective target sequences.
  • the synthesis of the first and second primer extension products proceeds at the same temperature. In certain embodiments, the synthesis of the first and second primer extension products proceeds at different temperatures. In certain embodiments, synthesis of the second primer extension product and strand displacement by controller oligonucleotide proceeds at the same temperature. In certain embodiments, synthesis of the second primer extension product and strand displacement by controller oligonucleotide proceeds at different temperatures.
  • template-dependent polymerases are used which are capable of strand displacement.
  • a large fragment of the Bst polymerase or its modifications can be used.
  • Klenow fragment, Vent exo minus polymerase, Deepvent exo minus DNA polymerase, large fragment of Bsu DNA polymerase, large fragment of Bsm DNA polymerase can be used.
  • Vent exo minus polymerase, Deepvent exo minus DNA (from NEB) and PyroPhage polymerase from Lucigen are thermostable enzymes with strand displacement activity.
  • polymerases are used which exhibit no activity at room temperature, so-called hot-start polymerases or warm-start polymerases.
  • hot-start polymerases or warm-start polymerases.
  • An example of this is provided by Bst 2.0 Polymerase Warm Start (from NEB).
  • the third primer oligonucleotide is identical to the first primer oligonucleotide of the first amplification system.
  • the third primer oligonucleotide is not identical to the first primer oligonucleotide of the first amplification system.
  • the length of the third primer oligonucleotide may be between 15 and 100 nucleotides, in particular between 20 and 60 nucleotides, in particular between 30 and 50 nucleotides.
  • the CG content is for example between 20% and 80%, in particular between 30 and 79%.
  • the nucleotide building blocks are in particular linked to each other via conventional 5'-3 'bond or Phosphodie- Phosphothioester bond. Such a primer oligonucleotide can be chemically synthesized in the desired form.
  • the third primer oligonucleotide may include nucleotide monomers that do not or only insignificantly affect the function of the polymerase, including, for example:
  • Modified nucleotides nuclease-resistant phosphorothioate compounds (PTO) modifications, LNA modifications, 2-amino-dA, 2-thio-dT or other nucleotide modifications with different base pairing (eg universal base pairs, such as inosine 5 -Nitroindol).
  • the 3 'OH end of the third oligonucleotide primer in particular free of modifications and a functional 3' has -OH group of the Polymerase detected and can be extended depending on the template.
  • the 3 ' segment of the third primer comprises at least one phosphorothioate compound, so that no degradation of the 3 ' end of the primer by 3 ' exonuclease activity of polymerases can take place.
  • the 3 ' end of the third primer is blocked.
  • a 3 ' phosphate group or with a C3 linker The activation of the 3 ' segment of the third primer oligonucleotide in these embodiments takes place only in the second amplification, for example using 3 ' -5 ' -exonuclease activity of the second polymerase.
  • the third primer oligonucleotide does not comprise any sequence segments which are capable of complementary binding to the first region of the controller oligonucleotide.
  • the third primer oligonucleotide ( Figures 15-31) can be positioned in various arrangements relative to the first amplification fragment 1.1 (the first amplification product 1.1 comprising a target sequence).
  • the third and fourth primers In order for the second amplification reaction to start using a first amplification fragment 1 .1 as template (starting nucleic acid chain 2.1), the third and fourth primers must bind within sequences predetermined by the first amplification fragment and be extended by the polymerase become.
  • the third primer oligonucleotide can bind to a strand of the first amplification fragment 1 .1.
  • the third primer oligonucleotide binds to the second primer extension product and can thereby initiate primer extension using a suitable polymerase and reaction conditions.
  • This binding of the third primer oligonucleotide is in certain embodiments preferably in the 3 ' segment of the second primer extension product.
  • the third primer oligonucleotide preferably comprises a sequence segment in its 3 ' region which can bind complementarily or predominantly complementarily to the second primer extension product under used reaction conditions such that the polymerase is capable of facilitating the synthesis of the third primer extension product initiate.
  • this segment comprises in particular ranges between 6 and 30 nucleotides, in particular between 8 and 25 nucleotides, in particular between 10 and 20 nucleotides, in particular between 10 and 15 nucleotides.
  • this segment is fully complementary to the corresponding segment of the second primer extension product.
  • this segment comprises at least one mismatch to the primer extension product.
  • the position of this mismatch is no closer than -4 position with respect to the 3 ' end of the third primer, in particular no closer than -5, in particular no closer than -6, in particular no closer than position -8 relative to the 3 ' end of the third primer oligonucleotide.
  • the third primer oligonucleotide can also bind to the controller oligonucleotide with this 3 ' segment, such is Mismatch weakened the binding of this segment to the controller oligonucleotide.
  • this segment is functional at the reaction conditions used does not irreversibly bind to the controller oligonucleotide and thus inactivate it.
  • the third primer oligonucleotide may bind predominantly complementary to the same sequence segment as the first primer oligonucleotide.
  • the position of the 3 ' end of the third primer oligonucleotide matches the position of the 3 ' end of the first primer oligonucleotide.
  • the third primer oligonucleotide may at least partially (with its 3 ' segment) bind complementary to a portion of the target sequence.
  • the 3 ' end of the third primer is thus within the second blocking unit of the controller oligonucleotide and can not be extended through the polymerase using the controller as a template ( Figure 20).
  • the third primer oligonucleotide binds predominantly complementary to the second primer extension product with its 3 ' end shifted relative to the 3 ' end of the first primer oligonucleotide.
  • the 3 ' end of the third primer oligonucleotide is shifted by at least one nucleotide in the 3 ' direction of the second primer extension product.
  • the segment of the second primer extension product to which the third primer oligonucleotide is capable of predominantly complementary binding is shifted in the 3 ' direction ( Figure 19).
  • the 3 ' end of the third primer oligonucleotide is shifted by at least one nucleotide in the 5 ' direction of the second primer extension product.
  • the segment of the second primer extension product, to which the third primer oligonucleotide can bind predominantly complementarily is shifted in the 5 ' direction (FIG. 21).
  • the binding position of the third primer oligonucleotide is shifted in the 5 ' direction of the second primer extension product so that the third primer oligonucleotide does not overlap the binding position of the first primer oligonucleotide of the first amplification system.
  • the segment of the second primer extension product to which the third primer oligonucleotide is capable of predominantly complementary binding is shifted in the 5 ' direction relative to the binding site of the first primer oligonucleotide ( Figure 22).
  • the third primer oligonucleotide thus comprises sequence segments which can bind complementarily to the controller oligonucleotide.
  • the segment of the controller oligonucleotide which is capable of complementary binding to the third primer oligonucleotide is referred to as the fourth region of the controller oligonucleotide.
  • the fourth blocking unit Figures 19-22. Their position depends on the potential binding position of the third primer oligonucleotide within the controller.
  • the third primer oligonucleotide is said to be capable of being copied upon reverse synthesis and also serves as a template for the synthesis of the fourth primer extension product.
  • the third primer oligonucleotide comprises, in certain embodiments, at least one sequence segment in its 3 ' region which is capable of predominantly complementary binding to the first target sequence. This segment can bind predominantly complementarily to the second primer extension product (comprising corresponding segments of the target sequence), which polymerase can perform a primer extension reaction.
  • the third primer oligonucleotide in certain embodiments, comprises at least one sequence segment in its 5 ' region which is not complementary to the target sequence.
  • This segment may, for example, comprise from 1 to 60 nucleotides and may serve, for example, for other purposes, for example barcoding, cloning, immobilization, probe binding, etc.
  • the sequence composition of this 5 ' region is adapted so as not to interfere with the second amplification.
  • the third primer oligonucleotide may comprise further modifications, eg fluorescent dyes (eg FAM, Cy5 etc.), fluorescence quenchers (eg BHQ1, BHQ2 etc), affinity tags (eg biotin, digoxigenin etc.).
  • the third primer oligonucleotide may comprise a linker (eg, C3 or HEG linker) such that its 5 ' region remains uncoupled from the polymerase.
  • the third primer is immobilized on a solid phase prior to the second amplification reaction.
  • the primer extension of this third primer oligonucleotide thus leads to the immobilization of the entire third primer extension product.
  • the concentration of the third primer oligonucleotide used may comprise, for example, ranges between 0.01 pmol / l to about 10 pmol / l, in particular between 0.1 pmol / l and about 2 pmol / l.
  • the fourth primer oligonucleotide is identical to the second primer oligonucleotide of the first amplification system.
  • the fourth primer oligonucleotide is not identical to the second primer oligonucleotide of the first amplification system.
  • the length of the fourth primer oligonucleotide can be between 15 and 100 nucleotides, in particular between 20 and 60 nucleotides, in particular between 30 and 50 nucleotides.
  • the CG content is for example between 20% and 80%, in particular between 30 and 79%.
  • the nucleotide building blocks are in particular linked to each other via conventional 5'-3 'phosphodiester bond or Phosphothioester bond. Such a primer oligonucleotide can be chemically synthesized in the desired form.
  • the fourth primer oligonucleotide may include nucleotide monomers that do not or only insignificantly affect the function of the polymerase, including, for example:
  • Modified nucleotides nuclease-resistant phosphorothioate compounds (PTO) modifications, LNA modifications, 2-amino-dA, 2-thio-dT or other nucleotide modifications with different base pairing (eg universal base pairs, such as inosine 5 -Nitroindol).
  • the 3 'OH end of the fourth oligonucleotide primer in particular free of modifications and has a functional 3' -OH group, that can be recognized by the polymerase, and template-extended.
  • the 3 ' segment of the fourth primer comprises at least one phosphorothioate compound such that no degradation from the 3 ' end of the primer by the 3 ' exonuclease activity of polymerases can occur.
  • the 3 ' end of the fourth primer is blocked.
  • a 3 ' phosphate group or with a C3 linker The activation of the 3 ' segment of the fourth primer oligonucleotide in these embodiments takes place only in the second amplification, for example using 3 ' -5 ' -exonuclease activity of the second polymerase.
  • the fourth primer oligonucleotide does not comprise any sequence segments which are capable of complementary binding to the first region of the controller oligonucleotide.
  • the fourth primer oligonucleotide ( Figures 15-31) can be positioned in various arrangements relative to the first amplification fragment 1.1 (the first amplification product 1.1 comprising a target sequence).
  • the third and fourth primers In order for the second amplification reaction to start using a first amplification fragment 1 .1 as template (starting nucleic acid chain 2.1), the third and fourth primers must bind within sequences predetermined by the first amplification fragment and be extended by the polymerase become.
  • the fourth primer oligonucleotide can bind to a strand of the first amplification fragment 1.1.
  • the fourth primer oligonucleotide binds to the first primer extension product and can thereby initiate primer extension using a suitable polymerase and reaction conditions.
  • This binding of the fourth primer oligonucleotide is in certain embodiments preferably in the 3 ' segment of the first primer extension product.
  • the fourth primer oligonucleotide preferably comprises a sequence segment in its 3 ' region which can bind complementary or predominantly complementary to the first primer extension product under reaction conditions used so that the polymerase is capable of facilitating the synthesis of the fourth primer extension product to initiate.
  • the length of this segment comprises in particular ranges between 6 and 40 nucleotides, in particular between 8 and 30 nucleotides, in particular between 10 and 25 nucleotides, in particular between 10 and 20 nucleotides.
  • this segment is fully complementary to the corresponding segment of the first primer extension product.
  • this segment comprises at least one mismatch to the first primer extension product.
  • the position of this mismatch is no closer than -4 position with respect to the 3 ' end of the fourth primer, in particular not closer than -5, in particular not closer than -6, in particular not closer than position -8 relative to the 3 ' . End of the fourth primer oligonucleotide.
  • the position of the binding of this segment to the first primer extension product may be chosen differently (Figs. 23-31, 57).
  • the fourth primer oligonucleotide may bind predominantly complementary to the same sequence segment as the second primer oligonucleotide.
  • the position of the 3 ' end of the fourth primer oligonucleotide matches the position of the 3 ' end of the second primer oligonucleotide.
  • the fourth primer oligonucleotide comprises at least in part (with its 3 ' segment) a portion of the target sequence.
  • the fourth primer oligonucleotide binds predominantly complementary to the first primer extension product, with its 3 ' end being shifted with respect to the 3 ' end of the second primer oligonucleotide.
  • the 3 ' end of the fourth primer oligonucleotide is shifted by at least one nucleotide in the 3 ' direction of the first primer extension product.
  • the segment of the first primer extension product to which the fourth primer oligonucleotide is capable of predominantly complementary binding is displaced in the 3 ' direction ( Figure 1).
  • the 3 ' end of the fourth primer oligonucleotide is shifted by at least one nucleotide in the 5 ' direction of the first primer extension product.
  • the segment of the first primer extension product to which the fourth primer oligonucleotide is capable of predominantly complementary binding is shifted in the 5 ' direction.
  • the fourth primer oligonucleotide does not comprise any sequence segments which can bind complementarily to the controller oligonucleotide.
  • the fourth primer oligonucleotide should be able to be copied in reverse synthesis and also serves as a template for in the context of the synthesis of the third primer extension product.
  • the fourth primer oligonucleotide in certain embodiments, comprises at least one sequence segment in its 3 ' region which comprises portions of the first target sequence and thus can bind to a strand which is complementary to the target sequence.
  • This segment can be predominantly complementary to the first primer extension product (comprising corresponding complementary segments to the target sequence), which polymerase can perform a primer extension reaction.
  • the fourth primer oligonucleotide in certain embodiments, comprises at least one sequence segment in its 5 ' region which does not comprise sequence segments of the first target sequence.
  • This segment may, for example, comprise from 1 to 60 nucleotides and may for example serve other purposes, for example "barcoding", cloning, immobilization, probe binding, etc.
  • the sequence composition of this 5 ' region is adapted so as not to interfere with the second amplification ,
  • the fourth primer oligonucleotide may comprise further modifications, eg fluorescent dyes (eg FAM, Cy5 etc.), fluorescence quenchers (eg BHQ1, BHQ2 etc), affinity tags (eg biotin, digoxigenin etc.)
  • fluorescent dyes eg FAM, Cy5 etc.
  • fluorescence quenchers eg BHQ1, BHQ2 etc
  • affinity tags eg biotin, digoxigenin etc.
  • Primer oligonucleotide include a linker (eg C3 or HEG linker) so that its 5 ' region remains uncoupled from the polymerase.
  • the fourth primer is immobilized on a solid phase prior to the second amplification reaction.
  • the primer extension of such a fourth primer oligonucleotide thus leads to immobilization of the entire fourth primer extension product.
  • the concentration of the fourth primer oligonucleotide used may comprise, for example, ranges between 0.01 pmol / l to about 10 pmol / l, in particular between 0.1 pmol / l and about 2 pmol / l.
  • thermostable template-dependent DNA polymerases are used, which have a 5'-3 'exonuclease activity.
  • Taq polymerase and / or its formulations and / or their modifications are used to carry out the second amplification.
  • thermostable template-dependent DNA polymerases having strand-displacement activity are used.
  • Vent Exo minus from NEB
  • PyroPhage Polymerase from Lucigene
  • SD Polymerase from Bioron.
  • thermostable template-dependent DNA polymerases are used which have a 3 ' -5 ' proof reading activity.
  • Vent exo plus Deep Vent exo plus (from NEB), Pfu Polymerase (Jena Biosciences), Phusion Polymerase (NEB).
  • thermostable template-dependent DNA polymerases are used which are conjugated to another protein, for example to increase the polymerase's processivity.
  • Phusion Polymerase NEB
  • Primer oligonucleotides comprising additional sequence segments:
  • first primer and the second primer can be considered as so-called “base structure of the primer” or “minimal structure of the primer”.
  • Such basic structures of oligonucleotides with primer function comprise sequence segments which are essential for the execution of the amplification reaction.
  • Method are advantageous, for example, the first and second region of the first primer.
  • Such a basic structure of the primer can be extended by additional, additional sequence segments.
  • additional sequence segments include structures which, while not necessary for the performance of the amplification process, may nevertheless be useful for other tasks.
  • Such additional sequence segments may optionally be introduced into a primer and used for further functions or reactions. This allows the polymerase synthesized primer extension products (starting from, for example, the first and / or the second primer) to be linked to such sequences segments. This achieves integration of such additional sequence segments and primer extension products into a molecular structure. Such integration may be advantageous in certain embodiments.
  • a variety of applications for primer sequences with additional sequence segments are known to one skilled in the art.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure mit verbesserter Spezifität unter Verwendung besonderer Primer-Oligonukleotide und Controller-Nukleotide, wobei in einer ersten Amplifikation die Controller-Oligonukleotide in sequenzspezifischer Weise eine Strangöffnung im Amplifikat ermöglichen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein entsprechendes Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure mit verbesserter Spezifität
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren mit verbesserter Spezifität.
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der folgenden Anmeldungen: Europäische Patentanmeldungen EP18158722.1 vom 26.02.18; EP18195312.6 vom 18.09.2018; EP 18159337.7 vom 28.02.2018; Deutsche Patentanmeldung 10 2018 001586.7 vom 28.02.2018; diese und alle anderen hier erwähnten Patentdokumente sollen durch die Referenzierung als in die vorliegende Beschreibung aufgenommen gelten (incorporation by reference)
Hintergrund
Die Synthese von Nukleinsäureketten nimmt heute eine zentrale Rolle in der Biotechnologie ein. Verfahren wie PCR haben sowohl die Forschungslandschaft als auch industrielle Applikationsfelder, wie Diagnostik und Lebensmittelindustrie, signifikant weiterentwickelt. Die Verbindung der PCR mit Technologien wie Sequenzierung, Real-Time- Nachweis, Microarray- Technologie, Mikrofluidic-Managment etc. hat zur technologischen Entwicklung beigetragen und Nachteile der ursprünglichen PCR teilweise überwinden können. Es wurden auch weitere Amplifikations-Verfahren, wie isothermale Amplifikationstechniken entwickelt. Deren Einsatz wurde besonders für Bereich von POCT ( point-of-care-testing ) vorgesehen. Trotz enormer Fortschritte auf diesem Gebiet nimmt die PCR die zentrale Rolle ein und bestimmt somit die einzelnen technologischen Barrieren ihrer Anwendung.
Während des Amplifikationsvorgangs findet bei der PCR keine Kontrolle der zwischen den Primern gelegenen amplifizierten Sequenzabschnitte statt. Die Primer-Bindung steht im Fokus von Optimierungen von PCR-Methoden. Zu Beginn der PCR und in ihrem Verlauf kommt es kontinuierlich zur Initiierung der Synthese von Hauptprodukten und Nebenprodukten, z.B. durch unspezifische Bindung oder Verlängerung der Primer. Bei ggf. erfolgenden Rücksynthesereaktionen wird der unspezifisch verlängerte Primer als Matrize abgelesen, was in der Regel zu Ausbildung einer vollständigen Primer-Bindungsstelle führt. Somit erfolgt eine Übertragung einer fehlerhaften Sequenzinformation von einem Synthese-Zyklus auf den nächsten, was in Summe nicht nur zur initialen Entstehung, sondern vor allem zur exponentiellen Vermehrung von Nebenprodukten führt.
Solche Nebenreaktionen können zur exponentiellen Vermehrung von Fragmenten führen, welche die Hauptreaktion (Amplifikation einer Zielsequenz) stören bzw. zu Interferenzen in nachfolgenden Schritten der Analyse führen. Solche Nebenprodukte umfassen typischerweise linke und rechte Primersequenzen, so dass ihre Amplifikation parallel zu der Hauptreaktion stattfinden kann. Anstatt einer Zielsequenz umfassen solche Nebenprodukte allerdings eine andere Nukleinsäure- Zielsequenz. Vorrangig wird die Spezifität der PCR Amplifikation durch Optimierung der Primer-Bindung an Zielsequenzen erreicht. Dabei können beispielsweise zusätzliche Oligonukleotide verwendet werden, welche teilweise an den Primer binden und somit bei Primer-Bindung an andere Nukleinsäureketten kompetitiv mitwirken können. Solche Sonden binden in der Regel an einen Sequenzabschnitt des Primers und lassen einen einzelsträngigen Abschnitt frei, mit dem der Primer an die Zielnukleinsäure binden und eine Synthesereaktion initiieren kann. Primer-Matrizen Mismatches können durch solche Oligonukleotide kompetitiv verdrängt werden, was die Spezifität der Initiierung verbessert. Solche zusätzlichen Oligonukleotide interagieren nicht mit der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette in Abschnitten zwischen den beiden Primern. Aufgrund eines molaren Überschusses der Primer kann es während einer Amplifikation dennoch zu unspezifischen Interaktionen von Primern mit Matrizen kommen, was zur Ausbildung einer voll funktionsfähigen Primer-Bindungsstelle als Folge der Synthese eines komplementären Stranges des Nebenproduktes. Das Vorliegen einer solchen vollständigen Primerbindungsstelle im Nebenprodukt führt zu einem Verlust der kompetitiven Wirkung von solchen zusätzlichen Oligonukleotiden auf die Primer-Bindung. Die Kontrolle der Spezifität der Bindung eines Primers an die Matrize durch solche Oligonukleotide macht somit nur die Initiierung einer Nebenreaktion unwahrscheinlicher, kann allerdings nach Entstehung eines Nebenproduktes seine expontielle Amplifikation kaum beeinflussen.
Die Nebenreaktionen bei einer PCR nehmen mit der Anzahl von durchgeführten Synthese-Zyklen zu, wobei oft bis zu 40 PCR-Zyklen durchgeführt werden. Nach der PCR-Amplifikation können andere Verfahren angeschlossen werden, z.B. Detektion, l/bra/y-Herstellung, Klonierung, Sequenzierung, etc. Diese Verfahren können nur bis zu einem gewissen Maß die während einer PCR-Amplifikation entstandenen Nebenprodukte bzw. Sequenzabweichungen tolerieren. Im Allgemeinen wird die Spezifität solcher Verfahren ebenfalls von der Problematik der Nebenreaktionen während einer PCR beeinflusst.
Die Verbesserung der Spezifität der Synthese eines Amplifikationsverfahrens mit reduzierter Entstehung und Co-Amplifikation von Nebenprodukten führt zu einer Verbesserung von diagnostischen Verfahren.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel bereitzustellen, welche die Spezifität der enzymatischen Amplifikation von Nukleinsäureketten verbessern.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Kombination eines Amplifikationsverfahren mit einer PCR-Amplifikation bereitzustellen, wobei die Signalerfassung (Monitoring bzw. Detektion), bzw. die Amplifikation von Zielsequenzen zunächst mittels geregelter Amplifikation unter Verwendung eines Controller-Oligonukleotids und von entsprechenden spezifischen Primer-Sets erfolgt und anschließend mittels PCR weitergeführt wird, insbesondere unter Verwendung PCR- spezifischer Primer.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist eine Reduzierung der Anzahl von PCR-Synthese-Zyklen, welche notwendig sind, um eine hinreichende Menge an PCR-Produkten zu erhalten. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues enzymatisches Verfahren und Komponenten für die Synthese von Nukleinsäureketten, sowie die Amplifikation von Nukleinsäureketten bereitzustellen, bei dem eine kontinuierliche (on-line) Signal-Erfassung bereitgestellt wird, wobei die Signal-Erfassung (Monitoring/Detektion) durch sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonden vermittelt bzw. unterstützt wird.
Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und ein Kit gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen und der folgenden Beschreibung aufgeführt.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, umfassend die Schritte:
a) eine erste Amplifikation mit den Schritten:
Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) an eine zu amplifizierende Nukleinsäure mit einer Zielsequenz, wobei das erste Primer-Oligonukleotid (P1 .1 ) folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (P1 .1 .1 ), der sequenzspezifisch an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure binden kann, wobei der Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure zumindest den 5'-Terminus der Zielsequenz umfasst oder in sich in 5'-Richtung von der Zielsequenz befindet;
• einen zweiten Bereich (P1 .1 .2), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und für die verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt;
Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1 ) durch eine erste Polymerase unter Erhalt eines ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 -Ext), welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid (P1 .1 ) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt und die zu amplifizierende Nukleinsäure als Doppelstrang vorliegen;
Bindung eines Controller-Oligonukleotids (C1 .1 ) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1 1 -Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (C1 .1 .1 ), der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 -Ext) binden kann,
• einen zweiten Bereich (C1 .1 .2), der zum ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotids (P1 .1 ) im Wesentlichen komplementär ist, und • einen dritten Bereich (C1 .1 .3), der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 -Ext) im Wesentlichen komplementär ist; und
wobei das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) dient, und das erste Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) an den ersten und zweiten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 - Ext) unter Verdrängung (des zu dem ersten und zweiten Bereich komplementären Bereichs) der zu amplifizierenden Nukleinsäure bindet;
Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids (P2.1 ) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen Bereich (P2.1 .1 ) umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 -Ext) binden kann, der zumindest zum 5'- Terminus der Zielsequenz komplementär ist oder sich in 3'-Richtung davon befindet; Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids (P.2.1 ) durch die erste Polymerase unter Erhalt eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1 -Ext), welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen identisch zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext) und das zweite Primerverlängerungsprodukt (P2.1 ) ein erstes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt bilden; und
b) eine zweite Amplifikation mit den Schritten:
Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids (P3.1 ; P3.2) an das zweite Primer- Verlängerungsprodukt (P1 1-Ext.) des ersten Amplifikationsprodukts, wobei das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.1 ; P3.2) einen ersten Bereich (P3.1 .1 ) umfasst, der sequenzspezifisch an einen Bereich des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 1-Ext.) binden kann, der zumindest den 5'-Terminus der Zielsequenz umfasst oder sich in 5'-Richtung davon befindet;
Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.1 ; P3.2) durch eine zweite Polymerase unter Erhalt eines dritten Primer-Verlängerungsprodukts (P3.1/2-Ext), welches neben dem dritten Primer-Oligonukleotid (P3.1 ; P3.2) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum zweiten Primer- Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) oder zur Zielsequenz ist, wobei das zweite Primer- Verlängerungsprodukt (P2.1 ) und das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 ) als Doppelstrang vorliegen;
Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids (P4.1 ; P4.2) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1 1 -Ext), wobei das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.1 ; P4.2) einen ersten Bereich (P4.1 .1 ) umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 -Ext) binden kann, der zumindest zum 5'-Terminus der Zielsequenz komplementär ist oder sich in 3'- Richtung davon befindet;
Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids (P4.1 ; P4.2) durch die zweite Polymerase unter Erhalt eines vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1/2-Ext), welches neben dem vierten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Primer- Verlängerungsprodukt (P1 1 -Ext) oder identisch zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1 1-Ext) und das vierte Primer- Verlängerungsprodukt (P4.1/2-Ext) als Doppelstrang vorliegen;
Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1 1 -Ext) und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1/2-Ext) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 ) und dem dritten Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1 );
Hybridisieren des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das vierte Primer- Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und Verlängerung des dritten Primer-
Oligonukleotids (P3.2) durch die zweite Polymerase; und
Hybridisieren des vierten Primer-Oligonukleotids an das dritte Primer-
Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext) und Verlängerung des vierten Primer-
Oligonukleotids (P4.1 ; P4.2) durch die zweite Polymerase.
Alternativ kann ein Aspekt der Erfindung auch als ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure (Fig. 1 , 55 - 56), formuliert werden, wobei eine Probe, die ein erstes Nukleinsäurepolymer umfassend eine erste Zielsequenz M1 [und die zu M1 (revers) komplementäre Sequenz M1 '], wobei M in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte M1 .5, M1 .4, M1 .3, M1 .2 und M1 .1 umfasst,
in einem ersten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
i. eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA- Polymerase, sowie Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren wie Mg-Salze,
ii. ein erster (rechter) Oligonukleotidprimer P1 .1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 umfasst, wobei P1 .1 .1 eine zu M1 .1 komplementäre [hybridisierende] Sequenz aufweist [im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann] und der Sequenzabschnitt P1 .1 .2 nicht an M1 [oder eine in Bezug auf die Sequenz M1 in 3‘ unmittelbar an M1 .1 anschließende Sequenz] binden kann, und wobei P1 .1 (insbesondere im Abschnitt P1 .1 .2) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass P1 .1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und iii. ein zweiter (linker) Oligonukleotidprimer P2.1 , welcher (im Wesentlichen) identisch mit M1 .5 ist [und sequenzspezifisch die revers komplementäre Sequenz von M1 .5 auf dem Gegenstrang von M1 oder dem Verlängerungsprodukt von P1 .1 , P1 1 -Ext, dort als P1 .1 E1 bezeichnet, binden kann];
iv. ein Controller-Oligonukleotid C1 .2, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte C1 .2.3, C1 .2.2 und C1 .2.1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C1 .2.3 identisch zu einem Abschnitt M1 .2 von M1 ist, welcher in 5‘ von M1 .1 liegt [und bei Initiation der Polymerase von P1 .1 zuerst abgelesen wird, C1 .2.3 also an das Polymerisationsprodukt des Primers P1 .1 -Ext binden kann], C1 .2.2 komplementär zu P1 .1 .1 (und identisch zu M1 .1 ) ist und C1 .2.1 komplementär zu P1 .1 .2 ist,
und wobei C1 .2 in C1 .2.1 modifizierte Nukleotid bausteine umfasst, so dass C1 .2.1 nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann;
und wobei die Probe nachfolgend oder gleichzeitig in einem zweiten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
v. ein dritter (rechter) Oligonukleotidprimer P3.1 , welcher am 3’ Terminus einen
Sequenzabschnitt 3.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 3.1 .1 besteht], der (revers) komplementär zu M1 .1 von M1 ist [komplementär an P2.1 -Ext binden kann],
vi. ein vierter (linker) Oligonukleotidprimer P4.1 , welcher am 3’ Terminus einen
Sequenzabschnitt 4.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 4.1 .1 besteht], der identisch / oder im Wesentlichen identisch zu M1 .5 von M1 ist [komplementär an P1 1 -Ext binden kann], vii. eine zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-
Polymerase, sowie ggf. Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren.
Im ersten Amplifikationsschritt wird ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt P1 .1-Ext. erhalten, welches in 5‘-3‘-Orientierung neben den Sequenzbereichen P1 .1 .2 und P1 .1 .1 einen synthetisierten Bereich umfasst, der in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte P1 .1 E4, P1 .1 E3, P1 .1 E2 und P1 .1 E1 aufweist, wobei P1 .1 E4 zum Sequenzabschnitt M1 .2 der Zielsequenz M1 , P1 .1 E3 zu M1 .3, P1 .1 E2 zu M1 .4 und P1 .1 E1 zu M1 .5 im Wesentlichen komplementär ist. Ebenso wird ein zweites Primer-Verängerungsprodukt P2.1 -Ext erhalten, welches neben dem Sequenzbereich P2.1 .1 einen synthetisierten Bereich P2.1 -Ext. umfasst, der im Wesentlichen identisch zur Zielsequenz M1 im an M1 .5 in 3‘ angrenzenden Bereich ist. Die Reaktionsbedingungen und/oderdie Längen bzw. Schmelztemperaturen von P1 .1 .2 und ggf. M1 .4, M1 .3, M1 .2 und M1 .1 des ersten Amplifikationsschrittes werden so gewählt, dass P1 1-Ext mit M1 bzw. mit P2.1 -Ext einen Doppelstrang bilden kann, und P1 .1 -Ext mit C1 .2 einen Doppelstrang bilden kann und die Bildung des Doppelstranges aus P1 1 -Ext mit C1 .2 gegenüber der Bildung des Doppelstrangs aus P1 1-Ext mit P2.1 -Ext bevorzugt ist. In einer allgemeineren Form kann die Erfindung auch als ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure formuliert werden, wobei eine Probe, die ein erstes Nukleinsäurepolymer umfassend eine erste Zielsequenz M1 in einem ersten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
a. eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine erste DNA- Polymerase, sowie Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäure^polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren,
b. ein erster (rechter) Oligonukleotidprimer P1 .1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 umfasst, wobei zumindest 3 '-Segment von P1 .1 .1 an einen Abschnitt von M1 (im Wesentlichen) sequenzspezifisch binden kann und der Sequenzabschnitt P1 .1 .2 nicht an M1 binden kann, und
wobei P1 .1 (insbesondere im Abschnitt P1 .1 .2) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass P1 .1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizen-'abhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und
c. ein zweiter (linker) Oligonukleotidprimer P2.1 , welcher zumindest ein 3'-Segment umfasst, welches (im Wesentlichen) identisch mit einer in 5‘ der Bindungsstelle von P1 .1 . gelegenen Sequenzsegment von M1 (im Wesentlichen) identisch ist, oder eine Bindungsstelle die revers komplementäre Sequenz auf dem Gegenstrang von M1 oder dem Verlängerungsprodukt von P1 .1 [auch als P1 .1-Ext, als P1 .1 E1 bezeichnet] binden kann; d. ein Controller-Oligonukleotid C1 .2, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte C1 .2.3, C1 .2.2 und C1 .2.1 in unmittelbarer Folge umfasst:
i. einen dritten Bereich (C1 .2.3) des Controller-Oligonukleotids, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des bei einer Amplifikationsreaktion gebildeten Verlängerungsprodukts des ersten Primers (P1 1 -Ext) im Wesentlichen komplementär ist, mit anderen Worten der dritte Bereich identisch zu einem Abschnitt von M1 ist, welcher bezüglich der Polarität des abgelesenen Stranges in 5‘ der Bindungsstelle des ersten Primers liegt [und bei Initiation der Polymerase von P1 .1 zuerst abgelesen wird, der dritte Bereich des Controllers also zumindest an einen Teil des an das Polymerisationsprodukts des ersten Primers [P1 .1 -Ext] binden kann,
ii. einen zweiten Bereich (C1 .2.2) des Controller-Oligonukleotids, der zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) im Wesentlichen komplementär ist (und identisch zumindest zu einem Teil derzur Bindungsstelle des ersten Primers auf der Zielsequenz M 1 ) ist und
iii. einen ersten Bereich (C1 .2.1 ) des Controller-Oligonukleotids, der an den Sequenzabschnitt P1 .1 .2 des ersten Primers bzw. den 5‘ terminalen Bereich des bei einer Amplifikationsreaktion gebildeten Verlängerungsprodukts des ersten Primers (P1 .1 -Ext) binden kann, und
wobei C1 .2 zumindest in C1 .2.1 C1 .2.3 modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass C1 .2.1 nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; die Probe mit oben genannten Komponenten unter Bedingungen inkubiert wird, welche eine erste Amplifikation zulassen, wobei Amplifikationsprodukte umfassend Primer-Verlängerungsprodukte des ersten Oligonukleotidprimers (P1 .1 -Ext) und des zweiten Oligonukleotidprimers (P2.1-Ext) gebildet werden, welche die Zielsequenz M oder zumindest ihre Anteile und entsprechende komplementäre Sequenzen umfassen; und wobei die Probe nachfolgend oder gleichzeitig in einem zweiten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
e. ein dritter (rechter) Oligonukleotidprimer P3.1 , welcher am 3’ Terminus einen
Sequenzabschnitt 3.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 3.1 .1 besteht], der (revers) komplementär an das im ersten Amplifikationsschritt gebildete Amplifikationsprodukt binden kann, mit anderen Worten: der sequenzspezifisch den 3‘ terminalen Bereich des bei der ersten Amplifikationsreaktion gebildeten Verlängerungsprodukts des zweiten Primers binden kann,
f. ein vierter (linker) Oligonukleotidprimer P4.1 , welcher am 3’ Terminus einen
Sequenzabschnitt 4.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 4.1 .1 besteht], der (revers) komplementär an das im ersten Amplifikationsschritt gebildete Amplifikationsprodukt binden kann, mit anderen Worten: der sequenzspezifisch den 3‘ terminalen Bereich des bei der ersten Amplifikationsreaktion gebildeten Verlängerungsprodukts des ersten Primers binden kann,
g. eine zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-
Polymerase, sowie ggf. Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäure-polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren.
Die Probe wird mit oben genannten Komponenten unter Bedingungen inkubiert, welche eine zweite Amplifikation zulassen, wobei Amplifikationsprodukte umfassend Primer-Verlängerungsprodukte des dritten Oligonukleotidprimers (P3.1-Ext) und des vierten Oligonukleotidprimers (P4.1 -Ext) gebildet werden, welche die Zielsequenz M oder zumindest ihre Anteile und entsprechende komplementäre Sequenzen umfassen.
Die Erfindung ist allerdings nicht zwangsläufig auf die in Fig. 50 bis 56 dargestellten Topologien beschränkt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Kit umfassend die folgenden Komponenten:
a. ein erster (rechter) Oligonukleotidprimer P1 .1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge zwei Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 umfasst, wobei i. P1 .1 .1 ein beliebiger Sequenzabschnitt ist, welcher zu einer zu amplifizierenden Sequenz [M1 .1 ] komplementär [hybridisierend] ist und ii. der Sequenzabschnitt P1 .1 .2 nicht an die zu amplifizierende Sequenz [oder eine in Bezug auf die zu amplifizierende Sequenz in 3‘ unmittelbar anschließende Sequenz] binden kann, und
iii. wobei P1 .1 .2 modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass P1 .1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität einer matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und
b. ein zweiter (linker) Oligonukleotidprimer P2.1 , welcher sequenzspezifisch eine Sequenz auf dem Gegenstrang der vom ersten Oligonucleotidprimer gebundenen Sequenz binden kann;
c. ein Controller-Oligonukleotid C1 .2, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte C1 .2.3, C1 .2.2 und C1 .2.1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei i. C1 .2.3 identisch zu einem Abschnitt M1 .2 der zu amplifizierenden Sequenz [M1 ] ist, welcher in 5‘ der Bindungsstelle von P1 .1 .1 [von M1 .1 ] liegt [und bei Initiation der Polymerase von P1 .1 zuerst abgelesen wird, C1 .2.3 also an das Polymerisationsprodukt des Primers P1 1-Ext binden kann], ii. C1 .2.2 komplementär zu P1 .1 .1 (und identisch zu M1 .1 ) ist und iii. C1 .2.1 komplementär zu P1 .1 .2 ist,
und wobei C1 .2 in C1 .2.1 modifizierte Nukleotid bausteine umfasst, so dass C1 .2.1 nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann;
d. eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase, sowie optional Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren wie Mg-Salze;
e. ein dritter (rechter) Oligonukleotidprimer P3.1 , welcher vom ersten Oligonukleotidprimer P1 .1 verschieden ist, insbesondere nicht dessen Abschnitt P1 .1 .2 aufweist, und welcher am 3’ Terminus einen Sequenzabschnitt 3.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 3.1 .1 besteht], der (revers) komplementär zu [Abschnitt M1 .1 ] der Zielsequenz [M1 ] ist;
f. ein vierter (linker) Oligonukleotidprimer P4.1 , welcher am 3’ Terminus einen Sequenzabschnitt 4.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 4.1 .1 besteht], der sequenzspezifisch eine Sequenz auf dem Gegenstrang der vom dritten Oligonucleotidprimer gebundenen Sequenz binden kann;
g. eine zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA- Polymerase, sowie ggf. Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, wobei eine Probe, die ein eine erste Zielsequenz M1 umfassende Nukleinsäure enthält, die in 5‘-3‘- Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte M1 .5, M1 .4, M1 .3, M1 .2 und M1 .1 umfasst, in einem ersten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA- Polymerase, sowie Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase, ein erster (rechter) Oligonukleotidprimer P1 .1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 umfasst, wobei P1 .1 .1 eine zu M1 .1 komplementäre [hybridisierende] Sequenz aufweist und der Sequenzabschnitt P1 .1 .2 nicht an M1 binden kann, und
wobei P1 .1 (insbesondere im Abschnitt P1 .1 .2) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass P1 .1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und
ein zweiter (linker) Oligonukleotidprimer P2.1 , welcher (im Wesentlichen) identisch mit M1 .5 ist;
ein Controller-Oligonukleotid C1 .2, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte C1 .2.3, C1 .2.2 und C1 .2.1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C1 .2.3 identisch zu einem Abschnitt M1 .2 von M1 ist, welcher in 5‘-Richtung von M1 .1 liegt, C1 .2.2 komplementär zu P1 .1 .1 (und identisch zu M1 .1 ) ist und C1 .2.1 komplementär zu P1 .1 .2 ist,
und wobei C1 .2 in C1 .2.1 modifizierte Nukleotid bausteine umfasst, so dass C1 .2.1 nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann,
und wobei die Probe weiterhin mit einem ersten Sonden-Oligonukleotid in Kontakt gebracht wird, welches:
a. einen Sequenzabschnitt umfasst, welcher
i. mit einer auf den Sequenzabschnitten M1 .2, M1 .3 und M1 .4 gelegenen Sequenz von M1 identisch oder
ii. zu einer auf den Sequenzabschnitten M1 .3 und M1 .4 gelegenen Sequenz von M1 komplementär ist,
b. an einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist, der
i. mit einem zweiten an das erste Sonden-Oligonukleotid ein Donor-Quencher-Paar oder ein FRET-Paar bildet oder ii. mit einem in hinreichender Nähe an die Bindungsstelle des ersten Sonden- Oligonukleotids bindungsfähigen zweiten Sonden-Oligonukleotids verbundenen Fluoreszenzfarbstoff ein Donor-Quencher-Paar oder ein FRET-Paar bildet.
Weiterhin kann ein Aspekt der Erfindung als Verfahren formuliert werden, welches die folgenden Schritte umfasst:
A) Bereitstellung eines Nukleinsäurefragmentes umfassend eine (erste Zielsequenz), im Weiteren auch als Start-Nukleinsäurekette bezeichnet.
B) Bereitstellung eines ersten Amplifikations-Systems, umfassend ein erstes Primer- Oligonukleotid, ein zweites Primer-Oligonukleotid, ein Controller-Oligonukleotid, eine erste DNA- Polymerase sowie Substrate für erste Polymerase (dNTPs) und eine geeignete Puffer-Lösung
C) Bereitstellung eines zweiten Amplifikations-Systems, umfassend ein drittes Primer- Oligonukleotid, ein viertes Primer-Oligonukleotid, eine zweite, thermostabile Polymerase und Substrate für zweite Polymerase (dNTPs) und geeigneten Puffer-Lösung.
Optional wird weiterhin ein Detektions-System bereitgestellt, insoweit der Gegenstand der Erfindung auch die Detektion durch das erste und/oder das zweite Amplifikationssystem amplifizierter Nukleinsäurefragmente insbesondere mit Sonden umfasst.
D) Durchführung einer ersten Amplifikation unter Verwendung der Start-Nukleinsäurekette als initialem Matrizenstrang und des ersten Amplifikationssystems, unter Erhalt eines ersten Amplifikations-Fragmentes 1 .1 , umfassend die erste Zielsequenz, und umfassend ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt und ein zweites Primer-Verlängerungsprodukt, welche einen komplementären Doppelstrang bilden können, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt aus der matrizenabhängigen Verlängerung eines ersten Primers mittels Polymerase unter Verwendung der Start-Nukleinsäurekette und / oder des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize resultiert und das das zweite Primer-Verlängerungsprodukt aus der matrizenabhängigen Verlängerung eines zweiten Primers mittels Polymerase unter Verwendung des ersten Primer- Verlängerungsproduktes als Matrize resultiert, wobei das erste und das zweite Primer- Verlängerungsprodukt gegenseitig als Matrizen für die jeweilige Primer-Verlängerung dienen können und wobei beide komplementären Stränge des ersten Amplifikations-Produktes 1 .1 unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotides zumindest teilweise in einzelsträngige Form überführt werden können, so dass eine erneute Primer-Bindung an jeweils komplementäre Segmente der synthetisierten Primer-Verlängerungsprodutke möglich ist.
Die verwendeten Reaktionsbedingen der ersten Amplifikation umfassen mindestens einen Temperatur-Schritt, welcher Hybridisierung und matrizenabhängige Primer- Verlängerung von beiden Primern des ersten Amplifikations-Systems zuläßt und mindestens einen Temperatur- Schritt, bei welchem das erste Primer-Verlängerungsprodukt vom zweiten Primer- Verlängerungsprodukt unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotides getrennt wird. Die verwendeten Reaktionsbedingungen lassen keine spontante Trennung des ersten Primer- Verlängerungsproduktes vom zweiten Primer-Verlängerungsprodukt in Abwesenheit des Controller-Oligonukleotides zu. Die erste Amplifikation wird so lange durchgeführt, bis die gewünschte Menge des ersten Amplifikationsproduktes 1 .1 synthetisiert ist.
E) Durchführung einer zweiten Amplifikation unter Verwendung mindestens eines der beiden Stränge des ersten Amplifikations-Fragmentes 1 .1 als initialer Matrizenstrang und unter Verwendung des zweiten Amplifikations-Systems unter Erhalt eines zweiten Amplifikations- Fragmentes 2.1 , umfassend ein drittes Primer-Verlängerungsprodukt und ein viertes Primer- Verlängerungsprodukt, welche einen komplementären Doppelstrang bilden können, wobei beide Stränge des Amplifikations-Fragmenten 2.1 gegenseitig als Matrizen bei der Primer- Verlängerung dienen können, wobei die verwendeten Reaktionsbedingungen der zweiten Amplifikation mindestens in einem Temperatur-Schritt eine Hybridisierung der beiden Primer des zweiten Amplifikations-Systems und eine matrizenabhängige Primer-Verlängerung des jeweils an komplementäre Bereiche gebundenen Primers des zweiten Amplifikations-Systems zulassen und mindestens in einem weiteren Temperatur-Schritt eine Trennung eines Doppelstranges zulassen, umfassend ein drittes Primer-Verlängerungsprodukt und ein viertes Primer-Verlängerungsprodukt, wobei das dritte und das vierte Primer-Verlängerungsprodukte in einzelstränige Form überführt werden, so dass eine erneute Primer-Bindung und Verlängerungs stattfinden kann. Die zweite Amplifikation wird so lange durchgeführt, bis die gewünschte Menge des zweiten Amplifikationsproduktes 2.1 synthetisiert wird.
Im Einzelnen bestimmen die Eigenschaften der Komponenten des jeweiligen Amplifikations- Systems, des Nukeinsäurefragmentes umfassend eine erste Zielsequenz, sowie verwendeten Reaktionsbedinungen den Verlauf der beiden Amplifikations-Reaktionen.
Im Allgemeinen erfolgt die erste Amplifikation unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotides. Dabei erfolgt die Trennung der beiden synthetisierten Primer- Verlängerungsprodukte zumindest teilweise in Abhängigkeit von der Sequenz des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und seiner Komplementarität zur Sequenz des Controller-Oligonukleotides.
Während der zweiten Amplifikation wird ein zweites Amplifikations-Fragment im Wesentlichen ohne Mitwirkung des Controller-Oligonukleotids amplifiziert.
Im Verlauf von beiden Amplifikations-Reaktionen können sowohl gewünschte Amplifikations- Produkte (Amplifikations-Fragment 1 .1 und Amplifikations-Fragment 2.1 ) gebildet werden, als auch ihre Zwischenstufen (Zwischenprodukte). Die Zusammensetzung der Zwischenprodukte hängt im Wesentlichen von den bereitgestellten Komponenten des ersten und des zweiten Amplifikations- Systems ab.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt schematisch die Komponenten bestimmter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens in einem heterogenen Format; A) des ersten Amplifikationssystems; B) des zweiten Amplifikationssystems. Fig. 2 zeigt schematisch die Komponenten bestimmter Ausführungsformen des ersten
Amplifikationssystems;
Fig. 3 zeigt ein Temperaturprofil bestimmter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens im heterogenen Format; Ein Aliquot wird übertragen nach Amplifikation 1 .1 in Amplifikation 2.1 . Das resultiert in einer Verdünnung von den ersten Amplifikations-Fragmenten.
Fig. 4 zeigt ein Temperaturprofil bestimmter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens im heterogenen Format; Es werden Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems zugegeben. Es erfolgt keine wesentliche Verdünnung von durch A-1.1 erzeugten Fragmenten.
Fig. 5 zeigt die Komponenten bestimmter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens in einem homgenen Format; A) des ersten Amplifikationssystems; B) des zweiten Amplifikationssystems.
Fig. 6 bis 1 1 zeigt Temperaturprofile von Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens;
Fig. 12 zeigt schematisch (A) die Struktur eines ersten Primer-Oligonukleotids; (B) die komplementäre Bindung des ersten Primers an die zu amplifizierende Nukleinsäurekette; (C) die komplementäre Bindung des ersten Primers an die zu amplifizierende Nukleinsäurekette und die Verlängerung des Primers.
Fig. 13 zeigt schematisch (A) die Relation zwischen den einzelnen Komponenten während der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsprodukts; (B) die Synthese des ersten Primer- Verlängerungsprodukts; 1 = zu amplifizierende Nukleinsäure in der ersten Amplifikation; 2 = Controller-Oligonukleotid; 3 = das erste Primer-Oligonukleotid; 4 = das Verlängerungsprodukt des ersten Primer-Oligonukleotids.
Fig. 14 zeigt schematisch die Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts;
Bezugszeichen 1 -4 wie Fig. 13; 5 = das zweite Primer-Oligonukleotid; 6 = das Verlängerungsprodukt des zweiten Primer-Oligonukleotids.
Fig. 15 zeigt schematisch die Synthese des dritten und vierten Primer-Verlängerungsprodukts; P3.1 -Ext-Teil 1 = Verlängerungsprodukt des P3.1 synthetisiert am P2.1-Ext als Matrize (Zwischenprodukt); P4.1 -Ext-Teil 1 = Verlängerungsprodukt des P4.1 synthetisiert am P1.1 -Ext als Matrize (Zwischenprodukt); P3.1 -Ext = Verlängerungsprodukt des P3.1 synthetisiert unter Verwendung von P4.1-Ext-Teil 1 oder am P4.1 -Ext als Matrize; P4.1-Ext = Verlängerungsprodukt des P4.1 synthetisiert unter Verwendung von P3.1 -Ext-Teil 1 oder am P3.1 -Ext als Matrize
Fig. 16 zeigt schematisch die Synthese des partiellen dritten Primer-Verlängerungsproduktes (P3.1-Ext-Teil 1 ); 7 = Segment von P3.1 komplementär zum Verlängerungsprodukt des zweiten Primers (P2.1 -Ext); 8 = Segment von P3.1 nicht komplementär zum Verlängerungsprodukt des zweiten Primers (P2.1 -Ext) P3.1-Ext-Teil 1 = Verlängerungsprodukt des dritten Primers (P3.1 ) synthetisiert unter Verwendung von P2.1 -Ext als Matrize. Fig. 17 zeigt schematisch die Synthese des vollständigen vierten Primer-Verlängerungsprodukts; P2.1 -Ext = Segmente 5 und 6; P3.1-Ext-Teil 1 = Verlängerungsprodukt des P3.1 synthetisiert am P2.1 -Ext als Matrize; P4.1 = vierter Primer; 9 = Segment des P4.1 , welches komplementär an P3.1 - Ext-T eil1 komplementär binden kann; 10 = Segment des P4.1 , welches nicht komplementär an P3.1 .-Ext-Teil 1 binden kann; P4.1 -Ext = Verlängerungsprodukt des P4.1 synthetisiert am P3.1 - Ext-teil 1 als Matrize
Fig. 18 zeigt schematisch die Synthese (A) eines Zwischenproduktes (P3.1 -Ext Teil 1 ) des dritten Primer-Verlängerungsprodukts unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsprodutkes (P2.1-Ext); (B) des vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukts (P3.1 -Ext) unter Verwendung von P4.1 -Ext als Matrize; P4.1 -Ext = Verlängerungsprodukt des P4.1 synthetisiert am P3.1 -Ext-teil 1 als Matrize; P3.1-Ext = Verlängerungsprodukt des P3.1 synthetisiert am P4.1 - Ext als Matrize
Fig. 19 bis 26 zeigen schematisch die Relationen zwischen den einzelnen Komponenten während der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsprodukts und des dritten PCR-Primers; 1 = P2.1- Extension in der ersten Amplifikation; 2 = Controller-Oligonukleotid; 3 = das erste Primer- Oligonukleotid; 4 = Primer 3.1
Fig. 27 bis 31 zeigen schematisch die Komponenten verschiedener Ausführungsformen des ersten Amplifikationssystems; (A) Komponenten des ersten Amplifikations-Systems; (B) Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems. Fig. 27 - 29: der vierte Primer ist mit dem zweiten Primer identisch, der dritte-Primer unterscheidet sich vom ersten Primer. Seine Bindung ist ggf. verschoben bezogen auf den ersten Primer. Fig. 30: der vierte Primer unterscheidet sich vom zweiten Primer. 3'-Ende des vierten Primers ist ggf. verschoben in Bezug auf 3'-Ende des zweiten Primers. Der vierte Primer umfasst kopierbare Sequenz-Segmente, welche nicht komplementär zur Zielsequenz sind, bzw. nicht an P1 .1-Ext binden. Fig. 31 : Der dritte Primer umfasst kopierbare Sequenz-Segmente, welche nicht komplementär zur Zielsequenz sind, bzw. nicht an P2.1-Ext binden.
Fig. 32 zeigt schematisch (A) ein erstes Primer-Oligonukleotid und (B) eine zu amplifizierende Nukleinsäure (P1 1 -Ext und P2.1 -Ext);
Fig. 33 zeigt schematisch die Strangverdrängung durch ein Controller-Oligonukleotid;
Fig. 34 zeigt schematisch die Interaktionen zwischen Komponenten in einer Reaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens; Der Zwischenschritt der Trennung des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes aus dem Komplex mit dem Doppelstrang bestehend aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt und Controller-Oligonukleotid ist erkennbar.
Fig. 35 zeigt schematisch eine Amplifikation durch gleichzeitige Synthese zweier Stränge und Trennung der synthetisierten Amplifikations-Fragmente;
Fig. 36 bis 49 zeigen die Ergebnisse von Beispielversuchen. Fig. 50 u.51 zeigen schematisch bestimmte Ausführungsformen der Vorbereitung einer Start- Nukleinsäurekette ausgehend von genomischer DNA.
Fig. 52 bis 54 zeigen schematisch bestimmte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Ampifikation.
Fig. 55 bis 57 zeigen schematisch bestimmte Ausführungsformen der Topographie der Komponenten des ersten Amplifikations-Systems und des zweiten Amplifikations-Systems.
Fig. 58 bis 59 zeigen schematisch bestimmte Ausführungsformen der möglichen Lokalisationsbereiche für Oligonukleotid-Sonden:
Fig. 60 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen der Lokalisation von Sonden- Segmenten, welche vorwiegend komplementär an das dritte (und ggf. das erste) Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext und P1 .1-Ext) binden können.
Fig. 61 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen der Lokalisation von Sonden- Segmenten, welche vorwiegend komplementär an das vierte (und ggf. das zweite) Primer- Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext und P2.1-Ext) binden können.
Fig. 62 - 67 zeigen schematisch bestimmte Ausführungsformen von Sonden.
Fig. 68 - 71 zeigen schematisch bestimmte Ausführungsformen der Lokalisation einer Zielsequenz 1 - 3 in der Start-Nukleinsäure 1.1 , einem Amplifikations-Fragment 1.1 (P1 .1-Ext und P2.1 -Ext), sowie dem zweiten Amplifikationsfragment 2.1 (P3.1-Ext und P4.1 -Ext).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die eingangs erwähnten Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden insbesondere durch Kombination von zwei hintereinander ausgeführten Amplifikationen gelöst, wobei eine PCR- Amplifikation den abschließenden Schritt darstellt.
Andere der Erfindung zugrunde liegende Aufgaben werden durch die Verwendung des nachfolgend in bestimmten Aspekten und Ausführungsformen beschriebenen Sondensystems gelöst.
Nachfolgend werden einige molekulare Vorgänge und dabei resultierende Produkte und deren potenzielle Zwischenstufen exemplarisch und schematisch erläutert.
Gemäß einem Aspekt 1 der Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifikation zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte:
1 ) eine erste Amplifikation mit den Schritten
1.A) Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids an das 3'-Segment eines als Matrize dienenden Nukleinsäurefragments (Matrizenstrang, Start-Nukleinsäurekette) einer ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure, welche eine Zielsequenz umfasst, wobei das erste Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst: - einen ersten Bereich, der sequenzspezifisch an das 3' -Segment eines Matrizenstranges der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure binden kann und komplementär zumindest zu einem Teil der Zielsequenz ist;
- einen zweiten Bereich, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und von einer für die ersten Amplifikation verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt;
1.B) Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids, wenn es hybridisiert an ein komplementäres Segment der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure vorliegt, durch die erste matrizenabhängige Polymerase unter Erhalt eines ersten Primer- Verlängerungsproduktes, welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid einen von der Polymerase synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum Matrizenstrang der Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt und der Matrizenstrang der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure unter den verwendeten Reaktionsbedingungen der ersten Amplifikation im Wesentlichen als Doppelstrang vorliegen;
1.C) Bindung eines Controller-Oligonukleotids an das erste Primer-Verlängerungsprodukt, wobei das Controller-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich des ersten Primers und / oder des ersten Primer-Verlängerungsprodukts binden kann;
• einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids und / oder des ersten Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär oder vollständig komplementär ist, und
• einen dritten Bereich, der zumindest zum Teil zu dem von der Polymerase synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts im Wesentlichen komplementär oder vollständig komplementär ist;
wobei das Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids dient, und
das Controller-Oligonukleotid ein Sequenzsegment umfasst, welches zu einem Strang des Matrizenstrangs (der Zielsequenz) identisch oder im Wesentlichen identisch ist, und
das Controller-Oligonukleotid an den ersten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts bindet und
das Controller-Oligonukleotid an den zweiten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodutkes, sowie zumindest teilweise an den synthetisierten Bereich des ersten Primer- Verlängerungsproduktes unter Verdrängung von komplementären Anteilen des Matrizenstrangs der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure bindet; wobei der von Polymerase synthetisierte Bereich des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welcher das zum zweiten Primer- Oligonukleotid komplementäres Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes umfasst, unter den Reaktionsbedingungen einzelsträngig wird;
1 .D) Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids an das einzelsträngige komplementäre Segment des ersten Primer-Verlängerungsprodukts, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid einen Bereich umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts hybridisieren kann und mindestens einen Anteil einer Zielsequenz umfasst;
1.E) Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids durch die erste Polymerase unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize unter Erhalt eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes, welches neben dem zweiten Primer- Oligonukleotid einen von Polymerase synthetisierten Bereich umfasst, der zumindest einen Anteil der ersten Zielsequenz umfasst, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt und das zweite Primerverlängerungsprodukt unter Reaktionsbedingungen der ersten Amplifikation ein erstes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt bilden, und
1.F) ggf. Wiederholung, auch mehrfache Wiederholung, der Schritte der ersten Amplifikation.
2) eine zweite Amplifikation mit den Schritten (Fig. 15):
2.A) Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids an das zweite Primer- Verlängerungsprodukt des ersten Amplifikationsprodukts, wobei das dritte Primer- Oligonukleotid einen ersten Bereich umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an ein Segment des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts binden kann;
2.B) Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids durch eine zweite Polymerase unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsprodutks als Matrize unter Erhalt eines dritten Primer-Verlängerungsprodukts (P3.1 -Ext Teil 1 ), welches neben dem dritten Primer- Oligonukleotid einen von der Polymerase synthetisierten Bereich umfasst, der ein Sequenzsegment umfasst, welches im Wesentlichen komplementär zum zweiten Primer- Verlängerungsprodukt bzw. zur zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zu einem Anteil der Zielsequenz ist, wobei das zweite Primer-Verlängerungsprodukt und das dritte Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext Teil 1 ) als Doppelstrang vorliegen;
2.C) Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids an das erste Primer- Verlängerungsprodukts des ersten Amplifikationsprodukts, wobei das vierte Primer- Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an den von Polymerase synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts binden kann;
2.D) Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids durch die zweite Polymerase unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize unter Erhalt eines vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1 -Ext Teil 1 ), welches neben dem vierten Primer-Oligonukleotid einen von Polymerase synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Primer-Verlängerungsprodukt ist und Anteile der Zielsequenz umfasst, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt und das vierte Primer- Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext Teil 1 ) als Doppelstrang vorliegen;
2.E) Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext Teil 1 ) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext Teil 1 );
2.F) Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids an das vierte Primer-
Verlängerungsprodukt (erhalten im Schritt 2.D, P4.1 -Ext Teil 1 ), wobei das dritte Primer- Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an ein Segment des vierten Primer-Verlängerungsprodukts (P4.1-Ext Teil 1 ) binden kann; 2.G) Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids durch eine zweite Polymerase unter Verwendung des vierten Primer-Verlängerungsprodutkes (P4.1-Ext Teil 1 ) als Matrize unter Erhalt eines vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext), wobei das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext) und das vierte Primer-
Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext Teil 1 ) als Doppelstrang vorliegen;
2.H) Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids an das dritte Primer-
Verlängerungsprodukts (erhalten im Schritt 2B, P3.1 -Ext Teil 1 ), wobei das vierte Primer- Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an den von Polymerase synthetisierten Bereich des dritten Primer-Verlängerungsprodukts binden kann;
2.I) Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids durch die zweite Polymerase unter Verwendung des dritten Primer-Verlängerungsproduktes (P3.1-Ext Teil 1 ) als Matrize unter Erhalt eines vollständigen vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1 -Ext), wobei das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext Teil 1 ) und das vierte Primer- Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) als Doppelstrang vorliegen;
2.J) Trennung des Doppelstrangs aus dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext Teil 1 ) und dem vollständigen vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) und des Doppelstrangs aus dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext Teil 1 ) und dem vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext);
2.K) Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids an das vollständige vierte Primer- Verlängerungsprodukt (erhalten im Schritt 2I, P4.1 -Ext), wobei das dritte Primer- Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an ein Segment des vierten Primer-Verlängerungsprodukts (P4.1-Ext) binden kann;
2.L) Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids durch eine zweite Polymerase unter Verwendung des vollständigen vierten Primer-Verlängerungsprodutkes (P4.1 -Ext) als Matrize unter Erhalt eines vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukts (P3.1 -Ext), wobei das vollständige dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) und das vollständige vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) als Doppelstrang vorliegen; 2.M) Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids an das vollständige dritte Primer- Verlängerungsprodukt (erhalten im Schritt 2G, P3.1 -Ext ), wobei das vierte Primer- Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an den von Polymerase synthetisierten Bereich des vollständigen dritten Primer- Verlängerungsprodukts binden kann;
2.N) Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids durch die zweite Polymerase unter Verwendung des vollständigen dritten Primer-Verlängerungsproduktes (P3.1-Ext ) als Matrize unter Erhalt eines vollständigen vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1- Ext), wobei das vollständige dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext ) und das vollständige vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) als Doppelstrang vorliegen; 2.0) Trennung der in Schritt 2.L und 2.N gebildeten Doppelstränge aus dem vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext) und dem vollständigen vierten Primer- Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext)
2.P) ggf. Wiederholung der Schritte der zweiten Amplifikation unter Vermehrung des vollständigen dritten Primer-Verlängerungsproduktes (P3.1-Ext) und des vollständigen vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1-Ext), optional mehrfache Wiederholung.
In Aspekten und Ausführungsformen, welche die Detektion der erhaltenen Amplifikationsprodukte, insbesondere mit Sonden, betreffen, kann vorgesehen sein, der Reaktionsmischung ein Detektionssystem zuzugeben.
Alternativ kann dieser Aspekt der Erfindung auch als ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure (Fig.1 , 5), formuliert werden:
1 ) Durchführung einer ersten Amplifikation zur Vermehrung von ersten Amplifikations-Fragmenten 1.1 umfassend eine Zielsequenz, wobei die erste Amplifikation die folgenden Schritte umfasst: a) Hybridisierung eines ersten Primer-Oligonukleotids an das 3'-Segment eines Stranges einer zur amplifizierenden Nukleinsäurekette, wobei die zu amplifizierende Nukleinsäurekette eine Zielsequenz umfasst,
wobei das erste Primer-Oligonukleotid die folgenden Bereiche umfasst:
• einen ersten Primer-Bereich im 3 '-Segment des ersten Primer-Oligonukleotides, der an einen Strang einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette sequenzspezifisch binden kann
• Einen zweiten Bereich, gekoppelt direkt oder via einen Linker an das 5'-Ende des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, welcher einen Polynukleotid- Schwanz umfasst, welcher zur Bindung eines Controller-Oligonukleotids und Unterstützung der Strangverdrängung (Schritt c) durch Controller-Oligonukleotids geeignet ist, wobei der Polynukleotid-Schwanz von Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedinungen im Wesentlichen unkopiert bleibt. b) Extension des ersten Primer-Oligonukleotids mit Hilfe einer Polymerase zur Bildung eines ersten Primer-Verlängerungsproduktes, das eine zur Zielsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette (a) komplementären Sequenz umfasst,
c) Bindung des Controller-Oligonukleotides an den Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten verlängerten Primer-Oligonukleotids, wobei das Controller-Oligonukleotid die folgenden Bereiche umfasst:
• einen ersten einzelsträngigen Bereich, welcher an den Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides binden kann
• einen zweiten einzelsträngigen Bereich, welcher zum ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides im Wesentlichen komplementär ist und an diesen binden kann
• einen dritten einzelsträngigen Bereich, welcher zumindest zu einem Segment des von der Polymerase synthetisierten Verlängerungsproduktes des ersten Primer- Verlängerungsprodukt im Wesentlichen komplementär ist,
wobei das Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotid dient,
d) Bindung des Controller-Oligonukleotides an den ersten Primer-Bereich des ersten verlängerten Primer-Oligonukleotids, unter Verdrängung des zu diesem ersten Primer-Bereich komplementären Stranges der zur amplifizierenden Nukleinsäurekette
e) Bindung des Controller-Oligonukleotides an das komplementäre Segment des Verlängerungsproduktes des ersten verlängerten Primer-Oligonukleotids, unter Verdrängung des zu diesem Verlängerungsprodukt komplementären Stranges der zur amplifizierenden Nukleinsäurekette, wobei das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes einzelsträngig wird,
f) Hybridisierung eines zweiten Oligonukleotid-Primers an das erste Primer- Verlängerungsprodukt, wobei das 3'-Segment des zweiten Oligonukleotid-Primers eine Sequenz umfasst, die an das erste Primer-Verlängerungsprodukt hybridisieren kann, und
g) Verlängerung des zweiten Oligonukleotid-Primers mit Polymerase zur Bildung eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes, wobei die Verlängerung bis einschließlich des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids erfolgt und dieser erste Primer-Bereich von der Polymerase kopiert wird, wobei der Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs unkopiert bleibt, h) Wiederholung der Schritte a)-g), bis das gewünschte Ausmaß der Amplifikation erreicht ist.
2) Durchführung einer zweiten Amplifikation, welche unter Verwendung von, in der ersten Amplifikationsreaktion erhaltenen, ersten Amplifikations-Fragmenten 1 .1 als Matrizen und unter Verwendung eines dritten Primers und eines vierten Primers und einer zweiten Polymerase, sowie geeigneter Cofaktoren zur Vermehrung eines zweiten Amplifikations-Fragments 2.1 umfassend eine Zielsequenz oder zumindest eines Segments der Zielsequenz (oder ihrer komplementären Sequenz) führt, wobei
• das dritte Primer-Oligonukleotid an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt und / oder an das vierte Primer-Verlängerungsprodukt im wesentlichen sequenzspezifisch binden kann und von der zweiten Polymerase verlängert werden kann,
• das vierte Primer-Oligonukleotid an das erste Primer-Verlängerungsprodukt und / oder an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt im wesentlichen sequenzspezifisch binden kann und von der zweiten Polymerase verlängert werden kann,
und die dabei entstehenden Primer-Verlängerungsprodukte ausgehend vom dritten und vierten Primer als Matrizen für eine exponentielle Amplifikation des zweiten Amplifikations-Fragmenten 2.1 dienen können.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass die zweite Amplifikation eine PCR (Polymerase Chain Reaktion, Polymerasenkettenreaktion, auch als PCR-Amplifikation genannt) ist und unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, die eine Vermehrung von zweiten Amplifikations-Fragmenten 2.1 umfassend eine Zielsequenz zuläßt.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass zumindest die zweite Amplifikation eine PCR-Amplifikation in Anwesenheit eines Detektions-Systems erfolgt, welches eine Oligonukleotid-Sonde umfasst.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass die zweite Amplifikation eine PCR-Amplifikation ist und unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, welche mindestens einen Schritt umfassen, bei welchem Primer hybridisiert und / oder von Polymerase verlängert werden, und mindestens einen Schritt umfassen, bei welchem die entstandenen Primer-Verlängerungsprodukte in einzelsträngige Form überführt werden (denaturiert werden).
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass die zweite Amplifikation eine PCR-Amplifikation ist und solange durchgeführt wird, bis die gewünschte Menge an Amplifikations-Fragmenten 2.1 synthetisiert sind.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass das dritte Primer-Oligonukleotid der zweiten Amplifikation im 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes und / oder im 3'-Segment des vierten Primer-
Verlängerungsproduktes binden und von einer Polymerase verlängert werden kann.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass das vierte Primer-Oligonukleotid der zweiten Amplifikation im 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und / oder im 3'-Segment des dritten Primer-
Verlängerungsproduktes binden und von einer Polymerase verlängert werden kann. Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass das dritte Primer-Oligonukleotid der zweiten Amplifikation mit seinem 3'-Segment an das zweite Primer-Verlängerungsproduktes und / oder das vierte Primer-Verlängerungsproduktes binden und von einer Polymerase verlängert werden kann.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass das vierte Primer-Oligonukleotid der zweiten Amplifikation mit seinem 3'-Segment an das erste Primer-Verlängerungsproduktes und / oder das dritte Primer-Verlängerungsproduktes binden und von einer Polymerase verlängert werden kann.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass das Verlängerungsprodukt des dritten Primer-Oligonukleotid und / oder das Verlängerungsprodukt des vierten Primer-Oligonukleotid der zweiten Amplifikation zumindest ein Segment der Zielsequenz oder deren komplementäre Sequenz umfasst.
Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte, dadurch gekennzeichnet, dass der dritte einzelsträngige Bereich des Controller-Oligonukleotids zum Segment des von der Polymerase synthetisierten Verlängerungsproduktes des ersten Primer-Verlängerungsprodukts, welches sich unmittelbar an den ersten Primer-Bereich anschließt, im Wesentlichen komplementär ist.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass die Verdrängung des zu dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt komplementären Stranges der zu amplifizierenden Nukleinsäure solange erfolgt, bis dieser komplementäre Strang der zu amplifizierenden Nukleinsäure vom ersten Primer-Verlängerungsprodukt abgelöst wird.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass Schritt (f) des Verfahrens dahingehend modifiziert wird, dass es umfasst die Hybridisierung eines zweiten Oligonukleotid-Primers an das erste Primer-Verlängerungsprodukt, wobei gleichzeitig zumindest eine partielle Verdrängung des Controller-Oligonukleotides aus der Bindung mit dem ersten Verlängerungsprodukt durch Strangverdrängung erfolgt.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass Schritt (g) des Verfahrens so modifiziert wird, dass er eine Verdrängung des Controller- Oligonukleotides aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt unter Mitwirkung der Polymerase umfasst.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass Schritt (h) des Verfahrens dahingehend modifiziert wird, dass es die Bindung des Controller-Oligonukleotides an den unkopierten Polynukleotid-Schwanz des ersten verlängerten Primer-Oligonukleotids und eine Verdrängung des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts aus der Bindung an das erste Primer-Verlängerungsprodukt unter gleichzeitiger Ausbildung eines komplementären Doppelstranges mit einem Segment des ersten spezifischen Verlängerungsproduktes des ersten Primer-Oiigonukleotides umfasst. Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass die Wiederholung der Schritte unter Bedingungen durchgeführt wird, die die Wiederholung der Schritte (a) bis (g) zulassen.
Weiterhin kann ein Verfahren nach einem der oben genannten Aspekte dadurch gekennzeichnet sein, dass es die gleichzeitige Amplifikation des ersten und zweiten Primer- Verlängerungsproduktes in einer exponentiellen Reaktion unter Verwendung der ersten und zweiten Primer-Oligonukleotide und des Controller-Oligonukleotides umfasst, wobei die gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte als Matrizen für die gegenseitige Synthese fungieren.
Die Ausbeute an einzelnen Produkten und Zwischenprodukten hängt von mehreren Faktoren ab. Beispielsweise begünstigen höhere Konzentrationen einzelner Primer im Allgemeinen die Ausbeute an Produkten / Zwischenprodukten. Weiterhin kann die Bildung von Produkten / Zwischenprodukten durch die Wahl der Reaktions-Temperatur sowie der Bindung-Affinität einzelner Reaktionsteilnehmer zueinander beeinflusst werden (Affinität der Bindung einzelner Primer an ihre komplementäre Primerbindungsstellen innerhalb von Matrizensträngen): im Allgemeinen binden beispielsweise längere Oligonukleotide bei höheren Temperaturen besser als kürzere Oligonukleotide, weiterhin kann CG-Gehalt bei komplementären Sequenzsegmenten eine Rolle spielen: CG-reichere Sequenzen binden ebenfalls bei höheren Temperaturen stärker als AT- reiche Sequenzen. Weiterhin können Modifikationen, wie MGB oder 2-Amino-dA oder LNA, die Bindungsstärke von Primern an ihre respektiven komplementären Segmente erhöhen, was ebenfalls in bevorzugter Bindung von Primern bei höheren Temperaturen resultiert.
Daraus lässt sich ableiten, dass durch die Gestaltung von Sequenzsegmenten einzelner Primer- Sequenzen man Einfluss auf die Ausbeuten bestimmter Produkte / Zwischenprodukte nehmen und somit ihre Anreicherung während der Amplifikation beeinflussen kann.
Weiterhin kann das erdfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure (Fig. 1 , 5, 55 - 57), als Folge der folgenden Schritte formuliert werden:
a) eine erste Amplifikation mit den Schritten:
Bereitstellung einer Start-Nukleinsäure 1.1 , welche eine Zielsequenz umfasst
Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1 ) an eine zu amplifizierende Nukleinsäure mit einer Zielsequenz (entweder Start-Nukleinsäure 1 .1 oder P2.1- Ext), wobei das erste Primer-Oligonukleotid (P1.1 ) folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (P1.1.1 ), der sequenzspezifisch an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure (P2.1 E1 ) binden kann,
• einen zweiten Bereich (P1 .1.2) , der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und für die verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt;
Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1 ) durch eine erste Polymerase unter Erhalt eines ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1-Ext), welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid (P1.1 ) einen synthetisierten Bereich umfasst (P1.1 E1 bis P1 .1 E4), der im Wesentlichen komplementär zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer- Verlängerungsprodukt und die zu amplifizierende Nukleinsäure als Doppelstrang vorliegen;
Bindung eines Controller-Oligonukleotids (C1 .2) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1 .2) folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (C1 .2.1 ), der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1 E6) binden kann,
• einen zweiten Bereich (C1.2.2), der zum ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotids (P1.1 .1 ) komplementär ist, und
• einen dritten Bereich (C1 .2.3), der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 E4) im Wesentlichen komplementär ist; und
wobei das Controller-Oligonukleotid (C 1 .1 ) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) dient, und das Controller-Oligonukleotid (C 1.1 ) an das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 E6, P1.1 E5, P1.1 E4) unter Verdrängung des zu diesem Bereich komplementären Bereichs (P2.1 E1 , P2.1 E2) der zu amplifizierenden Nukleinsäure bindet;
Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen Bereich umfasst (P2.1 .1 ), der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer- Verlängerungsprodukts (P1.1 E1 ) binden kann,
Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids (P.2.1 ) durch die erste Polymerase unter Erhalt eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1-Ext), welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen synthetisierten Bereich (P2.1 E4 bis P2.1 E1 ) umfasst, der im Wesentlichen identisch zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext) und das zweite Primerverlängerungsprodukt (P2.1 ) ein erstes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt bilden; und
die Schritte der ersten Amplifikation werden wiederholt, bis die gewünschte Menge an ersten Amplifikationsprodukten synthetisiert wurde. b) eine zweite Amplifikation mit den Schritten:
Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das zweite Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext.), wobei das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen ersten Bereich (P3.1.1 ) umfasst, der sequenzspezifisch an einen Bereich des zweiten Primer- Verlängerungsprodukts (P2.1 E1 ) binden kann,
Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) durch eine zweite Polymerase unter Erhalt eines dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext), welches neben dem dritten Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen synthetisierten Bereich (P3.1 E5 bis P3.1 E2 bzw. P3.1 E5 bis P3.1 E1 ) umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum zweiten Primer- Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext) oder zur Zielsequenz ist, wobei das zweite Primer- Verlängerungsprodukt (P2.1 ) und das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 ) als Doppelstrang vorliegen;
Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) an das erste Primer- Verlängerungsprodukts (P1 .1-Ext) und / oder an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) wobei das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.2) einen ersten Bereich umfasst (P4.1.1 ), der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer- Verlängerungsprodukts (P1.1 E1 ) und des dritten Primerverlängerungsprodukts (P3.1 E2) binden kann,
Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) durch die zweite Polymerase unter Erhalt eines vierten Primer-Verlängerungsprodukts (P4.2-Ext), welches neben dem vierten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich (P4.1 E5 bis P4.1 E2 oder P4.1 E5 bis P4.1 E1 ) umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) oder identisch zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext) und das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) als Doppelstrang vorliegen;
Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 - Ext) und des Doppelstrangs aus dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext);
Hybridisieren des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das vierte Primer- Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) durch die zweite Polymerase; und
Hybridisieren des vierten Primer-Oligonukleotids an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext) und Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) durch die zweite Polymerase.
Weiterhin umfasst die Erfindung folgende Aspekte: Verfahren gemäß dem Aspekt 1 , bei welchem das Nukleinsäurefragment umfassend eine Zielsequenz in einzelsträngiger Form bereitgestellt wird.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das Nukleinsäurefragment umfassend eine Zielsequenz in doppelsträngiger Form bereitgestellt (umfassend ein Nukleinsäurefragment einschließlich eine erste Zielsequenz, die Start-Nukleinsäurekette, und ein dazu komplementäres Nukleinsäurefragment) und dieses doppelsträngige Nukleinsäurefragment vor der ersten Amplifikation in einzelsträngige Form überführt wird.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem die zweite Amplifikation unter Verwendung des dritten und des vierten Primers als Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) verläuft.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem die Trennung der synthetisierten Stränge während der ersten Amplifikation vorwiegend sequenzspezifisch unter Mitwirkung des Controller- Oligonukleotids erfolgt.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem die Trennung der synthetisierten Stränge während der zweiten Amplifikation unter Einwirkung einer Temperatur erfolgt, welche die Trennung der synthetisierten Stränge bewirken kann. Beispielsweise umfasst eine solche Temperatur Bereiche von 80°C bis 105°C.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem die Hybridisierung und Primer-Verlängerung während der zweiten Amplifikation unter Temperaturen erfolgt, welche eine vorwiegend komplementäre Bindung von Primern an komplementäre Sequenzsegmente der synthetisierten Stränge sowie eine Primer-Verlängerung durch die zweite Polymerase zulassen. Beispielsweise umfasst eine solche Temperatur Bereiche von 20°C bis etwa 80°C.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem vor der zweiten Amplifikation eine Trennung von während der ersten Amplifikation synthetisierten ersten und zweiten Primer-Verlängerungsprodukten erfolgt, so dass beide Primer-Verlängerungsprodukte einzelsträngig vorliegen.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das erste Primer-Oligonukleotid in seinem ersten Bereich ein Sequenzsegment umfasst, welches komplementär an die erste Zielsequenz in ihrem 3'- Segment binden kann.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das zweite Primer-Oligonukleotid in seinem 3'-Bereich ein Sequenzsegment umfasst, welches zu einem Anteil der ersten Zielsequenz im Wesentlichen identisch ist, wobei dieser Anteil im 5'-Segment der Zielsequenz liegt
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das Controller-Oligonukleotid in seinem zweiten und dritten Bereich ein Sequenzsegment umfasst, welches im Wesentlichen zu einem Anteil der Zielsequenz identisch ist.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem die erste Zielsequenz und ein zu dieser ersten Zielsequenz komplementärer Strang auf beiden Seiten vom Primerpaar umfasst sind, welches ein erstes Primer-Oligonukleotid und ein zweites Primer-Oligonukleotid umfasst. Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das dritte Primer-Oligonukleotid in seinem 3'-Bereich ein Sequenzsegment umfasst, welches an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt des ersten Amplifikations-Fragments 1.1 im Wesentlichen komplementär binden kann.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das dritte Primer-Oligonukleotid in seinem 3'-Bereich ein Sequenzsegment umfasst, welches an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt des ersten Amplifikations-Fragments 1.1 im Wesentlichen komplementär binden kann und weiterhin dieser 3'- Bereich ein zu der ersten Zielsequenz komplementäres Segment umfasst.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das vierte Primer-Oligonukleotid in seinem 3'-Bereich ein Sequenzsegment umfasst, welches an das erste Primer-Verlängerungsprodukt des ersten Amplifikations-Fragments 1.1 im Wesentlichen komplementär binden kann.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das vierte Primer-Oligonukleotid in seinem 3'-Bereich ein Sequenzsegment umfasst, welches an das erste Primer-Verlängerungsprodukt des ersten Amplifikations-Fragments 1.1 im Wesentlichen komplementär binden kann und weiterhin dieser 3'- Bereich ein Segment umfasst, welches zu einem Anteil der ersten Zielsequenz im Wesentlichen identisch ist, wobei dieser Anteil im 5'-Bereich der Zielsequenz liegt
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem die erste Zielsequenz und ein zu dieser Zielsequenz komplementärer Strang teilweise oder vollständig auf beiden Seiten vom einem durch ein drittes Primer-Oligonukleotid und ein viertes Primer-Oligonukleotid geildeten Primerpaar umfasst sind.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das erste Primer-Oligonukleotid und das dritte Primer- Oligonukleotid identisch sind.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das erste Primer-Oligonukleotid und das dritte Primer- Oligonukleotid identisch sind, wobei während der zweiten Amplifikation resultierende
Primerverlängerungsprodukte (P4.1 -Ext Teil 1 ) und (P4.1 -Ext) identisch sind.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das erste Primer-Oligonukleotid und das dritte Primer- Oligonukleotid identisch sind, sich aber das zweite und vierte Primer-Oligonukleotid unterscheiden.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das erste Primer-Oligonukleotid und das dritte Primer- Oligonukleotid identisch sind, wobei während der zweiten Amplifikation resultierende
Primerverlängerungsprodukte (P4.1-Ext Teil 1 ) und (P4.1 -Ext) identisch sind, sich aber das Primerverlängerungsprodukt des zweiten und vierten Primer-Oligonukleotids unterscheiden.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das zweite Primer-Oligonukleotid und das vierte Primer- Oligonukleotid identisch sind.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das zweite Primer-Oligonukleotid und das vierte Primer- Oligonukleotid identisch sind, wobei während der zweiten Amplifikation resultierende
Primerverlängerungsprodukte (P3.1 -Ext Teil 1 ) und (P3.1 -Ext) identisch sind.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das zweite Primer-Oligonukleotid und das vierte Primer- Oligonukleotid identisch sind, sich aber das erste und dritte Primer-Oligonukleotid unterscheiden. Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das zweite Primer-Oligonukleotid und das vierte Primer- Oligonukleotid identisch sind, wobei während der zweiten Amplifikation resultierende Primerverlängerungsprodukte (P3.1-Ext Teil 1 ) und (P3.1 -Ext) identisch sind, sich aber das Primerverlängerungsprodukt des erstenn und dritten Primer-Oligonukleotids unterscheiden.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das erste Primer-Oligonukleotid und das dritte Primer- Oligonukleotid, sowie das zweite und das vierte Primer-Oligonukleotid identisch sind.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem das erste Primer-Oligonukleotid und das dritte Primer- Oligonukleotid, sowie das zweite und das vierte Primer-Oligonukleotid identisch sind, wobei während der zweiten Amplifikation resultierende Primerverlängerungsprodukte (P4.1 -Ext Teil 1 ) und (P4.1-Ext) identisch sind und resultierende Primerverlängerungsprodukte (P3.1 -Ext Teil 1 ) und (P3.1-Ext) identisch sind.
Verfahren nach Aspekt 1 , bei welchem der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids einen Polynukleotidschwanz umfasst, welcher nicht an erste Zielsequenz bindet.
Die vorstehend in Bezug auf Aspekt 1 genannten Ausführungsformen sind miteinander kombinierbar.
Die zu amplifizierende Nukleinsäure in der ersten Amplifikation umfasst dabei eine erste Zielsequenz. Vor dem Start der ersten Amplifikation wird zumindest eine Start-Nukleinsäurekette 1.1 in die Reaktion gegeben, welche eine Zielsequenz umfasst und als Matrize für die Synthese des ersten Amplifikations-Fragmentens dienen kann.
Die synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte der ersten Amplifikation (das erste Amplifikations-Fragment 1 .1 ) umfassen die Zielsequenz. Dieses erste Amplifikations-Fragment 1 .1 kann als Start-Nukleinsäurekette 2.1 mit einer Matrizenfunktion für die zweite Amplifikation dienen.
Die in der zweiten Amplifikation synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte (P3.1-Ext und P4.1 - Ext) (das zweite Amplifikations-Fragment 2.1 ) umfassen zumindest Anteile der ersten Zielsequenz.
Der Begriff "im Wesentlichen komplementär" bedeutet im Zusammenhang der vorliegenden Offenbarung, dass zwei Nukleinsäuren, insbesondere deren zueinander komplementären Bereiche, nicht mehr als 5, 4, 3, 2, oder 1 Mismatches zueinander aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Schritte der ersten Amplifikation so oft wiederholt werden, bis das erste Amplifikations-Fragment (1.1 ) in einer Kopienzahl im Bereich von 10 bis 1 E12 vorliegt, insbesondere von 100 bis 10E9, insbesondere von 1.000 bis 10E9 (10E9=1 .000.000.000).
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Schritte der ersten Amplifikation mindestens zweimal wiederholt werden.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die zweite Amplifikation ausgehend von einer Kopie-Anzahl des ersten Amplifikations-Fragments (1.1 ) gestartet wird, welche im Bereich von 10 bis 1 E12 vorliegt, insbesondere von 100 bis 1 E10, insbesondere von 10E3 bis 10E9.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Schritte der zweiten Amplifikation so oft wiederholt werden, bis das Amplifikations-Fragment (2.1 ) in einer Kopienanzahl im Bereich von 10E5 bis 1 E16 vorliegt, insbesondere von 10E5 bis 1 E14, insbesondere von 10E6 bis 1 E14.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Schritte der zweiten Amplifikation mindestens zweimal wiederholt werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Detektions-System mindestens eine
Oligonukleotid-Sonde, welche mit einem Fluoreszenzreporter markiert ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Detektions-System mindestens eine
Oligonukleotid-Sonde, welche mit einem Fluoreszenzreporter und einem Fluoreszenzquencher markiert ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Detektions-System mindestens eine
Oligonukleotid-Sonde, welche mit einem Donorfluorophor markiert ist, welches mit dem Fluoreszenzreporter ein FRET-Paar bilden kann.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Oligonukleotid-Sonde ein zu mindestens einem der gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte (P1 .1-Ext, P2.1-Ext, P3.1 -Ext, P4.1-Ext) im Wesentlichen komplementäres Sequenzsegment, welches mindestens an eines der gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte unter geeigneten Bedingungen hybridisieren kann (Hybridisierungsbedingungen).
In einer weiteren Ausführungform ist dieses Sequenzsegment zum ersten und / oder zum dritten Primer-Verlängerungsprodukt komplementär.
In einer weiteren Ausführungform ist dieses Sequenzsegment zum ersten und / oder zum dritten Primer-Verlängerungsprodukt komplementär, wobei die Oligonukleotid-Sonde im 3'Segment des jeweiligen Primer-Verlängerungsproduktes komplementär binden kann, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid komplementär gebunden wird.
In einer weiteren Ausführungform ist dieses Sequenzsegment zum zweiten und / oder zum vierten Primer-Verlängerungsprodukt komplementär.
In einerweiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde eine Länge, welche im Bereich zwischen 10 Nukleotiden und 50, insbesondere zwischen 15 und 40, insbesondere zwischen 15 und 30 Nukleotiden liegt.
In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde keinen Sequenzbereich, welcher zum Controller-Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär ist. In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde einen Sequenzbereich, welcher zum Controller-Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär ist, wobei die Länge dieses Segments weniger als 20 Nukleotide ist, insbesondere weniger als 15 Nukleotide, insbesondere weniger als 10 Nukleotide umfasst.
In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde keinen Sequenzbereich, welcher zu einem der Primer-Oligonukleotide im Wesentlichen komplementär ist.
In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde einen Sequenzbereich, welcher zu einem der Primer-Oligonukleotide im Wesentlichen komplementär ist, wobei die Länge dieses Segments weniger als 20 Nukleotide ist, insbesondere weniger als 15 Nukleotide, insbesondere weniger als 10 Nukleotide umfasst, insbesondere weniger als 5 Nukleotide.
In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde keinen Sequenzbereich, welcher mit der Sequenz des dritten Bereichs des Controller- Oligonukleotid im Wesentlichen identisch ist.
In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde einen Sequenzbereich, welcher mit der Sequenz des dritten Bereichs des Controller- Oligonukleotid im Wesentlichen identisch ist, wobei die Länge dieses Segments weniger als 20 Nukleotide ist, insbesondere weniger als 15 Nukleotide, insbesondere weniger als 10 Nukleotide umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst das Controller-Oligonukleotid eine der folgenden Komponenten (einen Fluoreszenzreporter und / oder einen Fluoreszenzquencher und / oder einen Donorfluorophor), wobei zumindest eine dieser Komponenten im dritten Bereich des Controller- Oligonukleotides lokalisiert ist.
In einer Ausführungsform ist die Oligonukleotid-Sonde zumindest teilweise durch eine 5'-3'- Nuklease spaltbar.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Oligonukleotid-Sonde ein Sequenzsegment, welches zur Zielsequenz oder ihrem Anteil, welches von einem der Amplifikationsprodukte umfasst wird, im Wesentlichen komplementär ist, wobei die Länge dieses Segmentes im Bereich zwischen 5 und 50 Nukleotiden liegt, insbesondere zwischen 10 und 40, insbesondere zwischen 15 und 30 Nukleotiden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Oligonukleotid-Sonde kein zur Zielsequenz oder ihrem komplementären Strang im Wesentlichen komplementäres Sequenzsegment.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Oligonukleotid-Sonde ein nicht zur Zielsequenz oder ihrem komplementären Strang im Wesentlichen komplementäres Sequenzsegment. Die Bindung der Oligonukleotid-Sonde an das jeweilige komplementäre Segment des gebildeten Primer-Verlängerungsproduktes unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen führt zu Ausbildung eines Doppelstranges. Die Hybridisierungsbedingungen liegen während des Verfahrens vor.
Zu geeigneten Zeitpunkten während des Verfahrens erfolgt eine Beleuchtung der Reaktion mit Licht einer geeigneten Wellenlänge für die Generierung eines Fluoreszenzsignals und die Detektion des Fluoreszenzsignals vom Fluoreszenzreporter, wobei die Intensität des Fluoreszenzsignals gemessen wird.
Die Detektion des Fluoreszenzsignals erfolgt mit geeigneten optischen/physikalischen Mitteln, bei denen entweder die Zunahme des Fluoreszenzsignals oder die Abnahme des Fluoreszenzsignals gemessen wird. Durch geeignete Sensoren kann die Intensität des Fluoreszenzsignals umgewandet werden in Messwerte, die nach entsprechender Kalibrierung eine Bestimmung dahingehend ermöglichen, ob eine gewünschte Zielsequenz in der Reaktionsmischung vorhanden ist oder nicht.
Ein wesentlicher Aspekt des Fluoreszenz-Detektionssystems ist das Reporter-Quencher-Paar. Wenn sich der Quencher in räumlicher Nähe zum Reporter befindet, wird bei Belichtung mit dem Anregungslicht kein Signal emittiert. Wenn Reporter- und Quenchermoleküle aufgrund einer komplementären Stern-Sequenz in räumlicher Nähe gehalten werden, tritt auch bei Beleuchtung kein Fluoreszenzsignal auf. Wenn aber das Fluoreszenzsystem dahingehend verändert wird, dass die zwischen Reporter und Quencher gelegene Nukleotidsequenz mit einer Zielsequenz hybridisieren kann, werden Reporter und Quencher in eine räumliche Entfernung verbracht, die bewirkt, dass der Quencher so weit von dem Reportermolekül entfernt ist, dass das Reportermolekül dann eine Fluoreszenzstrahlung emittiert, wenn die Reaktionsmischung mit einer Anregungslichtquelle bestrahlt wird. Der Abstand zwischen Reporter und Quencher hängt von den jeweils verwendeten Molekülen ab. Üblicherweise wird die Emission von Licht nach Bestrahlung des Fluoreszenzreporters dann reduziert oder nahezu vollständig vermindert, wenn Quencher und Reporter in einer Entfernung von weniger als 25 Nukleotiden voneinander entfernt sind. Diese Entfernung kann entweder durch die Nukleotidsequenz bewirkt werden oder durch spezielle Moleküle, die den Abstand bewirken, wie Linker oder Spacer.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Fluoreszenzreporter ein spezifisches Reporter-Donor- Paar (FRET-Paar) mit einem Donor-Fluorophor bilden, welches in der Lage ist, die absorbierte Energie auf Fluoreszenzreporter durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zu übertragen.
Ein Reporter-Donor-Paar welches einen Fluoreszenzreporter und ein passendes Donor- Fluorophor umfasst und ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Paar bildet, kann so beschaffen sein, dass nur einer der Partner eines solchen FRET-Paares an der Oligonukleotid- Sonde gekoppelt ist und der andere Partner am Controller-Oligonukleotid gekoppelt ist. Sowohl Fluoreszenzreporter als auch Donor-Fluorophor sind am jeweiligen Oligonukleotid dermassen gekoppelt, dass im nicht-hybridisierten Zustand der Oligonukleotid-Sonde das Donor-Fluorophor nicht in der Lage ist, die absorbierte Energie auf den Fluoreszenzreporter zu übertragen.
In einer Ausführungsform ist das Controller-Oligonukleotid ein Bestandteil des Detektions-Systems und umfasst einen Fluoreszenzreporter und / oder einen Fluoreszenzquencher und / oder ein Donor-Fluorophor. Durch eine gleichzeitige Hybridisierung des Controller-Oligonukleotides an das synthetisierte erste oder dritte Primer-Verlängerungsprodukt und der Oligonukleotid-Sonde an das 3'-Segment desselben ersten und / oder dritten Primer-Verlängerungsproduktes erfolgt eine Bindung an benachbarten Sequenzpositionen des ersten und / oder dritten Primer- Verlängerungsproduktes, was in räumlicher Annäherung des Donor-Fluorophores und des Fuoreszenzreporters resultiert. Dadurch wird der Abstand zwischen dem Fluoreszenzreporter und Donor-Fluorophor dermaßen verringert, dass FRET von Donor-Fluorophor auf Fluoreszenzreporter erfolgen kann. Dies führt zur Generierung eines Fluoreszenzsignals des Fluoreszenzreporters und resultiert in einer erfassbaren Zunahme des Fluoreszenzsignals des Fluoreszenzreporters.
Der Abstand zwischen Donor-Fluorophor und dem Fluoreszenzreporter soll nach Hybridisierung weniger als 25, insbesondere weniger als 15 und insbesondere weniger als 5 Nukleotide darstellen. Die Wellenlänge des Lichts bei Anregung wird vom Donor-Fluorophor absorbiert und auf den Reporter übertragen, wodurch Licht emittiert wird, das detektiert werden kann. Was die Anordnung des Detektionssystems im Amplifikationsprodukt angeht, sind folgende Ausführungsformen bevorzugt, wobei entweder der Fluoreszenzreporter oder der Fluoreszenzquencher oder das Donor-Fluorophor entweder am Controller-Oligonukleotid, insbesondere im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids gekoppelt sind:
- Die Kopplung am Controller-Oligonukleotid erfolgt bevorzugt im dritten Bereich des Controller- Oligonukleotides,
- Die Kopplung am Controller -Oligonukleotid erfolgt bevorzugt am 5'-Ende oder des dritten Bereichs oder in seiner Nähe, z.B. 2 bis etwa 10 Nukleotide vom 5'-Ende des dritten Bereichs
- Kopplung an der Oligonukleotid-Sonde erfolgt bevorzugt im mittleren Bereich der Oligonukleotid-Sonde,
- Kopplung an der Oligonukleotid-Sonde erfolgt bevorzugt im 3'-Segment der Oligonukleotid- Sonde.
In der Praxis der vorliegenden Erfindung haben sich folgende Ausführungsformen als besonders vorteilhaft erwiesen:
- Der Abstand zwischen beiden Elementen eines FRET-Paares im hybridisierten Zustand von Oligonukleotiden, welche an das erste Primer-Verlängerungsprodukt hybridisiert sind, beträgt weniger als etwa 30 Nukleotide. - Die Oligonukleotid-Sonde, die ein komplementäres 3'-Segment zu einem der Primer- Verlängerungprodukte umfasst, ist dermaßen modifiziert, dass die Polymerase nicht in der Lage ist, dieses 3'-Ende zu verlängern.
- Die Oligonukleotid-Sonde, die ein komplementäres 3'-Segment zu einem der Primer- Verlängerungprodukte umfasst, so dass die Polymerase in der Lage ist, dieses 3'-Ende zu verlängern, wobei die Oligonukleotid-Sonde als ein PCR-Primer dient.
- Verfahren zur Detektion von Amplifikation, wobei zwei oder mehr Nukleinsäureketten amplifiziert werden, bei welchem für jede zu amplifizierende Nukleinsäurekette ein spezifisches Detektions-System verwendet wird.
- Verfahren zur Detektion von Amplifikation, wobei zwei oder mehr zu amplifizierende Nukleinsäureketten amplifiziert werden, bei welchem die Detektion der Amplifikation von mindestens zwei zu amplifizierenden Nukleinsäureketten durch ein einheitliches Detektions- System erfolgt.
- Die Amplifikation umfasst eine asymetrische Vermehrung eines der Primer- Verlängerungsprodukte.
- Die Anregung des Fluoreszenzreporters und die Messung des Fluoreszenzsignals des Fluoreszenzreporters erfolgt während der Amplifikation.
- Die Anregung des Donor-Fluorophores und die Messung des Fluoreszenzsignals des Fluoreszenzreporters erfolgt während der Amplifikation.
- Die Anregung des Fluoreszenzreporters und die Messung des Fluoreszenzsignals des Fluoreszenzreporters erfolgt nach der Amplifikation.
- Die Anregung des Donor-Fluorophores und die Messung des Fluoreszenzsignals des Fluoreszenzreporters erfolgt nach der Amplifikation.
- Die Oligonukleotid-Sonde ist ein DNA-Oligonukleotid.
- Die Oligonukleotid-Sonde ist ein DNA-Oligonukleotid und das 3'-Ende ist blockiert, so dass die Polymerase es nicht verlängern kann.
- Die Oligonukleotid-Sonde umfasst ein komplementäres Sequenz-Segment zum ersten und / oder zum dritten Primer-Verlängerungsprodukt, wobei dieses Sequenz-Segment eine Länge von 8 bis etwa 60 Nukleotide umfasst.
- Eine Oligonukleotid-Sonde umfasst ein komplementäres Sequenz-Segment zum 3'-Segment des ersten und / oder des dritten Primer-Verlängerungsprodukts, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, wobei dieses Segment eine Länge von 8 bis etwa 40 Nukleotide umfasst. Eine Oligonukleotid-Sonde umfasst mindestens eine weitere Modifkation, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: Linker (z.B. HEG, C3, C6), Phosphat-Zucker-Rückgrad Modifikationen (z.B. PTO, 2'-0-Me, RNA, PNA, LNA Modifikationen).
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das dritte Primer-Oligonukleotid und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid einen zweiten Bereich aufweisen, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich nicht komplementär an das erste Primer- Verlängerungsprodukt oder an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt binden kann.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der zweite Bereich des dritten und/oder vierten Primer-Oligonukleotids in 5'-Richtung vom ersten Bereich des dritten und/oder vierten Primer-Oligonukleotids liegt.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das dritte Primer-Oligonukleotid und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid eine Barcode-Sequenz umfasst.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer- Verlängerungsprodukt und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt durch thermale Denaturierung durchgeführt wird, insbesondere bei einer Temperatur im Bereich von 85 °C bis 105 °C.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die erste Polymerase zu Strang-Verdrängung während der Synthese fähig ist.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die zweite Polymerase eine thermostabile Polymerase ist.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die erste Polymerase und die zweite Polymerase identisch sind.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das erste Primer-Oligonukleotid und das dritte Primer-Oligonukleotid im Wesentlichen identisch sind.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) und das dritte Primer-Oligonukleotid (P4.2) im Wesentlichen identisch sind.
Der Begriff "im Wesentlichen identisch" bedeutet im Sinne der Erfindung insbesondere, dass zwei Nukleinsäure Sequenzen mit nicht mehr als 5, 4, 3, 2, oder 1 Mismatches zueinander aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Reaktionsbedingungen der ersten Amplifikation so gewählt werden, dass es zu keiner spontanen Dissoziation des ersten Amplifikationsproduktes kommen kann. In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die zweite Amplifikation bei mindestens zwei Temperaturen durchgeführt wird, wobei bei einer ersten Temperatur die Hybridisierung und Verlängerung des dritten und/oder vierten Primer- Oligonukleotids an das erste und/oder zweite und / oder dritte und / oder vierte Primerverlängerungsprodukt stattfindet, und bei einer zweiten Temperatur die Trennung des resultierenden Doppelstranges.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die zweite Amplifikation bei mindestens drei Temperaturen durchgeführt wird, wobei bei einer ersten Temperatur die Hybridisierung des dritten und/oder vierten Primer-Oligonukleotids an das erste und/oder zweite und/ oder dritte und/oder vierte Primerverlängerungsprodukt stattfindet, bei einer zweiten Temperatur die Verlängerung des dritten und/oder vierten Primers, und bei einer dritten Temperatur die Trennung der resultierenden Doppelstränge.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die erste Amplifikation und die zweite Amplifikation im selben Reaktionsansatz durchgeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die zweite Polymerase, das dritte Primer-Oligonukleotid und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid aktivierbar sind, und/oder das Controller-Oligonukleotid deaktivierbar ist.
Aktivierbare Polymerasen können beispielsweise reversible inaktivierte Polymerasen wie thermostabile Polymerase (Hot-Start-Polymerase) oder Polymerasen sein, welche durch einen Antikörper oder eine chemische Modifikation reversibel inaktiviert sind.
Aktivierbare Primer können reversible inaktivierte Primer sein, beispielsweise Oligonukleotide mit geschützter 3'-OH-Gruppe, wobei die Schutzgruppe insbesondere durch eine Polymerase mit 5'- Exonukleaseaktivität entfernbar ist. Hierbei wäre es vorteilhaft, in der ersten Amplifikation eine Polymerase ohne 5'-Exonukleaseaktivität zu verwenden.
Das Controller-Oligonukleotid kann beispielsweise durch eine Polymerase mit 5'- Exonukleaseaktivität inaktiviert oder gespalten werden. Alternativ kann das Controller- Oligonukleotid vor der zweiten Amplifikation auch durch andere enzymatische oder chemische Verfahren gespalten und damit entfernt werden.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die erste Polymerase vor Durchführung der zweiten Amplifikation inaktiviert wird. Dies kann beispielsweise durch thermale Denaturierung erreicht werden, wenn es sich bei der ersten Polymerase um eine nicht thermostabile Polymerase handelt.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass die erste Amplifikation in einem ersten Reaktionsansatz und die zweite Amplifikation in einem zweiten Reaktionsansatz durchgeführt wird. In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass ein Aliquot des ersten Reaktionsansatz in den zweiten Reaktionsansatz gegeben wird.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass der vollständige erste Reaktionsansatz in den zweiten Reaktionsansatz gegeben wird.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids zum dem Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär ist, der sich unmittelbar an den Primer-Oligonukleotidanteil des ersten Primer-Verlängerungsproduktes anschließt. Vorteilhafterweise wird dadurch die sequenzspezifische Verdrängung der zu amplifizierenden Nukleinsäure verbessert.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass das Controller-Oligonukleotid einen vierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an den 3'-Bereich des dritten Primer-Oligonukleotids binden kann. Der vierte Bereich kann innerhalb des zweiten Bereichs und/oder des dritten Bereichs des Controller- Oligonukleotids liegen bzw. Sequenzsegmente des zweiten und/oder dritten Bereichs einschließen, wobei der vierte Bereich insbesondere durch eine Länge von 9 bis 30 Nukleotiden hat, insbesondere 10 bis 20 Nukleotide, oder 12 bis 16 Nukleotide.
Der Begriff "im Wesentlichen sequenzspezifisch" bedeutet im Zusammenhang der vorliegenden Offenbarung, dass die zueinander komplementären Bereiche des Primer-Oligonukleotids und der zu amplifizierenden Nukleinsäure nicht mehr als 5, 4, 3, 2, oder 1 Mismatches aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist vorgesehen, dass das Controller- Oligonukleotid eine oder mehrere Nukleotid-Modifikationen umfasst, welche dazu ausgebildet sind, die Verlängerung eines an das Controller-Oligonukleotid gebunden Primers zu verhindern. Beispielsweise können mehrere 2'-0-Alkylmodifikation eine solche Verlängerung blockieren bzw. verhindern. Insbesondere befindet sich mehrere Nukleotid-Modifikationen im zweiten und/oder dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids. Insbesondere umfasst das Controller- Oligonukleotid mindestens 5 solche Modifikationen, besser mindestens 10 Modifikationen.
In einer besonderen Ausführungsform besteht das Controller-Oligonukleotid vollständig aus Nukleotid-Modifikationen.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens weist der Teil des durch die Polymerase synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, der im Wesentlichen komplementär zum dritten Bereich des Controller-Nukleotids ist, eine Länge im Bereich von 5 Nukleotiden bis 70 Nukleotiden auf.
In bestimmten Ausführungsformen ist der dritte einzelsträngige Bereich des Controller- Oligonukleotids zum 5'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes vollständig komplementär, wobei die Länge dieses komplementären Sequenzabschnittes folgende Länge aufweisen kann: von mindestens 3 bis 70 Nukleotide, oder von mindestens 5 bis 50 Nukleotide, in besonderen Ausführungsformen von 5 bis 40 Nukleotide, von 5 bis 30 Nukleotide, insbesondere von 5 bis 20 Nukleotide.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die erste Amplifikation im Wesentlichen isothermal durchgeführt wird.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die zweite Amplifikation bei drei Temperaturen durchgeführt wird, wobei bei der ersten Temperatur die Hybridisierung des dritten oder vierten Primer-Oligonukleotids und optional die initiale Verlängerung der Primer durchgeführt wird, und bei einer zweiten Temperatur die vollständige Verlängerung der Primer und bei einer dritten Temperatur die Trennung von gebildeten Primer- Verlängerungsprodukten von ihren jeweiligen Matrizensträngen. Insbesondere ist die erste Temperatur im Bereich von 25 °C bis 65° C, die zweite Temperatur im Bereich von 65 °C bis 80 °C und die dritte Temperatur im Bereich von 85°C bis 105°C.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die zu amplifizierende Nukleinsäure eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 300 Nukleotiden aufweist.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das erste Primer-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden aufweist.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das zweite Primer-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden aufweist.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Controller-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden aufweist.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das dritte Primer-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 60 Nukleotiden aufweist.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das vierte Primer-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 60 Nukleotiden aufweist.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das dritte Primer-Oligonukleotid mindestens eine nuklease-resistente Nukleotid-Modifikation aufweist, beispielsweise eine PTO (Phosphothioat) oder 2'-0-Alkyl Modifikation.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das vierte Primer-Oligonukleotid mindestens eine nuklease-resistente Nukleotid-Modifikation aufweist, beispielsweise eine PTO oder 2'-0-Alkyl Modifikation.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das erste Primer-Oligonukleotid im zweiten Bereich eine Modifikation oder mehrere Modifikationen aufweist, insbesondere unmittelbar im Anschluss an den ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotid, welche die verwendete Polymerase am Kopieren zweiten Bereich stoppt / verhindert. Vorteilhafterweise wird dadurch nur der erste Bereich des ersten Primer- Oligonukleotids kopiert.
Dies kann in bestimmten Ausführungsformen durch Verwendung von Nukleotid-Modifikationen erreicht werden, welche zwar eine komplementäre Bindung mit dem ersten Primer- Verlängerungsprodukt eingehen können, nicht aber von der Polymerase als Matrize akzeptiert werden. Beispiele für solche Nukleotid-Modifikationen stellen Nukleotid-Verbindungen mit modifizierten Phosphat-Zucker-Rückgrad-Anteilen, z.B. 2'-0-Alkyl-RNA Modifikationen (z.B. 2 - OMe), LNA-Modifikationen oder Morpholino-Modifkationen dar. Im Allgemeinen hindert die Anwesenheit solcher Modifikationen in einem Strang eine DNA-Abhängige Polymerase beim Ablesen eines solchen Stranges. Die Anzahl von solchen Modifikationen kann unterschiedlich groß sein, in der Regel können wenige Modifikationen (zwischen 1 und 20) hinreichend sein, um eine Polymerase beim Ablesen eines solchen Stranges zu hindern. Solche Nukleotid-Modifikationen können beispielsweise an oder um die Bindungsstelle des ersten Primer-Oligonukleotides an das Controller-Oligonukleotid verwendet werden und/oder als Bestandteile des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides.
Dank der Verwendung solcher Modifikationen kommt es zu einer lokalen Hinderung der Polymerase-Funktion, so dass bestimmte Segmente der verwendeten Strukturen nicht durch die Polymerase kopiert werden können und vorwiegend einzelsträngig bleiben. In dieser einzelsträngigen Form können sie weitere Reaktionskomponenten binden und somit ihre Funktion ausführen.
Soweit vorstehend einzelne Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens als vorliegend in bestimmten Ausführungsformen diskutiert wurden, ist dem Fachmann bewußt, dass diese Merkmale sich jeweils zu spezielleren Ausführungsformen kombinieren lassen. Dies gilt für alle im Rahmen der vorliegenden Beschreibung diskutierten Merkmale, soweit nicht erkennbar ist, dass ihre Kombination sinnlos ist, z.B. bei sich ausschließenden Parameterüberlappungen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren gemäß den vorstehend geschilderten Aspekten oder ihrer speziellen Ausführungsformen oder Alternativen zur Verfügung gestellt. Das erfindungsgemäße Kit umfasst:
ein erstes Primer-Oligonukleotid aufweisend folgende Bereiche:
• einen ersten Bereich, der sequenzspezifisch an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure binden kann,
• einen zweiten Bereich, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem ersten Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt;
• wobei das erste Primer-Oligonukleotid durch eine Polymerase zu einem ersten Primer-Verlängerungsprodukt verlängert werden kann, welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst;
ein zweites Primer-Oligonukleotid, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid einen Bereich umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer- Verlängerungsprodukts binden kann, und von einer Polymerase zu einem zweiten Primer- Verlängerungsprodukt verlängert werden kann, welches neben dem zweiten Primer- Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst,
ein Controller-Oligonukleotid aufweisend folgende Bereiche:
• einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich des ersten Primer- Verlängerungsprodukts binden kann,
• einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär oder vollständig ist, und
• einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsprodukts im Wesentlichen komplementär oder voll komplementär ist;
wobei das Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids dient, und das Controller-Oligonukleotid an das Primer-
Verlängerungsprodukt unter Verdrängung des dazu komplementären Bereichs der zweiten Primer- Verlängerungsproduktes binden kann,
ein drittes Primer-Oligonukleotid, wobei das dritte Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der sequenzspezifisch an ein Segment des zweiten Primer- Verlängerungsprodukt binden kann, und von eine Polymerase zu einem dritten Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext) verlängert werden kann, welches neben dem dritten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst; und
ein viertes Primer-Oligonukleotid, wobei das vierte Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer- Verlängerungsprodukts binden kann, und von einer Polymerase zu einem vierten Primer- Verlängerungsprodukt verlängert werden kann, welches neben dem vierten Primer- Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits umfasst das Kit weiterhin mindestens eine Polymerase.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits umfasst das Kit eine erste Polymerase, die zur Verlängerung des ersten und zweiten Primer-Oligonukleotids vorgesehen ist, und eine zweite Polymerase, die zur Verlängerung des dritten und des vierten Primer- Oligonukleotids vorgesehen ist. In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits weist die erste Polymerase keine 5'-Exonukleaseaktivität auf und die zweite Polymerase keine 5'-Exonukleaseaktivität. Insbesondere kann die zweite Polymerase eine thermostabile Polymerase sein.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist vorgesehen, dass die zweite Polymerase, das dritte Primer-Oligonukleotid und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid aktivierbar ist, und/oder das Controller-Oligonukleotid deaktivierbar ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Kits gemäß obigen Aspekt zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß den vorstehend geschilderten Aspekten oder ihrer speziellen Ausführungsformen oder Alternativen zur Verfügung gestellt.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung sollen in nicht beschränkender Weise durch die Figuren und eine detaillierte Beschreibung ausgewählter Ausführungsformen erläutert werden.
Die erfindungsgemäße Kombination umfasst zwei hintereinander auszuführende Amplifikations- Verfahren. Während der ersten Teil-Amplifikation (das erste Amplifikationsverfahrens) werden Nukleinsäureketten amplifiziert, welche eine Zielsequenz umfassen. Dabei resultieren amplifizierte Nukleinsäureketten, welche anschließend als Matrizen in der zweiten Teil-Amplifikation (das zweite Amplifikations-Verfahren) verwendet werden. Diese zweite Teil-Amplifikation wird in vielen Fällen eine konventionelle PCR sein. Während der zweiten T eil-Amplifikation erfolgt eine Fortführung der Amplifikation ausgehend von den Zielnukleinsäuren bzw. Nukleinsäuren umfassend die Zielnukleinsäuren, welche in der ersten Teil-Amplifikation amplifiziert wurden. Dabei werden PCR- Fragmente amplifiziert. Diese PCR-Fragmente umfassen insbesondere Zielsequenzen oder Anteile von Zielsequenzen. Weiterhin können während des zweiten Amplifikationsverfahrens spezifische Veränderungen an amplifizierbaren Nukleinsäureketten vorgenommen werden. Dabei können beispielsweise Zielsequenzen durch Verwendung von Barcoding-Primern oder detektions spezifischen Primern flankiert werden. Ebenfalls kann eine Detektion unter Verwendung von PCR- Sonden (z.B. sogenannten Taqman-Sonden) detektiert werden. Weiterhin kann während PCR- Phase eine Immobilisierung von Zielsequenzen an die feste Phase unter Verwendung von immobilisierten Primern verwendet werden, so dass die PCR als Fest-Phasen-PCR abläuft.
Mit dem ersten erfindungsgemäßen Amplifikations-Verfahren sollen Nukleinsäureketten mit definierter Sequenz-Zusammensetzung synthetisiert bzw. amplifiziert werden können, wobei generierte Produkte als Start-Nukleinsäureketten mit Matrizenfunktion für anschließende PCR dienen können und die PCR-Amplifikation unter Verwendung von mindestens einem eigenen PCR- Primer erfolgt.
Eine Aufgabe der Erfindung wird weiterhin durch die Bereitstellung eines ersten Amplifikationsverfahrens (einer ersten Teil-Amplifikation) und entsprechenden Mitteln zu seiner Ausführung gelöst. Die Ausführung dieses ersten Amplifikationsverfahrens wurde in der PCT Anmeldung PCT/EP2017/07101 1 und der europäischen Anmeldung 16185624.0 bereits beschrieben. Zu Details der Ausführung der Amplifikation wird der Fachmann an diese Anmeldung verwiesen.
Das zweite Amplifikationsverfahren (die zweite Teil-Amplifikation), kann insbesondere als PCR ausgeführt werden, wobei mindestens einer der verwendeten Primer eine andere Zusammensetzung und/oder Struktur aufweist, als die Primer, welche im ersten Amplifikationsverfahren verwendet werden. Daraus resultiert eine Vermehrung von zumindest einer Nukleinsäurekette, welche die spezifische Zielsequenz oder ihre Anteile umfasst.
Eine PCR-Amplifikation an sich ist normalerweise in der Lage, ausgehend von einer Menge von mehr als etwa 1000 Kopien, besser ausgehend von mehr als etwa 100.000 Kopien, der initialen Matrize gut charakterisierbare Amplifikationsprodukte zu generieren bzw. auch im real-time- Modus spezifische Signale zu generieren. Bei der Reduzierung der Kopienanzahl auf unter 1000 (z.B. auf 100 oder 10 Kopien) muss die PCR mehr Synthesezyklen umfassen, was zunehmend zu fehlerhaften Amplifikationsprodukten bzw. -Signalen führen kann. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die PCR eine Sequenzvariante (z.B. eine Mutation oder Allel-Variante einer Sequenz) amplifizieren muss, welche im Ansatz in geringen Mengen vorliegt und die PCR-Amplifikation in Anwesenheit einer großen Menge einer anderen Sequenzvariante (z.B. Wildtyp-Sequenz oder Allel-Variante) erfolgt. Zwar wurden bereits viele Methoden entwickelt, um die Spezifität von PCR zu verbessern, dennoch können amplifikationsabhängige Nachweismethoden von einer weiteren Steigerung der Spezifität von Amplifikationsverfahren profitieren, z.B. im Feld der liquid biopsy. Vor allem in der klinischen Diagnostik besteht ein Bedarf, die Spezifität von Messverfahren zu verbessern.
Aufgrund einer großen Verbreitung der PCR-Technologie existieren zahlreiche Modifikationen dieser Technologie bzw. Erweiterungen des PCR-Basisverfahrens, welche auf vielen Gebieten der molekularen Biologie Anwendung finden. Durch Vorschaltung eines anderen, ersten Amplifikationsverfahren kann beispielsweise Signal-Spezifität oder PCR-Produkt-Spezifität bei diesen Anwendungen verbessert werden.
In der vorliegenden Erfindung wird die Kombination aus einem vorangehenden hochspezifischen Amplifikationsverfahren mit nachgeschalteter PCR beschrieben. Die Kombination ermöglicht eine Erhöhung der initialen Kopienzahl von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten unter hochselektiven Amplifikationsbedinungen eines ersten Amplifikationsverfahren bis zu den gewünschten Mengen, welche dann anschließend ggf. unter weniger spezifischen Bedingungen einer PCR-Amplifikation weiter amplifiziert werden. Das erste Amplifikationsverfahren (erste Teil- Amplifikation) hat somit eine Funktion des ersten Verstärkers mit hoher Spezifität. Die Menge an synthetisierten Kopien im ersten Amplifikationsverfahren umfasst beispielsweise einen Bereich von etwa 10 Kopien bis etwa 1 E 1 1 Kopien, besser von etwa 100 Kopien bis etwa 1 .0E 10 Kopien, bevorzugt von etwa 1000 bis etwa 10E8 Kopien. Dabei wird die Menge einer Zielsequenz durch die erste Amplifikation vermehrt. Diese Vermehrung (bezogen auf die Ausgangsmenge der Zielsequenz im Ansatz) liegt beispielsweise in folgenden Bereichen von etwa 2-fach bis etwa 1 E10- fach, besser von etwa 10-fach bis etwa 10E9-fach, noch besser von etwa 10-fach bis etwa 10E8- fach, bevorzugt von etwa 10-fach bis etwa 10E7-fach, besonders bevorzugt von etwa 100-fach bis 10E6-fach. Dabei werden, bezogen auf das Volumen der Reaktion, folgende Konzentrationsbereiche erreicht: von etwa 10 amol/l bis etwa 10 nmol/l, besser von etwa 1 fmol/l bis etwa 1 nmol/l, noch besser von etwa 10 fmol/l bis etwa 0,1 nmol/l, insbesondere von etwa 10 fmol/l bis etwa 10 pmol/l.
Das zweite Amplifikationsverfahren (die zweite Teil-Amplifikation, welche als PCR-Verfahren oder Modifikation dessen verwendet wird) spielt die Rolle eines zweiten Verstärkers und erlaubt, bereits bestehende PCR-basierte Verfahren, wie Sondeneinsatz oder Barcoding bzw. Sequenzkodierung bei NGS-library-preparation oder Festphasen-PCR in Kombination mit spezifischen Produkten der ersten Amplifikation einzusetzen.
Die Vorteile der Kombination liegen zum einen in der Reduzierung der Anzahl von PCR-Zyklen, welche für die Ausführung der Amplifikation bis zur gewünschten Menge des Endproduktes notwendig sind. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit bzw. das Ausmaß einer Synthese von Fehlprodukten durch die PCR reduziert. Das Syntheseergebnis kann somit höhere Spezifität aufweisen, als die PCR-Amplifikation alleine.
In einer besonderen Ausführungsform erfolgt zunächst die erste Amplifikation mit erforderlichen Komponenten des ersten Amplifikationssystems in Abwesenheit von mindestens einer der wesentlichen Komponenten des zweiten Amplifikationssystems im selben Reaktions-Ansatz während der ersten Amplifikations-Reaktion. Beispielsweise werden PCR-Primer oder eine thermostabile Polymerase erst vor der PCR-Amplifikation zugegeben.
Nach Abschluss der ersten Amplifikationsreaktion wird der Reaktions-Ansatz in Kontakt mit den Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems gebracht und es wird eine PCR-Amplifikation ausgeführt.
In bestimmten Ausführungsformen liegen die Reaktionskomponenten eines jeweiligen Amplifikationssystems vor Beginn einer Amplifikation in getrennten Reaktionsansätzen und/oder in getrennten Reaktionsgefäßen vor.
Beispielsweise wird die erste Amplifikationsreaktion in einem Reaktionsgefäß ausgeführt, und anschließend wird das Syntheseergebnis dieser Reaktion in das zweite Reaktionsgefäß (vollständig oder teilweise übertragen), und anschließend wird die zweite Amplifikation ausgeführt.
In weiteren Ausführungsformen werden die Reaktionskomponenten sequenziell zugegeben, so dass zunächst die Komponenten des ersten Amplifikationssystems zugegeben werden, und die erste Amplifikations-Reaktion ausgeführt wird. Anschließend werden die Komponenten des zweiten Amplifikationssystems zugeführt, so dass die zweite Amplifikation erfolgen kann. In weiteren Ausführungsformen erfolgt die Zugabe der Komponenten des zweiten Amplifikations- Systems zum ersten Amplifikationsansatz, so dass die Reaktion im Wesentlichen im gleichen Reaktionsgefäß ausgeführt wird. Die Abfolge von beiden Amplifikationsverfahren wird somit durch zeitliche Reihenfolge der Zugabe von einzelnen Komponenten vorgegeben.
Um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu verringern, können beide Reaktionen insbesondere in einem geschlossenen System ausgeführt werden. Ein solches System kann beispielsweise mindestens zwei getrennte Reaktionsgefäße umfassen. Die Überführung des Ansatzes von einem Reaktionsgefäß zum anderen erfolgt in bestimmten Ausführungsformen ebenfalls mittels eines geschlossenen Systems. Eine solche Trennung der beiden Reaktionen in einem geschlossenen Reaktionsgefäß-System ist bekannt, z.B. als getrennte Reaktionsgefäße, welche zu einem Kartuschensystem oder Array-System oder Mikrofluidic-System zusammengefasst sind.
In bestimmten Ausführungsformen wird der erste Amplifikationsansatzes umfassend die amplifizierten Nukleinsäuren der ersten Amplifikation für die zweite Amplifikation ohne Aufteilung des ersten Ansatzes verwendet. Der erste Ansatz wird somit im Wesentlichen vollständig der zweiten Amplifikationsreaktion zugeführt. Eine Menge an synthetisierten Kopien aus dem ersten Amplifikationsverfahren wird dem zweiten Amplifikationssystem damit zugeführt und umfasst beispielsweise einen Bereich von etwa 10 Kopien bis etwa 1 E1 1 Kopien, besser von etwa 100 Kopien bis etwa 1 E10 Kopien, bevorzugt von etwa 1000 bis etwa 10E9 Kopien. Dabei wird die Menge einer Zielsequenz durch die erste Amplifikation vermehrt. Diese Vermehrung (bezogen auf die Ausgangsmenge der Zielsequenz im Ansatz) liegt beispielsweise in folgenden Bereichen von etwa 2-fach bis etwa 1 E1 1 -fach, besser von etwa 10-fach bis etwa 1. 000.0000.000-fach, noch besser von etwa 10-fach bis etwa 1 .00.0000.000-fach, bevorzugt von etwa 10-fach bis etwa 10.0000.000-fach, besonders bevorzugt von etwa 100-fach bis 1000.000-fach. Dabei bezogen auf das Volumen der Reaktion folgende Konzentrationsbereiche erreicht werden: von etwa 10 amol/l bis etwa 10 nmol/l, besser von etwa 1 fmol/l bis etwa 1 nmol/l, noch besser von etwa 10 fmol/l bis etwa 0,1 nmol/l, bevorzugt von etwa 10 fmol/l bis etwa 10 pmol/l.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform erfolgt bevorzugt die Verwendung nur eines Teils des ersten Amplifikationsansatzes (ein Aliquot bzw. eine Teilmenge) in der zweiten Amplifikationsreaktion. Aufgrund einer Amplifikation mittels des ersten Amplifikationssystems erfolgt eine Vermehrung der Menge von Nukleinsäureketten umfassend mindestens eine Zielsequenz. In der zweiten Amplifikationsreaktion kann ein Anteil dieser Menge als Ausgangsmaterial verwendet werden. Dieser Anteil kann beispielsweise dem zweiten Reaktionsansatz zugeführt oder zugegeben werden. Der Anteil kann beispielsweise relativ gering sein und richtet sich im Wesentlichen nach den Erfordernissen der gewünschten Anwendung. Aufgrund der vermehrenden Wirkung der PCR kann die zweite Amplifikation insbesondere ausgehend von mehr als etwa 1000 Kopien der Nukleinsäureketten starten, welche im ersten Amplifikationsverfahren sequenzspezifisch amplifiziert wurden.
Die PCR-Amplifikation kann somit dann gestartet, wenn eine hinreichende Menge der amplifizierten Nukleinsäureketten im ersten Amplifikationsverfahren synthetisiert wurde. Dabei kann diese Menge der synthetisierten Nukleinsäureketten folgende Bereiche umfassen: beispielsweise einen Bereich von etwa 10.000 Kopien bis etwa 1 E 1 1 Kopien, besser von etwa 10.000 Kopien bis etwa 1 E10 Kopien, insbesondere von etwa 10.000 bis etwa 1 E9 Kopien. Dabei wird die Menge einer Zielsequenz durch diese erste Amplifikation wunschgemäß vermehrt. Diese Vermehrung (bezogen auf die Ausgangs-Menge der Zielsequenz im Ansatz) kann als N-faches der Ausgangsmenge bemessen werden und liegt beispielsweise in folgenden Bereichen von etwa 2- fach bis etwa 1 E1 1 -fach, besser von etwa 10-fach bis etwa 1 E10-fach, noch besser von etwa 10- fach bis etwa 1 E9-fach, insbesondere von etwa 10-fach bis etwa 1 E8-fach, besonders von etwa 100-fach bis 1 E6-fach. Dabei werden, bezogen auf das Volumen der Reaktion, folgende Konzentrationsbereiche erreicht: von etwa 10 amol/l bis etwa 10 nmol/l, besser von etwa 1 fmol/l bis etwa 1 nmol/l, noch besser von etwa 10 fmol/l bis etwa 0,1 nmol/l, insbesondere von etwa 10fmol/l bis etwa 10 pmol/l.
Da in der ersten Amplifikationsreaktion mehr als 1000 Kopien an spezifischen, die Zielsequenz umfassenden Nukleinsäureketten produziert werden können, kann ein Bruchteil (bzw. Aliquot bzw. ein Anteil) dieser Menge für die zweite Amplifikationsreaktion eingesetzt werden.
Die PCR kann beispielsweise ausgehend von einer Menge starten, welche folgende Bereiche umfasst: beispielsweise einen Bereich von etwa 100 Kopien bis etwa 1 E 1 1 Kopien, besser von etwa 1.000 Kopien bis etwa 1 E 10 Kopien, insbesondere von etwa 1 .000 bis etwa 1 E9 Kopien. Diese Menge kann als Teilmenge der synthetisierten, die Zielsequenz enthaltenden Nukleinsäurekette, vermehrt durch die erste Amplifikation, aufgefasst werden.
Die Bereitstellung von amplifizierten Synthese-Produkten der ersten Amplifikation bezogen auf das Volumen der Reaktion folgende Konzentrationsbereiche umfassen: von etwa 10 amol/l bis etwa 100 nmol/l, besser von etwa 1 fmol/l bis etwa 10 nmol/l, noch besser von etwa 10 fmol/l bis etwa 1 nmol/l, insbesondere von etwa 10 fmol/l bis etwa 10 pmol/l. Dabei kann eine PCR-Amplifikation ausgehend von diesen Konzentrationen der Synthese-Produkte der ersten Amplifikation gestartet werden. Im Laufe der PCR-Amplifikation erfolgt dann eine weitere Vermehrung von Produkten, wobei die Endkonzentration von PCR-Fragmenten Konzentrations-Bereiche von 0,01 nmol/l bis zu 5 pmol/l, besser von 1 nmol/l bis 1 pmol/l umfasst.
Es kann auch nur ein Bruchteil der im ersten Amplifikationsverfahren spezifisch synthetisierten Nukleinsäureketten im zweiten Amplifikationsverfahren verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen liefert die erste Amplifikation somit eine Menge an Kopien, welche einen relativen Überschuss darstellt, bezogen auf die notwendige Menge an Kopien, welche als Startmaterial für die PCR erforderlich bzw. gewünscht sind.
Aus dieser ersten Amplifikationsreaktion wird ein Anteil in die zweite Amplifikationsreaktion übertragen, und die darin enthaltenen synthetisierten Nukleinsäureketten dienen als Matrizen zum Start der PCR-Reaktion. Ein Anteil des ersten Reaktionsansatzes kann beispielsweise durch Verdünnung des ersten Reaktionsansatzes und Übertragung eines bestimmten Volumenanteils, das synthetisierte Nukleinsäureketten beinhaltet, in die zweite Reaktion erfolgen. Der Anteil der Menge von dabei übertragenen spezifisch synthetisierten Nukleinsäureketten, welche als Matrize für Generierung von PCR-Fragmenten dienen können, kann dabei folgende Bereiche umfassen (berechnet auf Gesamtmenge von synthetisierten Produkten im ersten Amplifikations-Schritt): von etwa 1 E-7% bis etwa 90%, besser von etwa 1 E-6% bis etwa 90%, noch besser von etwa 0,0001 % bis etwa 50%, insbesondere von etwa 0,001 % bis etwa 50%, oder von etwa 0,01 % bis etwa 50%, insbesondere 0,1 % bis etwa 20%.
Daraus resultiert nicht nur eine Verdünnung der die Zielsequenz enthaltenden synthetisierten Nukleinsäureketten, sondern auch der Komponenten des ersten Amplifikationssystems, z.B. Primer und Controller-Oligonukleotide. Auch ggf. entstandene Nebenprodukte werden verdünnt. Die dabei resultierende Reduktion der Konzentration der Komponenten des ersten Amplifikationssystems wird in Kauf genommen und kann sich sogar positiv auf die Ausführung der PCR auswirken. Beispielsweise kann eine Verdünnung von Primern und Controller- Oligonukleotiden dazu führen, dass die während der PCR Reaktion verwendeten Oligonukleotid- Primer oder Oligonukleotid-Sonden in höheren Konzentrationen vorliegen als die übertragenen Oligonukleotid-Primer des ersten Amplifikationssystems. Das kann die PCR-Reaktion begünstigen und Interferenzen mit dem Amplifikationsverfahren minimieren.
Weiterhin kann eine Verdünnung eines Controller-Oligonukleotides ebenfalls positive Auswirkung auf die PCR-Reaktion dadurch haben, dass dieses Controller-Oligonukleotid zwar im Ansatz während der zweiten Amplifikations-Reaktion präsent ist, doch seine Konzentration während der zweiten Amplifikation so verringert ist, dass seine Bindung an die Syntheseprodukte bzw. Reaktionskomponenten hinreichend verlangsamt wird bzw. die Interaktion mit komplementären Sequenzsegmenten vermindert wird bzw. insuffizient stattfindet und damit seine Wirkung auf den Reaktionsablauf insgesamt durch diesen Verdünnungseffekt vermindert wird.
Bei der Bereitstellung von Nukleinsäureketten für die zweite Amplifikation kann somit auch eine Verdünnung der Reaktionskomponenten des ersten Amplifikationssystems erfolgen, im Allgemeinen parallel mit Verdünnung der bereitgestellten spezifischen Nukleinsäurekette. Die relative Menge an Komponenten des ersten Amplifikationssystem, welche in die zweite Amplifikationsreaktion übertragen werden, kann als Anteil dargestellt werden. Dieser Anteil bezieht sich auf die Menge der in der ersten Amplifikationsreaktion eingesetzten Komponenten (100%). Der übertragene Anteil der Komponenten des ersten Amplifikationssystems in der zweiten Amplifikationsreaktion umfasst beispielsweise folgende Bereiche: von etwa 1 E-7% bis etwa 50%, besser von etwa 1 E-6% bis etwa 30%, noch besser von etwa 0,0001 % bis etwa 20%, insbesondere von etwa 0,001 % bis etwa 10%, besonders bevorzugt von etwa 0,1 % bis etwa 10%. Somit werden die Konzentrationen der Komponenten des ersten Amplifikationssystems so signifikant reduziert, dass ihre Wirkung im zweiten Amplifikationsschritt gemindert wird bzw. vernachlässigbar ist. Der übertragene Anteil des ersten Reaktionsansatzes kann sich beispielsweise auf die verwendeten Konzentrationen oder auf die Volumenanteile beziehen. Beispielsweise kann die Übertragung eines Mikroliters (1 pl) des Ansatzes umfassend das erste Amplifikations-System (nach Abschluss einer Amplifikation) zu 49 pl eines Ansatzes umfassend das zweite Amplifikations- System in einer 2% (v/v) Verdünnung, bzw. einer Verdünnung von 1 :50 resultieren. Höhere Verdünnungsstufen können entsprechend mittels einer Verdünnungsreihe erstellt werden.
Beispielsweise kann die Konzentration des Controller-Oligonukleotides im ersten Amplifikationssystem von etwa 10 pmol/l bei einer Verdünnung von 1 :1000 auf etwa 10 nmol/l reduziert werden. Der übertragene Anteil beträgt somit nur 0.01 %. Bei einer solchen Verdünnung kann gleichzeitig der gleiche Anteil der synthetisierten Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz übertragen werden. Beispielsweise wurde in der ersten Amplifikationsreaktion eine Menge von etwa 10.000.000 Kopien amplifiziert, wobei dann die in die PCR-Reaktion übertragene Menge an Produkten bei einer Verdünnung von 1 :1000 dann eine Teilmenge von ca. 10.000 Kopien ergibt. Diese Ausgangsmenge an Kopien reicht in der Regel für die PCR aus, um eine stabile und hinreichend spezifische Amplifikations-Reaktion auszuführen.
Ebenfalls vorteilhaft ist die Verdünnung von potenziell interferierenden Nukleinsäureketten, z.B. von Wildtyp-Molekülen oder Allel-Varianten. Währen der sequenzspezifischen ersten Amplifikation erfolgt vorwiegend die spezifische Amplifikation von Zielmolekülen. Andere Nukleinsäureketten werden nicht oder nicht wesentlich amplifiziert.
Bei Verdünnung wirkt der Verdünnungseffekt auch auf diese potenziell mit der PCR-Reaktion interferierenden Sequenzen. Beispielsweise wird damit die Menge an Wild-Typ-Sequenzen von 100.000 auf ca. 100 reduziert. Dies kann sich positiv auf die Spezifität der PCR-Reaktion auswirken.
In bestimmten Ausführungsformen werden insbesondere beide Verfahren in einem Ansatz ausgeführt (als „homogener Assay“). Dazu müssen die Komponenten von beiden Amplifikationssystemen in einem Ansatz bereits zu Beginn der ersten Amplifikation vorliegen. Die erforderlichen Komponenten für beide Amplifikations-Systeme werden somit vor Beginn der ersten Amplifikation dem Reaktionsansatz zugeführt.
In einer besonderen Ausführungsform erfolgt zunächst die erste Amplifikation mit erforderlichen Komponenten des ersten Amplifikationssystems in Anwesenheit von mindestens einer der wesentlichen Komponenten des zweiten Amplifikationssystems im selben Reaktions-Ansatz während der ersten Amplifikationsreaktion.
Die Zusammenführung von beiden Amplifikations-Systemen in einem Reaktions-Ansatz kann eine Anpassung einzelner Komponenten bzw. Konzentrationen und Reaktionsbedingungen erfordern.
Die Anwesenheit der Komponenten des zweiten Amplifikationssystem soll die erste Amplifikationsreaktion nicht verhindern. In bestimmten Ausführungsformen wird die Länge des 3'-Segments des dritten Primers, welcher mit dem Controller-Oligonukleotid eine komplementäre Bindung eingehen kann, so gewählt, dass dieses Segment die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid nicht verhindert. Dies wird im Wesentlichen dadurch erreicht, dass unter Reaktionsbedingungen der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid (z.B. 65 °C Schritt während der ersten Amplifikation) die Stabilität des doppelsträngigen Komplexes aus einem Controller-Oligonukleotid und einem 3'- Segment des dritten Primers hinreichend gering ist, dass die Bindung des dritten Primers an das Controller-Oligonukleotid nur vorübergehen ist und die Strang-Verdrängung nicht verhindert. Dies kann beispielsweise durch die Länge des 3'-Segmentes des dritten Primers beeinflusst werden, welches in der Lage wäre, einen solchen Komplex mit dem Controller-Oligonukleotid einzugehen. Beispielsweise beträgt die Länge dieses Komplexes zwischen 8 und 20 Nukleotiden. Weiterhin kann das 3'-Segment des dritten Primers einen oder mehrere Mismatches zur Sequenzzusammensetzung des Controller-Oligonukleotides im entsprechenden Segment aufweisen, was in einer Destabilisierung dieses Komplexes resultiert. Insbesondere werden ein bis drei Mismatches in Position von -10 bis - 20 bezogen auf das 3'-terminale Nukleotid des dritten Primers positioniert. Dadurch wird die Primer-Funktion des dritten Primers nicht wesentlich beeinträchtigt und gleichzeitig die Stabilität des Komplexes mit dem Controller-Oligonukleotid reduziert.
Weiterhin soll das Controller-Oligonukleotid von beiden Primern und der Polymerase des zweiten Amplifikationssystems nicht als Matrize verwendet werden. Dies ist insbesondere für den dritten Oligonukleotid-Primer von Bedeutung, da dieser ein Sequenzsegment umfasst, welches komplementär an das Controller-Oligonukleotid binden kann. Die Struktur des Controller- Oligonukleotide im Segment seiner möglichen komplementären Bindung an den dritten Oligonukleotid-Primer kann daher vergleichbar ausgestaltet werden wie bei dem ersten Primer des ersten Sets. In bestimmten Ausführungsformen wird die Primer-Verlängerung des dritten Oligonukleotid-Primers dadurch verhindert, dass das Controller-Oligonukleotid durch Verwendung von Nukleotid-Modifikationen die Polymerase daran hindert, einen an das Controller-Oligonukleotid gebundenen dritten Primer zu verlängern. Beispielsweise können mehrere 2'-0-Alkyl- Modifikationen eine solche blockierende Wirkung vermitteln.
Um unerwünschte Interferenzen zwischen beiden Amplifikationssystemen zu vermeiden, kann es weiterhin vorteilhaft sein, die Komponenten des zweiten Amplifikationssystems vollständig oder teilweise in einem „inerten“ bzw. „nicht-aktiven“ bzw. „reversibel inaktivierten“ bzw. „nicht reaktionsfähigen“ Zustand während der ersten Teil-Amplifikation vorzuhalten. Erst für die Durchführung der zweiten Amplifikation sollen solche Komponenten in einen aktiven, d.h. funktionsfähigen Zustand überführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen liegt zumindest eine dieser PCR-Komponenten während der ersten Amplifikation in einer reversibel inaktivierten Form vor, so dass diese Komponente nicht an der ersten Amplifikationsreaktion teilnimmt oder ihre Teilnahme unwesentlich ist. Nach Abschluss der ersten Amplifikation erfolgt dann zunächst eine Aktivierung dieser reversibel inaktivierten Komponenten, so dass die Inaktivierung aufgehoben wird und die Komponenten nun in der zweiten Amplifikationsreaktion in aktiver Form vorliegen und somit ihre Rolle bei der Amplifikation ausführen können.
Beispielsweise werden reversibel inaktivierte PCR-Primer verwendet oder eine reversible inaktivierte thermostabile Polymerase (so genannte Hotstart-Polymerase). Bei dem Umstellungsschritt von der ersten Amplifikation auf die zweite werden beispielsweise Reaktionsbedingungen verwendet, welche eine Aktivierung dieser inaktiven Form der Komponente ermöglichen. Bei anderen Ausführungsformen erfolgt die Aktivierung von Komponenten fortlaufend unter PCR-Bedingungen.
Einige Beispiele für reversibel inaktivierte Primer sind dem Fachmann bekannt (z.B. termolabile Primer sogenannte CleanAmp Primers Trilink-Technologies). Solche Primer können durch Erhitzung aktiviert werden, so dass die Polymerasen eine Synthese ausgehend von diesem Primer starten können. Zu weiteren Beispielen von reversibel inaktivierten Primern zählen Primer mit einem 3'-terminalen Nukleotid, welches einen modifizierten Zuckerrest umfasst, z.B. eine blockierte 3'-OH-Gruppe (z.B. durch einen C3-Linker an der 3 '-Position oder Primer mit terminalen dideoxy-Nukleotiden, Sambrook et al NAR 1998 p.3073).
In bestimmten Ausführungsformen weisen solche Primer ein 3'-terminales Mismatch zu Matrize auf. Bei Verwendung solcher Primer wird insbesondere eine Polymerase für die erste Amplifikation verwendet, welche keine 3'-5'-Exonuklease Aktivität aufweist (z.B. Bst Polymerase oder ihre Modifikationen). Dadurch bleiben solche Primer währen der ersten Phase im nicht aktivierten Zustand. Bei Verwendung solcher Primer in der PCR-Phase ist es somit erforderlich, diese zu aktivieren. Die Aktivierung erfolgt in der Regel durch enzymatische Abspaltung des 3'-terminalen Nukleotids zusammen mit dem modifizierten Zuckerrest. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, solche Primer in Kombination mit einer thermostabilen Polymerase zu verwenden, welche eine 3'- 5'-Exonuklease Aktivität umfasst (sogenannte proofreading Polymerasen). In bestimmten Ausführungsformen, welche Primer mit einem 3'-Terminalen Mismatch einschließt, erleichtert ein solches terminales Mismatch die Funktion der 3'-5'-Exonuklease der Polymerase. Nach dem Start der PCR-Amplifikation binden solche„inaktiven“ Primer an ihre komplementären Positionen an Matrizen. Nach einer Bindung an die Matrize können terminale Nukleotide einschließlich einer Blockierungsgruppe durch Exonuklease-Aktivität (welche mit Polymerase assoziiert ist) entfernt werden. Dabei entstehen ein an die Matrize komplementär gebundenes Primer-Oligonukleotid und freie 3'-OH-Gruppen, welche von der Polymerase verlängert werden können. Solche„aktivierte“ Primer können nun von der Polymerase verlängert werden, so dass zu den jeweiligen Matrizen komplementäre Stränge synthetisiert werden. Zu Polymerasen, welche in der Lage sind, solche Primer unter PCR-Bedingungen matrizenspezifisch zu aktivieren gehören, beispielsweise die Vent Polymerase, die Deep Venf-Polymerase, die Pfu Polymerase oder die Phusion Polymerase. Durch Design von PCR-Primern mit einem 3'-terminalen Mismatch zur jeweiligen Matrize (oder auch beispielsweise in Position -1 oder -2 bezogen auf das 3'-terminale Nukleotid) kann die Aktivierung von solchen Primern in der Regel beschleunigt werden (z.B. für Pfu Polymerase oder Phusion Polymerase). Andere thermostabile Polymerasen können auch modifizierte terminale Nukleotide mit geblockter 3'-OH Gruppe auch dann abspalten, wenn diese komplementär zum Templat sind (z.B. Vent oder Deep Vent Polymerasen). Zur Einschränkung der degradierenden Wirkung einer Polymerase auf die PCR-Primer können solche Primer eine von 3'-5'-Nuklease nicht spaltbare Bindung umfassen, z.B. eine oder mehrere Phosphorothioat-Modifikationen (PTO-Modifikationen) z.B. in Positionen„minus 2“ oder„minus 3“ oder von„minus 2“ bis„minus 7“. Dadurch wird der übermäßige Abbau von Primern verhindert.
Zu den reversibel aktivierten Polymerasen zählen beispielsweise solche, welche mittels eines Antikörpers reversibel inaktiviert sind oder welche mittels einer chemischen Modifikation reversible inaktiviert sind (AmpliT aq Polymerase). Mehrere kommerzielle Anbieter haben für PCR solche„hot- Start“ Polymerasen entwickelt (Qiagen, Thermofisher, Roche). Vor allem wurde die Taq Polymerase und ihre Modifikationen in verschiedenen reversibel inaktivierten Zuständen als sogenannte Hot-Start Taq Polymerase angeboten. Besonders bevorzugt sind Hot-Start- Polymerasen, welche in eine aktive Form beispielsweise durch initiale Erhitzung des Ansatzes auf 95 °C für 1 min bis 10 min überführt werden. Da Antikörper unterschiedliche Epitope bei Polymerasen abschirmen können, können auch unterschiedliche Aktivitäten von Polymerasen unterschiedlich stark reversibel inaktiviert werden (Scalice et al J.lmmunol.Methods, 1994, p. 147- , Lyamichev et al PNAS, 1999, p. 6143).
Bei bestimmten Ausführungsformen der Amplifikation im homogenen Format wird die Polymerase, welche in der ersten Amplifikationsreaktion die exponentielle Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette ausgeführt hat, vor Beginn der zweiten Amplifikation durch Erhitzung inaktiviert. Diese Inaktivierung kann beispielsweise durch Erhitzung des Ansatzes auf über 80 °C, besser auf über 90 °C, insbesondere auf 95 °C, für 1 bis 10 min erreicht werden. Damit können beispielsweise mesophile Polymerasen (wie Bst Polymerase oder Bsm Polymerase, oder Gst Polymerase) inaktiviert werden. Eine solche Inaktivierung begünstigt die Umstellung des Verfahrens von der ersten Amplifikationsreaktion auf die zweite Amplifikationsreaktion. Bei einem solchen Temperaturschritt kann somit gleichzeitig eine Inaktivierung der Polymerase der ersten Amplifikationsreaktion erfolgen und eine Aktivierung der Polymerase für die zweiten Amplifikationsreaktion.
Aufgrund einer solchen thermalen Inaktivierung der ersten Polymerase kann diese nun nicht mehr im gleichen Ausmaß an die Primer bzw. Matrize binden. Während der zweiten Amplifikationsreaktion werden somit die Primer-Matrizen-Komplexe insbesondere von der Polymerase verwendet, welche im zweiten Amplifikations-Schritt die Synthese ausführen soll.
Durch eine solche Umstellung von einer Polymerase auf die andere können sich ebenfalls auch die anderen, mit Polymerase assoziierten Aktivitäten, wie z.B. Strangverdrängung durch Bst Polymerase, „abschalten“ lassen, bzw. 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase „anschalten“ lassen.
In bestimmten Ausführungsformen kann während der zweiten Amplifikationsreaktion das 5'- Segment des am ersten Primer-Verlängerungsprodukt hybridisierten Controller-Oligonukleotides durch die 5'-3-Nuklease der Polymerase (z.B. 5'-3'-Nuklease einer Taq Polymerase) gespalten werden. Dieser Vorgang ist hinreichend bekannt und wird häufig für Sondendegradation und ein r eal-time-monitoring einer PCR- Reaktion verwendet (US Pat 5,210,015). Dabei kann die Polymerase den vierten PCR-Primer unter Verwendung des dritten Primer- Verlängerungsproduktes unter geeigneten Reaktionsbedingungen durch Einbau von Nukleotiden komplementär verlängern und gleichzeitig das Controller-Oligonukleotid in seinem 5'-Segment des an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt hybridisierten dritten Bereich enzymatisch spalten. Der von Polymerase verlängerte Strang bildet während der Synthese insbesondere eine Überlappung mit dem Controller-Oligonukleotid um mindestens ein 3'-terminales Nukleotid, so dass dabei eine für 5'-3'-Nuklease Aktivität der Taq Polymerase erkennbare Struktur unter verwendeten Reaktionsbedingungen gebildet wird, und diese Struktur gespalten werden kann. Durch 5'-3'- Exonuklease Aktivität kommt es zu Spaltung der Phosphodiester-Bindungen zwischen Nukleotiden des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotides. Die 5'-3'-Exonuklease bedingte Spaltung erfolgt insbesondere am DNA-Strang, wobei einige Zucker-Phosphat-Rückgrad-Modifikationen, wie 2'-OMe Ribonukleotide oder PTO-Modifkationen oder PNA, diese Spaltung verlangsamen oder gar verhindern können. Aus diesem Grund wird in dieser Ausführungsform insbesondere eine Kombination aus einer Polymerase umfassend eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität (z.B. Taq- Polymerase) und einem Controller-Oligonukleotid verwendet, wobei das Controller-Oligonukleotid in seinem 5'-Segment des dritten Bereichs, vorwiegend durch Nuklease spaltbare Nukleotide bzw. ihre Analoga umfasst (z.B. DNA). Die Länge dieses 5'-Segmentes des Controller-Oligonukleotide umfasst beispielsweise 5 bis 50, insbesondere 10 bis 30 Nukleotide.
Durch die Degradation des an das erste Primer-Verlängerungsprodukt gebundenen Controller- Oligonukleotides kann eine Polymerase auch ohne Strangverdrängungs-Eigenschaften den zweiten Primer verlängern und somit das zweite Primer-Verlängerungsprodukt synthetisieren.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Anwesenheit von Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems während der ersten Amplifikation wird wie folgt berücksichtigt:
Zum einen kann die Wirkung der Komponenten des zweiten Amplifikationssystems durch ihre reversible Inaktivierung vor der ersten Amplifikation reduziert werden. Zum anderen sollen einzelne Sequenz-Elemente nicht als unspezifische Matrizen für die Primer-Verlängerung während der ersten Amplifikation auftreten. Aus diesem Grund sollen Primer des ersten und des zweiten Amplifikationssystems auf Vorliegen von selbstkomplementären Strukturen überprüft werden, um eine Primer-Dimer-Bildung zu vermeiden.
Der dritte PCR-Primer umfasst in der Regel ein Sequenzsegment in seinem 3'-Segment, welches zum Controller-Oligonukleotid komplementäre Bereiche umfasst. Dadurch kann der dritte PCR- Primer an das Controller-Oligonukleotid komplementär binden. Zur Ausführung der ersten Amplifikation darf der dritte PCR-Primer die Strangverdrängung durch das Controller- Oligonukleotides während der ersten Amplifikation nicht verhindern. Zu diesem Zweck wird die Sequenzlänge bzw. Sequenzzusammensetzung des 3'-Segments des dritten PCR-Primer so angepasst, dass dieser bei Reaktionsbedingungen des Strangverdrängungsschrittes (z.B. 65 °C) nicht wesentlich an das Controller-Oligonukleotid bindet. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Schmelztemperatur des Komplexes aus einem Controller-Oligonukleotid und dem 3'-Segment des dritten Primers wesentlich unter der Reaktionstemperatur des Strangverdrängungs-Schrittes liegt, z.B. zwischen 45° und 60 °C. Ein solcher dritter PCR-Primer kann weiterhin mit seinem 3'-Segment an seine Matrize binden und eine Primer-Verlängerungs- Reaktion initiieren. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass das 3'-Segment des dritten PCR-Primers, welches mit dem Controller-Oligonukleotid komplementäre Bindung eingehen kann, in seiner Länge Bereiche umfasst, welche zwischen 9 und 30 Nukleotiden liegen, besser zwischen 12 und 20 Nukleotiden, insbesondere zwischen 12 und 16 Nukleotiden. Dieses 3'-Segment des dritten PCR-Primers kann einen oder mehrere Mismatches zu korrespondierenden Positionen des Controller-Oligonukleotides umfassen, so dass die Bindungsstärke weiter abnimmt.
Das Sequenzsegment des Controller-Oligonukleotides, welches im Wesentlichen komplementär den dritten PCR-Primer binden kann, wird als der vierte Bereich des Controller-Oligonukleotides bezeichnet. Dieser vierte Bereich des Controller-Oligonukleotides kann Sequenzsegmente des zweiten Bereichs und/oder des dritten Bereichs einschließen.
Der vierte Bereich des Controller-Oligonukleotide umfasst in seiner Länge Bereiche, welche zwischen 9 und 30 Nukleotiden liegen, besser zwischen 12 und 20 Nukleotiden, insbesondere zwischen 12 und 16 Nukleotiden. Der vierte Bereich des Controller-Oligonukleotides kann zum 3'- Segment des dritten PCR-Primers einen oder mehrere Mismatches umfassen. Insbesondere umfasst dieser vierte Bereich Nukleotid-Modifikationen, welche den dritten PCR-Primer daran hindern, von einer Polymerase des ersten und/oder des zweiten Amplifikationssystems unter Verwendung des Controller-Oligonukleotides als Matrize verlängert zu werden. Solche Modifikationen sind für die Kombination des ersten Primers und des Controller-Oligonukleotides bereits beschrieben. Sie umfassen beispielsweise Sequenzsegmente mit 2'-0-Alkyl- Modifikationen, wobei die Länge dieses Segmentes zwischen 6 und 30 Modifikationen sein kann und das komplementäre Nukleotid des Controller-Oligonukleotides zum 3'-terminalen Nukleotid des dritten PCR-Primers insbesondere selbst eine solche Modifikation umfasst und weiterhin auf beiden Seiten von mindestens drei Nukleotiden mit solchen Modifikationen flankiert ist. Damit wird sichergestellt, dass das Controller-Oligonukleotid vom dritten und vierten Primer und der Polymerase des zweiten Amplifikationssystems nicht als Matrize verwendet wird.
Die Erstellung des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes mit einer definierten Länge spielt eine Rolle bei der Trennung dieser beiden Produkte mittels eines Controller- Oligonukleotides. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, eine ggf. vorzeitige Verlängerung von 3'- Enden (jeweils des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes) unter Verwendung eines dritten oder vierten Primers des zweiten Amplifikationssystems als Matrize während der ersten Amplifikationsreaktion zu verhindern.
Eine Reduzierung bzw. Verhinderung einer ggf. unerwünschten überschüssigen Verlängerung des 3'-Endes des ersten Primer-Verlängerungsproduktes unter Verwendung des vierten PCR-Primers als Matrize kann auf verschiedene Art und Weise erzielt werden: In bestimmten Ausführungsformen wird das dadurch erreicht, dass der vierte PCR-Primer, wenn gebunden an das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, keine perfect match komplementäre Bindung mit dem 3'-terminalen Nukleotid dieses synthetisierten ersten Primer- Verlängerungsproduktes eingehen kann. Dadurch soll überschüssige Verlängerung des 3'- terminalen Nukleotide des ersten Primer-Verlängerungsproduktes verhindert oder zumindest reduziert werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird dies dadurch erreicht, dass der vierte PCR-Primer, wenn er an das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes gebunden ist, keine perfect match komplementäre Bindung mit dem mindestens einem der terminalen Nukleotide dieses synthetisierten ersten Primer-Verlängerungsproduktes eingehen kann. Die dabei entstehende mindestens eine Mismatch-Position liegt insbesondere in der Position von -1 bis - 5 relativ zum terminalen Nukleotid des ersten Primer-Verlängerungsproduktes.
Eine Reduzierung bzw. Verhinderung einer ggf. unerwünschten überschüssigen Verlängerung des 3'-Endes des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes unter Verwendung des dritten PCR-Primers als Matrize kann auf verschiedene Art und Weise erzielt werden: In bestimmten Ausführungsformen wird das dadurch erreicht, dass der dritte PCR-Primer, wenn er an das 3'- Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes gebunden ist, keine perfect match komplementäre Bindung mit dem 3'-terminalen Nukleotid dieses synthetisierten ersten Primer- Verlängerungsproduktes eingehen kann. Dadurch soll eine überschüssige Verlängerung des 3'- terminalen Nukleotide des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes verhindert oder zumindest reduziert werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird dies dadurch erreicht, dass der dritte PCR-Primer, wenn er an das 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes gebunden ist, keine perfect match komplementäre Bindung mit dem mindestens einem der terminalen Nukleotide dieses synthetisierten zweiten Primer-Verlängerungsproduktes eingehen kann. Die dabei entstehende mindestens eine Mismatch-Position liegt insbesondere in der Position -1 bis - 5 relativ zum Terminalen Nukleotid des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Die Anwesenheit von Komponenten des ersten Amplifikations-Systems während der zweiten Amplifikation wird wie folgt berücksichtigt: Zum einen kann die Wirkung der Komponenten des ersten Amplifikationssystems durch ihre Verdünnung vor der zweiten Amplifikation reduziert werden. Zum anderen sollen einzelne Elemente nicht als unspezifische Matrizen für die Primer-Verlängerung während der zweiten Amplifikation auftreten. Aus diesem Grund sollen die Primer des ersten und des zweiten Amplifikationssystems auf Vorliegen von selbstkomplementären Strukturen überprüft werden, um eine Primer-Dimer-Bildung zu vermeiden.
In einer besonderen Ausführungsform wird die zweite Amplifikation in Anwesenheit des Controller- Oligonukleotides des ersten Amplifikations-Systems ausgeführt. Aus diesem Grund muss die Ausgestaltung des Controller-Oligonukleotids, der Primer des zweiten Sets und der Reaktionsbedingungen dahingehend angepasst werden, dass die zweite Amplifikationsreaktion durch die Anwesenheit des Controller-Oligonukleotides nicht wesentlich gestört wird.
Zum einen soll das Controller-Oligonukleotid von beiden Primern und der Polymerase des zweiten Amplifikationssystems nicht als Matrize verwendet werden. Dies ist insbesondere für das dritte Oligonukleotid-Primer von Bedeutung, da dieser ein Sequenzsegment umfasst, welches komplementär an das Controller-Oligonukleotid im vierten Bereich binden kann. Die Struktur des Controller-Oligonukleotide im vierten Bereich umfasst insbesondere eine Modifikation, welche eine potenzielle Primer-Verlängerung verhindert. Beispielsweise können mehrere 2'-0-Alkyl- Modifikationen eine solche syntheseblockierende Wirkung vermitteln.
Das Controller-Oligonukleotid kann an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt während der zweiten Amplifikation und damit an einen komplementären Strang mit dem dritten Primer- Verlängerungsprodukt bilden. Ein solches doppelsträngiges Fragment kann unter Umständen eine Polymerase daran hindern, ausgehend vom vierten PCR-Primer, den komplementären Strang im vollen Ausmaß zu synthetisieren, bis einschließlich das 5'-Segment des dritten Primer- Verlängerungsproduktes kopiert wird. Daher soll die Wahl der Polymerase und der Reaktionsbedingungen so gestaltet werden, dass eine Bindung der Controller-Oligonukleotide die Synthese des vierten Primer-Verlängerungsproduktes nicht verhindert.
Die Länge des Segments des dritten Primer-Verlängerungsproduktes, welches mit dem Controller- Oligonukleotid eine komplementäre Bindung eingehen kann, wird beispielsweise durch die Positionierung des dritten Primers mitbestimmt. Insbesondere wird der dritte Primer so angeordnet, dass die Länge des resultierenden vollkomplementären Anteils eines zu erwartenden dritten Primer-Verlängerungsproduktes zum Controller-Oligonukleotid insbesondere in folgenden Bereichen liegt: von etwa 15 Nukleotiden bis etwa 60 Nukleotiden, oder von etwa 20 Nukleotiden bis etwa 40 Nukleotiden, besonders von etwa 20 Nukleotiden bis etwa 30 Nukleotiden.
In bestimmten Ausführungsformen wird insbesondere eine thermostabile Polymerase in der zweiten Amplifikationsreaktion gewählt, welche eine Strangverdrängungsaktivität umfasst, beispielsweise kann eine thermostabile Polymerase wie die Vent Exo minus Polymerase oder Pyrophage Polymerase verwendet werden. Dadurch kann das Controller-Oligonukleotid während der zweiten Amplifikation vom dritten Primer-Verlängerungsprodukt getrennt werden, und das vierte Primer-Verlängerungsprodukt kann in voller Länge synthetisiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird insbesondere eine Polymerase in der zweiten Amplifikationsreaktion gewählt, welche in der Lage ist, das Controller-Oligonukleotid durch 5'-3'- Exonuklease-Aktivität der Polymerase zu spalten, wobei eine gleichzeitige Primer-Verlängerung erfolgt (s.o.). Dabei wird ein Controller-Oligonukleotid verwendet, welches von einer 5'-3'- Exonuklease zumindest in seinem 5'-Segment gespalten werden kann. Die Degradation führt schrittweise zu einer Verkürzung des an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt hybridisierten Controller-Oligonukleotids, was bei geeigneten Reaktionsbedingungen (z.B. Temperatur von etwa 65 °C bis 75 °C) zu einer Destabilisierung dieser Bindung und schließlich zu einer Trennung der Bindung an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt führt. Dadurch kann das vierte Primer- Verlängerungsprodukt in voller Länge synthetisiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Konzentration des Controller-Oligonukleotides und die Konzentration des vierten Primers des zweiten Primer-Sets so gewählt, dass die Primer-Bindung und die Primer-Verlängerung unter den gewählten Reaktionsbedingungen schneller erfolgen, als die Bindung der Controller-Oligonukleotide an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt. Beispielsweise werden Konzentrationen des Controller-Oligonukleotid im Bereich von 0,01 pmol/l bis 0,3 pmol/l verwendet. Gleichzeitig werden Konzentrationen des vierten Primers verwendet, welche im Bereich von etwa 0,5 pmol/l bis 2 pmol/l liegen. Insbesondere werden dabei Polymerasen in der zweiten Amplifikationsreaktion verwendet, welche eine hohe Prozessivität aufweisen (z.B. Phusion Polymerase). Die Bindung der Primer und ihre Verlängerung erfolgen dabei in der Regel schneller als die Bindung des Controller-Oligonukleotide, so dass die Primer- Verlängerungsreaktion kinetisch im Vorteil ist.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Primer-Verlängerungsreaktion in der zweiten Amplifikationsreaktion bei mindestens zwei Temperaturen ausgeführt. Bei der ersten, im Allgemeinen niedrigeren Temperatur, z.B. im Bereich von 45 °C bis 65 °C, erfolgt die komplementäre Bindung des vierten Primers an sein komplementäres Segment im 3'-Segment des dritten Primer-Verlängerungsproduktes, sowie eine initiale Verlängerung durch die Polymerase. Hierbei wird ein partiell verlängertes Primer-Verlängerungsprodukt generiert, welches eine hinreichende Stabilität mit dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt aufweist, so dass nach Erhöhung der Temperatur des zweiten Bereichs, z.B. auf Werte von etwa 70 °C bis etwa 80 °C, dieses partiell verlängerte vierte Primer-Verlängerungsprodukt von der Polymerase verlängert werden kann. Bei dieser Temperatur kann das Controller-Oligonukleotid aus seiner Bindung mit dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt spontan dissoziieren, so dass die Polymerase die Synthese des vierten Primer-Verlängerungsprodukts fortsetzen kann, bis einschließlich das 5'- Segment des dritten Primer-Verlängerungsproduktes von der Polymerase kopiert wird. Insbesondere werden dabei Polymerasen in der zweiten Amplifikationsreaktion verwendet, welche eine hohe Prozessivität aufweisen (z.B. Phusion Polymerase). Verfahren, die mit der Zusammensetzung des Reaktionsgemisches im „homogenen Format“ arbeiten, eignen sich beispielsweise besonders dann, wenn eine Teilung des ersten Reaktionsansatzes nicht sinnvoll oder technisch sehr aufwendig ist, beispielsweise bei einer „Micro- bzw. Nanotröpfchen-Reaktion“ (auch als digital-PCR genannt).
Ebenfalls können weitere Elemente einer Amplifikation zugeführt werden, beispielsweise eine feste Phase umfassend Oligonukleotide, welche zu einer spezifischen Bindung von gebildeten Produkten geeignet sind und/oder auch als immobilisierte Primer auftreten, so dass eine Festphasen-PCR ausgeführt werden kann, wobei die Primer-Verlängerungsprodukte an der festen Phase immobilisiert sind. Die Herbeiführung des Kontaktes mit einer festen Phase, welche spezifische Oligonukleotide umfasst kann vor, während oder erst nach der ersten Amplifikation erfolgen.
Der Reaktionsansatz kann vor dem Beginn der ersten Amplifikations-Reaktion in eine Vielzahl von Reaktionsvolumina aufgeteilt werden (Partitionierung), so dass eine Amplifikation eines Reaktionsansatzes gleichzeitig in etwa 100 oder 1000 oder mehr gleiche Volumen-Anteile aufteilt wird. Diese Aufteilung kann in Form von Tröpfchen stattfinden (z.B. als Emulsion). Die Ausführung von Amplifikation kann parallel in dieser Vielzahl von Tröpfchen ausgeführt werden (z.B. als Digitale PCR).
Der Reihenfolge der Amplifikationsreaktionen (erst eine sequenzspezifische Amplifikation und erst anschließend eine PCR) kommt dabei eine wesentliche Rolle zu: die sequenzspezifische Amplifikation (erste Amplifikation) unter Verwendung eines Controller-Oligonukleotids erfolgt insbesondere vor einer PCR-Amplifikation. Damit sollen PCR-basierte Verzerrungen in den Zielsequenzen und Nebenreaktionen vor einer ersten Amplifikation vermieden werden. Daher erfolgt die PCR-basierte Amplifikation erst als zweiter Schritt.
In einer besonderen Ausführungsform werden daher für die erste Amplifikationsreaktion keine durch eine PCR oder ein ein anderes Amplifikationsverfahren generierte DNA-Fragmente als Start- Nukleinsäureketten verwendet.
Im Folgenden wird zunächst schematisch das erste Amplifikationsverfahren (erste Teil- Amplifikation) und die erforderlichen Komponenten des ersten Amplifikationssystems beschrieben, anschließend wird das zweite Amplifikationsverfahren (zweite Teil-Amplifikation) und die Komponenten des zweiten Amplifikationssystems beschrieben. Darauf folgend wird die Kombination des ersten und des zweiten Amplifikationsverfahrens, sowie werden vorteilhafte Ausführungsformen dargestellt. Das zweite Amplifikationsverfahren (im weiteren auch als PCR genannt) erfolgt im Anschluss an die erste Amplifikation.
Insbesondere erfolgt die erste Amplifikation als exponentielle Amplifikation, bei welcher neusynthetisierte Produkte beider Primer (Primer-Verlängerungsprodukte) als Matrizen für weitere Syntheseschritte auftreten. Dabei werden die Primersequenzen zumindest teilweise kopiert, so dass komplementäre Primer-Bindungsstellen entstehen, welche unmittelbar nach ihrer Synthese als Sequenzsegmente eines Doppelstranges vorliegen. Im ersten Amplifikationsverfahren erfolgen abwechselnd Syntheseschritte von beiden Strängen und Doppelstrangöffnungsschritte der neu synthetisierten Sequenzabschnitte. Eine hinreichende Doppelstrangtrennung nach einer Synthese stellt eine wichtige Voraussetzung für eine weitere Synthese dar. Insgesamt kann eine solche Abwechslung aus Synthese- und Doppelstrangtrennungsschritten zu einer exponentiellen Amplifikation führen.
Im ersten Amplifikationsverfahren erfolgt erfindungsgemäß die Doppelstrangöffnung der Hauptprodukte der Amplifikation (Amplifikation von Zielsequenz umfassenden Nukleinsäureketten) unter anderem mittels eines Oligonukleotides, welches hier als Controller-Oligonukleotid bezeichnet wird. Das Controller-Oligonukleotid umfasst insbesondere Sequenzsegmente, welche der Zielsequenz entsprechen.
Im Einzelnen wird die Strangtrennung erfindungsgemäß durch Einsatz eines Controller- Oligonukleotids mit jeweils vordefinierter Sequenz erreicht, welches insbesondere mittels einer sequenzabhängigen nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung einen neusynthetisierten Doppelstrang bestehend aus beiden spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten trennt. Die dabei entstehenden einzelsträngigen Segmente der Primer-Verlängerungsprodukten umfassen die Zielsequenz sowie entsprechende Primer-Bindungsstellen, welche als Bindungsstellen für weitere Primer-Oligonukleotide dienen können, so dass eine exponentielle Amplifikation von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten erreicht wird. Die Primer-Verlängerungsreaktionen und Strangverdrängungsreaktionen finden im Ansatz gleichzeitig statt. Die Amplifikation erfolgt insbesondere unter Reaktionsbedingungen, welche eine spontane Trennung von beiden spezifischen synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten nicht zulassen.
Eine spezifische exponentielle erste Amplifikation einer eine Zielsequenz umfassenden Nukleinsäurekette umfasst eine Wiederholung aus Syntheseschritten und Doppelstrangöffnungsschritten (Aktivierungs-Schritten für Primer-Bindungsstellen) als zwingende Voraussetzung für Vermehrung der Nukleinsäurekette.
Die Öffnung von synthetisierten Doppelsträngen wird als Reaktionsschritt umgesetzt, welcher sequenzspezifisch durch das Controller-Oligonukleotid beeinflusst werden soll. Diese Öffnung kann vollständig erfolgen, bis hin zu Dissoziation von beiden komplementären Primer- Verlängerungsprodukten, oder auch partiell sein.
Das Controller-Oligonukleotid umfasst erfindungsgemäß Sequenzabschnitte, welche mit der Zielsequenz interagieren können und weitere Sequenzabschnitte, welche diese Interaktion herbeiführen, bzw. ermöglichen, bzw. begünstigen. Im Rahmen der Interaktion mit dem Controller- Oligonukleotid werden doppelsträngige Abschnitte der synthetisierten Primer- Verlängerungsprodukte via sequenzspezifischer Strangverdrängung in eine einzelsträngige Form überführt. Dieser Vorgang ist sequenzabhängig: erst wenn die Sequenz des synthetisieren Doppelstranges ein gewisses Maß an Komplementarität mit der entsprechenden Sequenz des Controller-Oligonukleotides aufweist, kommt es zu einer hinreichenden Doppelstrangöffnung, so dass die für die Fortführung der Synthese wesentlichen Sequenzabschnitte, wie z.B. Primer- Bindungsstellen, in einzelsträngige Form überführt werden, was einem "aktiven Zustand" entspricht. Das Controller-Oligonukleotid "aktiviert" somit spezifisch die neusynthetisierten Primer- Verlängerungsprodukte, welche die Zielsequenz umfassen, für weitere Synthese-Schritte.
Hingegen werden Sequenzabschnitte, welche keine Zielsequenz umfassen, nicht in einzelsträngigen Zustand überführt und verbleiben als Doppelstrang, was einem "inaktiven" Zustand entspricht. Die potenziellen Primerbindungsstellen sind in einem solchen Doppelstrang bei der Interaktion mit neuen Primern benachteiligt bzw. vollständig gehindert, so dass weitere Synthese-Schritte an solchen "nicht aktivierten" Strängen im Allgemeinen nicht stattfinden. Diese fehlende oder verminderte Aktivierung (d.h. Überführung in einen einzelsträngigen Zustand) von synthetisierten Nukleinsäuresträngen nach einem Synthese-Schritt führt dazu, dass im darauffolgenden Synthese-Schritt nur eine verminderte Menge an Primern an einer Primer- Verlängerungsreaktion erfolgreich teilnehmen kann.
Aufgrund einer anzustrebenden exponentiellen ersten Amplifikation von Hauptprodukten (einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette, welche Zielsequenzen umfasst) werden mehrere Syntheseschritte und Aktivierungsschritte (Doppelstrang-Öffnungs-Schritte) zu einem Amplifikations-Verfahren zusammengefasst und so lange ausgeführt, bzw. so oft wiederholt, bis die gewünschte Menge der spezifischen Nukleinsäurekette bereitgestellt ist.
Die Reaktionsbedingungen (z.B. Temperatur) werden im Verlauf des ersten Amplifikationsverfahren so gestaltet, dass eine spontane Trennung von komplementären Primer- Verlängerungsprodukten in Abwesenheit eines Controller-Oligonukleotids unwahrscheinlich oder signifikant verlangsamt ist.
Die Erhöhung der Spezifität einer Amplifikation resultiert somit aus der Sequenzabhängigkeit der Trennung von komplementären Primer-Verlängerungsprodukten, welche eine Zielsequenz umfassen: das Controller-Oligonukleotid ermöglicht bzw. begünstigt diese Doppelstrang-Trennung als Folge der Übereinstimmung seiner Sequenzabschnitte mit vorgegebenen Sequenzabschnitten der Primer-Verlängerungsprodukte. Diese Übereinstimmung wird nach jedem Synthesezyklus durch das Controller-Oligonukleotid überprüft. Die exponentielle Amplifikation resultiert als Folge aus erfolgreichen Wiederholungen aus Synthesevorgängen und sequenzspezifischen Strangverdrängungen das durch Controller-Oligonukleotid, d.h. "Aktivierungen" (Doppelstrangöffnungen/ Doppelstrangtrennungen/Strangverdrängungsvorgängen resultierend in einzelsträngiger Form von entsprechenden Primer-Bindungsstellen) von neusynthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten.
Der Einsatz von vordefiniertem Controller-Oligonukleotid ermöglicht somit eine sequenzabhängige Überprüfung der Inhalte der Primer-Verlängerungsprodukten zwischen den einzelnen Syntheseschritten während der exponentiellen Amplifikation und Herbeiführung einer Selektion bzw. einer Auswahl von Sequenzen für nachfolgende Syntheseschritte. Dabei kann zwischen "aktiven", einzelsträngigen Zuständen von neusynthetisierten spezifischen Primer- Verlängerungsprodukten als Folge einer erfolgreichen Interaktion mit einem Controller- Oligonukleotid, und "inaktiven" doppelsträngigen Zuständen von neusynthetisierten unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukten als Folge einer mangelhaften, unzureichenden, verminderten und/oder verlangsamten Interaktion mit einem Controller-Oligonukleotid unterschieden werden.
Für eine exponentielle Amplifikation ergeben sich daraus folgende Effekte:
Unter nicht-denaturierenden Bedingungen erfolgt die Trennung von spezifisch synthetisierten Strängen unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotids.
Die exponentielle Amplifikation von eine Zielsequenz umfassenden Nukleinsäureketten erfolgt sequenzkontrolliert (Hauptreaktion). Diese Sequenzkontrolle erfolgt nach jedem Syntheseschritt und schließt Sequenzsegmente ein, welche zwischen den Primern liegen und die Zielsequenz umfassen. Die erfolgreiche Überprüfung des Ergebnisses der Synthese nach jedem Synthese- Schritt resultiert in der Trennung der beiden spezifischen Primer-Verlängerungsprodukte, was die Voraussetzung für weitere spezifische Synthese-Schritte darstellt.
Während der ersten Amplifikation kann eine initiale Entstehung von unspezifischen Primer- Verlängerungsprodukten nicht prinzipiell ausgeschlossen werden (Nebenprodukte). Solche unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukte liegen unmittelbar nach ihrer Synthese in der Regel in doppelsträngiger Form vor. Die Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid bleibt allerdings entweder vollständig aus oder ist eingeschränkt, so dass es nicht zu einer Strangtrennung kommt, oder die Strangtrennung verlangsamt gegenüber der Hauptreaktion ist. Die Übertragung einer fehlerhaften Sequenzinformation von einem Synthese-Zyklus auf den nächsten findet somit nicht statt.
Durch die Wahl der Reaktionsbedingungen und die Gestaltung des Controller-Oligonukleotids ist es somit möglich, einen gezielten Einfluss auf die Effizienz der Regenerierung von korrekten Nukleinsäureketten-Matrizen zwischen einzelnen Synthese-Schritten im Rahmen eines Amplifikationsverfahrens auszuüben. Im Allgemeinen gilt, dass die Trennung der synthetisierten Produkte und die Regenerierung von korrekten Matrizen von einem Synthese-Schritt zum nächsten umso erfolgreicher ist, je höher das Maß der Übereinstimmung der synthetisierten Sequenz mit der vorgegebenen Sequenz des Controller-Oligonukleotides ist. Umgekehrt führt eine Sequenzabweichung bei Nebenprodukten zu einer insuffizienten Regenerierung von Matrizensträngen und somit zu einer Verlangsamung der Synthese-Initiierung bzw. zu Reduzierung der Ausbeute in jedem nachfolgenden Zyklus. Die gesamte exponentielle Amplifikation von Nebenprodukten verläuft entweder langsamer oder findet gar nicht statt und/oder bleibt auf einem nicht detektierbaren Niveau.
Das Verfahren ermöglicht somit eine Überprüfung der synthetisierten Sequenzen in Echtzeit, d.h. ohne Reaktions-Unterbrechung und stellt damit Mittel für die Entwicklung von homogenen Assays zur Verfügung, bei welchen alle Komponenten des Assays bereits zu Beginn einer Reaktion im Reaktionsgemisch vorliegen. Als Ergebnis der ersten Teil-Amplifikation wird eine hinreichende Menge an hochspezifischen Amplifikationsfragmenten bereitgestellt, welche in der zweiten Teil-Amplifikation (PCR) als Matrize dienen können.
Nach einer hinreichenden Reaktionszeit bzw. Zykluszahl wird das erste Amplifikationsverfahren dann beendet, bzw. die Reaktionsbedingungen werden dahingehend geändert, dass das zweite Amplifikationsverfahren (PCR) gestartet werden kann. Im zweiten Amplifikationsverfahren erfolgt die Amplifikation der Zielsequenzen unter Verwendung von im ersten Amplifikationsverfahren hergestellten Nukleinsäureketten und zumindest einer weiteren, PCR-spezifischen Komponente, (z.B. einem Oligonukleotid-Primer und/oder einer PCR-Polymerase). Da die Anzahl von spezifischen Nukleinsäureketten bereits zu Beginn der zweiten Amplifikation hinreichend hoch ist, braucht das PCR-Verfahren weniger Zyklen, bis die gewünschte Gesamtmenge an Produkten erreicht wird. Dabei werden PCR-Produkte generiert, welche insgesamt weniger Fehler aufweisen.
Durch die sequenzielle Schaltung eines hochspezifischen ersten Amplifikationsverfahrens zu Beginn der Amplifikation und der PCR erst im Anschluss daran, lässt sich somit die Gesamtspezifität der generierten PCR-Produkte im Vergleich mit herkömmlichen PCR-Verfahren verbessern, welche von Beginn an unter PCR-Bedingungen arbeiten.
Insbesondere liegen Komponenten für beide Amplifikationsverfahren bereits zu Beginn der Amplifikation im Ansatz vor.
In bestimmten Ausführungsformen unterscheiden sich die Komponenten des ersten Amplifikations- Systems von den Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems (PCR).
In bestimmten Ausführungsformen unterscheiden sich die Komponenten des ersten Amplifikations- Systems von den Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems und die PCR-Komponenten (des zweiten Amplifikations-Systems) liegen unter Reaktionsbedingungen des ersten Amplifikationsverfahrens zumindest teilweise in Nicht-aktiver Form (z.B. als Hot-Start- Polymerasen). Die Umstellung von der ersten Amplifikation auf die zweite Amplifikation erfordert somit einen zusätzlichen Aktivierungs-Schritt der PCR-Komponenten (z.B. Polymerase).
In bestimmten Ausführungsformen wird die Polymerase des ersten Amplifikationssystems nach Abschluss der ersten Amplifikation inaktiviert, so dass für die zweite Amplifikation (PCR) eine andere Polymerase eingesetzt wird.
In bestimmten Ausführungsformen werden die Komponenten des ersten Amplifikations-Systems teilweise auch vom zweiten Amplifikations-System verwendet, wobei zumindest eine weitere PCR- spezifische Komponente (z.B. ein weiteres Primer-Oligonukleotid oder eine Polymerase) verwendet wird, welche kein Bestandteil des ersten Amplifikationssystems sind.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einige Ausführungsformen beider Verfahren, Anordnungen von Oligonukleotid-Primern, welche zur Durchführung von beiden Amplifikationsverfahren vorteilhaft sind. Durch geeignete Anordnung von einzelnen Elementen des ersten und des zweiten Amplifikations-Systems an einer Nukleinsäurekette, welche eine Zielsequenz umfasst, können homogene Assays mit höhere Gesamtspezifität zusammengestellt werden.
Begriffe und Definitionen
Soweit nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann verstanden werden. Standardtechniken werden für molekularboiologische oder biochemische Verfahren verwandt (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.).
Soweit die in der Beschreibung und im Sequenzprotokoll gezeigten Sequenzen von einander abweichen, gilt im Zweifel die in der Beschreibung gezeigte Sequenz.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die verwendeten Begriffe folgende Bedeutung:
Der Begriff "Oligonukleotid" wie er hier bezugnehmend auf Primer, Controller-Oligonukleotid, Sonden, zu amplifizierende Nukleinsäurekette verwendet wird, bezeichnet ein Molekül, das zwei oder mehr, insbesondere mehr als drei Desoxyribonukleotide und / oder Ribonukleotide und / oder Nukleotid-Modifikationen und / oder Nicht-Nukleotid-Modifikationen umfasst. Seine Länge umfasst beispielsweise Bereiche zwischen 3 bis 300 Nukleotid-Einheiten oder ihrer Analoga, insbesondere zwischen 5 bis 200 Nukleotid-Einheiten oder ihrer Analoga. Seine genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die ihrerseits von der letztendlichen Funktion oder Verwendung der Oligonukleotide abhängen.
Der Begriff "Primer", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Oligonukleotid, unabhängig davon, ob es natürlicherweise z. B. in einer gereinigten Restriktionsspaltung vorkommt oder synthetisch produziert wurde. Ein Primer ist fähig, als Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn er unter Bedingungen eingesetzt wird, bei denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang komplementären Primer-Verlängerungsproduktes induziert wird, d. h. in Gegenwart von Nukleotiden und einem induzierenden Agens, wie z.B. DNA-Polymerase bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert. Der Primer ist für eine maximale Wirksamkeit bei der Amplifikation insbesondere einzelsträngig. Der Primer muss genügend lang sein, um in Gegenwart des induzierenden Agens die Synthese des Verlängerungsproduktes zu initiieren. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Reaktions-T emperatur und der Primerquelle und der Anwendung des Verfahrens. Beispielsweise beträgt die Länge der Oligonukleotid-Primer bei diagnostischen Anwendungen je nach Komplexität der Zielsequenz zwischen 5 bis 100 Nukleotide, insbesondere 6 bis 40 und besonders bevorzugt 7 bis 30 Nukleotide. Kurze Primer-Moleküle erfordern im allgemeinen für Ausübung ihrer Primer-Funktion niedrigere Reaktions-Temperaturen, um genügend stabile Komplexe mit der Matrize zu bilden, oder höhere Konzentrationen anderer Reaktionskomponenten, beispielsweise von DNA- Polymerasen, so dass eine ausreichende Verlängerung von gebildeten Primer-Matrizen- Komplexen erfolgen kann.
Die hier verwendeten Primer sind so ausgewählt, das sie "im Wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen zu amplifizierenden Sequenz sind. Das bedeutet, dass die Primer genügend komplementär sein müssen, um mit ihren betreffenden Strängen zu hybridisieren und eine Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Somit braucht die Primersequenz beispielsweise nicht die genaue Sequenz der Zielsequenz wiederzuspiegeln. Zum Beispiel kann ein nicht-komplementäres Nukleotidfragment an dem 5'-Ende des Primers angeheftet sein, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem Strang ist. In einer anderen Ausführungsform können einzelne nicht-komplementäre Basen oder längere nicht komplementäre Sequenzen in einem Primer eingefügt sein, vorausgesetzt, dass die Primersequenz eine genügend große Komplementarität mit der zu amplifizierenden Sequenz des Stranges aufweist, um damit zu hybridisieren und so ein Primer-Matrizen-Komplex fähig zur Synthese des Verlängerungsproduktes zu erzeugen.
Im Rahmen der enzymatischen Synthese eines zu Matrize komplementären Stranges wird ein Primer-Verlängerungsprodukt erzeugt, was vollständig zum Matrizen-Strang komplementär ist.
Tm-Schmelztemperatur
Als Schmelztemperatur eines komplementären oder partiell komplementären Doppelstranges wird im Allgemeinen ein Messwert einer Reaktionstemperatur verstanden, bei welchem ca. die Hälfte der Stränge als Doppelstrang vorliegt und die andere Hälfte als Einzelstrang vorliegt. Das System (Assoziation und Dissoziation von Strängen) befindet sich im Gleichgewicht.
Aufgrund einer Vielzahl von Faktoren, welche die Tm eines Doppelstranges beeinflussen können (z.B. Sequenzlänge, CG-Gehalt der Sequenz, Puffer-Bedinungen, Konzentration von divalenten Metal-Kationen etc.) sollte die Bestimmung der Tm einer zu amplifizierenden Nukleinsäure unter gleichen Bedinungen erfolgen, wie die beabsichtigte Amplifikationsreaktion.
Wegen der Abhängigkeit der messbaren Schmelztemperatur von multiplen Reaktions-Parametern, z.B. von jeweiligen Puffer-Bedingungen und jeweiligen Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer, wird unter der Schmelztemperatur ein Wert verstanden, welcher in gleichem Reaktionspuffer gemessen wurde wie die exponentielle Amplifikation, bei Konzentrationen von beiden komplementären Komponenten eines Doppelstranges von etwa 0,1 pmol/l bis etwa 10 pmol/l, insbesondere in Konzentration von etwa 0,3 pmol/ bis ca. 3 pmol/l, insbesondere bei ca. 1 pmol/l. Bei dem jeweiligen Wert der Schmelztemperatur handelt sich um einen Richtwert, welcher mit der Stabilität eines jeweiligen Doppelstranges korreliert.
Desoxyribonukleosid-Triphosphate
Die Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und TTP (oder dUTP, oder dUTP/TTP-Gemisch) werden in adäquaten Mengen zum Synthesegemisch gegeben. In bestimmten Ausführungsformen können zusätzlich zu dNTPs mindestens eine weitere Art von dNTP-Analoga zum Synthesegemisch zugegeben werden. Diese dNTP-Analoga umfassen in bestimmten Ausführungsformen beispielsweise eine charakteristische Markierung (z.B. Biotin oder Fluoreszenzfarbstoff), die in den Nukleinsäurestrang eingebaut werden kann. In einer anderen Ausführungsform umfassen diese dNTP-Analoga mindestens eine Modifikation von Zucker- Phosphat-Anteil des Nukleotids, z.B. alpha-Phosphorothioat-2'-Desoxyribonukleosid- Triphosphate (oder andere Modifikationen, welche einem Nukleinsäurestrang eine Nuklease- Resistenz verleihen), 2',3'-Dideoxy-Ribonukleosid-Triphosphate, Azyklo-Nukleosid-Triphosphate (oder andere zur Termination einer Synthese führende Modifikationen). In bestimmten Ausführungsformen umfassen diese dNTP-Analoga mindestens eine Modifikation von Nukleobase, z.B. Iso-Cytosine, Iso-Guanosine (oder auch andere Modifikationen der Nukleobasen des erweiterten genetischen Alphabets), 2-Amino-Adenosine, 2-Thiouridine, Inosine, 7-deazy- adenosine, 7-deaza-guanosine, 5-Me-Cytosine, 5-Propyl-Uridine, 5-Propyl-Cytosine (oder auch andere Modifikationen von Nukleobasen, welche gegenüber natürlichen Nukleobasen durch eine Polymerase eingebaut werden können und zur Änderung der Strang-Stabilität führen). In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein dNTP-Analog sowohl eine Modifikation der Nukleobase als auch eine Modifikation des Zucker-Phosphat-Anteils. In bestimmten Ausführungsformen wird statt mindestens eines natürlichen dNTP-Substrates mindesten eine weitere Art von dNTP-Analoga zum Synthesegemisch zugegeben.
Das die Nukleinsäure-Synthese induzierende Agens kann ein Enzym oder ein System sein, das so wirkt, dass dadurch die Synthese der Primer-Verlängerungsprodukte bewirkt wird.
Geeignete Enzyme für die erste Amplifikation für diesen Zweck umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DNA-Polymerasen wie z.B. Bst Polymerase und ihre Modifikationen, Vent Polymerase und andere - insbesondere hitzestabile DNA-Polymerasen, die den Einbau der Nukleotide in der korrekten Weise ermöglichen, wodurch die Primer-Verlängerungsprodukte gebildet werden, die zu jedem synthetisierten Nukleinsäurestrang komplementär sind. Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet dann in 5'- Richtung entlang des Matrizenstranges fort, bis die Synthese beendet ist oder unterbrochen wird.
Insbesondere werden matrizenabhängige, zur Strangverdrängung fähige DNA-Polymerasen in der ersten Amplifikation verwendet. Dazu zählen beispielsweise das große Fragment der Bst Polymerase oder ihre Modifikationen (z.B. Bst 2.0 DNA Polymerase), das Klenow Fragment, Vent exo minus Polymerase, Deepvent exo minus DNA Polymerase, das große Fragment der Bsu DNA Polymerase, und das große Fragment der Bsm DNA Polymerase.
In bestimmten Ausführungsformen werden insbesondere Polymerasen eingesetzt, welche keine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität aufweisen, bzw. keine 5'-3'-FEN-Aktivität aufweisen.
Für die zweite Amplifikation werden insbesondere thermostabile matrizenabhängige DNA- Polymerasen verwendet. Beispielsweise Taq-Polymerase oder ihre Modifikationen (z.B. Ampli- Taq), oder Polymerasen mit Proofreading Funktion: Pfu und ihre Modifikationen oder Vent Polymerase und ihre Modifikationen. Es können Polymerasen verwendet werden, welche zur Erhöhung ihrer Prozessivität mit einem anderen Protein fusioniert worden sind, z.B. Phusion Polymerase. Eine Vielzahl von Polymerasen ist kommerziell erhältlich.
Auch Kombinationen von Polymerasen können verwendet werden, z.B. ist OneTaq-Polymerase (NEB) eine Kombination aus einer Taq-Polymerase und Vent-Polymerase. Solche Kombinationen von Polymerasen können zu höheren Synthese-Genauigkeit bei der zweiten Amplifikation beitragen.
In bestimmten Ausführungsformen werden mindestens zwei verschiedene Polymerasen eingesetzt, beispielsweise Polymerasen, welche zu Strangverdrängung fähig sind, und solche, welche eine 3'-5'-Proofreading Aktivität aufweisen.
In besonderen Ausführungsformen werden Polymerasen mit einer Hotstart-Funktion eingesetzt, welche erst beim Erreichen einer bestimmten Temperatur ihre Funktion entfalten können.
Das erste Amplifikations-System umfasst die zur Ausführung einer spezifischen ersten Amplifikation notwendigen Komponenten: das erste Primer-Oligonukleotid, das zweite Primer- Oligonukleotid, das Controller-Oligonukleotid sowie die erste Polymerase.
Im Weiteren können dazu auch Nukleotid-Gemische und Puffer-Systeme zählen, soweit sie für die Ausführung einer spezifischen ersten Amplifikation notwendig sind (z.B. spezielle Puffer-Systeme für die erste Polymerase).
Das erste Amplifikations-System unterstützt die Synthese des ersten Amplifikations-Fragmentes
1.1 (bzw. des ersten Amplifikations-Produktes 1.1 , auch als die zu amplifizierende Nukleinsäurekette der ersten Amplifiktion bezeichnet) während der ersten Amplifikation (auch als erste Teil-Amplifikation genannt).
Das zweite Amplifikations-System umfasst die zur Ausführung der spezifischen zweiten Amplifikation notwendigen Komponenten: das dritte Primer-Oligonukleotid, das vierte Primer- Oligonukleotid sowie die zweite Polymerase.
Im Weiteren können dazu auch Nukleotid-Gemische und Puffer-Systeme zählen, soweit sie für die Ausführung einer spezifischen zweiten Amplifikation notwendig sind (z.B. spezielle Puffer-Systeme für die zweite Polymerase).
Das zweite Amplifikations-System unterstützt Synthese des zweiten Amplifikations-Fragmentes
2.1 (bzw. des zweiten Amplifikations-Produktes 2.1 ) während der zweiten Amplifikation (auch als zweite Teil-Amplifikation genannt).
Erstes Primer-Oligonukleotid: (Komponente des ersten Amplifikations-Systems)
Das erste Primer-Oligonukleotid (Fig. 12 bis 16) umfasst einen ersten Primer-Bereich und einen zweiten Bereich. Der erste Primer-Bereich ist in der Lage, an eine im Wesentlichen komplementäre Sequenz innerhalb der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder ihrerÄquivalente zu binden und eine Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Der zweite Bereich umfasst einen Polynukleotid- Schwanz, welcher in der Lage ist, ein Controller-Oligonukleotid zu binden und damit eine räumliche Nähe zwischen dem Controller-Oligonukleotid und den anderen Teilen des ersten Primer- Verlängerungsproduktes zu bewirken, welche ausreichend ist, um eine Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid zu initiieren. Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids umfasst weiterhin mindestens eine Modifikation (eine Nukleotid-Modifikation oder eine nicht- Nukleotid-Modifikation), welche die Polymerase am Kopieren des Polynukleotid-Schwanzes hindert, indem die Fortführung der Polymerasen-abhängigen Synthese gehemmt wird. Diese Modifikation ist beispielsweise am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid lokalisiert. Der erste Primer-Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides ist folglich durch eine Polymerase kopierbar, so dass eine komplementäre Sequenz zu diesem Bereich während der (weiter unten ausführlich erläuterten) Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes von der Polymerase erzeugt werden kann. Der Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides wird insbesondere durch die Polymerase nicht kopiert. In bestimmten Ausführungsformen wird dies durch die Modifikation im zweiten Bereich erreicht, welche die Polymerase vor dem Polynukleotid- Schwanz stoppt. In bestimmten Ausführungsformen wird dies durch Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich erreicht, wobei der gesamte Polynukleotid-Schwanz im Wesentlichen aus solchen Nukleotid-Modifikationen besteht und somit für die Polymerase unkopierbar ist.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein jedes erstes Primer-Oligonukleotid spezifisch für je eine zu amplifizierende Nukleinsäure.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein jedes erstes Primer-Oligonukleotid spezifisch für mindestens zwei der zu amplifizierenden Nukleinsäuren, welche jeweils im Wesentlichen unterschiedliche Sequenzen umfassen.
In bestimmten Ausführungsformen ist das erste Primer-Oligonukleotid mit einem charakteristischen Marker markiert, z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. TAMRA, Fluoreszein, Cy3, Cy5) oder einem Affinitätsmarker (z.B. Biotin, Digoxigenin) oder einem zusätzlichen Sequenzfragment, z.B. zur Bindung einer spezifischen Oligonukleotid-Sonde für Detektion oder Immobilisierung oder zur Barcode-Markierung.
Ein erstes Primer-Oligonukleotid wird insbesondere in der ersten Amplifikation als Primer verwendet.
In bestimmten Ausführungsformen kann es sowohl in der ersten als auch in der zweiten Amplifikation als Primer verwendet werden.
Zweites Primer-Oligonukleotid: (Komponente des ersten Amplifikations-Systems)
Ein Oligonukleotid, welches mit seinem 3'-Segment in der Lage ist, an eine im Wesentlichen komplementäre Sequenz innerhalb der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder ihrer Äquivalente zu binden und eine spezifische zweite Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Dieses zweite Primer-Oligonukleotid ist somit in der Lage, an das 3 '-Segment eines ersten spezifischen Primer- Verlängerungsproduktes des ersten Primer-Oligonukleotids zu binden und eine Polymerase abhängige Synthese eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes zu initiieren.
Die Länge des zweiten Primer-Oligonukleotids kann zwischen 15 und 100 Nukleotiden liegen, insbesondere zwischen 20 und 60 Nukleotiden, insbesondere zwischen 30 und 50 Nukleotiden.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein jedes zweite Primer-Oligonukleotid spezifisch für je eine zu amplifizierende Nukleinsäure.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein jedes zweite Primer-Oligonukleotid spezifisch für mindestens zwei der zu amplifizierenden Nukleinsäuren, welche jeweils unterschiedliche Sequenzen umfassen.
In bestimmten Ausführungsformen ist das zweite Primer-Oligonukleotid mit einem charakteristischen Marker markiert, z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. TAMRA, Fluoreszein, Cy3, Cy5) oder einem Affinitätsmarker (z.B. Biotin, Digoxigenin) oder einem zusätzlichen Sequenzfragment, z.B. zur Bindung einer spezifischen Oligonukleotid-Sonde für Detektion oder Immobilisierung oder zur Barcode-Markierung.
Ein zweites Primer-Oligonukleotid wird insbesondere in der ersten Amplifikation als Primer verwendet. In bestimmten Ausführungsformen kann es sowohl in der ersten als auch in der zweiten Amplifikation als Primer verwendet werden.
Primer-Verlängerungsprodukt
Ein Primer-Verlängerungsprodukt (auch Primer-Extensionsprodukt genannt) entsteht durch enzymatische (Polymerase-abhängige) Verlängerung eines Primer-Oligonukleotides als Ergebnis einer matrizenabhängigen Synthese, welche durch eine Polymerase katalysiert wird.
Ein Primer-Verlängerungsprodukt umfasst die Sequenz des Primer-Oligonukleotids in seinem 5'- Segment und die Sequenz des Verlängerungsproduktes (auch Extensions-Produkt genannt), welches durch eine Polymerase in matrizenabhängiger Form synthetisiert wurde. Das durch die Polymerase synthetisierte Verlängerungsprodukt ist komplementär zum Matrizenstrang, an welchem es synthetisiert wurde.
Ein spezifisches Primer-Verlängerungsprodukt (z.B. P1 .1-Ext und P2.1 -Ext) der ersten Amplifikation (Hauptprodukt) umfasst Sequenzen der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette. Es ist Ergebnis einer spezifischen Synthese bzw. einer korrekten Ausführung einer beabsichtigten Primer-Verlängerungsreaktion bei welcher die spezifisch zu amplifizierende Nukleinsäurekette als Matrize dient. In einer besonderen Ausführungsform stimmt die Sequenz der synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte mit der zu erwartenden Sequenz einer zu amplifizierenden Nukleinsäure komplett überein. In einer anderen Ausführungsform können Abweichungen in der erhaltenen Sequenz von der theoretisch zu erwartenden Sequenz toleriert werden. In bestimmten Ausführungsformen liegt das Ausmaß der Übereinstimmung der erhaltenen Sequenz infolge einer Amplifikation mit der Sequenz der theoretisch zu erwartenden zu amplifizierenden Nukleinsäure beispielsweise zwischen 90 % und 100 %, insbesondere liegt die Übereinstimmung bei über 95 %, idealerweise liegt die Übereinstimmung über 98 % (gemessen am Anteil der synthetisierten Basen).
Die Länge des Verlängerungsproduktes eines spezifischen Primer-Verlängerungsproduktes kann zwischen 10 und 300 Nukleotiden, insbesondere zwischen 10 und 180 Nukleotiden liegen, insbesondere zwischen 20 und 120 Nukleotiden, insbesondere zwischen 30 und 80 Nukleotiden.
In der zweiten Amplifikation stellen beispielsweise Produkte einer spezifischen matrizenabhängigen Primer-Verlängerungsreaktion des dritten und des vierten Primers die Hauptprodukte bzw. die Zwischen-Produkte dar: das partielle dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext Teil 1 , Fig. 15 - 18), bzw. das vollständige Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext, Fig. 15 - 18), das partielle vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext Teil 1 , Fig. 15 - 18), bzw. das vollständige Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext, Fig. 15 - 18). Diese Produkte umfassen in bestimmten Ausführungsformen eine Zielsequenz oder ihre Äquivalente. In einer anderen Ausführungsform umfasst das zweite Primer-Verlängerungsprodukt eine Zielsequenz und das erste Primer-Verlängerungsprodukt Äquivalente der Zielsequenz, nämlich den komplementären Strang. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das vierte Primer-Verlängerungsprodukt eine Zielsequenz und das dritte Primer-Verlängerungsprodukt Äquivalente der Zielsequenz, nämlich den komplementären Strang. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das vierte Primer- Verlängerungsprodukt Anteile einer Zielsequenz und das dritte Primer-Verlängerungsprodukt Äquivalente dieser Anteile der Zielsequenz, nämlich den komplementären Strang.
Das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext) und das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) stellen zusammen das erste Amplifikations-Fragment 1 .1 (auch als Amplifikations- Produkt 1.1 bezeichnet) der ersten Amplifikation dar (Fig. 1 ).
Das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext) und das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) stellen zusammen das zweite Amplifikations-Fragment 2.1 (auch als das zweite Amplifikations-Produkt 2.1 bezeichnet) der zweiten Amplifikation dar (Fig. 1 ).
Das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext) kann auch als vollständiges drittes Primer- Verlängerungsprodukt bezeichnet werden. Dieses Produkt entsteht unter Verwendung des vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1-Ext) als Matrize. Das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) kann auch als vollständiges viertes Primer-Verlängerungsprodukt bezeichnet werden. Dieses Produkt entsteht unter Verwendung des dritten Primer-Verlängerungsproduktes (P3.1 -Ext) als Matrize (Fig. 15 - 18).
Im Gegensatz dazu steht ein partielles drittes Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext-Teil 1 ), welches unter Verwendung des zweiten Primr-Verlängerungsproduktes (P2.1 -Ext) als Matrize als Zwischenprodukt generiert wird. Das partielle vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext-Teil 1 ) wird unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungproduktes (P1 .1-Ext) als Matrize als Zwischenprodukt generiert (Fig. 15 - 18).
Ein unspezifisches Primer-Verlängerungsprodukt (Nebenprodukt) umfasst beispielsweise Sequenzen, welche als Ergebnis einer unspezifischen bzw. inkorrekten bzw. nicht beabsichtigten Primer-Verlängerungsreaktion entstanden sind. Diese schließen beispielsweise Primer- Verlängerungsprodukte ein, welche als Folge eines falschen Initiierungs-Ereignisses (falsches Priming) oder als Folge anderer Nebenreaktionen, einschließlich Polymerase-abhängigen Sequenzveränderungen wie Basen-Substitution, Deletion etc., entstanden sind. Das Ausmaß an Sequenzabweichungen von unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukten übersteigt im Allgemeinen die Fähigkeit von Controller-Oligonukleotiden, solche doppelsträngigen Nebenprodukte erfolgreich von ihren Matrizen zu verdrängen, so dass die Amplifikation von solchen Nebenprodukten langsamer verläuft oder vollständig ausbleibt. Das Ausmaß der Akzeptanz bzw. die Toleranzgrenze zu Abweichungen sind abhängig beispielsweise von Reaktionstemperatur und Art und Weise der Sequenabweichung. Beispiele für unspezifische Primer-Verlängerungsprodukte bilden Primer-Dimere oder Sequenzvarianten, welche nicht der zu amplifizierenden Nukleinsäure entsprechen, z.B. Sequenzen, welche keine Zielsequenz umfassen.
Die Beurteilung einer hinreichenden Spezifität der Amplifikation hängt häufig mit der Aufgabenstellung zusammen. In vielen Amplifikationsverfahren kann ein gewisses Maß der Unspezifität der Amplifikationsreaktion toleriert werden, solange das gewünschte Ergebnis erreicht werden kann. In einer besonderen Ausführungsform beträgt der Anteil von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten am Gesamtergebnis der Reaktion mehr als 1 %, insbesondere mehr als 10 %, insbesondere mehr als 30 % gemessen an der Gesamtmenge der neusynthetisierten Stränge.
Die zu amplifizierende Nukleinsäure (zu erwartendes Ergebnis der ersten Amplifikation)
Die zu amplifizierende Nukleinsäure stellt eine Nukleinsäurekette dar, welche sequenzspezifisch oder zumindest vorwiegend sequenzspezifisch mit Hilfe der ersten Amplifikation unter Einsatz von Primern und Controller-Oligonukleoid durch die Polymerase amplifiziert werden soll. Die zu amplifizierende Nukleinsäure umfasst beide Stränge des ersten Amplifikations-Fragments 1 .1 (auch als erstes Amplifikations-Produkt 1.1 bezeichnet) (Fig. 1 ). Sie kann als Start- Nukleinsäurekette 2.1 verwendet werden, wobei mindestens eines ihrer Stränge zur Initiierung der zweiten Amplifikation verwendet werden kann.
Die Länge der zu amplifizierenden Nukleinsäure kann zwischen 20 und 300 Nukleotiden, insbesondere zwischen 30 und 200 Nukleotiden liegen, insbesondere zwischen 40 und 150 Nukleotiden, insbesondere zwischen 50 und 100 Nukleotiden.
Die zu amplifizierende Nukleinsäurekette kann eine oder mehrere Zielsequenzen oder ihre Äquivalente umfassen. Weiterhin kann eine zu amplifizierende Nukleinsäure die im Wesentlichen zu einer Zielsequenz komplementären Sequenzen umfassen, welche mit ähnlicher Effizienz wie eine Zielsequenz in einer Amplifikationsreaktion vermehrt werden und die Zielsequenz oder ihre Abschnitte umfassen. Zusätzlich zu einer Zielsequenz kann die zu amplifizierende Nukleinsäure weitere Sequenzsegmente einschließen, beispielsweise Primer-Sequenzen, Sequenzen mit Primer-Bindungsstellen und /oder Sequenzsegmente für Bindung von Detektions-Sonden, und / oder Sequenzsegmente für Sequenz-Kodierung von Strängen durch Barcode-Sequenzen und / oder Sequenzsegmente für Bindung an eine feste Phase. Die Primer-Sequenzen oder ihre Sequenzanteile, sowie Primer-Bindungsstellen oder ihre Sequenzanteile können beispielsweise zu Sequenzabschnitten einer Zielsequenz gehören.
In bestimmten Ausführungsformen entspricht die zu amplifizierende Nukleinsäure der Zielsequenz.
In einer anderen Ausführungsform bildet die Zielsequenz einen Teil der Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette der ersten Amplifikation. Eine solche Zielsequenz kann von 3'- Seite und / oder von 5'-Seite von weiteren Sequenzen flankiert sein. Diese weiteren Sequenzen können beispielsweise Bindungsstellen für Primer oder ihre Anteile umfassen, und / oder Primer- Sequenzen oder ihre Anteile umfassen, und/ oder Bindungsstellen für Detektions-Sonden umfassen, und / oder Adaptor-Sequenzen für komplementäre Bindung an eine feste Phase (z.B. Im Rahmen von Microarrays, oder Bead-basierten Analysen) umfassen und / oder Barcoding- Sequenzen für eine digitale Signatur von Sequenzen umfassen.
Damit die Amplifikation starten kann, muss zu Beginn der Reaktion eine Nukleinsäurekette in das Reaktionsgemisch gegeben werden, welche als initiale Matrize für die Synthese der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette auftritt. Diese Nukleinsäurekette wird als Start- Nukleinsäurekette bezeichnet. Diese Start-Nukleinsäurekette gibt die Anordnung einzelner Sequenz-Elemente vor, welche für die Bildung / Synthese / exponentielle Amplifikation einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette von Bedeutung sind.
In einer besonderen Ausführungsform entspricht die initiale Matrize (Start-Nukleinsäurekette), welche einer Amplifikationsreaktion zu Beginn zugeführt wird, bzw. welche in das Reaktionsgemisch gegeben wird, der Sequenz-Zusammensetzung der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette.
In anfänglichen Stadien der Amplifikatons-Reaktion und in ihrem weiteren Verlauf binden die jeweiligen Primer an die entsprechenden Bindungsstellen in der Start-Nukleinsäurekette und initiieren die Synthese von spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten. Solche spezifischen Primer-Verlängerungsprodukte akkumulieren im Verlauf der Amplifikation in exponentieller Art und Weise und übernehmen zunehmend die Rolle von Matrizen für die Synthese komplementärer Primer-Verlängerungsprodukte bei einer exponentiellen Amplifikation.
Durch die wiederholten Matrizen-abhängigen Synthese-Vorgänge im Rahmen einer exponentiellen Amplifikation wird somit die zu amplifizierende Nukleinsäurekette gebildet.
Gegen Ende einer Amplifikationsreaktion kann das Hauptprodukt der Reaktion (die zu amplifizierende Nukleinsäure) vorwiegend einzelsträngig sein oder vorwiegend einen komplementären Doppelstrang bilden. Dies kann beispielsweise durch die relativen Konzentrationen von beiden Primern und entsprechende Reaktionsbedingungen bestimmt werden.
Äquivalente der zu amplifizierenden Nukleinsäure umfassen Nukleinsäuren mit im Wesentlichen identischen Informationsgehalt. Beispielsweise haben komplementäre Stränge einer zu amplifizierenden Nukleinsäure identischen Informationsgehalt und können als äquivalent bezeichnet werden.
Zielsequenz
Eine Zielsequenz ist in bestimmten Ausführungsformen ein Segment einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette, welches als charakteristische Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure dienen kann. Diese Zielsequenz kann als Marker für die Anwesenheit oder Abwesenheit einer anderen Nukleinsäure dienen. Diese andere Nukleinsäure dient somit als Quelle der Zielsequenz und kann beispielsweise eine genomische DNA oder RNA oder Teile der genomischen DNA oder RNA (z.B. mRNA), oder Äquivalente der genomischen DNA oder RNA eines Organismus sein (z.B. cDNA, modifizierte RNA wie rRNA, tRNA, microRNA etc.), oder definierte Veränderungen der genomischen DNA oder RNA eines Organismus umfassen, beispielsweise Mutationen (z.B. Deletionen, Insertionen, Substitutionen, Additionen, Sequenzvermehrung, z.B. Repeat- Vermehrung im Rahmen von Mikrosatellit-Instabilität), Splice-Varianten, Rearrangement-varianten (z.B. T-Zell-Rezeptor Varianten) usw. Die einzelnen Zielsequenzen können für ein phänotypisches Merkmal stehen, beispielsweise für Antibiotika-Resistenz oder prognostische Information haben und somit für diagnostische Assays / Tests von Interesse sein. Als Quelle / Ursprung einer Zielsequenz kann eine solche Nukleinsäure beispielsweise die Zielsequenz als Sequenz-Element ihres Stranges umfassen. Eine Zielsequenz kann somit als charakteristischer Marker für einen bestimmten Sequenzinhalt einer anderen Nukleinsäure dienen.
Die Zielsequenz kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Sie kann mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure der ersten Amplifikation im Wesentlichen identisch sein oder nur einen Teil der zu amplifizierenden Nukleinsäure darstellen.
Äquivalente der Zielsequenz umfassen Nukleinsäuren mit im Wesentlichen identischen Informationsgehalt. Beispielsweise haben komplementäre Stränge einer Zielsequenz identischen Informationsgehalt und können als äquivalent bezeichnet werden, RNA und DNA Varianten einer Sequenz sind ebenfalls Beispiele für äquivalenten Informationsgehalt.
Im Rahmen der Material-Vorbereitung vor Amplifikations-Reaktion kann eine solche Zielsequenz aus ihrer ursprünglichen Sequenzumgebung isoliert werden und für die Amplifikationsreaktion vorbereitet werden.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst eine zu amplifizierende Nukleinsäure eine Zielsequenz. In bestimmten Ausführungsformen entspricht die Zielsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst eine Start- Nukleinsäurekette 1 .1 eine Zielsequenz. In bestimmten Ausführungsformen entspricht die Zielsequenz einer Start-Nukleinsäurekette 1 .1
Die Zielsequenz kann vollständig oder teilweise während der ersten Amplifikation als Teil des ersten Amplifikations-Fragmenten 1 .1 umfasst werden. Dabei umfasst beispielsweise das zweite Primer-Verlängerungsprodukt die Zielsequenz oder ihre Anteile und das zweite Primer- Verlängerungsprodukt umfasst somit den zu dieser Zielsequenz komplementären Strang. Dieser Strang hat einen äquivalenten Informationsgehalt.
Die Zielsequenz kann vollständig oder teilweise während der zweiten Amplifikation als Teil des zweiten Amplifikations-Fragmenten 2.1 umfasst werden. Dabei umfasst beispielsweise das vierte Primer-Verlängerungsprodukt die Zielsequenz oder ihre Anteile und das dritte Primer- Verlängerungsprodukt umfasst somit den zu dieser Zielsequenz komplementären Strang. Dieser Strang hat einen äquivalenten Informationsgehalt.
Start-Nukleinsäurekete
Damit die erste Amplifikation starten kann, muss zu Beginn der Reaktion eine Nukleinsäurekette in das Reaktionsgemisch gegeben werden, welche als initiale Matrize für die Synthese der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette auftritt (Fig. 1 ). Diese Nukleinsäurekette wird als Start- Nukleinsäurekette der ersten Amplifikation (Start-Nukleinsäurekette 1.1 ) bezeichnet. Diese Start- Nukleinsäurekette gibt die Anordnung einzelner Sequenz-Elemente vor, welche für die Bildung / Synthese / exponentielle Amplifikation einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette von Bedeutung sind.
Eine solche Start-Nukleinsäurekette kann einzelsträngig oder doppelsträngig zu Beginn der Reaktion vorliegen. Wenn die komplementären Stränge der Start-Nukleinsäurekette voneinander getrennt sind, können die Stränge unabhängig davon, ob die Nukleinsäure ursprünglich doppel- oder einzelsträngig vorlag, als Matrize für die Synthese von spezifischen komplementären Primer- Verlängerungsprodukte dienen.
Die Start-Nukleinsäurekette 1 .1 umfasst in bestimmten Ausführungsformen eine Zielsequenz.
Eine Start-Nukleinsäurekette umfasst weiterhin zumindest ein vorwiegend einzelsträngiges Sequenzsegment, zu welchem mindestens eines der Primer des Amplifikations-Systems mit seinem 3'-Segment vorwiegend komplementär binden kann, so dass die verwendete Polymerase einen solchen Primer, wenn hybridisiert an die Start-Nukleinsäurekette, matrizenspezifisch unter Einbau von dNTPs verlängern kann.
Die Start-Nukleinsäurekette kann auch Segmente umfassen, welche nicht die Zielsequenz sind, welche aber Primer binden können.
Damit die zweite Amplifikation starten kann, muss zu Beginn der zweiten Amplifikationsreaktion eine Nukleinsäurekette im Reaktionsgemisch vorhanden sein oder da hineingegeben werden, welche als initiale Matrize für die Synthese des zweiten Amplifikations-Fragments auftritt (Fig. 1 ). Diese Nukleinsäurekette wird als Start-Nukleinsäurekette der zweiten Amplifikation (Start- Nukleinsäurekette 2.1 ) bezeichnet. Diese Start-Nukleinsäurekette 2.1 gibt die Anordnung einzelner Sequenz-Elemente vor, welche für die Bildung / Synthese / exponentielle Amplifikation einer zu amplifizierenden Nukleinsäurkette von Bedeutung sind.
Hier dient das während der ersten Amplifikation generierte erste Amplifikations-Fragment 1.1 (auch als die zu amplifizierende Nukleinsäurekette bezeichnet) als Start-Nukleinsäurekette 2.1 für die zweite Amplifikation. Diese Start-Nukleinsäurekette 2.1 umfasst somit das in der ersten Amplifikation erzeugte erste Primer-Verlängerungsprodukt, oder sie besteht daraus. Die Start- Nukleinsäurekette 2.1 umfasst in bestimmten Ausführungsformen eine Zielsequenz.
PCR-Amplifikation (auch als zweite Amplifikation genannt)
PCR ist eine Polymerase-Ketten-Reaktion, welche im Allgemeinen zur Amplifikation von DNA Fragmenten dient. Viele Varianten einer PCR-Reaktion sind in der Fachwelt bekannt. Unter anderem eine allel-spezifische PCR, Genotyping-PCR, eine assymetrische PCR, eine Fest-Phase- PCR, eine digital-PCR (Partitioning / Mikrotröpfchen PCR), Multiplex PCR, Real-Time PCR unter Verwendung von Sonden oder interkallierenden Farbstoffen (z.B. Molekular-Beacons oder 5'-3'- Exonuklease oder zwei-Oligonukleotid-Sonden mit FRET-Paaren), Clamping-PCR unter Verwendung von blockierenden Sonden, quantitative PCR, Nested-PCR etc. Ein Fachmann wird auf die zahlreichen Reviews verwiesen, welche einzelne PCR-Verfahren beschreiben.
Im Allgemeinen erfolgt während einer PCR eine Vermehrung von Nukleinsäurefragmenten, welche durch die Primer-Position definiert sind. Dabei werden im Allgemeinen mindestens zwei Temperatur-Bereiche verwendet: ein Temperatur-Bereich mit niedriger Temperatur zu Bindung von Primern an ihre vorwiegend spezifischen Sequenzsegmente und Verlängerung unter Ausbildung eines komplementären Strange und mindestens ein Temperatur-Bereich, bei welchen eine vorwiegend sequenz-unselektive Trennung von Strängen erfolgt, so dass sich frisch synthetisierte Primer-Verlängerungsprodukte von ihren Matrizen trennen.
Viele Techniken wurden entwickelt, um auf den Verlauf der PCR Einfluss zu nehmen, z.B. Hotstart- Polymerasen, Hotstart-Oligonukleotide, aktivierbare Primer (z.B. mittels eines 3'-5'-Proofreading Aktivität von Polymerasen).
PCR kann in Flüssig-Phase unter Verwendung von PCR-Reagenzgefäßen / Mikrotiter-Platten durchgeführt werden oder an einer festen Phase oder in Mikrofluidic-Systemen oder auch in-situ.
PCR-Primer-Paar (das dritte und das vierte Primer-Oligonukleotid)
(Komponenten der zweiten Amplifikation)
Umfasst in der Regel zwei Oligonukleotide, welche in der Lage sind, Amplifikation eines Nukleinsäurefragments mittels eines PCR-Verfahren zu unterstützen. Im Allgemeinen umfasst ein PCR-Primer-Paar ein drittes und ein viertes Primer-Oligonukleotid. Solche Primer sind in der Fachwelt bekannt.
Zur besseren Übersichtlichkeit, werden hier PCR Primer im Allgemeinen als P3 und P4 bezeichnet (im Gegensatz zu einer Controller-Abhäbgigen Amplifikation P1 und P2).
Viele Varianten von PCR-Primern sind einem Fachmann bekannt. In der Regel sind es Oligonukleotide mit einer Länge von ca. 15 bis ca. 60 Nukleotiden, welche mindestens in ihrem 3'- Segment Sequenzen umfassen, welche in der Lage sind an komplementäre Segmente einer Zielsequenz zu binden und unter Verwendung dieser Zielsequenz als Matrize eine matrizenabhängige Synthese mittels einer Polymerase zu iniziieren.
Viele weitere Funktionalitäten, wie Farbstoff-Markierung (z.B. mit FAM, TAMRA, Cy5), oder Quenchen (z.B. BHQ1 ), Affinitäts-Markierung (z.B. Biotin, Digoxigenin), oder von zusätzlichen Sequenzen z.B. für Sequenz-Barcoding (Verwendung von Spezifischen Tag-Sequenzen) oder Verwendung von Sequenzen zu Bibliothek-Erstellung sind einem Fachmann bekannt. PCR-Primer können in Lösung verwendet werden oder auch gekoppelt an eine feste Phase (z.B. Beads, Mikrititer-Platten). Auch diese Varianten sind einem Fachmann gut bekannt.
Controller-Oligonukleotid:
Das Controller-Oligonukleotid (Fig. 1 , C1 .1 ) ist eine einzelsträngige Nukleinsäurekette, welche eine vordefinierte im Wesentlichen komplementäre Sequenz in einem Teil des ersten Primer- Verlängerungsprodukts einschließt, welches im Rahmen der Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäure spezifisch generiert wird (erste Amplifikation). Dadurch kann das Controller- Oligonukleotid an das erste Primer-Oligonukleotid und mindestens an das 5'-Segment des spezifischen Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär binden. Das Controller-Oligonukleotid umfasst in seinem inneren Sequenzsegment in bestimmten Ausführungsformen Nukleotid-Modifikationen, welche die Polymerase daran hindern, einen komplementären Strang unter Verwendung des Controller-Oligonukleotides als Matrize zu synthetisieren, wenn das erste und / oder das dritte Primer-Oligonukleotid an das Controller-Oligonukleotid komplementär gebunden ist. In bestimmten Ausführungsformen ist es vorteilhaft, wenn das Controller-Oligonukleotid vollständig aus modifizierten Nukleotiden besteht, welche seine Matrizenfunktion blockieren. In bestimmten Ausführungsformen ist es vorteilhaft, wenn das Controller-Oligonukleotid nur zum Teil aus modifizierten Nukleotiden besteht, welche seine Matrizenfunktion blockieren. Das Controller-Oligonukleotid ist weiterhin in der Lage, unter den gewählten Reaktionsbedingungen das zweite spezifische Primer-Verlängerungsprodukt vollständig oder teilweise aus der Bindung mit dem ersten spezifischen Primer- Verlängerungsprodukt via Strangverdrängung zu verdrängen. Dabei lagert sich das Controller- Oligonukleotid mit seinen komplementären Bereichen an das erste spezifische Primer- Verlängerungsprodukt an. Bei erfolgreicher Bindung zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem ersten spezifischen Primer-Verlängerungsprodukt führt dies zu Wiederherstellung eines einzelsträngigen Zustandes des 3'-ständigen Segments des zweiten spezifischen Primer- Verlängerungsproduktes, welches für die Bindung des ersten Primer-Oligonukleotides geeignet ist, so dass eine neue Primer-Verlängerungsreaktion stattfinden kann. Während der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes kann das Controller-Oligonukleotid aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mittels Strangverdrängung beispielsweise durch Polymerase und/oder durch das zweite Primer-Oligonukleotid getrennt werden.
Detektions-System:
Ein Detektionssystem umfasst mindestens eine Oligonukleotid-Sonde und mindestens einen Fluoreszenz-Reporter (ein Fluorophor). Das Detektionssystem soll in der Lage sein, die Synthese des ersten und / oder des zweiten und / oder des dritten und / oder des vierten Primer- Verlängerungproduktes (P1 1-Ext, P2.1-Ext, P3.1 -Ext, P4.1 -Ext) zu erfassen. Dies geschieht durch Verwendung von Oligonukleotid-Sonden, welche in der Lage sind, an das jeweilige Primer- Verlängerungsprodukt zu binden und dabei ein spezifisches Signal zu generieren, bzw. eine Änderung des Signals herbeizuführen. Diese Änderung kann dabei eine Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenzintensität sein. Ein Detektions-System kann weiterhin zusätzliche Komponenten umfassen. Zu solchen Komponenten gehören insbesondere Fluoreszenzquencher und/oder Donor-Fluorophor. Weiterhin kann das Detektions-System auch das Controller-Oligonukleotid umfassen. Die Anordnung von Fluoreszenz-Reporter, Fluoreszenz-Quencher, Donor-Fluorophor an der Oligonukleotid-Sonde oder an dem Paar umfassend Oligonukleotid-Sonde und Controller- Oligonukleotid ermöglicht es, die Bindungsereignisse an das erste Primer-Verlängerungsprodukt zu erfassen.
Fluoreszenz-Reporter
Ein Fluorophor ist eine chemische Verbindung bzw. ein Molekül, welches bei Anregung durch elektromagnetische Strahlung in der Lage ist, eine elektromagnetische Strahlung (Licht) abzugeben (Emission). Diese vom Fluorophor abgegebene Strahlung (Emission) kann als Fluoreszenzsignal mit geeigneten technischen Mitteln erfasst werden. Ein solcher Reporter kann an einem Oligonukleotid kovalent gebunden werden. Viele Fluorophore sind bekannt, welche an Oligonukleotide gekoppelt werden können (z.B. FAM, TAMRA, HEX, ROX, Cy- Farbstoffe, Alexa- Farbstoffe)
Fluoreszenz-Quencher
Ein Quencher ist eine chemische Verbindung / ein Molekül, welches in der Lage ist durch direkten Kontakt (contact quenching) oder durch Energie-Übertragung (z.B. als FRET), die Emission eines Fluorophores zu verringern. In der Regel muss ein Quencher in eine räumliche Nähe zum Fluorophor gebracht werden, damit diese Signal-Minderung im signifikanten Ausmaß erfolgen kann. Vorteilhaft für eine deutliche Signal-Minderung eines Fluoreszenzreporters durch einen Quencher sind Distanzen zwischen dem Reporter und Quencher von weniger als 25 Nukleotiden, insbesondere von weniger als 15 Nukleotiden, insbesondere von weniger als 5 Nukleotiden.
Zur Überwindung einer Signal-Minderung eines Fluoreszenzreporters durch einen Quencher muss die Distanz zwischen diesen Komponenten entsprechend vergrößert werden, vorteilhaft ist dabei wenn die Distanz zwischen dem Reporter und Quencher von auf mehr als 15 Nukleotide, insbesondere auf mehr als 20 Nukleotide, insbesondere auf mehr als 40 Nukleotide vergrößert wird. In diesem Fall muss die durch die Nukleotidsequenz bewirkte Entfernung auf eine ausgestreckte Nukleotidsequenz zurückzuführen sein. Wenn sich beispielsweise Hairpin- Strukturen bilden, ist die räumliche Entfernung möglicherweise nicht mehr gegeben.
Besonders bei FRET-basierten Quenchern ist eine hinreichende spektrale Überlappung zwischen dem Emissions-Spektrum eines Fluorophores und dem Absorbtionsspektrum eines Quenchers vorteilhaft. Daher werden Fluorophor-Quencher-Paare bevorzugt, welche mehr als 25% spektrale Überlappung aufweisen. (z.B. FAM / TAMRA).
Donor-Fluorophore
Donor-Fluorophore sind chemische Verbindungen / Moleküle, welche in der Lage sind, elektromagnetische Strahlung zu absorbieren und durch Energie-Übertragung (z.B. als FRET) auf ein anderes Fluorophor (Akzeptor) dermassen zu übertragen, dass dieses Fluorophor angeregt wird und als Folge davon selbst Licht-Emission generiert. Bei der Emission wird ein Fluoreszenz- Signal generiert. In der Regel bilden Donor und Akzeptor ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer-Paar (ein FRET-Paar). In der Regel muss ein Donor in eine räumliche Nähe zum Akzeptor (Fluorophor) gebracht werden, damit diese Signal-Generierung im signifikanten Ausmaß erfolgen kann.
Vorteilhaft für Signal-Generierung eines Fluoreszenzreporters infolge eines FRET von einem Donor-Fluorophor sind Distanzen zwischen dem Reporter und Donor von weniger als 25 Nukleotiden, insbesondere von weniger als 15 Nukleotiden, insbesondere von weniger als 5 Nukleotiden.
Die Aufhebung der FRET-Wirkung vom Donor zum Akzeptor wird in der Regel durch Vergrößerung der Distanz zwischen beiden Partnern eines FRET-Paares erreicht. Vorteilhaft ist dabei wenn die Distanz zwischen dem Reporter und Donor auf mehr als 15 Nukleotide, insbesondere auf mehr als 20 Nukleotide, insbesondere auf mehr als 40 Nukleotide vergrößert wird.
Weiterhin ist in der Regel eine hinreichende spektrale Überlappung zwischen dem Emissions- Spektrum eines Donors und dem Absorbtionsspektrum eines Akzeptors vorteilhaft. Daher werden FRET-Paare bevorzugt, welche mehr als 25% in spektraler Überlappung aufweisen (z.B. FAM / Cy3). Erfindungsgemäß wird die räumliche Entfernung zwischen den einzelnen Komponenten insbesondere dadurch bewirkt, dass zwei Komponenten über eine Nukleotidsequenz verbunden sind, die mit einem bestimmten Teil der Zielsequenz hybridisieren kann.
Strangverdrängung (Strand Displacement):
Hiermit wird ein Vorgang bezeichnet, welcher durch Einwirkung eines geeigneten Mittels zu einer vollständigen oder partiellen Trennung eines ersten Doppelstranges (bestehend beispielsweise aus A1 und B1 -Strang) führt, und zur gleichzeitigen / parallelen Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges, wobei mindestens einer der Stränge (A1 oder B1 ) an der Ausbildung dieses neuen zweiten Stranges beteiligt ist. Man kann hier zwei Formen der Strangverdrängung unterscheiden.
In einer ersten Form der Strangverdrängung kann die Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges unter Verwendung eines bereits existierenden komplementären Stranges erfolgen, welcher zu Beginn der Reaktion im Allgemeinen in einzelsträngiger Form vorliegt. Dabei wirkt das Mittel der Strangverdrängung (beispielsweise ein vorgebildeter einzelsträngiger Strang C1 , welcher eine komplementäre Sequenz zum Strang A1 aufweist, auf den ersten bereits ausgebildeten Doppelstrang (A1 und B1 ) und geht mit dem Strang A1 eine komplementäre Bindung ein, wodurch der Strang B1 aus der Bindung mit dem Strang A1 verdrängt wird. Falls die Verdrängung des B1 vollständig abläuft, so ist das Ergebnis der C1 -Wirkung ein neuer Doppelstrang (A1 :C1 ) und ein einzelsträngiger Strang B1. Falls die Verdrängung von B1 unvollständig abläuft, so hängt das Ergebnis von mehreren Faktoren ab. Beispielsweise kann ein Komplex aus partiell doppelsträngigen A1 :B1 und A1 :C1 als Zwischenprodukt vorliegen.
In einer zweiten Form der Strangverdrängung kann die Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges unter einer gleichzeitig ablaufenden enzymatischen Synthese des komplementären Stranges erfolgen, wobei ein Strang des ersten vorgebildeten Doppelstranges als Matrize für die Synthese durch die Polymerase auftritt. Dabei wirkt das Mittel der Strangverdrängung (beispielsweise Polymerase mit einer Strangverdrängungs-Fähigkeit), auf den ersten bereits vorgebildeten Doppelstrang (A1 und B1 ) und synthetisiert einen zu Strang A1 neuen komplementären Strang D 1 , wobei gleichzeitig der Strang B1 aus der Bindung mit dem Strang A1 verdrängt wird.
Unter dem Begriff„nukleinsäurevermittelte Strang-Verdrängung" wird eine Summe / Reihe von Zwischenschritten zusammengefasst, welche untereinander im Gleichgewicht stehen können, und im Ergebnis zur vorübergehenden oder dauerhaften Öffnung eines ersten vorgeformten Duplex (bestehend aus komplementären Strängen A1 und B1 ) und Ausbildung eines neuen zweiten Duplex (bestehend aus komplementären Strängen A1 und C1 ), wobei A1 und C1 einander komplementär sind.
Es ist bekannt, dass eine wesentliche strukturelle Voraussetzung für die Initiierung einer Strangverdrängung die Herbeiführung einer räumlichen Nähe zwischen einem Duplex-Ende (vorgeformter erster Duplex aus A1 und B1 ) und einem einzelsträngigen Strang (C1 ) ist, welcher die Strangverdrängung initiiert (wobei A1 und C1 einen komplementären Strang bilden können). Eine solche räumliche Nähe kann insbesondere mittels eines einzelsträngigen Überhanges (in der Literatur sind Beispiele mit kurzen Überhängen bekannt, im Englischen genannt "Toehold", siehe Literatur oben) herbeigeführt werden, welcher den einzelsträngigen Strang (C1 ) vorübergehend oder dauerhaft komplementär bindet, und somit komplementäre Seqmente des Stranges C1 und A1 in hinreichende Nähe bringt, so dass eine erfolgreiche Strangverdrängung des Stranges B1 initiiert werden kann. Die Effizienz der Initiierung der nukleinsäurevermittelten Strang-Verdrängung ist im Allgemeinen um so höher, je näher die komplementären Segmente des Stranges A1 und C1 zueinander positioniert werden.
Eine weitere wesentliche strukturelle Voraussetzung für die effiziente Fortführung einer nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung in inneren Segmenten liegt in hoher Komplementarität zwischen Strängen (z.B. zwischen A1 und C1 ), welche einen neuen Doppelstrang ausbilden müssen. So können beispielsweise einzelne Nukleotid-Mutationen (in C1 ) zur Unterbrechung einer Strangverdrängung (beschrieben z.B. für Branch-Migration) führen.
Die vorliegende Erfindung macht Gebrauch von der Fähigkeit komplementärer Nukleinsäuren zu einer sequenzabhängigen nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung.
Besondere Ausführungsformen der Erfindung werden in den Figuren und Beispielen näher erläutert.
Einzelne Ausführungformen
Reaktionsbedingungen für erste Amplifikation
Reaktionsbedingungen umfassen unter anderem Puffer-Bedingungen, Temperatur-Bedingungen, Zeitdauer der Reaktion und Konzentrationen von jeweiligen Reaktionskomponenten.
Im Verlauf der Reaktion akkumuliert die Menge der spezifischen produzierten zu amplifizierenden Nukleinsäuren in einer exponentiellen Weise. Die Reaktion umfassend die Synthese der Verlängerungsprodukte kann zur Produktion der gewünschten Menge der spezifischen Nukleinsäuresequenz so lange wie nötig durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird insbesondere kontinuierlich durchgeführt. In bevorzugter Ausführungsform läuft die Amplifikations-Reaktion bei gleicher Reaktionstemperatur ab, wobei die Temperatur insbesondere zwischen 50°C und 70°C liegt. In einer anderen Ausführungsform kann die Reaktions-Temperatur auch variabel gesteuert werden, so dass einzelne Schritte der Amplifikation bei jeweils unterschiedlichen Temperaturen verlaufen.
Die für die exponentielle Amplifikation benötigten Reagenzien sind insbesondere bereits zu Beginn einer Reaktion im gleichen Ansatz vorhanden. In einer anderen Ausführungsform können Reagenzien auch in späteren Stadien des Verfahrens zugegeben werden. Insbesondere werden keine Helicasen oder Recombinasen in der Reaktionsmischung zur Trennung der neu synthetisieren Doppelstränge der zu amplifizierenden Nukleinsäure verwendet.
In einer besonderen Ausführungsform beinhaltet die Reaktionsmischung keine biochemischen Energie-spendenden Verbindungen wie ATP.
Die Menge der zu Beginn der Reaktion vorliegenden zu amplifizierenden Nukleinsäure kann zwischen wenigen Kopien und mehreren Milliarden Kopien in einem Ansatz vorliegen. Bei diagnostischen Einsätzen kann die Menge der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette unbekannt sein.
In der Reaktion können auch weitere, nicht zu amplifizierende Nukleinsäuren vorliegen. Diese Nukleinsäuren können von natürlicher DNA oder RNA oder ihren Äquivalenten abstammen. In bestimmten Ausführungsformen liegen Kontroll-Sequenzen im gleichen Ansatz vor, welche parallel zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure ebenfalls amplifiziert werden sollen.
Insbesondere wird ein molarer Überschuss von ungefähr 103: 1 bis ungefähr 1015: 1 (Verhältnis Primer:Matrize) der eingesetzten Primer und des Controller-Oligonukleotides zu der Reaktionsmischung gegeben, welche Matrizen-Stränge für die Synthese der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette umfasst.
Es kann die Menge der Zielnukleinsäuren nicht bekannt sein, wenn das erfindungsgemäße Verfahren in diagnostischen Anwendungen benutzt wird, so dass die relative Menge des Primers und des Controller-Oligonukleotides bezüglich des komplementären Stranges nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Die Menge des zugefügten Primers wird im Allgemeinen im molaren Überschuss bezüglich der Menge des komplementären Stranges (Matrize) vorhanden sein, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch von komplizierten langkettigen Nukleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuss wird bevorzugt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern.
Die verwendeten Konzentrationen von Primer-1 , Primer-2 und Controller-Oligonukleotide liegen beispielsweise in Bereichen zwischen 0,01 pmol/l und 100 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und 100 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und 50 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und 20 pmol/l. Die hohe Konzentration von Komponenten kann die Geschwindigkeit der Amplifikation erhöhen. Die jeweiligen Konzentrationen einzelner Komponenten können unabhängig von einander variiert werden, um das gewünschte Reaktionsergebnis zu erzielen.
Die Konzentration von Polymerase liegt in Bereichen zwischen 0,001 pmol/l und 50 pmol/l, insbesondere zwischen 0,01 pmol/l und 20 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und 10 pmol/l.
Die Konzentration von einzelnen dNTP-Substraten liegt in Bereichen zwischen 10 pmol/l und 10 mmol/l, insbesondere zwischen 50 pmol/l und 2 mmol/l, insbesondere zwischen 100 pmol/l und 1 mmol/l. Die Konzentration von dNTP kann die Konzentration von divalenten Metal-Kationen beeinflußen. Gegebenenfalls wird diese entsprechend angepasst. Als divalente Metal-Kationen werden beispielsweise Mg2+ verwendet. Als entsprechendes Anion können beispielsweise CI, Acetat, Sulfat, Glutamat etc. verwendet werden.
Die Konzentration von divalenten Metal-Kationen wird beispielsweise an den für die jeweilige Polymerase optimalen Bereich angepasst und umfasst Bereiche zwischen 0,1 mmol/l und 50 mmol/l, besser zwischen 0,5 mmol/l und 20 mmol/l, bevorzugter zwischen 1 mmol/l und 15 mmol/l.
Die enzymatische Synthese erfolgt im Allgemeinen in einer gepufferten wässrigen Lösung. Als Puffer-Lösungen können gelöste konventionelle Puffer-Substanzen, wie Tris-HCI, Tris-Acetat, Kalium-Glutamat, HEPES-Puffer, Natrium-Glutamat in gängigen Konzentrationen verwendet werden. Der pH-Wert dieser Lösungen liegt üblicherweise zwischen 7 und 9,5, insbesondere etwa bei 8 bis 8,5. Die Puffer-Bedingungen können beispielsweise nach Empfehlung des Herstellers der verwendeten Polymerase angepasst werden.
Weitere Substanzen, wie sogenannte Tm-Depressoren (z.B. DMSO, Betaine, TPAC) etc. können zum Puffer zugegeben werden. Solche Substanzen verringern die Schmelztemperatur („Tm- Depressoren“) von Doppelsträngen und können somit einen positiven Einfluss auf die Öffnung von Doppelsträngen haben. Auch Polymerase-stabilisierende Komponenten, wie Tween 20 oder T riton 100 können in üblichen Mengen zum Puffer zugegeben werden. EDTA oder EGTA kann zu Komplexierung von Schwermetallen in konventionellen Mengen zugegeben werden. Polymerase stabilisierende Substanzen, wie Trehalose oder PEG 6000 können ebenfalls zum Reaktionsgemisch zugegeben werden.
Insbesondere enthält die Reaktionsmischung keine Inhibitoren der Strangverdrängungsreaktion und keine Inhibitoren einer Polymerasen-abhängigen Primer-Verlängerung.
In bestimmten Ausführungsformen enthält die Reaktionsmischung DNA-bindende Farbstoffe, insbesondere interkalierenden Farbstoffe, wie z.B. EvaGreen oder SybrGreen. Solche Farbstoffe können ggf. die Detektion der Neubildung von Nukleinsäureketten ermöglichen.
Die Reaktionsmischung kann weiterhin Proteine bzw. andere Substanzen enthalten, welche beispielsweise aus einem Original-Material stammen und welche die Amplifikation nicht beeinflussen.
Besondere Ausführungsformen von Reaktionsbedingungen
Die Temperatur hat einen wesentlichen Einfluss auf die Stabilität der Doppelstränge.
In einer besonderen Ausführungsform werden während der Amplifikationsreaktion keine Temperaturbedinungen verwendet, welche im Wesentlichen zur Trennung von Doppelsträngen der zu amplifizierenden Nukleinsäure in Abwesenheit von Controller-Oligonukleotid führen. Damit soll sichergestellt werden, dass die Doppelstrang-Trennung von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten von Anwesenheit des Controller-Oligonukleotides im gesamten Verlauf der Amplifikation abhängig ist. Bei Temperatur etwa in Höhe von der gemessenen Schmelztemperatur (Tm) der zu amplifizierenden Nukleinsäure kommt es zu einer spontanen Trennung von beiden Strängen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, so dass der Einfluss des Controller-Oligonukleotids auf die Trennung von synthetisierten Strängen und somit auf die Sequenzspezifität der Amplifikation minimal bis begrenzt ist.
Bei einer exponentiellen Amplifikation, welche weniger sequenzspezifisch (d.h. wenig Controller- Oligonukleotid-abhängig) ablaufen muss, kann die Reaktionstemperatur beispielsweise um die Schmelztemperatur (d.h. Tm plus / minus 3° bis 5°C) der zu amplifizierenden Nukleinsäure liegen. Bei einer solchen Temperatur können Sequenzunterschiede zwischen Controller-Oligonukleotid und dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt im Rahmen einer Strangverdrängungsreaktion im Allgemeinen gut toleriert werden.
Auch im Temperatur-Bereich von ca. (Tm minus 3° C) bis ca. (Tm minus 10°C) kann es immer noch zu einer spontanen Strangtrennung von synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten kommen, obwohl mit geringerer Effizienz. Der Einfluss von Controller-Oligonukleotid auf die Sequenzspezifität der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist höher als bei Temperaturbedingungen um die Schmelztemperatur (Tm) der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette.
Zwar findet die Strangtrennung mit sinkender Reaktionstemperatur im Wesentlichen dank Interaktion des neusynthetisierten Doppelstranges mit Controller-Oligonukleotid statt. Allerdings können Duplexe aus Primer bei Verlängerungstemperatur unter den genannten Bedingungen auch spontan zerfallen, d.h. ohne sequenzabhängige Strangverdrängung durch Controller- Oligonukleotid. Beispielsweise liegt die Reaktionstemperatur bei einer vermindert sequenzspezifischen Amplifikation in Bereichen zwischen ca. (Tm minus 3°C) und ca. (Tm minus 10°C), insbesondere zwischen ca. (Tm minus 5°C) und ca. (Tm minus 10°C). Bei einer solchen Temperatur werden Sequenzunterschiede zwischen Controller-Oligonukleotid und dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt im Rahmen einer Strangverdrängungsreaktion schlechter toleriert.
Eine hohe Sequenzspezifität der Amplifikation des Verfahrens wird vor allem dann erreicht, wenn die neu synthetisierten Stränge der zu amplifizierenden Nukleinsäure unter Reaktionsbedinungen nicht spontan in Einzelstränge dissoziieren können. In einem solchen Fall spielt die sequenzspezifische Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleoid für eine sequenzspezifische Strangtrennung eine entscheidende Rolle und ist für die Sequenzspezifität der Amplifikatonsreaktion maßgeblich verantwortlich. Dies kann im Allgemeinen erreicht werden, wenn die Reaktionstemperatur deutlich unter der Schmelztemperatur von beiden Strängen der zu amplifizierenden Nukleinsäure liegt und keine weiteren Komponenten für eine Strangtrennung verwendet werden, beispielsweise keine Helicasen oder Recombinasen. Beispielsweise liegt die Reaktionstemperatur bei einer sequenzspezifischen Amplifikation in Bereichen zwischen ca. (Tm minus 10°C) und ca. (Tm minus 50°C), insbesondere zwischen ca. (Tm minus 15°C) und ca. (Tm minus 40°C), insbesondere zwischen ca. (Tm minus 15°C) und ca. (Tm minus 30°C). In einer besonderen Ausführungsform der Amplifikation wird die maximale Reaktions-Temperatur im Verlauf der gesamten Amplifikationsreaktion nicht über die Schmelztemperatur der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette erhöht.
In bestimmten Ausführungsformen der Amplifikation kann die Reaktionstemperatur über die Schmelztemperatur der zu amplifizierenden Nukleinsäurketten mindestens einmal erhöht werden. Die Erhöhung der Temperatur kann beispielsweise zu Beginn der Amplifikationsreaktion erfolgen und zur Denaturierung von Doppelsträngen einer genomischen DNA führen. Dabei muss beachet werden, dass während eines solchen Schrittes die Abhängigkeit der Doppelstrang-Trennung von der Wirkung des Controller-Oligonukleotides aufgehoben ist oder zumindest signifikant reduziert ist.
Die Reaktionstemperaturen der einzelnen Schritte der Amplifikationsreaktion können im Bereich von ca. 15°C bis ca. 85°C, besser im Bereich von ca. 15°C bis ca. 75°C, insbesondere im Bereich von ca. 25°C bis ca. 70°C liegen.
In den nachfolgend beschriebenen Beispielen 2 und 3 wurde eine Reaktionstemperatur der Amplifikationsreaktion von 65°C verwendet, wobei die Tm der zu amplifizierenden Nukleinsäuren zwischen ca. 75°C und ca. 80°C lag. Somit war der Doppelstrang der zu amplifizierenden Nukleinsäure unter Reaktionsbedingungen stabil und die Amplifikationsreaktion sequenzspezifisch.
Im Allgemeinen kann die Reaktionstemperatur für jeden einzelnen Reaktionsschritt optimal eingestellt werden, so dass für jeden Reaktionsschritt eine solche Temperatur herbeigeführt wird. Die Amplifikationsreaktion umfasst somit eine sich wiederholende Änderung von Temperaturen, welche zyklisch wiederholt werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden Reaktionsbedingungen für mehrere Reaktionsschritte vereinheitlicht, so dass die Anzahl von Temperatur-Schritten geringer ist als die Anzahl von Reaktionsschritten. In einer solchen besonderen Ausführungsform der Erfindung erfolgt mindestens einer der Schritte der Amplifikation bei einer Reaktionstemperatur, welche sich von der Reaktionstemperatur anderer Schritte der Amplifikation unterscheidet. Die Reaktion verläuft somit nicht isothermal, sondern die Reaktionstemperatur wird zyklisch geändert.
Es werden beispielsweise während Amplifikation mindestens zwei Temperatur-Bereiche verwendet, welche abwechselnd herbeigeführt werden (zyklische Änderung von Temperaturen zwischen einzelnen Temperatur-Bereichen). In bestimmten Ausführungsformen umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 25°C und 60°C, insbesondere zwischen 35°C und 60°C, insbesondere zwischen 50°C und 60°C und der obere Temperatur- Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 60°C und 75°C, insbesondere zwischen 60°C und 70°C.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 15°C und 50°C, insbesondere zwischen 25°C und 50°C, insbesondere zwischen 30°C und 50°C und der obere Temperatur-Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 50°C und 75°C, insbesondere zwischen 50°C und 65°C.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 15°C und 40°C, insbesondere zwischen 25°C und 40°C, insbesondere zwischen 30°C und 40°C und der obere Temperatur-Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 40°C und 75°C, insbesondere zwischen 40°C und 65°C.
Die Temperatur kann im jeweiligen Bereich konstant gehalten werden oder als Temperatur- Gradient (abfallend oder aufsteigend) geändert werden.
Weitere Erläuterungen zu Temperatur-Einstellungen werden in folgenden Abschnitten bei Ausführungsformen im Einzelnen angeführt.
Jede herbeigeführte Temperatur kann eine gewisse Zeit aufrechterhalten werden, so dass dabei ein Inkubations-Schritt resultiert. Das Reaktionsgemisch kann somit während einer Amplifikation bei einer ausgewählten Temperatur eine gewisse Zeit inkubiert werden. Diese Zeit kann unterschiedlich lange für den jeweiligen Inkubations-Schritt sein und kann sich an den Fortschritt der jeweiligen Reaktion bei gegebener Temperatur richten (z.B. Primer-Verlängerung oder Strangverdrängung usw.). Die Zeit eines Inkubationsschrittes kann folgende Bereiche umfassen: zwischen 0,1 sec und 10.000 sec, insbesondere zwischen 0,1 sec und 1000 sec, insbesondere zwischen 1 sec und 300 sec, insbesondere zwischen 1 sec und 100 sec.
Durch eine solche Temperatur-Änderung können einzelne Reaktionsschritte insbesondere bei einer ausgewählten Temperatur ausgeführt werden. Dadurch können Ausbeuten von einem jeweiligen Reaktionsschritt verbessert werden. Innerhalb eines Synthese-Zyklus kann Temperatur- Änderung bzw. Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Temperatur-Bereichen ggf. mehrmals herbeigeführt werden. Ein Synthese-Zyklus kann somit mindestens einen Temperatur-Wechsel umfassen. Ein solcher Temperatur-Wechsel kann beispielsweise in einem PCR-Gerät / Thermocycler routinemäßig als zeitliches Programm ausgeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird ein Amplifikationsverfahren bevorzugt, bei welchem mindestens einer der Schritte, welche Strangverdrängung umfassen, und mindestens einer der Schritte, welche Primer-Verlängerungsreaktionen umfassen, gleichzeitig bzw. parallel stattfinden und unter gleichen Reaktionsbedingungen erfolgen. In einer solchen Ausführungsform kann beispielsweise eine Primer-Verlängerungsreaktion von mindestens einem Primer-Oligonukleotid (z.B. vom ersten Primer-Oligonukleotid) insbesondere bei Temperaturbedinungen im unteren Temperatur-Bereich erfolgen. Hingegen erfolgt die Strangverdrängung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukletid und die eine weitere Primer-Verlängerungsreaktion (z.B. vom zweiten Primer-Oligonukleotid) insbesondere im Reaktionsschritt im oberen Temperatur-Bereich.
In bestimmten Ausführungsformen wird ein Amplifikationsverfahren bevorzugt, bei welchem mindestes eines der Schritte, welche Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid umfassen und mindestens eines der Schritte, welche Primer-Verlängerungsreaktion umfassen, bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt. In einer solchen Ausführungsform können beispielsweise Primer-Verlängerungsreaktionen von mindestens einem Primer-Oligonukleotid (z.B. vom ersten Primer-Oligonukleotid und / oder von zweiten Primer-Oligonukleotid) insbesondere bei Temperaturbedinungen im unteren Temperatur-Bereich erfolgen. Hingegen erfolgt die Strangverdrängung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukletid insbesondere im Reaktionsschritt im oberen Temperatur-Bereich.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform verlaufen sämltliche Schritte einer Amplifikatons- Reaktion unter gleichen Reaktionsbedingungen.
In einer solchen Ausführungsform kann das Amplifikationsverfahren unter isothermalen Bedingungen durchgeführt werden, d.h. dass keine Temperaturänderungen für die Ausführung des Verfahrens erforderlich sind. In einer solchen besonderen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die gesamte Amplifikationsreaktion unter konstanter Temperatur, d.h. die Reaktion ist isothermal. Die Zeit einer solchen Reaktion umfasst beispielsweise folgende Bereiche: zwischen 100 sec und 30.000 sec, insbesondere zwischen 100 sec und 10.000 sec, insbesondere zwischen 100 sec und 1000 sec.
Im Abschnitt „Beispiele“ wird gezeigt, dass es möglich ist, Strukturen einzelner Reaktionskomponenten und entsprechende Reaktionsschritte dermassen aneinander abzustimmen, dass eine isothermale Reaktion möglich ist.
Die Summe aller Verfahrens-Schritte, welche zu einer Verdoppelung der Menge einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette führt, kann als Synthese-Zyklus bezeichnet werden. Ein solcher Zyklus kann entsprechend isothermal ablaufen oder auch durch Änderungen der Temperatur in seinem Verlauf gekennzeichnet sein. Die Temperatur-Änderungen können sich von Zyklus zu Zyklus wiederholen und identisch gestaltet werden.
Besonders vorteilhaft sind Amplifikationsverfahren, bei welchen die maximal erreichbare Temperatur eine Strang-Trennung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukleotid nur dann im Wesentlichen zulässt, wenn mehr als 5 Nukleotide des dritten Bereichs des Controller- Oligonukleotides eine komplementäre Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt eingehen können, insbesondere wenn mehr als 10, insbesondere wenn mehr als 20 Nukleotide des Controller-Oligonukleotides mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt eine Bindung eingehen. Im Allgemeinen gilt, je länger die erforderliche Bindung zwischen Controller- Oligonukleotid und dem komplementären Strang des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, bevor die synthetisierten Stränge unter Reaktionsbedinungen dissoziieren, desto spezifischer ist die Amplifikations-Reaktion. Im Einzelnen, kann durch Verlängerung bzw. Verkürzung des dritten Abschnittes des Controller-Oligonukleotides das gewünschte Maß an Spezifität ermittelt werden.
Ein Verfahrensschritt kann bei seiner Wiederholung bei konstanter Temperatur erfolgen über die Gesamt-Dauer des Verfahrens oder auch bei unterschiedlichen Temperaturen. Einzelne Verfahrensschritte können jeweils hintereinander durch Zugabe von einzelnen Komponenten ausgeführt werden. Bei einer besonderen Ausführungsform liegen sämtliche für die Ausführung einer Amplifikation notwendige Reaktions-Komponenten zu Beginn einer Amplifikation in einem Reaktionsgemisch vor.
Der Start einer Amplifikations-Reaktion kann durch Zugabe einer Komponente erfolgen, z.B. durch Zugabe einer Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (z.B. eine Start-Nukleinsäurekette), oder einer Polymerase oder divalenten Metal-Ionen, oder auch durch Herbeiführung von Reaktions-Bedingungen, welche für die Amplifikation notwendig sind, z.B. Einstellung einer erforderlichen Reaktionstemperatur für einen oder mehrere Verfahrenschritte.
Die Amplifikation kann so lange ausgeführt werden, bis die gewünschte Menge an zu amplifizierender Nukleinsäure erreicht ist. In einer anderen Ausführungsform wird die Amplifikationsreaktion über eine Zeit ausgeführt, welche bei Vorliegen einer zu amplifizierenden Nukleinsäure ausgereicht hätte, um eine ausreichende Menge zu bekommen. In einer anderen Ausführungsform wird die Amplifikationsreaktion über eine hinreichede Anzahl von Synthese- Zyklen (Verdoppelungszeiten) ausgeführt, welche bei Vorliegen einer zu amplifizierenden Nukleinsäure ausgereicht hätte, um eine ausreichende Menge zu bekommen.
Die Reaktion kann durch verschiedene Eingriffe gestoppt werden. Beispielsweise durch Änderung der Temperatur (z.B. Abkühlen oder Erhitzen, wobei beispielsweise Polymerase in ihrer Funktion gestört wird) oder durch Zugabe einer Substanz, welche eine Polymerase-Reaktion stoppt, z.B. EDTA oder Formamid.
Im Anschluss an die Amplifikation kann die amplifizierte Nukleinsäurekette für weitere Analysen verwendet werden. Dabei können synthetisierte Nukleinsäureketten durch verschiedene Detektionsverfahren analysiert werden. Beispielsweise können fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonden verwendet werden oder Sequenzierungsverfahren (Sanger-Sequenzierung oder Next-Generation Sequenzierung), fest-Phasen-Analysen wie Microarray oder Bead-Array- Analysen usw. Die synthetisierte Nukleinsäurekette kann als Substrat / Matrize in weiteren Primer- Verlängerungsreaktionen verwendet werden.
In einer besonderen Ausführungsform wird der Fortschritt der Synthese-Reaktion während der Reaktion überwacht. Das kann beispielsweise durch Einsatz von interkalierenden Farbstoffen erfolgen, z.B. Sybrgreen oder Evagreen, oder unter Einsatz von markierten Primern (z.B. Lux- Primer oder Scorpion-Primer) oder unter Einsatz von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid- Sonden.
Die Detektion der Veränderung der Fluoreszenz während der Amplifikation wird in einem Detektions-Schritt des Verfahrens umgesetzt. Dabei kann die Temperatur und die Dauer dieses Schrittes an die jeweiligen Erfordernisse der Oligonukleotid-Sonde angepasst werden. Die Temperaturen des Detektioins-Schrittes umfassen beispielsweise Bereiche zwischen 20°C und 75°C, insbesondere zwischen 40 und 70°C, insbesondere zwischen 55 und 70°C. Während des Detektionschrittes erfolgt Beleuchtung der Reaktion mit Licht einer Wellenlänge, welche in der Lage in ein verwendetes Fluorophor des Detektions-Systems (ein Donor oder ein Fluoreszenzreporter) anzuregen. Die Signal-Erfassung erfolgt in der Regel parallel zu Anregung, wobei das spezifische Fluoreszenzsignal detektiert wird und seine Intensität quantifiziert wird.
Das Amplifikationsverfahren kann zur Überprüfung der Anwesenheit einer Zielnukleinsäurekette in einem biologischen Material oder einem diagnostischen Material im Rahmen eines diagnostischen Verfahrens eingesetzt werden.
Besondere Ausführungsformen für Reaktionsbedingungen der zweiten Amplifikation
Die Reaktionsbedinungen einer PCR sind einem Fachmann hinreichend bekannt.
Hier sollen daher exemplarisch einige besondere Ausführungsformen dargestellt werden.
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die in Fig. 3 - 1 1 dargestellten Temperaturen folgende Bereiche:
T1 = 55°C (+/- 5°C)
T2 = 65°C (+/- 5°C)
T3 = 95°C (+/- 5°C)
T4 = 45°C (+/- 5°C)
T5 = 70°C (+/- 5°C)
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die in Fig. 3 - 1 1 dargestellten Temperaturen folgende Bereiche:
T1 = 55°C (+/- 10°C)
T2 = 65°C (+/- 10°C)
T3 = 95°C (+/- 10°C)
T4 = 45°C (+/- 10°C)
T5 = 70°C (+/- 10°C)
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die in Fig. 3 - 1 1 dargestellten Temperaturen folgende Bereiche:
T1 = 55°C (+/- 15°C)
T2 = 65°C (+/- 10°C)
T3 = 95°C (+/- 10°C)
T4 = 45°C (+/- 20°C)
T5 = 70°C (+/- 10°C) In bestimmten Ausführungsformen umfassen die in Fig. 3 - 1 1 dargestellten Temperaturen folgende Bereiche:
T1 = 55°C (+/- 5°C)
T2 = 65°C (+/- 3°C)
T3 = 95°C (+/- 10°C)
T4 = 45°C (+/- 5°C)
T5 = 70°C (+/- 3°C)
Die Zeit der Inkubation während einzelner Temperatur-Schritte kann in einigen Ausführngsformen zwischen 0,1 sec und 60 min liegen, insbesondere zwischen 1 sec und 10 min, insbesondere zwischen 1 sec und 5 min.
Die zyklischen Temperatur-Änderungen werden häufig als PCR-Zyklen bezeichnet. Ein PCR- Zyklus umfasst beispielsweise eine komplette Änderung der Temperatur von T1 , T2 auf T3.
Die verwendeten Temperatur-Bereiche sollen vor allem folgende Schritte der zweiten Amplifikation unterstützen:
T1 , T2, T4 und T5 Temperaturen: Hybridisierung des dritten und des vierten Primers an ihre komplementären Segmente in den jeweiligen Matrizensträngen und Verlängerung eines dritten und vierten Primer-Verlängerungsproduktes.
T3 Temperatur dient zur Trennung von Doppelsträngen umfassend zumindest eines der Primer- Verlängerungsprodukte. Bevozugt werden alle als Doppelstrang vorliegenden Nukleinsäureketten (z.B. doppelsträngige Zielsequenzen, erste Amplifikations-Fragmente 1 .1 , zweite Amplifikations- Fragmente 2.1 , sowie Zwischenprodukte, umfassend P1 .1 -Ext und P4.1-Ext-Teil 1 oder P2.1 -Ext und P3.1 -Ext-Teil 1 ) durch Einwirkung der Temperatur in die einzelsträngige Form überführt.
Weiterhin kann T3 Temperatur zur Aktivierung von Hot-Start-Formen der zweiten Polymerasen dienen (z.B. welche durch einen Antikörper inaktiviert Vorlagen) oder zu Inaktivierung einer ersten Polymerase. Weiterhin können thermolabile Controller-Oligonukleotide durch diese Temperatur (T3) gespalten werden. Weiterhin können thermoaktiviertbare Primer drei und vier aktiviert werden.
Somit können zur Reaktions-Kontrolle verschiedene Temperaturen verwendet werden.
Weiterhin kann durch die Wahl von Reaktionstemperaturen in Kombination mit jeweiligen PCR- Primern (der dritte und der vierte Primer der zweiten Amplifikation) die Herstellung von Produkten / Entstehung von Zwischenprodukten während der zweiten Amplifikation beeinflusst werden.
Der Umfang von Ausbeuten an einzelnen Produkten und Zwischenprodukten hängt von mehreren Faktoren ab. Beispielsweise begünstigen höhere Konzentrationen von einzelnen Primern im Allgemeinen die Ausbeuten an Produkten / Zwischenprodukten. Weiterhin kann die Bildung von Produkten / Zwischenprodukten durch die Reaktions-Temperatur sowie die Bindung / Affinität einzelner Reaktionsteilnehmer zu einander beeinflusst werden (Affinität der Bindung einzelner Primer an ihre komplementäre Primerbindungsstellen innerhalb von Matrizensträngen): im Allgemeinen binden beispielsweise längere Oligonukleotide bei höheren Temperaturen besser als kürzere Oligonukleotide, weiterhin kann CG-Gehalt bei komplementären Sequenzsegmenten eine Rolle spielen: CG-reichere Sequenzen binden ebenfalls bei höheren Temperaturen stärker als AT- reiche Sequenzen. Weiterhin können Modifikationen, wie MGB oder 2-Amino-dA oder LNA, die Bindungsstärke von Primern an ihre respektiven komplementären Segmente erhöhen, was ebenfalls in bevorzugter Bindung von Primern bei höheren Temperaturen resultiert.
Beispielsweise werden für die PCR längere Primer verwendet (z.B. zwischen 25 und 60 Nukleotiden, mit einem CG-Gehalt von über 40%), welche mit ihren komplementären Bereichen eine relativ höhere Tm aufweisen (z.B. von 60 - 70°C). Dadurch können Hybridisierungs-Schritte und Primer-Verlängerungsschritte der zweiten Amplifikation bei höheren Temperaturen ausgeführt werden (z.B. T2 oder T5). In Kombination mit relativ kurzen ersten und zweiten Primern (aus der ersten Amplifikation) kann somit die Reaktion dahingehend gesteuert werden, dass Primer- Verlängerungsprodukte P4.1 -Ext und P3.1 -Ext vorrangig gebildet werden und die Co-Amplifikation von Primer-Verlängerungsprodukten ausgehend von P1 .1 und P2.1 während der PCR- Amplifikation weitgehend unterdrückt werden kann.
Bei Verwendung von dritten und vierten Primern, welche beispielsweise nur ein kurzes 3'-Segment umfassen, welches an die Zielsequenz oder ihre Äquivalente binden kann (z.B. dieses Segment ist zwischen 6 und 15 Nukleotiden lang), kann es von Vorteil sein, zunächst einige Zyklen mit einer niedrigen Temperatur auszuführen (Fig. 10 A und B, A2.1 Phase). Eine ähnliche Sitution betrifft auch PCR-Primer, welche beispielsweise Mismatches zu jeweils nur im Wesentlichen komplementären ersten Amplifikations-Fragment 1 .1 umfassen.
Während dieser Phase mit relativ niedrigen Temperaturen (T1 und T4) erfolgt eine Primer-Bindung des dritten und / oder vierten Primers an ihre komplementären Segmente des ersten Amplifikations-Fragments, so dass trotz einer geringen Länge des komplementären Segmentes und / oder vorhandenen Mismatches die Polymerase ausgehend von diesen Primern hybridisiert an einzelne Stränge des ersten Amplifikations-Fragmentes eine matrizenabhängige Primer- Verlängerung ausführen kann und Primer-Verlängerungsprodukte umfassend ein drittes und viertes Primer-Oligonukleotid synthetisiert werden können.
Diese PCR-Zyklen werden mindestens zwei mal wiederholt, so dass auch komplementäre Stränge synthetisiert werden können. Beim Wiederholen der Zyklen werden somit auch der dritte und vierte Primer selbst als Matrizen kopiert, was zur Ausbildung von vollständigen Primerbindungsstellen für das dritte und / oder vierte Primer-Oligonukleotid führt.
Anschließend kann dann eine Erhöhung der Temperatur erfolgen (A2.2 Phase), so dass der dritte und vierte Primer an vollständig ausgebildete Primerbindungsstellen bei höheren Temperatur binden können. Verwendung von höheren Temperaturen (T2 und T5) ist beispielsweise bei homogenen Assays von Vorteil (wenn beide Amplifikations-Systeme im selben Reaktionsansatz vorliegen). Damit kann beispielsweise der Einfluss der Bindung des Controller-Oligonukleotides an komplementäre Bereiche der Zielsequenz des dritten Primer-Verlängerungsprodukts (P3.1 -Ext oder P3.1 -Ext Teil) reduziert werden.
Die enzymatische Synthese erfolgt auch in der zweiten Amplifikation im Allgemeinen in einer gepufferten wässrigen Lösung. Als Puffer-Lösungen können gelöste konventionelle Puffer- Substanzen, wie Tris-HCI, Tris-Acetat, Kalium-Glutamat, HEPES-Puffer, Natrium-Glutamat in gängigen Konzentrationen verwendet werden. Der pH-Wert dieser Lösungen liegt üblicherweise zwischen 7 und 9,5, insbesondere etwa bei 8 bis 8,5. Die Puffer-Bedingungen können beispielsweise nach Empfehlung des Herstellers der verwendeten Polymerase angepasst werden.
Weitere Substanzen, wie sogenannte Tm-Depressoren (z.B. DMSO, Betaine, TPAC) etc. können zum Puffer zugegeben werden. Solche Substanzen verringern die Schmelztemperatur („Tm- Depressoren“) von Doppelsträngen und können somit einen positiven Einfluss auf die Öffnung von Doppelsträngen haben. Auch Polymerase-stabilisierende Komponenten, wie Tween 20 oder T riton 100 können in üblichen Mengen zum Puffer zugegeben werden. EDTA oder EGTA kann zu Komplexierung von Schwermetallen in konventionellen Mengen zugegeben werden. Polymerase stabilisierende Substanzen, wie Trehalose oder PEG 6000 können ebenfalls zum Reaktionsgemisch zugegeben werden.
Besondere Ausführungsformen einer Start-Nukleinsäurekete: für die erste Amplifikation
Die zu Beginn einer Amplifikations-Reaktion eingesetzte bzw. einzusetzende Nukleinsäurekette kann als Start-Nukleinsäurekette bezeichnet werden (Fig. 1 ).
Ihre Funktion kann dahingehend gesehen werden, dass sie die anfängliche Matrize darstellt, welche eine korrekte Positionierung von Primern, der Synthese-Abschnitte zwischen beiden Primern, sowie die Initiierung von Bindungs- und Verlängerungsvorgängen ermöglicht. In einer besonderen Ausführungsform umfasst eine Start-Nukleinsäurekette eine Zielsequenz.
Durch Bindung von Primern an ihre entsprechenden Primer-Bindungsstellen (PBS 1 und PBS 2) und Initiierung von entsprechenden Primer-Verlängerungsreaktionen erfolgt durch Generierung von ersten Primer-Verlängerungsprodukten. Diese werden als spezifische Kopien der zu Beginn der Reaktion vorliegenden Nukleinsäurekette synthetisiert.
In bestimmten Ausführungsformen kann diese in das Reaktionsgemisch vor Beginn der Amplifikatons-Reaktion einzusetzende Nukleinsäurekette (Start-Nukleinsäurekette) mit der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette identisch sein. Durch die Amplifikations-Reaktion wird lediglich die Menge einer solchen Nukleinsäurekette erhöht.
In bestimmten Ausführungsformen unterscheiden sich die zu amplifizierende Nukleinsäure und die Start-Nukleinsäurekette dahingehend, dass die Start-Nukleinsäurekette zwar die Anordnung einzelner Sequenzelemente der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette vorgibt, doch kann die Sequenzzusammensetzung der Start-Nukleinsäurekette von der Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette abweichen. Beispielsweise können im Rahmen der Primer-Bindung und Verlängerung während einer Amplifikation neue Sequenzinhalte (bezogen auf Start- Nukleinsäurekette) in die zu amplifizierende Nukleinsäurekette integriert werden. Weiterhin können sich Sequenzelemente einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette von solchen Sequenzelementen einer Start-Nukleinsäurekette in ihrer Sequenzzusammensetzung unterscheiden (z.B. Primer-Bindungsstellen oder Primer-Sequenzen). Die Start-Nukleinsäure dient nur als initiale Matrize für die spezifische Synthese der zu amplifizierenen Nukleinsäurekette. Diese initiale Matrize kann im Reaktionsgemisch bis zum Ende der Amplifikation verbleiben. Durch den exponentiellen Charakter der Amplifikation überwiegt allerdings die Menge der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette am Ende einer Amplifikationsreaktion gegenüber der Menge einer in die Reaktion zugegebenen Start-Nukleinsäurekette.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Start-Nukleinsäurekette mindestens einen Sequenzabschnitt umfassen, welcher nicht amplifiziert wird. Eine solche Start-Nukleinsäurekette ist somit nicht mit der zu amplifizierenden Sequenz identisch. Solche nicht zu amplifizierenden Abschnitte können beispielsweise als Folge von Sequenz-Vorbereitungsschritten bzw. als Folge von vorangegangenen Sequenz-Manipulations-Schritten einen Sequenzabschnitt einer Start- Nukleinsäurekette repräsentieren.
In einer besonderen Ausführungsform schließt die in das Reaktionsgemisch vor Beginn der Reaktion einzusetzende Start-Nukleinsäurekette mindestens eine Zielsequenz ein.
In bestimmten Ausführungsformen schließt eine solche Start-Nukleinsäurekette mindestens eine Zielsequenz (engl. Target-Sequence) und noch weitere Sequenzen ein, welche nicht Zielsequenz (engl. Non-target Sequences) sind. Während der Amplifikation werden Sequenzsegmente umfassend die Zielsequenz exponentiell vermehrt und andere Sequenzsegmente werden dabei entweder gar nicht oder nur teilweise exponentiell vermehrt.
Aufbau einer Start-Nukleinsäurekete (für die erste Amplifikation)
Ein Beispiel für eine solche Start-Nukleinsäurekette stellt eine Nukleinsäurekette dar, welche eine Zielsequenz einschließt und welche ein Sequenzfragment-A umfasst und ein Sequenzfragment-B umfasst.
Das Sequenzfragment-A der Start-Nukleinsäurekette umfasst eine Sequenz, die mit der Sequenz eines der beiden in der Amplifikation verwendeten Primer eine signifikante Homologie aufweist oder im Wesentlichen mit dem kopierbaren Anteil des 3'-Segments des einen Primers identisch ist. Bei Synthese eines komplementären Stranges zu diesem Segment wird eine komplementäre Sequenz generiert, welche eine entsprechende Primer-Bindungs-Stelle darstellt.
Das Sequenzfragment-B der Start-Nukleinsäurekette umfasst eine Sequenz, welche zur komplementären Bindung eines entsprechenden weiteren Primers oder seines 3'-Segmentes unter Ausbildung eines extensionsfähigen Primer-Matrizen-Komplexes geeignet ist, wobei Sequenzfragment-A und Sequenzfragment-B im Verhältnis zu einander vorwiegend nicht komplementär sind.
In einer besonderen Ausführungsform wird zum Reaktionsgemisch eines Amplifikationsverfahrens eine Start-Nukleinsäurekette gegeben, welche folgende Eigenschaften aufweist:
Insbesondere liegt das Sequenzfragment-A im 5'-Segment der Start-Nukleinsäurekette. Insbesondere bildet dieses Sequenzfragment-A eine Begrenzung des Nukleinsäurekette-Stranges in 5'-Richtung.
Insbesondere liegt das Sequenzfragment-B in 3‘-Richtung, bezogen auf die Bindungsstelle des ersten Primers und bezogen auf die Polarität des ersten Primers („stromabwärts“), vom Sequenzfragment-A.
In einer besonderen Ausführungsform bildet dieses Sequenzfragment-B eine Begrenzung des Nukleinsäurekette-Stranges in 3'-Richtung. In bestimmten Ausführungsformen stellt dieses Sequenzfragment-B keine Begrenzung des Nukleinsäurekette-Stranges in 3'-Richtung dar, sondern wird von weiteren Sequenzen von der 3'-Seite flankiert. Insbesondere sind diese Sequenzen keine Zielsequenzen und nehmen an der exponentiellen Amplifikation nicht teil.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Zielsequenz mindestens eines von beiden Sequenzfragment-A oder Sequenzfragment-B. In bestimmten Ausführungsformen liegt die Zielsequenz zwischen Sequenzfragment-A und Sequenzfragment-B.
In einer Ausführungsform (Fig. 50) kann eine solche Start-Nukleinsäurekette als Matrize für die Synthese eines ersten Primer-Verlängerungsproduktes dienen. Die Start-Nukleinsäurekette kann dabei beispielsweise im Rahmen einer Primer-Verlängerungsreaktion unter Verwendung des zweiten Primer-Oligonukleotides als ein Sequenzsegment einer längeren Ausgangs- Nukleinsäurekette während eines vorbereitenden Schrittes vor der exponentiellen Amplifikation bereitgestellt werden und in eine einzelsträngige Form überführt werden. Die Ausgangsnukleinsäurekette kann beispielsweise eine genomische DNA oder RNA sein und dient als Quelle der Zielsequenz. Die Start-Nukleinsäurekette umfasst im 5'-Segment der Nukleinsäurekette ein Segment 1 , was Sequenzabschnitte des zweiten Primer-Oligonukleotides umfasst und Begrenzung in 5'-Richtung darstellt, ein Segment 2, was eine Zielsequenz oder ihre Anteile umfasst, ein Segment 3, was eine Primerbindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid umfasst und ein Segment 4 was eine nicht-Zielsequenz im 3'-Segment der Start- Nukleinsäurekette lokalisiert ist und somit das Segment 3 auf der 3'-Seite flankiert.
Im Rahmen der Initiierung der Amplifikation kann der erste Primer zumindest mit 3'-Segment seines ersten Bereichs an eine solche Start-Nukleinsäurekette im Segment 3 binden und in Anwesenheit einer Polymerase und Nukleotide entsprechend verlängert werden. Dabei entsteht ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt, welches dem Matrizenstrang der Start-Nukleinsäurekette komplementär ist und in seiner Länge begrenzt ist. Im Rahmen der Amplifikationsreaktion kann ein solches Primer-Verlängerungsprodukt via Controller-Oligonukleotid von seinem Matrizenstrang sequenzspezifisch abgelöst werden, so dass entsprechende Sequenzabschnitte im 3'-Segment des nun synthetisierten ersten Primer-Verlängerungsproduktes als Bindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid zur Verfügung stehen.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst eine Start-Nukleinsäurekette somit folgende Sequenzfragmente (Fig. 50):
• Sequenzsegment-1 (Segment 1 bezeichnet), welches eine Sequenz umfasst, die mit der Sequenz des zweiten Primers eine signifikante Homologie aufweist oder im Wesentlichen mit dem kopierbaren Anteil des 3 '-Segments des zweiten Primers identisch ist. Dieses Sequenzsegment-1 liegt im 5'-Segment der Start-Nukleinsäurekette, insbesondere bildet dieses Sequenzsegment-1 eine Begrenzung des Nukleinsäurekette-Stranges in 5'- Richtung.
• Das Sequenzsegment-3 (Segment 3 bezeichnet), welches eine Sequenz umfasst, welche zu komplementären Bindung des ersten Bereichs des ersten Primers oder seines 3'- Segmentes unter Ausbildung eines extensionsfähigen Primer-Matrizen-Komplexes geeignet ist. Insbesondere liegt das Sequenzsegment-3 in 3‘-Richtung, („stromaufwärts“) vom Sequenzsegment-1 .
• Zielsequenz, welche teilweise oder ganz zwischen Segment 1 und Segment 3 liegt (dieser Anteil der Zielsequenz wird als Segment 2 bezeichnet). In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Zielsequenz das Segment 2, sowie mindestens eines von Segment 1 und / oder Segment 3.
• Optional umfasst die Start-Nukleinsäurekette im 3'-Segment flankierende Sequenzabschnitte (als Segment 4 bezeichnet), welche nicht amplifiziert werden.
In einer weiteren Ausführungsfrom (Fig. 51 ) kann eine Start-Nukleinsäurekette als Matrize für die Synthese eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes dienen.
Die Start-Nukleinsäurekette kann dabei beispielsweise im Rahmen einer Primer- Verlängerungsreaktion unter Verwendung des ersten Primer-Oligonukleotides als ein Sequenzsegment einer längeren Ausgangs-Nukleinsäurekette während eines vorbereitenden Schrittes vor der exponentiellen Amplifikation bereitgestellt werden und in eine einzelsträngige Form überführt werden. Die Ausgangsnukleinsäurekette kann beispielsweise eine genomische DNA oder RNA sein und dient als Quelle der Zielsequenz (schematisch dargestellt als Doppelstrang). Die Start-Nukleinsäurekette umfasst im 5'-Segment der Nukleinsäurekette ein Segment 5, was Sequenzabschnitte des ersten Primer-Oligonukleotides umfasst und Begrenzung in 5'-Richtung darstellt, ein Segment 6, was eine Zielsequenz oder ihre Anteile umfasst, ein Segment 7, was eine Primerbindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid umfasst und ein Segment 8 was eine nicht-Zielsequenz im 3'-Segment der Start-Nukleinsäurekette lokalisiert ist und somit das Segment 7 auf der 3'-Seite flankiert. Im Rahmen der Initiierung der Amplifikation kann der zweite Primer zumindest mit dem 3'-Segment seines ersten Bereichs an eine solche Start-Nukleinsäurekette im Segment 7 binden und in Anwesenheit einer Polymerase und Nukleotide entsprechend bis zu hin zum Stopp-Abschnitt des ersten Primer-Oligonukleotides verlängert werden. Dabei entsteht ein zweites Primer- Verlängerungsprodukt, welches dem Matrizenstrang der Start-Nukleinsäurekette komplementär ist und in seiner Länge begrenzt ist. Im Rahmen der Amplifikationsreaktion kann ein solches Primer- Verlängerungsprodukt via Controller-Oligonukleotid von seinem Matrizenstrang sequenzspezifisch abgelöst werden, so dass entsprechende Sequenzabschnitte im 3'-Segment des nun synthetisierten zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Bindungsstelle für das erste Primer- Oligonukleoid zur Verfügung stehen.
In dieser besonderen Ausführungsform umfasst eine Start-Nukleinsäurekette folgende Sequenzfragmente (Fig. 51 ):
• Sequenzsegment-5 (genannt Segment 5), welches eine Sequenz umfasst, die mit der Sequenz des ersten Bereichs des ersten Primers eine signifikante Homologie aufweist oder im Wesentlichen mit dem kopierbaren Anteil des ersten Bereichs des ersten Primers identisch ist. Dieses Segment-5 liegt im 5'-Segment der Start-Nukleinsäurekette und ist von einem nicht kopierbaren Oligonukleotid-Schwanz flankiert (analog zum ersten Primer- Oligonukleotid), insbesondere bildet dieses Segment - 5 eine Begrenzung des kopierbaren Nukleinsäurekette-Stranges in 5'-Richtung.
• Das Sequenzfragment-7 (genannt Segment 7), welches eine Sequenz umfasst, welche zur komplementären Bindung eines zweiten Primers oder seines 3'-Segmentes unter Ausbildung eines extensionsfähigen Primer-Matrizen-Komplexes geeignet ist.
Insbesondere liegt das Segment 7 in 3‘-Richtung, („stromaufwärts“) vom Segment 5.
• Zielsequenz, welche teilweise oder ganz zwischen Segment 5 und Segment 7 liegt (dieser Anteil der Zielsequenz wird als Segment 6 bezeichnet). In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Zielsequenz Segment 6 und mindestens eines von Segment 5 und / oder Segment 7.
• Optional umfasst die Start-Nukleinsäurekette im 3'-Segment flankierende
Sequenzabschnitte (als Segment 8 bezeichnet), welche nicht amplifiziert werden.
Funktionsweise der Start-Nukleinsäurekette für die erste Amplifikations-Reaktion
Zu Beginn der Amplifikations-Reaktion dient die Start-Nukleinsäurekette als Matrize für die initiale Entstehung von jeweiligen Primer-Verlängerungsprodukten. Sie stellt somit die Ausgangs-Matrize für die zu amplifizierende Nukleinsäurekette dar. Die Start-Nukleinsäurekette braucht nicht zwingend mit der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette identisch zu sein. Durch Bindung und Verlängerung von beiden Primern während der Amplifikations-Reaktion bestimmen im Wesentlichen die beiden Primer, welche Sequenzen an beiden endständigen Segmenten der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette im Rahmen der Amplifikation generiert werden.
In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens werden für einen Doppelstrang nicht- denaturierende Reaktions-Bedingungen während des exponentiellen Amplifikationsvorgangs aufrechterhalten. Daher ist es vorteilhaft, wenn die Start-Nukleinsäurekette eine Begrenzung in ihrem durch eine Polymerase verlängerbaren 5'-Sequenzsegment aufweist, was zu einem Stopp in der enzymatischen Verlängerung eines entsprechenden Primers führt. Damit wird die Länge der unter Reaktionsbedinungen generierten Primer-Verlängerungsfragmente begrenzt. Das kann sich vorteilhaft auf die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid auswirken und zu einer Dissoziation des jeweiligen Stranges führen, so dass Primer-Bindungsstellen in den einzelsträngigen Zustand überführt werden und somit für eine erneute Bindung von Primern zugängig werden.
Besondere Ausführungsformen des ersten Primer-Oligonukleotids (Primer-1)
Das erste Primer-Oligonukleotid (Primer-1 ) ist eine Nukleinsäurekette welche mindestens folgende Bereiche einschließt (Fig. 12 - 14):
• Einen ersten Primer-Bereich im 3 '-Segment des ersten Primer-Oligonukleotides, der an einen Strang einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann
• Einen zweiten Bereich, gekoppelt direkt oder via einen Linker an das 5'-Ende des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, welcher einen Polynukleotid- Schwanz umfasst, welcher zur Bindung eines Controller-Oligonukleotids und Unterstützung der Strangverdrängung (Schritt c) durch Controller-Oligonukleotids geeignet ist, wobei der Polynukleotid-Schwanz unter Reaktionsbedingungen im Wesentlichen einzelsträngig bleibt, d.h. keine stabile Hairpin-Struktur oder ds-Strukturen ausbildet, und insbesondere nicht von der Polymerase kopiert wird.
Die Gesamtlänge des ersten Primer-Oligonukleotides liegt zwischen 10 und 80, insbesondere zwischen 15 und 50, insbesondere zwischen 20 und 30 Nukleotiden oder ihren Äquivalenten (z.B. Nukleotid-Modifikationen). Die Struktur des ersten Primer-Oligonukleotids ist dermaßen angepasst, dass es unter gewählten Reaktionsbedinungen eine reversible Bindung an das Controller-Oligonukleotid eingehen kann. Weiterhin ist die Struktur des ersten Primer- Oligonukletides an seine Primer-Funktion angepasst. Weiterhin ist die Struktur so angepasst, dass eine Strangverdrängung mittels Controller-Oligonukleotid ausgeführt werden kann. Insgesamt sind Strukturen des ersten und des zweiten Bereichs aneinander angepasst, so dass eine exponentielle Amplifikation ausgeführt werden kann.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind der erste und der zweite Bereich des Primers in einer konventionellen 5'-3' Anordnung gekoppelt. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Kopplung von beiden Abschnitten über eine 5'-5'-Bindung, so dass der zweite Bereich eine umgekehrte Richtung hat als der erste Bereich.
Die Kopplung von Bereichen zwischeneinander/untereinander erfolgt insbesondere kovalent. In bestimmten Ausführungsformen ist die Kopplung zwischen dem ersten und zweiten Bereich eine für DNA konventionelle 5'-3'-Phosphodiester-Kopplung. In bestimmten Ausführungsformen ist es eine 5'-5'-Phosphodiester-Kopplung. In bestimmten Ausführungsformen ist es eine 5'-3'- Phosphodiester-Kopplung, wobei zwischen benachbarten endständigen Nukleotiden bzw. Nukleotid-Modifikationen der beiden Bereiche mindestens ein Linker (z.B. ein C3, C6, C12 oder ein HEG-Linker oder eine abasische Modifikation) positioniert ist.
Einzelne Bereiche können unterschiedliche Nukleotid-Modifikationen einschließen. Dabei können individuelle Elemente von Nukleotiden modifiziert sein: Nukleobase und Rückgrad (Zucker-Anteil und / oder Phosphat-Anteil). Weiterhin können Modifikationen verwendet werden, welchen mindestens eine Komponente der Standard-Nukleotid-Bausteine fehlt oder modifiziert ist, z.B. PNA.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein zweiter Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides weitere Sequenzen, die nicht an das Controller-Oligonukleotid binden. Diese Sequenzen können zu anderen Zwecken verwendet werden, z.B. zur Bindung an die feste Phase. Diese Sequenzen sind insbesondere am 5'-Ende des Polynukleotid-Schwanzes lokalisiert.
In bestimmten Ausführungsformen kann ein erstes Primer-Oligonukleotid charakteristische Markierung umfassen. Beispiele für eine solche Markierung stellen Farbstoffe dar (z.B. FAM, TAMRA, Cy3, Alexa 488 etc.) oder Biotin bzw. andere Gruppen, die spezifisch gebunden werden können, z.B. Digoxigenin.
Der erste Primer-Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides
Die Sequenz-Länge liegt zwischen ca. 3-30 Nukleotiden, insbesondere zwischen 5 und 20 Nukleotiden, wobei die Sequenz vorwiegend komplementär zum 3'-Segment eines Stranges der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette ist. Im Einzelnen, muss dieser Primer-Bereich in der Lage sein, an das komplementäre 3'-Segment eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes spezifisch zu binden. Dieser erste Bereich soll bei Rücksynthese kopiert werden können und dient auch als Matrize für 2. Strang. Die Nukleotid-Bausteine sind insbesondere untereinander via übliche 5'-3' Phosphodieser-Bindung oder Phosphothioester-Bindung verknüpft.
Der erste Primer-Bereich schließt bevorzugt Nukleotid-Monomere ein, welche Funktion der Polymerase nicht oder nur unwesentlich beeinflussen, dazu gehöhren beispielsweise:
• natürliche Nukleotide (dA, dT, dC, dG etc.) oder deren Modifikationen ohne veränderte Basen-Paarung
• Modifizierte Nukleotide, 2-Amino-dA, 2-thio-dT oder andere Nukleotid-Modifikationen mit abweichender Basen-Paarung. In einer besonderen Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende dieses Bereichs insbesondere frei von Modifikationen und hat eine funktionsfähige 3'-OH Gruppe, welche von der Polymerase erkannt werden kann. Der erste Primer-Bereich dient als Initiator der Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes in der Amplifikation. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst der erste Bereich mindestens eine Phosphorothioat-Verbindung, so dass kein Abbau vom 3'-Ende des Primers durch 3'-Exonuclease Aktivität von Polymerasen erfolgen kann.
Die Sequenz des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids und die Sequenz des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides sind insbesondere zueinander komplementär.
In bestimmten Ausführungsformen kann der erste Primer-Bereich oder sein 3'-Segment an Sequenzsegmente einer Zielsequenz binden.
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides ist insbesondere eine Nukleinsäuresequenz, welche mindestens einen Polynukleotid-Schwanz umfasst, welcher insbesondere während der Synthesereaktion von der Polymerase unkopiert bleibt und welcher zur Bindung mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides fähig ist. Das Segment des zweiten Bereichs, welches überwiegend diese Bindung mit dem Controller-Oligonukleotid eingeht, kann als Polynukleotid-Schwanz bezeichnet werden.
Weiterhin muss der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids nicht nur das Controller- Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen spezifisch binden, sondern auch beim Vorgang der Strangverdrängung mittels Controller-Oligonukleotid mitwirken. Die Struktur des zweiten Bereichs muß folglich für die Herbeiführung einer räumlichen Nähe zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem entsprechenden Doppelstrang-Ende (im Einzelnen, dem 3'-Ende des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes) geeignet sein.
Die Gestaltung der Struktur des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids wird in mehreren Ausführungsformen genauer dargestellt. Dabei werden Anordnung der Oligonukleotid- Segmente und verwendete Modifikationen berücksichtigt, welche zu einem Stopp in der Polymerase-katalysierten Synthese führen.
Die Länge des zweiten Bereichs liegt zwischen 3 und 60, insbesondere zwischen 5 und 40, insbesondere zwischen 6 und 15 Nukleotiden oder ihren Äquivalenten.
Die Sequenz des zweiten Bereichs kann willkürlich gewählt sein. Insbesondere ist sie nicht komplementär mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder mit dem zweiten Primer- Oligonukleotid und/oder mit dem ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid. Weiterhin enthält sie insbesondere keine selbstkomplementären Segmente, wie Hairpins oder Stemmloops.
Die Sequenz des zweiten Bereichs ist insbesondere auf die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids abgestimmt, so dass beide Sequenzen unter Reaktionsbedingungen eine Bindung eingehen können. In einer besonderen Ausführungsform ist diese Bindung unter Reaktionsbedingungen reversibel: es besteht somit ein Gleichgewicht zwischen aneinander gebundenen Komponenten und nicht-gebundenen Komponenten.
Die Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides ist insbesondere dermaßen gewählt, dass die Anzahl von komplementären Basen, welche mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotid binden können, zwischen 1 und 40, insbesondere zwischen 3 und 20, insbesondere zwischen 6 und 15 liegt.
Die Funktion des zweiten Bereichs besteht unter anderem in der Bindung des Controller- Oligonukleotides. In bestimmten Ausführungsformen ist diese Bindung insbesondere spezifisch, so dass ein zweiter Bereich eines ersten Primer-Oligonukleotides ein spezifisches Controller- Oligonukleotid binden kann. In einer anderen Ausführungsform kann ein zweiter Bereich mehr als nur ein Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedinungen binden.
Es besteht im Allgemeinen keine Notwendigkeit in einer perfekten Übereinstimmung in der Sequenz zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides. Das Maß der Komplementarität zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller- Oligonukleotides kann zwischen 20 % und 100 %, insbesondere zwischen 50 % und 100 %, insbesondere zwischen 80 % und 100 % liegen. Die jeweils komplementären Bereiche können unmittelbar aneinander anschließend positioniert sein oder auch nicht-komplementäre Sequenz- Segmente dazwischen umfassen.
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides kann in bestimmten Ausführungsformen mindestens eine Tm-modifizierende Modifikation einschließen. Durch Einführung solcher Modifikationen kann die Stabilität der Bindung zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides modifiziert werden. Beispielsweise können Tm-erhöhende Modifikationen (Nukleotid-Modifikationen oder nicht- Nukleotid-Modifikationen) verwendet werden, wie LNA-Nukleotide, 2-Amino-Adenosine oder MGB- Modifikationen. Andererseits können auch Tm-senkende Modifikationen verwendet werden, wie beispielsweise Inosine-Nukleotid. In der Struktur des zweiten Bereichs können auch Linker (z.B. C3, C6, HEG-Linker) integriert werden.
Für die Strangverdrängung muss das Controller-Oligonukleotid in räumliche Nähe des Doppelstrang-Endes der zu amplifizierenden Nukleinsäure gebracht werden. Dieses Doppelstrang-Ende besteht aus Segmenten des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer- Verlängerungsproduktes und einem entsprechend komplementären dazu 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Der Polynukleotid-Schwanz bindet vorwiegend komplementär das Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen und bewirkt damit eine vorübergehende Annäherung des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides und des ersten Bereichs eines verlängerten Primer- Verlängerungsproduktes, so dass eine komplementäre Bindung zwischen diesen Elementen im Rahmen eines Strangverdrängungsvorgangs initiiert werden kann.
In bestimmten Ausführungsformen führt die Bindung des Controller-Oligonukleotides an den Polynukleotid-Schwanz des ersten Primer-Oligonukleotides unmittelbar zu einem solchen Kontakt. Das bedeutet, dass der Polynukleotid-Schwanz und der erste Primer-Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides unmittelbar aneinandergekoppelt sein müssen. Dank einer solchen Anordnung kann nach einer Bindung eines Controller-Oligonukleotids im seinem ersten Bereich unmittelbar zu einem Kontakt zwischen komplementären Basen des zweiten Bereichs des Controller- Oligonukleotides und zu entsprechenden Basen des ersten Primer-Bereichs kommen, so dass eine Strangverdrängung initiiert werden kann.
In bestimmten Ausführungsformen liegen zwischen Strukturen des Polynukleotid-Schwanzes und dem ersten Primer-Bereich andere Strukturen des zweiten Bereichs des ersten Primer- Oligonukleotides. Nach einer Bindung eines Controller-Oligonukleotids an den Polynukleotid- Schwanz ist dieser somit nicht unmittelbar an den ersten Primer-Bereich positioniert, sondern in einer gewissen Distanz dazu. Die Strukturen zwischen dem unkopierbarem Polynukleotid- Schwanz und dem kopierbaren ersten Primer-Bereich des Primer-Oligonukleotides können einen solchen Abstand generieren. Dieser Abstand hat einen Wert, welcher zwischen 0,1 und 20 nm, insbesondere zwischen 0,1 und 5 nm, insbesondere zwischen 0,1 und 1 nm liegt.
Solche Strukturen stellen beispielsweise Linker (z.B. C3 oder C6 oder HEG-Linker) oder nicht zu Controller-Oligonukleotid komplementäre Segmente dar (z.B. in Form von nicht-komplementären, nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen). Die Länge dieser Strukturen kann im Allgemeinen in Ketten-Atomen ausgemessen werden. Diese Länge beträgt zwischen 1 und 200 Atomen, insbesondere zwischen 1 und 50 Kettenatomen, bevorzugt zwischen 1 und 10 Kettenatomen.
Damit der Polynukleotid-Schwanz von Polymerase unter Amplifikationsbedinungen unkopierbar bleibt, umfasst der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides im allgemeinen Sequenz- Anordnungen bzw. Strukturen, welche zu einem Stopp der Polymerase in der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes bewirken, nachdem die Polymerase den ersten Primer- Bereich erfolgreich kopiert hat. Diese Strukturen sollen das Kopieren des Polynukleotid- Schwanzes des zweiten Bereichs verhindern. Der Polynukleotid-Schwanz bleibt somit insbesondere von der Polymerase unkopiert.
In bestimmten Ausführungsformen liegen solche Strukturen zwischen dem ersten Primer-Bereich und dem Polynukleotid-Schwanz.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Sequenz des Polynukleotid-Schwanzes Nukleotid- Modifikationen einschließen, welche zum Stopp der Polymerase führen. Dadurch kann ein Sequenzsegment des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids beide Funktionen umfassen: es ist sowohl ein Polynukleotid-Schwanz als auch eine zum Stopp der Polymerase führende Sequenz aus Nukleotid-Modifikationen. Modifikationen im zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid, welche zu einem Synthese- Stopp führen und somit den Polynukleotid-Schwanz unkopierbar lassen, werden in dieser Anmeldung unter dem Begriff "erste Blockierungs-Einheit oder ein Stopp-Bereich" zusammengefasst.
Nachfolgend sind weitere Ausführungsformen von Strukturen angeführt, welche zum Stopp in der Synthese des zweiten Stranges führen können.
Mehrere Bausteine bei der Oligonukleotid-Synthese sind bekannt, welche die Polymerase beim Ablesen der Matrize hindern und zur Termination von Polymerase-Synthese führen. Beispielsweise sind nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen oder Nicht-Nukleotid-Modifikationen bekannt. Es gibt auch Synthese-Arten/Anordnungen von Nukleotid-Monomeren innerhalb eines Oligonukleotides, welche zum Stopp der Polymerase führen (z.B. 5'-5-Anordnung oder 3'- 3'Anordnung). Primer-Oligonukleotide mit einem nicht kopierbaren Polynukleotid-Schwanz sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt (z.B. Scorpion-Primer-Strukturen bzw. Primer für Bindung an die feste Phase). Beide Primer-Varianten beschreiben Primer-Oligonukleotid-Strukturen, welche in der Lage sind, einerseits die Synthese eines Stranges zu initiieren, so dass eine Primer- Verlängerungsreaktion stattfinden kann. Es resultiert ein erster Strang, welcher im Primer- Verlängerungs-Produkt auch die Primer-Struktur mit Schwanz integriert. Bei der Synthese eines komplementären Stranges zum ersten Primer-Verlängerungs-Produkt, z.B. im Rahmen einer PCR- Reaktion, wird der zweite Strang bis zur "Blockierungs-Einheit/Stopp-Struktur" der Primer-Struktur verlängert. Beide beschriebenen Primer-Strukturen sind dermaßen konzipiert, dass der 5'-Anteil des Primer-Oligonukleotides einzelsträngig bleibt und nicht von der Polymerase kopiert wird.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welche in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'- nach 3'- aufweist und nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen einschließt. Zu solchen nicht- kopierbaren Nukleotid-Modifikationen zählen beispielsweise 2'-0-Alkyl-RNA Modifikationen, PNA, Morpholino. Diese Modifikationen können unterschiedlich im zweiten Primer-Bereich verteilt sein.
Der Anteil von nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen kann im Polynukleotid-Schwanz zwischen 20 % und 100 % liegen, insbesondere beträgt er mehr als 50% der Nukleotid-Bausteine. Insbesondere liegen diese Nukleotid-Modifikationen im 3'-Segment des zweiten Bereichs und grenzen somit an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Sequenz der nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen zumindest teilweise komplementär zu der Sequenz im Matrizenstrang, so dass die Primer-Bindung an die Matrize unter Einbeziehung von zumindest einem Teil dieser Nukleotid-Modifikationen stattfindet. In bestimmten Ausführungsformen ist die Sequenz der nicht-kopierbaren Nukleotid- Modifikationen nicht-komplementär zu der Sequenz im Matrizenstrang.
Die nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen werden insbesondere aneinander kovalent gekoppelt und stellen somit ein Sequenz-Segment im zweiten Bereich dar. Die Länge dieses Segments umfasst zwischen 1 und 40, insbesondere zwischen 1 und 20 Nukleotid-Modifikationen, insbesondere zwischen 3 und 10 Nukleotid-Modifikationen.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'-3' aufweist und nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen einschließt (z.B. 2'-0-Alkyl- Modifikationen) und mindestens einen Nicht-Nukleotid-Linker (z.B. C3, C6, HEG-Linker) einschließt. Ein Nicht-Nukleotid-Linker hat die Funktion, benachbarte Nukleotide oder Nukleotid- Modifikationen kovalent zu verbinden und gleichzeitig die Synthese-Funktion der Polymerase ortsspezifisch zu unterbrechen.
Ein solcher Nicht-Nukleotid-Linker soll die Strukturen des Polynukleotid-Schwanzes und des ersten Primer-Bereichs nicht zu weit voneinander entfernen. Vielmehr sollte der Polynukleotid-Schwanz in einer räumlichen Nähe vom ersten Primer-Bereich sein. Unter einem Nicht-Nukleotid-Linker werden Modifikationen zusammengefasst, welche in ihrer Länge nicht länger sind als 200 Ketten- Atome, insbesondere nicht länger als 50 Ketten-Atome, insbesondere nicht länger als 10 Ketten- Atome umfassen. Die Minimal-Länge eines solchen Linkers kann ein Atom betragen. Ein Beispiel für solche Nicht-Nukleotid-Linker stellen gerade oder verzweigte Alkyl-Linker mit einer Alkyl-Kette dar, welche mindestens ein Kohlenstoff-Atom einschließen, insbesondere mindestens 2 bis 30, insbesondere 4 bis 18. Solche Linker sind in der Oligonukleotid-Chemie hinreichend bekannt (z.B. C3, C6 oder C12 Linker) und können während einer Festphasen-Synthese von Oligonukleotiden zwischen der Sequenz des Polynukleotid-Schwanzes und der Sequenz des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides eingeführt werden. Ein anderes Beispiel für solche Nicht-Nukleotid- Linker stellen lineare oder verzweigte Polyethylen-Glykol-Derivate dar. Ein bekanntes Beispiel in der Oligonukleotid-Chemie stellt Hexaethylenglycol (HEG) dar. Ein weiteres Beispiel für solche Nicht-Nukleotid-Linker stellen abasische Modifikationen dar (z.B. THF-Modifikation, als Analog von d Ribose).
Wenn eine oder mehrere solche Modifikationen in einen zweiten Bereich integriert sind, können sie eine Polymerase in ihrer Kopier-Funktion während ihrer Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsprodukts effektiv stören, so dass in 3‘-Richtung gelegene Segmente nach einer solchen Modifikation unkopiert bleiben. Die Anzahl von solchen Modifikationen im zweiten Bereich kann zwischen 1 und 100 liegen, insbesondere zwischen 1 und 10, insbesondere zwischen 1 und 3.
Die Position eines solchen Nicht-Nukleotid-Linkers kann am 3'-Ende des zweiten Bereichs liegen und somit den Übergang zum ersten Bereich und dem zweiten Bereich des Primer-Oligonukleotid darstellen.
Die Lage des Nicht-Nukleotid-Linkers im mittleren Segment des zweiten Bereichs kann ebenfalls verwendet werden. Damit wird ein Polynukleotid-Schwanz in mindestens zwei Segmente geteilt. In dieser Ausführungsform schließt das 3'-Segment des Polynukleotid-Schwanzes mindestens eine, insbesondere mehrere, z.B. zwischen 2 und 20, insbesondere zwischen 2 und 10 nicht- kopierbaren Nukleotid-Modifikationen ein. Diese nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen liegen insbesondere am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des Primer- Oligonukleotides.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in seiner gesamten Länge eine Anordnung von 5'-nach 3'- aufweist und zumindest ein Nukleotid-Monomer in einer "umgekehrten" Anordnung von 3'-nach 5'- einschließt und welche am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides positioniert sind.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, wobei ein solcher Polynukleotid-Schwanz vollständig aus Nukleotiden besteht, welche in umgekehrten Anordnung direkt an den ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides angrenzen, so dass die Kopplung des ersten und des zweiten Bereichs durch 5'- 5' Position erfolgt. Ein Vorteil einer solchen Anordnung ist, dass die Polymerase nach einer Kopierung des ersten Bereichs an eine "umgekehrte" Anordnung von Nukleotiden trifft, was typischerweise zu Termination der Synthese an dieser Stelle führt.
Bei einer "umgekehrten" Anordnung von Nukleotiden in der Gesamtlänge des Polynukleotid- Schwanzes soll insbesondere das 3'-terminale Nukleotid des Polynukleotid-Schwanzes an seinem 3'-OH-Ende blockiert sein, um Nebenreaktionen vorzubeugen. Alternativ kann auch ein terminales Nukleotid verwendet werden, welches gar keine 3'-OH Gruppe aufweist, z.B. ein Dideoxy- Nukleotid.
In einer solchen Ausführungsform soll natürlich auch die entsprechende Nukleotid-Anordnung im Controller-Oligonukleotid angepasst werden. In einem solchen Fall müssen der erste und der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotids in 3'-3' Anordnung verknüpft werden.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welche in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'- nach 3'- aufweist und mindestens eine Nukleotid-Modifikation einschließt, welche für die Polymerase keine komplementäre Nukleobase darstellt, wenn die Synthese mit ausschließlich natürlichen dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP oder dUTP) durchgeführt wird.
Beispielsweise können Iso-dG bzw. Iso-dC Nukleotid-Modifikationen als einzelne, insbesondere aber mehrere (mindestens 2 bis 20) Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids integriert sein. Weitere Beispiele für Nukleobasen-Modifikationen stellen verschiedene Modifikationen des erweiterten genetischen Alphabets dar. Solche Nukleotid- Modifikationen unterstützen insbesondere keine komplementäre Basen-Paarung mit natürlichen Nukleotiden, so dass eine Polymerase (zumindest theoretisch) kein Nukleotid aus der Reihe (dATP, dCTP, dGTP, dTTP oderdUTP) einbaut. In der Realität kann es dennoch zum rudimentären Einbau kommen, insbesondere bei höheren Konzentrationen von dNTP-Substraten und prolongierten Inkubationszeiten (z.B. 60 min oder länger). Daher sollen bevorzugt mehrere solche Nukleotid-Modifikationen positioniert an benachbarten Stellen zum Einsatz kommen. Der Stopp der Polymerase-Synthese wird durch Fehlen von passenden komplementären Substraten für diese Modifikationen bewirkt. Oligonukleotide mit Iso-dC bzw. Iso-dG können mit Standardverfahren synthetisiert werden und sind von mehreren kommerziellen Anbietern erhältlich (z.B. Trilink- Technologies, Eurogentec, Biomers GmbH). Wahlweise kann auch die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids an die Sequenz eines solchen zweiten Primer-Bereichs angepasst werden. Dabei können komplementäre Nukleobasen des erweiterten genetischen Alphabets in den ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides entsprechend während der chemischen Synthese integriert werden. Beispielsweise kann Iso-dG im zweiten Bereich des ersten Primer-Nukleotids integriert sein, sein komplementäres Nukleotid (lso-dC-5-Me) kann an der passenden Stelle im ersten Bereich des Controller-Oligonukleotids platziert werden.
Zusammenfassend, kann die Termination der Synthese von Polymerase im zweiten Bereich auf verschiedene Art und Weise erreicht werden. Diese Blockade erfolgt bevorzugt allerdings erst, wenn die Polymerase den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides kopiert hat. Damit wird sichergestellt, dass ein zweites Primer-Verlängerungsprodukt eine passende Primer- Bindungsstelle in seinem 3'-Segment besitzt. Diese Primer-Bindungsstelle wird im Rahmen der Strangverdrängung freigelegt und steht somit für eine erneute Bindung eines weiteren ersten Primer-Oligonukleotids zur Verfügung.
Bei der Synthese des komplementären Stranges zum ersten Primer-Verlängerungsprodukt bleibt die Primer-Verlängerungsreaktion vor dem Polynukleotid-Schwanz stehen. Da dieser Polynukleotid-Schwanz für die Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid dadurch einzelsträngig bleibt und somit für Bindung zur Verfügung steht, unterstützt dieser die Initiierung der Strangverdrängungs-Reaktion durch das Controller-Oligonukleotid, indem er den entsprechenden komplementäre Segmente des Controller-Oligonukleotids in unmittelbare Nähe des passenden Duplex-Endes bringt. Der Abstand zwischen dem komplementären Teil des Controller-Oligonukleotides (zweiter Bereich) und dem komplementären Teil des verlängerten Primer-Oligonukleotid (erster Bereich) wird dadurch auf ein Minimum reduziert. Solche räumliche Nähe erleichtert die Initiierung der Strangverdrängung.
Im Rahmen einer schematischen Darstellung einer nukleinsäurevermittelten Strangverdrängungs- Reaktion liegt nun eine komplementäre Sequenz von Controller-Oligonukleotid unmittelbar in der Nähe des passenden Duplex-Endes. Dabei kommt es zu Konkurrenz um die Bindung an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids zwischen dem Strang des Controller- Oligonukleotides und dem zum Primer komplementären Matrizenstrang. Durch repetetive Schließung und Formierung von Basenpaarung zwischen dem Primer-Bereich und dem komplementären Segment des Controller-Oligonukleotids (zweiter Bereich des Controller- Nukleotides) bzw. dem komplementären Segment des Matrizenstranges kommt es zur Initiierung des nukleinsäurevermittelten Strangverdrängungs-Vorgangs. Im Allgemeinen ist die Ausbeute der Initiierung der Stang-Verdrängung ist umso höher, je näher der entsprechende komplementäre Sequenzabschnitt des Controller-Oligonukleotides zum komplementären Segment des Primer-Bereichs liegt. Bei Vergrößerung dieses Abstandes sinkt dagegen die Ausbeute der Initiierung der Strangverdrängung.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es nicht zwingend notwendig, dass die Initiierung der Strangverdrängung mit maximaler Ausbeute funktioniert. Daher können Abstände zwischen dem 5'-Segment des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotid, welcher eine Bindung mit einem komplementären Strang der Matrize eingeht und eine komplementäre Duplex bildet, und einem entsprechend komplementären Sequenzabschnitt im Controller-Oligonukleotides, wenn gebunden an Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides in folgenden Bereichen liegen: zwischen 0,1 und 20 nm, insbesondere zwischen 0,1 und 5 nm, insbesondere zwischen 0,1 und 1 nm. Im besonderen Fall beträgt diese Distanz weniger als 1 nm. In anderen Einheiten ausgedruckt entspricht dieser Abstand einer Strecke von weniger als 200 Atomen, insbesondere weniger als 50 Atomen, insbesondere weniger als 10 Atomen. Im besonderen Fall ist diese Distanz ein Atom. Die Angaben zur Distanz sollen lediglich zur Orientierung dienen und veranschaulichen, dass kürzere Distanzen zwischen diesen Strukturen bevorzugt werden. Die Messung dieser Distanz ist in vielen Fällen nur durch Analyse der genauen Strukturen von Oligonukleotiden und Ausmessung der Messung von Sequenzabständen bzw. von Linker-Längen möglich.
Der erste Primer kann auch noch weitere Sequenzabschnitte umfassen, welche nicht zu Interaktion mit Controller-Oligonukleotid oder Matrizen Strang benötigt werden. Solche Sequenzabschnitte können beispielsweise weitere Oligonukleotide binden, welche als Detektionssonden oder Immobilisierungspartner bei einer Bindung an die feste Phase verwendet werden.
Primer-Funktion des ersten Primer-Oligonukleotides
Das erste Primer-Oligonukleotid kann in mehreren Teil-Schritten verwendet werden. In erster Linie übernimmt es eine Primer-Funktion in der Amplifikation. Dabei wird die Primer- Verlängerungsreaktion unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize ausgeführt. In bestimmten Ausführungsformen kann das erste Primer-Oligonukleotid zu Beginn der Amplifikationsreaktion die Start-Nukleinsäurekette als Matrize verwenden. In bestimmten Ausführungsformen kann das erste Primer-Oligonukleotid bei der Erstellung / Bereitstellung einer Start-Nukleinsäurekette verwendet werden. Im Rahmen der Amplifikation dient der erste Primer als Initiator der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize. Das 3'-Segment des ersten Primers umfasst eine Sequenz, welche vorwiegend komplementär an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt binden kann. Die enzymatische Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize führt zu Ausbildung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes. Ein solches erstes Primer-Verlängerungsprodukt umfasst die Zielsequenz bzw. ihre Sequenz-Anteile. Im Verlauf der Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes wird die Sequenz des kopierbaren Anteils des ersten Primer- Oligonukleotids von der Polymerase als Matrize erkannt und eine entsprechende komplementäre Sequenz wird synthetisiert, so dass eine entsprechende Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid resultiert. Die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes erfolgt bis einschließlich des 5'-Segments des zweiten Primer-Oligonukleotids. Unmittelbar nach der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes ist dieses Produkt an das zweite Primer- Verlängerungsprodukt gebunden und bildet einen doppelsträngigen Komplex. Das zweite Primer- Verlängerungsprodukt wird aus diesem Komplex sequenzspezifisch durch das Controller- Oligonukleotid verdrängt. Dabei bindet das Controller-Oligonukleotid an das erste Primer- Verlängerungsprodukt. Nach einer erfolgreichen Strangverdrängung durch das Controller- Oligonukleotid kann das zweite Primer-Verlängerungsprodukt wiederum selbst als Matrize für die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes dienen. Das nun frei gewordene 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes kann ein weiteres zweites Primer-Oligonukleotid binden, so dass eine neue Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes initiiert werden kann.
Weiterhin kann das erste Primer-Oligonukleotid als Initiator der Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes ausgehend von der Start-Nukleinsäurekette zu Beginn der Amplifikation dienen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Sequenz des ersten Primers vollständig komplementär zum entsprechenden Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäurekette. In bestimmten Ausführungsformen ist die Sequenz des ersten Primer-Oligonukleotides nur teilweise komplementär zum entsprechenden Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäurekette. Diese abweichende Komplementarität soll das erste Primer-Oligonukleotid allerdings nicht daran hindern, eine vorwiegend sequenzspezifische Primer-Verlängerungsreaktion zu starten. Die jeweiligen Unterschiede in Komplementarität des ersten Primer-Oligonukleotides zur jeweiligen Position in der Start-Nukleinsäurekette liegen insbesondere im 5'-Segment des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, so dass im 3'-Segment vorwiegend komplementäre Basenpaarung und Initiierung der Synthese möglich ist. Für die Initiierung der Synthese sollen beispielsweise besonders die ersten 4 - 10 Positionen im 3'-Segment vollkomplementär zur Matrize (Start- Nukleinsäurekette) sein. Die restlichen Nukleotidpositionen können von einer perfekten Komplementarität abweichen. Das Ausmaß einer perfekten Komplementarität im restlichen 5'- Segment des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides kann somit Bereiche umfassen zwischen 50% bis 100%, insbesondere zwischen 80% und 100% der Basenzzusammensetzung. Je nach Länge des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, umfassend die Sequenz- Abweichungen von 1 bis maximal 15 Positionen, insbesondere 1 bis maximal 5 Positionen. Das erste Primer-Oligonukleotid kann somit eine Synthese von einer Start-Nukleinsäurekette initiieren. Bei einer darauffolgenden Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes werden kopierbare Sequenzabschnitte des ersten Primer-Oligonukleotides von der Polymerase kopiert, so dass wiederum in darauf folgenden Synthese-Zyklen eine vollkomplementäre Primer- Bindungsstelle innerhalb des zweiten Primer-Verlängerungsprodukte für die Bindung des ersten Primer-Oligonukleotides ausgebildet wird und in darauf folgenden Synthese-Zyklen zur Verfügung steht.
In bestimmten Ausführungsformen kann das erste Primer-Oligonukleotid im Rahmen der Vorbereitung einer Start-Nukleinsäurekette verwendet werden. Dabei kann ein solches erstes Primer-Oligonukleotid an eine Nukleinsäure (z.B. eine einzelsträngige genomische DNA oder RNA oder ihre Äquivalente umfassend eine Zielsequenz) vorwiegend sequenzspezifisch binden und in Anwesenheit einer Polymerase eine matrizenabhängige Primer-Verlängerungsreaktion initiieren. Die Bindungsposition ist dermassen gewählt, dass das Primer-Verlängerungsprodukt eine gewünschte Zielsequenz umfasst. Durch die Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotides resultiert ein Nukleinsäure-Strang, welcher eine zur Matrize komplementäre Sequenz aufweist. Ein solcher Strang kann von der Matrize abgelöst werden (z.B. durch Hitze oder Alkalie) und damit in eine einzelsträngige Form überführt werden. Eine solche einzelsträngige Nukleinsäurekette kann als Start-Nukleinsäurekette zu Beginn der Amplifikation dienen. Eine solche Start- Nukleinsäurekette umfasst in ihrem 5'-Segment die Sequenzanteile des ersten Primer- Oligonukleotides, weiterhin umfasst sie eine Zielsequenz oder ihre Äquivalente und eine Primer- Bindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid. Weitere Schritte sind im Abschnitt„Start- Nukleinsäurekette“ erläutert.
Die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes ist eine Primer-Verlängerungsreaktion und bildet einen Teilschritt in der Amplifikation. Die Reaktionsbedinungen während dieses Schrittes sind entsprechend angepasst. Die Reaktions-Temperatur und die Reaktions-Zeit sind dermassen gewählt, dass die Reaktion erfolgreich stattfinden kann. Die jeweils bevorzugte Temperatur in diesem Schritt hängt von der verwendeten Polymerase ab und der Bindungsstärke des jeweiligen ersten Primer-Oligonukleotides an seine Primer-Bindungsstelle und umfasst beispielsweise Bereiche von 15°C bis 75°C, insbesondere von 20 bis 65°C, insbesondere von 25°C bis 65°C. Die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides umfasst Bereiche von 0,01 pmol/l bis 50 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 20 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 10 pmol/l.
In bestimmten Ausführungsformen verlaufen alle Schritte der Amplifikation unter stringenten Bedinungen, welche die Ausbildung von unspezifischen Produkten / Nebenprodukten verhindern bzw. verlangsamen. Zu solchen Bedinungen zählen beispielsweise höhere Temperaturen, insbesondere über 50°C.
Falls mehr als eine spezifische Nukleinsäurekette in einem Ansatz amplifiziert werden muss, werden in bestimmten Ausführungsformen bevorzugt jeweils sequenzspezifische Primer- Oligonukleotide für die Amplifikation von entsprechenden jeweiligen Zielsequenzen verwendet.
Insbesondere sind Sequenzen des ersten, des zweiten Primer-Oligonukleotides und des Controller-Oligonukleotides dermassen aneinander angepasst, dass Nebenreaktionen, z.B. Primer-Dimer-Ausbildung, minimiert sind. Zu diesem Zweck sind beispielsweise die Sequenz des ersten und des zweiten Primer-Oligonukleotides aneinander demassen angepasst, daß beide Primer-Oligonukleotide nicht in der Lage sind, eine Amplifikations-Reaktion in Abwesenheit einer passenden Matrize und/oder einer Zielsequenz und/oder einer Start-Nukleinsäurekette zu starten bzw. zu unterstützen. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass das zweite Primer- Oligonukleotid keine Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid umfasst und das erste Primer-Oligonukleotid keine Primer-Bindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid umfasst. Weiterhin soll vermieden werden, dass die Primer-Sequenzen ausgedehnte eigen komplementäre Strukturen (Self-complement) umfassen.
In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des ersten und des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes bei gleicher Temperatur. In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes bei unterschiedlichen Temperaturen. In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur. In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei unterschiedlichen Temperaturen.
Besondere Ausführungsformen des Controller-Oligonukleotids
Ein Controller-Oligonukleotid (Fig. 19 - 26) umfasst:
• Einen ersten einzelsträngigen Bereich, welcher an den Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides binden kann,
• einen zweiten einzelsträngigen Bereich, welcher an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides im Wesentlichen komplementär binden kann,
• einen dritten einzelsträngigen Bereich, welcher zumindest zu einem Segment des Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Verlängerungsprodukts im Wesentlichen komplementär ist,
und das Controller-Oligonukleotid dient nicht als Matrize für Primerverlängerung des ersten oder des zweiten Primer-Oligonukleotids.
Im Allgemeinen wird die Sequenz des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotides an die Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure angepasst, da diese als Matrize für die Reihenfolge der Nukleotide im Verlängerungsprodukt eines ersten Primers maßgeblich ist. Die Sequenz des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotids wird an die Sequenz des ersten Primer-Bereiches angepasst. Die Struktur des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides wird an die Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides angepasst, vor allem an die Beschaffenheit des Polynukleotid-Schwanzes.
Ein Controller-Oligonukleotid kann auch weitere Sequenz-Segmente einschließen, welche nicht zum ersten, zweiten oder dritten Bereich gehören. Diese Sequenzen können beispielsweise als flankierende Sequenzen am 3'- und am 5'-Ende angebracht werden. Insbesondere stören diese Sequenzsegmente die Funktion des Controller-Oligonukleotids nicht. Die Struktur des Controller-Oligonukleotids weist insbesondere folgende Eigenschaften auf:
Die einzelnen Bereiche sind untereinander kovalent gebunden. Die Bindung kann beispielsweise via konventionelle 5'-3' Bindung erfolgen. Es kann beispielsweise eine Phospho-Diesterbindung oder eine Nuklease-resistente Phospho-Thioester Bindung verwendet werden.
Ein Controller-Oligonukleotid kann mittels seines ersten Bereichs an den Polynukleotid-Schwanz des ersten Primer-Oligonukleotides binden, wobei die Bindung vorwiegend durch Hybridisierung komplementärer Basen vermittelt wird. Die Länge dieses ersten Bereichs beträgt 3 - 80 Nukleotide, insbesondere 4 - 40 Nukleotide, insbesondere 6 - 20 Nukleotide. Das Ausmaß an Sequenzübereinstimmung zwischen der Sequenz des ersten Bereichs des Controller- Oligonukleotids und der Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotide kann zwischen 20 % und 100 %, insbesondere zwischen 50 % und 100 %, insbesondere zwischen 80 % und 100 % liegen. Die Bindung des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids sollte insbesondere spezifisch an den zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen erfolgen.
Die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids ist insbesondere dermaßen gewählt, dass die Anzahl von komplementären Basen, welche mit dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids komplementär binden können, zwischen 1 und 40, insbesondere zwischen 3 und 20, insbesondere zwischen 6 und 15 liegt.
Da das Controller-Oligonukleotid keine Matrize für die Polymerase darstellt, kann es Nukleotid- Modifikationen einschließen, welche die Polymerase-Funktion nicht unterstützen, welche sowohl Basenmodifikationen und / oder Zucker-Phosphat-Rückgrad-Modifikationen sein können. Das Controller-Oligonukleotid kann beispielsweise in seinem ersten Bereich Nukleotide und/oder Nukleotid-Modifikationen einschließen, welche aus der folgenden Liste ausgewählt sind: DNA, RNA, LNA („locked nucleic acids“ Analoga mit 2'-4' Brückenbindung im Zuckerrest), UNA („unlocked nucleid acids“ ohne Bindung zwischen 2'-3'-Atomen des Zuckerrestes), PNA („peptide nucleic acids“ Analoga), PTO (phosphorothioate), Morpholino-Analoga, 2'-0-Alkyl-RNA Modifikationen (wie 2'-OMe, 2'-0 Propargyl, 2'-0-(2-Methoxyethyl), 2'-0-Propyl-Amin), 2 - Halogen-RNA, 2'-Amino-RNA etc. Diese Nukleotide oder Nukleotid-Modifikationen sind untereinander beispielsweise durch konventionelle 5'-3'- Bindung oder 5'-2' Bindung verknüpft. Es kann beispielsweise eine Phospho-Diesterbindung oder eine Nuklease-resistente Phospho- Thioester Bindung verwendet werden.
Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nukleotide und/oder Nukleotid- Modifikationen einschließen, wobei die Nukleobasen aus der folgenden Liste ausgewählt sind: Adenine und seine Analoga, Guanine und seine Analoga, Cytosine und seine Analoga, Uracil und seine Analoga, Thymine und seine Analoga, Inosine oder andere Universalbasen (z.B. Nitroindol), 2-Amino-Adenin und seine Analoga, Iso-Cytosine und seine Analoga, Iso-Guanine und seine Analoga. Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nicht-Nukleotid-Verbindungen einschließen, welche aus der folgenden Liste ausgewählt sind: Interkallierende Stoffe, welche die Bindungsstärke zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid beeinflussen können, z.B. MGB, Naphthalene etc. Gleiche Elemente können auch im zweiten Bereich des ersten Primers verwendet werden.
Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nicht-Nukleotid-Verbindungen einschließen, z.B. Linker wie C3, C6, HEG Linker, welche einzelne Segmente des ersten Bereichs untereinander verknüpfen.
Das Controller-Oligonukleotid kann mittels seines zweiten Bereichs an den ersten Primer-Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids binden, wobei die Bindung im Wesentlichen durch Hybridisierung komplementärer Basen vermittelt wird.
Die Länge des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotids ist an die Länge des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotid angepasst und stimmt mit dieser insbesondere überein. Sie liegt zwischen ca. 3-30 Nukleotiden, insbesondere zwischen 5 und 20 Nukleotiden. Die Sequenz des zweiten Bereichs von Controller-Oligonukleotid ist insbesondere komplementär zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids. Das Maß der Übereinstimmung in Komplementarität liegt zwischen 80 % und 100 %, insbesondere zwischen 95 % und 100 %, insbesondere bei 100 %. Der zweite Bereich von Controller-Oligonukleotid schließt insbesondere Nukleotid-Modifikationen ein, welche die Polymerase bei Verlängerung des ersten Primer- Oligonukleotides behindern, allerdings die Ausbildung von komplementären Doppelsträngen nicht blockieren oder nicht wesentlich verhindern, beispielsweise 2'-0-Alkyl RNA-Analoga (z.B. 2'-0- Me, 2'-0-(2-Methoxyethyl), 2'-0-Propyl, 2'-0-Propargyl Nukleotid-Modifikationen), LNA, PNA oder Morpholino Nukleotid-Modifikationen. Einzelne Nukleotid-Monomere sind insbesondere via 5'-3'- Bindung verknüpft, aber auch die alternative 5'-2'-Bindung zwischen Nukleotid-Monomeren kann verwendet werden.
Die Sequenz-Länge und die Beschaffenheit des ersten und des zweiten Bereichs des Controller- Oligonukleotides sind insbesondere dermassen gewählt, dass die Bindung dieser Bereiche an das erste Primer-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen zumindestens in einem Reaktions-Schritt des Verfahrens reversibel ist. Das bedeutet, dass Controller-Oligonukleotid und das erste Primer- Oligonukleotid zwar spezifisch aneinander binden können, diese Bindung soll allerdings nicht zu Ausbildung eines unter Reaktionsbedingungen dauerhaft stabilen Komplexes aus beiden Elementen führen.
Vielmehr soll ein Gleichgewicht zwischen einer gebunden Komplex-Form aus Controller- Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und einer freien Form von einzelnen Komponenten unter Reaktionsbedingungen zumindest in einem Reaktions-Schritt angestrebt bzw. ermöglicht werden. Damit wird sichergestellt, dass zumindest ein Anteil der ersten Primer- Oligonukleotide unter Reaktionsbedingungen in freier Form vorliegt und mit der Matrize interagieren kann, um eine Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Andererseits, wird damit sichergestellt werden, dass entsprechende Sequenzbereiche des Controller-Oligonukleotides zur Bindung mit einem verlängerten Primer-Oligonukleotid zur Verfügung stehen.
Durch Temperatur-Wahl während der Reaktion kann der Anteil von freien, einzelsträngigen und somit reaktionsfähigen Komponenten beeinflusst werden: durch Absenkung der Temperatur binden erste Primer-Oligonukleotide an die Controller-Oligonukleotide, so dass beide Teilnehmer einen komplementären doppelsträngigen Komplex binden. Damit kann die Konzentration einzelsträngiger Formen einzelner Komponenten abgesenkt werden. Eine Erhöhung der Temperatur kann zur Dissoziation beider Komponenten in die einzelsträngige Form führen. Im Bereich der Schmelz-Temperatur des Komplexes (Controller-Oligonukleotid / erstes Primer- Oligonukleotid) liegen ca. 50% der Komponenten in einzelsträngiger Form und ca. 50% als doppelsträngiger Komplex vor. Durch Verwendung entsprechender Temperaturen kann somit die Konzentration einzelsträngiger Formen im Reaktionsgemisch beeinflusst werden.
Bei Ausführungsformen des Amplifikationsverfahrens, welche Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Reaktions-Schritten umfassen, können gewünschte Reaktionsbedingungen während entsprechender Reaktions-Schritte herbeigeführt werden. Beispielsweise durch Verwendung von Temperatur-Bereichen etwa in Höhe von Schmelztemperatur von Komplexen aus Controller- Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid können Anteile von jeweils freien Formen einzelner Komponenten beeinflusst werden. Dabei führt die verwendete Temperatur zu einer Destabilisierung von Komplexen umfassend Controller-Oligonukleotid / erster Primer- Oligonukleotid, so dass während dieses Reaktionsschrittes einzelne Komplex-Komponenten zumindest vorübergehend einzelsträngig werden und damit in die Lage versetzt werden, mit anderen Reaktionspartnern zu interagieren. Beispielsweise kann ein erster Sequenzbereich des Controller-Oligonukleotides aus dem doppelsträngigen Komplex mit einem nicht-verlängerten ersten Primer freigesetzt werden und kann somit mit dem zweiten Sequenzbereich eines verlängerten ersten Primer-Oligonukleotides interagieren und damit eine Strangverdrängung initiieren. Andererseits, führt die Freisetzung eines ersten, nicht verlängerten Primer- Oligonukleotides aus einem Komplex umfassend Controller-Oligonukleotid / erster Primer- Oligonukleotid dazu, dass der erste Primer-Bereich einzelsträngig wird und somit mit der Matrize interagieren kann, so dass eine Primer-Verlängerung durch eine Polymerase initiiert werden kann.
Die verwendete Temperatur muss dabei nicht exakt der Schmelztemperatur des Komplexes aus Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid entsprechen. Es genügt, wenn die Temperatur in einem Reaktionsschritt etwa im Bereich der Schmelztemperatur verwendet wird. Beispielsweise umfasst die Temperatur in einem der Reaktionsschritte Bereiche von Tm +/- 10°C, insbesondere Tm +/- 5°C, insbesondere Tm +/- 3°C des Komplexes aus Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid.
Eine solche Temperatur kann beispielsweise im Rahmen des Reaktions-Schrittes eingestellt werden, welcher eine sequenzspezifische Strandverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid umfasst. Bei Ausführungsformen des Amplifikationsverfahrens, welche keinen Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Reaktions-Schritten umfassen und wo die Amplifikation unter isothermalen Bedinungen verläuft, werden über die Gesamtdauer der Amplifikationsreaktion Reaktionsbedinungen aufrechterhalten, bei welchen ein Gleichgewicht zwischen einer Komplex- Form aus Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und einer freien Form von einzelnen Komponenten möglich ist.
Das Verhältnis zwischen einer Komplex-Form aus Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und freien Formen einzelner Komponenten kann sowohl durch Reaktionsbedinungen (z.B. Temperatur und Mg2+ Konzentration) als auch durch Strukturen und Konzentrationen einzelner Komponenten beeinflusst werden.
Die Sequenz-Länge und die Beschaffenheit des ersten und des zweiten Bereichs des Controller- Oligonukleotides sind in bestimmten Ausführungsformen so gewählt, dass unter gegebenen Reaktionsbedinungen (z.B. im Reaktionsschritt einer Strangverdängung durch das Controller- Oligonukleotid) das Verhältnis zwischen einem Anteil eines freien Controller-Oligonukleotids und einem Anteil eines Controller-Oligonukleotids im Komplex mit einem ersten Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst: von 1 :100 bis 100:1 , insbesondere von 1 :30 bis 30:1 , insbesondere von 1 :10 bis 10:1 . Das Verhältnis zwischen einem Anteil eines freien ersten Primer-Oligonukleotid und einem Anteil eines ersten Primer-Oligonukleotids im Komplex mit einem Controller- Oligonukleotid umfasst Bereiche von 1 :100 bis 100:1 , insbesondere von 1 :30 bis 30:1 , insbesondere von 1 : 10 bis 10: 1 .
In bestimmten Ausführungsformen ist die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides höher als die Konzentration des Controller-Oligonukleotides. Dadurch liegt ein Überschuß des ersten Primers in der Reaktion vor und das Controller-Oligonukleotid muss für seine Wirkung aus der Bindung mit dem ersten Primer durch die Wahl einer entsprechenden Reaktionstemperatur freigesetzt werden. Im Allgemeinen erfolgt das durch eine Temperaturerhöhung, bis hinreichende Konzentrationen von freien Formen des Controller-Oligonukleotids vorliegen.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides niedriger als die Konzentration des Controller-Oligonukleotides. Dadurch liegt ein Überschuss des Controller-Oligonukleotids vor und das erste Primer-Oligonukleotid muss für seine Wirkung aus der Bindung mit dem Controller-Oligonukleotid durch die Wahl einer entsprechenden Reaktionstemperatur freigesetzt werden. Im Allgemeinen erfolgt das durch eine Temperaturerhöhung, bis hinreichende Konzentrationen von freien Formen des ersten Primer- Oligonukleotids vorliegen.
Bei isothermalen Bedingungen liegt ein Gleichgewicht vor: gewisse Anteile des ersten Primer- Oligonukleotides und des Controller-Oligonukleotides sind aneinander gebunden, andere dagegen sind als einzelsträngige Form in der Reaktion vorhanden. Das Controller-Oligonukleotid kann mittels seines dritten Bereichs an mindestens ein Segment des spezifisch synthetisierten Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotids binden (Fig. 13 bis 35). Die Bindung erfolgt bevorzugt durch Hybridisierung komplementärer Basen zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem von der Polymerase synthetisierten Verlängerungsprodukt.
Zur Unterstützung der Strangverdrängungsreaktion soll die Sequenz des dritten Bereichs insbesondere eine hohe Komplementarität zum Verlängerungsprodukt aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Sequenz des dritten Bereichs zu 100 % zu dem Verlängerungsprodukt komplementär.
Die Bindung des dritten Bereichs erfolgt insbesondere an das Segment des Verlängerungsproduktes, welches unmittelbar an den ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides anschließt. Somit liegt das Segment des Verlängerungsprodukts insbesondere im 5'-Segment des gesamten Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotids.
Die Bindung des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotids erfolgt insbesondere nicht über die gesamte Länge des Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotides. Insbesondere bleibt ein Segment am 3'-Ende des Verlängerungsproduktes ungebunden. Dieses 3'-ständige Segment ist für die Bindung des zweiten Primer-Oligonukleotides notwendig.
Die Länge des dritten Bereichs ist entsprechend dermassen angepasst, dass der dritte Bereich zum einen an das 5'-ständige Segment des Verlängerungsproduktes bindet, andererseits das 3'- ständige Segment des Verlängerungsproduktes nicht bindet.
Die Gesamtlänge des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotids beträgt von 2 bis 100, insbesondere von 6 bis 60, insbesondere von 10 bis 40 Nukleotide oder ihrer Äquivalente. Das Controller-Oligonukleotid kann mit dem Segment des Verlängerungsproduktes über diese Länge eine komplementäre Bindung eingehen und damit dieses 5'-ständige Segment des Verlängerungsprodukts aus der Bindung mit seinem komplementären Matrizen-Strang verdrängen.
Die Länge des 3'-ständigen Segments des Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller- Oligonukleotid gebunden wird, umfasst beispielsweise Bereiche zwischen 5 und 100 Nukleotide, insbesondere 5 und 60 Nukleotide, insbesondere zwischen 10 und 40, insbesondere zwischen 15 und 30 Nukleotide.
Dieses 3'-ständige Segment des Verlängerungsprodukts wird nicht vom Controller-Oligonukletid aus der Bindung mit dem Matrizenstrang verdrängt. Auch bei vollständig gebundenem dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids an sein komplementäres Segment des Verlängerungsproduktes kann das erste Primer-Verlängerungsprodukt via seinem 3'-ständigen Segment mit dem Matrizenstrang gebunden bleiben. Die Bindungsstärke dieses Komplexes ist insbesondere so gewählt, dass er unter Reaktionsbedinungen (Schritt e) beispielsweise spontan dissoziieren kann. Dies kann bespielsweise dadurch erreicht werden, dass die Schmelztemperatur dieses Komplexes aus dem 3 '-ständigen Segment des Verlängerungsprodukts des ersten Primer- Oligonukleotid und seinem Matrizenstrang etwa im Bereich der Reaktionstemperatur liegt oder unterhalb der Reaktionstemperatur bei einem entsprechenden Reaktionsschritt (Reaktionsschritt e). Bei geringer Stabilität dieses Komplexes im 3'-Segment des Verlängerungsproduktes führt eine vollständige Bindung des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotid an das 5'-ständige Segment des Verlängerungsproduktes zu einer schnellen Dissoziation des ersten Primer- Verlängerungsprodukts von seinem Matrizenstrang.
Das Controller-Oligonukleotid hat insgesamt eine passende Struktur, um seine Funktion auszuführen: unter entsprechenden Reaktionsbedinungen ist es in der Lage, das verlängerte erste Primer-Oligonukleotid aus der Bindung mit dem Matrizenstrang sequenzspezifisch zu verdrängen, wodurch der Matrizenstrang in einzelsträngige Form überführt wird und somit für weitere Bindungen mit einem neuen ersten Primer-Oligonukleotid und deren zielsequenzspezifischer Verlängerung durch die Polymerase zur Verfügung steht.
Um die Funktion der Strangverdrängung zu erfüllen, sollten Bereiche eins, zwei und drei des Controller-Oligonukleotids vorwiegend in einzelsträngiger Form unter Reaktionsbedingungen vorliegen. Daher sollten doppelsträngige selbstkomplementäre Strukturen (z.B. Hairpins) in diesen Bereichen nach Möglichkeit vermieden werden, da sie die Funktionalität des Controller- Oligonukleotides herabsetzen können.
Das Controller-Oligonukleotid soll im erfindungsgemäßen Verfahren nicht als Matrize auftreten, daher soll das erste Primer-Oligonukleotid, wenn angelagert an das Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen, nicht von der Polymerase verlängert werden.
Dies wird insbesondere durch Verwendung von Nukleotid-Modifikationen erreicht, welche die Polymerase am Kopieren des Stranges hindern. Insbesondere bleibt das 3'-Ende des ersten Primer-Oligonukleotid nicht verlängert, wenn das erste Primer-Oligonukleotid an das Controller- Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen bindet.
Das Ausmaß der Blockade/Hinderung/Verlangsamung/Erschwerung der Reaktion kann zwischen vollständiger Ausprägung dieser Eigenschaft (z.B. 100 % Blockade unter gegebenen Reaktionsbedingungen) und einer partiellen Ausprägung dieser Eigenschaft liegen (z.B. 30-90 % Blockade unter gegebenen Reaktionsbedingungen). Bevorzugt werden Nukleotid-Modifikationen, welche einzeln oder in einer Reihe aneinander gekoppelt (z.B. als Sequenzfragment bestehend aus modifizierten Nukleotiden) mehr als 70 %, insbesondere mehr als 90 %, insbesondere mehr als 95 %, und insbesondere zu 100 % die Verlängerung eines ersten Primers verhindern können.
Die Nukleotid-Modifikationen können Basen-Modifikationen und/oder Zucker-Phosphat-Rest Modifikationen umfassen. Die Zucker-Phosphat-Modifikationen sind bevorzugt, da durch Kombination mit konventionellen Nukleobasen eine beliebige komplementäre Sequenz eines Controller-Oligonukleotides zusammengestellt werden kann. Die Nukleotide mit Modifikationen im Zucker-Phosphat-Rest, welche zur Hinderung bzw. Blockade der Synthese der Polymerase führen können, schließen beispielsweise ein: 2'-0-Alkyl-Modifikationen (z.B. 2'-0-Methyl, 2'-0-(2- Methoxyethyl), 2'-0-Propyl, 2'-0-Propargyl Nukleotid-Modifikationen), 2'-Amino-2'-Deoxy- Nukleotid-Modifikationen, 2'-Amino-Alkyl-2'-Deoxy-Nukleotid-Modifikationen, PNA, Morpholino- Modifikationen usw.
Die Blockade kann sowohl durch eine einzelne Nukleotid-Modifikation erfolgen oder erst durch Kopplung von mehreren Nukleotid-Modifikationen in Reihe erfolgen (z.B. als Sequenzfragment bestehend aus modifizierten Nukleotiden). Beispielsweise können mindestens 2, insbesondere mindestens 5, insbesondere mindestens 10 solcher Nukleotid-Modifikationen nebeneinander im Controller-Oligonukleotid gekoppelt sein.
Ein Controller-Oligonukleotid kann eine einheitliche Art von Nukleotid-Modifikationen aufweisen oder auch mindestens zwei verschiedene Arten der Nukleotid-Modifizierung umfassen.
Die Position solcher Nukleotid-Modifikationen im Controller-Oligonukleotid soll insbesondere die Polymerase daran hindern, das 3'-Ende eines am Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer-Oligonukleotids zu verlängern.
In bestimmten Ausführungsformen sind solche Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotids lokalisiert. In bestimmten Ausführungsformen sind solche Nukleotid- Modifikationen im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids lokalisiert. In bestimmten Ausführungsformen sind solche Nukleotid-Modifikationen im zweiten und im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids lokalisiert.
Beispielsweise besteht der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotids zu mindestens 20 % seiner Positionen aus solchen Nukleotid-Modifikationen, insbesondere zu mindestens 50 %.
Beispielsweise besteht der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids zu mindestens 20 % seiner Positionen aus solchen Nukleotid-Modifikationen, insbesondere zu mindestens 50 %, insbesondere zu mindestens 90%. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der gesamte dritte Bereich Nukleotid-Modifikationen, welche eine Polymerase daran hindern, einen an einen solchen Bereich gebundenen Primer unter Verwendung des Controller-Oligonukleotides als Matrize zu verlängern. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der gesamte dritte und zweite Bereich solche Nukleotid-Modifikationen. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der gesamte erste, zweite und dritte Bereich solche Nukleotid-Modifikationen. Somit kann das Controller- Oligonukleotid vollständig aus solchen Nukleotid-Modifikationen bestehen. Solche modifizierten Controller-Oligonukleotide können beispielsweise bei Multiplex-Analysen verwendet werden, bei welchen weitere Primer verwendet werden. Dadurch soll verhindert werden, dass es zu unbeabsichtigten Primer-Verlängerungs-Reaktionen an einem oder mehreren Controller- Oligonukleotiden kommt.
Die Sequenz der Nukleobasen von diesen Nukleotid-Modifikationen ist den Anforderungen an die Sequenz im jeweiligen Bereich angepasst.
Den restlichen Anteil können beispielsweise natürliche Nukleotide ausmachen, oder Nukleotid- Modifikationen, welche die Polymerasen-Funktion gar nicht oder nur unwesentlich hindern z.B. DNA-Nukleotide, PTO-Nukleotide, LNA-Nukleotide, RNA-Nukleotide. Dabei können weitere Modifikationen, beispielsweise Basenmodifikationen wie 2-Amino-Adenosin, 2-Aminopurine, 5- Methyl-Cytosine, Inosine, 5-Nitroindole, 7-Deaza-Adenosin, 7-Deaza-Guanosin, 5-Propyl-Cytosin, 5-Propyl-Uridin oder Nicht-Nukleotid-Modifikationen wie Farbstoffe, oder MGB-Modifikationen etc. z.B. zur Anpassung von Bindungsstärken von einzelnen Bereichen der Controller-Oligonukleotide verwendet werden. Die einzelnen Nukleotid-Monomere können via konventionelle 5'-3'-Bindung untereinander gekoppelt werden oder auch abweichend via 5'-2'-Bindung.
Ein Segment des Controller-Oligonikleotids mit Nukleotid-Modifikationen, welches die Verlängerung von dem 3'-Ende eines an den Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer- Oligonukleotids durch die Polymerase verhindert, wird als "zweite Blockierungs-Einheit" bezeichnet. Die Länge dieses Segments kann zwischen 1 bis 50 Nukletid-Modifikationen einschließen, insbesondere zwischen 4 und 30. Dieses Segment kann beispielsweise dermaßen im Controller-Oligonukleotid lokalisiert sein, dass das 3'-Ende des gebundenen ersten Primer- Oligonukleotids in diesem Segment liegt. Somit kann dieses Segment die Bereiche zwei und drei überspannen.
In bestimmten Ausführungsformen werden insbesondere keine Linker-Strukturen oder Spacer- Strukturen, wie C3, C6, HEG-Linker zur Verhinderung der Verlängerung des 3'-Ende eines an das Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer-Oligonukleotids verwendet.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein Controller-Oligonukleotid in seinem dritten Bereich mindestens eine Komponte des Detektions-Systems (z.B. Fluoreszenzreporter oder Fluoreszenzquencher oder einen Donor-Fluorophor). Die Position dieser Komponente liegt in bestimmten Ausführungsformen am 5'-Ende des Controller-Oligonukleotides. In einer anderen Ausführungsform liegt diese Komponente im inneren Sequenzsegment des dritten Bereichs. Dabei kann die Distanz bis zum 5'-Ende des Controller-Oligonukleotides zwischen 2 bis 50 Nukleotide betragen, insbesondere zwischen 2 und 20, insbesondere zwischen 2 und 10 Nukleotiden. Bei einer gleichzeitigen Bindung der Oligonukleotid-Sonde und des Controller-Oligonukleotides am selben ersten Primer-Verlängerungsprodukt kommt es dabei zu einer räumlichen Nähe der beiden Komponenten des Detektions-System (z.B. zwischen einem Fluoreszenzreporter an der Oligonukleotid-Sonde und einem Donor-Fluorophor am Controller-Oligonukleotid).
Das Controller-Oligonukleotid kann außer Bereichen eins, zwei und drei noch weitere Sequenzsegmente umfassen, welche beispielsweise im 5'-Segment oder 3'-Segment des Controller-Oligonukleotids die oben genannten Bereiche flankieren. Solche Sequenzelemente können beispielsweise für weitere Funktionen verwendet werden, wie beispielsweise Interaktion mit Sonden, Bindung an feste Phase etc. Solche Bereiche stören insbesondere die Funktion der Bereiche eins bis drei nicht. Die Länge dieser flankierenden Sequenzen kann beispielsweise zwischen 1 bis 50 Nukleotide betragen. Weiterhin kann ein Controller-Oligonukleotid mindestes ein Element zur Immobilisierung an einer festen Phase umfassen, z.B. einen Biotin-Rest. Weiterhin kann ein Controller-Oligonukleotid mindestes ein Element zu Detektion umfassen, z.B. einen F I uo resze nz- Fa rbstoff .
In Anwesenheit von einem Controller-Oligonukleotid werden neusynthetisierte Sequenzen auf ihre Sequenz-Inhalte durch Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid überprüft.
• Bei korrekter Übereinstimmung mit vorgegebenen Sequenzinhalten des Controller- Oligonukleotides erfolgt eine Strangverdrängung, wobei die Matrizen-Stränge von neusynthetisierten Strängen abgelöst werden. Dabei werden Primer-Bindungsstellen in den einzelsträngigen Zustand überführt und stehen für eine neue Interaktion mit Primern und somit für eine weitere Synthese zur Verfügung. Somit wird das System aus beiden Primer-Verlängerungsprodukten in einen aktiven Zustand versetzt. Das Controller- Oligonukleotid hat somit eine aktivierende Wirkung auf das System.
• Bei fehlender Übereinstimmung mit vorgegebenen Sequenzinhalten des Controller- Oligonukleotides wird Strangverdrängung der Matrizen-Stränge von neusynthetisierten Strängen beeinflusst. Die Strangverdrängung und /oder Ablösung wird entweder quantitativ verlangsamt oder komplett aufgehoben. Es kommt somit gar nicht oder seltener zur Überführung von Primer-Bindungsstellen in den einzelsträngigen Zustand. Somit stehen für eine neue Interaktion mit Primern gar keine oder quantitativ gesehen wenige Primer- Bindungsstellen zur Verfügung. Somit wird das System aus beiden Primer- Verlängerungsprodukten seltener in einen aktiven Zustand versetzt bzw. ein aktiver Zustand wird gar nicht erreicht.
Die Effizienz der Doppelstrang-Öffnung der neusynthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte nach jedem einzelnen Synthese-Schritt wirkt sich auf die potenziell erreichbaren Ausbeuten in darauf folgenden Zyklen aus: je weniger freie/einzelsträngige Primer-Bindungsstellen einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette zu Beginn eines Synthese-Schrittes zur Verfügung gestellt werden, um so geringer ist die Anzahl von neusynthetisierten Strängen der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette in diesem Schritt. Anders ausgedrückt: Die Ausbeute eines Synthese-Zyklus ist proportional der Menge von Primer-Bindungsstellen, welche für die Interaktion mit entsprechenden komplementären Primern zur Verfügung stehen. Insgesamt kann dadurch ein Regelungs-Kreis realisiert werden.
Dieser Regelungs-Kreis entspricht einer Echtzeit-Kontrolle (real-time / on-line control) von synthetisierten Fragmenten: Sequenz-Kontrolle erfolgt im Reaktionsansatz während die Amplifikation stattfindet. Diese Sequenzkontrolle erfolgt nach einem vorgegebenen Muster und das Oligonukleotid-System (durch die Strang-öffnende Wirkung vom Controller-Oligonukleotid) kann ohne äußere Einmischung zwischen "korrekten" und "nicht-korrekten" Zuständen unterscheiden. Im korrekten Zustand wird die Synthese von Sequenzen fortgesetzt, im nicht-korrekten Zustand wird die Synthese entweder verlangsamt oder vollständig verhindert. Die resultierenden Unterschiede in Ausbeuten an„korrekten“ und„nicht-korrekten“ Sequenzen nach jedem Schritt wirken sich auf die gesamte Amplifikation aus, welche eine Vielzahl solcher Schritte umfasst. Bei einer exponentiellen Amplifikation ist diese Abhängigkeit exponentiell, so dass sogar geringfügige Unterschiede in der Effizienz im Rahmen eines einzelnen Synthese-Zyklus aufgrund der Sequenzunterschiede eine signifikante zeitliche Verzögerung der Gesamtamplifikation bedeuten können, bzw. das vollständige Ausbleiben einer detektierbaren Amplifikation in einem vorgegebenen Zeitrahmen bewirken.
Dieser Effekt der Echtzeit-Kontrolle der neusynthetisierten Nukleinsäureketten ist verbunden mit dem Einsatz des Controller-Oligonukleotides und die Wirkung des Controller-Oligonukleotids im Rahmen einer Amplifikation geht somit über den die Länge der Primer-Oligonukleotide umspannenden Bereich deutlich hinaus.
Reaktionsbedingungen bei Strangverdrängungsreaktion
Die Verdrängung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mittels einer sequenzabhängigen Strangverdängung durch das Controller-Oligonukleotid bildet einen Teilschritt in der Amplifikation. Die Reaktionsbedingungen während dieses Schrittes sind entsprechend angepasst. Die Reaktions-Temperatur und die Reaktions-Zeit sind dermassen gewählt, dass die Reaktion erfolgreich stattfinden kann.
In einer besonderen Ausführungsform verläuft die Strangverdrängung durch das Controller- Oligonukleotid bis zur Ablösung / Dissoziation des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt. Eine solche Dissoziation des 3'- Segments des ersten Primer-Verlängerungsproduktes von komplementären Anteilen des zweiten Primerverlängerungsproduktes kann spontan erfolgen im Rahmen einer temperatur-abhängigen / temperatur-bedingten Trennung von beiden Primer-Verlängerungprodukten. Eine solche Dissoziation wirkt sich günstig auf Kinetik der Amplifikationsreaktion aus und kann durch die Wahl der Reaktionsbedinungen beeinflusst werden, z.B. mittels Temperatur-Bedingungen. Die Temperatur-Bedingungen werden deshalb dermassen gewählt, dass eine erfolgreiche Strangverdrängung durch komplementäre Bindung des Controller-Oligonukleotides eine Dissoziation des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes vom 3'-Segment des ersten Primer- Verlängerungsproduktes begünstigt.
Diese Ausführungsform stellt keine „klassische“ PCR dar, sondern die thermisch induzierte Dissoziation des 3‘ Segmentes verläuft in Temperaturbereichen deutlich unter den typischen Strangtrennungs-induzierenden Reaktionen von >90°C der klassischen PCR.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform verläuft die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bis zur Ablösung / Dissoziation eines 3'-Segmentes des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes (P2.1 -Ext) aus der komplementären Bindung mit dem ersten Primer- Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext), wobei dieses 3'-Segment des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes (P2.1 -Ext) zumindest einen komplementeren Bereich zum ersten Primer umfasst und ein komplementäres Segment zum ersten Primerverlängerungsprodukt (P1 .1-Ext), welches erst bei der enzymatischen Synthese entstanden ist. Dabei kommt es zur Ausbildung eines Komplexes (C 1 .1/ P1.1 -Ext / P2.1.-Ext) (Fig. 2B), welcher sowohl das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext), das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) sowie das Controller-Oligonukleotid (C1.1 ) umfasst. In einem solchen Komplex liegt das 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes zumindest vorübergehend in einer einzelsträngiger Form vor, da es vom Controller-Oligonukleotid aus seiner Bindung mit dem ersten Primer- Verlängerungsprodukt verdrängt werden kann. Schematisch dargestellt, besteht ein Gleichgewicht zwischen Bindung und Ablösung des P2.1-Ext an das P1.1-Ext. Das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1 .1-Ext) liegt in einem solchen Komplex komplementär hybridisiert an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext) vor (Fig. 2B).
Aufgrund einer teilweise offenen Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid (3'- Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes) kann ein neues Primer-Oligonukleotid an seine Primer-Bindungsstelle dieses einzelsträngigen Sequenzsegments des noch im Komplex liegenden (P2.1 -Ext) unter Reaktionsbedinungen binden und somit eine Synthese eines neuen ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1.2-Ext) durch eine Polymerase initiieren. In der Regel verläuft diese Reaktion mit verminderter Geschwindigkeit, da das 3'-Segment des P2.1 -Ext nicht dauerhaft einzelsträngig vorliegt, sondern im kompetetiven Verhalten mit Controller-Oligonukleotid steht und damit abwechselnd einzelsträngige und doppelsträngige Zustände durch Bindung an das P1 1 -Ext aufweist.
Fortführung dieser neugestarteten Synthese von P1 2-Ext unter Verwendung des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes als Matrize (P2.1 -Ext) kann durch Polymerase-bedingte Strangverdrängung ebenfalls zur Dissoziierung des Komplexes (C1 .1/ P1 1-Ext / P2.1.-Ext) führen. Dabei wirken Controller-Oligonukleotid, temperatur-abhängige doppelstrang-Destabilisierung und Strang-Verdrängung durch die Polymerase synergistisch und komplementär. Es resultiert eine Dissoziation des 3'-Segments des ersten Primer-Verlängrungsproduktes (P1.1 -Ext) von komplementären Anteilen des zweiten Primerverlängerungsproduktes (P2.1-Ext).
Eine solche Dissoziation wirkt sich günstig auf die Kinetik der Amplifikationsreaktion aus und kann durch die Wahl der Reaktionsbedinungen beeinflusst werden, z.B. mittels Temperatur- Bedingungen. Das Mitwirken der Polymerase-vermittelten syntheseabhängigen Strangverdrängung an der Dissoziierung von P1.1 -Ext und P2.1 -Ext hat einen begünstigenden Effekt bei der Strangtrennung.
Die Temperatur in diesem Schritt umfasst beispielsweise Bereiche von 15°C bis 75°C, insbesondere von 30°C bis 70°C, insbesondere von 50°C bis 70°C.
Bei gegebener Länge des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides und des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides (umfassend beispielsweise Bereiche von 3 bis 25 Nukleotid-Monomeren, insbesondere von 5 bis 15 Nukleotid-Monomeren) kann eine Strangverdrängungsreaktion im Allgemeinen erfolgreich initiiert werden. Bei vollständiger Komplementarität des Controller-Oligonukleotids zu entsprechenden Anteilen des ersten Primer- Verlängerungsproduktes kann das Controller-Oligonukleotid an das erste Primer- Verlängerungsprodukt bis auf das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes binden und das zweite Primer-Verlängerungsprodukt verdrängen. Das zweite Primer- Verlängerungsprodukt verbleibt somit in Verbindung mit dem 3'-Segment des ersten Primer- Verlängerungsproduktes. Diese Stärke dieser Verbindung kann Temperatur-abhängig beeinflusst werden. Beim Erreichen einer kritischen Temperatur kann diese Verbindung zerfallen und beide Primer-Verlängerungsprodukte dissoziieren. Je kürzer die Sequenz des 3'-Segmentes ist, umso instabiler ist diese Verbindung und umso niedriger kann die Temperatur sein, welche eine spontane Dissoziation herbeiführt.
Eine spontane Dissozialtion kann beispielsweise im Temperatur-Bereich erreicht werden, welcher etwa bei der Schmelztemperatur liegt. In bestimmten Ausführungsformen liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid etwa bei der Schmelztemperatur (Tm +/- 3°C) des Komplexes umfassend das 3'-Segment des ersten Primer- Verlängerungsproduktes, welches nicht von Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer-Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt.
In bestimmten Ausführungsformen liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid etwa bei der Schmelztemperatur (Tm +/- 5°C) des Komplexes umfassend das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer-Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt.
In bestimmten Ausführungsformen liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid über der Schmelztemperatur des Komplexes umfassend das 3'- Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer-Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer- Verlängerungsprodukt. Eine solche Temperatur umfasst Temperatur-Bereiche von etwa Tm + 5°C bis Tm+20°C, insbesondere von Tm+5°C bis Tm +10°C. Durch Verwendung einer höheren Temperatur kann das Gleichgewicht in diesem Reaktionsschritt in Richtung Dissoziation verschoben werden. Dadurch kann die Kinetik der Reaktion günstig beeinflusst werden. Verwendung von zu niedrigen Temperaturen im Schritt der Strangverdrängung mittels Controller- Oligonukleotides kann zu einer signifikanten Verlangsamung der Amplifikation führen.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'- Segment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches
Sequenzlängen von 4 bis 6, besser 7 bis 8, insbesondere von 9 bis etwa 18 Nukleotiden umfasst.
Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur- Bereichen zwischen 40°C und 65°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'- Segment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches
Sequenzlängen von 15 bis etwa 25 Nukleotiden umfasst. Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur-Bereichen zwischen 50°C und 70°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'- Segment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches Sequenzlängen von 20 bis etwa 40 Nukleotiden umfasst. Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur-Bereichen zwischen 50°C und 75°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
Die Zusammensetzung des 3'-Segmentes des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und ggf. eine Einführung von Schmelztemperatur-beeinflussenden Oligonukleotid-Modifikationen (z.B. MGB) bzw. Reaktionsbedinungen (z.B. TPAC, Betaine)) kann die Wahl der Temperatur beeinflussen. Eine entsprechende Anpassung kann daher vorgenommen werden.
In bestimmten Ausführungsformen verlaufen alle Schritte der Amplifikation unter stringenten Bedinungen, welche die Ausbildung von unspezifischen Produkten / Nebenprodukten verhindern bzw. verlangsamen. Zu solchen Bedinungen zählen beispielsweise höhere Temperaturen, beispielsweise über 50°C.
In bestimmten Ausführungsformen Verläufen die Einzelschritte der Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotide bei gleicher Temperatur wie die Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes. In bestimmten Ausführungsformen Verläufen die Einzelschritte der Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotide bei Temperatur, welche von der Temperatur der jeweiligen Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes abweicht. In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur. In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur.
Die Konzentration des Controller-Oligonukleotides umfasst Bereiche von 0,01 pmol/l bis 50 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 20 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 10 pmol/l.
Besondere Ausführungsformen des zweiten Primer-Oligonukleotides (Primer-2):
Ein Oligonukleotid, welches mit seinem 3'-Segment in der Lage ist, an eine im Wesentlichen komplementäre Sequenz innerhalb der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder ihrer Äquivalente zu binden und eine spezifische zweite Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren (Fig 14, 27 bis 29, 55, 68 bis 71 ). Dieses zweite Primer-Oligonukleotid ist somit in der Lage, an das 3'-Segment eines ersten spezifischen Primer-Verlängerungsproduktes des ersten Primer-Oligonukleotids zu binden und eine Polymerase-abhängige Synthese eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes zu initiieren. In bestimmten Ausführungsformen ist ein jedes zweite Primer-Oligonukleotid spezifisch für je eine zu amplifizierende Nukleinsäure. Das zweite Primer-Oligonukleotid soll bei der Rücksynthese kopiert werden können und dient auch selbst als Matrize für die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes.
Die Länge des zweiten Primer-Oligonukleotids kann zwischen 15 und 100 Nukleotiden liegen, insbesondere zwischen 20 und 60 Nukleotiden, insbesondere zwischen 30 und 50 Nukleotiden. Die Nukleotid-Bausteine sind insbesondere untereinander via übliche 5'-3' Phosphodieser- Bindung oder Phosphothioester-Bindung verknüpft. Ein solches Primer-Oligonukleotid kann in gewünscher Form chemisch synthetisiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann das zweite Primer-Oligonukleotid Nukleotid-Monomere einschließen, welche die Funktion der Polymerase nicht oder nur unwesentlich beeinflussen, dazu gehöhren beispielsweise:
• natürliche Nukleotide (dA, dT, dC, dG etc.) oder deren Modifikationen ohne veränderte Basen-Paarung
• Modifizierte Nukleotide, 2-Amino-dA, 2-thio-dT oder andere Nukleotid-Modifikationen mit abweichender Basen-Paarung (z.B. Universal-Basenpaaren, wie beispielsweise Inosine 5- Nitroindol).
In einer besonderen Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende dieses Bereichs insbesondere frei von Modifikationen und hat eine funktionsfähige 3'-OH Gruppe, welche von der Polymerase erkannt und matrizenabhänig verlängert werden kann. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst Das 3'-Segment des zweiten Primers mindestens eine Phosphorothioat-Verbindung, so dass kein Abbau vom 3'-Ende des Primers durch die 3'-Exonuclease Aktivität von Polymerasen erfolgen kann.
Das zweite Primer-Oligonukleotid kann in mehreren Teil-Schritten verwendet werden. In erster Linie übernimmt es eine Primer-Funktion in der Amplifikation. Dabei wird die Primer- Verlängerungsreaktion unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize ausgeführt. In bestimmten Ausführungsformen kann das zweite Primer-Oligonukleotid zu Beginn der Amplifikationsreaktion die Start-Nukleinsäurekette als Matrize verwenden. In bestimmten Ausführungsformen kann das zweite Primer-Oligonukleotid bei der Erstellung / Bereitstellung einer Start-Nukleinsäurekette verwendet werden.
Im Rahmen der Amplifikation dient der zweiten Primer als Initiator der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize. Das 3'-Segment des zweiten Primers umfasst eine Sequenz, welche vorwiegend komplementär an das erste Primer-Verlängerungsprodukt binden kann. Die enzymatische Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids unter Verwendung des ersten Primer- Verlängerungsproduktes als Matrize führt zur Ausbildung des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes. Eine solche Synthese erfolgt typischerweise parallel zur Verdrängung des Controller-Oligonukleotides aus seiner Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt. Diese Verdrängung erfolgt vorwiegend durch die Polymerase und kann teilweise durch das zweite Primer-Oligonukleotid erfolgen. Ein solches zweites Verlängerungsprodukt umfasst die Zielsequenz oder ihre Segmente. Im Verlauf der Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes wird die Sequenz des kopierbaren Anteils des ersten Primer- Oligonukleotids von der Polymerase als Matrize erkannt und eine entsprechende komplementäre Sequenz wird synthetisiert. Diese Sequenz liegt im 3'-Segment des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes und umfasst die Primer-Bindungsstelle für das erste Primer- Oligonukleotid. Die Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes erfolgt bis zur Stopp- Position im ersten Primer-Oligonukleotid. Unmittelbar nach der Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes ist dieses Produkt an das erste Primer-Verlängerungsprodukt gebunden und bildet einen doppelsträngigen Komplex. Das zweite Primer-Verlängerungsprodukt wird aus diesem Komplex sequenzspezifisch durch das Controller-Oligonukleotid verdrängt. Nach einer erfolgreichen Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid kann das zweite Primer- Verlängerungsprodukt wiederum selbst als Matrize für die Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes dienen.
Weiterhin kann das zweite Primer-Oligonukleotid als Initiator der Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes ausgehend von der Start-Nukleinsäurekette zu Beginn der Amplifikation dienen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Sequenz des zweiten Primers vollständig komplementär zum entsprechenden Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäurekette. In bestimmten Ausführungsformen ist die Sequenz des zweiten Primer-Oligonukleotides nur teilweise komplementär zum entsprechenden Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäurekette. Diese abweichende Komplementarität soll das zweite Primer-Oligonukleotid allerdings nicht daran hindern, eine vorwiegend sequenzspezifische Primer-Verlängerungsreaktion zu starten. Die jeweiligen Unterschiede in Komplementarität des zweiten Primer-Oligonukleotides zur jeweiligen Position in der Start-Nukleinsäurekette liegen insbesondere im 5'-Segment des zweiten Primer- Oligonukleotides, so dass im 3'-Segment eine vorwiegend komplementäre Basenpaarung und eine Initiierung der Synthese möglich ist. Für die Initiierung der Synthese sollen beispielsweise besonders die ersten 4 - 10 Positionen im 3'-Segment vollkomplementär zur Matrize (Start- Nukleinsäurekette) sein. Die restlichen Nukleotidpositionen können von einer perfekten Komplementarität abweichen. Das Ausmaß einer perfekten Komplementarität im 5'-Segment kann somit Bereiche umfassen zwischen 10% bis 100%, insbesondere zwischen 30% und 100% der Basenzzusammensetzung. Je nach Länge des zweiten Primer-Oligonukleotides, umfässt diese Abweichung von einer vollständigen Komplementarität im 5'-Segment von 1 bis 40, insbesondere 1 bis 20 Nukleotid-Positionen. In bestimmten Ausführungsformen bindet das zweite Primer- Oligonukleotid nur mit seinem 3'-Segment an die Start-Nukleinsäurekette, aber nicht mit seinem 5'-Segment. Die Länge eines solchen zur Start-Nukleinsäurekette vollkomplementären 3'- Segments des zweiten Primer-Oligonukleotides umfasst Bereiche zwischen 6 und 40 Nukleotide, insbesondere zwischen 6 und 30 Nukleotide, insbesondere zwischen 6 und 20. Die Länge eines entsprechenden, zur Start-Nukleinsäurekette nicht komplementären 5'-Segments des zweiten Primer-Oligonukleotides umfasst Bereiche zwischen 5 und 60, insbesondere zwischen 10 und 40 Nukleotide. Das zweite Primer-Oligonukleotid kann somit eine Synthese von einer Start- Nukleinsäukette initiieren. Bei einer darauffolgenden Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes werden Sequenzabschnitte des zweiten Primer-Oligonukleotides von der Polymerase kopiert, so dass wiederum in darauf folgenden Synthese-Zyklen eine vollkomplementäre Primer-Bindungsstelle innerhalb des ersten Primer-Verlängerungsproduktes für die Bindung des zweiten Primer-Oligonukleotides ausgebildet wird und in darauf folgenden Synthese-Zyklen zur Verfügung steht.
In bestimmten Ausführungsformen kann das zweite Primer-Oligonukleotid im Rahmen der Vorbereitung einer Start-Nukleinsäurekette verwendet werden. Dabei kann ein solches zweites Primer-Oligonukleotid an eine Nukleinsäure (z.B. eine einzelsträngige genomische DNA oder RNA oder ihre Äquivalente umfassend eine Zielsequenz) vorwiegend / bevorzugt sequenzspezifisch binden und in Anwesenheit einer Polymerase eine matrizenabhängige Primer- Verlängerungsreaktion initiieren. Die Bindungsposition ist dermassen gewählt, dass das Primer- Verlängerungsprodukt eine gewünschte Zielsequenz umfasst. Durch die Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotides resultiert ein Strang, welche eine zur Matrize komplementäre Sequenz aufweist. Ein solcher Strang kann von der Matrize abgelöst werden (z.B. durch Hitze oder Alkalie) und damit in eine einzelsträngige Form überführt werden. Eine solche einzelsträngige Nukleinsäurekette kann als Start-Nukleinsäurekette zu Beginn der Amplifikation dienen. Eine solche Start-Nukleinsäurekette umfasst in ihrem 5'-Segment die Sequenzanteile des zweiten Primer-Oligonukleotides, weiterhin umfasst sie eine Zielsequenz oder ihre Äquivalente und eine Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid. Weitere Schritte sind im Abschnitt „Start-Nukleinsäurekette“ erläutert.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst das zweite Primer-Oligonukleotid zumindest in seinem 3'-Segment Sequenzanteile, welche komplementär und sequenzspezifisch an ein Sequenzsegment einer Zielsequenz binden können und eine erfolgreiche Primer- Verlängerungsreaktion durch die Polymerase initiieren / unterstützen. Die Länge eines solchen Sequenzsegments umfasst Bereiche von 6 und 40 Nukleotide, insbesondere von 8 bis 30 Nukleotide, insbesondere von 10 bis 25 Nukleotide.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst das zweite Primer-Oligonukleotid in seinem 3'- und 5'- Segment kopierbare Sequenzabschnitte, welche bei Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes von der Polymerase kopiert werden. Somit werden alle Sequenzabschnitte des zweiten Primers von der Polymerase kopiert. Das führt zur Ausbildung einer Primer-Bindungsstelle im 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes.
In bestimmten Ausführungsformen entspricht das zweite Primer-Oligonukleotid mit seinen kopierbaren Anteilen in ihrer Länge dem 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird. Im Komplex umfassend das zweite Primer-Oligonukleotid und das erste Primer-Verlängerungsprodukt grenzt das 3'-Ende eines solchen zweiten Primer-Oligonukleotides an das Controller-Oligonukleotid, welches an das erste Primer-Verlängerungsprodukt gebunden ist. Verlängerung eines solchen Primers erfolgt unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungproduktes als Matrize. Bei Verlängerung eines solchen Primers erfolgt die Verdrängung des Controller-Oligonukleotides aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mittels Polymerase-abhängiger Strangverdrängung.
In bestimmten Ausführungsformen ist das zweite Primer-Oligonukleotid mit seinen kopierbaren Sequenzanteilen kürzer als das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird. Im Komplex umfassend das zweite Primer- Oligonukleotid und das erste Primer-Verlängerungsprodukt liegt somit zwischen dem 3'-Ende eines solchen Primers und dem an das erste Primer-Verlängerungsprodukt gebundenen Controller-Oligonukleotids ein einzelsträngiger Abschnitt des ersten Primer- Verlängerungsproduktes. Verlängerung eines solchen Primers erfolgt unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungproduktes als Matrize. Bei Verlängerung eines solchen Primers erfolgt die Verdrängung des Controller-Oligonukleotides aus der Bindung mit dem ersten Primer- Verlängerungsprodukt mittels Polymerase-abhängiger Strangverdrängung.
In bestimmten Ausführungsformen ist das zweite Primer-Oligonukleotid mit seinen kopierbaren Anteilen länger als das 3 '-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird. Im Komplex aus dem zweiten Primer-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt konkurrieren das 3 '-Segment des zweiten Primers und das 5'-Segment des Controller-Oligonukleotides um die Bindung an das erste Primer- Verlängerungsprodukt. Die für eine Initiierung der Synthese erforderliche Bindung des 3'- Segments des zweiten Primers an das erste Primer-Verlängerungsprodukt erfolgt unter gleichzeitiger partieller Verdrängung des 5'-Segmentes des Controller-Oligonukleotides.
Nach Initiierung der Synthese durch die Polymerase erfolgt die Verlängerung eines solchen Primers unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungproduktes als Matrize. Bei Verlängerung eines solchen Primers erfolgt die Verdrängung des Controller-Oligonukleotides aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mittels Polymerase-abhängiger Strangverdrängung. Die Sequenzlänge des 3'-Segments des zweiten Primer-Oligonukleotides, welches das 5'-Segment des Controller-Oligonukleotid verdrängt, kann folgende Bereiche umfassen: 1 bis 50 Nukleotide, insbesondere 3 bis 30 Nukleotide, insbesondere 5 bis 20 Nukleotide. Die Verwendung von zweiten Primer-Oligonukleotiden mit einer größeren Länge, welche die Länge des 3'-Segments des ersten Primer-Verlängerungsproduktes übersteigt, ist beispielsweise in einigen Ausführungsformen vorteilhaft. Solche Ausführungsformen umfassen beispielsweise ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt mit einem 3'-Segment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, mit einer Länge von 5 bis 40 Nukleotiden, insbesondere von 10 bis 30 Nukleotiden. Besonders bei kürzeren 3'-Segmenten bietet ein längeres zweites Primer-Oligonukleotid eine verbesserte Sequenzspezifität bei Initiierung der Synthese. Die Bindungsstärke des zweiten Primer-Oligonukleotides an seine Primer-Bindungsstelle hängt von der Länge des Primers ab. Im Allgemeinen können längere zweite Primer-Oligonukleotide bei höheren Reaktionstemperaturen eingesetzt werden.
Insbesondere sind Sequenzen des ersten, des zweiten Primer-Oligonukleotides und des Controller-Oligonukleotides dermassen aneinander angepasst, dass Nebenreaktionen, z.B. Primer-Dimer-Ausbildung, minimiert sind. Zu diesem Zweck sind beispielsweise die Sequenz des ersten und des zweiten Primer-Oligonukleotides aneinander demassen angepasst, daß beide Primer-Oligonukleotide nicht in der Lage sind, eine Amplifikations-Reaktion in Abwesenheit einer passenden Matrize und/oder einer Zielsequenz und/oder einer Start-Nukleinsäurekette zu starten. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass das zweite Primer-Oligonukleotid keine Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid umfasst und das erste Primer- Oligonukleotid keine Primer-Bindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid umfasst. Weiterhin soll vermieden werden, dass die Primer-Sequenzen ausgedehnte eigen-komplementäre Strukturen (Self-complement) umfassen.
Die Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes ist eine Primer-Verlängerungsreaktion und bildet einen Teilschritt in der ersten Amplifikation. Die Reaktionsbedingungen während dieses Schrittes sind entsprechend angepasst. Die Reaktions-Temperatur und die Reaktions-Zeit sind dermassen gewählt, dass die Reaktion erfolgreich stattfinden kann. Die jeweils bevorzugte Temperatur in diesem Schritt hängt von der verwendeten Polymerase ab und der Bindungsstärke des jeweiligen zweiten Primer-Oligonukleotides an seine Primer-Bindungsstelle und umfasst beispielsweise Bereiche von 15°C bis 75°C, insbesondere von 20 bis 65°C, insbesondere von 25°C bis 65°C. Die Konzentration des zweiten Primer-Oligonukleotides umfasst Bereiche von 0,01 pmol/l bis 50 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 20 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 10 pmol/l.
In bestimmten Ausführungsformen verlaufen alle Schritte der Amplifikation unter stringenten Bedinungen, welche die Ausbildung von unspezifischen Produkten / Nebenprodukten verhindern bzw. verlangsamen. Zu solchen Bedinungen zählen beispielsweise höhere Temperaturen, beispielsweise über 50°C.
Falls mehr als eine spezifische Nukleinsäurekette in einem Ansatz amplifiziert werden muss, werden in bestimmten Ausführungsformen bevorzugt jeweils sequenzspezifische Primer- Oligonukleotide für die Amplifikation von entsprechenden jeweiligen Zielsequenzen verwendet.
In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des ersten und des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes bei gleicher Temperatur. In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes bei unterschiedlichen Temperaturen. In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur. In bestimmten Ausführungsformen verläuft die Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei unterschiedlichen Temperaturen. Polymerasen :
Bevorzugt werden matrizenabhängige Polymerasen verwendet, welche zur Strangverdrängung fähig sind.
In einzelnen Ausführungsformen können beispielsweise ein großes Fragment der Bst Polymerase oder ihre Modifikationen (z.B. Bst 2.0 DNA Polymerase) verwendet werden. Weiterhin können Klenow Fragment, Vent exo minus Polymerase, Deepvent exo minus DNA Polymerase, großes Fragment der Bsu DNA Polymerase, großes Fragment der Bsm DNA Polymerase verwendet werden. Vent exo minus Polymerase, Deepvent exo minus DNA (von NEB) und PyroPhage Polymerase von Lucigen sind thermostabile Enzyme mit Strangverdrängungs-Aktivität.
In einer Ausführungsform werden Polymerasen verwendet, welche bei Raumtemperatur keine Aktivität vorweisen, sogenannte Hot-Start-Polymerasen oder Warm-Start-Polymerasen. Ein Beispiel dafür stellt Bst 2.0 Polymerase Warm Start (von NEB).
Besondere Ausführungsformen des driten Primer-Oligonukleotids
(Komponente des zweiten Amplifikations-Systems)
In einer Ausführungsform ist das dritte Primer-Oligonukleotid mit dem ersten Primer-Oligonukleotid des ersten Amplifikations-Systems identisch.
In bestimmten Ausführungsformen ist das dritte Primer-Oligonukleotid nicht mit dem ersten Primer- Oligonukleotid des ersten Amplifikations-Systems identisch.
Die Länge des dritten Primer-Oligonukleotids kann zwischen 15 und 100 Nukleotiden liegen, insbesondere zwischen 20 und 60 Nukleotiden, insbesondere zwischen 30 und 50 Nukleotiden. Der CG-Gehalt liegt beispielsweise zwischen 20% und 80%, insbesondere zwischen 30 und 79%. Die Nukleotid-Bausteine sind insbesondere untereinander via übliche 5'-3' Phosphodieser- Bindung oder Phosphothioester-Bindung verknüpft. Ein solches Primer-Oligonukleotid kann in gewünscher Form chemisch synthetisiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann das dritte Primer-Oligonukleotid Nukleotid-Monomere einschließen, welche die Funktion der Polymerase nicht oder nur unwesentlich beeinflussen, dazu gehöhren beispielsweise:
• natürliche Nukleotide (dA, dT, dC, dG etc.) oder deren Modifikationen ohne veränderte Basen-Paarung
• Modifizierte Nukleotide, nuklease-resistente Phosphorothioat-Verbindungen (PTO) Modifikationen, LNA-Modifikationen, 2-Amino-dA, 2-thio-dT oder andere Nukleotid- Modifikationen mit abweichender Basen-Paarung (z.B. Universal-Basenpaaren, wie beispielsweise Inosine 5-Nitroindol).
In einer besonderen Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende des dritten Primer-Oligonukleotids insbesondere frei von Modifikationen und hat eine funktionsfähige 3'-OH Gruppe, welche von der Polymerase erkannt und matrizenabhängig verlängert werden kann. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst das 3'-Segment des dritten Primers mindestens eine Phosphorothioat- Verbindung, so dass kein Abbau des 3'-Endes des Primers durch 3'-Exonuclease Aktivität von Polymerasen erfolgen kann.
In bestimmten Ausführungsformen ist das 3'-Ende des dritten Primers blockiert. Beispielsweise mit einer 3 '-Phosphat-Gruppe oder mit einem C3-Linker. Die Aktivierung des 3'-Segmentes des dritten Primer-Oligonukleotides erfolgt bei diesen Ausführungsformen erst in der zweiten Amplifikation, z.B. unter Verwendung von 3 '-5'-Exonuklease-Aktivität der zweiten Polymerase.
Das dritte Primer-Oligonukleotid umfasst insbesondere keine Sequenzsegmente, welche mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides komplementär binden können.
Das dritte Primer-Oligonukleotid (Fig. 15 - 31 ) kann in verschiedenen Anordnungen bezogen auf das erste Amplifikations-Fragment 1.1 (das erste Amplifikations-Produkt 1.1 , umfassend eine Zielsequenz) positioniert werden.
Damit die zweite Amplifikations-Reaktion unter Verwendung eines ersten Amplifikations- Fragmentes 1 .1 als Matrize (Start-Nukleinsäurekette 2.1 ) starten kann, müssen der dritte und der vierte Primer innerhalb von durch das erste Amplifikations-Fragment vorgegebene Sequenzen binden und von der Polymerase verlängert werden.
In einer besonderen Ausführungsform kann das dritte Primer-Oligonukleotid an einen Strang des ersten Amplifikations-Fragmentes 1 .1 binden. Insbesondere bindet das dritte Primer- Oligonukleotid an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt und kann unter Verwendung einer geeigneten Polymerase und Reaktionsbedingungen dabei eine Primer-Verlängerung initiieren.
Diese Bindung des dritten Primer-Oligonukleotides erfolgt in bestimmten Ausführungsformen bevorzugt im 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Das dritte Primer-Oligonukleotid umfasst bevorzugt ein Sequenzsegment in seinem 3'-Bereich, welches komplementär oder vorwiegend komplementär an das zweite Primer- Verlängerungsprodukt unter verwendeten Reaktionsbedinungen binden kann, so dass die Polymerase in der Lage ist, die Synthese des dritten Primer-Verlängerungsprodukts zu initiieren.
Die Länge dieses Segments umfasst insbesondere Bereiche zwischen 6 und 30 Nukleotiden, insbesondere zwischen 8 und 25 Nukleotide, insbesondere zwischen 10 und 20 Nukleotiden, insbesondere zwischen 10 und 15 Nukleotiden. In bestimmten Ausführungsformen ist dieses Segment vollkomplementär zum korrespondierenden Segment des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes. In bestimmten Ausführungsformen umfasst dieses Segment mindestens einen Mismatch zum Primer-Verlängerungsprodukt. Insbesondere liegt die Position dieses Mismatchs nicht näher als -4 Position bezogen auf das 3'-Ende des dritten Primers, insbesondere nicht näher als -5, insbesondere nicht näherals - 6, insbesondere nicht näher als Position -8 bezogen auf das 3'-Ende des dritten Primer-Oligonukleotides. Da das dritte Primer-Oligonukleotid mit diesem 3'-Segment auch an das Controller-Oligonukleotid binden kann, wird durch ein solches Mismatch die Bindung dieses Segmentes an das Controller-Oligonukleotid geschwächt. Bei der Wahl der Länge und der Anzahl von Mismatches wird somit berücksichtigt, dass das 3'-Segment zwar an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt binden soll und eine Primer-Verlängerungs- Reaktion initieren soll, doch gleichzeitig wird berücksitigt, dass dieses Segment bei verwendeten Reaktionsbedinungen nicht irreversibel an das Controller-Oligonukleotid bindet und somit dieses inaktiviert.
Bei der Wahl der Position und der Länge werden somit Interaktionen zwischen dem dritten Primer- Oligonukleotid und dem Controller, sowie dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt berücksichtigt.
Die Position der Bindung dieses Segments an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt kann unterschiedlich gewählt werden (Fig. 27 - 31 , 57).
Beispielsweise kann das dritte Primer-Oligonukleotid an das gleiche Sequenzsegment vorwiegend komplementär binden, wie das erste Primer-Oligonukleotid. Die Position des 3'-Endes des dritten Primer-Oligonukleotides stimmt mit der Position des 3'-Endes des ersten Primer-Oligonukleotides überein. Somit kann das dritte Primer-Oligonukleotid zumindest teilweise (mit seinem 3'-Segment) an einen Anteil der Zielsequenz komplementär binden. Das 3'-Ende des dritten Primers liegt somit innerhalb der zweiten Blockierungseinheit des Controller-Oligonukleotides und kann nicht unter Verwendung des Controllers als Matrize durch die Polymerase verlängert werden (Fig. 20).
In bestimmten Ausführungsformen bindet das dritte Primer-Oligonukleotid vorwiegend komplementär an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt, wobei sein 3'-Ende verschoben liegt bezogen auf das 3'-Ende des ersten Primer-Oligonukleotides. In bestimmten Ausführungsformen ist das 3'-Ende des dritten Primer-Oligonukleotides verschoben um mindestens ein Nukleotid in 3'-Richtung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes. Somit liegt das Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes, an welches das dritte Primer-Oligonukleotid vorwiegend komplementär binden kann, in 3'-Richtung verschoben (Fig. 19).
In bestimmten Ausführungsformen ist das 3'-Ende des dritten Primer-Oligonukleotides verschoben um mindestens ein Nukleotid in 5'-Richtung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes. Somit liegt das Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes, an welches das dritte Primer- Oligonukleotid vorwiegend komplementär binden kann, in 5'-Richtung verschoben (Fig. 21 )
In bestimmten Ausführungsformen ist die Bindungsposition des dritten Primer-Oligonukleotides dermassen verschoben in 5'-Richtung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes, so dass das dritte Primer-Oligonukleotid nicht mit der Bindungsposition des ersten Primer-Oligonukleotides des ersten Amplifikations-Systems überlappt. Somit liegt das Segment des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes, an welches das dritte Primer-Oligonukleotid vorwiegend komplementär binden kann, in 5'-Richtung verschoben relativ zur Bindungsstelle des ersten Primer- Oligonukleotides (Fig. 22) Das dritte Primer-Oligonukleotid umfasst somit Sequenzsegmente, welche komplementär an das Controller-Oligonukleotid binden können. Das Segment des Controller-Oligonukleotides, welche komplementär an das dritte Primer-Oligonukleotid binden können, werden als vierter Bereich des Contoller-Oligonukleotides bezeichnet. Um die ungewollte Primer-Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotides am Controller zu verhindern, werden zumindest Positionen des Controller- Oligonukleotides, welche um das 3'-Ende des dritten Primer-Oligonukleotides lokalisiert sind, modifiziert. Beispielsweise kann das in ähnlicherWeise erfolgen, wie bei Modifkationen der zweiten Blockierungs-Einheit. Das Segment des Controllers, welches solche Modifikationen umfasst (welche die Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotides verhindern) wird als die vierte Blockierungseinheit bezeichnet (Fig. 19 - 22). Ihre Position richtet sich an die potenzielle Bindungsposition des dritten Primer-Oligonukleotides innerhalb des Controllers.
Das dritte Primer-Oligonukleotid soll bei Rücksynthese kopiert werden können und dient auch als selbst Matrize für die Synthese des vierten Primer-Verlängerungsproduktes.
Das dritte Primer-Oligonukleotid umfasst in bestimmten Ausführungsformenen mindestens ein Sequenz-Segment in seinem 3'-Bereich, welches an die erste Zielsequenz vorwiegend komplementär binden kann. Dieses Segment kann an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (umfassend entsprechende Segmente der Zielsequenz) vorwiegend komplementär binden, wobei die Polymerase eine Primer-Verlängerungsreaktion ausführen kann.
Das dritte Primer-Oligonukleotid umfasst in bestimmten Ausführungsformenen mindestens ein Sequenz-Segment in seinem 5'-Bereich, welches nicht komplementär zur Zielsequenz ist. Dieses Segment kann beispielsweise von 1 bis 60 Nukleotide umfassen und kann beispielsweise für andere Zwecke dienen, beispielsweise Barcoding, Clonierung, Immobilisierung, Sonden-Bindung etc. Die Sequenzzusammensetzung dieses 5'-Bereichs wird dermassen angepasst, dass es die zweite Amplifikation nicht stört.
Das dritte Primer-Oligonukleotid kann weitere Modifikationen umfassen, z.B. Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. FAM, Cy5 etc.), Fluoreszenz-Quencher (z.B. BHQ1 , BHQ2 etc), Affinitäts-Marker (z.B. Biotin, Digoxigenin etc.). In einer weiteren Ausführungsform kann das dritte Primer-Oligonukleotid einen Linker (z.B. C3 oder HEG-Linker) umfassen, so dass sein 5'-Bereich von der Polymerase unkopiert bleibt.
In bestimmten Ausführungsformen ist der dritte Primer an einer festen Phase vor der zweiten Amplifikations-Reaktion immobilisiert. Die Primer-Verlängerung dieses dritten Primer- Oligonukleotides führt somit zur Immobilisierung des gesamten dritten Primer- Verlängerungsproduktes.
Die verwendete Konzentration des dritten Primer-Oligonukleotides kann beispielsweise Bereiche zwischen 0,01 pmol/l bis ca. 10 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und etwa 2 pmol/l umfassen.
Besondere Ausführungsformen des vierten Primer-Oligonukleotids (Komponente des zweiten Amplifikations-Systems)
In einer Ausführngsform ist das vierte Primer-Oligonukleotid mit dem zweiten Primer-Oligonukleotid des ersten Amplifikations-Systems identisch.
In bestimmten Ausführungsformen ist das vierte Primer-Oligonukleotid nicht mit dem zweiten Primer-Oligonukleotid des ersten Amplifikations-Systems identisch.
Die Länge des vierten Primer-Oligonukleotids kann zwischen 15 und 100 Nukleotiden liegen, insbesondere zwischen 20 und 60 Nukleotiden, insbesondere zwischen 30 und 50 Nukleotiden. Der CG-Gehalt liegt beispielsweise zwischen 20% und 80%, insbesondere zwischen 30 und 79%. Die Nukleotid-Bausteine sind insbesondere untereinander via übliche 5'-3' Phosphodiester- Bindung oder Phosphothioester-Bindung verknüpft. Ein solches Primer-Oligonukleotid kann in gewünschter Form chemisch synthetisiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann das vierte Primer-Oligonukleotid Nukleotid-Monomere einschließen, welche die Funktion der Polymerase nicht oder nur unwesentlich beeinflussen, dazu gehöhren beispielsweise:
• natürliche Nukleotide (dA, dT, dC, dG etc.) oder deren Modifikationen ohne veränderte Basen-Paarung
• Modifizierte Nukleotide, nuklease-resistente Phosphorothioat-Verbindungen (PTO) Modifikationen, LNA-Modifikationen, 2-Amino-dA, 2-thio-dT oder andere Nukleotid- Modifikationen mit abweichender Basen-Paarung (z.B. Universal-Basenpaaren, wie beispielsweise Inosine 5-Nitroindol).
In einer besonderen Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende des vierten Primer-Oligonukleotids insbesondere frei von Modifikationen und hat eine funktionsfähige 3'-OH Gruppe, welche von der Polymerase erkannt und matrizenabhängig verlängert werden kann. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst das 3'-Segment des vierten Primers mindestens eine Phosphorothioat- Verbindung, so dass kein Abbau vom 3'-Ende des Primers durch die 3'-Exonuclease Aktivität von Polymerasen erfolgen kann.
In bestimmten Ausführungsformen ist das 3 '-Ende des vierten Primers blockiert. Beispielsweise mit einer 3'-Phosphat-Gruppe oder mit einem C3-Linker. Die Aktivierung des 3'-Segmentes des vierten Primer-Oligonukleotides erfolgt bei diesen Ausführungsformen erst in der zweiten Amplifikation, z.B. unter Verwendung von 3'-5'-Exonuklease-Aktivität der zweiten Polymerase.
Das vierte Primer-Oligonukleotid umfasst insbesondere keine Sequenzsegmente, welche mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides komplementär binden können.
Das vierte Primer-Oligonukleotid (Fig. 15 - 31 ) kann in verschiedenen Anordnungen bezogen auf das erste Amplifikations-Fragment 1.1 (das erste Amplifikations-Produkt 1.1 , umfassend eine Zielsequenz) positioniert werden. Damit die zweite Amplifikations-Reaktion unter Verwendung eines ersten Amplifikations- Fragmentes 1 .1 als Matrize (Start-Nukleinsäurekette 2.1 ) starten kann, müssen der dritte und der vierte Primer innerhalb von durch das erste Amplifikations-Fragment vorgegebene Sequenzen binden und von der Polymerase verlängert werden.
In einer besonderen Ausführungsform kann das vierte Primer-Oligonukleotid an einen Strang des ersten Amplifikations-Fragmentes 1.1 binden. Bevorzugt bindet das vierte Primer-Oligonukleotid an das erste Primer-Verlängerungsprodukt und kann unter Verwendung einer geeigneten Polymerase und Reaktionsbedingungen dabei eine Primer-Verlängerung initiieren.
Diese Bindung des vierten Primer-Oligonukleotides erfolgt in bestimmten Ausführungsformen bevorzugt im 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes.
Das vierte Primer-Oligonukleotid umfasst bevorzugt ein Sequenzsegment in seinem 3'-Bereich, welches komplementär oder vorwiegend komplementär an das erste Primer-Verlängerungsprodukt unter verwendeten Reaktionsbedinungen binden kann, so dass die Polymerase in der Lage ist, dass die Synthese des vierten Primer-Verlängerungsprodukts zu initiieren.
Die Länge dieses Segments umfasst insbesondere Bereiche zwischen 6 und 40 Nukleotiden, insbesondere zwischen 8 und 30 Nukleotide, insbesondere zwischen 10 und 25 Nukleotiden, insbesondere zwischen 10 und 20 Nukleotiden. In bestimmten Ausführungsformen ist dieses Segment vollkomplementär zum korrespondierenden Segment des ersten Primer- Verlängerungsproduktes. In bestimmten Ausführungsformen umfasst dieses Segment mindestens einen Mismatch zum ersten Primer-Verlängerungsprodukt. Insbesondere liegt die Position dieses Mismatches nicht näher als -4 Position bezogen auf das 3 '-Ende des vierten Primers, insbesondere nicht näher als -5, insbesondere nicht näher als - 6, insbesondere nicht näher als Position -8 bezogen auf das 3'-Ende des vierten Primer-Oligonukleotides.
Die Position der Bindung dieses Segments an das erste Primer-Verlängerungsprodukt kann unterschiedlich gewählt werden (Fig. 23 - 31 , 57).
Beispielsweise kann das vierte Primer-Oligonukleotid an das gleiche Sequenzsegment vorwiegend komplementär binden, wie das zweite Primer-Oligonukleotid. Die Position des 3'-Endes des vierten Primer-Oligonukleotides stimmt mit der Position des 3 '-Endes des zweiten Primer- Oligonukleotides überein. Somit umfasst das vierte Primer-Oligonukleotid zumindest teilweise (mit seinem 3'-Segment) einen Anteil der Zielsequenz.
In bestimmten Ausführungsformen bindet das vierte Primer-Oligonukleotid vorwiegend komplementär an das erste Primer-Verlängerungsprodukt, wobei sein 3'-Ende liegt verschoben bezogen auf das 3'-Ende des zweiten Primer-Oligonukleotides. In bestimmten Ausführungsformen ist das 3'-Ende des vierten Primer-Oligonukleotides verschoben um mindestens ein Nukleotid in 3'-Richtung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes. Somit liegt das Segment des ersten Primer-Verlängerungsprodutkes, an welches das vierte Primer-Oligonukleotid vorwiegend komplementär binden kann in 3'-Richtung verschoben (Fig.1 ). In bestimmten Ausführungsformen ist das 3'-Ende des vierten Primer-Oligonukleotides verschoben um mindestens ein Nukleotid in 5'-Richtung des ersten Primer- Verlängerungsproduktes. Somit liegt das Segment des ersten Primer-Verlängerungsprodutkes, an welches das vierte Primer-Oligonukleotid vorwiegend komplementär binden kann in 5'-Richtung verschoben.
Das vierte Primer-Oligonukleotid umfasst insbesondere keine Sequenzsegmente, welche komplementär an das Controller-Oligonukleotid binden können.
Das vierte Primer-Oligonukleotid soll bei Rücksynthese kopiert werden können und dient auch selbst als Matrize für im Rahmen der Synthese des dritten Primer-Verlängerungsproduktes.
Das vierte Primer-Oligonukleotid umfasst in bestimmten Ausführungsformenen mindestens ein Sequenz-Segment in seinem 3'-Bereich, welches Anteile der ersten Zielsequenz umfasst und somit an einen Strang, welcher komplementär zur Zielsequenz ist, binden kann. Dieses Segment kann an das erste Primer-Verlängerungsprodukt (umfassend entsprechende komplementäre Segmente zur Zielsequenz) vorwiegend komplementär binden, wobei die Polymerase eine Primer- Verlängerungsreaktion ausführen kann.
Das vierte Primer-Oligonukleotid umfasst in bestimmten Ausführungsformenen mindestens ein Sequenz-Segment in seinem 5'-Bereich, welches keine Sequenzsegmente der ersten Zielsequenz umfasst. Dieses Segment kann beispielsweise von 1 bis 60 Nukleotide umfassen und kann beispielsweise für andere Zwecke dienen, beispielsweise „Barcoding“, Klonierung, Immobilisierung, Sonden-Bindung etc. Die Sequenzzusammensetzung dieses 5'-Bereichs wird dermassen angepasst, dass er die zweite Amplifikation nicht stört.
Das vierte Primer-Oligonukleotid kann weitere Modifikationen umfassen, z.B. Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. FAM, Cy5 etc.), Fluoreszenz-Quencher (z.B. BHQ1 , BHQ2 etc), Affinitäts-Marker (z.B. Biotin, Digoxigenin etc.) In einer weiteren Ausführungsform kann das vierte Primer-Oligonukleotid einen Linker (z.B. C3 oder HEG-Linker) umfassen, so dass sein 5'-Bereich von der Polymerase unkopiert bleibt.
In bestimmten Ausführungsformen ist der vierte Primer an einer festen Phase vor der zweiten Amplifikations-Reaktion immobilisiert. Die Primer-Verlängerung eines solchen vierten Primer- Oligonukleotides führt somit zu Immobilisierung des gesamten vierten Primer- Verlängerungsproduktes.
Die verwendete Konzentration des vierten Primer-Oligonukleotides kann beispielsweise Bereiche zwischen 0,01 pmol/l bis ca. 10 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und etwa 2 pmol/l umfassen.
Polymerasen des zweiten Amplifikations-Systems:
Zur Ausführung einer PCR sind viele Polymerasen bekannt. In bestimmten Ausführungsformen werden thermostabile matrizenabhängige DNA-Polymerasen verwendet, welche eine 5'-3'-Exonuklease Aktivität aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen wird Taq-Polymerase und / oder Ihre Formulierungen und / oder ihre Modifikationen (z.B. Ampli-Taq) zur Ausführung der zweiten Amplifikation verwendet.
In bestimmten Ausführungsformen werden thermostabile matrizenabhängige DNA-Polymerasen verwendet, welche eine Strang-Verdängungs Aktivität aufweisen. Beispielsweise Vent Exo minus (von NEB), PyroPhage Polymerase (von Lucigene), SD Polymerase (von Bioron).
In bestimmten Ausführungsformen werden thermostabile matrizenabhängige DNA-Polymerasen verwendet, welche eine 3'-5'-Proof-Reading-Aktivität aufweisen. Beispielsweise Vent exo plus, Deep Vent exo plus (von NEB), Pfu Polymerase (Jena Biosciences), Phusion Polymerase (NEB).
In bestimmten Ausführungsformen werden thermostabile matrizenabhängige DNA-Polymerasen verwendet, welche mit einem weiteren Protein konjugiert sind, beispielsweise um Prozessivität der Polymerase zu erhöhen. Beispielsweise Phusion Polymerase (NEB).
Primer-Oligonukleotide umfassend zusätzliche Sequenz-Segmente:
Die oben angeführten Strukturen des ersten Primers und des zweiten Primers können als sogenannte„Basis-Struktur des Primers“ bzw.„Minimale Struktur des Primers“ aufgefasst werden.
Solche Basis-Strukturen von Oligonukleotiden mit Primer-Funktion (z.B. erstes Primer- Oligonukleotid, zweites Primer-Oligonukleotid, ggf. drittes Primer-Oligonukleotid, ggf. viertes Primer-Oligonukleotid usw.) umfassen Sequenz-Segmente, welche für die Ausführung des Amplifikations-Verfahrens vorteilhaft sind, beispielsweise den ersten und zweiten Bereich des ersten Primers.
Eine solche Basis-Struktur der Primer kann durch weitere, zusätzliche Sequenz-Segmente erweitert werden. Solche zusätzlichen Sequenz-Segmente umfassen Strukturen, welche ihrerseits zwar nicht für die Ausführung des Amplifikations-Verfahrens notwendig sind, dennoch für andere Aufgaben nützlich sein können.
Solche zusätzliche Sequenz-Segmente können optional in einen Primer eingeführt werden und für weitere Funktionen bzw. Reaktionen eingesetzt werden. Dadurch können die von der Polymerase synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte (ausgehend z.B. vom ersten und /oder vom zweiten Primer) mit solchen Sequenzen-Segmenten verbunden werden. Dadurch wird eine Integration solcher zusätzlichen Sequenz-Segmente und Primer-Verlängerungsprodukte zu einer molekularen Struktur erreicht. Eine solche Integration kann in gewissen Ausführungsformen vorteilhaft sein. Eine Vielzahl von Anwendungen für Primer-Sequenzen mit zusätzlichen Sequenz-Segmenten sind einem Fachmann bekannt.
Mehrere Funktionen sind einem Fachmann bekannt, welche durch zusätzliche Sequenz-Segmente des Primers unterstützt werden. Die Einführung von zusätzlichen Strukturen kann beispielsweise als Mittel zur Vermittlung einer intermolekularen oder intramolekularen Bindung verwendet werden. Einem Fachmann sind mehrere Beispiele solcher Strukturen bekannt. Beispielsweise können Sonden nach einem solchen Prinzip einer intra-molekularen Bindung gestaltet werden, z.B. im Rahmen von Scorpion- Primern. Beispielsweise können weiterhin Sequenzsegmente zur Bindung von weiteren Oligonukleotiden dienen. Dabei kann eine sequenz-spezifische inter-molekulare Bindung unter Verwendung von stringenten Bedingungen zustande kommen. Solche Interaktionen können beispielsweise für die Bindung von Amplifikations-Produkten an eine feste Phase durch komplementäre Bindung an immobilisierte Oligonukleotide verwendet werden.
Ein weiteres Beispiel stellt Einführung von sogenannten Adaptor-Sequenzen und / oder Verwendung von weiteren Sequenz-Segmenten zur eindeutigen Kodierung bzw. sequenz spezifischen Markierung von Primern und davon ausgehenden Primer-Verlängerungsprodukten (sogenanntes Primer Barcoding). Das wird beispielsweise für NGS-Library Preparation verwendet (Stählberq et al Nucleic Acids Res. 2016 Jun 20; 44(1 1 ): e105). Bei der Sequenz-Analyse von Primer-Verlängerungs-Produkten kann durch eine solche Markierung eine spätere Zuordnung von Sequenzen erfolgen.
Noch ein weiteres Beispiel stellt die Verwendung von weiteren Sequenz-Segmenten zur Einführung von spezifischen Sequenzen mit Bindung von gewissen Proteinen, z.B. Restrictions- Endonukleasen etc.
Noch ein weiteres Beispiel stellt die Verwendung von weiteren Sequenz-Segmenten zur Einführung von Abstand-Halter-Sequenzen (Spacer-Sequences), welche keinen spezifischen interaktions-Partner binden sollen, sondern vorwiegend zur Erhöhung des Abstandes zwischen benachbarten Sequenzen dienen.
Solche zusätzlichen Sequenzen können entweder am kopierbaren Anteil des Primers positioniert werden oder an den unkopierbaren Anteil des Primers angefügt werden. Mehrere Faktoren spielen eine Rolle bei der Beurteilung, ob ein Sequenzsegment kopiert wird oder nicht. Beispielsweise kann Positionierung des Sequenzsegmentes im jeweiligen Oligonukleotid, verwendete Nukleotid- Modifikationen (z.B. C3, HEG, 2'-Ome etc.) darüber entscheiden, ob ein Sequenz-Segment als Template während eines Verfahrensschrittes verwendet wird oder nicht.
In einer Ausführungsform wird ein zusätzliches Sequenz-Segment in kopierbaren Bereich des Primers, z.B. am 5'-Segment des kopierbaren Anteils des zweiten Primers, eingeführt, so dass beispielsweise bei der Ablesung der Primer-Sequenz während eines Synthese-Vorgangs einer Zielsequenz auch zusätzliche Sequenz-Segmente von der Polymerase ebenfalls abgelesen werden. Die Länge eines solchen zusätzlichen Sequenz-Segments umfasst Bereiche von 3 bis 50 Nukleotiden. Die Zusammensetzung dieser Sequenz-Segmente läßt bei dieser Ausführungsform die Synthese durch eine Polymerase zu, dieses Sequenz-Segment dient also als Matrize für Polymerase-abhängige Synthese. In einem solchen Segment werden beispielsweise natürliche Nukleotide verwendet, z.B. dA, dG, dC, dT. In einer weiteren Ausführungsform können zusätzliche Sequenz-Segmente beispielsweise am 5'- Terminus des Primers positioniert sein, welches nicht bei der Synthese von spezifischen Amplifikations-Fragmenten umfassend eine Zielsequenz kopiert werden soll. Dies kann beispielsweise durch Positionierung einer oder mehrerer Modifikationen bzw. chemischen Gruppen erreicht werden, welche Polymerase an der Synthese eines komplementären Stranges hindert (z.B. HEG, C3, ein Segment umfassend 4 - 10 Nukleotide mit 2'-Ome Modifikationen etc.). Eine solche Modifikation kann beispielsweise am 5'-Terminus des kopierbaren Anteils des zweiten Primers positioniert sein und die Fortführung der Synthese behindern. Beispielsweise kann am 5'- Ende des kopierbaren Segments des zweiten Primers eine HEG-Gruppe eingeführt werden, und danach ein zusätzliches Sequenz-Segment.
Weiterhin kann ein zusätzliches Sequenz-Segment am 5'-Terminus des zweiten Bereichs des ersten Primers positioniert werden. Durch eine solche Lokalisation von zusätzlichen Sequenz- Segmenten wird die Synthese eines komplementären Stranges während einer regulären Synthese von spezifischen Amplifikations-Produkten umfassend eine Zielsequenz verhindert.
Die Länge eines solchen zusätzlichen Sequenz-Segments umfasst Bereiche von 3 bis 50 Nukleotide. Die Basen-Zusammensetzung kann beispielsweise natürliche Nukleobasen (A,G, C, T, U, Inosine) oder Modifikationen an unterschiedlichen Positionen von Nukleotiden umfassen (z.B. an den Basen, wie 2-Amino-Adenin, Iso-Guanin, Iso-Cytosine, 5-Propargyl-Uridine, 5-Propargyl- Cytosine oder am Zucker-Phosphat-Rückgrat, wie beispielsweise LNA, 2'-Ome, 2'-Halogen etc.). In einer gewissen Ausführungsform werden ein erster Primer und zusätzliche Sequenz-Segmente zu einem Oligonukleotid zusammengefasst. In einer gewissen weiteren Ausführungsform werden ein zweiter Primer und zusätzliche Sequenz-Segmente zu einem Oligonukleotid zusammengefasst.
Solche zusätzlichen Sequenz-Segmente werden in einem Oligonukleotid dermaßen gestaltet, dass sie das Amplifikations-Verfahren von Zielsequenzen nicht verhindern. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, dass hemmende Interaktionen mit den für das Verfahren wesentlichen Strukturen der Primer bzw. Controller vermieden bzw. vermindert werden. In bestimmten Ausführungsformen können zusätzliche Strukturen unter den gewählten Reaktionsbedingungen mit anderen Primer- Bereichen komplementäre Doppelsträng-Segmente ausbilden. Insbesondere verhindern solche doppelsträngige Segmente allerdings eine spezifische Amplifikation einer Zielsequenz nicht. In bestimmten Ausführungsformen interagieren bzw. binden solche zusätzliche Sequenz-Segmente nicht an den ersten oder zweiten Primer-Bereich des ersten Primers. In bestimmten Ausführungsformen interagieren solche zusätzliche Sequenz-Segmente nicht mit dem Controller- Oligonukleotid. In bestimmten Ausführungsformen interagieren solche zusätzliche Sequenz- Segmente nicht mit anderen Primern in der Reaktion. In bestimmten Ausführungsformen interagieren solche zusätzliche Sequenz-Segmente nicht mit P1 1 -Ext oder P2.1 -Ext oder anderen Amplifikations-Fragmenten umfassend eine Zielsequenz. In bestimmten Ausführungsformen bilden solche zusätzliche Sequenz-Segmente keine unter Reaktionsbedingungen stabile doppelsträngige Abschnitte mit dem ersten oder zweiten Bereich des ersten Primers, welche die Funktion des ersten oder des zweiten Bereichs vollständig verhindern.
In bestimmten Ausführungsformen interagieren bzw. binden solche zusätzliche Sequenz- Segmente nicht an den zweiten Primer. In bestimmten Ausführungsformen interagieren solche zusätzliche Sequenz-Segmente insbesondere nicht mit dem 3'-Segment des zweiten Primers.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der erste Primer an seinem 5'-Terminus des zweiten Bereichs ein zusätzliches Sequenz-Segment des ersten Primers (Zusatzsequenz Variante P1 ). Dieses Segment umfasst optional eine Sequenz von 10 - 50 Nukleotiden, welche nicht mit dem Amplifikations-Verfahren von Zielsequenzen interferiert (z.B. keine sekundären Strukturen mit Primern bildet). Weiterhin umfasst dieses Segment optional eine Sequenz von etwa 5 bis 15 Nukleotiden des kopierbaren ersten Bereichs des ersten Primers. Die Zusatzsequenz Variante P1 umfasst natürliche Nukleotide als Monomere (A, C, G,T) und kann potenziell als Matrize für eine Polymerase dienen.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der zweite Primer an seinem 5'-Terminus ein zusätzliches Sequenz-Segment des zweiten Primers (Zusatzsequenz Variante P2). Dieses Segment umfasst optional eine Sequenz von 10 - 50 Nukleotiden, welche nicht mit dem Amplifikations-Verfahren von Zielsequenzen interferiert (z.B. keine sekundären Strukturen mit Primern bildet). Weiterhin umfasst dieses Segment optional eine Sequenz von etwa 5 bis 15 Nukleotiden des kopierbaren Bereichs des zweiten Primers. Die Zusatzsequenz Variante P2 umfasst natürliche Nukleotide als Monomere (A, C, G,T) und kann potenziell als Matrize für eine Polymerase dienen.
Es wurde beobachtet, dass solche Oligonukleotide umfassend einen ersten Primer und Zusatzsequenz Variante P1 oder Oligonukleotide umfassend einen zweiten Primer und Zusatzsequenz Variante P2 im geringeren Maß anfällig für Neben-Reaktionen sind, als Oligonukleotide umfassend nur einen ersten Primer, oder Oligonukleotide umfassend nur einen zweiten Primer. In bestimmten Ausführungsformen kann beispielsweise die Generierung und / oder Amplifikation von unspezifischen Primer-Dimer-Strukturen verzögert werden. In einer solchen Nebenreaktion kann somit optional die Bildung von Nebenprodukten umfassend keine Zielsequenz verringert oder verzögert werden. Dadurch kann beispielsweise der vorzeitige Verbrauch von Primern reduziert oder verzögert werden. Vorteilhaft ist beispielsweise der Einsatz von solchen Oligonukleotiden, wenn durch Nebenreaktionen Primer-Dimere umfassend ersten Primer (PD P1 ) oder Primer-Dimere umfassend zweiten Primer (PD P2) erzeugt werden und zum vorzeitigen Verbrauch von Primern in der Reaktion führen. Verwendung von Primern mit solchen zusätzlichen Strukturen (erster Primer mit Zusatzsequenz Variante P1 und / oder zweiter Primer mit Zusatzsequenz Variante P2) ist in gewissen Ausführungsformen vom Vorteil, wenn in einer Amplifikations-Reaktion unspezifische Reaktionen beobachtet werden. Solche Nebenreaktionen können durch mehrere Faktoren begünstigt werden, dazu zählen unter anderem:
• längere Reaktionszeiten (z.B. in Bereichen zwischen 1 hr und 100 hr) • höhere Konzentrationen von Primern werden verwendet (z.B. in Bereichen zwischen 1 mitioI/I und 1 mmol/l)
• höhere Konzentrationen von Polymerase werden verwendet (z.B. in Bereichen über 10 Unit / 10 mI)
• Multiplex-Reaktionen (z.B. Amplifikation von mehr als 10 unterschiedlichen Zielsequenzen in einem Reaktions-Ansatz).
• hohe Konzentrationen von komplexen Nukleinsäureketten im Reaktions-Ansatz (z.B.
Konzentrationen über 1 pg hgDNA in 50 mI)
Einzelne Faktoren können dabei alleine oder in Kombination mit anderen Faktoren Nebenreaktionen begünstigen.
Im Allgemeinen kann man gegen Nebenreaktionen (z.B. unspezifische Primer-Dimer Bildung) Vorgehen, indem man Reaktions-Komponenten und / oder Reaktions-Bedingungen optimiert, beispielsweise durch Reduzierung von Konzentrationen von einzelnen Komponenten, kürzere Reaktions-Zeiten, Sequenz-Gestaltung von Primer-Sequenzen, Wahl von stringenteren Reaktions- Bedingungen. Die in einer vorteilhaften Ausführungsform angeführten zusätzliche Sequenz- Segmente (Oligonukleotide umfassend einen ersten Primer und Zusatzsequenz Variante P1 oder Oligonukleotide umfassend einen zweiten Primer und Zusatzsequenz Variante P2) stellen eine weitere Möglichkeit dar, gewisse Nebenreaktionen zu verzögern.
In Ausführungsbeispielen werden Primer-Oligonukleotide mit zusätzlichen Sequenz-Segmenten gezeigt. In diesen Ausführungsbeispielen werden zusätzliche Sequenz-Segmente verwendet, welche nicht an der spezifischen Amplifikation einer Zielsequenz teilnehmen und zur Verzögerung von Neben-Reaktionen beitragen. Somit werden Oligonukleotide umfassend einen ersten Primer und Zusatzsequenz Variante P1 und Oligonukleotide umfassend einen zweiten Primer und Zusatzsequenz Variante P2 verwendet.
Ein Fachmann wird erkennen, dass ein Oligonukleotid neben einer Primer-Struktur, welche für die spezifische Amplifikation einer Zielsequenz vorteilhaft ist (diese Struktur kann auch als„Basis- Struktur“ oder „Minimal-Struktur“ bezeichnet werden), auch weitere, zusätzliche Sequenz- Segmente umfassen kann (z.B. Zusatzsequenz Variante P1 oder Zusatzsequenz Variante P2). Solche zusätzliche Sequenz-Segmente können eine Vielzahl von unterschiedlichen weiteren vorteilhaften bzw. nützlichen Eigenschaften bzw. Funktionen vermitteln.
Bestimmte Ausführungsformen des Detektions-Systems
Das Detektions-System umfasst mindestens einen Fluoreszenzreporter (Reporter) und mindestens eine Oligonukleotid-Sonde, welche in der Lage ist, zumindest an eines der während der Amplifikation gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte zu hybridisieren. Weiterhin kann ein Detektionssystem einen zum Fluoreszenzreporter passenden Fluoreszenzquencher (Quencher genannt) umfassen, so dass dieser Quencher in der Lage ist, die Fluoreszenzsignale des Fluoreszenzreporters unter bestimmten Umständen zu verringern bzw. die Signal-Intensität zu reduzieren. Weiterhin kann ein Detektionssystem ein zum Fluoreszenzreporter passendes Donor- Fluorophor umfassen, so dass dieses Donor-Fluorophor in der Lage ist, die Fluoreszenzsignale des Fluoreszenzreporters unter bestimmten Umständen durch Energie-Übertragung zu ermöglichen. Weiterhin kann das Detektions-System das Controller-Oligonukleotid umfassen, wobei ein solches Controller-Oligonukleotid entweder einen Fluoreszenzreporter oder ein Donor- Fluorophor oder einen Fluoreszenzquencher umfasst.
Die Anordnung einzelner Elemente (Fluoreszenzreporter, Fluoreszenzquencher, Donor- Fluorophor) an der Oligonukleotid-Sonde und / oder an dem Controller-Oligonukleotid sollen in Anwesenheit eines Primer-Verlängerungsproduktes unter Ausbildung jeweils komplementärer Komplexe zur Änderung des Fluoreszenzsignals vom Fluoreszenzreporter führen.
Einem Fachmann ist eine Vielzahl an Reporter-Systemen bekannt, welche in den letzten 20 Jahren im Bereich der Real-Time PCR entwickelt wurden. Dazu gehören beispielsweise Sonden mit selbstkomplementären Segmenten, z.B: sogenannte „Molecular Beacons“, Exonuklease- degradation basierten Sonden (sogenannte„Taqman“ Sonden, welche unter Verwendung der 5'- 3'-Nuklease Aktivität von Taq Polymerase spezifisch gespalten werden), Sonden-Systeme mit zwei Oligonukleotiden, welche mit FRET-Paar markiert sind und an einem Strang angeordnet binden können, so dass ein Signal generiert wird, Primer-basierte Sonden (z.B. LUX Primer, welcher bei Entfaltung von selbskomplementären Strukturen bei Rücksynthese die Intensität des Signal ändern), „Scorpion-Primer“ (mit Segmenten komplementär zu dem mit dem Primer synthetisierten Strang) etc. Manche Sonden können als Endpunktmessung bei Signal-Erfassung eingesetzt werden (z.B. Molecular Beacons). Manche Sonden werden zur Erfassung der Kinetik der PCR eingesetzt, z.B. 5'-3'-Nuklease-Sonden. In der Literatur sind viele verschiedene Anordnungen von Sonden und Fluoreszenz-Reportern, Fluoreszenz-Quenchern und Donor- Fluorophoren bekannt. Ebenfalls sind viele Fluoreszenzreporter-Quencher sowie Fluoreszenzreporter-Donor-Fluorophore (auch Donor-Aceptor-Paare oder auch FRET-Paare genannt) bekannt ("Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes" Ed. Didenko, 2006, beispielsweise Chapter 1 and 2; Product Description "Flurescent Molecular Probes", published by Gene Link Inc.). Die meisten Sonden wurden für PCR-basierte Verfahren entwickelt, wobei sowohl die spezifische Anordnung von Primern, Sonden als auch von verwendeten Polymerasen, z.B. mit 3'-Exonuklease (FEN) verwendet wurden.
Im Allgemeinen können solche Sonden mehr oder weniger spezifsich an die während einer Amplifikation generierten DNA-Fragmente binden, wobei das Signal infolge einer solchen Bindung alleine oder in Kombination mit anderen Ereignissen (z.B. Nuklease-Abbau oder Bindung eines weiteren Oligonukleotides an benachbarte Segmente) verändert wird. Diese Veränderung kann erfasst und quantifiziert werden.
Aufgrund der Verwendung der PCR in der zweiten Amplifikation können daher auch solche bekannten Techniken und Sonden zum Einsatz kommen. Dabei werden die Sequenzen von Oligonukleotid-Sonden an die während der Reaktion entstehenden Amplifikations-Produkte angepasst.
Die Wahl einer Sonde richtet sich auch danach, ob beispielsweise eine bestimmte Variante der Zielsequenz nachgewiesen werden muss mittels einer Zielsequenz-spezifischen Sonde oder soll beispielsweise lediglich der Verbrauch von Primern (als Zeichen einer Amplifikation) registriert werden. Es können somit unterschiedliche Sonden-Formate gewählt werden, je nach Aufgabe.
Im Folgenden sollen daher in erster Linie die Besonderheiten einer solchen Anpassung für einige Ausführungsformen besprochen werden.
Heterogenes Format
Dabei liegen Komponenten von beiden Amplifikations-Systemen zu Beginn der ersten Amplifikation getrennt, so dass kein Einfluss von Oligonukleotid-Sonden oder PCR-Primern auf die erste Amplifiaktion erfolgen kann. Umgekehrt, nach Abschluss der ersten Amplifikation wird ein Aliquot wird aus der ersten Amplifikation in die zweite Amplifikation übertragen. Die dabei resultierende Verdünnung von Reaktionskomponenten des ersten Amplifikations-Systems begünstigt den Einsatz von für eine PCR-Reaktion bekannten Sonden-Konstruktionen. Beispielsweise bei Anwesenheit des Controller-Oligonukleotides in Konzentrationen von unter 100 nmol/l, insbesondere unter 10 nmol/l, insbesondere unter 1 nmol/l, insbesondere unter 0,01 nmol/l wird die Sondenbindung an komplementäre Segmente der gebildeten Primer- Verlängerungsfragmente unter PCR-Bedinungen kaum beeinflusst, so können einem Fachmann bekannte sondenbasierte Nachweismethoden angewandt werden.
Die Oligonukleotid-Sonden können dabei an eines der gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte binden (z.B. an das dritte und vierte Primer-Verlängerungsprodukt) und dieses Bindungsereignis kann mittels verschiedener Techniken nachgewiesen werden (z.B. durch Verwendung von Taqman-Sonden und einer Taq-Polymerase oder durch Bindung von „Molecular Beacons“ an komplementäre Segmente entsprechender Primer-Verlängerungsprodukte).
Homogenes Format
Bei einem homogenen Format liegen die Komponenten von beiden Amplifikations-Systemen zu Beginn der ersten Amplifikation im gleichen Ansatz und können deshalb eine Interaktion mit anderen Komponenten eingehen und bei bestimmten Vorgängen intervenieren. Insbesondere die Anwesenheit von wirksamen Konzentrationen von Controller-Oligonukleotid (z.B. zwischen 0,01 pmol/l und 10 pmol/l) und Oligonukleotid-Sonden (z.B. zwischen 0,01 pmol/l und 10 pmol/l) kann dazu führen, dass Interaktionen zwischen diesen Komponenten Einfluss auf Teilschritte bzw. Ergebnisse dieser Schritte haben können. Aus diesem Grund müssen unter anderem folgende Aspekte beachet werden:
• Anwesenheit von Controller-Oligonukleotiden kann die Bindung von Oligonukleotid- Sonden an die gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte beeinflussen. Das ist beispielsweise dann der Fall, wenn eine Sonde und ein Controller signifikante Überlappungen in Segmenten umfassen, welche komplementär zu Primer- Verlängerungsprodukten sind (z.B. dritter Bereich des Controllers und Oligonukleotid- Sonde können teilweise ein das gleiche Segment des ersten und / oder des dritten Primer- Verlängerungsproduktes hybridisieren). Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, das Ausmass solcher Überlappungen zu begrenzen. Dafür kann beispielsweise die Länge von Segmenten bei Controller und Sonde, dermassen angepasst werden, dass diese möglichst geringe Überlappung aufweisen. Vorzugsweise überlappen die Sequenzsegmente bei komplementärer Bindung an die gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte nicht.
• Oligonukleotid-Sonden können an das Controller-Oligonukleotid ggf. binden und dieses bei Strangverdrängung beeinflussen. Das kann beispielsweise dann erfolgen, wenn das Controller-Oligonukleotid und die Oligonukleotid-Sonde je ein Segment umfassen, welches zur Ausbildung eines doppelsträngigen Kompleses zwischen dem Controller und der Sonde führt. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, das Ausmass solcher komplementären Segmente zu begrenzen. Dafür kann beispielsweise die Länge von Segmenten bei Controller und Sonde, dermassen angepasst werden, dass diese möglichst geringe Komplementarität aufweisen. Vorzugsweise umfassen Controller und Sonde keine komplementären Sequenzsegmente.
Aus solchen Gründen ist es beispielsweise vorteilhaft, bei einem homogenen Format, die Oligonukleotid-Sonde dermassen zu gestalten, dass sie bevorzugt an das 3 '-Segment des ersten oder des dritten Primer-Verlängerungsproduktes hybridisiert. Diese Segmente werden vom Controller-Oligonukleotid nicht hybridisiert.
Ein weiterer wesentlicher Aspekt dieser Erfindung ist ein möglicher Polymerasen-Wechsel bei Umschaltung von der ersten auf die zweite Amplifikation: die erste Polymerase kann dabei inaktiviert werden und die zweite Polymerase kann dabei aktiviert werden. Das ermöglicht beispielsweise Einsatz von 5'-3'-Nuklease-sensitiven Sonden („Taqman-Sonden“) während der zweiten Amplifikation: bei der ersten Amplifikation wird beispielsweise bevorzugt Bst-Polymerase Large Fragment verwendet. Dieses Fragment kann die Taqman-Sonden nicht spalten. Bei Beginn der zweiten Amplifikation wird die Bst-Polymerase Large Fragment inaktiviert und die Taq- Polymerase (z.B. als Hot-Start Polymerase verwendet) wird dabei aktiviert. Dadurch können nun die 5'-3'-Nuklease-sensitiven Sonden verwendet werden.
Diese Änderung kann je nach gewählter Konstellation zwischen einem Fluoreszenzreporter und/oder einem Donor-Fluorophor und/oder eines Fluoreszenzquenchers zu einer Zunahme oder Abnahme der Signal-Intensität des Flupreszenzrepoters führen. Diese Änderung kann mit bekannten geeigneten Mitteln (z.B. in einem Real-Time PCR-Gerät, wie StepOne-PCR oder Lightcycler oder Rotorgene, siehe Angaben von Herstellern) während oder nach einer abgelaufenen Reaktion detektiert werden. Die Erfassung der Änderungen des Signals kann dabei Rückschlüsse auf den Verlauf der Reaktion ermöglichen: z.B. Amplitude des Signals, Kinetik, Zeit- bzw. Konzentrations-Abhängigkeit der Signal-Erscheinung. Bei Verwendung mehrerer Target- Sequenzen können Multiplexe Analysen entsprechend durch unterschiedliche spektrale Eigenschaften kodiert werden, so dass auch mehrere Reaktionen parallel zu einander beobachet werden können.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einige Ausführungsformen von Oligonukleotid-Sonden, welche zur Erfassung des Reaktionsfortschrittes besonders vorteilhaft sind.
Die Oligonukleotid-Sonde ist ein Oligonukleotid, welches vorzugsweise aus DNA-Nukleotiden aufgebaut ist. In einer anderen Ausführungsform kann dieses Oligonukleotid aus anderen Nukleotid-Monomeren aufgebaut sein, z.B. aus RNA oder aus Nukleotid-Modifikationen z.B. mit Zucker-Phosphat-Rückgrad-Modifikationen wie PTO oder LNA oder 2'-0-Me. In einer anderen Ausführungsform ist diese Oligonukleotid-Probe ein Mischpolymer, welches sowohl DNA als auch nicht DNA-Elemente (z.B. RNA, PTO LNA) umfasst. Diese Oligonukleotid-Sonde kann weitere Oligonukleotid-Modifikationen umfassen, z.B. Linker oder Spacer (z.B. C3, HEG, Abasische Monomere, z.B. THF-Modifikation).
Die Basen-Zusammensetzung der Oligonukleotid-Sonde umfasst vorzugsweise Basen, welche mit natürlichen Nukleobasen (A,C,T,G) komplementäre Bindungen unter Hybridisierungbedingungen eingehen können. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Sonde auch Modifikationen, welche beispielsweise Universal-Basen umfasst (z.B. Inosine, 5-Nitro-lndol). Die Sonde kann weitere Modifikationen umfassen, welche das Bindungsverhalten von Oligonukleotiden beeinflussen, z.B. MGB-Modifikationen.
Die Länge der Oligonukleotid-Sonde liegt vorzugsweise zwischen 8 und 80 Nukleotiden, insbesondere zwischen 12 und 80 Nukleotiden, insbesondere zwischen 12 und 50, insbesondere zwischen 12 und 35 Nukleotiden. Die Oligonukleotid-Sonde umfasst in der Regel ein Segment, welches komplementär an mindestes eines der gebildeten Produkte komplementär binden kann. In einer Ausführungsform umfasst die Oligonukleotid-Sonde mindestens ein weiteres Segment, welches nicht an eines der gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte komplementär binden kann.
Die Sonde kann in Relation zu anderen Komponenten der Amplifikations-Systeme unterschiedlich angeordnet sein. Dabei sind bestimmte Ausführungsformen bevorzugt:
In einer Ausführungsform umfasst eine Oligonukleotid-Sonde ein zu mindestens einem der gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte (P1 .1-Ext, P2.1 -Ext, P3.1 -Ext, P4.1-Ext) im
Wesentlichen komplementäres Sequenzsegment, welches mindestens an eines der gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte unter geeigneten Bedingungen hybridisieren kann (Hybridisierungsbedingungen). In einerweiteren Ausführungform ist dieses Sequenzsegment zum ersten und / oder zum dritten Primer-Verlängerungsprodukt komplementär. In einer weiteren Ausführungform ist dieses Sequenzsegment zum ersten und / oder zum dritten Primer- Verlängerungsprodukt komplementär, wobei die Oligonukleotid-Sonde im 3'-Segment des jeweiligen Primer-Verlängerungsproduktes komplementär binden kann, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid komplementär gebunden wird. In einer weiteren Ausführungform ist dieses Sequenzsegment zum zweiten und / oder zum vierten Primer-Verlängerungsprodukt komplementär. In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde eine Länge, welche im Bereich zwischen 10 Nukleotiden und 50, insbesondere zwischen 15 und 40, insbesondere zwischen 15 und 30 Nukleotiden liegt. In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde keinen Sequenzbereich, welcher zum Controller-Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär ist. In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde einen Sequenzbereich, welcher zum Controller-Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär ist, wobei die Länge dieses Segments weniger als 20 Nukleotide ist, insbesondere weniger als 15 Nukleotide, insbesondere weniger als 10 Nukleotide, insbesondere weniger als 5 Nukleotdie umfasst.
In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde keinen Sequenzbereich, welcher zu einem der Primer-Oligonukleotide im Wesentlichen komplementär ist. In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde einen Sequenzbereich, welcher zu einem der Primer-Oligonukleotide im Wesentlichen komplementär ist, wobei die Länge dieses Segments weniger als 20 Nukleotide ist, insbesondere weniger als 15 Nukleotide, insbesondere weniger als 10 Nukleotide umfasst, insbesondere weniger als 5 Nukleotide.
In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde keinen Sequenzbereich, welcher mit der Sequenz des dritten Bereichs des Controller- Oligonukleotid im Wesentlichen identisch ist. In einer weiteren Ausführungform umfasst dieses Sequenzsegment der Oligonukleotid-Sonde einen Sequenzbereich, welcher mit der Sequenz des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotids im Wesentlichen identisch ist, wobei die Länge dieses Segments weniger als 20 Nukleotide ist, insbesondere weniger als 15 Nukleotide, insbesondere weniger als 10 Nukleotide, insbesondere weniger als 5 Nukleotide umfasst,
In einer Ausführungsform umfasst das Controller-Oligonukleotid eine der folgenden Komponenten (einen Fluoreszenzreporter und / oder einen Fluoreszenzquencher und / oder einen Donorfluorophor), wobei zumindest eine dieser Komponenten im dritten Bereich des Controller- Oligonukleotides lokalisiert ist.
In einer Ausführungsform ist die Oligonukleotid-Sonde zumindest teilweise durch eine 5'-3'- Nuklease spaltbar. In einer weiteren Ausführungsform ist das Controller-Oligonukleotid zumindest in seinem 5'-Segment (dritte Bereich des Controllers) durch eine 5'-3'-Nuklease spaltbar.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Oligonukleotid-Sonde ein Sequenzsegment, welches zur Zielsequenz oder ihrem Anteil, welches von einem der Amplifikationsprodukte umfasst wird, im Wesentlichen komplementär ist, wobei die Länge dieses Segmentes im Bereich zwischen 5 und 50 Nukleotiden liegt, insbesondere zwischen 10 und 40, insbesondere zwischen 15 und 30 Nukleotiden. In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Oligonukleotid-Sonde kein zur Zielsequenz oder ihrem komplementären Strang im Wesentlichen komplementäres Sequenzsegment. Beispielsweise kann es sich
In einer Ausführungsform ist das 3'-Ende der Oligonukleotid-Sonde durch eine Modifikation geblockt, z.B. durch einen Fluorophor oder Quencher oder Donor oder durch eine andere Modifikation, welche die Polymerase daran hindert, das Oligonukleotid als Primer zu verwenden (z.B. Phosphat-Rest oder C3-Linker oder dideoxy-Nukleotid-Modifikation).
In einer weiteren Ausführungsform ist das 3'-Ende der Oligonukleotid-Sonde frei und kann mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt komplementär binden und die Synthese durch die Polymerase starten. Dadurch kann die Oligonukleotid-Sonde wie ein Primer verlängert werden, was zur Bildung eines Sonden-Verlängerungsproduktes führt.
In einer Ausführungsform entspricht die Sequenzzusammensetzung der Sonde der Sequenzzusammensetzung des Primers.
Position von Fluoreszenzreporter, Fluoreszenzquencher oder Donor-Fluorophor können je nach Ausführungsform der Oligonukleotid-Sonde unterschiedlich sein. Diese Elemente können sowohl an einem der jeweiligen Enden der Oligonukleotid-Sonde kovalent gebunden werden oder im mittleren Bereich. Viele solche Modifikationen sind einem Fachmann bekannt, beispielsweise Kopplung von FAM-Reporter an das 3'-Ende oder an das 5'-Ende eines Nukleotides, oder Verwendung von dT-BHQ1 oder dT-FAM oder dT-TMR Modifikationen für Kopplung von Sonden im mittleren bzw. inneren Sequenzsegment der Sonde. Solche modifizierten Oligonukleotid- Sonden können bei kommerziellen Anbietern bezogen werden (z.B. Sigma-Aldrich, Eurofins, IDT, Eurogentec, Thermofisher Scientific).
Beispeilsweise umfasst die Oligonukleotid-Sonde zumindest ein Sequenzsegment, welches in der Lage ist, mit dem während der Amplifikation gebildeten dritten oder vierten Primer- Verlängerungsprodukt eine im Wesentlichen komplementäre Bindung unter geeigneten Reaktionsbedingungen eines Detektions-Schrittes einzugehen. Dabei wird die Oligonukleotid- Sonde beispielsweise an das einzelsträngige 3'-Segment des synthetisierten dritten Primer- Verlängerungsproduktes oder an das synthetisierte 5'-Segment des vierten Primer- Verlängerungsproduktes komplementär gebunden. Dabei umfasst eine solche Sonde keine Sequenzsegmente, welche identisch mit dem Controller sind oder komplementär zum Controller sind. Dadurch wird ein Komplex generiert, welcher ein Primer-Verlängerungsprodukt und eine Oligonukleotid-Sonde umfasst. Die Bindung der Oligonukleotid-Sonde und des Controller- Oligonukleotides an das synthetisierte dritte Primer-Verlängerungsprodukt erfolgt bevorzugt sequenzspezifisch. Die Länge dieses zum 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes komplementären Sequenz-Segments liegt beispielsweise in Bereichen von 8 bis 80 Nukleotiden, insbesondere zwischen 12 und 80 Nukleotiden, insbesondere zwischen 12 und 50, insbesondere zwischen 12 und 35 Nukleotiden, insbesondere zwischen 15 und 25 Nukleotiden. Das Detektions-System, umfassend zumindestens einen Fluoreszenz-Reporter gebunden entweder an der Oligonukleotid-Sonde oder am Controller-Oligonukleotid, ist in der Lage die Signal-Generierung bzw. Signal-Intenstität des Fluoreszenz-Reporters in Abhängigkeit von der Bindung der Oligonukleotid-Sonde an komplementäre Sequenzen zu verändern. Je nach Ausführungsform des Detektions-Systems kann diese Änderung in einer Generierung bzw. einer Zunahme oder einer Abnahme des Signals resultieren.
Während einer Amplifikation erfolgt eine Trennung des dritten und des vierten Primer- Verlängerungsproduktes, so dass das 3'-Segment des dritten Primer-Verlängerungsproduktes und das korrespondierende Fragment des vierten Primer-Verlängerungsproduktes in einzelsträngiger Form vorliegen. An dieses 3'-Segment des dritten Primer-Verlängerungsproduktes bzw. 5'- Segment des vierten Primer-Verlängerungsproduktes kann eine Oligonukleotid-Sonde während der Reaktion oder erst nach ihrem Abschluss binden.
Die Bindung erfolgt im Wesentlichen sequenzspezifisch, kann aber auch Abweichungen von vollständiger Komplementarität tolerieren.
Die Bindung der Oligonukleotid-Sonde verhindert vorzugsweise die Amplifikation nicht. Die Konzentration der Sonde und ihre Länge werden dermassen angepasst, dass hinreichende Menge an Primern die Synthese der Primer-Verlängerungsprodukte initiieren kann.
Mit fortschreitender Reaktion wird eine hinreichende Menge an Primer-Verlängerungsprodukten gebildet, so dass die Oligonukleotid-Sonde ebenfalls hinreichend binden kann, um eine erfassbare Signal-Veränderung zu bedingen.
Ein geeignetes Detektions-System umfassend mindestens einen Fluoreszenz-Reporter umfasst weiterhin in einer Ausführungsform mindestens einen zum Fluoreszenz-Reporter passenden Fluoreszenz-Quencher. Der Fluoreszenz-Quencher (auch Quencher genannt) kann dabei als Kontakt-Quencher oder als FRET-Quencher seine Funktion entfalten. Passende Beispiele in der Literatur sind bekannt ("Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes" Ed. Didenko, 2006, beispielsweise Chapter 1 and 2; Product Description "Flurescent Molecular Probes", published by Gene Link Inc.). Beispielsweise kann als Fluoreszenz-Reporter Fluoresein (FAM) dienen, als ein geeigneter Fluoreszenz-Quencher kann dabei BHQ-1 oder BHQ-2 oder TAMRA auftreten. Bei einer Ausführungsform können Guanosine-Nukleobasen als Quencher auftreten (z.B. in Kombination mit einem FAM als Reporter). Bei einer Anregung des Fluoreszenz-Reporters mit einer geeigneten Licht-Wellenlänge erfolgt in Abwesenheit des Quenchers eine Emission des Fluoreszenzsignals. Bei einer räumlichen Nähe zwischen dem Fluoreszenzreporter und einem geeigneten Quencher erfolgt allerdings Minderung/Verringerung der Intensität eines Fluoreszenz- Reporters. Mit zunehmender Entfernung/Separierung des Fluoreszenz-Reporters und des Quenchers steigt die Signalintensität an.
Ein weiteres geeignetes Detektions-System umfassend mindestens einen Fluoreszenz-Reporter umfasst weiterhin in einer Ausführungsform mindestens einen zum Fluoreszenz-Reporter passenden Donor-Fluorophor (auch Donor genannt), so dass ein FRET-Paar gebildet wird. Passende Beispiele in der Literatur sind bekannt ("Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes" Ed. Didenko, 2006, beispielsweise Chapter 1 and 2; Product Description "Fluorescent Molecular Probes", published by Gene Link Inc.). Ein FRET-Paar umfasst in der Regel einen Donor und einen Akzeptor (in der Regel tritt ein Reporter als Akzeptor auf). Beispielsweise kann als Fluoreszenz-Reporter Tetramethylrodamin (TAMRA) dienen, als ein geeigneter Partner eines FRET-Paares kann dabei FAM (Donor) auftreten, ein anderes Beispiel ist FAM (Donor) und Cy3 (als Akzeptor oder Reporter). Bei einer räumlichen Nähe erfolgt dabei bei Anregung des Donors (z.B. FAM) die Übertragung der Energie auf den Reporter (TAMRA oder Cy3), so dass der Reporter selbst dadurch in die Lage versetzt wird, Energie als elektromagnetische Strahlung (erfassbares Lichtsignal bzw. Fluoreszenzsignal) abzugeben. Dieses Fluoreszenzsignal des Reporters kann mit geeigneten Mitteln erfasst werden. Mit zunehmender räumlicher Separierung des Reporters und des Donor-Fluorophors sinkt das Signal zunehmend und ist in der Regel ab einer Distanz von über 50 Nukleotiden (gemessen als 50 Nukleotide eines Doppelstranges) nicht mehr messbar detektierbar.
Durch geeignete Positionierung von einzelnen Elementen des Detektionssystems an Oligonukleotid-Sonde und/oder Controller-Oligonukleotid ist es möglich, Bindungsereignisse dieser Komponenten an das erste Primer-Verlängerungsprodukt durch Signal-Zunahme oder Signal-Abnahme zu erfassen.
Eine solche Erfassung kann entweder während der Amplifikation stattfinden (z.B. als On-Line- Erfassung) oder in geeigneten zeitlichen Abständen oder auch erst am Ende einer Reaktion erfolgen.
Erfassung des Fluoreszenzsignals erfolgt in einem Detektions-Schritt. Im Detektions-Schritt des Verfahrens soll überprüft werden, ob die Oligonukleotid-Sonde an das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1 -Ext) komplementär gebunden hat oder nicht. Im Detektionsschritt wird die Reaktionstemperatur daher dermassen angepasst, dass die Sonde in der Lage wäre, an das 3 '-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär zu binden. Diese Temperatur kann entweder einer der Temperaturen während der Amplifikation entsprechen oder einen von Amplifikations-Temperatur-Schritten separaten Schritt darstellen.
Während dieses Schrittes kann die Reaktion von einer Lichtquelle mit dem Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt werden. Je nach Ausgestaltung des Detektions-Systems wird die Wellenlänge an das Absorbtionsspektrum des Fluoreszenzreporters bzw. des Donor-Fluorophores angepasst. Falls die Oligonukleotid-Sonde an das 3'-Ende eines synthetisierten ersten Primer- Verlängerungsproduktes binden kann, ist ein Signal vom Fluoreszenzreporter zu erwarten. Dieses Signal hat ein charakteristisches Spektrum der Wellenlängen und kann durch ein entsprechendes Erfassungs-System detektiert und quantifiziert werden. Gegenwärtige Real-Time-PCR Geräte umfassen in der Regel sowohl Lichtquelle für die Anregung als auch ein Erfassungs-System zu Detektion der Fluoreszenz von Reportern, sowie temperierbare Behälter für Reaktionsgefäße. Ein Beispiel dafür stellen Real-Time PCR-Geräte wie StepOne oder LightCycler oder RotorGene dar.
Die Erfassung kann zur Quantifizierung von einer oder mehreren in der Reaktion vorliegenden Start-Nukleinsäureketten verwendet werden. Weiterhin kann die Erfassung zum Nachweis einer Verfügbarkeit einer Start-Nukleinsäurekette zu Beginn einer Reaktion verwendet werden. Weiterhin kann ein Detektions-System in Verbindung mit einer Internen-Amplifikations-Kontrolle verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform können zwei oder mehr Nukleinsäureketten in einem Amplifikations-Ansatz spezifisch amplifiziert werden. Dabei können beispielsweise Kombinationen von spezifischen ersten Primern und/oder spezifischen Controller-Oligonukleotiden und/oder spezifischen zweiten Primern verwendet werden. Beispielsweise werden Zielsequenzen und eine Interne Amplifikatons-Kontrolle in einem Ansatz amplifiziert. Es ist daher vorteilhaft, die Erfassung einzelner Nukleinsäureketten während ihrer Amplifikation getrennt und unabhängig von einander durchzuführen.
In einer Ausführungsform werden jeweils spezifische Detektions-Systeme verwendet, so dass Monitoring der Amplifikation einer Nukleinsäurekette durch ein jeweils spezifisches Detektions- System erfolgt. Die jeweils spezifischen Signale von Fluoreszenzreportern können gleichzeitig detektiert werden. Vorzugsweise unterscheiden sich die spektralen Eigenschaften von Fluoreszenzreportern dermaßen, dass sie durch Erfassung von jeweiligen Fluoreszenzsignalen bei charakteristischen Wellenlängen erfolgen kann. Beispielsweise können zwei oder drei oder vier Fluoreszenzreporter verwendet werden, Die jeweiligen spezifischen Wellenlängen von Fluoreszenzsignalen liegen vorzugsweise um mehr als 10 nm, insbesondere um mehr als 20 nm, insbesondere um mehr als 30 nm gemessen bei maximaler Intensität (Fluoresenz-Peak) eines Fluoreszenzspektrums. Solche Kombinationen sind bekannt. Beispielsweise eignen sich Kombinationen umfassend FAM und/oder Cy3 und/oder Cy5 oder FAM und/oder HEX und/oder ROX. Die jeweiligen Quencher werden bevorzugt spezifisch für jeden Fluoreszenzreporter gewählt, so dass Signal-Minderung durch ein Quencher eine hohe Effizienz aufweist. Beispielsweise werden Kombinationen von FAM/BHQ-1 und HEX/ BHQ-2 oder FAM/ BHQ-1 und Cy5/BHQ-2 verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein Detektions-System verwendet werden, welches Monitoring der Amplifikation einer Gruppe von unterschiedlichen Nukleinsäureketten ermöglicht. Dabei kann diese Gruppe zwei oder mehr zu amplifizierende Nukleinsäureketten umfassen. Die Komponenten eines Detektions-Systems werden entsprechend angepasst. In einer Ausführungsform umfasst eine solche Gruppe von unterschiedlichen zu amplifizierenden Nukleinsäureketten bespielsweise mindestens ein einheitliches, für die verwendete Oligonukleotid- Sonde spezifisches Sequenzsegment für eine komplementäre Bindung einer Oligonukleotid- Sonde unter Reaktionsbedingungen eines Detektions-Schrittes. In einerweiteren Ausführungsform umfasst eine solche Gruppe von unterschiedlichen zu amplifizierenden Nukleinsäureketten bespielsweise mindestens ein Sequenzsegment für eine vorwiegend komplementäre Bindung einer Oligonukleotid-Sonde, wobei die Sequenzzusammensetzung dieses Sequenzsegmentes innerhalb dieser Gruppe unterschiedlich ist. Diese Unterschiede können von 1 bis 10 Nukleotide umfassen, vorzugsweise von 1 bis 3 Nukleotide.
Weitere Aspekte und Ausführungsformen finden sich in den nachfolgenden Gegenständen, welche die Erfindung illustrieren, ohne auf sie beschränkt zu sein:
1 . Gegenstand: Ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, wobei
a) eine Probe, die ein erstes Nukleinsäurepolymer umfassend eine erste Zielsequenz M [und die zu M (revers) komplementäre Sequenz M'], wobei M in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte MPL, MS und MPR umfasst, in einem ersten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird: b) eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA- Polymerase, sowie Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren;
c) ein erster linker Oligonukleotidprimer PL1 , welcher (im Wesentlichen) identisch mit MPL ist;
d) ein erster rechter Oligonukleotidprimer PR1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte PCR und PMR umfasst, wobei PMR die zu MPR komplementäre [hybridisierende] Sequenz aufweist [im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann] und der Sequenzabschnitt PCR nicht an M [oder eine in Bezug auf die Sequenz M in 3‘ unmittelbar an MPR anschließende Sequenz] binden kann, und
wobei PR1 (insbesondere im Abschnitt PCR) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass PCR nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und
e) ein Controller-Oligonukleotid CR, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte CSR, CPR und CCR in unmittelbarer Folge umfasst, wobei CSR identisch zu einem Abschnitt von MS ist, welcher in 5‘ von MPR liegt [und bei Initiation der Polymerase von PR zuerst abgelesen wird, CSR also an das Polymerisationsprodukt des Primers PR1 binden kann], CPR komplementär zu PMR (und identisch zu MPR) ist und CCR komplementär zu PCR ist,
und wobei CR in CSR modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass CSR nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann;
2. Gegenstand: Das Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure gemäß 1. Gegenstand, wobei ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt PR1‘ erhalten wird, welches in 5‘-3‘- Orientierung neben den Sequenzbereichen PCR und PMR einen synthetisierten Bereich PSR umfasst, der im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz M in dem in 5‘ an MPR angrenzenden Bereich ist, und ein zweites Primer-Verängerungsprodukt PL1‘ erhalten wird, welches neben dem Sequenzbereich MPL einen synthetisierten Bereich PSL umfasst, der im Wesentlichen identisch zur Zielsequenz M im an MPL in 3‘ angrenzenden Bereich ist,
und wobei
entweder die Reaktionsbedingungen des ersten Amplifikationsschrittes so gewählt sind, und/oder
die Längen und Schmelztemperaturen von PCR und ggf. MS so gewählt sind, dass PRT mit M einen Doppelstrang bilden kann, [PL1 ' mit M'einen Doppelstrang bilden kann,] [PRI 'mit PL1 'einen Doppelstrang bilden kann], und PRT mit C einen Doppelstrang bilden kann und die Bildung des Doppelstranges aus PRT und C gegenüber der Bildung des Doppelstrangs aus PRT mit M [mindestens im Bereich von MPR] bevorzugt ist.
3. Gegenstand: Das Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure gemäß den 2.
Gegenstand, wobei
entweder die Reaktionsbedingungen des ersten Amplifikationsschrittes so gewählt sind, und/oder
die Längen und Schmelztemperaturen von PCR und ggf. MS und/oder die Positionen von MPL und MPR so gewählt sind,
dass sich in Abwesenheit des Controller-Oligonukleotides CR das erste Primer- Verlängerungsprodukt PRT nicht vom zweiten Primer-Verlängerungsprodukt PLT trennt.
4. Gegenstand: Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Gegenstände, wobei die Probe in einem zweiten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
a) ein zweiter linker Oligonukleotidprimer PL2, welcher zu einem ersten Sekundärprimerbindungsbereich MPL2 identisch ist,
b) ein zweiter rechter Oligonukleotidprimer PR2, welcher zu einem Bereich MPR2 komplementär ist,
wobei MPL2 und MPR2 von M umfasst werden und das 3‘-Ende von MPL2 [mindestens 20 Positionen] in 5‘ des 5‘-Endes von MPR2 angeordnet ist, (insbesondere MPL2 mit MPL und /oder MPR2 mit MPR identisch ist).
5. Gegenstand: Das Verfahren gemäß dem 4. Gegenstand, wobei PL2 und/oder PR2 [unmittelbar] in 5‘ von dem zu MPL2 identischen bzw. dem zu MPR2 komplementären Sequenzabschnitt einen Sequenzabschnitt PCL2 bzw. PCR2 aufweisen.
6. Gegenstand: Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Gegenstände 1 bis 5, wobei eine zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA- Polymerase, sowie ggf. Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren), in dem zweiten Amplifikationsschritt mit der Probe in Kontakt gebracht werden.
7. Gegenstand: Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Gegenstände 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierten Nukleotidbausteine 2’-0- Alkylribonukleosidbausteine, insbesondere 2’-0-Methylribonukleosidbausteine, umfassen.
8. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Amplifikationsschritt im Wesentlichen isothermal durchgeführt wird.
9. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass MS eine Länge von 20 Nukleotiden bis 200 Nukleotiden hat.
10. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass PR1 eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden hat.
1 1 . Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass PCR eine Länge im Bereich von 5 Nukleotiden bis 85 Nukleotiden hat, insbesondere dass PCR zwischen 50% und 300% der Länge des Sequenzabschnitts PMR hat.
12. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 1 1 , durch gekennzeichnet, dass CR (Controller-Oligonukleotid) eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden hat.
13. Gegenstand: as Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Amplifikation und die zweite Amplifikation im selben Reaktionsansatz durchgeführt werden.
14. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase eine thermostabile Polymerase, insbesondere eine thermostabile DNA-Polymerase ist.
15. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase thermisch inaktivierbar ist, insbesondere dass die erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase eine mesophile Polymerase ist.
16. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das die zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, der zweite rechte Oligonukleotidprimer PR2 und/oder der zweite linke Oligonukleotidprimer PL2 aktivierbar sind, und/oder das Controller-Oligonukleotid CR deaktivierbar ist.
17. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten des zweiten Amplifikationsschrittes nach Durchführung des ersten Amplifikationschritts mit der Probe in Kontakt gebracht werden. 18. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass CR in CSR und CPR einen Sequenzbereich umfasst, der sequenzspezifisch an den zweiten rechten Oligonukleotidprimer PR2 binden kann.
19. Gegenstand: Das Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die gewählten Reaktionsbedingungen, insbesondere des ersten Amplifikationsschrittes, eine Reaktionstemperatur im Bereich von 25 °C bis 80 °C , insbesondere 50 bis 70°C, umfassen.
20. Gegenstand: Ein Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Gegenstände 1 bis 19, umfassend:
ein erster rechter Oligonukleotidprimer PR1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte PCR und PMR umfasst, wobei PMR an eine Primerbindungsstelle MPR einer genomischen Sequenz M eines eukaryoten Organismus oder eines pathogenen Bakteriums, insbesondere eines Säugetiers, ganz inbesondere an eine menschliche Zielsequenz, binden kann, wobei M in 5‘- 3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte MPL, MS und MPR umfasst, und der Sequenzabschnitt PCR nicht an eine direkt in 3‘ von MPR liegende Sequenz binden kann, und wobei
PR1 (insbesondere im Abschnitt PCR) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass PCR nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und
ein erster linker Oligonukleotidprimer PL1 , welcher (im Wesentlichen) identisch mit MPL ist;
ein Controller-Oligonukleotid CR, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte CSR, CPR und CCR in unmittelbarer Folge umfasst, wobei CSR identisch zu einem Abschnitt von MS ist, welcher in 5‘ von MPR liegt [und bei Initiation der Polymerase von PR zuerst abgelesen wird, CSR also an das Polymerisationsprodukt des Primers PR1 binden kann], CPR komplementär zu PMR (und identisch zu MPR) ist und CCR komplementär zu PCR ist, und
wobei CR in CSR modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass CSR nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann;
ein zweiter linker Oligonukleotidprimer PL2, welcher zu einem ersten Sekundärprimerbindungsbereich MPL2 identisch ist, und
ein zweiter rechter Oligonukleotidprimer PR2, welcher zu einem Bereich MPR2 komplementär ist,
wobei MPL2 und MPR2 von M umfasst werden und das 3‘-Ende von MPL2 [mindestens 20 Positionen] in 5‘ des 5‘-Endes von MPR2 angeordnet ist, (insbesondere MPL2 mit MPL und /oder MPR2 mit MPR identisch ist).
21 . Gegenstand: Der Kit nach dem 20. Gegenstand, weiterhin umfassend eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase, sowie optional Substrate der DNA-Polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren, insbesondere eine mesophile matritzenabhängige Polymerase, insbesondere eine mesophile matritzenabhängige Polymerase ohne 5'-3'-Exonukleaseaktivität.
22. Gegenstand: Der Kit nach einem der Gegenstände 20 und 21 , weiterhin umfassend eine zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase, sowie optional Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren, insbesondere eine thermophile matritzenabhängige Polymerase, insbesondere eine thermophile matritzenabhängige Polymerase mit 5'-3'- Exonukleaseaktivität.
23. Gegenstand: Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, umfassend die Schritte: a) eine erste Amplifikation mit den Schritten:
Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1 ) an eine zu amplifizierende Nukleinsäure mit einer Zielsequenz, wobei das erste Primer-Oligonukleotid (P1 .1 ) folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich, der sequenzspezifischen an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure binden kann, wobei der Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure zumindest den 5'-T erminus der Zielsequenz umfasst oder in sich in 5'-Richtung von der Zielsequenz befindet;
• einen zweiten Bereich, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und für die verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt;
Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1 ) durch eine erste Polymerase unter Erhalt eines ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext), welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid (P1.1 ) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer- Verlängerungsprodukt und die zu amplifizierenden Nukleinsäure als Doppelstrang vorliegen;
Bindung eines Controller-Oligonukleotids (C1 .1 ) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1-Ext) binden kann, • einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotid (P1.1 ) im Wesentlichen komplementär ist, und
• einen dritten Bereich, der zumindest zu einen Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1-Ext) im Wesentlichen komplementär ist; und
wobei das Controller-Oligonukleotide (C1 .1 ) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) dient, und das erste Controller-Oligonukleotid (C1.1 ) an den ersten und zweiten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 - Ext) unter Verdrängung des zu dem ersten und zweiten Bereich komplementären Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure bindet;
Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) das erste Primer- Verlängerungsprodukt, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen Bereich umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1 -Ext) binden kann, der zumindest zum 5'- Terminus der Zielsequenz komplementär ist oder sich in 3'-Richtung davon befindet;
Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids (P.2.1 ) durch die erste Polymerase unter Erhalt eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1-Ext), welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen identisch zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) und das zweite Primerverlängerungsprodukt (P2.1 ) ein erstes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt bilden; und b) eine zweite Amplifikation mit den Schritten:
Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das zweite Primer- Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext.) des ersten Amplifikationsprodukts, wobei der dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen ersten Bereichs umfasst, der sequenzspezifisch an einen Bereich des zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P1 1-Ext.) binden kann, der zumindest den 5' -Terminus der Zielsequenz umfasst oder sich in 5'-Richtung davon befindet;
Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) durch eine zweite Polymerase unter Erhalt eines dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext), welches neben dem dritten Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum zweiten Primer- Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) oder zur Zielsequenz ist, wobei das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 ) und das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 ) als Doppelstrang vorliegen;
Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) an das erste Primer- Verlängerungsprodukts (P1.1 -Ext), wobei das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.2) einen ersten Bereichs umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1-Ext) binden kann, der zumindest zum 5'-Terminus der Zielsequenz komplementär ist oder sich in 3'- Richtung davon befindet;
Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) durch die zweite Polymerase unter Erhalt eines vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.2-Ext), welches neben dem vierten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) oder identisch zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext) und das vierte Primer- Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) als Doppelstrang vorliegen;
Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 - Ext) und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 ) und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 );
Hybridisieren des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das vierte Primer- Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und Verlängerung des dritten Primer- Oligonukleotids (P3.2) durch die zweite Polymerase; und
Hybridisieren des vierten Primer-Oligonukleotids an das dritte Primer- Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext) und Verlängerung des vierten Primer- Oligonukleotids (P4.2) durch die zweite Polymerase.
Verfahren nach Gegenstand 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte der ersten Amplifikation so oft widerholt werden, bis das ersten Amplifikationsprodukt in einer Kopienanzahl im Bereich von 10 bis 100.000.000.0000 vorliegt, insbesondere von 100 bis 1000.000.000, insbesondere von 1000 bis 100.000.000.
Verfahren nach Gegenstand 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Primer- Oligonukleotid und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid einen zweiten Bereich aufweisen, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich nicht komplementär an das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) oder an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1- Ext) binden kann.
Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 23 - 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1 1-Ext) und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 ) und dem dritten Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1 ) durch thermale Denaturierung durchgeführt wird, insbesondere bei einer Temperatur im Bereich von 85 °C bis 105 °C.
Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 23 - 26, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polymerase und die zweite Polymerase identisch sind. 28. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 23 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Primer-Oligonukleotid (P1 .1 ) und das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) im Wesentlichen identisch sind; und/oder
das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) und das dritte Primer-Oligonukleotid (P4.2) im Wesentlichen identisch sind.
29. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 23 - 28, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Amplifikation und die zweite Amplifikation im selben Reaktionsansatz durchgeführt werden.
30. Verfahren nach Gegenstand 29, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Polymerase, das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.1 ) und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.1 ) aktivierbar sind, und/oder das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) deaktivierbar ist.
31. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Amplifikation in einem ersten Reaktionsansatz und die zweite Amplifikation in einem zweiten Reaktionsansatz durchgeführt werden.
32. Verfahren nach Gegenstand 31 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Aliquot des ersten Reaktionsansatz oder der vollständige erste Reaktionsansatz in den zweiten Reaktionsansatz gegeben wird.
33. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 23 - 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Controller-Oligonukleotid (C 1.1 ) einen vierten Bereich umfasst, der sequenzspezifisch an das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) binden kann.
34. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 23 - 33, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Amplifikation im Wesentlichen isothermal durchgeführt wird.
35. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 23 - 24, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Primer-Oligonukleotid (P1 .1 ) im zweiten Bereich eine Modifikation oder mehrere Modifikationen aufweist, insbesondere unmittelbar im Anschluss an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid, welche die erste Polymerase am zweiten Bereich stoppt.
36. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Gegenstände 23 bis 35, umfassend:
ein erstes Primer-Oligonukleotid (P1.1 ) aufweisend folgende Bereiche:
• einen ersten Bereich, der sequenzspezifischen an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure binden kann, wobei der Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure zumindest den 5'-T erminus der Zielsequenz umfasst oder in sich in 5'-Richtung von der Zielsequenz befindet;
• einen zweiten Bereich, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem ersten Controller-Oligonukleotids gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt; wobei das erste Primer-Oligonukleotid (P1.1 ) durch eine Polymerase zu einem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) verlängert werden kann, welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid (P1.1 ) einen synthetisierten Bereich umfasst;
ein zweites Primer-Oligonukleotid (P2.1 ), wobei das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen Bereich umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1-Ext) binden kann, der zumindest zum 5'-Terminus der Zielsequenz komplementär ist oder sich in 3'- Richtung davon befindet, und von einer Polymerase zu einem zweiten Primer- Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) verlängert werden kann, welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen synthetisierten Bereich umfasst ein Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) aufweisend folgende Bereiche::
• einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich des ersten Primer- Verlängerungprodukts (P1.1 -Ext) binden kann,
• einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotid (P1.1 ) im Wesentlichen komplementär ist, und
• einen dritten Bereich, der zumindest zu einen Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungprodukts (P1.1 -Ext) im Wesentlichen komplementär ist;
wobei das Controller-Oligonukleotide (C 1 .1 ) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) dient, und das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) an den ersten und zweiten Bereich des ersten Primer-Verlängerungprodukts (P1.1 -Ext) unter Verdrängung des zu dem ersten und zweiten Bereich komplementären Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure binden kann;
ein drittes Primer-Oligonukleotid (P3.2), wobei das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen ersten Bereichs umfasst, der sequenzspezifisch an einen Bereich des zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) binden kann, der zumindest den 5'-Terminus der Zielsequenz umfasst oder sich in 5'-Richtung davon befindet, und von einer Polymerase zu einem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext) verlängert werden kann, welches neben dem dritten Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen synthetisierten Bereich umfasst; und
ein viertes Primer-Oligonukleotid (P4.2), wobei das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.2) einen ersten Bereichs umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1 -Ext) binden kann, der zumindest zum 5'-Terminus der Zielsequenz komplementär ist oder sich in 3'-Richtung davon befindet, und von einer Polymerase zu einem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) verlängert werden kann, welches neben dem vierten Primer-Oligonukleotid (P4.2) einen synthetisierten Bereich umfasst. 37. Verwendung eines Kits nach Gegenstand 36 für die Durchführung eines Verfahrens nach einem der Gegenstände 23 bis 36.
38. Gegenstand: Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, umfassend die Schritte: a) eine erste Amplifikation mit den Schritten:
Bereitstellung einer Start-Nukleinsäure 1.1 , welche eine Zielsequenz umfasst
Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) an eine zu amplifizierenden Nukleinsäure mit einer Zielsequenz (entweder Start-Nukleinsäure 1 .1 oder P2.1 -Ext), wobei das erste Primer-Oligonukleotid (P1.1 ) folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (P1 .1.1 ), der sequenzspezifischen an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure (P2.1 E1 ) binden kann,
• einen zweiten Bereich (P1 .1.2) , der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und für die verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt;
Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1 ) durch eine erste Polymerase unter Erhalt eines ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext), welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid (P1.1 ) einen synthetisierten Bereich umfasst (P1.1 E1 bis P1 .1 E4), der im Wesentlichen komplementär zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer- Verlängerungsprodukt und die zu amplifizierenden Nukleinsäure als Doppelstrang vorliegen;
Bindung eines Controller-Oligonukleotids (C1 .2) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1 .2) folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (01 .2.1 ), der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1 E6) binden kann,
• einen zweiten Bereich (C1.2.2), der zum ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotid (P1.1 .1 ) komplementär ist, und
• einen dritten Bereich (C1 .2.3), der zumindest zu einen Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 E4) im Wesentlichen komplementär ist; und
wobei das Controller-Oligonukleotide (C 1 .1 ) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) dient, und das erste Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) an den ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 E6, P1 .1 E5, P1.1 E4) unter Verdrängung des zu diesem Bereich komplementären Bereich (P2.1 E1 , P2.1 E2) der zu amplifizierenden Nukleinsäure bindet;
Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen Bereich umfasst (P2.1.1 ), der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1 E1 ) binden kann,
Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids (P.2.1 ) durch die erste Polymerase unter Erhalt eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1-Ext), welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) einen synthetisierten Bereich (P2.1 E4 bis P2.1 E1 ) umfasst, der im Wesentlichen identisch zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) und das zweite Primerverlängerungsprodukt (P2.1 ) ein erstes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt bilden; und
Schritte der ersten Amplifikation wiederholt werden, bis die gewünschte Menge an ersten Amplifikationsprodukten synthetisiert wurde.
b) eine zweite Amplifikation mit den Schritten:
Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das zweite und / oder das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P1 1 -Ext. oder P4.1-Ext ), wobei der dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen ersten Bereichs (P3.1.1 ) umfasst, der sequenzspezifisch an einen Bereich des zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 E1 ) und des vierten Primer-Verlängerungsprodukts (P4.1 E2) binden kann,
Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) durch eine zweite Polymerase unter Erhalt eines dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext), welches neben dem dritten Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen synthetisierten Bereich (P3.1 E5 bis P3.1 E2 bzw. P3.1 E5 bis P3.1 E1 ) umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) oder zur Zielsequenz ist, wobei das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 ) und das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 ) als Doppelstrang vorliegen;
Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) an das erste Primer- Verlängerungsprodukts (P1 .1-Ext) und / oder an das dritte Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) wobei das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.2) einen ersten Bereichs umfasst (P4.1 .1 ), der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1 E1 ) und des dritten Primerverlängerungsproduktes (P3.1 E2) binden kann,
Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) durch die zweite Polymerase unter Erhalt eines vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.2-Ext), welches neben dem vierten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich (P4.1 E5 bis P4.1 E2 oder P4.1 E5 bis P4.1 E1 ) umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) oder identisch zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) und das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) als Doppelstrang vorliegen;
Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 - Ext) und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext) und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext) und des Doppelstrangs aus dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) und dem dritten Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext);
Hybridisieren des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das vierte Primer- Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und Verlängerung des dritten Primer- Oligonukleotids (P3.2) durch die zweite Polymerase; und
Hybridisieren des vierten Primer-Oligonukleotids an das dritte Primer- Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext) und Verlängerung des vierten Primer- Oligonukleotids (P4.2) durch die zweite Polymerase.
Verfahren nach Gegenstand 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte der ersten Amplifikation so oft widerholt werden, bis das ersten Amplifikationsprodukt in einer Kopienanzahl im Bereich von 10 bis 100.000.000.0000 vorliegt, insbesondere von 100 bis 1000.000.000, insbesondere von 1000 bis 100.000.000.
Verfahren nach Gegenstand 38 oder 39, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Primer- Oligonukleotid und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid einen zweiten Bereich (P3.1.2 bzw. P4.1 .2) aufweisen, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt, wobei der zweite Bereich nicht komplementär an das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext) oder an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext) binden kann.
Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 38 - 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1 1-Ext) und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext) und dem dritten Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) und des Doppelstrangs aus dem vierten Primer- Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1 -Ext) durch thermale Denaturierung durchgeführt wird, insbesondere bei einer Temperatur im Bereich von 85 °C bis 105 °C.
Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 38 - 40, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polymerase und die zweite Polymerase identisch sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Primer-Oligonukleotid (P1 .1 ) und das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) im Wesentlichen identisch sind; und/oder
das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) und das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.2) im Wesentlichen identisch sind.
44. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 38 - 40, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Amplifikation und die zweite Amplifikation im selben Reaktionsansatz durchgeführt werden.
45. Verfahren nach Gegenstand 44, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Polymerase, das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.1 ) und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.1 ) aktivierbar sind, und/oder das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) deaktivierbar ist.
46. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 38 - 45, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonukleotid-Sonde an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt komplementär binden kann und das Signal des
Fluoreszenzfarbstoffs erfasst wird.
47. Verfahren nach einem der vorherigen Gegenstände 38 - 46, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonukleotid-Sonde an das vierte Primer-Verlängerungsprodukt komplementär binden kann und das Signal des
Fluoreszenzfarbstoffs erfasst wird.
Beispiele
Material und Methoden:
Reagenzien wurden von folgenden kommerziellen Anbietern bezogen:
nicht modifizierte und modifizierte Oligonukleotide (Eurofins MWG, Eurogentec, Biomers, Trilink Technologies, IBA Solutions for Life Sciences) ; Polymerasen NEB (New England Biolabs) ; dNTP's: Jena Bioscience; interkallierender EvaGreen Farbstoff: Jena Bioscience; Puffer- Substanzen und andere Chemikalien: Sigma-Aldrich; Plastikware: Sarstedt
Lösung 1 (Amplifikationsreaktion Lösung 1 ):
Kaliumglutamat, 50 mmol/l, pH 8,0; Magnesiumacetat, 10 mmol/l ; dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), je 200 pmol/l; Polymerase (Bst 2.0 Warmstart, 120.000 U/ml NEB), 12 Units / 10 pl; Triton X-100, 0,1 % (v/v) ; EDTA, 0,1 mmol/l; TPAC (Tetrapropylammonium Chloride), 50 mmol/l, pH 8,0; EvaGreen Farbstoff (Farbstoff wurde entsprechend Anleitung des Herstellers in Verdünnung 1 :50 eingesetzt). Lösung 2 (Amplifikationsreaktion Lösung 2):
1x Isothermal Puffer (New England Biolabs); in einfacher Konzentration enthält der Puffer: 20 mM Tris-HCI; 10 mM (NH4)2S04 ; 50 mM KCl; 2 mM MgS04; 0.1 % Tween® 20;pH 8.8@25°C) ; dNTP (dATP, dCTP, dUTP, dGTP), je 200 pmol/l;
EvaGreen Farbstoff (Farbstoff wurde entsprechend Anleitung des Herstellers in Verdünnung 1 :50 eingesetzt)
Lösung 4 (Amplifikationsreaktion Lösung 4): ; 1 x Isothermal Puffer (New England Biolabs) siehe vorstehend.
Alle Konzentrationen sind Angaben der Endkonzentrationen in der Reaktion. Abweichungen von der Standard-Reaktion werden entsprechend angegeben.
Die Schmelztemperatur (Tm) von beteiligten Komponenten wurde bei Konzentration von 1 pmol/l von jeweiligen Komponenten in Lösung 1 bestimmt. Abweichende Parameter sind jeweils angegeben.
Allgemeine Informationen zu Reaktionen (erste Amplifikation)
Der Reaktionsstart erfolgte durch Erhitzen der Reaktionslösungen auf Reaktionstemperatur, da Bst 2.0 Polymerase Warmstart bei niedrigeren Temperaturen größtenteils in ihrer Funktion durch ein Temperatur-sensitives Oligonukleotid gehemmt ist (laut Hersteller-Angaben). Die Polymerase wird zunehmend aktiver ab einer Temperatur von ca. 45°C, bei einer Temperatur von 65°C konnten keine Unterschiede zwischen Polymerase Bst 2.0 und Bst 2.0 Warmstart festgestellt werden. Um der extensiven Bildung von Nebenprodukten (z.B. Primer-Dimeren) während der Vorbereitungsphase einer Reaktion vorzubeugen, wurde Polymerase Bst 2.0 Warmstart verwendet. Abweichungen davon werden speziell angegeben.
Reaktionsstopp erfolgte durch Erhitzen der Reaktionslösung auf über 80°C, z.B. 10 min bei 95°C. Bei dieser Temperatur wird Polymerase Bst 2.0 irreversibel denaturiert und das Ergebnis der Synthese-Reaktion kann nachträglich nicht geändert werden.
Reaktionen wurden in einem Thermostat mit einer Fluoreszenz-Messvorrichtung ausgeführt. Zu diesem Zweck wurde ein kommerzielles Real-Time PCR Gerät verwendet, StepOne Plus (Applied Biosystems, Thermofischer). Das Reaktionsvolumen betrug standardmäßig 10 pl. Abweichungen davon werden angegeben.
Sowohl Endpunkt-Bestimmung als auch kinetische Beobachtungen wurden vorgenommen. Bei Endpunktbestimmungen wurde das Signal beispielsweise von an Nukleinsäuren gebundenen Farbstoffen registriert, z.B. von TMR (Tetramethyl-Rhodamine, auch TAMRA genannt) oder von FAM (Fluorescein). Die Wellenlängen zur Anregung und Messung der Fluoreszenzsignale von FAM und TMR sind als Werkeinstellungen bei StepOne Plus Real-Time PCR Gerät gespeichert. Ebenfalls wurde ein interkallierender Farbstoff (EvaGreen) bei Endpunktmessungen vorgenommen (z.B. bei Messung einer Schmelzkurve). EvaGreen ist ein interkallierender Farbstoff und ist ein Analogon des häufig eingesetzten Farbstoff Sybrgreen, allerdings mit etwas geringerer Inhibierung von Polymerasen. Die Wellenlängen zur Anregung und Messung der Fluoreszenzsignale von SybrGreen und EvaGreen sind identisch und sind als Werkeinstellungen bei StepOne Plus Real-Time PCR Gerät gespeichert. Die Fluoreszenz kann mittels eingebauter Detektoren fortlaufend, d.h. „online“ oder„Real-Time“ detektiert werden. Da die Polymerase während ihrer Synthese einen Doppelstrang synthetisiert, konnte diese Technik zu kinetischen Messungen (Real-Time Monitoring) der Reaktion verwendet werden. Aufgrund von einem gewissen Cross-Talk zwischen Farb-Kanälen bei StepOne Plus Gerät wurde teilweise erhöhte basale Signal-Intensität bei Messungen beobachtet, bei welchen z.B. TMR-markierte Primer in Konzentration von über 1 pmol/l (z.B. 10 pmol/l) eingesetzt waren. Es wurde beobachtet, dass TMR-Signal in Sybr-Green-Kanal zu erhöhten Grundwerten führt. Diese erhöhten Grundwerte wurden bei Berechnungen berücksichtigt.
Die kinetischen Beobachtungen von Reaktionsverläufen wurden routinemäßig mittels Fluoreszenzsignalen von Fluoreszein (FAM-TAMRA Fret-Paar) bzw. interkallierenden Farbstoffen (EvaGreen) aufgenommen. Zeitabhängigkeit des Signal-Verlaufs wurde registriert (Real-Time Signal Erfassung bei StepOne plus PCR Gerät). Ein Anstieg des Signals während einer Reaktion verglichen zu einer Kontroll-Reaktion wurde je nach Aufbau des Ansatzes interpretiert. Beispielsweise, eine Zunahme des Signals bei Verwendung von Evagreen-Farbstoff wurde als Hinweis auf eine Zunahme der Menge an doppelsträngigen Nukleinsäureketten während der Reaktion interpretiert, und somit als Ergebnis einer stattfindenden Synthese durch die DNA- Polymerase gewertet.
Bei einigen Reaktionen wurde im Anschluss an die Reaktion eine Schmelzkurvenbestimmung durchgeführt. Solche Messungen erlauben Rückschlüsse auf das Vorliegen von Doppelsträngen, welche beispielsweise interkallierende Farbstoffe aufnehmen können und dadurch die Signalintensität von Farbstoffen deutlich verstärken. Mit der steigenden Temperatur sinkt der Anteil von Doppelsträngen und die Signal-Intensität sinkt ebenfalls. Das Signal ist von der Länge von Nukleinsäureketten und von der Sequenzzusammensetzung abhängig. Diese Technik ist einem Fachmann hinreichend bekannt.
Bei Verwendung der Schmelzkurven-Analyse im Zusammenhang mit Reaktionen, welche signifikante Anteile von modifizierten Nukleinsäureketten (z.B. Controller-Oligonukleotide oder Primer) enthielten, wurde festgestellt, dass sich das Signal von Farbstoff EvaGreen beispielsweise unterschiedlich zwischen B-Form der DNA und A-Form von modifizierten Nukleinsäureketten verhalten kann. Beispielsweise wurde bei B-Form der doppelsträngigen Nukleinsäureketten (gewöhnlich angenommen für klassische DNA-Abschnitte) eine höhere Signal-Intensität beobachtet, als bei doppelsträngigen Nukleinsäureketten mit der gleichen Sequenz von Nukleobasen, welche eine A-Form ähnliche Konformation annehmen können (z.B. durch mehrere 2'-0-Me Modifikationen von Nukleotiden). Diese Beobachtung wurde beim Einsatz von interkallierenden Farbstoffen berücksichtigt. Bei Bedarf wurde die Reaktion mittels Kapillarelektrophorese analysiert und die Länge von gebildeten Fragmenten mit einem Standard verglichen. Als Vorbereitung auf die Kapillarelektrophorese wurde die Reaktionsmischung in einem Puffer (Tris-HCI, 20 mmol/l, pH 8,0, und EDTA, 20 mmol/l, pH 8,0) dermaßen verdünnt, dass die Konzentration von markierten Nukleinsäuren ca. 20 nmol/l betrug. Die Kapillar-Elektrophorese wurde bei Firma GATC-Biotech (Konstanz, Deutschland) als Auftragsleistung durchgeführt. Nach Angaben des Anbieters wurde die Kapillarelektrophorese auf einem ABI 3730 Cappilary Sequencer unter Standard-Bedingungen für eine Sanger-Sequenzierung unter Verwendung von POP7 Gelmatrix, bei ca. 50°C durchgeführt und bei konstanter Spannung (ca. 10 kV) durchgeführt. Die verwendeten Bedinungen führten zu Denaturierung von Doppelsträngen, so dass in der Kapillarelektrophorese die einzelsträngige Form von Nukleinsäureketten separiert wurde. Die Elektrophorese ist eine Standardtechnik in der genetischen Analyse. Die automatisierte Kapillar-Elektrophorese wird heute routinemäßig bei Sanger-Sequenzierung eingesetzt. Das Fluoreszenz-Signal wird während der Kapillar- Elektrophorese kontinuierlich aufgezeichnet (gewöhnlich unter Verwendung von virtuellen Filtern), so dass ein Elektrophorogramm entsteht, bei welchem die Signal-Intensität mit der Dauer der Elektrophorese korreliert. Bei kürzeren Fragmenten, z.B. nicht verbrauchte Primer, beobachtet man einen früheren Signal-Peak, bei verlängerten Fragmenten kommt es zu einer zeitlichen Verschiebung der Signale proportional zu der Länge des extendierten Bereichs. Dank mitgeführten Kontrollen mit bekannten Längen lässt sich die Länge von extendierten Fragmenten ausmessen. Diese Technik ist einem Fachmann bekannt und wird ebenfalls standardmäßig bei Fragment- Längen-Polymorphismus eingesetzt.
Soweit nichts anderes in Bezug auf eine bestimmte Sequenz definiert ist, bezeichnen sowohl Groß- wie Kleinbuchstaben agct und AGCT die Desoxyribonucleotidbausteine der DNA, oder die entsprechenden Ribonucleotide oder Basenanaloga. In einigen Ausführungsbeispielen werden Uracil-Nukleobasen in modifizierten Sequenzsegmenten eingesetzt, als Zucker waren daher 2 - OMe Modifikationen eingesetzt (Ribose mit 2'-0-Methyl-Modifikation). Auch andere 2'-0-Alkyl Modifikationen kommen in Frage. Bei Amplifikations-Ansätzen mit dUTP (insbesondere erste Amplifikationsreaktion) werden Amplifikations-Fragmente generiert, welche dUMP umfassen (als Schutz vor Kontamination). Generell können aber Uracil-Basen sowohl mit 2'-Deoxy-Ribose als auch mit Ribose eingesetzt werden; der Fachmann entnimmt der Offenbarung als Ganzes die auf die jeweiligen Sequenzabschnitte der hier verwendeten Sequenzen bezogene Lehre zur Bestimmung, an welchen Stellen klassische DNA-Rückgrate, RNA oder Basenanaloga sinnvoll einsetzbar sind. Beispiel 1 (Fig. 36)
Verwendung humaner genomischer DNA als Quelle von Zielsequenz
In diesem Beispiel wird die Verwendung humaner genomischer DNA (hgDNA) als Quelle einer Zielsequenz gezeigt. Als Zielsequenz wurde ein Sequenzsegment des Faktor-V-Leiden Genes (Homo sapiens coagulation factor V (F5), mRNA, hier als FVL-Gen bezeichnet) gewählt.
Es wurde nur die erste Amplifikation durchgeführt. Das Beispiel zeigt, dass eine Controller abhängige erste Amplifikation durchgeführt werden kann. In diesem Beispiel wurde keine zweite Amplifikation durchgeführt.
Zielsequenz:
5' GTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA - 3' (SEQ ID NO:001 )
Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen. Das zweite Primer- Oligonukleotid bindet mit seinem 3'-Segment an das Reverse-Complement der doppelt unterstrichenen Sequenz.
Der erste Primer, der zweite Primer, sowie Controller-Oligonukleotid wurden für die FVL-Mutation Variante des Genes designt und synthetisiert.
Das erste Primer-Oligonukleotid: P1 F5-200-AE2053
5 ' AACT CAG ACAAG ATGTG AT ttTTTT AC CTGTAT [CUCU GAUGCUUC] 1TACCTGTATTCC 3' (SEQ ID NO:2):
Der als Primer in der Reaktion verwendetes Segment ist unterstrichen.
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:
1 = C3-Linker diente zur Terminierung der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Das in eckige Klammern gesetzte Segment des Primers [CUCU GAUGCUUC] umfasste 2'-0- Me-Modifikationen und diente als zweiter Primer-Bereich zur Bindung des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides:
A = (2'-0-Methyl-Adenosine); G = (2'-0-Methyl-Guanosine); C = (2'-0-Methyl-Cytosine); U = (2'-0-Methyl-Uridine)
Dieses Primer-Oligonukleotid umfasst den ersten Bereich (Positionen 1 - 12 vom 3 '-Ende), den zweiten Bereich (C3-Linker, sowie Positionen 13 - 24 vom 3'-Ende), sowie ein Segment mit einer Zusatzsequenz Variante P1 (Positionen 25 - 57 vom 3'-Ende). Der erste Bereich und der zweite Bereich sind für die Ausführung einer spezifischen Amplifikation notwendig und können als "Basis- Struktur des ersten Primers" oder "minimale Struktur des ersten Primers" zusammengefasst werden. Die Zusatzsequenz Variante P1 stellt ein Beispiel für zusätzliche Sequenz-Segmente, welche am ersten Primer-Oligonukleotid integriert werden können. Positionen 1 - 12 dienen als Matrize bei Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes. C3-Modifikation und der zweite Bereich verhindern eine Fortsetzung der Synthese an Positionen 25 - 57 während einer Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Primer 2: P2G3-5270-7063
5' CT ACAGAACT CAG ACAAG ATGTG AACT ACAAT GTT 6
G CT CAT ACT AC AATGTC ACTT ACTGTAAG AG C AG A 3' (SEQ ID NO:3)
Der als Primer in der Reaktion verwendetes Segment ist unterstrichen.
Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:
6 = HEG-Linker
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Dieses Primer-Oligonukleotid umfasst einen kopierbaren Bereich und einen nicht kopierbaren Bereich. Der kopierbare Bereich umfasst (Positionen 1 - 13 vom 3'-Ende, welche an Sequenz von FVL-Gen innerhalb von hgDNA komplementär binden kann und Positionen 14 - 35, welche zwar nicht an Sequenz von FVL-Gen komplementär binden aber während der Amplifikation an das erste Primer-Verlängerungsprodukt binden können). Der kopierbare Bereich kann als "Basis-Struktur des zweiten Primers" oder "minimale Struktur des zweiten Primers" zusammengefasst werden.
Der unkopierbare Bereich (Positionen 36 - 70 vom 3'-Ende, welche nicht an Sequenz von FVL- Gen komplementär binden) ist durch HEG-Modifikation vom kopierbaren Bereich getrennt, was die Fortsetzung der Synthese an Positionen 36 - 70 während einer Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes verhindert. Der unkopierbare Bereich stellt ein Beispiel für eine Zusatzsequenz Variante P2, welche am zweiten Primer-Oligonukleotid integriert werden können.
Folgendes Controller-Oligonukleotid wurde verwendet: AD-F5-1001 -503
5'[UAAUCUGUAA GAGCAGAUCCCUGGACAGGC AA GGAAUACJAGGTAGAAGCATC AGAG X 3' (SEQ ID NO:4)
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Das in eckige Klammern gesetzte 5'-Segment des Oligonukleotids [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC] umfasste 2'-0-Me-Nukleotid-Modifikationen:
Modifikationen: A = (2'-0-Methyl-Adenosine); G = (2'-0-Methyl-Guanosine); C = (2'-0-Methyl- Cytosine); U = (2'-0-Methyl-Uridine)
X = 3'-Phosphat-Gruppe zur Blockade einer möglichen Verlängerung durch Polymerase. Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft. Das 3'-Ende des Controller-Oligonukleotides ist mit einer Phosphat-Gruppe blockiert, um eine mögliche Verlängerung durch die Polymerase zu verhindern.
Der erste Primer umfasst in seinem ersten Bereich eine Sequenz, welche spezifisch an die Sequenz des Faktor-V-Leiden Genes innerhalb der genomischen DNA binden kann, so dass eine Synthese durch eine Polymerase gestartet werden kann. Der zweite Bereich des ersten Primers umfasst eine Sequenz, welche nicht an die Sequenz des FVL-Gens spezifisch hybridisiert. Weiterhin umfasst der erste Primer ein weiteres Sequenzsegment, welches an das 5'-Ende des zweiten Bereichs anknüpft (Zusatzsequenz Variante P1 ). Dieses Segment nimmt an der spezifischen Amplifikation des Faktor-5-Leiden Segments nicht teil. Die Funktion dieses Segments wird vor allem in der Verzögerung von Nebenreaktionen gesehen.
Der zweite Primer umfasst ein Segment in seinem 3 '-Segment, welches spezifisch an die genomische DNA binden kann, so dass eine Synthese durch eine Polymerase gestartet werden kann. Das 5'-Segment des zweiten Primers umfasst eine Sequenz, welche nicht an die Sequenz des FVL-Gens spezifisch hybridisiert. Während der Rücksynthese kann dieses Sequenzsegment kopiert werden. Der zweite Primer umfasst ein weiteres Sequenzsegment, welches weder mit dem Controller-Oligonukleotid, noch mit dem ersten Primer, noch mit dem zweiten Primer spezifisch hybridisieren kann. Dieses Segment wurde an das 5'-Ende des zweiten Primers lokalisiert und ist vom 5'-Ende des Primers durch eine HEG-Linker getrennt (Zusatzsequenz Variante P2). Dieses Segment nimmt nicht an der spezifischen Amplifikation teil. Die Funktion dieses Segments wird vor allem in der Verzögerung von Nebenreaktionen gesehen.
Das Controller-Oligonukleotid wurde dermaßen konstruiert, dass eine Perfekt-Match-Situation zur Sequenz der Faktor-V-Leiden Mutation des FVL-Gens resultiert. Das Controller-Oligonukleotid umfasst einen ersten, zweiten und dritten Bereich.
Als genomische DNA wurde der WHO-Standard für die FVL-Mutation verwendet. Vor der Verwendung in der Reaktion wurde die DNA durch Erhitzung denaturiert (5 min bei 95°C) und damit aus dem doppelsträngigen Zustand in den einzelsträngigen Zustand überführt. Anhand dieser einzelsträngigen hgDNA wurde zunächst eine Start-Nukleinsäurekette durch eine Primer- Verlängerung erstellt. Anschließend erfolgte eine exponentielle Amplifikation ausgehend von dieser Start-Nukleinsäurekette. Der Nachweis der Spezifität der Amplifikation erfolgte mittels Schmelzkurven-Analyse und Sanger-Sequenzierung mit einem Sequenzierungprimer.
Alle Reaktionen wurden in Amplifikations-Lösung 1 durchgeführt.
Die verwendeten dNTPs umfassten: dATP, dGTP, dCTP, dUTP (anstatt von dTTP).
Als Polymerase wurde Bst 2.0 Warm-Start Polymerase von NEB verwendet.
Die Start-Nukleinsäurekette wurde wie folgt erstellt: Etwa 50,000 haploider genom Äquivalente (HGE), 150 ng hgDNA, wurden in Kontakt mit dem zweiten Primer (0,5 pmol/l) und Bst-2.0 Warm Start Polymerase (etwa 1 unit), sowie dNTPs (ca. 250 pmol/l) unter Hybridierungsbedingungen (Amplifikationslösung 1 , Temperatur von etwa 60°C) in 50 pl Reaktionsvolumen gebracht und ca. 10 min inkubiert. Während dieser Phase erfolgt eine Verlängerung des zweiten Primers, wobei die genomische DNA als Matrize diente. Es resultiert ein Primer-Verlängerungsprodukt, welches als Start-Nukleinsäure dienen kann. Nach Abschluss dieser Reaktion wurde das Reaktionsgemisch erhitzt auf 95°C für ca. 10 min, um diese Start- Nukleinsäurekette zu trennen. Dieses Reaktionsgemisch wurde eingefroren und als Quelle der Start-Nukleinsäurekette nach Bedarf verwendet.
Die spezifische Amplifikation der Zielsequenz des FVL-Gens erfolgte unter Verwendung von 5 pl des Reaktionsgemisches mit der Start-Nukleinsäurekette (entspricht ca. 5000 HGE).
Die anderen Reaktionskomponenten (erster Primer, zweiter Primer, Controller-Oligonukleotid, Eva-Green Farbstoff, Polymerase Bst.2.0 Warm Start, dNTPs) wurden dazugegeben, so dass ein Reaktionsendvolumen von ca. 10 pl resultierte. Die Endkonzentrationen der Komponenten betrugen: erster Primer: 5 pmol/l, zweiter Primer:
2 pmol/l, Controller-Oligonukleotid: 1 pmol/l, Eva-Green Farbstoff (1 :50), Polymerase Bst.2.0 Warm Start (ca. 8 Units), dNTPs: ca. 250 pmol/l.
Im Kontroll-Ansatz wurde keine hgDNA zugegeben.
Die Reaktion wurde in einem Step-One Plus Gerät (Thermofisher Scientific) durchgeführt.
Die Reaktionstemperatur wurde initial durch zyklische Änderungen (30 Zyklen) geändert zwischen 65°C (5 min, einschließlich Detektionsschritt) und 55°C (1 min) und anschließend für 1 hr bei 65°C konstant gehalten (Detektionsschritt alle 2 min). Der Verlauf der Reaktion wurde durch Signal- Erfassung des EvaGreen Farbstoffs verfolgt. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zunächst auf 95°C für 10 min gebracht und anschließend wurde eine Schmelzkurve der gebildeten Produkte gemessen.
Zunächst erfolgte eine Erstellung einer Start-Nukleinsäurekette (schematisch Fig. 50). Anschließend erfolgte eine exponentielle Amplifikation unter Verlängerung des ersten Primers und des zweiten Primers und des Controller-Oligonukleotids.
Als Ergebnis der Amplifikation kommt es zur Akkumulierung von Amplifikationsfragmenten. Das Ergebnis der Detektion der Amplifikation ist in Fig. 36 zu sehen. Man sieht, dass ca. nach 2 hr der Reaktion eine sichtbare Zunahme der Fluoreszenz erfolgt (36 A). Die anschließende Schmelzkurven-Analyse zeigte eine spezifische Schmelzkurve mit Tm von 84°C (Fig. 36 B).
Sequenzüberprüfung (Fig. 36C):
Die Sequenzüberprüfung erfolgte mittels eines Sequenzierungsprimers:
SeqP1 F5-35-x03 5'- AAG CTCGACAAAAGAAC TCAG AG TGTG CTCGAC AC tacctgtattcc ttgcc 3' (SEQ ID NO: 005)
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Zur Sequenzüberprüfung wurde das Reaktionsgemisch (nach Messung der Schmelzkurve) mit Wasser verdünnt (von ca. 1 :10 bis ca. 1 :100) und die jeweils erhaltenen Aliquoten mit einem Sequenzierungsprimer (zugegeben in Konzentration von 2 pmol/l) gemischt. Dieses Gemisch wurde durch einen kommerziellen Sequenzierungs-Anbieter versendet (GATC-Biotec) und mittels Sanger-Sequenzierung als Auftrags-Sequenzierung sequenziert. Die erhaltenen Elektropherogramme wurden auf Übereinstimmung mit der FVL-Sequenz Gens geprüft. Als Ergebnis der Reaktion wurde Sequenz des FVL-Gens identifiziert.
Beispiel 2 (Fig. 37):
Selektive Amplifikations-Reaktion von Sequenz-Varianten einer Zielsequenz.
In diesem Beispiel wurde Einfluss einer Sequenzänderung in der Matrize auf die Amplifikation untersucht. Bei Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotides wird ein komplementärer Strang gebildet, welcher eine komplementäre Sequenz zur Matrize aufweist und somit diese Abweichungen in der Sequenz umfasst. Auf diese Weise sollte überprüft werden, welche Auswirkung ein solcher Mismatch zwischen einem dabei entstehenden ersten Primer- Verlängerungsprodukt und einem Controller-Oligonukleotid auf die Amplifikation hat. Die Position des Mismatches liegt in 3'-Richtung des ersten Primers und wird somit nicht durch den Primer, sonder durch das Controller-Oligonukleotid überprüft.
Diskriminierung zwischen einzelnen Sequenz-Varianten der Zielsequenz erfolgt somit mittels Controller-Oligonukleoitid unter Verwendung eines einheitlichen ersten und zweiten Primers.
Es wurde nur die erste Amplifikation durchgeführt. Das Beispiel zeigt, dass eine Controller abhängige erste Amplifikation mit Diskriminierung zwischen zwei Zielsequenzvarianten durchgeführt werden kann. In diesem Beispiel wurde keine zweite Amplifikation durchgeführt.
Folgende Matrizen wurden verwendet:
Matrize (SEQ ID NO 6) mit Sequenzzusammensetzung, welche zu einem ersten Primer- Verlängerungsprodukt mit einem Perfekt-Match Übereinstimmung mit Controller-Oligonukleotid führt:
M2SF5-M001 -200
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA AAAAA 3' (SEQ ID NO:6)
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin) Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen. Das zweite Primer- Oligonukleotid bindet an das Reverse-Complement der doppelt unterstrichen Sequenz .(35 Positionen in 5‘ Terminus).
Matrize (SEQ ID NO 7) mit Sequenzzusammensetzung, welche zu einem ersten Primer- Verlängerungsprodukt führt, das an einer einzelnen Basenposition (fett gedruckt) ein Mismatch mit dem Controller-Oligonukleotid bildet:
M2SF5-WT01-200
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC GA GGAATACAGGTA AAAAA 3' (SEQ ID NO:7)
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen. Das zweite Primer- Oligonukleotid bindet an das Reverse-Complement der doppelt unterstrichenen Sequenz.
Folgende Primer wurden verwendet:
Das erste Primer-Oligonukleotid:
P1 F5-200-AE2053
5 ' AACT CAG ACAAG ATGTG AT ttTTTT AC CTGTAT [CUCU GAUGCUUC] 1TACCTGTATTCC 3' (SEQ ID NO:2)
Der als Primer in der Reaktion verwendetes Segment ist unterstrichen.
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:
1 = C3-Linker diente zur Terminierung der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Segment des Primers [CUCU GAUGCUUC] umfasste 2'-0-Me-Modifikationen und diente als zweiter Primer-Bereich zur Bindung des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides:
A = (2'-0-Methyl-Adenosine) G = (2'-0-Methyl-Guanosine); C = (2'-0-Methyl-Cytosine); U = (2'-0-Methyl-Uridine)
Primer 2: P2G3-5270-7063
5' CT AC AG AACT CAG ACAAG AT GT G AACT AC AATGTT 6
GCT CAT ACT AC AATGTC ACTT ACTGT AAG AG C AG A 3' (SEQ ID NO: 3)
Das als Primer in der Reaktion verwendete Segment ist unterstrichen.
Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen: 6 = HEG-Linker
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Folgendes Controller-Oligonukleotid wurde verwendet:
AD-F5-1001-503
5'[UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUACjAGGTAGAAGCATC AGAG X 3' (SEQ ID NO:4)
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Das in eckige Klammern gesetzte 5'-Segment des Oligonukleotids [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC] umfasst 2'-0-Me-Nukleotid-Modifikationen:
Modifikationen:
A = (2'-0-Methyl-Adenosine) G = (2'-0-Methyl-Guanosine); C = (2'-0-Methyl-Cytosine); U = (2'-0-Methyl-Uridine)
X = 3'-Phosphat-Gruppe zur Blockade einer möglichen Verlängerung durch Polymerase.
Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft. Das 3'-Ende des Controller-Oligonukleotdies ist mit einer Phosphat-Gruppe blockiert, um eine mögliche Verlängerung durch die Polymerase zu verhindern.
Es wurden vier Ansätze vorbereitet:
Ansatz 1 enthält als Start-Nukleinsäurekette die Matrize M2SF5-M001 -200 (Perfect Match Situation) in Konzentration von 300 fmol/l (entspricht ca. 2x10L6 Kopien/ Ansatz).
Ansatz 2 enthält als Start-Nukleinsäurekette die Matrize M2SF5-M001 -200 (Perfect Match Situation) in Konzentration von 300 amol/l (entspricht ca. 2x10L3 Kopien/ Ansatz).
Ansatz 3 enthält keine Matrize und bildet somit eine Kontrolle.
Ansatz 4 enthält als Start-Nukleinsäurekette die Matrize M2SF5-WT01-200 (single Mismatch Situation) in 300 pmol/l Konzentration (ca. 2x 10L9 Kopien pro Ansatz).
Primer 1 wurde mit 5 pmol/l, das Controller-Oligonukleotid mit 2 pmol/l und Primer 2 mit 1 pmol/l eingesetzt.
Die weiteren Reaktionsbedingungen waren: Amplifikations-Lösung 2.
Um die Anwesenheit von genomischer DNA im Assay nachzustellen wurden pro Reaktion 100 ng frisch denaturierte Fisch-DNA (Lachs-DNA) zugegeben.
Die thermischen Reaktionsbedingungen waren zyklisch alternierende Temperaturänderungen, wobei jeweils auf ein 2 min Zeitintervall bei 55 °C ein 5 min Zeitintervall bei 65 °C folgte. Die Amplifikation wurde über 100 Zyklen verfolgt. Detektion erfolgte bei 65°C für EvaGreen- Fluoreszenzsignal.
Die erfolgreiche Amplifikation konnte durch einen Anstieg des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit festgestellt werden.
Die Temperatur-Änderungen und Real-Time Monitoring wurde mit StepPne Plus Real-Time PCR Gerät von Thermofisher durchgeführt.
Fig. 37 zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Signals. Auf der Y-Achse ist die Zunahme des Fluoreszenzsignal (Delta Rn) und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Pfeile markieren einzelne Reaktionsansätze. Dabei gehören die markierten Positionen zu folgenden Ansätzen:
Pfeil 1 : 300 fmol/l perfekt-Match Matrize ( ca. 2x10L6 Kopien/Ansatz)
Pfeil 2: 300 amol/l perfekt-Match Matrize ( ca. 2x10L3 Kopien/Ansatz)
Pfeil 3: keine Matrize
Pfeil 4: 300 pmol/l Mismatch Matrize (ca. 2x 10L9 Kopien pro Ansatz).
Man sieht den Anstieg des Fluoreszenz-Signals sowohl bei perfekt-Match als auch bei Mismatch- Variante der Matrize, wobei das Signal der Mismatch-Variante (4) trotz 100fachen Überschußes später erscheint. Es ist erkennbar, dass die Mismatch-Amplifikationssignale gegenüber dem Perfekt-Match Amplifikationssignal deutlich verzögert sind. Beim Single Mismatch wird eine Verzögerung von ca. 15 Zyklen beobachtet. Die zeitliche Verzögerung (=Zyklusanzahl) ist ein unmittelbares Maß für die Diskriminierung in der Amplifikation. Eine weitere Quantifizierung der Diskriminierung in der Amplifikation kann über den Vergleich mit einer Matrizen- Konzentrationsreihe unter Perfekt-Match Amplifikation erzielt werden.
Bei Verwendung einer Perfect-Match Matrize kommt es zur Synthese eines komplementären Stranges eines Primer-Verlängerungsproduktes. Dieses Verlängerungsprodukt ist sowohl zur Perfect-Match-Matrize komplementär als auch zum verwendeten Controller-Oligonukleotid.
Im Gegensatz dazu, unter Verwendung einer Mismatch-Sequenz kommt es bei der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes zur Generierung eines komplementären Stranges des Verlängerungsproduktes, welches zwar eine vollständige Komplementarität zur Mismatch-Matrize aufweist, aber dadurch von der Komplementarität mit dem dritten Bereich des Controller- Oligonukleotid abweicht. Diese Abweichung findet im 5'-ständigen Segment des Verlängerungsproduktes statt, welches mit Controller-Oligonukleotid reagieren sollte, damit der Strangverdrängungsvorgang voranschreiten kann. Wie im vorliegenden Beispiel gezeigt wird, stört das Mismatch eine Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid.
Die Kontrollreaktionen mit einer Perfect Match Matrize (Pfeile 1 und 2) zeigten eine Konzentrationsabhängigkeit der Amplifikation. Mit sinkender Konzentration brauchte die Reaktion längere Zeit, um eine ausreichende Menge der zu amplifizierenden Nukleinsäure zu synthetisieren, damit das Signal über das Niveau der Baseline ansteigt.
Dieses Ergebnis veranschaulicht die Bedeutung der Basenzusammensetzung im Controller- Oligonukleotid: Abweichungen von der Komplementarität zwischen Controller-Oligonukleotid und dem Primer-Verlängerungsprodukt können zu Verlangsamung oder sogar Unterbrechung der Amplifikation führen.
In diesem Beispiel wurde gezeigt, dass obwohl Sequenz-Enden von Perfect-Match-Matrize und Mismatch-Matrize komplett übereinstimmten und somit das Potenzial zu Bindung von beiden Primer-Oligonukleotiden gleich war, sind beide Reaktionen vollkommen unterschiedlich gelaufen: bei einer vollständigen Komplementarität zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem 5'- Segment des Verlängerungsproduktes des ersten Primer-Oligonukleotides verlief die Amplifikation planmäßig. Eine Unterbrechung der Strangverdrängung durch eine Sequenzabweichung (in diesem Fall durch ein Mismatch) führte zur Unterdrückung der Amplifikation.
Beispiel 3 (Fig. 38-42):
Verwendung von zwei Amplifikationen: einer ersten Amplifikation und nachgeschaltet einer zweiten Amplifikation
In diesem Ausführungsbeispiel wird demonstriert, dass Amplifikations-Produkte der ersten Amplifikation (erste Amplifikation) durch eine nachgeschaltete, klassische PCR (zweite Amplifikation) als Start-Nukleinsäureketten verwendet werden können. Somit wurden insgesamt zwei getrennte Amplifikations-Reaktionen durchgeführt: zunächst eine erste Amplifikation, danach eine zweite Amplifikation.
Erste Amplifikation
Zunächst wurde eine erste Amplifikation durchgeführt unter Verwendung einer einzelsträngigen Nukleinsäurekette (hier als eine einzelsträngige Start-Nukleinsäurekette 1.1 ), welche eine Zielsequenz umfasste, unter Verwendung eines ersten Amplifikations-Systems. Die verwendeten Reaktionsbedingungen (Temperatur von 55°C und 65°C) lassen keine spontane Trennung des während der Reaktion gebildeten Doppelstranges, umfassend das erste Primer-Verlängerungs- Produkt und das zweite Primer-Verlängerungsprodukt, in Abwesenheit eines Controller- Oligonukleotides zu.
Das erste Amplifikations-System umfasste folgende Komponenten:
• Ein erstes Primer-Oligonukleotid,
• ein zweites Primer-Oligonukleotid,
• ein Controller-Oligonukleotid und
• eine Polymerase, (Bst 2.0 Warm Start Polymerase), welche Strangverdrängungseigenschaften hat • sowie notwendige Substrate für Polymerase (dNTP's: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und geeignete Puffer-Systeme (Die Reaktion wurde im Isothermal-Puffer 1 x (NEB) durchgeführt).
Der Fortschritt der Reaktion wurde mittels EvaGreen detektiert bei 65°C.
Bei den eingesetzten Konzentrationsverhältnissen des ersten Primer-Oligonukleotides (5mitioI/I) und des Controller-Oligonukleotides (2mitioI/I) liegt der erste Primer im relativen Überschuß zum Controller-Oligonukleotid. Die Schmelztemperatur des Komplexes umfassend das erste Primer- Oligonukleotid und das Controller-Oligonukleotid betrug ca. 63°C (Tm), gemessen in der gleichen Reaktions-Lösung.
Bei der ersten Amplifikations-Reaktion wurden zwei Temperatur-Bereiche verwendet:
55°C (2 min) und 65°C (2 min). Beim Temperatur-Schritt 55°C lag das Controller-Oligonukleotid vollständig im Komplex mit dem ersten Primer-Oligonukleotid. Dadurch konnte das Controller- Oligonukleotid nicht an das erste Primer-Verlängerungsprodukt binden. Beim zweiten Temperatur- Schritt (65°C) konnte dieser Komplex zumindest teilweise aus dem Komplex dissoziieren, so dass im Ansatz freie, einzelsträngige Controller-Oligonukleotide verfügbar wurden. Ein solches freies Controller-Oligonukleotid kann entweder einen Komplex mit einem neuen ersten Primer- Oligonukleotid ausbilden oder sich an das erste Primer-Verlängerungsprodukt anlagern. Der Kontakt mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt beginnt durch komplementäre Bindung der Sequenzsegmente des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides an die korrespondierenden Sequenzsegmente des zweiten Primer-Bereichs, welche von der Polymerase nicht kopiert werden.
Die einzelnen Synthese-Vorgänge und Strang-Trennungs-Vorgänge umfassen im Wesentlichen folgende Prozesse:
Das erste Primer-Oligonukleotid kann dabei an das 3'-Segment der bereitgestellten Nukleinsäurekette (Start-Nukleinsäurekette 1.1 ) vorwiegend spezifisch binden und von der Polymerase verlängert werden (diese Reaktion verläuft vorwiegend bei 55°C). Die Synthese verläuft dabei bis zum Ende des Matrizenstranges (5'-Bereich der Start-Nukleinsäurekette). Es resultierte ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt. Das Controller-Oligonukleotid kann an dieses erste Primer-Verlängerungsprodukt unter Verdrängung des Matrizenstranges (hier zunächst die Start-Nukleinsäurekette) durch komplementäre Basenpaarung binden (diese Reaktion verläuft vorwiegend bei 65°C). Dabei erfolgte bei 65°C die Trennung des 3'-Segmentes des ersten Primer- Verlängerungsproduktes (welches nicht vom Controller gebunden wurde) aus dem Komplex mit dem Matrizenstrang vorwiegend Temperatur-bedingt.(die Tm dieses 3'-Segmentes lag unter 65°C). Das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes wurde dadurch einzelsträngig. Das erste Primer-Verlängerungsprodukt lag somit im Komplex mit dem Controller-Oligonukleotid vor. Das zweite Primer-Oligonukleotid war nun in der Lage, an dieses 3'-Segment des synthetisierten ersten Primer-Verlängerungsproduktes komplementär zu binden und die Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes durch die Polymerase zu initiieren (dieser Schritt kann dabei sowohl bei 55°C als auch bei 65°C erfolgen). Die Synthese erfolgte unter gleichzeitiger Verdrängung des Controller-Oligonukleotides aus der Bindung an das erste Primer- Verlängerungsprodukt. Die in der ersten Primer-Verlängerungsreaktion verwendete Polymerase (Bst 2.0 Warm Start) hat eine strangverdrängende Eigenschaft. Die Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes erfolgte bis einschließlich des ersten Bereichs des ersten Primers, welcher hierbei von der Polymerase kopiert wurde. Die Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes wurde durch einen C3-Linker im ersten Primer-Verlängerungsproduktes terminiert, so dass der zweite Bereich des ersten Primer-Verlängerungsproduktes nicht von der Polymrease kopiert wurde. Es resultierte das zweite Primer-Verlängerungsprodukt, welches mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt einen Doppelstrang bildete (Tm dieses Doppelstranges = erstes Amplifikations-Produkt betrug ca. 79°C). Beim wiederholten Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 65°C erfolgte eine erneute Bindung des Controller-Oligonukleotides an das erste Primer-Verlängerungsprodukt, so dass nun das zweite Primer-Verlängerungsprodukt aus seiner Bindung an das erste Primer-Verlängerungsprodukt freigesetzt wurde.
Infolge der Freisetzung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes konnte nun dieses Produkt als Matrize dienen: das zweite Primer-Verlängerungsprodukt umfasst in seinem 3'-Segment eine Sequenz, welche komplementär zum ersten Bereich des ersten Primer ist und somit in der Lage ist, ein neues Primer-Oligonukleotid zu binden und die Synthese mittels der Polymerase zu starten.
Im Ergebnis erfolgten wiederholte Synthese- und Strang-Trennungsvorgänge, wobei beide synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte in nachfolgenden Zyklen als Matrizen auftreten konnten.
Das erste Amplifikationsprodukt konnte dabei ausgehend der Start-Nukleinsäurekette (1 .1 ) unter Verwendung von bereitgestellten Primern unter Mitwirkung des bereitgestellten Controller- Oligonukleotides synthetisiert werden, bis die gewünschte Menge von Kopien erreicht wurde (hier die Konzentration des ersten Amplifikations-Produktes 1 .1 war gegen Ende der ersten Amplifikation ca. 0,8 - 1 pmol/l. was ca. 1000.000.000.000 Kopien in 10 pl Reaktionsansatz entspricht). Die Angabe von Kopienanzahl wurde zur Veranschaulichung ausgehend von Konzentration abgeschätzt.
Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 95°C für 10 min gestoppt, wobei die erste Polymerase denaturiert wurde. Es wurde anschließend eine Schmelzkurzven-Analyse zur Bestätigung der spezifischen Amplifikation durchgeführt. Der Reaktions-Ansatz wurde eingefroren und bei Bedarf in der zweiten Amplifikation verwendet.
Zweite Amplifikation (PCR) Nach Abschluss der ersten Amplifikation wurde ein Anteil des ersten Reaktionsansatzes in die zweite Amplifikation gegeben. Dabei diente das während der ersten Amplifikation synthetisierte erste Amplifikations-Fragment (1 .1 ) als zweite Start-Nukleinsäurekette (2.1 ) für die zweite Amplifikation.
Es wurden mehrere Verdünnungs-Stufen des ersten abgeschlossenen Amplifiktions-Ansatzes in die zweite Amplifikations-Reaktion gegeben, welche in einer Verdünnungs-Reihe resultierten.
Es ist anzumerken, dass keine Aufreinigung von gebildeten ersten Amplifikations-Fragmenten (1.1 ) erfolgte, sondern lediglich eine Verdünnung. So dass alle nicht verbrauchten Komponenten des ersten Amplifikations-System - wenn auch in verdünnter Form - auch im zweiten Amplifikations- Schritt Vorlagen.
Die verwendeten PCR-Reaktionsbedingungen (es wurden drei Temperaturbereiche verwendet von 55°C (1 min) und 72°C (3 min) und 95°C (20 sec) ermöglichten die Durchführung einer Standard- PCR (zweite Amplifikation).
Das zweite Amplifikations-System umfasste jeweils folgende Komponenten:
• Ein drittes Primer-Oligonukleotid,
• ein viertes Primer-Oligonukleotid,
• eine Polymerase, (Taq Polymerase), welche eine thermostabile Polymerase ist
• sowie notwendige Substrate für Polymerase (dNTP's: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und geeignete Puffer-Systeme.
Dabei wurden für eine PCR typische Konzentrationen von einzelnen Komponenten verwendet: PCR-Primer in Endkonzentrationen von je 0,5 pmol/l, und die Taq-Polymerase in Konzentation (1.100 Verdünnung, entsprach ca. 1 Unit / Reaktion) und dNTPs (A, G,C,T) in Konzentration von ca. 200 pmol/l. Die Reaktion wurde im Isothermal-Puffer 1 x (NEB) durchgeführt.
Die zweite Amplifikation erfolgte unter Verwendung dieses ersten Amplifikations-Fragmentes als Start-Nukleinsäurekette (2.1 ) und unter Verwendung eines zweiten Amplifikations-Systems. Der Fortschritt der Synthese wurde mittels EvaGreen detektiert bei 72°C. Als Kontroll-Reaktion wurden NTC sowie Start-Nukleinsäurekette 1 .1 verwendet, welche ebenfalls als Matrize im zweiten Amplifikations-System verwendet werden kann.
Die bei der zweiten Amplifikation erforderliche Anzahl von Zyklen, bis zum Anstieg des spezifischen Signals, wurde gemessen und mit Referenz-Werten verglichen. Aus dem Vergleich der für die detektierbare Amplifikation erforderlichen Anzahl von Zyklen wurde auf die erfolgreiche Verwendung des ersten Amplifikations-Fragmentes (1 .1 ) bei der PCR geschlossen.
Im Einzelnen wurde folgendes durchgeführt:
Das erste Amplifikationsprodukt einer Controller-Oligonukleotid-basierten ersten Amplifikationsreaktion wurde verdünnt und als Matrize (Input) unter typischen PCR-Bedingungen amplifiziert. Die Detektion im Rahmen der nachgeschalteten PCR erfolgt in diesem Beispiel mit dem interkalierenden Farbstoff EvaGreen. Durch den Vergleich mit einer Reihe von verschiedenen Kontrollansätzen zeigen die Erfinder, dass nur dann in der nachgeschalteten PCR ein Signal entsteht, wenn die Controller-Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion erfolgreich war. Aus diesem Grund kann die nachgeschaltete, klassische PCR auch als Detektions-PCR bezeichnet werden.
Das Amplifikationsprodukt der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion wurde im Wesentlichen hergestellt wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben.
Es wurden dabei folgende Primer-Oligonukleotide verwendet:
Das erste Primer-Oliqonukleotid: P1 F5-200-AE205
CACTTAC GACA22CAAGA TTTTTT TACCTGTAT [CUCU GAUGCUUC] 1 TACCTGTATTCC (SEQ ID NO 13)
Das als Primer in der Reaktion verwendete Segment ist unterstrichen.
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:
1 = C3-Linker diente zur Terminierung der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes. 2 = 2'-deoxy-lnosine
Das Segment des Primers [CUCU GAUGCUUC] umfasste 2'-0-Me-Modifikationen und diente als zweiter Primer-Bereich zur Bindung des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides:
A = (2'-0-Methyl-Adenosine) G = (2'-0-Methyl-Guanosine); C = (2'-0-Methyl-Cytosine); U = (2'-0-Methyl-Uridine)
Das zweite Primer-Oligonukleotid: P2G3-5270-7063
5' CT AC AG AACT C AG AC AAG AT GT G AACT AC AATGTT 6
G CT CAT ACT AC AATGTC ACTT ACTGT AAG AG C AG A 3' (SEQ ID NO:3)
Das als Primer in der Reaktion verwendete Segment ist unterstrichen.
Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:
6 = HEG-Linker
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Folgendes Controller-Oligonukleotid (SEQ ID NO:4) wurde verwendet:
AD-F5-1001-503 5 ' [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]AGGTAGAAGCATC AGAG x 3
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Das in eckige Klammern gesetzte 5'-Segment des Oligonukleotids [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC] umfasste 2'-0-Me-Nukleotid-Modifikationen:
A = (2'-0-Methyl-Adenosine) G = (2'-0-Methyl-Guanosine); C = (2'-0-Methyl-Cytosine); U = (2'-0-Methyl-Uridine)
X = 3'-Phosphat-Gruppe zur Blockade einer möglichen Verlängerung durch Polymerase.
Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft. Das 3'-Ende des Controller-Oligonukleotides ist mit einer Phosphat-Gruppe blockiert, um eine mögliche Verlängerung durch die Polymerase zu verhindern.
Start-Nukleinsäurekette (1.1 ) mit pefekt-match Übereinstimmung zum Controller.
M2SF5-M001 -200
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA AAAAA 3' (SEQ ID NO 006)
Die Start-Nukleinsäurekette wurde in Konzentration von etwa 1 pM eingesetzt.
Im Ergebnis ist ein Amplifikations-Fragment zu erwarten, welches das zweite Primer- Verlängerungsprodukt mit folgender Sequenz ergibt:
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA 3' (SEQ ID NO 10)
(die nicht kopierbaren Sequenzanteile des zweiten Primers sind hier nicht dargestellt).
Die PCR wurde mit 3 unterschiedlichen Primer-Paaren ausgeführt. Die Primer-Paare erfassen unterschiedliche Sequenzbereiche des Amplifikationsproduktes. Zum besseren Verständnis sind für jedes Primer-Paar auch die Primer-Bindungsstellen auf dem Matrizenstrang (= Amplifikationsprodukt) markiert.
Für die PCR wurden verwendet:
PCR-Primer Paar 1 bestehend aus dem dritten Primer-Oligonukleotid SeqP1 F5 300-35x (SEQ ID NO 8) und dem vierten Primer-Oligonukleotid P2-4401 -601 TMR (SEQ ID NO 9):
Das dritte Primer-Oligonukleotid SeqP1 F5 300-35x
5‘ ACGAAGCTCGCAAGAACTCAGAGTGTGCTCGACACTACCTGTATTCC 3‘ (SEQ ID NO: 8)
Das vierte Primer-Oligonukleotid P2-4401-601
TMR 5’ G CT CAT ACT AC AATGTCACTT AC 3’(SEQ ID NO. 9) Jeweils mit: A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy- Thymidin (Thymidin)
TMR = Tetramethylrhodamine am 5’-Ende des Stranges angehängt (P2-4401-601 TMR)
Diese beiden Primer binden auf folgende Weise am Matrizenstrang (hier als das zweite Primer- Verlängerungsprodukt der ersten Amplifikation dargestellt):
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA
GGAATACAGGTA 3' (SEQ ID NO:010)
Im Kontroll-Ansatz können Primer dieses Primer-Paares auch an der Start-Nukleinsäurekette 1 .1 binden wie folgt:
M2SF5-M001 -200 (SEQ ID NO:006)
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA AAAAA 3'
Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen. Das zweite Primer-Oligonukleotid bindet an das Reverse-Complement der doppelt unterstrichen Sequenz.
PCR-Primer Paar 2 bestehend aus dem dritten Primer-Oligonukleotid P3F5D-600-203 (SEQ ID NO XY) und dem vierten Primer-Oligonukleotid P2-4401 -601 TMR:
Das dritte Primer-Oligonukleotid
P3F5D-600-203
- 5‘ TMR GTACCGAAGC TCGCAGGAAC TCAGAGTGTG GAGAGGACGA AAATGTCCAG GGA 3‘ (SEQ ID NO 1 1 )
Das vierte Primer-Oligonukleotid P2-4401-601 TMR
TMR - 5’ GCT CAT ACT ACAATGTC ACTT AC 3’ (SEQ ID NO 9)
Jeweils mit: A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy- Thymidin (Thymidin)
Modifikationen:
TMR = Tetramethylrhodamine am 5’-Ende des Stranges angehängt (P3F5D-600-203) und des P2- 4401-601 TMR
Diese beiden Primer binden auf folgende Weise am Matrizenstrang (hier als das zweite Primer- Verlängerungsprodukt der ersten Amplifikation dargestellt):
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA
GGAATACAGGTA 3' (SEQ ID NO:010) Im Kontroll-Ansatz können Primer dieses Primer-Paares auch an der Start-Nukleinsäurekette 1 .1 binden wie folgt:
M2SF5-M001 -200
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA AAAAA 3' (SEQ ID N0:006)
Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen. Das zweite Primer-Oligonukleotid bindet an das Reverse-Complement der doppelt unterstrichen Sequenz.
PCR-Primer Paar 3 bestehend aus dem dritten Primer-Oligonukleotid SeqP1 F5-35-X02 und dem vierten Primer-Oligonukleotid P2-4401-601 TMR:
Das dritte Primer-Oligonukleotid SeqP1 F5-35-X02
5‘ AAGCTCGACAAAAGAACTCAGAGTGTGCTCGACACTACCTGTATTCCTTG 3‘ (SEQ ID NO:012)
Das vierte Primer-Oligonukleotid P2-4401-601 TMR
TMR - 5’ GCT CAT ACT ACAATGTC ACTT AC 3’ (SEQ ID NO:009)
Jeweils mit: A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy- Thymidin (Thymidin)
TMR = Tetramethylrhodamine am 5’-Ende des Stranges angehängt (P2-4401-601 TMR)
Diese beiden Primer binden auf folgende Weise am Matrizenstrang (hier als das zweite Primer- Verlängerungsprodukt der ersten Amplifikation dargestellt):
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA 3' (SEQ ID NO:010)
Im Kontroll-Ansatz können Primer dieses Primer-Paares auch an der Start-Nukleinsäurekette 1 .1 binden wie folgt:
M2SF5-M001 -200:
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA AAAAA 3' (SEQ ID NO 6)
Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen. Das zweite Primer-Oligonukleotid bindet an das Reverse-Complement der doppelt unterstrichen Sequenz.
Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander jeweils mit
Phosphodiesterbindungen verknüpft. In der PCR wurde Taq-Polymerase (NEB, Katalog# M0273S) eingesetzt. Dabei wurden pro Reaktion Polymerase-Verdünnungen von 1 :100 eingesetzt.
Das Amplifikationsprodukt aus einer Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion (erste Amplifikation) wurde in die PCR in Verdünnungen von 1 :5.000 bis 1 :500.000.000 eingesetzt.
Zur Kontrolle wurden auch Reaktionsansätze untersucht, die keine Matrize zur Amplifikation enthielten (NTC = no template control = Negativkontrolle).
Darüber hinaus wurde in weiteren Kontrollansätzen überprüft, ob das Controller-Oligonukleotid als Matrize für PCR-Primer dienen kann. Dazu wurde das Controller-Oligonukleotid (SEQ ID NO 4 = hier als„Controller 503“ bezeichnet), das zuvor während der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikation zum Einsatz kam, in Konzentrationen von 1 pmol/l bis 1 pmol/l zur Amplifikation in der PCR angeboten.
In einer weiteren Kontrolle wurde eine definierte Menge der Matrize M2SF5-M001 -200 zur Amplifikation in der PCR angeboten (Positivkontrolle). Diese Kontrolle demonstrierte die Funktionstüchtigkeit der PCR-Primer-Paare (unter idealen Bedingungen). Zusätzlich konnte man eine Probe nach einer ersten Amplifikation durch Vergleich der erhaltenen Ct-Werte mit einer Standard-Verdünnungs-Reihe der Positivkontrolle auch quantifiziert werden. Konkret wurde die Matrize M2SF5-M001-200 in Konzentrationen von 1 nmol/l bis 1 fmol/l ausgetestet.
Das dritte und das vierte Primer-Oligonukleotide wurden in Konzentationen von je 0,5 pmol/l eingesetzt.
Die weiteren Reaktionsbedingungen waren:
1x Isothermal Puffer (New England Biolabs); in einfacher Konzentration enthält der Puffer: 20 mM Tris-HCI; 10 mM (NH4)2S04 ; 50 mM KCl; 2 mM MgS04; 0.1 % Tween® 20;pH 8.8@25°C) ; dNTP (dATP, dCTP, dUTP, dGTP), je 200 pmol/l;
EvaGreen Farbstoff (Farbstoff wurde entsprechend Anleitung des Herstellers in Verdünnung 1 :50 eingesetzt)
Die thermischen Reaktionsbedingungen wurden folgendermaßen gewählt:
• 20 Sekunden 95 °C zur Aktivierung des Systems
• 30 Zyklen mit jeweils folgendem Temperatur-Zeit-Profil
o 1 min 55 °C
o 3 min 72 °C
o 20 Sekunden 95 °C
• 10 min 72 °C zur Vereinheitlichung der Amplifikationsprodukte
• Schmelzkurvenanalyse
Die Amplifikation wurde typischerweise über 30 Zyklen, d.h. 30 x (1 min 55°C + 3 min 72°C + 20 s 95°C) = ca. 30 x 260 s = 130 min verfolgt. Die erfolgreiche Amplifikation konnte durch einen Anstieg des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit festgestellt werden. Analyse der Detektions-PCR
Zur Analyse der Detektions-PCR und zur Bewertung der entstandenen Amplifikationsprodukte wurden folgende Techniken genutzt:
• Fluoreszenzsignal eines interkalierenden Farbstoffes (EvaGreen)
· Schmelzkurvenanalyse von den entstandenen Amplifikationsprodukten
Bei der Analyse der PCR diskutieren wir ausschließlich Daten, die mit einer 1 : 100 Verdünnung an Taq-Polymerase erhalten wurden.
In den Kontroll-Experimenten mit Matrize (M2SF5-M001 -200) konnte überprüft werden, dass alle drei gewählten PCR-Primer-Paare ein spezifisches PCR-Produkt unter verwendeten PCR- Bedinungen generieren konnten. Ebenfalls konnte überprüft werden, dass alle drei Primer-Paare nicht in der Lage waren, ausgehend vom Controller-Oligonukleotid ein Produkt zu bilden. Das war ein zu erwartendes Ergebnis, da alle verwendeten„dritten“ Primer im modifizierten Anteil des Controller-Oligonukleotides binden.
Fig. 38A zeigt einen typischen zeitlichen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals, das bei der Amplifikation von verdünnten Controller-Oligonukleotid Amplifikationsansätzen, durch Primer-Paar 1 erhalten wurde. Auf der Y-Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Pfeile markieren unterschiedliche Amplifikationsansätze. Zu den Pfeilen gehören folgende Ansätze:
Pfeil 6 markiert einen Negativkontrolle-Ansatz, der keine Matrize enthält und daher im Laufe des Experiments auch kein Amplifikationssignal generiert.
In Abhängigkeit von der gewählten Verdünnung des Controller-Oligonukleotid-Amplifikations- ansatzes werden zeitlich verschobene Amplifikationssignale beobachtet. Für PCR-Primer-Paar 1 können unter den gewählten Bedingungen Verdünnungen von 1 :5.000 bis 1 :50.000.000 gut aufgelöst werden. Eine Verdünnung von 1 :50.000.000 erzeugt ein Amplifikationssignal, das sich marginal von der Negativkontrolle abhebt (vgl. Pfeil 5).
Fig. 38 B zeigt die zugehörige Schmelzkurvenanalyse für die Reaktionen 1 bis 5 und macht deutlich, dass spezifische Amplifikationsprodukte entstanden sind (Tm = 82,7°C).
Fig. 38 B zeigt die Schmelzkurven der Amplifikationsprodukte von Primer-Paar 1 aus Fig. 38 A. Auf der Y-Achse ist die Ableitung des Fluoreszenzsignals gegen die Temperatur und auf der X- Achse ist die Temperatur aufgetragen. Es wurde ein einheitlicher Peak gefunden, markiert mit Pfeil 1. Der Peak bei Position 1 mit einem Schmelzpunkt in der Nähe von 82,7 °C gehört zum Amplifikationsprodukt des Primer-Paar 1 . Die Schmelzkurvenanalyse weist auf eine spezifische Amplifikation hin.
Fig. 39 A zeigt einen typischen zeitlichen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals, das bei der Amplifikation von verdünnten Controller-Oligonukleotid Amplifikationsansätzen, durch PCR- Primer-Paar 2 erhalten wurde. Auf der Y-Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen- Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Pfeile markieren unterschiedliche Amplifikationsansätze. Zu den Pfeilen gehören folgende Ansätze:
Pfeil 5 markiert einen Negativkontrolle-Ansatz, der keine Matrize enthält und daher im Laufe des Experiments auch kein Amplifikationssignal generiert.
In Abhängigkeit von der gewählten Verdünnung des Controller-Oligonukleotid Amplifikations ansatzes werden zeitlich verschobene Amplifikationssignale beobachtet. Für PCR-Primer-Paar 2 können unter den gewählten Bedingungen Verdünnungen von 1 :5.000 bis 1 :5.000.000 gut aufgelöst werden. Eine Verdünnung von 1 :5.000.000 erzeugt ein Amplifikationssignal, das sich gerade von der Negativkontrolle abhebt (Pfeil 4).
Fig. 39 B zeigt die zugehörige Schmelzkurvenanalyse für die Reaktionen 1 bis 4 und macht deutlich, dass spezifische Amplifikationsprodukte entstanden sind. Fig. 39 B zeigt die Schmelzkurven der Amplifikationsprodukte von PCR-Primer-Paar 2 aus Fig. 39 A. Auf der Y-Achse ist die Ableitung des Fluoreszenzsignals gegen die Temperatur und auf der X- Achse ist die Temperatur aufgetragen. Es wurde ein einheitlicher Peak gefunden, markiert mit Pfeil 1. Der Peak bei Position 1 mit einem Schmelzpunkt in der Nähe von 81 ,9 °C gehört zum Amplifikationsprodukt des PCR-Primer-Paar 2. Die Schmelzkurvenanalyse weist auf eine spezifische Amplifikation hin.
Fig. 40A zeigt einen typischen zeitlichen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals, das bei der Amplifikation von verdünnten Controller-Oligonukleotid Amplifikationsansätzen durch PCR-Primer- Paar 3 erhalten wurde. Auf der Y-Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Pfeile markieren unterschiedliche Amplifikationsansätze. Zu den Pfeilen gehören folgende Ansätze:
Position Verdünnung des Controller-Oligonukleotid Amplifikationsansatzes im Detektions- PCR-Ansatz
Pfeil 1 ca. 1 :5.000 Pfeil 2 ca. 1 :50.000 Pfeil 3 ca. 1 :500.000 Pfeil 4 ca. 1 :5.000.000 Pfeil 5 ca. 1 :50.000.000 Pfeil 6 ca. 1 :500.000.000 Pfeil 7 0 mol/l = Negativkontrolle
Pfeil 7 markiert einen Negativkontrolle-Ansatz, der keine Matrize enthält und daher im Laufe des Experiments auch kein Amplifikationssignal generiert.
In Abhängigkeit von der gewählten Verdünnung des Controller-Oligonukleotid Amplifikationsansatzes werden zeitlich verschobene Amplifikationssignale beobachtet. Für Primer- Paar 3 können unter den gewählten Bedingungen Verdünnungen von 1 :5.000 bis 1 :500.000.000 gut aufgelöst werden. Eine Verdünnung von 1 :500.000.000 erzeugt ein Amplifikationssignal, das sich gerade von der Negativkontrolle abhebt (vgl. Pfeil 6 und 7).
Fig. 40 B zeigt die zugehörige Schmelzkurvenanalyse für die Reaktionen 1 bis 6 und macht deutlich, dass spezifische Amplifikationsprodukte entstanden sind.
Fig. 40B zeigt die Schmelzkurven der Amplifikationsprodukte von PCR-Primer-Paar 3 aus Fig. 40 A. Auf der Y-Achse ist die Ableitung des Fluoreszenzsignals gegen die Temperatur und auf der X- Achse ist die Temperatur aufgetragen. Es wurde ein einheitlicher Peak gefunden, markiert mit Pfeil 1. Der Peak bei Position 1 mit einem Schmelzpunkt in der Nähe von 81 ,2 °C gehört zum Amplifikationsprodukt des PCR-Primer-Paar 3. Die Schmelzkurvenanalyse weist auf eine spezifische Amplifikation hin.
Durch Analyse der Fluoreszenzsignale im zeitlichen Verlauf der Amplifikation (Amplification Plots) und durch die Schmelzkurvenanalyse am Ende der Amplifikation wurde nachgewiesen, dass die PCR-Primer-Paare 1 bis 3 jeweils in der Lage waren, verdünnte Amplifikationsprodukte, die aus der ersten Amplifikationsreaktion hervorgegangen waren, als Matrize zu nutzen.
In Abhängigkeit von der gewählten Verdünnung entstehen zeitlich verzögerte Amplifikationssignale, welche für eine Verdünnngsreihe typisch sind. Durch die hier gewählten PCR Bedingungen können 5.000.000-fach verdünnte Amplifikationsprodukte nachgewiesen werden. Das Primer Paar 3 weist die höchste Empfindlichkeit auf und kann sogar noch Amplifikationsprodukte bei 500.000.000-facher Verdünnung detektieren.
Fig. 41 zeigt als Kontroll-Experimente mit Matrize (M2SF5-M001-200), welche in 1 nmol/l (Pfeil 1 ) und 10 pmol/l (Pfeil 2) eingesetzt wurde, sowie NTC-Kontrollen (Pfeil 3).
Fig. 41 A stellt Ergebnisse für PCR-Primer Paar 1 dar.
Fig. 41 B stellt Ergebnisse für PCR-Primer Paar 2 dar.
Fig. 41 C stellt Ergebnisse für PCR-Primer Paar 3 dar.
Aus dem Vergleich der Zeit des Anstieges des Fluoreszenzsignals zwischen Kontroll- Experimenten (Matrize) und der durchgeführten zweiten Amplifikation ausgehend von ersten Amplifikations-Fragmenten ist ersichtlich, dass die erste Amplifiaktion eine Vermehrung von Amplifikations-Fragmenten bewirkte, welche in der zweiten Amplifikation als Matrize verwendet werden konnten.
Fig. 42 zeigt Verlauf der ersten Amplifikation (vor PCR).
Man erkennt einen Signal-Anstieg, welcher als Anreicherung der Kopie-Anzahl in der ersten Amplifikation gedeutet wurde. Pfeil 1 entsprach einem Ansatz mit einer Start-Nukleinsäurekette 1.1. Pfeil 2 = NTC Kontrolle.
Beispiel 4 (Fig. 43 - 47):
Kombination von der ersten Amplifikation und der zweiten Amplifikation im gleichen Ansatz (homogener Assay)
In diesem Ausführungsbeispiel demonstrieren die Erfinder, wie die Controller-Oligonukleotid- basierte Amplifikationsreaktion mit einer nachgeschalteten, klassischen PCR in einem homogenen Assay-Format kombiniert werden kann. Hierbei nutzen die Erfinder die hochselektive Controller- Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion in der frühen Amplifikationsphase und schalten danach zur Amplifikation und Detektion der Amplifikationsprodukte auf eine klassische PCR um. Im Gegensatz zu Ausführungsbeispiel 3 (= heterogenes Assay-Format) erfolgt die Kombination in diesem Ausführungsbeispiel in einem homogenen Assay-Format. Alle Assay-Komponenten liegen bereits beim Reaktionsstart vor, das Umschalten zwischen Controller-Oligonukleotid-basierter Amplifikation und klassischer PCR erfolgt durch eine Änderung der Temperaturführung im Laufe der Reaktion.
Zuerst wurde das erste Amplifikations-Produkt 1 .1 ausgehend von einer einzelsträngigen Start- Nukleinsäurkette (1.1 ) mittels Controller-Oligonukleotid-basierter Amplifikationsreaktion für 15 bis 30 Zyklen amplifiziert, danach erfolgten 30 klassische PCR-Zyklen, um das voramplifizierte Produkt weiter zu amplifizieren und zu detektieren. Zur Detektion wird in diesem Beispiel der interkalierende Farbstoff EvaGreen verwendet.
Das erste Amplifikations-System umfasst folgende Komponenten:
• Ein erstes Primer-Oligonukleotid,
• ein zweites Primer-Oligonukleotid,
• ein Controller-Oligonukleotid und
• eine Polymerase, (Bst 2.0 Warm Start Polymerase), welche Strangverdrängungseigenschaften hat
• sowie notwendige Substrate für die Polymerase (dNTP's: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und geeignete Puffer-Systeme (Die Reaktion wurde im Isothermal-Puffer 1 x (NEB) durchgeführt).
Das zweite Amplifikations-System umfasste jeweils folgende Komponenten:
• Ein drittes Primer-Oligonukleotid,
• ein viertes Primer-Oligonukleotid
• eine Polymerase, (Taq Polymerase), welche eine thermostabile Polymerase ist
• sowie notwendige Substrate für die Polymerase (dNTP's: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und geeignete Puffer-Systeme.
Beide Amplifikations-Systeme lagen vor Beginn der ersten Amplifikation zusammen vor.
In diesem Beispiel wurde das zweite Primer-Oligonukleotid für beide Amplifikationen verwendet. Das vierte Primer-Oligonukleotid ist somit identisch mit dem zweiten Primer-Oligonukleotid.
Das dritte Primer-Oligonukleotid wurde variiert.
In diesem Beispiel präsentieren die Erfinder 4 unterschiedliche Primer, welche jeweils einzeln pro Ansatz als„das dritte Primer-Oligonukleotid“ verwendet wurden.
Das jeweilige dritte Primer-Oligonukleotid unterscheidet sich vom ersten Primer-Oligonukleotid. Somit umfasst jeder Reaktions-Ansatz drei Primer: ein erstes Primer-Oligonukleotid und ein zweites Primer-Oligonukleotid (als Komponenten des ersten Amplifikations-Systems) und das dritte-Primer-Oligonukleotid, welches als spezifischer Primer des zweiten Amplifikations-Systems verwendet wurde. Die Rolle des vierten Primers übernahm der zweite Primer des ersten Amplifikations-Systems, welcher für die nachgeschaltete PCR-Reaktion ebenfalls geeignet war. Zum besseren Verständnis sind für jede Primer-Kombination die Primer-Bindungsstellen auf dem Matrizenstrang (= Amplifikationsprodukt) markiert.
Folgende Start-Nukleinsäurekette (1.1 ) wurde als einzelsträngige Matrize verwendet:
Matrize (SEQ ID NO 6) mit Sequenzzusammensetzung, welche zu einem ersten
Primer-Verlängerungsprodukt mit einer Perfekt-Match-Übereinstimmung mit dem Controller- Oligonukleotid führt:
M2SF5-M001 -200:
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGA TCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA AAAAA 3' (SEQ ID NO 6)
Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen. Das zweite Primer-Oligonukleotid bindet an das Reverse-Complement der doppelt unterstrichen Sequenz. Die Bindungssequenz für das dritte Primer-Oligonukleotid (P3F5D-600-203) ist in fettkursiv markiert dargestellt.
Das erste Amplifikations-System:
Das erste Primer-Oligonukleotid: P1 F5-200-AE205
CACTTAC GACA22CAAGA TTTTTT TACCTGTAT [CUCU GAUGCUUC] 1 TACCTGTATTCC (SEQ ID NO 13)
Das als Primer in der Reaktion verwendete Segment ist unterstrichen.
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:
1 = C3-Linker diente zur Terminierung der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes. 2 = 2'-deoxy-lnosine
Ein Segment des Primers [CUCU GAUGCUUC] umfasste 2'-0-Me-Modifikationen und diente als zweiter Primer-Bereich zur Bindung des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides:
A = (2'-0-Methyl-Adenosine) G = (2'-0-Methyl-Guanosine); C = (2'-0-Methyl-Cytosine); U = (2'-0-Methyl-Uridine)
Das zweite Primer-Oligonukleotid: P2G3-5270-7063
5' CT AC AG AACT C AG AC AAG AT GT G AACT AC AATGTT 6
GCT CAT ACT AC AATGTC ACTT ACTGT AAG AG C AG A 3' (SEQ ID NO:3) Das als Primer in der Reaktion verwendete Segment ist unterstrichen.
Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:
6 = HEG-Linker
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Folgendes Controller-Oligonukleotid wurde verwendet:
AD-F5-1001-503
5'[UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUACjAGGTAGAAGCATC AGAG X 3' (SEQ ID NO:4)
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Das in eckige Klammern gesetzte 5'-Segment des Oligonukleotids [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC] umfasste 2'-0-Me-Nukleotid-Modifikationen:
Modifikationen:
A = (2'-0-Methyl-Adenosine) G = (2'-0-Methyl-Guanosine); C = (2'-0-Methyl-Cytosine); U = (2'-0-Methyl-Uridine)
X = 3'-Phosphat-Gruppe zur Blockade einer möglichen Verlängerung durch die Polymerase.
Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft. Das 3'-Ende des Controller-Oligonukleotides ist mit einer Phosphat-Gruppe blockiert, um eine mögliche Verlängerung durch die Polymerase zu verhindern.
Das zweite Amplifikations-System umfasste spezifisch jeweils ein drittes Primer-Oligonukleotid (P3-Primer) aus der folgenden Liste:
• Das dritte Primer-Oligonukleotid: P3F5D-600-201
TMR 5' GTACCGAAGC TCGCAGGAAC TCAGAGTGTG GAGAGGACGA AAA CTGTCCAGGGATC 3' (SEQ ID NO 14)
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen:
TMR (= Tetramethylrhodamin) in der 5‘ Position
• Das dritte Primer-Oligonukleotid: P3F5D-600-202
TMR 5 'GTACCGAAGC TCGCAGGAAC TCAGAGTGTG GAGAGGACGAAAA CCAGGGAT 3' (SEQ ID NO 15) A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen:
TMR (= Tetramethylrhodamin) in der 5‘ Position
• Das dritte Primer-Oligonukleotid P3F5D-600-203
TMR 5' GTACCGAAGCTCGCAGGAACTCAGAGTGTGGAGAGGACGAAAA TGTCCAGGGA 3' (SEQ ID NO 1 1 ):
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen:
TMR (= Tetramethylrhodamin) in der 5‘ Position
• Das dritte Primer-Oligonukleotid: P3F5D-600-204
TMR 5' GT ACCG AAGCTCGCAGG AACT CAG AGTGTGG AG AGG ACG AAAA CTGTCCAG 3' (SEQ ID NO 16)
A = 2'-deoxy-Adenosin
A = 2'-deoxy-AdenosinC = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen:
TMR (= Tetramethylrhodamin) in der 5‘ Position
Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft. Das 3'-Ende ist mit einer Phosphat-Gruppe blockiert, um eine mögliche Verlängerung durch die Polymerase zu verhindern.
Die Start-Nukleinsäurekette 1.1 (Matrize) wurde in Konzentrationen von 1 pmol/l eingesetzt. Primer 1 wurde mit 5 pmol/l, das Controller-Oligonukleotid mit 2 pmol/l, Primer 2 mit 1 pmol/l und Primer 3 mit 0,5 pmol/l eingesetzt. Zur Amplifikation befanden sich 2 Polymerasen im Ansatz Taq- Polymerase (NEB, Katalog# M0273S?) in einer Verdünnung 1-zu-100 und Bst 2.0 Warm Start Polymerase (NEB, Katalog# M0538S?) in einer Verdünnung 1-zu-200.
In einer Kontroll-Reaktion wurde kein P3-Primer eingesetzt. In weiteren Kontroll-Reaktionen wurde nur BST-Polymerase, aber keine Taq-Polymerase eingesetzt.
Die weiteren Reaktionsbedingungen waren:
1x Isothermal Puffer (New England Biolabs); in einfacher Konzentration enthält der Puffer: 20 mM Tris-HCI; 10 mM (NH4)2S04 ; 50 mM KCl; 2 mM MgS04; 0.1 % Tween® 20;pH 8.8@25°C) ; dNTP (dATP, dCTP, dUTP, dGTP), je 200 pmol/l; EvaGreen Farbstoff (Farbstoff wurde entsprechend Anleitung des Herstellers in Verdünnung 1 :50 eingesetzt)
Die thermischen Reaktionsbedingungen wurden nach folgendem Profil gewählt:
• 2 min 65 °C zur Aktivierung des Systems
• 15 bzw. 30 Zyklen mit folgendem Temperatur-Zeit-Profil (Controller-Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion)
o 2 min 55 °C
o 2 min 65 °C
• 20 Sekunden 95 °C zur Aktivierung des Systems
• 30 Zyklen mit folgendem Temperatur-Zeit-Profil
(Detektions-PCR)
o 1 min 55 °C
o 3 min 72 °C
o 20 Sekunden 95 °C
• 10 min 72 °C zur Vereinheitlichung der Amplifikationsprodukte
• Schmelzkurvenanalyse
Die Gesamt-Amplifikation wurde typischerweise über 45-60 Zyklen, d.h.:
Erste Amplifikation: (15 bzw. 30) x (2 min 55°C + 2 min 65°C) = (15 bis 30) x 4 min = 60 bis 120 min
Zweite Amplifikation (PCR) 30 x (1 min 55°C + 3 min 72°C + 20 s 95°C) = 30 x 260 s = 130 min verfolgt. Dies entspricht einer Gesamtzeit von 190 bis 250 min.
Die erfolgreiche Amplifikation konnte durch einen Anstieg des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit festgestellt werden.
Analyse der Kombination aus Controller-Oligonukleotid-basierter Amplifikationsreaktion und Detektions-PCR.
Zur Analyse und zur Bewertung der entstandenen Amplifikationsprodukte wurden folgende Techniken genutzt:
• Fluoreszenzsignal eines interkalierenden Farbstoffes (EvaGreen)
• Schmelzkurvenanalyse von den entstandenen Amplifikationsprodukten
Die erste Teil-Amplifikation (mit 15 Zyklen oder mit 30 Zyklen) führt zu einer Anreicherung der Nukleinsäureketten (das erste Amplifikations-Fragment 1 .1 ), welche als Matrizen in der nachgeschalteten PCR verwendet werden können. Dadurch braucht die PCR weniger Zyklen, um detektierbare Mengen an PCR-Produkt zu generieren. Durch die Wahl der Anzahl an Zyklen in den beiden Amplifikationsphasen kann der Verstärkungsanteil an der Gesamtverstärkung für die beiden Amplifikationsreaktionen eingestellt werden. Durch den Vergleich mit einer Reihe von verschiedenen Kontrollansätzen zeigen die Erfinder, dass durch die Verwendung einer ersten Amplifikation, die Zyklus-Zahl der zweiten Amplifikation (PCR) reduziert werden konnte, bis ein detektierbares Signal entstand (Ct). Diese Minderung der Zyklus- Anzahl der PCR erfolgte nur dann, wenn die erste Amplifikation (Controller-Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion) erfolgreich war. Die zweite Amplifikation erfolgte dann ausgehend von ersten Amplifikationsprodukten bis zu Detektion. Aus diesem Grund kann die nachgeschaltete, klassische PCR auch als Detektions-PCR bezeichnet werden.
Weiterhin zeigen die Erfinder, dass eine Kombination des ersten und des zweiten Amplifikations- Systems in einem Ansatz möglich ist, so dass ein homogenes Assay Format durchgeführt werden konnte.
Nachfolgend erfolgt die Darstellung von Ergebnissen von einzelnen Reaktions-Ansätzen.
Fig. 43A zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der kombinierten Amplifikation von Matrize M2SF5-M001 -200 mit Primer P3F5D-600-201 . Auf der Y- Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. In den Zyklen 1 bis 15 kommt die Controller- Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion zum Einsatz. Ab Zyklus 15 bis Zyklus 45 kommt die klassische PCR (Detektions-PCR) zum Einsatz. Der Umschaltzeitpunkt (Ende Zyklus 15) ist mit Pfeil 1 markiert.
Pfeil 2 markiert einen Amplifikationsansatz, in dem die Matrize M2SF5-M001 -200 ausgehend von 1 pmol/l Startkonzentration durch BST- und Taq-Polymerase amplifiziert wird.
Pfeil 3 markiert einen Kontrollansatz, der nur BST-Polymerase enthält. Eine Amplifikation unterbleibt, da die hitzeempfindliche BST-Polymerase ab Zyklus 16 durch das Temperatur-Profil in der Detektions-PCR denaturiert wird. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Pfeil 4 markiert einen weiteren Kontrollansatz, bei dem auf die Zugabe des Primers P3F5D-600- 201 verzichtet wurde. Ein Amplifikationssignal wird nun nicht mehr beobachtet, da ohne den dritten Primer keine exponentielle Amplifikation in der Detektions-PCR möglich ist. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Fig. 43 B zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der kombinierten Amplifikation von Matrize M2SF5-M001 -200 mit Primer P3F5D-600-202. Auf der Y- Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. In den Zyklen 1 bis 15 kommt die Controller- Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion zum Einsatz. Ab Zyklus 15 bis Zyklus 45 kommt die klassische PCR (Detektions-PCR) zum Einsatz. Der Umschaltzeitpunkt (Ende Zyklus 15) ist mit Pfeil 1 markiert. Pfeil 2 markiert einen Amplifikationsansatz, in dem die Matrize M2SF5-M001 -200 ausgehend von 1 pmol/l Startkonzentration durch BST- und Taq-Polymerase amplifiziert wird.
Pfeil 3 markiert einen Kontrollansatz, der nur BST-Polymerase enthält. Eine Amplifikation unterbleibt, da die hitzeempfindliche BST-Polymerase ab Zyklus 16 durch das Temperatur-Profil in der Detektions-PCR denaturiert wird. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Pfeil 4 markiert einen weiteren Kontrollansatz, bei dem auf die Zugabe des Primers P3F5D-600-
202 verzichtet wurde. Ein Amplifikationssignal wird nun nicht mehr beobachtet, da ohne den dritten Primer keine exponentielle Amplifikation in der Detektions-PCR möglich ist. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Fig. 44A zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der kombinierten Amplifikation von Matrize M2SF5-M001 -200 mit Primer P3F5D-600-203. Auf der Y- Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. In den Zyklen 1 bis 15 kommt die Controller- Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion zum Einsatz. Ab Zyklus 15 bis Zyklus 45 kommt die klassische PCR (Detektions-PCR) zum Einsatz. Der Umschaltzeitpunkt (Ende Zyklus 15) ist mit Pfeil 1 markiert.
Pfeil 2 markiert einen Amplifikationsansatz, in dem die Matrize M2SF5-M001 -200 ausgehend von 1 pmol/l Startkonzentration durch BST- und Taq-Polymerase amplifiziert wird.
Pfeil 3 markiert einen Kontrollansatz, der nur BST-Polymerase enthält. Eine Amplifikation unterbleibt, da die hitzeempfindliche BST-Polymerase ab Zyklus 16 durch das Temperatur-Profil in der Detektions-PCR denaturiert wird. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Pfeil 4 markiert einen weiteren Kontrollansatz, bei dem auf die Zugabe des Primers P3F5D-600-
203 verzichtet wurde. Ein Amplifikationssignal wird nun nicht mehr beobachtet, da ohne den dritten Primer keine exponentielle Amplifikation in der Detektions-PCR möglich ist. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Fig. 44B zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der kombinierten Amplifikation von Matrize M2SF5-M001 -200 mit Primer P3F5D-600-204. Auf der Y- Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. In den Zyklen 1 bis 15 kommt die Controller- Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion zum Einsatz. Ab Zyklus 15 bis Zyklus 45 kommt die klassische PCR (Detektions-PCR) zum Einsatz. Der Umschaltzeitpunkt (Ende Zyklus 15) ist mit Pfeil 1 markiert.
Pfeil 2 markiert einen Amplifikationsansatz, in dem die Matrize M2SF5-M001 -200 ausgehend von 1 pmol/l Startkonzentration durch BST- und Taq-Polymerase amplifiziert wird.
Pfeil 3 markiert einen Kontrollansatz, der nur BST-Polymerase enthält. Eine Amplifikation unterbleibt, da die hitzeempfindliche BST-Polymerase ab Zyklus 16 durch das Temperatur-Profil in der Detektions-PCR denaturiert wird. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Pfeil 4 markiert einen weiteren Kontrollansatz, bei dem auf die Zugabe des Primers P3F5D-600- 204 verzichtet wurde. Ein Amplifikationssignal wird nun nicht mehr beobachtet, da ohne den dritten Primer keine exponentielle Amplifikation in der Detektions-PCR möglich ist. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Es zeigt sich, dass eine Kombination von Controller-Oligonukleotid-basierter Amplifikationsreaktion und (klassischer) Detektions-PCR mitjeder der 4 Primer-3-Varianten (P3F5D-600-201 bis P3F5D- 600-204) im homogenen Assay-Format gelingt. Dabei ist der kombinierte Einsatz von BST- und Taq-Polymerase wichtig. Ebenso wichtig ist der dritte Primer, ohne den keine Amplifikationssignale zu detektieren waren. Die Primer-3-Varianten verhalten sich durchaus individuell, was an den unterschiedlichen Zeitpunkten zu erkennen ist, zu denen sich das Amplifikationssignal von der Basislinie abzuheben beginnt. Je früher ein Amplifikationssignal in der Detektions-PCR zu erkennen ist, um so effizienter ist die jeweilige Primer-3-Variante in der Detektion von zuvor entstandenen Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsprodukten.
Nun zeigen wir, dass eine Verdopplung der Zyklusanzahl der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion in der frühen Amplifikationsphase zu qualitativ sehr ähnlichen Ergebnissen führt.
Fig. 45 A zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der kombinierten Amplifikation von Matrize M2SF5-M001 -200 mit Primer P3F5D-600-201 . Auf der Y- Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. In den Zyklen 1 bis 30 kommt die Controller- Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion zum Einsatz. Ab Zyklus 31 bis Zyklus 60 kommt die klassische PCR (Detektions-PCR) zum Einsatz. Der Umschaltzeitpunkt (Ende Zyklus 30) ist mit Pfeil 1 markiert.
Pfeil 2 markiert einen Amplifikationsansatz, in dem die Matrize M2SF5-M001 -200 ausgehend von 1 pmol/l Startkonzentration durch BST- und Taq-Polymerase amplifiziert wird.
Pfeil 3 markiert einen Kontrollansatz, der nur BST-Polymerase enthält. Eine Amplifikation unterbleibt, da die hitzeempfindliche BST-Polymerase ab Zyklus 16 durch das Temperatur-Profil in der Detektions-PCR denaturiert wird. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Pfeil 4 markiert einen weiteren Kontrollansatz, bei dem auf die Zugabe des Primers P3F5D-600- 201 verzichtet wurde. Ein Amplifikationssignal wird nun nicht mehr beobachtet, da ohne den dritten Primer keine exponentielle Amplifikation in der Detektions-PCR möglich ist. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Fig. 45 B zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der kombinierten Amplifikation von Matrize M2SF5-M001 -200 mit Primer P3F5D-600-203. Auf der Y- Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. In den Zyklen 1 bis 30 kommt die Controller- Oligonukleotid-basierte Amplifikationsreaktion zum Einsatz. Ab Zyklus 31 bis Zyklus 60 kommt die klassische PCR (Detektions-PCR) zum Einsatz. Der Umschaltzeitpunkt (Ende Zyklus 30) ist mit Pfeil 1 markiert.
Pfeil 2 markiert einen Amplifikationsansatz, in dem die Matrize M2SF5-M001 -200 ausgehend von 1 pmol/l Startkonzentration durch BST- und Taq-Polymerase amplifiziert wird.
Pfeil 3 markiert einen Kontrollansatz, der nur BST-Polymerase enthält. Eine Amplifikation unterbleibt, da die hitzeempfindliche BST-Polymerase ab Zyklus 16 durch das Temperatur-Profil in der Detektions-PCR denaturiert wird. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Pfeil 4 markiert einen weiteren Kontrollansatz, bei dem auf die Zugabe des Primers P3F5D-600- 203 verzichtet wurde. Ein Amplifikationssignal wird nun nicht mehr beobachtet, da ohne den dritten Primer keine exponentielle Amplifikation in der Detektions-PCR möglich ist. Bereits entstandene Amplifikationsprodukte aus der Controller-Oligonukleotid-basierten Amplifikationsreaktion bleiben unter der Detektionsschwelle von EG verborgen.
Fig. 46 zeigt einen Vergleich von Zeitintervalen zwischen einer Kombinierten Amplifikation (umfassend die erste und die zweite Amplifikation) vs. PCR alleine (nur die zweite Amplifikation).
Die erste Amplifikation wurde wie oben dargestellt ausgeführt. In der zweiten Reaktion war als drittes Primer-Oligonukleotid (P3F5D-600-203) verwendet. Die Ansätze wurden wie oben beschrieben pipettiert und Reaktionen durchgeführt. Wie oben dargestellt wurde bei einem Kombinierten Ansatz zunächst eine Controller-Abhängige Amplifikation durchgeführt (hier 15 Zyklen) anschließend wurde auf PCR umgeschaltet (Pfeil 1 ). Verglichen wurden die Zeitintervale 1 und 2. Pfeil 2 zeigt den Verlauf der Kombinierten Amplifikation (Bst und Taq Polymerase waren beide im Ansatz). Im Ansatz befand sich 1 pmol/l Start-Nukleinsäurekette (Matrize) vor dem Beginn der ersten Amplifikation. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals erfolgt nach einem Zeitinterval 1 .
Pfeil 3 zeigt den Verlauf eines Kontroll-Ansatzes, bei welchem die Bst weggelassen wurde, so dass die erste Amplifikations-Reaktion„still-gelegt wurde“ (zwar befanden sich alle Komponenten des ersten Amplifikations-Systems im Ansatz, dennoch fehlte es an der richtigen Polymerase, in diesem Fall Bst 2.0 Polymerase). Im Ansatz befand sich 1 pmol/l Start-Nukleinsäurekette (Matrize) vor dem Beginn der ersten Amplifikation. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals erfolgt nach einem Zeitinterval 2. Die Taq Polymerase kann zwar ausgehend von dem gleichen Template auch ein Produkt sythetisieren, die PCR alleine braucht aber mehr Zyklen dafür.
Pfeil 4 zeigt den Verlauf von Kombiniertem Ansatz ohne Start-Nukleinsäurekette 1 .1 (ohne Matrize =NTC-Kontrolle).
Insgesamt sieht man, dass durch die Vermehrung von Amplifikations-Fragmenten 1 .1 während der ersten Amplifikation, welche anschließend in der PCR als Start-Nukleinsäurekette 2.1 (Matrize) dienen könnte, erfolgt die Erzeugung von PCR-Fragmenten der Reaktion im Ansatz 2 insgesamt schneller: die PCR braucht weniger Zyklen, bis eine detektierbare Menge des zweiten Amplifikationsproduktes (2.1 ) hergestellt wurde. Zeitinterval 1 ist kürzer als Zeitinterval 2.
Fig. 47 zeigt einen Vergleich von Zeitintervalen zwischen einer Kombinierten Amplifikation (umfassend die erste und die zweite Amplifikation) vs. PCR alleine (nur die zweite Amplifikation).
Die erste Amplifikation wurde wie oben dargestellt ausgeführt. In der zweiten Reaktion wurde als drittes Primer-Oligonukleotid (P3F5D-600-203) verwendet. Die Ansätze wurden wie oben beschrieben pipettiert und Reaktionen durchgeführt. Wie oben dargestellt wurde bei einem Kombinierten Ansatz zunächst eine Controller-abhängige Amplifikation durchgeführt (hier 30 Zyklen) anschließend wurde auf PCR umgeschaltet (Pfeil 1 ). Verglichen wurden die Zeitintervale 3 und 4.
Pfeil 2 zeigt den Verlauf der Kombinierten Amplifikation (Bst und Taq Polymerase waren beide im Ansatz). Im Ansatz befand sich 1 pmol/l Start-Nukleinsäurekette (Matrize) vor dem Beginn der ersten Amplifikation. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals erfolgt nach einem Zeitinterval 3.
Pfeil 3 zeigt den Verlauf eines Kontroll-Ansatzes, bei welchem die Bst weggelassen wurde, so dass die erste Amplifikations-Reaktion„still-gelegt wurde“ (zwar befanden sich alle Komponenten des ersten Amplifikations-Systems im Ansatz, dennoch fehlte es an der richtigen Polymerase, in diesem Fall Bst 2.0 Polymerase). Im Ansatz befand sich 1 pmol/l Start-Nukleinsäurekette (Matrize) vor dem Beginn der ersten Amplifikation. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals erfolgt nach einem Zeitinterval 4. Die Taq Polymerase kann zwar ausgehend vom gleichen Template auch ein Produkt synthetisieren, die PCR alleine braucht aber mehr Zyklen dafür. Pfeil 4 zeigt den Verlauf von Kombiniertem Ansatz ohne Start-Nukleinsäurekette 1 .1 (ohne Matrize =NTC-Kontrolle).
Insgesamt sieht man, dass durch die Vermehrung von Amplifikations-Fragmenten 1 .1 während der ersten Amplifikation, welche anschließend in der PCR als Start-Nukleinsäurekette 2.1 (Matrize) dienen könnte, erfolgt die Erzeugung von PCR-Fragmenten die Reaktion im Ansatz 2 insgesamt schneller: die PCR braucht weniger Zyklen, bis eine detektierbare Menge des zweiten Amplifikationsproduktes (2.1 ) hergestellt wurde. Zeit-Interval 3 ist kürzer als Zeitinterval 4.
Beispiel 5 (Fig. 48 - 49, 71): Amplifikation von humaner FVL Zielsequenz mit Mutation in Anwesenheit humaner genomischer DNA mit Wildtyp-Sequenz Variante
Das Beispiel zeigt die selektive Amplifikation einer Zielsequenz umfassend einen polymorphen Lokus, welcher zwei Sequenzvarianten (Mutation oder Wildtyp) umfasst (SNP Varianten von Coagulation Faktor V Leiden Gen, FVL-Gen).
Die Komponenten des ersten Amplifikations-Systems (erster Primer, zweiter Primer, Controller, Polymerase) und Reaktionsbedingungen wurden so gewählt, dass die zu amplifizierende Nukleinsäure (Amplifikations-Fragment 1 .1 umfassend beide Primer-Verlängerungsprodukte, P1.1 -Ext du P2.1 -Ext) bevorzugt die Sequenzvariante mit Mutation im FVL-Gen umfasste. Die Wildtyp-Sequenzvariante (WT-Sequenz) sollte während der ersten Amplifiaktion nicht signifikant amplifiziert werden. Die erste Amplifikation startete ausgehend von der Start-Nukleinsäure 1.1 , welche als Primer-Verlängerungsprodukt unter Verwendung von einzelsträngiger humaner gDNA (Matrize umfassend eine Zielsequenz) erhalten wurde. Die Amplifikation wurde solange durchgeführt, bis das gewünschte Maß an Amplifikations-Fragmenten erreicht wurde. Die in der ersten Amplifikation erzeugten Produkte (Amplifikations-Fragment 1 .1 ) konnten als Matrizen (Start- Nukleinsäure 2.1 ) für die zweite Amplifikation (PCR) dienen.
Die Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems (dritter Primer, vierter Primer, Polymerase) und Reaktionsbedingungen (PCR-Amplifikation) wurden so gewählt, dass beide Varianten der Zielsequenz amplifiziert werden konnten. Die zweite Amplifikation (PCR) erfolgte im Anschluss an die erste Amplifikation in einem separaten Schritt.
Eine schematische Topographie des ersten Amplifikations-Systems und des zweiten Amplifikations-Systems ist in Fig. 71 abgebildet. Primer des zweiten Amplifikations-Systems waren im„Nested-Format“ in Bezug auf Primer des ersten Amplifikations-Systems.
Die erhalten Produkte der ersten Amplifikation (Amplifikations-Fragment 1.1 ) bzw. der zweiten Amplifikation (Amplifikations-Fragment 2.1 ) wurden mittels verschiedener Methoden detektiert und analysiert. Eine Detektions-Methode umfasste Real-Time-Detektion mittels interkalierender Farbstoffe (Eva-Green Fabrstoff), eine andere Detektions-Methode umfasste Real-Time-Detektion mittels sequenzspezifischer Oligonukleotid-Sonden (Taqman-Sonden) (diese Sonden ermöglichen eine Diskriminierung nach Sequenzvariante: Mutation vs. Wildtyp-Variante), eine weitere Analyse- Methode umfasste Sanger-Sequenzierung von in der Amplifikation erhaltenen Amplifikations- Fragmenten.
Eine Demonstration einer sequenzspezifischen Amplifikation wurde auf mehreren Wegen erreicht. Zum einen konnte die Amplifikation einer Zielsequenz umfassend eine Mutation-Variante erreicht werden (entweder alleine durch die erste Amplifikation oder durch Kombination der ersten und der zweiten Amplifikation). Zum anderen konnte die Amplifikation einer Zielsequenz umfassend eine Mutation-Variante (100 oder 10 Kopien) in Anwesenheit von ca. 30.000 Kopien humaner gDNA mit Wildtyp Variante erreicht werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass keine messbare Amplifikation der Zielsequenz mit Wildtyp-Variante (5000 Kopien) unter gewählten Bedingungen erfolgte.
Material und Methoden:
Zielsequenz:
Als Zielsequenz mit einem polymorphen Lokus wurden folgende Varianten gewählt:
FVL-Sequenz-Variante mit Mutation:
5' - tgggctaata ggactacttc taatctgtaa gagcagatcc ctggacaggc aaggaataca ggtattttgt - 3' (SEQ ID NO 17)
WildTyp Sequenz-Variante:
5' - tgggctaata ggactacttc taatctgtaa gagcagatcc ctggacaggc gaggaataca ggtattttgt - 3' (SEQ ID NO 18)
Beide Sequenzen wurden auf der Basis bei NCBI erhältlicher Information abgeleitet:
Homo sapiens chromosome 1 , GRCh38.p12 Primary Assembly, Sequence ID: NC 000001 .1 1 Coagulation Factor V mit SNP 1691 G>A (Substitution), im Codon 506.
Komponenten im Ansatz für die Erstellung der Start-Nukleinsäure 1.1
Humane gDNA: WHO Standard 04/224 für human gDNA für FVL-Gen
• Mutation-tragende Variante humaner gDNA ( 03/260 Factor V Leiden Homozygote) (FVL- Mutation)
• Wildtyp-tragende Variante humaner gDNA (03/254 Wild Type Factor V ) (WT Sequenz)
• Primer-Oligonukleotid
P1 F5G2-2001 -203 (SEQ ID NO 19)
5'- CAcaaTCATCAATACTTTTTTGTcaaaatarcucu qauacucu ]1 GTcaaaatacc tgtATT
1 = C3 Unterstrichene Sequenz besteht aus 2'-0Me-modifizierten Nukleotiden (2'-0-Methyl Nukleotiden) und entspricht dem zweiten Bereich des ersten Primers.
• Bst 2.0 Warmstart DNA Polymerase (NEB 120,000 units/ml), (wurde in Reaktion in 1 :1000 Verdünnung eingesetzt), weiter als„Bst-Polymerase“ genannt
Erstes Amplifikations-System
• Erstes Primer-Oligonukleotid P1 F5G2-1001-103
5'- CAcaaTCATCAATACTTTTTTGTcaaaatarcucuaauqcucuU GTcaaaatacct (SEQ ID NO 20)
1 = C3
Die unterstrichene Sequenz besteht aus 2'-OMe-modifizierten Nukleotiden und entspricht dem zweiten Bereich des ersten Primers.
• Block-Oligonukleotid: B1-P1 F5G2-3501 -304
5'- rcucuaauqcucuGucaal2aatacctqAAA X (SEQ ID NO 21 )
2= HEG
X= 3'-Phosphat-Gruppe
Die unterstrichene und in Klammern gesetzte Sequenz besteht aus 2'-OMe-modifizierten Nukleotiden.
• Controller-Oligonukleotid: CF5G2-1002-401 (SEQ ID NO 22)
5' [Aggacuacuu cuaaucugua agagcagauc ccuggacagg caaggaauac agguauu] ttgACagagcat cagagag X
X= 3'-Phosphat-Gruppe
Die in Klammern gesetzte Sequenz besteht aus 2'-OMe-modifizierten Nukleotiden.
• Zweites Primer-Oligonukleotid
P2-HAF5-081-1051 (SEQ ID NO 23)
CAcaaTCATCAATACtaataggac 6 ctctgggctaataggactacttctaatctgtaagagca
6= HEG
• Bst 2.0 Warmstart DNA Polymerase (NEB 120,000 units/ml), weiter als„Bst-Polymerase“ genannt
Folgende Konzentrationen für einzelne Komponenten wurden verwendet:
• Erstes Primer-Oligonukleotid 0,3 pmol/l
• Block-Oligonukleotid 5 pmol/l
• Controller-Oligonukleotid 2 pmol/l • Zweites Primer-Oligonukleotid 0,2 mitioI/I
• Bst-Polymerase wurde in Reaktion in 1 :1000 Verdünnung eingesetzt,
Zu Ansätzen der ersten Amplifikation wurde humane gDNA (von Promega, „Human male“) in einzelsträngiger Form zugegeben in Konzentration von ca. 100 ng pro Ansatz (12 mI). Damit wurde ein Test-System mit einem komplexen genetischen Hintergrund simuliert. Die humane gDNA umfasst gepoolte Proben (ca. 30.000 Kopien pro Ansatz).
Zweites Amplifikations-System (EvaGreen Detektion)
• drittes Primer-Oligonukleotid: P3F5G2-1001-301
5'- CTCGACACTACTTCAAGGACAAAATacctgtattcc (SEQ ID NO 24) (eingesetzt in 0,5 pmol/l)
• viertes Primer-Oligonukleotid: P4F5G2-1001-401
5'- ctc tgggctaata ggactacttc taatatgtaa gagca gat (SEQ ID NO 25) (eingesetzt in 0,5 pmol/l)
• Taq Polymerase Hot Start (NEB 5,000 units/ml) (wurde in Reaktion in 1 :100 Verdünnung eingesetzt)
• Detektion mittels EvaGreen Farbstoff (Jena Biosciences Stock 1 :50)
Der dritte und der vierte Primer waren im„Nested-Format“ bezogen entsprechend auf ersten und zweiten Primer gestaltet.
Oligonukleotid-Sonden zur Detektion von FVL System in der zweiten Amplifikation:
Zweites Amplifikations-System (Sondendetektion)
• drittes Primer-Oligonukleotid: P3F5G3-1001-3303-4
5'- ACTT C AAG G AC AAAAT a cctgt att (SEQ ID NO 26) (eingesetzt in 0,5 pmol/l)
• viertes Primer-Oligonukleotid: P4F5G3-1001 -3404-2
5'- ATATGTAA GAGCA GAT CCC (SEQ ID NO 27) (eingesetzt in 0,5 pmol/l)
• Taq Polymerase Hot Start (NEB 5,000 units/ml) (wurde in Reaktion in 1 :100 Verdünnung eingesetzt)
• Detektion mittels Oligonukleotid-Sonden
Der dritte und der vierte Primer waren im„Nested-Format“ bezogen entsprechend auf ersten und zweiten Primer gestaltet.
• Sonden-Oligonukleotid für FVL-Mutations-Spezifische Detektion S1 P4-FVL-1007
5'- FAM - TT G AC AG G C AAG G AA 3'-MGB-NFQ (SEQ ID NO 28) (von Thermofisher) (eingesetzt in 0,2 pmol/l)
• Sonden-Oligonukleotid für WT-Spezifische Detektion: S1 P4-FVL-1003-1 5'- NED - TTCTGGACAGGCGAGG 3'-MGB-NFQ (SEQ ID NO 29) (von Thermofisher) (eingesetzt in 0,6 mitioI/I)
Diskriminierende Base ist unterstrichen.
NFQ = non fluorescent quencher (Quencher der BlackHole-Serie)
Diese Sonden stellen Beispiel für“Taqman-Sonden” mit einem Fluoreszenzreporter und einem Fluoreszenzquencher dar.
Puffer:
alle Reaktionen wurden im gleichen Puffer durchgeführt. 1X Buffer Components (NEB)
20 mM Tris-HCI
10 mM (NH4)2S04
50 mM KCl
2 mM MgS04
0.1 % Tween® 20
pH 8.8@25°C
• Optional Eva-Green Farbstoff (Jena Biosciences), (wurde in Reaktion in 1 :50 Verdünnung eingesetzt).
• dNTP-Mix für Bst-Polymerase: dATP, dCTP, dGTP je 200 pmol/L, dUTP 400 pmol/l
• dNTP-Mix für Taq-Polymerase: dATP, dCTP, dGTP, dTTP je 200 pmol/L
Ablauf des Verfahrens:
Erstellung einer Start-Nukleinsäure für die erste Amplifikation
Zunächst wurde die Start-Nukleinsäure 1 .1 umfassend die Zielsequenz ausgehend von der einzelsträngigen humanen genomischen DNA (WHO-Standards für FVL und WT Sequenzvarianten) unter Verwendung des Primers (P1 F5G2-2001 -203, eingesetzt in 0,2 pmol/l) durch Primer-Extension mit Bst-Polymerase synthetisiert (10 min bei 50°C) und anschließend von dem Matrizenstrang durch Hitzedenaturierung bei 95°C (5 min) abgelöst. Die Erstellung der Start- Nukleinsäure 1 .1 für Sequenzvariante der Zielsequenz mit FVL-Mutation und Wildtyp-Mutation erfolgte in separaten Ansätzen. Pro Ansatz wurden ca. 100.000 Kopien humanger gDNA eingesetzt. Der hierfür verwendete Primer war ähnlich aufgebaut, wie das erste Primer- Oligonukleotid P1 F5G2-1001-103.
Nach Primer-Extension resultierte eine Start-Nukleinsäure 1.1 , welche ein Primer- Verlängerungsprodukt mit einem zur Zielsequenz komplementären Sequenz-Segment und einen Überhang am 5'-Ende umfasst. In der ersten Amplifikation kann eine solche Start-Nukleinsäure als Matrize dienen: ein zweiter Primer kann an eine solche Start-Nukleinsäure 1.1 sequenzspezifisch binden und kann von Polymerase verlängert werden. An den Überhang kann ein Controller- Oligonukleotid mit seinem ersten Bereich binden. Durchführung einer ersten Amplifikation und Detektion:
Die Start-Nukleinsäure 1.1 (mit FVL-Mutation und / oder WT-Sequenz) wurde in unterschiedlicher Verdünnung zum Amplifikations-Ansatz zugegeben (100 Kopien, 10 Kopien für FVL-Mutation, und 5000 Kopien für WT-Sequenz). Die Reaktion wurde durchgeführt unter zyklischen Veränderungen der Temperatur zwischen 50°C und 65°C. Bei diesen Temperaturen erfolgte kein spontaner Zerfall von spezifischen Amplifikations-Fragementen. Ein Zyklus umfasste Inkubation bei 50°C (2 min) und bei 65°C (4 min). Die Ansätze wurden unterschiedliche Zeit inkubiert (bis ca. 15 hr). Das Signal vom interkallierenden Farbstoff EvaGreen wurde während des Reaktionsverlaufs detektiert. Nach Abschluss der Reaktion wurden Schmelzkurven ermittelt. Eine Amplifikation führte zum Anstieg von Mengen an doppelsträngiger DNA (Amplifikations-Fragmente 1.1 ), welche in der Lage waren, interkallierende Farbstoffe einzulagern, was zu einem Signal-Anstieg von EvaGreen führte.
Die während dieser Reaktion synthetisierten Amplifikations-Fragmente 1.1 konnten als Matrizen für die zweite Amplifikation dienen bzw. für Sanger-Sequenz-Analyse verwendet werden.
Durchführung einer zweiten Amplifikation und Detektion (EvaGreen):
Vor dem Einsatz in der zweiten Amplifikation wurden die Produkte der ersten Amplifikation im Verhältnis 1 :6000 verdünnt. In diesen verdünnten Ansätzen vorhandene Amplifikations-Fragmente dienten als Start-Nukleinsäure 2.1 für die PCR-Reaktion. Die PCR -Reaktion wurde in 40 Zyklen durchgeführt. Ein Zyklus umfasste: 55°C 1 min, 68°C 3 min, 95°C 20 sec. Die Detektion wurde mit Eva-Green Farbstoff durchgeführt. Durch Beobachtung des Signal-Anstiegs (Ct-Wert) konnte relative Menge an zugegebenen Matrizen zu Beginn der Reaktion abgeschätzt werden. Die in der zweiten Amplifikation synthetisieren Amplifikations-Fragmente 2.1 konnten für Sanger- Sequenzierung verwendet werden.
Durchführung einer zweiten Amplifikation und Detektion (Sonden-Oligonukleotiden):
Vor dem Einsatz in der zweiten Amplifikation wurden die Produkte der ersten Amplifikation im Verhältnis 1 :6000 verdünnt. In diesen verdünnten Ansätzen vorhandene Amplifikations-Fragmente dienten als Start-Nukleinsäure 2.1 für die PCR-Reaktion. Die PCR -Reaktion wurde in 40 Zyklen durchgeführt. Ein Zyklus umfasste: 57°C 1 min, 95°C 20 sec. Die Detektion wurde mit sequenzspezifischen Oligonukleotid-Sonden (Taqman-Sonden mit Fluoreszenz-Reporter und MGB von Thermofisher) durchgeführt. Durch Beobachtung des Signal-Anstiegs (Ct-Wert) konnte sowohl relative Menge an zugegebenen Matrizen zu Beginn der Reaktion abgeschätzt werden als auch die Sequenz-Zusammensetzung im relevanten Sequenz-Abschnitt der synthetisierten Produkte.
Ergebnisse und Auswertung:
In der ersten Amplifikation war bei Ansätzen ausgehend von Start-Nukleinsäure 1 .1 (Zielsequenz mit FVL-Mutation Sequenzvariante) mit Ausgangskonzentrationen von ca. 100 und 10 Kopien pro Ansatz (Fig. 48, Pfeile 1 und 2, A) Signal-Verlauf während Amplifikation, B) Schmelzkurven) ein Signal-Anstieg (von EvaGreen Farbstoff) detektierbar. In Ansätzen ausgehend von Start- Nukleinsäure mit Zielsequenzen der WT-Variante mit Ausgangskonzentration von ca. 5000 Kopien pro Ansatz war kein Signal-Anstieg zu detektieren (Fig. 48, Pfeil 3). Das Signal lag auf dem Niveau von Ansätzen ohne eine Start-Nukleinsäure. Nach Abschluss der ersten Amplifikation wurde ein Aliquot entnommen, verdünnt und in die zweite Amplifikation gegeben.
Die zweite Amplifikation erfolgte ausgehend von einer Verdünnung von Ansätzen der abgeschlossenen ersten Amplifikation (Endverdünnung 1 :6000). Die zweite Amplifikation verwendete den dritten und vierten Primer, welche im nested Format zum ersten und zweiten Primer gestaltet wurden. Die zweite Amplifikation zeigte einen spezifischen Signal-Ansieg bei allen Ansätzen der ersten Amplifikation mit Amplifikations-Fragementen ausgehend von Start- Nukleinsäure 1 .1 mit Zielsequenz der FVL-Mutations-Variante (Fig. 49 Pfeil 2, A) zeigt Signal- Verlauf während Amplifikation, B) zeigt Schmelzkurven). Der Signal-Anstieg erfolgt früh im Verlauf der PCR (Ct-Wert ca. 5 bzw. 8) und spricht für eine hohe Konzentration von Amplifikations- Fragmenten der ersten Amplifikation. Bei Ansätzen ausgehend von Start-Nukleinsäure 1.1 mit Zielsequenz der WildTyp-Variante wurde ein Signal beobachtet (Fig. 49 Pfeil 3, Ct-Wert ca. 25), welches auf dem Niveau von Ansätzen ohne Start-Nukleinsäure lag (Fig. 49 Pfeil 4, Ct-Wert ca. 25). Der Vergleich von Zeitpunkten des Signal-Anstieges (Ct-Werte) bei diesen Ansätzen zeigt, dass die Menge der Amplifikations-Fragemente mit FVL-Mutation am Ende der ersten Amplifikation deutlich größer war, als die Megen an Amplifikations-Fragmenten mit Wildtyp-DNA. Unter Berücksichtigung der eingesetzten Start-Nukleinsäuren (10 Kopien FVL-Sequenz-Variante vs. 5000 Kopien der Wildtyp-DNA) in die erste Amplifikation konnte beobachtet werden, dass die Amplifikation der FVL-Sequenzvariante gegenüber der Wildtyp-Variante deutlich begünstigt war. Die Zusammensetzung der Amplifikate (FVL-Sequenz) einzelner Reaktionen wurde durch Sanger- Analyse und Sonden-basierte Detektion weiterhin bestätigt.
Dieses Ergebnis spricht für eine spezifische Amplifikation von Zielsequenzen während der ersten Amplifikation. Die in der ersten Amplifikation synthetisierten Amplifikations-Fragmente konnten als Matrizen in der zweiten Amplifikation verwendet werden.
Die Unterscheidung zwischen zwei Varianten der Zielsequenz während der ersten Amplifikation erfolgte durch Wirkung des Controller-Oligonukleotids, welches zur Zielsequenz mit Mutation komplementär gestaltet wurde. Damit umfasst dieses Controller-Oligonukleotid an einer Nukleotid- Position einen Mismatch zur Wildtyp-Variante der Zielsequenz. Das Controller-Oligonukleotid wurde so gestaltet, dass der polymorphe Lokus der Zielsequenz im dritten Bereich des Controller- Oligonukleotides liegt. Somit lag der polymorpher Lokus im Sequenzsegment der Zielsequenz, welches in 3'-Richtung vom ersten Primer und in 3'-Richtung vom zweiten Primer lag. Die verwendeten Primer allein hätten einzelne Sequenzvarianten im polymorphen Lokus der Zielsequenz nicht unterscheiden können.
Während der ersten Amplifikation erfolgte vorwiegend eine selektive Vervielfältigung von Produkten, welche Sequenzen mit perfekt komplementären Inhalt zum dritten Bereich des Controllers (FVL-Zielsequenz mit Mutation) aufwiesen. In diesem Beispiel wurde eine vorteilhafte Ausführungsform der Reaktionsbedingungen gewählt, bei welcher einerseits die Primer- Konzentration geringer war als die Konzentration von Controller-Oligonukleotid und andererseits zyklische Temperatur-Veränderungen (zwischen 50°C und 65°C) verwendet wurden.
Bei den verwendeten Oligonukleotiden bilden Primer-Oligonukleotide ein Interaktions-Paar mit den entsprechenden Controller-Oligonukleotiden (z.B. erstes Primer-Oligonukleotid und erstes Controller-Oligonukleotid). Dieses Interaktions-Paar hatte unter Reaktionsbedingungen der Amplifikation eine Schmelztemperatur von ca. 63°C (gemessen bei ca. 1 pmol/l Konzentration von beiden Komponenten unter Puffer-Bedingungen der Amplifikation). Der erste Bereich des Primer- Oligonukleotides bildete mit einem komplementären Sequenz-Anteil einer Matrize einen Komplex mit einer Schmelztemperatur von ca. 50°C (z.B. erster Bereich des ersten Primers und das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext) gemessen bei ca. 1 pmol/l Konzentration von beiden Komponenten unter Puffer-Bedingungen der Amplifikation).
Je nach Ausführungsform können Primer und Controller-Oligonukleotide in unterschiedlichen Verhältnissen eingesetzt werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wurden Primer-Controller-Kombinationen verwendet, bei welchen die Konzentration von Primer höher lag, als die Konzentration von Controller (z.B. erster Primer 5 pmol/l und Controller 2 pmol/l, siehe Beispiel 1 bis 3). Bei dieser Ausführungsform lag ein Überschuss an Primer vor, so dass der Primer-Verlängerungsschritt bei einer Temperatur von 50°C in guten Ausbeuten verlief, trotz partieller Bindung von Primer-Oligonukleotid an das Controller- Oligonukleotid.
In einerweiteren vorteilhaften Ausführungsform (Beispiel 5) wurden ein Gemisch aus einem Primer und einem entsprechenden Controller-Oligonukleotid verwendet, bei welchem die Konzentration von Primer niedriger lag, als die Konzentration des Controller-Oligonukleotids (z.B. Primer 0,5 pmol/l und Controller 2 pmol/l). Somit lag das Controller-Oligonukleotid im Überschuss vor. Bei dieser Ausführungsform führte die Absendung der Reaktionstemperatur auf 50°C zur raschen Bindung der Primer-Oligonukleotide an die Controller-Oligonukleotide. Das reduzierte die Ausbeute im Primer-Verlängerungsschritt bei 50°C und senkte die Geschwindigkeit der Amplifikation. Um eine ausreichende Primer-Konzentration auch bei geringen Temperaturen aufrecht zu erhalten und damit Ausbeuten im Primer-Verlängerungsschritt zu erhöhen, wurden sogenannte Block-Oligonukleotide eingesetzt. Solche Block-Oligonukleotide konkurrierten mit dem Primer-Oligonukleotid um die Bindung an das Controller-Oligonukleotid, waren aber selbst nicht in der Lage von einer Polymerase verlängert zu werden.
Durch Verwendung von Block-Oligonukleotiden war es möglich, die Kombination aus Primer- Oligonukleotid und Controller-Oligonukleotid bei einigen Konzentrations-Bereichen einzusetzen und mit zyklischen Temperatur-Veränderungen zu kombinieren. Dies führte zu einer Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit. Die Struktur von Block-Oligonukleotiden ist im Wesentlichen ähnlich gestaltet wie die Struktur von Primer-Oligonukleotiden, mit folgenden Unterschieden:
Block-Oligonukleotide werden von Polymerase nicht verlängert. Das kann beispielsweise durch Blockade des 3'-Endes durch eine Modifikation erreicht werden (z.B. 3'-Phosphat, 3'- C3, dideoxi-Nukleotid), und / oder durch Einführung von terminalen Mismatches in 3'-Ende des Block-Oligonukleotides.
Block-Oligonukleotide können in ihrer Sequenzzusammensetzung von ihren zugehörigen Primern abweichen. Die Anzahl von Sequenz-Abweichungen kann zwischen 1 Nukleotid bis 20 Nukleotide betragen.
Beim Design von Block-Oligonukleotiden ist es vorteilhaft, die Tm von Block-Oligonukleotiden an Controller-Oligonukleotide im ähnlichen Bereich zu halten, wie die Tm von Primer-Oligonukleotiden und Controller-Oligonukleotiden. Dadurch konkurrieren Block-Oligonukleotide und Primer- Oligonukleotide um die Bindung an Controller-Oligonukleotide im ähnlichen Ausmaß (z.B. Tm von Primer-Controller-Komplex plus / minus 3°C). Durch Verwendung höherer Konzentrationen von Block-Oligonukleotiden als Primer-Oligonukleotiden, kann das Bindungs-Verhältnis vorteilhaft beeinflusst werden.
Weitere Beispiele Ausführungsformen der Erfindung
Fig. 1 zeigt schematisch die Edukte und Produkte einer Amplifikation umfassend eine erste Amplifikation (Fig. 1A) (erste Teil-Amplifikation) und anschließend eine zweite Amplifikation (Fig. 1 B) (zweite Teil-Amplifikation) unter Verwendung von Komponenten des ersten Amplifikationssystems und des zweiten Amplifikations-Systems. Die Reaktion beginnt mit der Start- Nukleinsäure 1 .1 , welche eine Zielsequenz umfasst und als Matrize zum Start der ersten Teil- Amplifikation verwendet wird.
Komponenten des ersten Amplifikations-Systems sind insbesondere: ein erster Oligonukleotid- Primer (P1 .1 ), ein zweites Oligonukleotid Primer (P2.1 ), ein Controller-Oligonukleotid (C 1 .1 ) und erste Polymerase (Pol 1 .1 ), dNTPs.
Während der ersten Teil-Amplifikation (A1 .1 ) erfolgt eine spezifische Amplifikation eines ersten Amplifikations-Fragmentes 1 .1. umfassend ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt P1 .1-Ext und ein zweites Primer-Verlängerungsprodukt P2.1-Ext. Das Primer-Verlängerungsprodukt P1 .1-Ext erfolgt als matrizenabhängige Verlängerung von P1 .1 durch die Polymerase unter Reaktionsbedingungen der ersten Teil-Amplifikation. Das Primer-Verlängerungsprodukt 2.1 -Ext resultiert aus matrizenabhängigen Verlängerung des P2.1 unter Reaktionsbedingungen der ersten Teil-Amplifikation. Beide Primer P1.1 und P2.1 schließen Sequenzsegmente ein, welche komplementär an die Zielsequenz bzw. ihre komplementäre Sequenzanteile binden können, so dass die Primer an beiden Enden der Zielsequenz positioniert sind. Das während der ersten Teil-Amplifikation gebildete Amplifikations-Produkt 1 .1 kann als Start- Nukleinsäure 2.1 für die zweite Teil-Amplifikation (A2.1 ) verwendet werden. Während der zweiten Teil-Amplifikation wird ein zweites Amplifikations-Fragment 2.1 amplifiziert, umfassend ein drittes Primer-Verlängerungsprodukt P3.1 -Ext und ein viertes Primer-Verlängerungsprodukt P4.1 -Ext., wobei das Primer-Verlängerungsprodukt P3.1 -Ext als matrizenabhängige Verlängerung von P3.1 entsteht, und durch die Polymerase und das Primer-Verlängerungsprodukt 4.1 -Ext aus der matrizenabhängigen Verlängerung des P4.1 unter Reaktionsbedingungen der zweiten Teil- Amplifikation resultiert. Beide Primer P3.1 und P4.1 schließen Sequenzsegmente ein, welche komplementär an die Zielsequenz bzw. ihre komplementären Sequenzanteile binden können. P1 .1 und P3.1 können zwar mit ihren 3'-Segmenten an das Controller-Oligonukleotid komplementär binden, werden allerdings aufgrund der Modifikation des Controller-Oligonukleotids nicht durch die verwendete Polymerase verlängert.
Fig. 2 zeigt schematisch Edukte und Produkte einer ersten Teil-Amplifikation. Während der ersten Teil-Amplifikation erfolgt eine spezifische Amplifikation eines ersten Amplifikations-Fragmentes 1.1. umfassend ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt P1.1 -Ext und ein zweites Primer- Verlängerungsprodukt P2.1 -Ext.. Das Primer-Verlängerungsprodukt P1.1 -Ext erfolgt als matrizenabhängige Verlängerung von P1.1 , und das Primer-Verlängerungsprodukt 2.1 -Ext resultiert aus matrizenabhängiger Verlängerung des P2.1 .
Die während der Reaktion gebildeten Synthese-Produkte (P1 .1-Ext und P2.1-Ext) können untereinander und mit dem Controller-Oligonukleotid unterschiedliche Komplexformen ausbilden (je nach Konzentrationsverhältnis und Reaktionsbedingungen). Im Einzelnen können diese Formen Komplexe aus P1 1-Ext / C1 .1 und / oder P1 1 -Ext und / oder P1 1 -Ext / C1.1/ P2.1 -Ext umfassen.
Das P1-Ext umfasst ein 3'-Segment, welches Sequenzanteile einschließt, welche im Wesentlichen komplementär einen P4.1 Primer unter Reaktionsbedingungen der zweiten Teil-Amplifikation binden können. Das P2-Ext umfasst ein 3'-Segment, welches Sequenzanteile einschließt, welche im Wesentlichen komplementär einen P3.1 -Primer unter Reaktionsbedingungen der zweiten Teil- Amplifikation binden können.
Fig. 3 zeigt schematisch ein Temperaturprofil der beiden Teil-Amplifikationen (Fig. 3A) sowie eine schematische Abbildung einer Produktakkumulation (als Erhöhung der Kopie-Anzahl in einer zeitabhäniger Art) während der ersten und der zweiten Teil-Amplifikation (Fig. 3B).
Der Ablauf der ersten Teil-Amplifikation A1 .1 erfolgt unter Temperaturbedingungen, welche eine unspezifische, spontane Strangtrennung in Abwesenheit eines spezifischen Controller- Oligonukleotides nicht zulassen. Im Wesentlichen verläuft die Reaktion zwischen Temperatur T1 und T2 ab. Bei niedrigerer Temperatur (T1 ) erfolgt insbesondere eine Hybridisierung von mindestens einem Primer des ersten Amplifikations-Systems und seine Verlängerung durch die Polymerase, bei der zweiten Temperatur (T2) erfolgt insbesondere eine Trennung von P1 -Ext und P2-Ext unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotids. Die Reaktion verläuft als zyklische Veränderung der Reaktionstemperaturen, wobei die erforderliche Anzahl von Zyklen gewählt werden kann und einen Einfluss auf das Ausmaß der Amplifikation nehmen kann. Hier wird schematisch eine Vermehrung von etwa 10 Kopien auf etwa 108 Kopien gezeigt (Fig. 3B). Weiterhin wird hier schematisch dargestellt, dass nach Ablauf der ersten Teil-Amplifikation ein Anteil an gebildeten Produkten (Amplifikations-Produkt 1.1 ) als Aliquot in die zweite Teil- Amplifikation übertragen wurde und als Start-Nukleinsäurekette für die zweite Teil-Amplifikation dienen kann. Bei der Verdünnung des Ansatzes nach der ersten Teil-Reaktion wird somit nur eine Teil-Menge der in der ersten Reaktion gebildeten Kopien in die zweite Reaktion übertragen. Ebenfalls werden die Komponenten des ersten Amplifikations-Systems verdünnt, so dass ihre Wirkung auf das zweite Amplifikations-System wegen resultierender geringer Konzentrationen vermindert wird.
Fig. 3A zeigt weiterhin schematisch den Ablauf der zweiten Teil-Amplifikation (A2.1 ), wobei die verwendeten Temperatur-Bedingungen so gewählt sind, dass die Trennung der entstehenden Amplifikationsprodukte bei der Temperatur (T3) vorwiegend unspezifisch durch thermale Destabilisierung der Bindungen zwischen beiden Strängen der synthetisierten komplementären Primer-Verlängerungsprodukte und ohne wesentliche Mitwirkung vom Controller-Oligonukleotid erfolgt. Die Primer-Bindung und Verlängerung erfolgt bei T1 ähnlich wie in der ersten Teil- Amplifikation. Die Reaktion verläuft im Wesentlichen wie eine PCR, wobei die notwendige Anzahl an PCR-Zyklen durchgeführt wird, um die gewünschte Kopie-Zahl zu generieren. Die Reaktionen umfassen die Bindung von Primern an die Matrize, ihre Verlängerung bis zur Ausbildung von entsprechenden Primer-Verlängerungsprodukten und Trennung der gebildeten Stränge durch Temperatur. Dabei resultiert das Amplifikationsprodukt 2.1. Die PCR startet bei einer initialen Menge an Kopien des ersten Amplifikations-Produktes 1.1 umfassend eine Zielsequenz von etwa 105 und vermehrt das Amplifikations-Produkt 2.1 umfassend die Zielsequenz bis zu einer Kopienzahl von etwa 1010.
Die erste Teil-Amplifikation verläuft unter Bedingungen, welche eine sequenzabhängige Trennung der synthetisierten Stränge unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotids herbeiführen. Die zweite Teil-Amplifikation verläuft als PCR, wobei die Strang-Trennung vorwiegend sequenzunspezifisch ist.
Fig. 4 zeigt schematisch ein Temperaturprofil der beiden Teil-Amplifikationen (Fig. 4A) sowie eine schematische Abbildung einer Produktakkumulation (als Erhöhung der Kopie-Anzahl in einer zeitabhäniger Art) während der ersten und der zweiten Teil-Amplifikation (Fig. 4B). Die Reaktionen verlaufen, wie in Fig. 3 abgebildet, mit dem Unterschied, dass die Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems zum Ansatz mit der ersten Teil-Amplifikation zugegeben werden, so dass die gebildete Anzahl von Kopien des ersten Amplifikations-Fragments 1 .1 die Ausgangs-Menge der Start-Nukleinsäuren 2.1 für die zweite Teil-Amplifikation darstellt und keine nennenswerte Verdünnung der Komponenten des ersten Amplifikations-System erfolgt. Fig. 5 zeigt schematisch die Edukte und Produkte einer Amplifikation umfassend eine erste Teil- Amplifikation (Fig. 5A) und anschließend eine zweite Teil-Amplifikation (Fig. 5B) unter Verwendung der Komponenten des ersten Amplifikationssystems und des zweiten Amplifikations-Systems. Die Reaktion verläuft im Wesentlichen wie in Fig. 1 dargestellt, mit dem Unterschied, dass während der zweiten Teil-Amplifikation die Primer P3.2 und P4.2 verwendet werden, welche keine komplementären Sequenzsegmente zu den 3'-terminalen Segmenten von P1 1 -Ext bzw. P2.1 -Ext umfassen. Dadurch können P1.1 -Ext und P2.1- Ext- Produkte mit ihren 3'-Enden keine komplementäre Bindung an die Primer P3.2 bzw. P4.2 eingehen, welche von einer Polymerase (z.B. Pol 1.1 oder Pol 2.1 ) verlängert werden. Somit wird verhindert, dass P1 1 -Ext und P2.1-Ext bei einem Einsatz der Primer P3.2 und P4.2 unter Reaktionsbedingungen der ersten Teil- Amplifikation übermäßig verlängert werden. Während der zweiten Teil-Amplifikation erfolgt eine Ausbildung der vollständigen P3.1-Ext- und P4.1- Ext- Produkte während der zyklischen Synthesevorgängen und ihre Vermehrung. Die Verwendung von solchen Primerkombinationen (Set 1 umfassend P1 .1 und P2.1 und Set 2 umfassend P3.1 und P4.1 ) ermöglichen ein Design von homogenen Reaktionen, bei welchen beide Primer-Sets zu Beginn der Amplifikation im gleichen Reaktions-Ansatz bereitgestellt sind.
Fig. 6 zeigt schematisch ein Temperatur-Profil von beiden Teil-Amplifikationen (Fig. 6A) sowie eine schematische Abbildung einer Produktakkumulation (als Erhöhung der Kopie-Anzahl in einer zeitabhängigen Art) während der ersten und der zweiten Teil-Amplifikation (Fig. 6B).
Die Abbildung zeigt schematisch ein Temperatur-Profil, bei welchem beide Teil-Amplifikationen unmittelbar hintereinander ausgeführt werden (beide Primer-Sets liegen zu Beginn der Reaktion im Ansatz vor). Schematisch ist dargestellt, dass während der ersten Amplifikation die Erhöhung der Anzahl von Kopien des Amplifikations-Produktes 1.1 von etwa 10 auf etwa 104 erfolgt. Diese Produkte umfassen eine Zielsequenz und dienen als Start-Nukleinsäure 2.1 für die zweite Amplifikation. Während der zweiten Amplifikation erfolgt eine weitere Erhöhung der Anzahl von amplifizierten Zielsequenzen ausgehend von etwa 104 der Amplifikations-Produkte 1.1 auf etwa 1010 resultierender Amplifikations-Produkte 2.2.
Fig. 7A zeigt schematisch ein Temperatur-Profil der beiden Teil-Amplifikationen. Der Ablauf von Temperatur-Änderungen in Fig. 7A entspricht denen wie in Fig. 3 beschrieben: Der Ablauf der ersten Teil-Amplifikation A1 .1 erfolgt unter Temperaturbedingungen, welche eine unspezifische, spontane Strangtrennung in Abwesenheit eines spezifischen Controller-Oligonukleotides nicht zulassen. Im Wesentlichen verläuft die Reaktion zwischen Temperatur T1 und T2 ab. Bei niedrigerer Temperatur (T1 ) erfolgt insbesondere eine Hybridisierung von mindestens einem Primer des ersten Amplifikations-Systems und seine Verlängerung durch die Polymerase, bei der zweiten Temperatur (T2) erfolgt insbesondere eine Trennung von P1 -Ext und P2-Ext unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotids. Im Verlauf der Reaktion erfolgt die Amplifikation des ersten Amplifikations-Produktes 1 .1 , welches als Start-Nukleinsäure 2.1 in der zweiten Teil- Amplifikation verwendet werden kann. Die Reaktion verläuft als zyklische Veränderung der Reaktionstemperaturen, wobei die erforderliche Anzahl von Zyklen gewählt werden kann, und einen Einfluss auf das Ausmaß der Amplifikation nehmen kann. Fig. 7A zeigt weiterhin schematisch den Ablauf der zweiten Teil-Amplifikation (A2.1 ) welche unmittelbar nach der ersten Teil- Amplifikation stattfindet, wobei die verwendeten Temperaturbedingungen so gewählt sind, dass die Trennung der entstehenden Amplifikationsprodukte bei der Temperartur (T3) vorwiegend unspezifisch durch thermale Destabilisierung der Bindungen zwischen beiden Strängen der synthetisierten komplementären Primer-Verlängerungsprodukte und ohne wesentlicher Mitwirkung des Controller-Oligonukleotids erfolgt. Die Primer-Bindung und Verlängerung erfolgt bei T1 ähnlich wie in der ersten Teil-Amplifikation. Die Reaktion verläuft im Wesentlichen wie eine PCR, wobei die notwendige Anzahl an PCR-Zyklen durchgeführt wird, um die gewünschte Kopie-Zahl zu generieren. Die Reaktionen umfassen die Bindung der Primer an die Matrize, ihre Verlängerung bis zur Ausbildung von entsprechenden Primer-Verlängerungsprodukten und die Trennung von gebildeten Strängen durch Temperatur. Dabei resultiert das Amplifikations-Produkt 2.1 . Die erste Teil-Amplifikation verläuft unter Bedingungen, welche eine sequenzabhängige Trennung von synthetisierten Strängen unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotids herbeiführen. Die zweite Teil-Amplifikation verläuft als PCR, wobei die Strang-Trennung vorwiegend sequenzunspezifisch ist.
Fig. 7B zeigt eine erste und eine zweite Amplifikation wie in Fig. 7A. Beide Reaktionen sind durch einen weiteren Temperatur-Schritt getrennt, hier als „Temperatur-Schalt-Schritt“ bezeichnet, welche eine Erhöhung der Temperatur auf etwa T3 für eine gewisse Zeit umfasst. Während dieses Schrittes kann beispielsweise eine Inaktivierung der Polymerase der ersten Teil-Amplifikation erfolgen und/oder eine Aktivierung der Polymerase der zweiten Teil-Amplifikation und/oder eine Aktivierung von thermolabilen Primern. Mit einem solchen Schritt erfolgt somit auch eine Änderung der Aktivität der einzelnen Komponenten der Amplifikations-Systeme.
Fig. 8 zeigt schematisch ein Temperaturprofil von beiden Teil-Amplifikationen. Der Ablauf ersten Teil-Amplifikation entspricht denen wie in Fig. 7A beschrieben. Der Ablauf der zweiten Teil- Amplifikation wird hier in zwei Phasen aufgeteilt. Während der ersten Phase (A2.1 Phase 1 ) erfolgt eine Temperaturänderung zwischen T1 und T3. Während T1 kann mindestens ein Primer des zweiten Amplifikations-Systems an seine entsprechend komplementäre Position im Amplifikations- Produkt 1.1 binden und verlängert werden. Durch Verwendung von niedrigeren Temperaturen können auch Primer mit relativ kurzen 3'-Segmenten verwendet werden, welche komplementär binden können (wie in Fig. 5 dargestellt). Phase 1 kann einige Zyklen umfassen, wobei die initialen Amplifikationsprodukte 2.1 gebildet werden, welche komplementäre Segmente umfassen, welche länger sind und somit in der Lage sind, Primer bei höheren Temperaturen zu binden. Das ermöglicht Verwendung von höheren Temperaturen in der Phase 2 für Primer-Bindung und Primer- Verlängerungsschritt (hier als zyklische Verlängerungen zwischen T2 und T3 dargestellt). Durch eine Erhöhung der Temperatur kann beispielsweise einer Entstehung von Nebenreaktionen entgegengewirkt werden. Fig. 8B hier wird schematisch dargestellt, dass die Temperatur während der A2.1 Phase 1 weiter auf Temperatur T4 abgesenkt wird, so dass beispielsweise die Primer des Set 2 binden können. Der Einsatz der Temperatur T4 in Phase 1 kann beispielsweise durch Verwendung von mindestens eines Primers des Set 2 umfassend mindestens einen Mismatch zu komplementären Sequenzsegmenten der ersten Amplifikations-Produkte bedingt sein. Niedrige Temperatur (T4) soll dabei eine initiale Generierung von Primer-Verlängerungsprodukten ausgehend von P3.1 und/oder P4.1 unterstützen. Nach dieser initialen Generierung kann die Temperatur des Schrittes mit Primer- Bindung und Primer-Verlängerung erhöht werden (Phase 2), da nun vollkomplementäre Primer- Bindungsstellen vorliegen.
Fig. 9A zeigt schematisch ein Temperatur-Profil der beiden Teil-Amplifikationen. Der Ablauf der ersten Teil-Amplifikation erfolgt unter einer einheitlichen Temperatur, hier bei T2. Dabei verlaufen alle erforderlichen Schritte der ersten Teil-Amplifikation bei dieser Temperatur. Anschließend kann beispielsweise eine Temperaturerhöhung (Temperatur-Schalt-Schitt) folgen (wie in Fig. 7B beschrieben). Anschließend erfolgt eine PCR-Reaktion als zweite Teil-Amplifikation.
Die erste Teil-Amplifikation verläuft dabei bei einer einheitlichen Temperatur, welche eine sequenzabhängige Strang-Trennung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukleotid begünstigt.
Fig. 9B zeigt schematisch einen weiteren Temperatur-Verlauf bei der ersten Teil-Amplifikation, welche sowohl eine isothermale Phase umfasst (zu Beginn) als auch eine spätere zyklische Phase. Auch hier verläuft die erste Teil-Amplifikation bei Temperaturen, welche eine sequenzabhängige Strangtrennung unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotids begünstigt.
Fig. 10A zeigt schematisch ein Temperatur-Profil der beiden Teil-Amplifikationen. Die zweite Teil- Amplifikation in der Phase 2 umfasst den Einsatz einer weiteren Temperatur T5, welche höher ist als T2. Diese Temperatur liegt zwischen etwa 68 °C und 82 °C. Der Einsatz der Temperatur T5 kann die Bindung des Controller-Oligonukleotids an das P3.1 -Ext schwächen, und somit den Einfluss dieser Bindung auf die Verlängerung von P4.1 reduzieren, so dass die Verlängerung von P4.1 gegebenenfalls effizienter verlaufen kann.
Fig. 10B zeigt schematisch ein Temperatur-Profil von beiden Teil-Amplifikationen. Während der zweiten Teil-Amplifikation erfolgt in der Phase 1 eine initiale Generierung der zweiten Amplifikationsprodukte. Unter Verwendung der Primer 3.1 und 4.1 , welche in der Lage sind, bei höheren Temperaturen (T5) an ihre komplementären Positionen zu binden und von der Polymerase verlängert zu werden, kann die Temperatur in der zweiten Phase zwischen T5 und T3 verändert werden. Durch die Wahl der Reaktionsbedingungen kann man die Entstehung von Zwischenprodukten bzw. Endprodukten beeinflussen. Beispielsweise unter Verwendung von längeren P3.1 und P4.1 (z.B. 30 - 40 Nukleotide lang) in Kombination mit einer höheren Temperatur beim Primer-Bindungs-Schritt und Primer-Verlängerungs-Schritt in der zweiten Teil- Amplifikation (z.B. bei T2 und / oder T5) werden bevorzugt P3.1-Ext und P4.1-Ext akkumuliert. Fig. 1 1 zeigt schematisch ein Temperatur-Profil von beiden Teil-Amplifikationen. Die Übergangs- Phase zwischen beiden Teil-Amplifikationen kann unterschiedlich gestaltet werden. In Fig. 1 1A wird eine kontinuierliche Erhöhung der Temperatur zum Ende der ersten Teil-Amplifikation gezeigt. In Fig. 1 1 B wird eine zyklische Absenkung der Temperatur zum Ende der ersten Teil-Amplifikation gezeigt. Damit können beide Teil-Amplifikationen partielle Überlappungen in Reaktions-Abläufen aufweisen.
In den Figuren Fig. 12 - 18 sind die Relationen zwischen einzelnen Komponenten des ersten Amplifikations-Systems (bis Fig. 14) sowie Relationen zwischen Komponenten des ersten Amplifikations-Systems und des zweiten Amplifikations-Systems dargestellt. Fig. 15A zeigt schematisch die Generierung der ersten Amplifikations-Fragmente (umfassend P1 1 -Ext und P2.1 - Ext) ausgehend von einer Start-Nukleinsäure 1.1 (welche hier schematisch als die zu amplifizierende Nukleinsäure in die Reaktion zugegeben wird). Fig. 15B zeigt schematisch die Generierung von Zwischenprodukten, welche unter Verwendung der Primer P3.1 und P4.1 und P1.1 -Ext und P2.1-Ext der ersten Teil-Amplifikation als Matrizen entstehen (P3.1 -Ext Teil 1 und P4.1 -Ext Teil 1 ). Diese Zwischenprodukte können in nachfolgenden Zyklen durch erneute Primer- Bindung und Verlängerung zu vollständigen P3.1-Ext und P4.1-Ext unter Verwendung von P3.1 - Ext TeiM und P4.1 -Ext Teil 1 als Matrizen umgewandelt werden. Durch die Wahl der Bedingungen kann die Entstehung von Zwischenprodukten bzw. Endprodukten beeinflusst werden. Beispielsweise unter Verwendung von längeren P3.1 und P4.1 (z.B. 30 - 40 Nukleotide lang) in Kombination mit einer höheren Temperatur beim Primer-Bindungsschritt und Primer- Verlängerungsschritt in der zweiten Teil-Amplifikation (z.B. bei T2 und / oder T5) werden bevorzugt P3.1 -Ext und P4.1 -Ext akkumuliert.
Die Figuren Fig. 19 bis 26 zeigen schematisch Beispiele für Anordnungen von Sequenzsegmenten eines Controller-Oligonukleotides (C1.1 ), des ersten Primers (P1 .1 ) und des dritten Primers (P3.1 ) und eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1 -Ext). Das P2.1-Ext umfasst im 3'- Segment eine für P1.1 komplementäre Sequenz und kann als Matrize für die Generierung von P1.1 -Ext in der ersten Teil-Amplifikation dienen. Weiterhin umfasst das P2.1 -Ext ein weiteres komplementäres Segment für das 3'-Segment des P3.1 , welches an das P2.1 -Ext binden und von der Polymerase verlängert werden kann, so dass in der zweiten Teil-Amplifikation ein P3.1-Ext generiert werden kann.
Die Figuren. 16 bis 26 fassen Beispiele für Anordnungen von Segmenten im Controller- Oligonukleotid und P1.1 und P3.1 zusammen. P3.1 kann mit seinem 3'-Segment an das Controller- Oligonukleotid komplementär binden. Diese Bindung erfolgt in einem Sequenzsegment des Controller-Oligonukleotides, welches hier als vierter Bereich bezeichnet wird. Je nachdem, wie im Einzelnen die Positionierung des P3.1 erfolgt, kann dieser vierte Bereich entsprechend im Bezug auf Bereiche eins, zwei oder drei, unterschiedliche Lokalisation haben. In bestimmten Ausführungsformen liegt der vierte Bereich innerhalb des zweiten Bereichs (Fig. 19, 20), in einer anderen Ausführungsform liegt der vierte Bereich am Übergang zwischen dem Bereich zwei und drei (Fig. 21 ), in einer anderen Ausführungsform liegt der vierte Bereich im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides (Fig. 22). Insbesondere soll die Anwesenheit des Controller- Oligonukleotides nicht zu einer ungewollten Bildung von Nebenprodukten führen. Vor allem soll die Primer-Bindung an das Controller-Oligonukleotid nicht dazu führen, dass die Polymerase unter Verwendung des Controller-Oligonukleotids eine P1.1 -Verlängerung bzw. P3.1 -Verlängerung katalysiert. Dies wird im Allgemeinen durch Verwendung von Nukleotid-Modifikationen im Controller-Oligonukleotid erreicht, z.B. durch Verwendung von 2'-0-Alkyl-Modifikationen. Solche Modifikationen sind insbesondere in Sequenzsegmenten des Controller-Oligonukleotides eingesetzt, welche zumindest zum 3'-Segment des jeweiligen Primers komplementäre Sequenzen umfassen. Weiterhin können solche Modifikationen über das zu einem Primer komplementäre Sequenzsegment hinausgehen, beispielsweise können diese Sequenzsegmente Positionen von etwas minus 10 bis etwa plus 10 Nukleotide respektive der Position von 3'-Ende eines jeweiligen Primers umfassen. Die Sequenzsegmente mit solchen Nukleotid-Modifikationen werden als hier als„zweite Blockierungseinheit“ bezeichnet, welche die komplementären Sequenzsegmente zum ersten Primer (P1 .1 ) umfassen (Fig. 19 - 22), bzw. als „vierte Blockierungseinheit“ welche komplementäre Sequenzsegmente zum dritten Primer (P3.1 ) umfassen (Fig. 19 - 22). Durch eine solche Modifizierung von Controller-Oligonukleotiden wird verhindert, dass die Polymerasen bei einer Primer-Bindung an die Controller-Oligonukleotide eine matrizenabhängige Primer- Verlängerung starten. Die Zusammensetzung der Nukleotid-Modifikationen kann in der zweiten und vierten Blockierungseinheit gleich oder auch unterschiedlich sein. Die Länge der jeweiligen Sequenzsegmente, welche zu einer zweiten oder vierten Blockierungs-Einheit zusammengefasst werden, kann ebenfalls gleich oder unterschiedlich für die jeweiligen Blockierungseinheiten sein. Die Lokalisation der jeweiligen Blockierungseinheiten richtet sich nach der Position der jeweiligen potenziellen Bindungs-Stellen der Primer am Controller-Oligonukleotid (Fig. 19 - 22). Eine mögliche Zusammensetzung der zweiten Blockierungseinheit für den ersten Primer wird im Detail dargestellt. Die Zusammensetzung der vierten Blockierungseinheit kann in Anlehnung an die zweite Blockierungseinheit analog gestaltet werden. In einer besonderen Ausführungsform besteht der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids vollständig aus 2'-0-Alkyl-Modifikationen von Nukleotiden. In einer weiteren besonderen Ausführungsform besteht der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids in seinem 3'-Segment (z.B. Nukleotid Positionen von 1 bis 20 anschließend an den zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotides) vollständig aus 2'-0-Alkyl- Modifikationen von Nukleotiden. In einer anderen besonderen Ausführungsform besteht der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotid vollständig aus 2'-0-Alkyl-Modifikationen von Nukleotiden. In einer weiteren besonderen Ausführungsform besteht der zweite Bereich des Controller- Oligonukleotids und der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids in seinem 3'-Segment (Positionen 1 bis 20 anschließend an den zweiten Bereich) vollständig aus 2'-0-Alkyl- Modifikationen von Nukleotiden. Somit ist es nicht zwingend erforderlich, einzelne Segmente getrennt mit Modifikationen zu versehen, es können komplette Sequenzsegmente des Controller- Oligonukleotides durch komplementäre Nukleotide beispielsweise mit 2'-0-Alkyl-Modifikation bereitgestellt werden.
Aufgrund einer fehlenden Modifizierung in komplementären Sequenzsegmenten der Primer- Verlängerungsprodukte (welche als Ergebnis einer enzymatischen Aktivität von Polymerasen in matrizenabhäniger Art erstellt werden) können Primer bei einer komplementären Bindung an solche Sequenzsegmente von Polymerasen erkannt und verlängert werden.
Die Figuren 27 bis 31 zeigen schematisch Beispiele für Anordnungen und potenzielle Kombinationen umfassend Primer-Set 1 (P1 .1 und P2.1 ) sowie Primer-Set 2 (P3.1 und P4.1 ). Dabei kann einer der Primer von Primer-Set 1 mit einem der Primer von Set 2 identisch sein (z.B. P4.1 entspricht P2.1 in Fig. 27 - 28). Insbesondere bei der Verwendung einer Verdünnung des Reaktionsansatzes nach der ersten Teil-Amplifikation und einer Zugabe der Komponenten des zweiten Amplifikations-Systems nach Ablauf der ersten Teil-Amplifikation können die Primer des zweiten Primer-Sets sich in ihrer Länge vom Primer-Set 1 unterscheiden (Fig. 30). Bevorzugt werden Primer-3 Strukturen verwendet, welche nur in ihrem 3'-Segment eine komplementäre Sequenz zum Controller-Oligonukleotid umfassen. Die Zusammensetzung des 5'-Segmentes des dritten Primers umfasst insbesondere keine komplementären Sequenzsegmente zum Controller- Oligonukleotid (Fig. 31 ).
Die Figuren 32 bis 35 zeigen schematisch das Zusammenwirken von Komponenten bei einer ersten Teil-Amplifikation.
Figur 32 beschreibt Komponenten der in Fig. 33 - 35 dargestellten Strukturen.
Figur 33 zeigt schematisch den Strangverdrängungsmechanismus.
Figur 34 zeigt schematisch das Zusammenwirken der Strukturen bei Strangverdrängung.
Figur 35 zeigt schematisch das Zusammenwirken der Strukturen während der ersten Nukleinsäureamplifikation durch einerseits die Amplifikation des ersten Primer-Oligonukleotids und des zweiten Primer-Oligonukleotids und weiterhin die Einwirkung des Controller-Oligonukleotids und dabei resultierende Strangverdrängung.
Fig. 36 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 1 ; Fig. 37 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 2; Fig. 38 - 40 zeigen Ergebnisse aus Beispiel 3; Fig. 41 - 47 zeigen Ergebnisse aus Beispiel 4, 48 - 49 zeigen Ergebnisse aus Beispiel 5.
Fig. 50 - 51 zeigen schematisch eine Vorbereitung einer Start-Nukleinsäurekette 1 .1
Fig. 52 - 54 zeigen schematisch bestimmte Ausführungsformen des Amplifikations-Verfahrens.
Zur Initierung der ersten Amplifikation wird ein erstes Nukleinsäurepolymer umfassend eine erste Zielsequenz M [und die zu M (revers) komplementäre Sequenz M'], wobei M in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte MPL, MS und MPR umfasst, bereitgestellt. In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Nukleinsäurepolymer die Start-Nukleinsäurekette. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein erstes Nukleinsäurepolymer die zu amplifizierende Nukleinsäurekette der ersten Amplifikation. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein erstes Nukleinsäurepolymer die zu amplifizierende Nukleinsäurekette der zweiten Amplifikation.
In dieser Ausführungsform umfasst die Zielsequenz M [und die zu M (revers) komplementäre Sequenz M'] in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte MPL, MS und MPR. In einer Ausführungsform umfasst das erste Nukleinsäurepolymer eine solche Zielsequenz M. In einerweiteren Ausführungsform umfasst die Start-Nukleinsäurekette eine solche Zielsequenz M. In einer anderen Ausführungsform umfasst die zu amplifizierende Nukleinsäurekette der ersten Amplifikation eine solche Zielsequenz M. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Amplifikations-Fragment 1 .1 der ersten Amplifikation eine solche Zielsequenz M. In einer anderen Ausführungsform umfasst die zu amplifizierende Nukleinsäurekette der zweiten Amplifikation eine solche Zielsequenz M. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Amplifikations-Fragment 2.1 der zweiten Amplifikation eine solche Zielsequenz M.
Ein hier dargestellte erster linker Oligonukleotidprimer PL1 ist (im Wesentlichen) identisch mit MPL der Zielsequenz M. Ein solcher PL1 ist eine besondere Ausführungsform des zweiten Oligonukleotid-Primers (P2.1 ).
Ein hier dargestellte erster rechter Oligonukleotidprimer PR1 ist eine besondere Ausführungsform des ersten Oligonukleotid-Primers (P1.1 ). PR1 umfasst in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte PCR und PMR, wobei PMR (entspricht in dieser Ausführungform dem esten Bereich des ersten Primers) die zu MPR (beispielsweisse ein Sequenzsegment der Zielsequenz M, welcher von der zu amplifizierenden Nukleinsäure umfasst wird) komplementäre [hybridisierende] Sequenz aufweist [im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann] und der Sequenzabschnitt PCR (in dieser Ausführungsform entspricht dieses Segment dem zweiten Bereich des ersten Primers) nicht an Zielsequenz M [oder eine in Bezug auf die Sequenz M in 3‘ unmittelbar an MPR anschließende Sequenz, beispielsweise einer ersten Start-Nukleinsäure ] binden kann, und wobei PR1 (insbesondere im Abschnitt PCR) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass PCR nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann
Ein hier dargestelltes Controller-Oligonukleotid CR umfasst in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte CSR, CPR und CCR in unmittelbarer Folge. Sequenzabschnitt CSR entspricht dem dritten Bereich des Controller-Oligonukleoties. Sequenzabschnitt CPR entspricht dem zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotides. Sequenzabschnitt CCR entspricht dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides.
Bei einer Ausführungsform ist Sequenzabschnitt CSR identisch zu einem Abschnitt von MS der Zielsequenz, welcher in 5‘ von MPR liegt [und bei Initiation der Polymerase von PR1 zuerst abgelesen wird, CSR also an das Polymerisationsprodukt des Primers PR1 (Verlängerungsprodukt des ersten Primers) binden kann], Bei einer Ausführungsform ist Sequenzabschnitt CPR komplementär zu PMR des ersten Primers (und identisch zu MPR der Zielsequenz M).
In einer Ausführungsform ist Sequenzabschnitt CCR (erste Abschnitt des Controller- Oligonukleotides) komplementär zu PCR (zweiter Bereich) des ersten Primers ist,
In einer Ausführungsform umfasst Controller-Oligonukleotid (CR) in seinem dritten Bereich (CSR) modifizierte Nukleotidbausteine, so dass CSR nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann
Ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt (PR1‘): Dieses erste Primer-Verlängerungsprodukt umfasst in 5‘-3‘-Orientierung neben den Sequenzbereichen PCR und PMR (des ersten Primer- Oligonukleotides) einen synthetisierten Bereich PSR, der im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz M in dem in 5‘ an MPR angrenzenden Bereich ist
Ein zweites Primer-Verängerungsprodukt (PL1‘ ): Dieses Primer-Verlängerungsprodukt umfasst neben dem Sequenzbereich MPL einen synthetisierten Bereich PSL, der im Wesentlichen identisch zur Zielsequenz M im an MPL in 3‘ angrenzenden Bereich ist,
PR1 ' und PL1 ' stellen zusammen das Amplifikations-Fragment 1.1 und dienen als Matrizen (Start- Nukleinsäure 2.1 ) für zweite Amplifikation.
Ein zweiter linker Oligonukleotidprimer PL2: Ein solcher PL2 ist eine besondere Ausführungsform des vierten Oligonukleotid-Primers (P4.1 ). Dieser PL2 ist in einer Ausführungsform einem ersten Sekundärprimerbindungsbereich MPL2 identisch. Dieser MPL2 ist in einer solchen Ausführungsform wird vom P4.1-Ext des zweiten Amplifikations-Fragment 2.1 umfasst. In einer anderen Ausführungsform kann MPL2 vom zweiten Primer-Verlängerungsprodukt umfasst werden. In einer weiteren Ausführungsform kann MPL2 von Zielsequenz M umfasst werden.
Ein zweiter rechter Oligonukleotidprimer PR2: Ein PR2 ist eine besondere Ausführungsform des dritten Oligonukleotid-Primers (P3.1 ) Dieser ist in einer Ausführungsform zu einem Bereich MPR2 komplementär. Dieser MPR2 kann in einer Ausführungsform vom zweiten Primer- Verlängerungsprodukt umfasst werden. In einer anderen Ausführungsform kann MPR2 vom vierten Primer-Verlängerungsprodukt umgasst werden. In einer weiteren Ausführungsform kann MPR2 von Zielsequenz M umfasst werden.
Die Anordnung von PL2 und PR2 kann unterschiedlich sein. In einer Ausführungsform werden MPL2 und MPR2 von Zielsequenz M umfasst werden. In einer weiteren Ausführungsform ist das 3‘-Ende von MPL2 [mindestens 20 Positionen] in 5‘ des 5‘-Endes von MPR2 angeordnet. In einer weiteren Ausführungsform ist insbesondere MPL2 mit MPL und /oder MPR2 mit MPR identisch.
In einer weiteren Ausführungsform können das dritte (PR2) und vierte (PL2) Primer- Oligonukleotide weitere Sequenz-Segmente umfassen (PCL2 bzw PCR2).
In der zweiten Amplifikation kann die Bindung des dritten (PR2) und des vierten (PL2) Primer- Oligonukleotide an entsprechende Komplementäre Stellen der ersten Amplifikations-Fragmente erfolgen, so dass diese Primer von der zweiten Polymerase im Rahmen der zweiten Amplifikation verlängert werden. Als Ergebnis der zweiten Amplifikation werden Primer-Verlängerungsprodukte des dritten und des vierten Primer-Oligonukleotides (P3.1 -Ext und P4.1-Ext) vermehrt. Es resultiert ein zweites Amplifikations-Fragment 2.1 .
Fig. 55 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen der Topographie von Komponenten des ersten Amplifikations-Systems.
Die Start-Nukleinsäure 1.1 umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: M1.Y, M1.5, M1 .4, M1.3, M1 .2, M1.1 , M1 .X.
Das erste Primer-Oligonukleotid umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: den ersten Bereich (P1.1 .1 ) und den zweiten Bereich (P1.1 .2).
Das Controller-Oligonukleotid (C1.1 ) umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: den dritten Bereich (C1 .1.3), den zweiten Bereich ( C1 .1.2), den ersten Bereich ( C.1.1 .1 );
Das Controller-Oligonukleotid (C1.2) umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: den dritten Bereich (C1 .2.3), den zweiten Bereich ( C1 .2.2), den ersten Bereich ( C.1.2.1 );
Das zweite Primer P2.1 umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P2.1.1
Das zweite Primer P2.2 umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P2.2.1
Das zweite Primer P2.3 umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P2.3.1
Das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1 -Ext) umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P1.1 E6, P1 .1 E5, P1 .1 E4, P1 .1 E3, P1 .1 E2, P1.1 E1.
Das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P2.1 E5, P2.1 E4, P2.1 E3, P2.1 E2, P2.1 E1.
Die während der ersten Amplifikation vorzugsweise erhaltenen Primer-Verlängerungsprodukte P1.1 -Ext und P2.1-Ext können komplementären Doppelstrang bilden und stellen zusammen das zweite Amplifikations-Fragment 1 .1 dar, welches als Start-Nukleinsäure 2.1 für die zweite Amplifikation dienen kann.
P1.1 .1 kann an M1.1 vorwiegend komplementär binden und von Polymerase verlängert werden. P2.1 .1 kann an P1.1 E1 komplementär binden und verlängert werden. P1 .1 -Ext und P2.1 -Ext stellen die zu amplifizierende Nukleinsäure dar, welche als Start-Nukleinsäure 2.1 für die zweite Amplifikation dient. P2.1 , P2.2. und P2.3 stellen Varianten des zweiten Primers dar und führen zu gleichen Amplifikations-Fragmenten.
Fig. 56 - 57 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen der Topographie des ersten und des zweiten Amplifikations-Systems:
Das dritte Primer-Oligonukleotid umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P3.1 .2, P3.1 .1 , wobei P3.1.2 nicht komplementär zu Start-Nukleinsäure 1.1 oder zu P2.1 -Ext ist. P3.1.1 ist im Wesentlichen komplementär zu P2.1 E1 des P2.1 -Ext. Das vierte Primer-Oligonukleotid umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P4.1.2, P4.1.1 , wobei P4.1.2 nicht komplementär zum komplementären Strang der Start-Nukleinsäure 1.1 oder zu P1 1 -Ext ist. P4.1 .1 ist im Wesentlichen komplementär zu P1.1 E1 des P1 1 -Ext.
Die während der zweiten Amplifikation vorzugsweise erhaltenen Primer-Verlängerungsprodukte P3.1 -Ext und P4.1-Ext können komplementären Doppelstrang bilden und stellen zusammen das zweite Amplifikations-Fragment 2.1 dar.
P3.1 -Ext umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P3.1 E7, P3.1 E6, P3.1 E5, P3.1 E4, P3.1 E3, P3.1 E2, P3.1 E1 . Die Segmente P3.1 .E5 bis P3.1 E3 sind in ihrer Sequenz identisch zu P1.1 E4 bis P1.1 E2.
P4.1 -Ext umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P4.1 E7, P4.1 E6, P43.1 E5, P4.1 E4, P4.1 E3, P43.1 E2, P4.1 E1. Die Segmente P4.1 E5 bis P4.1 E3 sind in ihrer Sequenz identisch zu P2.1 E4 bis P2.1 E2.
Fig. 57 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen des dritten Primers (P3.1 , P3.2, P3.3) und des vierten Primers (P4.1 , P4.2, P4.3), wobei das 3'-Segment des jeweiligen Primers verschoben sein kann in Bezug aufeinander.
Fig. 58 - 59 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen für Lokalisationsbereiche für Oligonukleotid-Sonden:
D1 - ist am 5'-Ende des P4.1-Ext lokalisiert. Daher können beispielsweise Primer mit Sondenfunktion verwendet werden, z.B. Scorpion-Primer, Lux-Primer, wobei Primer in ihren 3'Segmenten ähnlich wie P4.1 aufgebaut sind.
D4 - ist am 5'-Ende des P3.1-Ext lokalisiert. Daher können beispielsweise Primer mit Sondenfunktion verwendet werden, z.B. Scorpion-Primer, Lux-Primer, wobei Primer in ihren 3'Segmenten ähnlich wie P3.1 aufgebaut sind.
Bereiche D2 und D3 liegen in mittleren Segmenten des P3.1 -Ext bzw. P4.1 -Ext. Daher können hier beispielsweise Hybridisierung-Sonden (z.B. Molecular Beacons, Taqman-Sonden (5'-3'-Nuklease spaltbare Sonden oder 2-Oligonukleotid-Sonden mit FRET-Paaren) lokalisiert werden.
D2 Bereich eignet sich besonder gut für eine potenzielle Sonden-Lokalisierung (in P3.1-Ext bzw. in P4.1-Ext), da dieser Bereich nicht mit Controller-Oligonukleotid überlappt. Daher können Sonden besonders bei homogenen Assays in diesem Bereich verwendet werden. Dieser Bereich umfasst das 3'-Segment des dritten Primer-Verlängerungsproduktes. Sonden im Bereich D3 können ebenfalls sowohl für P3.1-Ext als auch für P4.1 -Ext bereitgestellt werden. Im bei realtiv hohen Konzentrationen von C1.2 (Controller, z.B. 0,5 mol/l bis 5 pmol/l, z.B. im Rahmen eines Homogenen Assays) muss aber brücksichtigt werden, dass solche Sonden ggf. mit Controller interagieren können bzw. vom Controller verdrängt werden können. Bei relativ geringen Konzentrationen von Controller (z.B. im Bereich weniger als 1 nmol/l), kann diese Interaktion mit Controller vernachläßigt werden (z.B. bei Verdünnung der ersten Amplifikation vor der zweiten Amplifikation).
Fig. 60 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen der Lokalisation von Sonden-
Segmenten, welche vorwiegend komplementär an das dritte (und ggf. das erste) Primer- Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext und P1 .1-Ext) binden können. Verschiedene Ausführungsformen zeigen, dass es mehrere Möglichkeiten für potenzielle Sondenlokalisationen gibt.
Fig. 61 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen der Lokalisation von Sonden-
Segmenten, welche vorwiegend komplementär an das vierte (und ggf. das zweite) Primer- Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext und P2.1-Ext) binden können. Verschiedene Ausführungsformen zeigen, dass es mehrere Möglichkeiten für potenzielle Sondenlokalisationen gibt.
Fig. 62 - 63 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen von Sonden:
Sonden mit Lokalisation in D1 : S3.1 , S3.2, S3.3. Die Sonden umfassen ein Fluoreszenzreporter (R) / Fluoreszenzquencher (Q) Paar, welche bei Hybridisierung an entsprechende Segmente von Primer-Verlängerungsprodukten (räumlicher Trennung von Reporter / Quencher) zur Zunahme des Signals führen. Sonde S3.1 und S3.3 können als Primer verlängert werden, so dass dabei Primer-Verlängerungsprodukte ausgehend von Primern mit Sondenfuntion entstehen (S3.1 -Ext) und S3.3.Ext in Fig. 63).
In Fig. 64 - 67 zwigt schematisch bestimmte Ausführungsformen von Oligonukleotid-Sonden dargestellt, wie weit verbreitet sind: S3.4 stellt eine 5'-3'-Nuklease spaltbare Sonde („Taqman Sonde“) dar. Diese Sonde kann nach ihrer Hybridiserung an das P3.1-Ext von einer Taq- Polymerase gespalten werden, wobei gleichzeitig P4.1 -Verlängerung stattfindet.
Sonde S3.6 stellt ein Sondensystem, bei welchen 2 Oligonukleotide an das P3.1-Ext binden können / müssen. Ein Oligonukleotid ist dabei die Sonde S3.6 mit Fluoreszenzreporter (R), die andere Sonde ist das Controller-Oligonukleotid C1.2, welches in seinem 5'-Bereich einen Donor- Fluorophor umfasst. Bei gleichzeitiger Bindung von beiden Oligonukleotiden an P3.1-Ext entsteht eine hinreichende räumliche Nähe (unter 25NT), so dass FRET erfolgen kann, was zum Signal führt.
Sonde S3.7 stellt schematisch eine Sonde mit selbstkomplementären Anteilen dar („Molecular Beacon“). Im Nicht gebundene Zustand wird das Signal vom Fluroreszenzreporter (R) durch Fluoreszenzquencher (Q) bei gewählten Reaktionsbedingungen bevorzugt gelöscht. Bei komplementärer Bindung erfolgt eine Entfaltung der Struktur, welche in räumlicher Separierung des R von Q führt, was in der Regel in Signal-Zunahme resultiert.
Fig. 68 - 71 zeigt schematisch bestimmte Ausführungsformen der Lokalisation einer Zielsequenzen 1 - 3 in der Start-Nukleinsäure 1 .1 , einem Amplifikations-Fragment 1.1 (P1 .1-Ext und P2.1 -Ext), sowie dem zweiten Amplifikationsfragment 2.1 (P3.1 -Ext und P4.1 -Ext).

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure (Fig.56), wobei:
• eine Probe, die ein erstes Nukleinsäurepolymer enthält umfassend eine erste Zielsequenz M1 [und die zu M1 (revers) komplementäre Sequenz M1 '], wobei M in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte M1 .5, M1 .4, M1 .3, M1 .2 und M1 .1 umfasst, in einem ersten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
• eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase, sowie Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäure polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren, insbesondere Magnesiumionen,
• ein erster (rechter) Oligonukleotidprimer P1 .1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 umfasst, wobei P1 .1 .1 eine zu M1 .1 komplementäre [hybridisierende] Sequenz aufweist [im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann] und der Sequenzabschnitt P1 .1 .2 nicht an M1 [oder eine in Bezug auf die Sequenz M1 in 3‘-Richtung unmittelbar an M1 .1 anschließende Sequenz] binden kann, und
wobei P1 .1 (insbesondere im Abschnitt P1 .1 .2) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass P1 .1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und
• ein zweiter (linker) Oligonukleotidprimer P2.1 , welcher (im Wesentlichen) identisch mit M1 .5 ist [und sequenzspezifisch die revers komplementäre Sequenz von M1 .5 auf dem Gegenstrang von M1 oder dem Verlängerungsprodukt von P1 .1 , P1 .1 -Ext, dort als P1 .1 E1 bezeichnet, binden kann];
• ein Controller-Oligonukleotid C1 .2, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte C1 .2.3, C1 .2.2 und C1 .2.1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C1 .2.3 identisch zu einem Abschnitt M1 .2 von M1 ist, welcher in 5‘-Richtung von M1 .1 liegt [und bei Initiation der Polymerase von P1 .1 zuerst abgelesen wird, C1 .2.3 also an das Polymerisationsprodukt des Primers P1 .1 -Ext binden kann], C1 .2.2 komplementär zu P1 .1 .1 (und identisch zu M1 .1 ) ist und C1 .2.1 komplementär zu P1 .1 .2 ist, und wobei C1 .2 in C1 .2.1 modifizierte Nukleotid bausteine umfasst, so dass C1 .2.1 nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann,
und wobei die Probe in einem zweiten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
c) ein dritter (rechter) Oligonukleotidprimer P3.1 , welcher am 3’ Terminus einen Sequenzabschnitt 3.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 3.1 .1 besteht], der (revers) komplementär zu M1 .1 von M1 ist [komplementär an P2.1 -Ext binden kann], d) ein vierter (linker) Oligonukleotidprimer P4.1 , welcher am 3’ Terminus einen Sequenzabschnitt 4.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 4.1 .1 besteht, der identisch / oder im Wesentlichen identisch zu M1 .5 von M1 ist [komplementär an P1 1 -Ext binden kann],
e) eine zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA- Polymerase, sowie ggf. Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäure polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid- triphosphate) und geeignete Kofaktoren.
2. Das Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 , wobei ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt P1 .1-Ext. erhalten wird, welches in 5‘-3‘-Orientierung neben den Sequenzbereichen P1 .1 .2 und P1 .1 .1 einen synthetisierten Bereich umfasst, der in 5‘- 3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte P1 .1 E4, P1.1 E3, P1 .1 E2 und P1 .1 E1 aufweist, wobei P1 .1 E4 zum Sequenzabschnitt M1 .2 der Zielsequenz M1 , P1 .1 E3 zu M1 .3, P1 .1 E2 zu M1 .4 und P1 .1 E1 zu M1 .5 im Wesentlichen komplementär ist, und ein zweites Primer- Verängerungsprodukt P2.1 -Ext erhalten wird, welches neben dem Sequenzbereich P2.1 .1 einen synthetisierten Bereich P2.1-Ext. umfasst, der im Wesentlichen identisch zur Zielsequenz M1 im an M1 .5 in 3‘-Richtung angrenzenden Bereich ist,
und wobei
die Reaktionsbedingungen des ersten Amplifikationsschrittes so gewählt sind, und/oder
die Längen und/oder die Schmelztemperaturen von P1 .1 .2 und ggf. M1 .4, M1 .3, M1 .2 und M1 .1 so gewählt sind,
dass P1 .1 -Ext mit M1 bzw. mit P2.1-Ext einen Doppelstrang bilden kann, und P1 .1-Ext mit C1 .2 einen Doppelstrang bilden kann und die Bildung des Doppelstranges aus P1 .1 -Ext mit C1 .2 gegenüber der Bildung des Doppelstrangs aus P1 1 -Ext mit P2.1-Ext bevorzugt ist.
3. Das Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 2, wobei
die Reaktionsbedingungen des ersten Amplifikationsschrittes so gewählt sind, und/oder die Längen und/oder die Schmelztemperaturen von P1 .1 .2 und ggf. M1 .4, M1 .3, M1 .2 und M1 .1 so gewählt sind,
dass sich in Abwesenheit des Controller-Oligonukleotides C1 .2 das erste Primer- Verlängerungsprodukt P1 .1 -Ext überhaupt nicht oder nicht wesentlich vom zweiten Primer- Verlängerungsprodukt P2.1-Ext trennt.
4. Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierten Nukleotidbausteine 2’-0-Alkylribonukleosidbausteine, insbesondere 2’-0- Methylribonukleosidbausteine, umfassen.
5. Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der erste
Amplifikationsschritt im Wesentlichen isotherm durchgeführt wird, insbesondere bei einer Temperatur im Bereich zwischen 20°C und 50°C.
6. Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der erste
Amplifikationsschritt so lange durchgeführt wird, bis P1 .1 -Ext in einer Kopienanzahl im Bereich von 10 bis 1 e12, insbesondere von 100 bis 1 e10, insbesondere von 1000 bis 1 e8 vorliegt.
7. Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei P3.1 und/oder P4.1 einen zweiten Bereich P3.1 .2 bzw. P4.1 .2 aufweisen, der sich an das 5'-Ende des Bereichs P3.1 .1 bzw. P4.1 .1 anschließt, wobei der zweite Bereich nicht komplementär zu P1 .1-Ext bzw. P2.1 -Ext ist.
8. Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei während des zweiten Amplifikationsschritts die Reaktionstemperatur zyklisch erhöht und erniedrigt wird, insbesondere zwischen einer Temperatur im Bereich zwischen 20°C und 75°C als tiefe Temperatur, und einer Temperatur zwischen 85 °C bis 105 °C gewechselt wird.
9. Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polymerase und die zweite Polymerase identisch sind.
10. Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
P1 .1 und P3.1 im Wesentlichen identisch sind; und/oder
P2.1 und P4.1 im Wesentlichen identisch sind.
1 1 . Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Amplifikation und die zweite Amplifikation im selben Reaktionsansatz durchgeführt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Polymerase, das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.1 ) und/oder das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.1 ) aktivierbar sind, und/oder das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) deaktivierbar ist.
13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Amplifikation in einem ersten Reaktionsansatz und die zweite Amplifikation in einem zweiten Reaktionsansatz durchgeführt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Aliquot des ersten Reaktionsansatz oder der vollständige erste Reaktionsansatz in den zweiten Reaktionsansatz gegeben wird.
15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) einen vierten Bereich umfasst, der sequenzspezifisch an das dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) binden kann.
16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Primer-Oligonukleotid (P1 .1 ) im zweiten Bereich eine Modifikation oder mehrere Modifikationen aufweist, insbesondere unmittelbar im Anschluss an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids, welche die erste Polymerase am zweiten Bereich stoppt.
17. Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Probe weiterhin mit einem ersten Sonden-Oligonukleotid in Kontakt gebracht wird, welches:
a. einen Sequenzabschnitt umfasst, welcher
i. mit einer auf den Sequenzabschnitten M1 .2, M1 .3 und M1 .4 gelegenen Sequenz von M1 identisch oder
ii. zu einer auf den Sequenzabschnitten M1 .3 und M1 .4 gelegenen Sequenz von M1 komplementär ist,
b. an einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist, der
i. mit einem zweiten an das erste Sonden-Oligonukleotid ein Donor- Quencher-Paar oder ein FRET-Paar bildet oder
ii. mit einem in hinreichender Nähe an die Bindungsstelle des ersten Sonden- Oligonukleotids bindungsfähigen zweiten Sonden-Oligonukleotids verbundenen Fluoreszenzfarbstoff ein Donor-Quencher-Paar oder ein FRET-Paar bildet.
18. Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, wobei:
a) eine Probe, die ein erstes Nukleinsäurepolymer enthält umfassend eine erste Zielsequenz M1 , wobei M1 in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte M1 .5, M1 .4, M1 .3, M1 .2 und M1 .1 umfasst, in einem ersten Amplifikationsschritt mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird: b) eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA- Polymerase, sowie Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase, c) ein erster (rechter) Oligonukleotidprimer P1 .1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 umfasst, wobei P1 .1 .1 eine zu M1 .1 komplementäre [hybridisierende] Sequenz aufweist und der Sequenzabschnitt P1 .1 .2 nicht an M1 binden kann, und wobei P1 .1 (insbesondere im Abschnitt P1 .1 .2) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass P1 .1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und
d) ein zweiter (linker) Oligonukleotidprimer P2.1 , welcher (im Wesentlichen) identisch mit M1 .5 ist;
e) ein Controller-Oligonukleotid C1 .2, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte C1 .2.3, C1 .2.2 und C1 .2.1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C1 .2.3 identisch zu einem Abschnitt M1 .2 von M1 ist, welcher in 5‘-Richtung von M1 .1 liegt, C1 .2.2 komplementär zu P1 .1 .1 (und identisch zu M1 .1 ) ist und C1 .2.1 komplementär zu P1 .1 .2 ist,
und wobei C1 .2 in C1 .2.1 modifizierte Nukleotid bausteine umfasst, so dass C1 .2.1 nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann,
wobei die Probe weiterhin mit einem ersten Sonden-Oligonukleotid in Kontakt gebracht wird, welches:
a. einen Sequenzabschnitt umfasst, welcher
i. mit einer auf den Sequenzabschnitten M1 .2, M1 .3 und M1 .4 gelegenen Sequenz von M1 identisch oder
ii. zu einer auf den Sequenzabschnitten M1 .3 und M1 .4 gelegenen Sequenz von M1 komplementär ist,
b. an einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist, der
i. mit einem zweiten an das erste Sonden-Oligonukleotid ein Donor- Quencher-Paar oder ein FRET-Paar bildet oder
ii. mit einem in hinreichender Nähe an die Bindungsstelle des ersten Sonden- Oligonukleotids bindungsfähigen zweiten Sonden-Oligonukleotids verbundenen Fluoreszenzfarbstoff ein Donor-Quencher-Paar oder ein FRET-Paar bildet.
19. Das Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei der Sequenzabschnitt des ersten Sonden-Oligonukleotides mit P1 .1 , P2.1 , P3.1 und P4.1 sowie mit C1 .2 unter den Reaktionsbedingungen des zweiten Amplifikationsschritts nicht hybridisiert.
20. Ein Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend:
a) ein erster (rechter) Oligonukleotidprimer P1 .1 , der in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 umfasst, wobei P1 .1 .1 an eine Primerbindungsstelle M1 .1 einer genomischen Sequenz M1 eines eukaryoten Organismus oder eines pathogenen Bakteriums, insbesondere eines Säugetiers, ganz inbesondere an eine menschliche Zielsequenz, binden kann, wobei M1 in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte M1 .5, M1 .4, M1 .3, M1 .2 und M1 .1 umfasst, und der Sequenzabschnitt P1 .1 .2 nicht an M1 [oder eine in Bezug auf die Sequenz M1 in 3‘ unmittelbar an M 1 , 1 anschließende Sequenz] binden kann, und
wobei P1 .1 (insbesondere im Abschnitt P1 .1 .2) modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass P1 .1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität einer ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; und
b) ein zweiter (linker) Oligonukleotidprimer P2.1 , welcher (im Wesentlichen) identisch mit M1 .5 ist [und sequenzspezifisch die revers komplementäre Sequenz von M1 .5 auf dem Gegenstrang von M1 oder dem Verlängerungsprodukt von P1 .1 , P1 .1 -Ext, dort als P1 .1 E1 bezeichnet, binden kann];
c) ein Controller-Oligonukleotid C1 .2, das in 5‘-3‘-Orientierung die Sequenzabschnitte C1 .2.3, C1 .2.2 und C1 .2.1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C1 .2.3 identisch zu einem Abschnitt M1 .2 von M1 ist, welcher in 5‘ von M1 .1 liegt [und bei Initiation der Polymerase von P1 .1 zuerst abgelesen wird, C1 .2.3 also an das Polymerisationsprodukt des Primers P1 .1 -Ext binden kann], C1 .2.2 komplementär zu P1 .1 .1 (und identisch zu M1 .1 ) ist und C1 .2.1 komplementär zu P1 .1 .2 ist, wobei C1 .2 in C1 .2.1 modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass C1 .2.1 nicht als Matrize für die Aktivität einer ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann,
sowie
f) einen dritten (rechter) Oligonukleotidprimer P3.1 , welcher am 3’ Terminus einen Sequenzabschnitt 3.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 3.1 .1 besteht], der (revers) komplementär zu M1 .1 von M1 ist [komplementär an P2.1 -Ext binden kann], g) einen vierten (linker) Oligonukleotidprimer P4.1 , welcher am 3’ Terminus einen Sequenzabschnitt 4.1 .1 umfasst [oder im Wesentlichen aus 4.1 .1 besteht, der identisch / oder im Wesentlichen identisch zu M1 .5 von M1 ist [komplementär an P1 1 -Ext binden kann],
und optional weiterhin umfassend eine zweite matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase, sowie optional Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid- triphosphate) und geeignete Kofaktoren, insbesondere eine thermophile matritzenabhängige Polymerase, insbesondere eine thermophile matritzenabhängige Polymerase mit 5'-3'- Exonukleaseaktivität;
und/oder
umfassend ein erstes Sonden-Oligonukleotid, welches: a. einen Sequenzabschnitt umfasst, welcher
i. mit einer auf den Sequenzabschnitten M1 .2, M1 .3 und M1 .4 gelegenen Sequenz von M1 identisch oder
ii. zu einer auf den Sequenzabschnitten M1 .3 und M1 .4 gelegenen Sequenz von M1 komplementär ist,
und
b. an einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist, der
i. mit einem zweiten an das erste Sonden-Oligonukleotid ein Donor- Quencher-Paar oder ein FRET-Paar bildet oder
ii. mit einem in hinreichender Nähe an die Bindungsstelle des ersten Sonden-
Oligonukleotids bindungsfähigen zweiten Sonden-Oligonukleotids verbundenen Fluoreszenzfarbstoff ein Donor-Quencher-Paar oder ein
FRET-Paar bildet.
21 . Der Kit nach Anspruch 20, weiterhin umfassend eine erste matrizenabhängige
Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase, sowie optional Substrate der DNA-Polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren, insbesondere eine mesophile matritzenabhängige Polymerase, insbesondere eine mesophile matritzenabhängige Polymerase ohne 5'-3'-Exonukleaseaktivität.
22. Der Kit nach einem der Ansprüche 20 oder 21 , wobei die modifizierten Nukleotidbausteine
2’-0-Alkylribonukleosidbausteine, insbesondere 2’-0-Methylribonukleosidbausteine, umfassen.
EP19712690.7A 2018-02-26 2019-02-26 Agverfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität Withdrawn EP3759248A1 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18158722 2018-02-26
EP18159337 2018-02-28
DE102018001586.7A DE102018001586A1 (de) 2018-02-28 2018-02-28 Verfahren zur Detektion der Amplifikation einer Nukleinsäure mit verbesserter Spezifität
EP18195312.6A EP3530754A1 (de) 2018-02-26 2018-09-18 Verfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität
PCT/EP2019/054767 WO2019162530A1 (de) 2018-02-26 2019-02-26 Agverfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3759248A1 true EP3759248A1 (de) 2021-01-06

Family

ID=67687045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP19712690.7A Withdrawn EP3759248A1 (de) 2018-02-26 2019-02-26 Agverfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP3759248A1 (de)
JP (1) JP2021514637A (de)
CN (1) CN112074612A (de)
WO (1) WO2019162530A1 (de)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US20040091923A1 (en) * 1993-07-23 2004-05-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Linked linear amplification of nucleic acids
US5882857A (en) * 1995-06-07 1999-03-16 Behringwerke Ag Internal positive controls for nucleic acid amplification
WO2002018616A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Hitachi Chemical Co., Ltd. Adjusting the efficiency of nucleic acid template amplification by attenuated pcr with template-mimic oligonucleotides
US8455197B2 (en) * 2007-10-04 2013-06-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Nucleic acid amplification
CN104593483B (zh) * 2009-08-25 2018-04-20 伊鲁米那股份有限公司 选择和扩增多核苷酸的方法
DK2633071T3 (en) * 2010-10-27 2017-01-30 Harvard College COMPOSITIONS OF "MAINTENANCE" PRIMER DUPLEXES AND METHODS OF USE
US9115394B2 (en) * 2011-12-22 2015-08-25 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and reagents for reducing non-specific amplification
JP6804462B2 (ja) * 2014-12-15 2020-12-23 セファイド 指数関数の底が２より大きい核酸増幅

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019162530A1 (de) 2019-08-29
CN112074612A (zh) 2020-12-11
JP2021514637A (ja) 2021-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3504338B1 (de) Verfahren zur amplifikation von nukleinsäuren und verwendung eines kits zu dessen durchführung
DE60121750T2 (de) Hybridisierungsprobe und methode zum schnellen nachweis und zur schnellen unterscheidung von sequenzen
DE60009323T2 (de) Methoden und zusammensetzungen zur linearen isothermalen amplifikation von polynukleotidsequenzen
DE60116651T2 (de) Methode zur amplifizierung und möglicher charakterisierung von nukleinsäuren
DE69829328T2 (de) Strangverdrängungsamplifikation von RNA
DE69838950T2 (de) Multiplex Strangverdrämgungsamplifizierung
CN104862385B (zh) 等温核酸扩增
DE602006000944T2 (de) Verfahren zur Genotypisierung durch Schmelztemperaturabhängigkeit
DE10150121B4 (de) Echtzeitdetektion von DNA-Amplifikationsprodukten
US20090068643A1 (en) Dual Function Primers for Amplifying DNA and Methods of Use
WO2012146377A1 (de) Methoden und komponenten zur detektion von nukleinsäureketten
CA3086320A1 (en) Improvements in or relating to amplification of nucleic acids
DE10253966B4 (de) Microarray-basiertes Verfahren zur Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren in einem kontinuierlichen Prozess
WO2019162529A1 (de) Verfahren zur primer-verlängerungsreaktion mit verbesserter spezifität
AU2017277304A1 (en) Thermostable polymerase inhibitor compositions and methods
EP3759252A1 (de) Verfahren zur selektiven amplifikation von nukleinsäuren und kit zu dessen durchführung
EP3759248A1 (de) Agverfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität
WO2019166586A1 (de) Verfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität
EP3530755B1 (de) Verfahren zum anzeigen des fortschrittes der amplifikation von nukleinsäuren und kit zu dessen durchführung
JP2007319096A (ja) エンドヌクレアーゼのニッキング活性を利用した核酸増幅法
DE102018001586A1 (de) Verfahren zur Detektion der Amplifikation einer Nukleinsäure mit verbesserter Spezifität
DE102018001639A1 (de) Verfahren zur Primer-Verlängerungsreaktion mit verbesserter Spezifität
EP4036248A1 (de) Verfahren zur bibliotheksvorbereitung in der next-generation-sequenzierung durch enzymatische dna-fragmentierung
DE102005048503B4 (de) Verfahren zur Steuerung der abschnittsweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge
EP3856931A1 (de) Allelspezifische konstruktion von kooperativen primern für verbesserte genotypisierung von nukleinsäurevarianten

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20200916

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20230901