DE102018001639A1

DE102018001639A1 - Verfahren zur Primer-Verlängerungsreaktion mit verbesserter Spezifität

Info

Publication number: DE102018001639A1
Application number: DE102018001639.1A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: AGCT GmbH
Current assignee: AGCT GmbH
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2019-08-29

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extension eines Primer-Oligonukleotids mit verbesserter Spezifität unter Verwendung eines besonderen Primer-Oligonukleotid und eines Controller-Nukleotid, wobei das Controller-Oligonukleotid in sequenzspezifischer Weise eine Strangöffnung im einem Doppelstrang aus Extensionsprodukt und Matrize ermöglicht. Die Erfindung betrifft weiterhin ein entsprechendes Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur matrizenabhängigen Primer-Verlängerungsreaktion mittels einer matrizenabhängigen Polymerase. Bei dem Verfahren können Primer-Verlängerungsprodukte hergestellt werden, welche in einer Amplifikation von Nukleinsäuren eingesetzt werden können. Das Verfahren kann somit zur Verbesserung der Spezifität von Analysen umfassend einen Primer-Verlängerungs-Schritt beitragen.
Hintergrund
Die Primerverlängerungsreaktion spielt bei sehr vielen genetischen Analysen eine Rolle, z.B. in Amplifikationsverfahren, wie PCR, in Einzelschritten der Analysen. Es wird eine enzymatische Primerverlängerung mittels einer Polymerase durchgeführt, wobei ein synthetisierter Strang gebildet wird. In vielen Verfahren wird dieser Strang durch verschiedene Mittel sequenzunabhängig von der Matrize abgelöst und in weiteren Verfahrensschritten verwendet. Zu solchen Mitteln zählen beispielsweise Temperatur, denaturierende Agenzien wie Laugen oder Formamid. Weiterhin können Stränge mittels Enzyme unter Aufwendung von chemischen Energiequellen, wie dNTP oder ATP, getrennt werden. Dazu zählen Helicasen oder Polymerasen mit strangverdrängender Wirkung. Solche Trennungen erfolgen vorwiegend sequenzunspezifisch.
Viele Reaktionen in genetischen Analysen benötigen einzelstränge oder doppelsträngige, komplementäre Zustände von Nukleinsäureketten oder Nukleinsäurekettensegmenten, um bestimmte Effekte zu erzielen. Ein Wechsel zwischen der einzelsträngiger Form und der doppelsträngiger Form wird häufig zur An/Aus-Schaltung einer Reaktion oder der Herbeiführung einer Funktionalität benötigt. Die Bindung von gewissen Elementen der Reaktionen (z.B. Primer/Matrize oder Sonde/Matrize, etc.) hängen von der Herbeiführung einer dauerhaften oder vorübergehenden sequenzspezifischen Bindung von Komponenten aneinander ab. Diese Bindung erfolgt in vielen Fällen unter Ausbildung von Wasserstoffbindungen unter komplementärer Strängen (bei Watson-Crick-Basenpaarung). Dabei kann ein Strang an einer bestimmten Position zu einem konkreten Zeitpunkt nur mit einem anderen Strang eine Bindung einhergehen. Ein dritter Strang ist somit zu diesem Zeitpunkt von der Interaktion ausgeschlossen. Somit kann die Verfügbarkeit von freien komplementären Positionen für potenzielle Interaktionen mit anderen Reaktionskomponenten in vielen Verfahren eine Rolle spielen. Weiterhin kann die Häufigkeit und die Dauer der Bindung von Reaktionspartnern aneinander via komplementäre Positionen eine Rolle für die Geschwindigkeit oder Ausbeute eines gewissen Reaktionsschrittes spielen. Viele Reaktionen im Feld molekulare Analysen basieren auf Herbeiführung von mehr oder weniger stabiler Bindungen zwischen einzelnen Reaktionskomponenten. Die dabei erzielten Effekte können Einfluss auf Spezifität von Reaktionen haben.
Die Primerverlängerung wird in vielen genetischen Analysen verwendet. Dabei spielt das Ergebnis eines korrekten Primings (Ausbildung eines Primer-Matrizen-Komplexes) als auch Fortführung der matrizenabhängigen enzymatischen Synthese mittels einer Polymerase eine Rolle. Mit der Erstellung des Produktes einer sequenzspezifischen Primerverlängerungsreaktion (Primerverlängerungsprodukt) ist die Synthese-Phase abgeschlossen. Nach Abschluss der Primerverlängerung kann das Primerverlängerungsprodukt von der Matrize abgelöst werden und in anderen Verfahrensschritten verwendet werden.
In jedem dieser Schritte können Fehler oder Abweichungen stattfinden, welche die Spezifität der jeweiligen Verfahren beeinflussen können und schließlich auch bestimmte Grenzen der Einsetzbarkeit von jeweiligen Verfahren bedeuten. Viele Beispiele dafür sind bekannt, z.B. falsches Priming, polymerasebedingte Fehler, fehlerhafte Bindung von Sonden, etc..
Genetische Analyseverfahren müssen häufig unter mehreren Varianten einer bekannten Sequenz unterscheiden (z.B. Allel-spezifische Nachweismethoden oder Mutations-Analyse in Gegenwart von Wildtyp-Sequenzen). Die Anwesenheit von mehreren Sequenzen im gleichen Reaktionsansatz führt häufig dazu, dass es zu Interferenzen (ungewollten Interaktionen bzw. parallel laufenden Nebenreaktionen, etc.) zwischen den Sequenzen kommen kann. Solche Interferenzen können zu unterschiedlichen Zeiten eines Verfahrens entstehen, angefangen bei der Herstellung der ersten Kopien bis hin zur Detektion. Im Allgemeinen können Interferenzen zwischen sehr ähnlichen Sequenzen zu Fehlinterpretation von Ergebnissen führen. Eine hohe Spezifität bei solchen Verfahren spielt daher eine große Rolle.
Besonders bei geringfügigen genetischen Unterschieden, wie Einzelnukleotid-Veränderungen (SNV) und kurzen Insertionen/Deletionen (2 - 10 Nukleotide) wäre es von Vorteil, wenn die Spezifität von primerverlängerungsabhängigen Verfahren bzw. Verfahrensschritten verbessert werden kann.
Dabei kann sowohl die Synthese des Primerverlängerungsproduktes an sich als auch die Bereitstellung des synthetisierten Primer-Verlängerungsproduktes zu einer weiteren Verwendung verbessert werden.
Die Primerverlängerungsreaktion wird zur Zeit in den meisten Fällen durch Einstellung der Primerbindung (z.B. durch Verwendung optimaler Reaktionstemperaturen, Pufferbedingungen und Komplementarität der Primer zu einer Primerbindungsstelle) optimiert. Einige Tools wurden zur Verbesserung der Primerbindung entwickelt. Diese beschränken sich lediglich auf die Verbesserung der Primerbindung und gehen nicht über die Primerlänge hinaus. Unter Verwendung einer Polymerase mit einer 3'-Exonuklease-Aktivität (Polymerasen mit proofreading) kann man eine weitere Verbesserung der Qualität des Syntheseergebnisses erreichen. Dabei wird das 3'-Ende des synthetisierten Stranges von mit der Polymerase assoziierten Exonuklease überprüft.
Bis auf diese Phasen der Primerverlängerungsreaktion (Priming und proofreading durch die Polymerase) wird die Primerverlängerungsreaktion in den meisten Fällen gar nicht weiter auf ihre Qualität überprüft.
Insbesondere für Spurenanalysen in Anwesenheit starker Interferenzen (z.B. Nachweis von ctDNA in liquid biopsy-Verfahren) stoßen heutige Verfahren an ihre Grenzen, was die Steigerung der Spezifität von Analysen erschwert bzw. unmöglich macht.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren zur Verbesserung der Spezifität bei genetischen Analyseverfahren bereitzustellen, welche eine Primerverlängerungsreaktion umfassen oder voraussetzen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Komponenten zur Verbesserung der Spezifität insbesondere in Verfahren bereitzustellen, welche eine enzymatische, matrizenabhängige Synthese bei einer Primerverlängerungsreaktion umfassen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Komponenten zur Verbesserung der Spezifität bei Verfahren bereitzustellen, welche eine Ablösung bzw. Trennung eines synthetisierten Nukleinsäurestranges von seiner Matrize umfassen.
Es ist insbesondere weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Komponenten für eine sequenzspezifische bzw. selektive Trennung eines synthetisierten Nukleinsäurestrangs von seiner Matrize bei einer matrizenabhängigen Primerverlängerungsreaktion bereitzustellen, besonders bei gleichzeitiger Anwesenheit sehr ähnlichen Matrizensequenzen.
Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche erfüllt. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen und der folgenden Beschreibung aufgeführt.
Beschreibung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt wird ein Verfahren zur Verlängerung (Extension) eines Primer-Oligonukleotids zur Verfügung gestellt. Das Verfahren zur spezifischen Verlängerung eines Primer-Oligonukleotids, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellung einer Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (Matrizenstrang) (M1)
b) Hybridisieren eines Primer-Oligonukleotids (P1.1) an ein Segment umfassend einen Anteil der Zielsequenz (Primer-Bindungsstelle) der bereitgestellten Nukleinsäurekette (M1), wobei das Primer-Oligonukleotid (P1.1) folgende Bereiche umfasst:
- einen ersten Bereich, der im Wesentlichen sequenzspezifisch, an ein komplementäres Segment (Primer-Bindungsstelle) umfassend einen Anteil der Zielsequenz innerhalb einer bereitgestellten Nukleinsäurekette (M1) binden kann,
- einen zweiten Bereich (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid (C1.1) gebunden werden kann;
c) Verlängerung des Primer-Oligonukleotids (P.1.1) durch eine matrizenabhängige Polymerase unter Erhalt eines Primer-Verlängerungsprodukts (Primer-Extensionsprodukt, P1.1-Ext), welches neben dem Primer-Oligonukleotid (P1.1) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zu Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (M1) ist, wobei das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) und Nukleinsäurekette (M1) unter Reaktionsbedinungen einen Doppelstrang bilden;
d) Bindung eines Controller-Oligonukleotids (C1.1) an das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) folgende Bereiche umfasst:
- einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) binden kann,
- einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des Primer-Oligonukleotid (P1.1) komplementär ist, und
- einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) im Wesentlichen komplementär ist; und
wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des Primer-Oligonukleotids (P1.1) dient, und das Controller-Oligonukleotid (C1.1) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an das Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) unter Verdrängung von komplementären Segmenten der Nukleinsäurekette (M1) binden kann.

Bei dem zweiten Bereich des Primer-Oligonukleotids handelt es sich insbesondere um einen Polynukleotidschwanz.
Der Begriff „im Wesentlichen sequenzspezifisch“ bedeutet im Sinne der Erfindung insbesondere, dass die zueinander komplementären Bereiche des Primer-Oligonukleotids und der zu amplifizierenden Nukleinsäure nicht mehr als 5, 4, 3, 2, oder 1 Mismatches aufweisen.
Der Begriff „im Wesentlichen komplementär“ bedeutet im Sinne der Erfindung insbesondere, dass die zueinander komplementären Bereiche von Nukleinsäuren nicht mehr als 5, 4, 3, 2, oder 1 Mismatches aufweisen.
Die oben genannte Schritte können in einem Ansatz oder in getrennten Ansätzen ausgeführt werden. Wenn die Vorgänge in einem Ansatz durchgeführt werden sollen, so können diese unter gleichen Bedingungen, z.B. isothermal, oder unter unterschiedlichen Bedingungen, z.B. beim Thermocycling, ausgeführt werden. In bestimmten Ausführungsformen sind Primer-Oligonukleotide und Controller-Oligonukleotid zu Beginn der Reaktion präsent. Eine sequenzielle Zugabe einzelner Reagenzien ist allerdings auch möglich.
Ebenfalls sind Kombinationen mit anderen Amplifikationsverfahren möglich, z.B. mit PCR, wobei die PCR beispielsweise erst über 1 bis 10 Zyklen durchgeführt und anschließend beispielsweise unter isothermalen Bedingungen weitergearbeitet wird.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der erste Bereich des Primer-Oligonukleotids vollständig sequenzspezifisch, d.h. insbesondere ohne Mismatches, an die zu amplifizierenden Nukleinsäure binden kann.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der zweite Bereich (Überhang) des Primer-Oligonukleotids von einer für die Primerextension verwendeten Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Verfahren weiterhin folgenden Schritt umfasst: Hybridisieren eines Block-Oligonukleotids an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure, der sich in 5'-Richtung des Bereichs befindet, der vom ersten Bereich (Primerbindungsstelle) des Primer-Oligonukleotids gebunden wird, wobei das Block-Oligonukleotid dazu ausgebildet ist, die Extension des Primer-Oligonukleotids am gebunden Bereich zu blockieren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das Block-Oligonukleotid durch eine Länge von etwa 15 Nukleotiden bis etwa 60 Nukleotiden gekennzeichnet ist, und optional Modifikationen (z.B. PTO oder LNA (locked nucleic acid, 2'O, 4'C methylenverbrückte Ribosylreste im Polymer) oder PNA (peptide nucleic acid, N-(2-Aminoethyl) glycine-Rückgrat) aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids zum dem Teil des synthetisierten Bereiches des Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär ist, der sich unmittelbar an den Primer-Oligonukleotidanteil des Primer-Verlängerungsproduktes anschließt. Vorteilhafterweise wird dadurch die sequenzspezifische Verdrängung der zu amplifizierenden Nukleinsäure verbessert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist der Teil des synthetisierten Bereiches, der im Wesentlichen komplementär zum dritten Bereich des Controller-Nukleotids ist, eine Länge im Bereich von 5 Nukleotiden bis 50 Nukleotiden auf.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist der Teil des synthetisierten Bereiches, der im Wesentlichen komplementär zum dritten Bereich des Controller-Nukleotids ist, eine Länge im Bereich von 3 Nukleotide bis 70 Nukleotide auf, bevorzugt 5 Nukleotide bis 50 Nukleotide, bevorzugter 5 Nukleotide bis 50 Nukleotide, weiter bevorzugt, 5 Nukleotide bis 30 Nukleotide, weiter bevorzugt 5 Nukleotide bis 20 Nukleotide.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Verfahren weiterhin folgenden Schritt umfasst: Hybridisierung einer Sonde an einen Bereich des Primer-Extensionsproduktes, der nicht von dem Controller-Oligonukleotid gebunden wird .
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Verfahren im Wesentlichen isothermal durchgeführt wird.
Der Begriff „im Wesentlichen isothermal“ bedeutet im Sinne der vorliegenden Beschreibung insbesondere, dass die Reaktionstemperatur innerhalb eines Temperaturbereichs von 10k Temperaturdifferenz zwischen der höchsten und der niedrigsten Temperatur durchgeführt wird.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Zielsequenz einer Nukleinsäure eine Länge im Bereich von etwa 20 Nukleotiden bis etwa 300 Nukleotiden aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Primer-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Controller-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 10 Nukleotiden aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die gewählten Reaktionsbedingungen eine Reaktionstemperatur im Bereich von 50 °C bis 70 °C umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Primer-Oligonukleotid im zweiten Bereich eine Modifikation oder mehrere Modifikationen aufweist, insbesondere unmittelbar im Anschluss an den ersten Bereich des Primer-Oligonukleotid, welche die verwendete Polymerase am zweiten Bereich stoppt. Vorteilhafterweise wird dadurch nur der erste Bereich des Primer-Oligonukleotids ggf. in späteren Verfahrensschritten amplifiziert.
Dies kann bevorzugt durch Verwendung von Nukleotid-Modifikationen erreicht werden, welche zwar eine komplementäre Bindung mit dem Primer-Verlängerungsprodukt eingehen können, nicht aber von der Polymerase als Matrize akzeptiert werden. Beispiele für solche Nukleotid-Modifikationen stellen Nukleotid-Verbindungen mit modifizierten Phosphat-Zucker-Rückgrat-Anteilen, z.B. 2'-O-Alkyl-RNA Modifikationen (z.B. 2'-OMe), LNA-Modifikationen oder Morpholino-Modifikationen dar. Die Anwesenheit solcher Modifikationen in einem Strang hindert eine DNA-abhängige Polymerase beim Ablesen eines solchen Stranges. Die Anzahl von solchen Modifikationen kann unterschiedlich groß sein, in der Regel können wenige Modifikationen (zwischen 1 und 20) hinreichend sein, um eine Polymerase am Ablesen eines solchen Stranges zu hindern. Solche Nukleotid-Modifikationen können beispielsweise an oder um die Bindungsstelle des Primer-Oligonukleotides an das Controller-Oligonukleotid verwendet werden und/oder als Bestandteile des zweiten Bereichs des Primer-Oligonukleotides.
Dank der Verwendung solcher Modifikationen kommt es zu einer lokalen Hinderung der Polymerasefunktion, so dass bestimmte Segmente der verwendeten Strukturen nicht durch die Polymerase kopiert werden können und vorwiegend einzelsträngig bleiben. In dieser einzelsträngigen Form können sie weitere Reaktionskomponenten binden und somit ihre Funktion ausführen.
Nachfolgend sind einige Aspekte der Erfindung zusammengefasst:

1. Das Verfahren zur spezifischen Verlängerung eines Primer-Oligonukleotids, umfassend die Schritte:
1. a) Bereitstellung einer Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (Matrizenstrang) (M1)
2. b) Hybridisieren eines Primer-Oligonukleotids (P1.1) an ein Segment umfassend einen Anteil der Zielsequenz (Primer-Bindungsstelle) der bereitgestellten Nukleinsäurekette (M1), wobei das Primer-Oligonukleotid (P1.1) folgende Bereiche umfasst:
  - einen ersten Bereich, der im Wesentlichen sequenzspezifisch, an ein komplementäres Segment (Primer-Bindungsstelle) umfassend einen Anteil der Zielsequenz innerhalb einer bereitgestellten Nukleinsäurekette (M1) binden kann,
  - einen zweiten Bereich (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid (C1.1) gebunden werden kann;
3. c) Verlängerung des Primer-Oligonukleotids (P.1.1) durch eine matrizenabhängige Polymerase unter Erhalt eines Primer-Verlängerungsprodukts (Primer-Extensionsprodukt, P1.1-Ext), welches neben dem Primer-Oligonukleotid (P1.1) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zu Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (M1) ist, wobei das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) und Nukleinsäurekette (M1) unter Reaktionsbedinungen einen Doppelstrang bilden;
4. d) Bindung eines Controller-Oligonukleotids (C1.1) an das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) folgende Bereiche umfasst:
  - einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) binden kann,
  - einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des Primer-Oligonukleotid (P1.1) komplementär ist, und
  - einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) im Wesentlichen komplementär ist; und
  wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des Primer-Oligonukleotids (P1.1) dient, und das Controller-Oligonukleotid (C1.1) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an das Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) unter Verdrängung von komplementären Segmenten der Nukleinsäurekette (M1) binden kann.

In einer Ausführungsform umfasst eine Zielsequenz einen polymorphen Lokus, welcher mindestens eine Nukleotid-Position umfasst, welche mindestens zwei charakteristische Sequenz-Varianten bei einer Zielsequenz umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Zielsequenz einen polymorphen Lokus, welcher mindestens zwei Nukleotid-Positionen umfasst, welche mindestens zwei charakteristische Sequenz-Varianten bei einer Zielsequenz umfassen.
In einer Ausführungsform umfasst eine Zielsequenz einen polymorphen Lokus, welcher eine Länge zwischen ein Nukleotid bis 100 Nukleotiden umfasst, wobei solcher Lokus mindestens zwei charakteristische Sequenz-Varianten einer Zielsequenz umfasst.
In einer Ausführungsform in Schritt (1) werden mindestens zwei Matrizenstränge bereitgestellt, wobei jeder Matrizenstrang eine Variante einer Zielsequenz mit einer spezifischen und charakteristischen Sequenzvariante eines polymorphen Lokus umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform in Schritt (1) werden mindestens zwei Matrizenstränge bereitgestellt, wobei jeder Matrizenstrng eine eigne Zielsequenz umfasst und diese Zielsequenzen der ersten und einer weiteren Start-Nukleinsäurekette unterschiedlich sind.

2. Verfahren nach Nr. 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Bereich (Überhang) des Primer-Oligonukleotids (P1.1) von einer für die Primerverlängerung verwendeten Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt.
3. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, wobei die Primer-Verlängerung des an die Nukleinsäurekette (M1) hybridisierten Primers (P1.1) durch eine matrizenabhängige Polymerase in Anwesenheit des Controller-Oligonukleotides (C1.1) im gleichen Reaktionsansatz erfolgt.
4. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, wobei das gebildete Primer-Verlängerungsprodukt von der Nukleinsäurekette (M1) unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotides (C1.1) getrennt wird.
5. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, wobei Schritte (b) bis (d) mindestens einmal wiederholt werden.
6. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren weiterhin folgenden Schritt umfasst:
- Hybridisieren eines Block-Oligonukleotids (B1.1) an ein Sequenzsegment der Nukleinsäurekette (M1), das sich in 5'-Richtung von dem Segment (Primerbindungsstelle) befindet, der vom ersten Bereich des Primer-Oligonukleotids (P1.1) gebunden wird, wobei das Block-Oligonukleotid (B1.1) dazu ausgebildet ist, die Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes (P1.1-Ext) am gebunden Segment zu verhindern, so dass dadurch die Länge des synthetisierten Bereichs des Primer-Verlängerungsproduktes begrenzt wird.
7. Verfahren nach Nr. 6, wobei der Schritt der Hybridisierung eines Block-Oligonukleotides (B1.1) vor dem Schritt der Primer-Verlängerung erfolgt.
8. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, dadurch gekennzeichnet, dass der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids (C1.1) zum dem Teil des synthetisierten Bereiches des Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär ist, der sich unmittelbar an den Primer-Oligonukleotidanteil des Primer-Verlängerungsproduktes (P1.1-Ext) anschließt.
9. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren im Wesentlichen isothermal durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielsequenz der Nukleinsäurekette (M1) eine Länge von 20 Nukleotiden bis 200 Nukleotiden umfasst.
11. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, dadurch gekennzeichnet, dass das Primer-Oligonukleotid (P1.1) eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden aufweist.
12. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, durch gekennzeichnet, dass das Controller-Oligonukleotid (C1.1) eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden aufweist.
13. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, dadurch gekennzeichnet, dass die gewählten Reaktionsbedingungen eine Reaktionstemperatur im Bereich von 25 °C bis 80 °C umfassen.
14. Verfahren nach einer der vorstehenden Nummern, dadurch gekennzeichnet, dass das Primer-Oligonukleotid (P1.1) im zweiten Bereich eine Modifikation oder mehrere Modifikationen aufweist, insbesondere unmittelbar im Anschluss an den ersten Bereich des Primer-Oligonukleotid (P1.1), welche die verwendete Polymerase am Kopieren des zweiten Bereichs hindert.
15. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einer der vorstehenden Nummern, umfassend:
- - ein Primer-Oligonukleotid (P1.1) umfassend folgende Bereiche:
  - ◯ einen ersten Bereich, der im Wesentlichen sequenzspezifisch, an ein komplementäres Segment (Primer-Bindungsstelle) innerhalb einer bereitgestellten Nukleinsäurekette (M1) umfassend eine Zielsequenz binden kann,
  - ◯ einen zweiten Bereich (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid (C1.1) gebunden werden kann; wobei das erste Primer-Oligonukleotid (P1.1), wenn hybridisiert an komplementeres Segment der Zielsequenz, durch eine matrizenabhängige Polymerase zu einem Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) verlängert werden kann, welches neben dem Primer-Oligonukleotid (P1.1) einen synthetisierten Bereich umfasst;
- - ein Controller-Oligonukleotid (C1.1) umfassend folgende Bereiche:
  - ◯ einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) binden kann,
  - ◯ einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des Primer-Oligonukleotid (P1.1) komplementär ist, und
  - ◯ einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) im Wesentlichen komplementär ist; und
  wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des Primer-Oligonukleotids (P1.1) dient, und das Controller-Oligonukleotid (C1.1) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an das Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) unter Verdrängung von komplementären Segmenten der Nukleinsäurekette (M1) binden kann; und optional
- - ein Block-Oligonukleotid (B1.1), das an ein Segment der Nukleinsäurekette (M1) binden kann, das sich in 5'-Richtung von dem Segment (Primerbindungsstelle) befindet, das vom ersten Bereich des Primer-Oligonukleotids (P1.1) gebunden wird, wobei das Block-Oligonukleotid (B1.1) dazu ausgebildet ist, die Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes (P1.1-Ext) am gebunden Bereich zu blockieren und dadurch die Länge des synthetisierten Bereichs des Primer-Verlängerungsproduktes zu limitieren.
16. Kit nach Nr. 15, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotids (P1.1) von einer für die Primerverlängerung verwendeten Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt.
17. Verwendung eines Kits nach Nr. 15 oder 16 für die Durchführung eines Verfahrens nach einem der Nr. 1 bis 14.
18. Verfahren zur spezifischen Verlängerung eines Primer-Oligonukleotids, umfassend die Schritte:
1. a) Bereitstellung von mindesten zwei Nukleinsäureketten umfassend Varianten einer Zielsequenz (Matrizenstrang) (M 1.1 und M 1.2), wobei bereitgestellte Nukleinsäureketten mindesten ein einheitliches Segment umfassen, welches für M 1.1 und M 1.2 spezifisch ist und bei M 1.1 und M 1.2 identisch ist, und Mindestens ein charakteristisches, für jede Nukleinsäurekette spezifisches Segment umfassen
2. b) Bereitstellung eines ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1), welches an das einheitliche Segment von mindestens zwei bereitgestellten Nukleinsäureketten komplementär binden kann, wobei das Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereich, der im Wesentlichen sequenzspezifisch, an ein komplementäres Segment (Primer-Bindungsstelle) umfassend einen Anteil der Zielsequenz innerhalb eines einheitlichen Segments von bereitgestellten Nukleinsäureketten (M 1.1 und M 1.2) binden kann, einen zweiten Bereich (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid (C 1.1 oder C 1.2) gebunden werden kann; wobei die Bindung an das einheitliche Segment der bereitgestellen Nukleinsäureketten dermassen erfolgt, dass das jeweils charakteristische und spezifische Segment in 5'-Richtung der bereitgestellten Nukleinsäurekette vom hybridisierten Primer (P 1.1) liegt;
3. c) Bereitstellung von mindestens zwei Controller-Oligonukleotiden (C1.1 und C1.2), wobei jedes folgende Bereiche umfasst:
  - einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich des Primer-Oligonukleotids (P1.1) (Überhang) binden kann, und
  - einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des Primer-Oligonukleotid (P1.1) komplementär ist, und
  - einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches von mindestens einem zu erwartenden ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext oder P1.2-Ext) komplementär ist; und
  - wobei Controller-Oligonukleotide (C1.1 und C1.2) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des Primer-Oligonukleotids (P1.1) dienen, und
  - das Controller-Oligonukleotid (C1.1) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an die komplementären Segmente des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) unter Verdrängung von Nukleinsäurekette (M 1.1) binden kann und
  - das Controller-Oligonukleotid (C1.2) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an die komplementären Segmente des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.2-Ext) unter Verdrängung von Nukleinsäurekette (M 1.2) binden kann.
4. d) Hybridisieren eines Primer-Oligonukleotids (P1.1) an ein Segment umfassend einen Anteil der Zielsequenz (Primer-Bindungsstelle) von mindestens zwei bereitgestellten Nukleinsäureketten (M 1.1 und M 1.2),
5. e) Verlängerung des Primer-Oligonukleotids (P.1.1) durch eine matrizenabhängige Polymerase unter Verwendung von bereitgestellten Nukleinsäureketten als Matrizen für die Primer-Verlängerung unter Erhalt von spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten (Primer-Extensionsprodukte, P1.1-Ext und P1.2-Ext), wobei jedes neben dem Primer-Oligonukleotid (P1.1) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zu der jeweiligen Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (M1) ist, wobei das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) einen synthetisierten komplementären Bereich zum charakteristischen und spezifischen Segment der einen Nukleinsäure (M 1.1) umfasst und das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.2-Ext) einen synthetisierten komplementären Bereich zum charakteristischen und spezifischen Segment der zweiten Nukleinsäure (M 1.2) umfasst und die synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte (P1.1-Ext und P1.2-Ext) und ihre entsprechende als Matrize dienende Nukleinsäurekette (M 1.1 und M 1.2) unter Reaktionsbedinungen je einen Doppelstrang bilden;
6. f) Bindung mindestens eines Controller-Oligonukleotids (C1.1 und C 1.2) an die im Schritt (e) gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte (P1.1-Ext und P1.2-Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an die komplementären Segmente des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) unter Verdrängung von Nukleinsäurekette (M 1.1) binden kann und das Controller-Oligonukleotid (C1.2) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an die komplementären Segmente des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.2-Ext) unter Verdrängung von Nukleinsäurekette (M 1.2) binden kann.
19. Verfahren nach Nr. 18, wobei Nukleinsäureketten umfassend Varainten einer Zielsequenz (Matrizenstrang) (M 1.1 und M 1.2), mindestens zwei einheitliche Segmente umfassen, welches bei M1.1 und M1.2 identisch ist.
20. Verfahren nach Nr. 19, wobei das einheitliche Segment eine Länge von 10 bis 180 Nukleotiden umfasst.
21. Verfahren nach Nr. 18 bis 20, wobei das charakteristische und spezifische Segment eine Länge von einem Nukleotid bis zu 50 Nukleotiden umfasst.
22. Verfahren zur spezifischen Verlängerung eines Primer-Oligonukleotids, umfassend die Schritte:
1. a) Bereitstellung von mindesten zwei Nukleinsäureketten umfassend Varianten einer Zielsequenz (Matrizenstrang) (M 1.1 und M 1.2), wobei bereitgestellte Nukleinsäureketten mindesten ein einheitliches Segment umfassen, welches für M 1.1 und M 1.2 spezifisch ist und bei M 1.1 und M 1.2 identisch ist, und mindestens ein charakteristisches, für jede Nukleinsäurekette spezifisches Segment umfassen
2. b) Bereitstellung von mindestens zwei ersten Primer-Oligonukleotiden (P1.1 und P 1.2), welche jeweils vollständig oder teilweise an das korrespondierende charakteristische und spezifische Segment jeder der bereitgestellten Nukleinsäureketten komplementär binden können, wobei jedes Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereich umfasst, der jeweils sequenzspezifisch an ein komplementäres Segment (Primer-Bindungsstelle) umfassend einen Anteil der Zielsequenz innerhalb eines charakteristischen und spezifischen Segments von bereitgestellten Nukleinsäureketten (M 1.1 und M 1.2) binden kann, einen zweiten Bereich (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid (C 1.1 oder C 1.2) gebunden werden kann;
3. c) Bereitstellung von mindestens zwei Controller-Oligonukleotiden (C1.1 und C1.2), wobei jedes folgende Bereiche umfasst:
  - einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich der Primer-Oligonukleotide (P1.1 und / oder P1.2) (Überhang) binden kann, und
  - einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des jeweiligen Primer-Oligonukleotids (P1.1 oder P1.2) komplementär ist, wobei C 1.1 einen komplementären zweiten Bereich zum korrespondierenden ersten Bereich des P1.1 umfasst und C 1.2 einen komplementären zweiten Bereich zum korrespondierenden ersten Bereich des P1.2 umfasst und
  - einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches von mindestens einem zu erwartenden ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P 1.1-Ext oder P 1.2-Ext) komplementär ist;
  - wobei Controller-Oligonukleotide (C 1.1 und C 1.2) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung eines verwendeten Primer-Oligonukleotids (P 1.1 oder P 1.2) dienen,
4. d) Hybridisieren von mindestens einem Primer-Oligonukleotid (P1.1 und / oder P1.2) an das jeweils komplementäre Segment umfassend einen Anteil der Zielsequenz (Primer-Bindungsstelle) von mindestens einer der bereitgestellten Nukleinsäureketten (M 1.1 und M 1.2),
5. e) Verlängerung mindestens eines Primer-Oligonukleotids (P1.1 und / oder P1.2) durch eine matrizenabhängige Polymerase unter Verwendung von bereitgestellten Nukleinsäureketten als Matrizen für die Primer-Verlängerung unter Erhalt von mindestens einem spezifischen Primer-Verlängerungsprodukt (Primer-Extensionsprodukte, P1.1-Ext und P1.2-Ext), wobei jedes neben dem Primer-Oligonukleotid (P1.1 oder P1.2) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zu der jeweiligen Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (M1) ist, wobei das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) einen komplementären Bereich zum charakteristischen und spezifischen Segment der einen Nukleinsäure (M 1.1) umfasst und das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.2-Ext) einen komplementären Bereich zum charakteristischen und spezifischen Segment der zweiten Nukleinsäure (M 1.2) umfasst und die synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte (P1.1-Ext und P1.2-Ext) und ihre entsprechende als Matrize dienende Nukleinsäurekette (M 1.1 und M 1.2) unter Reaktionsbedinungen je einen Doppelstrang bilden;
6. f) Bindung mindestens eines Controller-Oligonukleotids (C1.1 und C1.2) an die im Schritt (e) gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte (P1.1-Ext und P1.2-Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an die komplementären Segmente des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) unter Verdrängung von Nukleinsäurekette (M 1.1) binden kann und das Controller-Oligonukleotid (C1.2) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an die komplementären Segmente des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.2-Ext) unter Verdrängung von Nukleinsäurekette (M 1.2) binden kann.
23. Verfahren nach Nr. 22, wobei die Bindung eines jeweiligen ersten Primers an das charakteristische und spezifische Segment der bereitgestellen Nukleinsäureketten dermassen erfolgt, dass das jeweils charakteristische und spezifische Segment der Nukleinsäurekette vom 3'-terminalen Nukleotid des jeweiligen ersten Primer komplementär gebunden ist.
24. Verfahren nach Nr. 22, wobei die Bindung eines jeweiligen ersten Primers an das charakteristische und spezifische Segment der bereitgestellen Nukleinsäureketten dermassen erfolgt, dass das jeweils charakteristische und spezifische Segment der Nukleinsäurekette vom 3'-Segment des jeweiligen ersten Primer komplementär gebunden ist.
25. Verfahren zur spezifischen Verlängerung eines Primer-Oligonukleotids unter Verwendung eines Kompetitor-Primers, umfassend die Schritte:
1. a) Bereitstellung von mindesten zwei Nukleinsäureketten umfassend Varianten einer Zielsequenz (Matrizenstrang) (M 1.1 und M 1.2), wobei bereitgestellte Nukleinsäureketten mindesten ein einheitliches Segment umfassen, welches für M 1.1 und M 1.2 spezifisch ist und bei M 1.1 und M 1.2 identisch ist, und Mindestens ein charakteristisches, für jede Nukleinsäurekette spezifisches Segment umfassen
2. b) Bereitstellung von einem ersten Primer-Oligonukleotiden (P1.1), welches vollständig oder teilweise an das korrespondierende charakteristische und spezifische Segment einer der bereitgestellten Nukleinsäureketten komplementär binden kann, wobei das erste Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereich umfasst, der sequenzspezifisch, an ein komplementäres Segment (Primer-Bindungsstelle) umfassend einen Anteil der Zielsequenz innerhalb eines charakteristischen und spezifischen Segments von bereitgestellten Nukleinsäureketten (M 1.1) binden kann, einen zweiten Bereich (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid (C 1.1) gebunden werden kann;
3. c) Bereitstellung von einem Kompetitor-Primer-Oligonukleotiden (P 5.2), welches vollständig oder teilweise an das korrespondierende charakteristische und spezifische Segment einer zweiten bereitgestellten Nukleinsäureketten komplementär binden kann (M 1.2), wobei das Kompetitor-Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereich umfasst, der sequenzspezifisch, an ein komplementäres Segment (Primer-Bindungsstelle) umfassend einen Anteil der Zielsequenz innerhalb eines charakteristischen und spezifischen Segments von bereitgestellten Nukleinsäureketten (M 1.2) binden kann, wobei dieser Bereich ist nicht identisch zum erten Bereich des erten Primer-Oligonukleotides
4. d) Bereitstellung eines Controller-Oligonukleotids (C1.1), wobei es folgende Bereiche umfasst:
  - einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotide (P1.1) (Überhang) binden kann, und
  - einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1) komplementär ist, und
  - einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches von einem zu erwartenden ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P 1.1-Ext) komplementär ist;
  - wobei Controller-Oligonukleotid (C 1.1) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung eines verwendeten ersten Primer-Oligonukleotids (P 1.1) oder eines Kompetitor-Primer-Oligonukleotid dient,
5. e) gleichzeitiges Hybridisieren des ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1) und des Kompatitor-Primer-Oligonukleotids an das jeweils komplementäre Segment umfassend einen Anteil der Zielsequenz (Primer-Bindungsstelle) von mindestens einer der bereitgestellten Nukleinsäureketten (M 1.1 und M 1.2),
6. f) gleichzeitige Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotid (P1.1) und des Kompetitor-Oligonukleotides durch eine matrizenabhängige Polymerase unter Verwendung von bereitgestellten Nukleinsäureketten als Matrizen für die Primer-Verlängerung unter Erhalt von mindestens einem spezifischen Primer-Verlängerungsprodukt (Primer-Extensionsprodukte, P1.1-Ext und P5.2-Ext), wobei jedes neben dem Primer-Oligonukleotid (P1.1 oder P5.2) einen synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zu der jeweiligen Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (M1) ist, wobei das Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) einen komplementären Bereich zum charakteristischen und spezifischen Segment der einen Nukleinsäure (M 1.1) umfasst und das Primer-Verlängerungsprodukt (P5.2-Ext) einen komplementären Bereich zum charakteristischen und spezifischen Segment der zweiten Nukleinsäure (M 1.2) umfasst und die synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte (P1.1-Ext und P5.2-Ext) und ihre entsprechende als Matrize dienende Nukleinsäurekette (M 1.1 und M 1.2) unter Reaktionsbedinungen je einen Doppelstrang bilden;
7. g) Selektive Bindung des Controller-Oligonukleotids (C1.1) an die im Schritt (e) gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte (P1.1-Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) mit seinem ersten, zweiten und dritten Bereich an die komplementären Segmente des Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) unter Verdrängung von Nukleinsäurekette (M 1.1) binden kann, wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.1) nicht in der Lage ist, unter verwendeten Reaktionsbedinungen an das P5.2-Ext zu binden und P5.2-Ext von seinem Matrizenstrang zu trennen.
26. Verfahren nach Nr. 25, wobei das 3'-terminale Nukleotid des Kompetiror-Primer innerhalb der zweiten Blockierungs-Einheit des Controller-Oligonukleotide binden kann.
27. Verfahren nach Nr. 25, wobei das 3'-terminale Nukleotid des Kompetiror-Primer innerhalb der vierten Blockierungs-Einheit des Controller-Oligonukleotide binden kann, wobei die vierte Blockierungs-Einheit im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides liegt

In einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Primer-Oligonukleotid und ein dazu korrespondierendes Controller-Oligonukleotid zu einem Primer-Verlängerungs-System zusammengefasst: Ein solches Primer-Verlängerungs-System umfasst:

• ein spezifisches Controller-Oligonukleotid für eine Sequenz-Variante der Zielsequenz
• ein erstes Primer-Oligonukleotid, welches an das für die bereitgestelle Zielsequenz (Matrizenstrang) einheitliche Sequenzfragment im Wesentlichen komplementär binden kann und

• ein spezifisches Controller-Oligonukleotid für eine Sequenz-Variante der Zielsequenz
• ein erstes Sequenz-varianten spezifisches Primer-Oligonukleotid, welches zumindest teilweise (z.B. mit seinem 3'-terminalen Nukleotid) an das spezifische Sequenz-Segment eines polymorphen Lokus einer bereitgestellen Zielsequenz voll-komplementär binden kann

In einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Primer-Oligonukleotid und ein dazu korrespondierendes Controller-Oligonukleotid sowie ein Kompetitor-Primer-Oligonukleotid zu einem Primer-Verlängerungs-System zusammengefasst: Ein solches Primer-Verlängerungs-System umfasst:

• ein spezifisches Controller-Oligonukleotid für eine Sequenz-Variante der Zielsequenz
• ein erstes Primer-Oligonukleotid, welches an das für die bereitgestelle Zielsequenz (Matrizenstrang) einheitliche Sequenzfragment im Wesentlichen komplementär binden kann und
• ein spezifisches Kompetitor-Primer-Oligonukleotid

In einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Primer-Oligonukleotid und ein dazu korrespondierendes Controller-Oligonukleotid und ein Kompetitor-Oligonukleotid zu einem Primer-Verlängerungs-System zusammengefasst: Ein solches Primer-Verlängerungs-System umfasst:

• ein spezifisches Controller-Oligonukleotid für eine Sequenz-Variante der Zielsequenz
• ein erstes Sequenz-varianten spezifisches Primer-Oligonukleotid, welches zumindest teilweise (z.B. mit seinem 3'-terminalen Nukleotid) an das spezifische Sequenz-Segment eines polymorphen Lokus einer bereitgestellen Zielsequenz voll-komplementär binden kann
• ein spezifisches Kompetitor-Primer-Oligonukleotid

In einer Ausführungsform ist ein solches Primer-Verlängerungs-System somit dermassen konstruiert, dass die Sequenz des ersten Primer-Oligonukleotides zumindest mit einer Nukleotid-Position mit einer charakteristischen Sequenz des polymorphen Lokus überlagert.
Das zum polymorphen Lokus korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotides liegt in einer Ausführungsform vollständig im zweiten Bereich des Controller-Oligonukeotides.
In einer weiteren Ausführungform liegt das zum polymorphen Lokus korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotides partiell im zweiten und partiell im dritten Bereich des Controller-Oligonukeotides.
In einer Ausführungsform kann das verwendete Kompetitor-Oligonukleotid vollständig oder teilweise an das Segment der Zielsequenz binden, welches mit dem ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids komplementäre Bindung eingehen kann.
In einer Ausführungsform ist dieses Kompetitor-Primer-Oligonukleotid voll-komplementär zu einer Sequenz-Variante einer Zielsequenz, welche nicht identisch ist mit der Sequenz-Variante des Matrizenstranges, welcher vom ersten Primer erkannt wird.
In einer Ausführungsform des Verfahrens umfasst ein Kompetitor-Primer-Oligonukleotid kein Sequenzsegment, welches mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides im Wesentlichen komplementär binden kann.
Die Anmeldung beschreibt die Herstellung von Primer-Verlängerungsprodukten, welche beispielsweise in einer exponenetiellen Amplifikation als Start-Nukleinsäure verwendet werden können.
Die hier verwendeten erste Primer-Oligonukleotide und Controller-Oligonukleotide können mit solchen einer exponentiellen Amplifikation identisch sein oder sich von denen unterscheiden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die eingangs erwähnten technischen Aufgaben werden insbesondere durch die Bereitstellung von Verfahren und Komponenten (Feedback-System) gelöst, welche die Qualität von synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten in unterschiedlichen Phasen einer matrizenabhängigen Primer-Verlängerung überprüfen können. Diese Überprüfung kann je nach Ausführungsform entweder während der Synthese stattfinden oder erst nach Abschluss der Synthese. Die Überprüfung kann im gleichen Reaktionsansatz stattfinden, so dass die eigentliche Primerverlängerungsreaktion nicht unterbrochen werden muss (online-Kontrolle) oder erst nach Abschluss der Primerverlängerungsreaktion (End-Kontrolle).
Durch Überprüfung der Qualität kann Einfluss auf die Primerverlängerungsreaktion selbst oder auf die Trennung des Produktes von der Matrize genommen werden. Dieser Einfluss wird durch die bereitgestellten Komponenten genommen. Somit bilden diese Komponenten ein Feedback-System für die Primerverlängerungsreaktion bzw. für die Ablösung des Produktes der Primer-Verlängerungsreaktion von der Matrize.
Die Komponenten des Feedback-Systems können dahingehend Einfluss auf die Primerverlängerungsreaktion ausüben, dass es zwischen einer Fortführung der enzymatischen Synthese oder einer Unterbrechung der Synthese bzw. Neustart der Synthese entschieden werden kann. Weiterhin können die Komponenten des Feedback-Systems Einfluss dahingehend ausüben, dass die Ablösung des Produktes der Synthese von der Matrize von der Übereinstimmung mit dem Controller-Oligonukleotid abhängig fortgeführt wird oder bei ggf. auftretenden Abweichungen in der Sequenz angehalten bzw. verzögert oder vollständig unterbrochen wird.
Das Synthesesstem bei einer Primer-Verlängerungsreaktion umfasst in der Regel mindestens eine Matrize und mindestens einen Primer, welcher in der Lage ist sich mehr oder weniger spezifisch an die Matrize zu binden und eine Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Weiterhin umfasst das Synthesesystem mindestens eine Polymerase, sowie Substrate (dNTPs) und Pufferbedingungen, unter welchen eine Primerverlängerungsreaktion stattfinden kann. Weitere Oligonukleotide können je nach Ausführungsform des Verfahrens hinzugefügt werden, z.B. Block-Oligonukleotide, zum sequenzspezifischen Stopp der Polymerase oder Sonden-Oligonukleotide, welche ein Fluoreszenzsignal abgeben können.
Das Feedback-System umfasst einen Primer, welcher als Initiator einer Primer-Verlängerungsreaktion auftritt, sowie ein weiteres Oligonukleotid, ein so genanntes Controller-Oligonukleotid. Der Primer des Feedback-Systems ist in bevorzugter Ausführungsform mit dem Primer des Synthesesystems identisch. Das Controller-Oligonukleotid ist in der Lage, sowohl mit dem jeweiligen Primer als auch mit dem ausgehend von diesem Primer sequenzspezifischen Primerverlängerungsprodukts zu interagieren. Es ist in der Lage, bei Sequenzübereinstimmung mit dem Primerverlängerungsprodukt einen komplementären Doppelstrang unter Reaktionsbedingungen auszubilden. Das Controller-Oligonukleotid dient selbst nicht als Matrize zur Synthese für das genannten Primer/Polymerase-System. Weitere Oligonukleotide können je nach Ausführungsform des Verfahrens hinzugefügt werden, z.B. Block-Oligonukleotide, zum sequenzspezifischen Stopp der Polymerase oder Sonden-Oligonukleotide, welche ein Fluoreszenzsignal abgeben können.
Das Verfahren umfasst in einer Ausführungsform eine Primerverlängerungsreaktion (auch Primer-Extension genannt) mittels eines Primers in Anwesenheit eines passenden Controller-Oligonukleotides im gleichen Reaktionsansatz. Das Controller-Oligonukleotid ist hierbei in der Lage, mit dem Primerverlängerungsprodukt unter Ausbildung eines komplementären Stranges zu interagieren. Der Fortschritt der Ausbildung des Doppelstranges zwischen dem Controller und dem Primerverlängerungsproduktes (P1-Ext) hängt im Wesentlichen von der Übereinstimmung der Sequenzen zwischen dem Controller und dem korrespondierenden Primerverlängerungsprodukt ab. Dadurch kann eine Sequenzkontrolle bzw. Sequenzüberprüfung bereits während einer Primer-Extension oder unmittelbar nach einer Primer-Extension zumindest über Teilsegmente des synthetisierten Primer-Extension-Fragments mittels Controller-Oligonukleotides erfolgen.
Weiterhin umfasst das Verfahren in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zu einer matrizenabhängigen Primer-Extension in Kombination mit einer anschließender Kontrolle des synthetisierten Primerverlängerungsproduktes durch mindestens ein Controller-Oligonukleotid nach Abschluss der Primer-Extension Reaktion. Primer-Extension und Controller-Interaktion mit dem synthetisierten Primerverlängerungsprodukt sind zwei zeitlich getrennte Reaktionen. Die Primerverlängerungsreaktion verläuft zwar in Anwesenheit eines entsprechenden Controller-Oligonukleotides im gleichen Reaktionsansatz, die Reaktionen sind aber durch Wahl von Reaktionsbedingungen in einzelne Reaktionsschritte zeitlich separiert.
Durch Präsenz des Feedback-Systems im gleichen Reaktionsansatz wie die Primerverlängerungsreaktion ist es möglich, einen homogenen Assay zu gestalten.
Durch Einbringen bzw. Zusammenführung der Komponenten des Feedback-Systems in den gleichen Reaktionsansatz wie die Primerverlängerungsreaktion an sich, d.h. gleichzeitiger Präsenz von sowohl der Komponenten des Synthesesystems als auch des Feedback-Systems, kann die Überprüfung oder Beeinflussung der Primerverlängerungsreaktion und der Trennung der Primerverlängerungsprodukte von der Matrize ggf. in sehr kurzen Zeitabständen erfolgen. Dadurch kann das Feedback-System sehr schnell auf ggf. auftretende Abweichungen reagieren.
Die gleichzeitige Präsenz des Feedback-Systems im Primerverlängerungsansatz kann zu einer wiederholten Überprüfung führen, so dass das Ergebnis der Überprüfung als Summe multipler Überprüfungsereignisse zusammengefasst werden kann. Die Häufigkeit der Überprüfung kann sowohl mittels der geeigneten Wahl von Reaktionsbedingungen (z.B. Temperatur, Konzentration der Feedback-System-Komponenten) als auch durch die Strukturen von Feedback-Komponenten (z.B. Länge und Komplementarität bzw. Ausmaß der Verwendung modifizierten Nukleotide beim Design einzelner Strukturen) beeinflusst werden.
In den vielen Fällen soll dabei das Feedback-System zwischen korrekt ablaufenden Reaktionen (in vielen Fällen mehr als 99% aller Primerverlängerungsstränge einer Primer-Verlängerungsreaktion aufgrund einer hohen natürlichen Spezifität einer enzymatischen matrizenabhängigen Reaktion) und fälschlich synthetisierten Primerverlängerungsprodukten (geringer als 1% aller Primer-Verlängerungsprodukte) unterscheiden. Somit kann ein Feedback-System beispielsweise bei Spurenanalysen hilfreich sein.
Durch eine hohe Sequenzabhängigkeit der Interaktion des Primerverlängerungsprodukts (P1-Ext) mit dem Controller können Gleichgewichte unter einzelnen Zwischenkomplexe, welche während der Reaktion generiert werden, individuell beeinflusst werden. Da diese Komplexe unterschiedliche Zugänglichkeiten zu bestimmten Sequenzsegmenten (einzelsträngige Segmente) aufweisen, können viele Reaktionen während einer laufenden Primerverlängerungsreaktion beeinflusst werden. Mögliche Zwischenkomplexe umfassen z. B. Primerverlängerungsprodukt/Matrize, Primerverlängerungsprodukt/Controller-Oligonukleotid und Primerverlängerungsprodukt/Matrize/Controller-Oligonukleotid und/oder Primerverlängerungsprodukt/Sonde. Damit kann man stärkeren Einfluss auf Spezifität im Gesamtvorgang der Primerverlängerung als auch in davon abhängigen Reaktionen ausüben.
Als Folge der sequenzabhängigen Interaktion zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem synthetisierten Strang des Primerverlängerungsproduktes (P1-Ext) können mehrere technische Effekte erzielt werden:

◯ Vollständige oder partielle sequenzabhängige Trennung, Dissoziation oder Ablösung des P1-Ext vom Matrizenstrang;
◯ Sequenzspezifische Detektion von bestimmten Varianten der Sequenz des P1.Ext.
◯ Sequenzspezifische Aufrechterhaltung eines Doppelstranges bzw. umgekehrt sequenzspezifische Überführung von Strangsegmenten in eine einzelsträngige Form, und eine damit zusammenhängende Zugänglichkeit von bestimmten Sequenzsegmenten für die Interaktion mit anderen System-Komponenten, z.B. Sonden, Primern, etc.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Primer-Extension als einmalige Synthese in einem Schritt ablaufen oder als wiederholte Reaktion (lineare Amplifikation).
Die Primerverlängerungsreaktion kann an sich alleine durchgeführt werden oder in Kombination mit einem Amplifikationsverfahren.
Besonders bei gleichzeitiger Anwesenheit von mehreren sehr ähnlichen Sequenzen, welche potenziell für eine Primerverlängerungsreaktion ausgehend von einem Primer auftreten können, ist es daher von Vorteil, ein Feedback-System innerhalb des Reaktionsansatzes unterzubringen. Dadurch können Unterschiede in der Regel viel stärker bzw. schärfer getrennt werden. Vorteilhaft kann dies beispielsweise bei Allel-Diskriminierungsverfahren oder bei der gezielten Amplifikation von wenigen Kopien mit Mutationen haben, welche in weitem Unterschuss zum Wildtyp vorliegen.
Die Sequenzüberprüfung durch das erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt über die Primerlänge hinaus (ca. 5 - 50 Nukleotide des synthetisierten Abschnittes) und unterscheidet sich somit von üblichen Primer-Verlängerungsreaktionen, bei welchen im Wesentlichen Primer-Sequenz für die sequenzspezifische Bindung verantwortlich ist.
Die verbesserte Spezifität der Ablösung des synthetisierten Stranges kann unter mehreren Aspekten in Nachweisverfahren vorteilhaft verwendet werden.

• Sie kann beispielsweise als alternatives Detektionsverfahren und oder Komponente für genetische Veränderungen, wie Einzelnukleotidpolymorphismen, verwendet werden.
• Der sequenzspezifisch synthetisierte Strang des Primerverlängerungsprodukts (P1-Ext) ist das gewünschte Produkt der Primerverlängerungsreaktion. Es kann in verschiedenen Verfahren der Analyse genetischer Information eingesetzt werden, beispielsweise in:
- oder Generierung einer oder mehreren Kopien ausgehend von einer längeren Nukleinsäurekette, z.B. einer genomischen DNA oder deren Segmenten, oder einer RNA oder ihrer Äquivalenten wie cDNA oder deren Segmente. Diese Kopien können als Start-Nukleinsäureketten in Amplifikationsverfahren eingesetzt werden, wie PCR oder anderen Amplifikationsverfahren; oder
- ◯ dem Nachweis einer bestimmten Veränderung einer Sequenz in einem Nukleinsäurefragment, z.B. eines Amplifikationsfragmentes
• Die Komponenten und Verfahren sollen besonders bei gleichzeitiger Anwesenheit von mehreren, sehr ähnlichen Varianten einer Matrizensequenz, z.B. Wildtyp und einer oder mehreren mutierten Sequenz, eine Verbesserung der Spezifität bei einzelnen Verfahrensschritten unterstützen.
• Die Vorteile des Verfahrens sind besonders bei gleichzeitiger Anwesenheit von mehreren, sehr ähnlichen Varianten einer Matrizensequenz, z.B. Wildtyp und einer oder mehreren mutierten Sequenz, zu sehen.
• Besonders bei geringfügigen genetischen Unterschieden, wie Einzelnukleotid-Veränderungen (SNV) und kurzen InDels (2 - 10 Nukleotide) kann Spezifität der Primer-Verlängerungs-Abhängiger Verfahren / Verfahrensschritte verbessert werden.
• In einigen Ausführungsformen des Verfahrens sollen Komponenten für ein homogenes Assay bereitgestellt werden, welche eine gleichzeitige Anwesenheit von Komponenten in einer Reaktion (Eintopfreaktion bzw. homogener Assay) ermöglichen.

Die hier beschriebene Primer-Verlängerungsreaktion und die dabei generierten Primer-Verlängerungsprodukte können beispielsweise in einem Amplifikationsverfahren als Start-Nukleinsäuren dienen.
Ein solches Amplifikations-Verfahren wurde in der PCT Anmeldung ( PCT/EP2017/071011 ) und der europäischen Anmeldung ( EP-A 16185624.0 ) bereits beschrieben. Zu Details der Ausführung des Amplifikation wird der Fachmann an diese Anmeldung verwiesen.
Vorzugsweise erfolgt eine solche Amplifikation als exponentielle Amplifikation, bei welcher neusynthetisierte Produkte beider Primer (Primer-Verlängerungsprodukte) als Matrizen für weitere Syntheseschritte auftreten. Dabei werden Primersequenzen zumindest teilweise kopiert, so dass komplementäre Primer-Bindungsstellen entstehen, welche unmittelbar nach ihrer Synthese als Sequenzsegmente eines Doppelstranges vorliegen. Im Amplifikatonsverfahren erfolgen Synthese-Schritte von beiden Strängen und Doppelstrang-Öffnungs-Schritten der neusynthetisierten Sequenzabschnitte in gegenseitiger Abwechselung. Eine hinreichende Doppelstrang-Trennung nach einer Synthese stellt eine wichtige Voraussetzung für weitere Synthese dar. Insgesamt kann eine solche Abwechslung aus Synthese- und Doppelstrang-Trennungsschritten zu einer exponentiellen Amplifikation führen.
Im Amplifikationsverfahren erfolgt die Doppelstrang-Öffnung von Hauptprodukten der Amplifikation (Amplifikation von Zielsequenz umfassenden Nukleinsäureketten) unter anderem mittels eines Oligonukleotides, genannt Controller-Oligonukleotid. Das Controller-Oligonukleotid umfasst vorzugsweise Sequenzsegmente, welche der Zielsequenz entsprechen.
Im Einzelnen, wird die Strangtrennung durch Einsatz von Controller-Oligonukleotide mit vordefinierten Sequenzen erreicht, welche vorzugsweise mittels einer sequenzabhängigen nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung einen neusynthetisierten Doppelstrang bestehend aus beiden spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten trennen. Die dabei entstehenden einzelsträngigen Segmente von Primer-Verlängerungsprodukten umfassen die Zielsequenz, sowie entsprechende Primer-Bindungsstellen, welche als Bindungsstellen für weitere Primer-Oligonukleotide dienen können, so dass eine exponentielle Amplifikation von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten erreicht wird. Die Primer-Verlängerungsreaktionen und Strangverdrängungsreaktionen finden vorzugsweise im Ansatz gleichzeitig statt. Die Amplifikation erfolgt vorzugsweise unter Reaktionsbedinungen, welche eine spontane Trennung von beiden spezifischen synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten nicht zulassen.
Eine spezifische exponentielle Amplifikation einer Zielsequenz-umfassenden Nukleinsäurekette umfasst eine Wiederholung aus Synthese-Schritten und Doppelstrang-Öffnungs-Schritten (Aktivierungs-Schritten für Primer-Bindungsstellen) als zwingende Voraussetzung für Vermehrung der Nukleinsäurekette.
Die in dieser Anmeldung beschriebene Mechanismen der Strang-Trennung mittels eines Controllers ähneln solchen Mechanismen, wie für das „Controller-Oligonukleotid“ in der PCT Anmeldung ( PCT/EP2017/071011 ) beschrieben. Nachfolgend wird dieser Mechanismus kurz zusammengefasst.
Die Öffnung von synthetisierten Doppelsträngen wird als Reaktions-Schritt umgesetzt, welcher sequenzspezifisch durch das Controller-Oligonukleotid beeinflusst werden soll. Diese Öffnung kann vollständig erfolgen, bis hin zu Dissoziation von beiden komplementären Primer-Verlängerungsprodukten, oder auch partiell sein.
Das Controller-Oligonukleotid umfasst erfindungsgemäß Sequenzabschnitte, welche mit der Zielsequenz interagieren können und weitere Sequenzabschnitte, welche diese Interaktion herbeiführen, bzw. ermöglichen, bzw. begünstigen. Im Rahmen der Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid werden doppelsträngige Abschnitte der synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte via sequenzspezifischer Strangverdrängung einzelsträngige Form überführt. Dieser Vorgang ist sequenzabhängig: erst wenn die Sequenz des synthetisieren Doppelstranges ein gewisses Maß an Komplementarität mit der entsprechenden Sequenz des Controller-Oligonukleotides aufweist, kommt es zu einer hinreichenden Doppelstrang-Öffnung, so dass die für die Fortführung der Synthese wesentlichen Sequenzabschnitte, wie z.B. Primer-Bindungsstellen, in einzelsträngige Form überführt werden, was einem „aktiven Zustand“ entspricht. Das Controller-Oligonukleotid „aktiviert“ somit spezifisch die neusynthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte, welche die Zielsequenz umfassen, für weitere Synthese-Schritte.
Hingegen werden Sequenzabschnitte, welche keine Zielsequenz umfassen, nicht in einzelsträngigen Zustand überführt und verbleiben als Doppelstrang, was einem „inaktiven“ Zustand entspricht. Die potenziellen Primerbindungsstellen sind in einem solchen Doppelstrang an Interaktion mit neuen Primern benachteiligt bzw. vollständig gehindert, so dass weitere Synthese-Schritte an solchen „nicht aktivierten“ Strängen im Allgemeinen nicht stattfinden. Diese fehlende oder verminderte Aktivierung (d.h. Überführung in einen einzelsträngigen Zustand) von synthetisierten Nukleinsäuresträngen nach einem Synthese-Schritt führt dazu, dass im darauffolgenden Synthese-Schritt nur eine verminderte Menge an Primern an einer Primer-Verlängerungsreaktion erfolgreich teilnehmen kann.
Die Reaktionsbedinungen (z.B. Temperatur) werden dabei dermassen gestaltet, dass eine spontane Trennung von komplementären Primer-Verlängerungsprodukten in Abwesenheit eines Controller-Oligonukleotdies unwahrscheinlich oder signifikant verlangsamt ist.
Die anzustrebende Erhöhung der Spezifität einer Primer-Verlängerungsreaktion resultiert somit aus der Sequenzabhängigkeit der Trennung von komplementären Primer-Verlängerungsprodukten, welche eine vordefinierte Zielsequenz umfassen: Controller-Oligonukleotid ermöglicht bzw. begünstigt diese Doppelstrang-Trennung als Folge der Übereinstimmung seiner Sequenzabschnitte mit vorgegebenen Sequenzabschnitten der Primer-Verlängerungsprodukte.
Vorwiegend sequenzspezifsiche Trennung des Doppelstrange unter Mitwirkung eines Controller-Oligonukleotides kann in Kombination mit sequenz-spezifischen oder weniger sequenz-spezifischen Primern Kombiniert werden.
Verwendung von vorwiegend spezifischen Controller-Oligonukleotiden, welche in der Lage sind, zwischen einzelnen Varianten zu unterscheiden, ermöglicht beispielsweise Zusammenstellung von Allel-spezifischen bzw. Mutations- spezifischen Assays.
Die Erfindung eignet sich besonders bei Primer-Verlängerungsreaktionen von Sequenzvarianten eines bekannten Lokus einer Zielsequenz. Ein solcher Lokus kann mehrere vorkommende Sequenzvariante einer Zielsequenz umfassen und ist somit ein polymorpher Lokus. Ein solcher polymorpher Lokus umfasst beispielsweise Einzelnukleotid-Polymorphismen.
Um die Sequenzspezifität einer Sequenzvariante eines Lokus der Zielsequenz zu erreichen, sollten Komponenten, welche für Spezifität der Primer-Verlängerung eine wesentliche Rolle spielen in eine spezifische Anordnung gebracht werden. Besonders vorteilhaft sind Anordnungen, welche eine bekannte Sequenzvariante eines Lokus umfassen, wobei ein vorwiegend sequenz-spezifisches Controller-Oligonukleotid sowie entsprechende Primer designt werden können.
Die Position einer zu erwartenden Sequenzvariante im bekannten Lokus wird somit bei dem Design von Komponenten dahingehend berücksichtigt, dass zumindest das Controller-Oligonukleotid, besser Controller-Oligonukleotid in Kombination mit mindestens einem Primer, eine spezifische Sequenzzusammensetzung in einem Primer-Verlängerungs-System aufweisen, welches für Primer-Verlängerung einer gewünschten Variante der Zielsequenz geeignet ist.
Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin dadurch gelöst, dass ein Primer-Verlängerungs-System zumindest einen sequenz-spezifischen Primer (z.B. allel-diskriminierender Primer) in Kombination mit jeweils einem spezifischen Controller-Oligonukleotiden (z.B. allel-spezifische Controller-Oligonukleotide) umfasst. Somit kann für jede spezifische Zusammensetzung einer Zielsequenz und ihre spezifische Varienten (z.B. Allele) jeweils eine spezifische Kombination aus mindesten einem spezifischen Primer und mindesten einem spezifischen Controller-Oligonukleotid bereitgestellt werden. Dabei resultiert eine spezifische Amplifikatio einer der möglichen Sequenzvarianten einer Zielsequenz.
Weiterhin wird die Aufgaben der Erfindung dadurch gelöst, dass ein Primer-Verlängerungs-System zumindest zwei, besser vier sequenz-spezifische Primer (z.B. allel-diskriminierende Primer) in Kombination mit jeweils einem spezifischen Controller-Oligonukleotiden (z.B. allel-spezifische Controller-Oligonukleotide) umfasst. Somit kann für jede spezifische Zusammensetzung einer Zielsequenz und ihre spezifische Varienten (z.B. Allele) jeweils eine spezifische Kombination aus mindesten einem spezifischen Primer und mindesten einem spezifischen Controller-Oligonukleotid bereitgestellt werden, wobei für alle vier Nukleotid-Varianten an einer bestimmten Position ein spezifisches Primer-Controller-Oligonukleotid bereitgestellt wird.. Bei Anwesenheit von mindesten einer Sequenzvariante der Zielsequenz im Reaktions-Ansatz resultiert eine spezifische Primer-Verlängerung einer der möglichen Sequenzvarianten einer Zielsequenz.
Weiterhin wird die Aufgabe der Erfindung dadurch gelöst, dass ein Primer-Verlängerungs-System zumindest einen sequenz-spezifischen Primer (z.B. allel-diskriminierender Primer) in Kombination mit jeweils einem spezifischen Controller-Oligonukleotiden (z.B. allel-spezifische Controller-Oligonukleotide) und mindesten einen weiteren Primer (einen Kompetitor-Primer) umfasst, welcher zu anderen zu erwartenden Sequenzvarianten eine komplementäre Sequenzzusammensetzung aufweist,. Somit kann für jede spezifische Zusammensetzung einer Zielsequenz und ihre spezifische Varienten (z.B. Allele) jeweils eine spezifische Kombination aus mindesten einem spezifischen Primer und mindesten einem spezifischen Controller-Oligonukleotid bereitgestellt werden. Dabei resultiert eine spezifische Primer-Verlängerung einer der möglichen Sequenzvarianten einer Zielsequenz.
Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin dadurch gelöst, dass beide Stränge einer doppelsträngigen Nukleinsäurekette analysiert werden, wobei in einer Reaktion die Komponenten eines Primer-Verlängerungs-Systems für einen Strang einer Zielnukleinsäure bereitgestellt werden, welche als Start-Nukleinsäure verwendet wird, und in einem getrennten Ansatz werden Komponenten für den komplementären Strang der Zielnukleinsäurekette bereitgestellt, welche als Start-Nukleinsäue verwendet wird. Somit werden mindestens zwei Controller-Oligonukleotide verwerdet, welche je für an einen Strang der Zielnukleinsäurekette binden können (als erster Primer-Verlängerungsprodukt). Beide Controller-Oligonukleotide werden in getrennten Reaktions-Ansätzen verwendet.
Weiterhin wird die Aufgabe der Erfindung dadurch gelöst, dass ein Primer-Verlängerungs-System umfasst zumindest einen Primer, welcher eine Primer-Verlängerung von mehreren potenziellen Sequenzvarianten unterstützen kann (z.B. ein zielsequenzspezifischer Primer, aber kein allel-diskriminierender Primer, ein zielsequenzspezifischer aber ein allelunspezifischer Primer) in Kombination mit jeweils einem spezifischen Controller-Oligonukleotiden (z.B. allel-spezifische Controller-Oligonukleotide) bereitgestellt werden. Somit kann für jede spezifische Zusammensetzung einer Zielsequenz und ihre spezifische Varienten (z.B. Allele) jeweils eine spezifische Kombination aus mindesten einem allelunspezifischen Primer und mindesten einem allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid bereitgestellt werden. Dabei resultiert eine spezifische Primer-Verlängerung einer der möglichen Sequenzvarianten einer Zielsequenz.
Die für eine Primer-Verlängerung erforderlichen Oligonukleotide (mindestens ein zielsequenzspezifischer erster Primer und midnestens ein zielsequenzspezifischer Controller-Oligonukleotid) werden als zielsequenzspezifisches Primer-Verlängerungs-System zusammengefasst.
Da im Ansatz auch mehrere Zielsequenzen vorliegen können, soll durch Verwendung von mehreren zielsequenzspezifischen Primer-Verlängerungs-Systemen in einem Reaktions-Ansatz parallele Primer-Verlängerung von mehr als eine Zielsequenz ermöglicht werden, wobei bevorzugt jeweils zielsequenz-spezifsiche Komponenten kombiniert werden.
Der Einsatz von vordefiniertem Controller-Oligonukleotid ermöglicht somit eine sequenzabhängige Überprüfung der Inhalte von Primer-Verlängerungsprodukten nach einzelnen Synthese-Schritten oder während der Primer-Verlängerung und Herbeiführung einer Selektion bzw. einer Auswahl von Sequenzen für nachfolgende Synthese-Schritte. Dabei kann zwischen „aktiven“, einzelsträngigen Zuständen von neusynthetisierten spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten als Folge einer erfolgreichen Interaktion mit einem Controller-Oligonukleotid, und „inaktiven“ doppelsträngigen Zuständen von neusynthetisierten unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukten als Folge einer mangelhaften und / oder unzureichenden und /oder verminderten und / oder verlangsamten Interaktion mit einem Controller-Oligonukleotid unterschieden werden.
Definitionen und bevorzugte Ausführungsformen:
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die verwendeten Begriffe folgende Bedeutung:
Der Begriff „Oligonukleotid“, wie er hier bezugnehmend auf Primer, Controller-Oligonukleotid, Sonden, zu amplifizierende Nukleinsäurekette verwendet wird, ist als ein Molekül definiert, das zwei oder mehr, bevorzugt mehr als drei Desoxyribonukleotide und / oder Ribonukleotide und / oder Nukleotid-Modifikationen und / oder Nicht-Nukleotid-Modifikationen umfasst. Seine Länge umfasst beispielsweise Bereiche zwischen 3 bis 300 Nukleotid-Einheiten (wobei natürliche Basen und Analoga zusammen oder jeweils allein verwendet werden können), bevorzugt zwischen 5 bis 200 Nukleotid-Einheiten. Der Fachmann versteht, die genaue Größe abhängend von der letztendlichen Funktion oder Verwendung der Oligonukleotide zu bestimmen.
Der Begriff „Primer“, wie er hier verwendet wird, betrifft ein Oligonukleotid, unabhängig davon, ob es natürlicherweise z. B. in einer gereinigten Restriktionsspaltung vorkommt oder synthetisch produziert wurde. Ein Primer ist fähig, als Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn er unter Bedingungen eingesetzt wird, bei denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang komplementären Primer-Verlängerungsproduktes induziert wird, d. h. in Gegenwart von Nukleotiden und einem induzierenden Agens, wie z.B. DNA-Polymerase bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert. Der Primer ist für eine maximale Wirksamkeit bei der Primer-Verlängerung bevorzugt einzelsträngig. Der Primer muss genügend lang sein, um in Gegenwart des induzierenden Agens die Synthese des Verlängerungsproduktes zu initiieren. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Reaktions-Temperatur und der Primerquelle und der Anwendung des Verfahrens. Beispielsweise beträgt die Länge der Oligonukleotid-Primer bei diagnostischen Anwendungen, je nach Komplexität der Zielsequenz zwischen 5 bis 100 Nukleotide, vorzugsweise 6 bis 40 und besonders bevorzugt 7 bis 30 Nukleotide. Kurze Primer-Moleküle erfordern im allgemeinen für Ausübung ihrer Primer-Funktion niedrigere Reaktions-Temperaturen, um genügend stabile Komplexe mit der Matrize zu bilden, oder höhere Konzentrationen von anderen Reaktionskomponenten, beispielsweise von DNA-Polymerasen, so dass eine ausreichende Verlängerung von gebildeten Primer-Matrizen-Komplexen erfolgen kann.
Die hier verwendeten Primer sind so ausgewählt, das sie „im Wesentlichen“ komplementär zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen zu amplifizierenden Sequenz sind. Das bedeutet, dass die Primer genügend komplementär sein müssen, um mit ihren betreffenden Strängen zu hybridisieren und eine Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Somit braucht die Primersequenz beispielsweise nicht die genaue Sequenz der Zielsequenz wiederzuspiegeln. Zum Beispiel kann ein nicht-komplementäres Nukleotidfragment an dem 5'-Ende des Primers angeheftet sein, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem Strang ist. In einer anderen Ausführungsform können einzelne nicht-komplementäre Basen oder längere nicht-komplementäre Sequenzen in einem Primer eingefügt sein, vorausgesetzt, dass die Primersequenz eine genügend große Komplementarität mit der zu amplifizierenden Sequenz des Stranges aufweist, um damit zu hybridisieren und so ein Primer-Matrizen-Komplex fähig zur Synthese des Verlängerungsproduktes zu erzeugen.
Im Rahmen der enzymatischen Synthese eines zu Matrize komplementären Stranges wird ein Primer-Verlängerungsprodukt erzeugt, was vollständig zum Matrizen-Strang komplementär ist.
Der Begriff komplementär im Bezug auf Sequenzen bezieht sich auf hybridisierende Sequenzen mit revers komplementärer Basensequenz.
Allel-spezifische Primer sind Primer, welche durch ihre Sequenzzusammensetzung in der Lage sind, bevorzugt unter stringenten Reaktionsbedinungen an jeweils einzelnen Sequenzvarianten einer Zielsequenz zu hybridisieren und durch eine Polymerase unter Verwendung der Zielsequenz verlängert zu werden. Einzelne allel-spezifische Primer können zu einer Gruppe zusammengefasst werden, welche sämtliche Varianten einer gemeinsamen Zielsequenz abdecken. Eine solche Gruppe von allel-spezifischen Primern umfasst zumindest zwei unterschiedliche allel-spezifische Primer, da ein polymorpher Lokus an einer vorgegeben Position in der Zielsequenz mindestens zwei Sequenzvarianten umfasst. Die allel-spezifischen Primer sind dahingehend ausgewählt, dass sie unter stringenten Reaktionsbedinungen vorzugsweise mit ihrer jeweils spezifischen perfekt-match Matrize Bindung eingehen und somit diese spezifische perfekt-match Matrize zur Ausbildung der jeweiligen Primer-Verlängerungsprodukte unter katalytischer Wirkung der Polymerase verwenden. Vorzugsweise können 3'-terminale Segmente von allel-spezifischen Primern zur Diskriminierung von Varianten von Zielsequenzen verwendet werden und dabei dermassen in ihrer Sequenzzusammensetzung an die jeweiligen Varianten angepasst, dass solche Primer einen perfekt-match Doppelstrang unter stringenten Bedinhungen mit der jeweiligen Variante ausbilden. Solche perfekt-match Doppelstränge können in der Regel von einer Polymerase gut erkannt werden und unter geeigneten Reaktionsbedingungen kommt es zu einer Primer-Verlängerung. Bei der Interkation eines allel-spezifischen Primers mit einer anderen Variante eienr Zielsequenz entsteht somit ein Mismatch-Doppelstrang. Solche Mismatches führen in der Regel zu einer Verzögerung der Verlängerung durch eine Polymerase bzw. zu einer Verlangsamung der Gesamtreaktion. In einer Ausführungsform können allel-spezifischen Primer im 3'-Segment mindestens eine phosphoro-thioat-Bindung umfassen, welche allel-spezifische Primer vor 3'-5'-Nuklease-Abbau durch eine Polymerase schützt.
Mehrere Allel-spezifische Primer umfassen somit Sequenzsegmente, welche für eine Gruppe von allel-spezifischen Primern im Wesentlichen identisch bzw. einheitlich sind, sowie Sequenzsegmente, welche in unter den Primern einer Gruppe unterschiedlich sind und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariante einer Zielsequenz. Unter Einbeziehung von einheitlichen Sequenzsegmenten können solche Primer an die jeweilige Zielsequenz unter Reaktionsbedinungen hybridisieren. Unter Einbeziehung von charakteristischen Sequenzsegmenten kann ein jeweiliger Primer spezifisch an eine Sequenzvariante der Zielsequenz unter Ausbildung eines perfekt-match Doppelstranges binden. Vorzugsweise sind die Primer dermassen konstruiert, dass unter verwendeten Reaktionsbedinungen die Bindung an eine Zielsequenz unter Ausbildung eines perfekt-match Doppelstranges bevorzugt wird und die Bindung an einer Zielsequenz unter Ausbildung eines Mismatch-Doppelstranges weniger bevorzugt wird.
In einer Ausführungsform wird das erste Primer-Oligonukleotid als allel-spezifsicher Primer in Kombination mit einem entsprechenden allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird das zweite Primer-Oligonukleotid als allel-spezifsicher Primer in Kombination mit einem entsprechenden allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid bereitgestellt.
Tm-Schmelztemperatur
Als Schmelztemperatur eines komplementären oder partiell komplementären Doppelstranges wird im Allgemeinen ein Messwert einer Reaktionstemperatur verstanden, bei welchem ca. die Hälfte der Stränge als Doppelstrang vorliegt und die andere Hälfte als Einzelstrang vorliegt. Das System (Assoziation und Dissoziation von Strängen) befindet sich im Gleichgewicht.
Aufgrund einer Vielzahl von Faktoren, welche die Tm eines Doppelstranges beeinflussen können (z.B. Sequenzlänge, CG-Gehalt der Sequenz, Puffer-Bedinungen, Konzentration von divalenten Metal-Kationen etc.) sollte die Bestimmung der Tm einer zu amplifizierenden Nukleinsäure unter gleichen Bedinungen erfolgen, wie die beabsichtigte Primer-Verlängerungsreaktion.
Wegen Abhängigkeit der messbaren Schmelztemperatur von multiplen Reaktions-Parametern, z.B. von jeweiligen Puffer-Bedingungen und jeweiligen Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer, wird unter Schmelztemperatur ein Wert verstanden, welcher in gleichem Reaktionspuffer gemessen wurde wie die exponentielle Amplifikation, bei Konzentrationen von beiden komplementären Komponenten eines Doppelstranges von etwa 0,1µmol/l bis etwa 10 µmol/l, bevorzugt in Konzentration von etwa 0,3 µmol/ bis ca. 3 µmol/l, vorzugsweise bei ca. 1 µmol/l. Bei dem jeweiligen Wert der Schmelztemperatur handelt sich um einen Richtwert, welcher mit der Stabilität eines jeweiligen Doppelstranges korreliert.
Eine Schmelztemperatur für einen Doppelstrang kann grob abgeschätzt werden. Mehrere kommerzielle Anbieter ermöglichen eine theoretische Berechnung einer zu erwartenden Schmelztemperatur. Beispielsweise kann Software-Packet OligoAnalyzer 3.1 (online zugängig bei IDT (Intergrated DNA-Technologies) zur Abschätzung der Stärke der Bindungen einzelner Oligonukleotide verwendet werden.
Die Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und TTP (oder dUTP, oder dUTP/TTP-Gemisch) werden in adäquaten Mengen zum Synthesegemisch gegeben. In einer Ausführungsform können zusätzlich zu dNTPs mindestens eine weitere Art von dNTP-Analoga zum Synthesegemisch zugegeben werden. Diese dNTP-Analoga umfassen in einer Ausführungsform beispielsweise eine charakteristische Markierung (z.B. Biotin oder Fluoreszenzfarbstoff), so dass wenn in Nukleinsäurestrang eingebaut, auch diese Markierung in den Nukleinsäurestrang integriert ist. In einer anderen Ausführungsform umfassen diese dNTP-Analoga mindestens eine Modifikation von Zucker-Phosphat-Anteil des Nukleotids, z.B. alpha-Phosphorothioat-2'-Desoxyribonukleosid-Triphosphate (oder andere Modifikationen, welche einem Nukleinsäurestrang eine Nuklease-Resistenz verleihen), 2',3'-Dideoxy-Ribonukleosid-Triphosphate, Azyklo-Nukleosid-Triphosphate (oder andere zur Termination einer Synthese führende Modifikationen). In einer weiteren Ausführungsform umfassen diese dNTP-Analoga mindestens eine Modifikation von Nukleobase, z.B. Iso-Cytosine, Iso-Guanosine (oder auch andere Modifikationen der Nukleobasen des erweiterten genetischen Alphabets), 2-Amino-Adenosine, 2-Thiouridine, Inosine, 7-deazy-adenosine, 7-deaza-guanosine, 5-Me-Cytosine, 5-Propyl-Uridine, 5-Propyl-Cytosine (oder auch andere Modifikationen von Nukleobasen, welche gegenüber natürlichen Nukleobasen durch eine Polymerase eingebaut werden können und zur Änderung der Strang-Stabilität führen). In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein dNTP-Analog sowohl eine Modifikation der Nukleobase als auch eine Modifikation des Zucker-Phosphat-Anteils. In einer weiteren Ausführungsform wird statt mindestens eines natürlichen dNTP-Substrates mindesten eine weitere Art von dNTP-Analoga zum Synthesegemisch zugegeben.
Das die Nukleinsäure-Synthese induzierende Agens kann eine Enzyme einschließende Verbindung oder ein System sein, das so wirkt, dass dadurch die Synthese der Primer-Verlängerungsprodukte bewirkt wird. Geeignete Enzyme für diesen Zweck umfassen z.B. matrizenabhängige DNA-Polymerasen wie Bst Polymerase und ihre Modifikationen, Vent Polymerase und andere - bevorzugt hitzestabile DNA-Polymerasen, die den Einbau der Nukleotide in der korrekten Weise ermöglichen, wodurch die Primer-Verlängerungsprodukte gebildet werden, die zu jedem synthetisierten Nukleinsäurestrang komplementär sind. Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet dann in 5'- Richtung entlang des Matrizenstranges fort, bis die Synthese beendet ist oder unterbrochen wird.
Bevorzugt werden Polymerasen verwendet, welche zu Strangverdrängung fähig sind. Dazu zählen beispielsweise großes Fragment der Bst Polymerase oder ihre Modifikationen (z.B. Bst 2.0 DNA Polymerase), Klenow Fragment, Vent exo minus Polymerase, Deepvent exo minus DNA Polymerase, großes Fragment der Bsu DNA Polymerase, großes Fragment der Bsm DNA Polymerase.
In einer Ausführungsform werden bevorzugt Polymerasen eingesetzt, welche keine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität aufweisen, bzw. keine 5'-3'-FEN-Aktivität aufweisen.
In einer Ausführungsform werden mindestens zwei verschiedene Polymerasen eingesetzt, beispielsweise Polymerasen welche zu Strangverdrängung fähig sind und solche, welche eine 3'-5'-Proofreading Aktivität aufweisen.
In bevorzugten Ausführungsformen werden Polymerasen mit einer Hotstart-Funktion eingesetzt, welche erst beim Erreichen einer bestimmten Temperatur ihre Funktion entfalten können.
Erstes Primer-Oligonukleotid:
Das Primer-Oligonukleotid umfasst einen ersten Primer-Bereich und einen zweiten Bereich. Der erste Primer-Bereich ist in der Lage, an eine im Wesentlichen komplementäre Sequenz innerhalb der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder ihrer Äquivalente zu binden und eine Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Der zweite Bereich umfasst einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in der Lage ist, ein Controller-Oligonukleotid zu binden und damit eine räumliche Nähe zwischen dem Controller-Oligonukleotid und den anderen Teilen des ersten Primer-Verlängerungsproduktes zu bewirken, welche ausreichend ist, um eine Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid zu initiieren. Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids umfasst weiterhin mindestens eine Modifikation (eine Nukleotid-Modifikation oder eine nicht-Nukleotid-Modifikation), welche die Polymerase am Kopieren des Polynukleotid-Schwanzes hindert, indem die Fortführung der polymeraseabhängigen Synthese gehemmt wird. Diese Modifikation ist beispielsweise am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des Primer-Oligonukleotid lokalisiert. Der erste Primer-Bereich des Primer-Oligonukleotides ist folglich durch eine Polymerase kopierbar, so dass eine komplementäre Sequenz zu diesem Bereich während der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes von der Polymerase erzeugt werden kann. Der Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des Primer-Oligonukleotides wird vorzugsweise durch die Polymerase nicht kopiert.
Bevorzugte Ausführungsformen des ersten Primer-Oligonukleotids
In einer Ausführungsform wird dies durch die Modifikation im zweiten Bereich erreicht, welche die Polymerase vor dem Polynukleotid-Schwanz stoppt. In einer weiteren Ausführungsform wird dies durch Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich erreicht, wobei der gesamte Polynukleotid-Schwanz im Wesentlichen aus solchen Nukleotid-Modifikationen besteht und somit für Polymerase unkopierbar ist.
In einer Ausführungsform ist ein jedes Primer-Oligonukleotid spezifisch für je eine zu amplifizierende Nukleinsäure.
In einer Ausführungsform ist ein jedes Primer-Oligonukleotid spezifisch für mindestens zwei der zu amplifizierenden Nukleinsäuren, welche jeweils im Wesentlichen unterschiedliche Sequenzen umfassen.
In einer Ausführungsform ist das Primer-Oligonukleotid mit einem charakteristischen Marker markiert, z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. TAMRA, Fluoreszein, Cy3, Cy5) oder einem Affinitätsmarker (z.B. Biotin, Digoxigenin) oder einem zusätzlichen Sequenzfragment, z.B. zur Bindung einer spezifischen Oligonukleotid-Sonde für Detektion oder Immobilisierung oder zur Barcode-Markierung.
In einer Ausführungsform wird mindestens ein erstes Primer-Oligonukleotid als allel-spezifsicher Primer in Kombination mit mindestens einem entsprechenden allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid bereitgestellt.
Primerverlängerungsprodukt:
Ein Primerverlängerungsprodukt (auch Primer-Extensionsprodukt genannt) entsteht durch enzymatische (polymeraseabhängige) Verlängerung eines Primer-Oligonukleotides als Ergebnis einer matrizenabhängigen Synthese, welche durch eine Polymerase katalysiert wird.
Ein Primerverlängerungsprodukt umfasst die Sequenz des Primer-Oligonukleotid in seinem 5'-Segment und die Sequenz des Verlängerungsproduktes (auch Extensions-Produkt genannt), welches durch eine Polymerase in matrizenabhängiger Form synthetisiert wurde. Das durch die Polymerase synthetisierte Verlängerungsprodukt ist komplementär zum Matrizenstrang, an welchem es synthetisiert wurde.
Ein spezifisches Primerverlängerungsprodukt (Hauptprodukt) umfasst Sequenzen der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette. Es ist Ergebnis einer spezifischen Synthese bzw. einer korrekten Ausführung einer beabsichtigten Primerverlängerungsreaktion bei welcher die spezifisch zu amplifizierende Nukleinsäurekette als Matrize dient.
Die Länge des Verlängerungsproduktes eines spezifischen Primerverlängerungsproduktes kann zwischen 10 und 300 Nukleotiden, besser zwischen 10 und 180 Nukleotiden liegen, bevorzugt zwischen 20 und 120 Nukleotiden, besonders bevorzugt zwischen 30 und 80 Nukleotiden.
Ein unspezifisches Primerverlängerungsprodukt (Nebenprodukt) umfasst beispielsweise Sequenzen, welche als Ergebnis einer unspezifischen bzw. inkorrekten bzw. nicht beabsichtigten Primer-Verlängerungsreaktion entstanden sind. Diese schließen beispielsweise Primer-Verlängerungsprodukte ein, welche als Folge eines falschen Initiierungs-Ereignisses (falsches Primings) oder als Folge anderer Nebenreaktionen, einschließlich polymeraseabhängigen Sequenzveränderungen wie Basen-Substitution, Deletion etc., entstanden sind. Das Ausmaß an Sequenzabweichungen von unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukten übersteigt im Allgemeinen die Fähigkeit von Controller-Oligonukleotide, solche doppelsträngige Nebenprodukte erfolgreich von ihren Matrizen zu verdrängen, so dass Amplifikation von solchen Nebenprodukten langsamer verläuft oder vollständig ausbleibt. Das Ausmaß der Akzeptanz bzw. die Toleranzgrenze zu Abweichungen sind abhängig beispielsweise von Reaktionstemperatur und Art und Weise der Sequenzabweichung. Beispiele für unspezifische Primer-Verlängerungsprodukte bilden Primer-Dimere oder Sequenzvarianten, welche nicht der zu amplifizierenden Nukleinsäure entsprechen, z.B. Sequenzen, welche keine Zielsequenz umfassen.
Die Beurteilung einer hinreichenden Spezifität der Amplifikation hängt häufig mit der Aufgabenstellung zusammen. In vielen Amplifikationsverfahren kann ein gewisses Maß der Unspezifität der Amplifikationsreaktion toleriert werden, solange das gewünschte Ergebnis erreicht werden kann.
Bevorzugte Ausführungsformen des ersten Primerverlängerungsprodukts:
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Anteil von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten am Gesamtergebnis der Reaktion mehr als als 1 %, besser mehr als 10 %, noch bevorzugter mehr als 30 % gemessen an Gesamtmenge von neusynthetisierten Stränge.
In einer bevorzugten Ausführungsform stimmt die Sequenz der synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte mit der zu erwartenden Sequenz einer zu amplifizierenden Nukleinsäure komplett überein. In einer anderen Ausführungsform können Abweichungen in der erhaltenen Sequenz von der theoretisch zu erwartenden Sequenz toleriert werden. In einer Ausführungsform liegt das Ausmaß der Übereinstimmung der erhaltenen Sequenz infolge einer Amplifikation mit der Sequenz der theoretisch zu erwartenden zu amplifizierenden Nukleinsäure beispielsweise zwischen 90 % und 100 %, bevorzugt liegt die Übereinstimmung bei über 95 %, idealerweise liegt die Übereinstimmung über 98 % (gemessen am Anteil der synthetisierten Basen).
Das erste Primer-Verlängerungsprodukt wird ausgehend von einem ersten Primer-Oligonukleotid gebildet. Ein Kompetitor-Primer-Verlängerungsprodukt wird ausgehend von einem Kompetitor-Primer-Oligonukleotid gebildet.
Ein Primerverlängerungsprodukt kann in einer Ausführngsform als eine Start-Nukleinsäurekette dienen, welche eine Zielnukleinsäure umfassenden Sequenz umfasst.
Zielsequenz:
Eine Zielsequenz ist in einer Ausführungsform ein Segment einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette, welches als charakteristische Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure dienen kann. Diese Zielsequenz kann als Marker für die Anwesenheit oder Abwesenheit einer anderen Nukleinsäure dienen. Diese andere Nukleinsäure dient somit als Quelle der Zielsequenz und kann beispielsweise eine genomische DNA oder RNA oder Teile der genomischen DNA oder RNA (z.B. mRNA), oder Äquivalente der genomischen DNA oder RNA eines Organismus sein (z.B. cDNA, modifizierte RNA wie rRNA, tRNA, microRNA etc.), oder definierte Veränderungen der genomischen DNA oder RNA eines Organismus umfassen, beispielsweise Mutationen (z.B. Deletionen, Insertionen, Substitutionen, Additionen, Sequenzvermehrung, z.B. Repeat-Vermehrung im Rahmen von Mikrosatellit-Instabilität), Splice-Varianten, Rearrangement-varianten (z.B. T-Zell-Rezeptor Varianten) usw. Die einzelnen Zielsequenzen können für ein phänotypisches Merkmal stehen, beispielsweise für Antibiotika-Resistenz oder prognostische Information haben und somit für diagnostische Assays / Teste vom Interesse sein. Als Quelle / Ursprung einer Zielsequenz kann eine solche Nukleinsäure beispielsweise die Zielsequenz als Sequenz-Element ihres Stranges umfassen. Eine Zielsequenz kann somit als charakteristischer Marker für einen bestimmten Sequenzinhalt einer anderen Nukleinsäure dienen.
Die Zielsequenz kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Sie kann mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure im Wesentlichen identisch sein oder nur einen Teil der zu amplifizierenden Nukleinsäure darstellen.
Äquivalente der Zielsequenz umfassen Nukleinsäuren mit im wesentlichen identischen Informationsgehalt. Beispielsweise haben komplementäre Stränge einer Zielsequenz identischen Informationsgehalt und können als äquivalent bezeichnet werden, RNA und DNA Varianten einer Sequenz sind ebenfalls Beispiele für äquivalenten Informationsgehalt.
Im Rahmen der Material-Vorbereitung vor Amplifikations-Reaktion kann eine solche Zielsequenz aus ihrer ursprünglichen Sequenzumgebung isoliert werden und für die Amplifikationsreaktion vorbereitet werden.
Bevorzugte Ausführungsformen der Zielsequenz:
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine zu amplifizierende Nukleinsäure eine Zielsequenz. In einer Ausführungsform entspricht die Zielsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Start-Nukleinsäurekette eine Zielsequenz. In einer Ausführungsform entspricht die Zielsequenz einer Start-Nukleinsäurekette.
Die zu amplifizierende Nukleinsäure stellt eine Nukleinsäurekette dar, welche sequenzspezifisch oder zumindest vorwiegend sequenzspezifisch mit Hilfe der exponentiellen Amplifikation unter Einsatz von Primern und Controller-Oligonukleoid durch die Polymerase amplifiziert werden soll.
Die Länge der zu amplifizierenden Nukleinsäure kann zwischen 20 und 300 Nukleotiden, besser zwischen 30 und 200 Nukleotiden liegen, bevorzugt zwischen 40 und 150 Nukleotiden, besonders bevorzugt zwischen 50 und 100 Nukleotiden.
Die zu amplifizierende Nukleinsäurekette kann eine oder mehrere Zielsequenzen oder ihre Äquivalente umfassen. Weiterhin kann eine zu amplifizierende Nukleinsäure die im Wesentlichen zu einer Zielsequenz komplementären Sequenzen umfassen, welche mit ähnlicher Effizienz wie eine Zielsequenz in einer Amplifikationsreaktion vermehrt werden und Zielsequenz oder ihre Abschnitte umfasst. Zusätzlich zu einer Zielsequenz kann die zu amplifizierende Nukleinsäure weitere Sequenzsegmente einschließen, beispielsweise Primer-Sequenzen, Sequenzen mit Primer-Bindungsstellen und /oder Sequenzsegmente für Bindung von Detektions-Sonden, und / oder Sequenzsegmente für Sequenz-Kodierung von Strängen durch Barcode-Sequenzen und / oder Sequenzsegmente für Bindung an eine feste Phase. Die Primer-Sequenzen oder ihre Sequenzanteile, sowie Primer-Bindungsstellen oder ihre Sequenzanteile können beispielsweise zu Sequenzabschnitten einer Zielsequenz gehören.
In einer Ausführungsform entspricht die zu amplifizierende Nukleinsäure der Zielsequenz.
In einer anderen Ausführungsform bildet die Zielsequenz einen Teil der Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette. Eine solche Zielsequenz kann von 3'-Seite und / oder von 5'-Seite von weiteren Sequenzen flankiert sein. Diese weiteren Sequenzen können beispielsweise Bindungsstellen für Primer oder ihre Anteile umfassen, und / oder Primer-Sequenzen oder ihre Anteile umfassen, und/ oder Bindungsstellen für Detektions-Sonden umfassen, und / oder Adaptor-Sequenzen für komplementäre Bindung an eine feste Phase (z.B. Im Rahmen von Microarrays, oder Bead-basierten Analysen) umfassen und / oder Barcoding-Sequenzen für eine digitale Signatur von Sequenzen umfassen.
Damit die Amplifikation starten kann, muss zu Beginn der Reaktion eine Nukleinsäurekette in das Reaktionsgemisch gegeben werden, welche als initiale Matrize für die Synthese der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette auftritt. Diese Nukleinsäurekette wird als Start-Nukleinsäurekette bezeichnet. Diese Start-Nukleinsäurekette gibt die Anordnung einzelner Sequenz-Elemente vor, welche für die Bildung / Synthese / exponentielle Amplifikation einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette von Bedeutung sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform entspricht die initiale Matrize (Start-Nukleinsäurekette), welche einer Amplifikationsreaktion zu Beginn zugeführt wird, bzw. welche in das Reaktionsgemisch gegeben wird, der Sequenz-Zusammensetzung der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette.
In anfänglichen Stadien der Amplifikatons-Reaktion und in ihrem weiteren Verlauf binden die jeweiligen Primer an die entsprechenden Bindungsstellen in der Start-Nukleinsäurekette und initiieren die Synthese von spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten. Solche spezifischen Primer-Verlängerungsprodukte akkumulieren im Verlauf der Amplifikation in exponentieller Art und Weise und übernehmen zunehmend die Rolle von Matrizen für Synthese komplementärer Primer-Verlängerungsprodukte bei einer exponentiellen Amplifikation.
Durch die wiederholten matrizen-abhängige Synthese-Vorgänge im Rahmen einer exponentiellen Amplifikation wird somit die zu amplifizierende Nukleinsäurekette gebildet.
Gegen Ende einer Amplifikationsreaktion kann das Hauptprodukt der Reaktion (die zu amplifizierende Nukleinsäure) vorwiegend einzelsträngig sein oder vorwiegend einen komplementären Doppelstrang bilden. Dies kann beispielsweise durch die relative Konzentrationen von beiden Primern und entsprechende Reaktionebedinungen bestimmt werden.
Äquivalente der zu amplifizierenden Nukleinsäure umfassen Nukleinsäuren mit im Wesentlichen identischen Informationsgehalt. Beispielsweise haben komplementäre Stränge einer zu amplifizierenden Nukleinsäure identischen Informationsgehalt und können als äquivalent bezeichnet werden.
Allel-Varianten einer Zielsequenz / Polymorpher Lokus einer Zielsequenz
Eine Zielsequenz (z.B. ein charakteristisches Segment einer DNA oder RNA) kann mehrere in der Natur vorkommende Sequenzvarianten oder künstlich eingeführte Sequenzveränderungen umfassen. Solche Varianten werden häufig als Polymorphismen eines Lokus oder Allel-Sequenzen genannt. Weiterhin können diese Varianten einer Zielsequenz spezifische Veränderungen des natrülichen Zustandes der DNA abbilden, welche z.B. durch Mutationen / Mutagenese enstehen und bei Vermehrung einer Zell-masse charakteristische Merkmale eines solchen klonalen Vermehrungvorgangs darstellen (z.B. bei Krebs-Erkrankungen oder bei biotechnologischen verwertbaren Stämmen). Bei einzelnen Allel-Sequenzen einer Zielsequenz kann es dabei um Sequenzunterschiede handeln, welche einzelne Nukleotide umfassen (z.B. A-> G oder T->C Substitutionen oder Einzelnukleotid-Insertionen bzw. Deletionen) oder ein Sequenzunterschied kann auch mehrere Nukleotide umfassen (z.B. 2 bis 200 Nukleotide). Dabei kann es sich beispielsweise um Deletionen / Insertionen / Transversionen / Duplikationen etc. handeln. Ein Sequenzsegment umfassend solche Sequenzvarianten einer Zielsequenz wird häufig als polymorpher Lokus genannt. Eine Zielsequenz kann einen oder auch mehrere polymorphe Loci umfassen.
Die Sequenz-Positionen von einzelnen Allel-Varianten einer Zielsequenz sind in der Regel bekannt und erlauben somit ein Design von sequenzspezifischen Reaktions-Komponenten, z.B. Controller-Oligonukleotide oder von Kombinationen umfassend ein Controller-Oligonukleotid und einen ersten Primer oder ein Controller-Oligonukleotid und einen zweiten Primer.
Die Ausführungsformen von Zielsequenzen:
In einer Ausführungsform umfasst eine Zielsequenz, welche mehrere Sequenzvarianten in einem polymorphen Lokus umfassen kann, weiterhin mindestens ein erstes Zielsequenzsegment, welches für alle Zielsequenzvarianten einer Zielsequenz (Zielsequenz-Gruppe) charakteristisch und einheitlich ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Zielsequenz mindestens zwei Zielsequenzsegmente (ein erstes Zielsequenzsegment und ein zweites Zielsequenzsegment, jedes dieser Zielsequenzsegmente für alle Zielsequenzvarianten einer Zielsequenz (Zielsequenz-Gruppe) charakteristisch und einheitlich ist.. Solche einheitliche Zielsequenzsegmente sind vorzugsweise auf beiden Seiten eines polymorphen Lokus lokalisiert und flankieren somit einen polymorpehen Lokus (mit Sequenzvarianten) einer Zielsequenz von beiden Seiten. Vorzugsweise unterscheiden sich das erste einheitliche Zielsequenzsegment in seiner Sequenzzusammensetzung von der Sequenzzusammensetzung des zweiten einheitlichen Zielsequenzsegments in mindestens einer Nukleotid-Position.
Die Länge eines polymorphen Lokus einer Zielsequenz kann Bereiche von einem Nukleotid bis zu 200 Nukleotiden, besser von einem Nukleotid bis zu 100 Nukleotiden, bevorzugt von einem Nukleotid bis zu 50 Nukleotiden, besonders bevorzugt von einem Nukleotid bis zu 20 Nukleotiden umfassen. Die Längen von einem einheitlichen Sequenzsegmenten (erstes und zweite einheitliches Sequenzsegment) kann zumindest für eines der beiden Segmente folgende Bereiche umfassen: von 6 bis 300 Nukleotiden, besser von 10 bis 200 Nukleotiden, bevorzugt von 15 bis 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 20 bis 100 Nukleotiden.
In einer Ausführungsform können einzelne Sequenz-Varianten einer Zielsequenz-Gruppe zusammengefasst werden, wobei solche Varianten mindestens ein für diese Zielsequenz (Zielsequenz-Gruppe) einheitliches und spezifisches Sequenzsegmenten definiert sind. Einzelne Sequenzvarianten einer solchen Zielsequenz (Zielsequenz-Gruppe) unterscheiden sich somit durch Sequenz-Segmente des polymorphen Lokus.
In einer weiteren Ausführungsform können einzelne Sequenz-Varianten einer Zielsequenz-Gruppe zusammengefasst werden, wobei solche Varianten mindestens zwei für diese Zielsequenz (Zielsequenz-Gruppe) einheitliche und spezifische Sequenzsegmente definiert sind. Einzelne Sequenzvarianten einer solchen Zielsequenz (Zielsequenz-Gruppe) unterscheiden sich somit durch Sequenz-Segmente des polymorphen Lokus. Vorzugsweise liegt der polymorphe Lokus zwischen beiden einheitlichen Sequenzsegmenten.
In einer Ausführungsform können zwei unterschiedliche Zielsequenzen in einer Amplifikations-Reaktion jeweils spezifisch amplifiziert werden.
Unterschiedliche Zielsequenzen sind dadurch charakterisiert, dass sie vorzugsweise durch für jede Zielsequenz spezifische und charakteristische Sequenzen unter einander differenzierbar sind. Vorzugsweise sind unterschiedliche Zielsequenzen in ihrer gesamten Länge durch jeweils spezifische und charakteristische Sequenzen differenzierbar und somit keine Sequenzsegmente umfassen, welche für beide Zielsequenzen identisch sind. In einer weiteren Ausführungsform können unterschiedliche Zielsequenzen mindesten ein Sequenzsegment umfassen, welches für mindestens zwei unterschiedliche Zielsequenzen im Wesentlichen ähnlich oder sogar identisch st. Die Länge eines solchen Sequenzsegmentes beträgt gleich / oder weniger als 19 Nukleotide (gezählt als aneinander gekoppelte Nukleotid-Positionen), besser gleich / oder weniger als 14 Nukleotide (als aneinander gekoppelte Nukleotid-Positionen), bevorzugt gleich / oder weniger als 9 Nukleotide (als aneinander gekoppelte Nukleotid-Positionen), besonders bevorzugt gleich / oder weniger als 5 Nukleotide (als aneinander gekoppelte Nukleotid-Positionen)
Start-Nukleinsäurekette stellt eine bevorzugte Ausführungsform eines Zielnukleinsäure umfassenden Sequenz segmentes, welches als Produkt einer Primer-Verlängerungs-Reaktion resultieren soll.
Damit die Amplifikation starten kann, muss zu Beginn der Reaktion eine Nukleinsäurekette in das Reaktionsgemisch gegeben werden, welche als initiale Matrize für die Synthese der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette auftritt. Diese Nukleinsäurekette wird als Start-Nukleinsäurekette bezeichnet. Diese Start-Nukleinsäurekette gibt die Anordnung einzelner Sequenz-Elemente vor, welche für die Bildung / Synthese / exponentielle Amplifikation einer zu amplifizierenden Nukleinsäurkette von Bedeutung sind.
Eine solche Start-Nukleinsäurekette kann einzelsträngig oder doppelsträngig zu Beginn der Reaktion vorliegen. Wenn die komplementären Stränge der Start-Nukleinsäurekette voneinander getrennt sind, können die Stränge unabhängig davon, ob die Nukleinsäure ursprünglich doppel- oder einzelsträngig vorlag, als Matrize für die Synthese von spezifischen komplementären Primer-Verlängerungsprodukte dienen.
Die Start-Nukleinsäurekette umfasst in einer Ausführungsform eine Zielsequenz oder ihre Teil-Segmente, welche zumindest eine zu erwartende Sequenz-Variante eines polymorphen Lokus der Zielsequenz umfassen.
Eine Start-Nukleinsäure umfasst weiterhin zumindest ein vorwiegend einzelsträngiges Sequenzsegment, zu welchem mindestens eines der Primer des Amplifikations-Systems mit seinem 3'-Segment vorwiegend komplementär binden kann, so dass verwendete Polymerase einen solchen Primer, wenn hybridisiert an die Start-Nukleinsäurekette, matrizenspezifsiche unter Einbau von dNTPs verlängern kann.
Eine Start-Nukleinsäurekette umfasst in einer weiteren Ausführungsform eine Zielsequenz oder ihre Teil-Segmente, welche zumindest eine zu erwartende Sequenz-Variante eines polymorphen Lokus der Zielsequenz und mindestens ein einheitliches Sequenzsegment einer Zielsequenz umfassen.
Eine Start-Nukleinsäurekette umfasst in einer weiteren Ausführungsform eine Zielsequenz oder ihre Teil-Segmente, welche zumindest eine zu erwartende Sequenz-Variante eines polymorphen Lokus der Zielsequenz und mindestens zwei einheitliche Sequenzsegmente einer Zielsequenz umfassen, wobei einheitliche Sequenzsegmente einer Zielsequenz den polymorphen Lokus mit möglichen Sequenzvarianten auf beiden Seiten flankieren.
Controller-Oligonukleotid/Controller:
Das Controller-Oligonukleotid ist eine einzelsträngige Nukleinsäurekette, welche eine vordefinierte im wesentlichen komplementäre Sequenz in einem Teil des Primer-Verlängerungsprodukts einschließt, welches im Rahmen der Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäure spezifisch generiert wird. Dadurch kann das Controller-Oligonukleotid an das Primer-Oligonukleotid und mindestens an das 5'-Segment des spezifischen Verlängerungsprodukts des Primer-Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär binden. Das Controller-Oligonukleotid umfasst in seinen inneren Sequenzsegment in einer Ausführungsform Nukleotid-Modifikationen, welche die Polymerase daran hindern, einen komplementären Strang unter Verwendung des Controller-Oligonukleotides als Matrize zu synthetisieren, wenn das Primer-Oligonukleotid an das Controller-Oligonukleotid komplementär gebunden ist.
In einer Ausführungsform wird bei der Primer-Verlängerungsreaktion identischer Controller verwendet, wie bei der nachfolgenden Säure-Reaktion.
In einer weiteren Ausführungsform wird bei der Primer-Verlängerungsreaktion ein Controller verwendet, welcher sich von dem in der nachfolgenden Säure-Reaktion unterscheidet.
Das Zielsequenz-spezifische Controller-Oligonukleotid wird vorzugsweise dermassen konstruiert, dass es in der Lage ist, bei Amplifikation von bevorzugt einer definierten spezifischen Sequenz-Variante einer vordefinierten Zielsequenz mitzuwirken.
Das Allel-spezifische Controller-Oligonukleotid wird vorzugsweise dermassen konstruiert, dass es in der Lage ist, die Amplifikation einer spezifischen Sequenz-Varianten einer Zielsequenz (z.B. Allel 1) bevorzugt zu bewirken, wobei bei einer anderen Sequenz-Variante dergleichen Zielsequenz (z.B. Allel 2) verläuft Amplifikation mit verminderter Effizient bzw. findet in der vorgegebener Zeit gar nicht statt, bzw. resultiert in einer nicht für eine Detektion hinreichender Ausbeute an Amplifikationsprodukten. Somit ergeben sich messbare Unterschiede im Verlauf einer Amplifikations-Reaktion, welche davon abhängen, ob die Sequenz eines für eine Allel-Variante spezifischen Controller-Oligonukleotid mit der Sequenz einer zu Beginn der Reaktion bereitgestellte Nukleinsäurekette, welche als Start-Nukleionsäure dient und die Zielsequenz mit einem polymorphen Lokus umfasst, spezifisch übereinstimmt oder nicht. Bei Übereinstimmung bzw. perfekt-match Komplementarität zwischen der Sequenzzusammensetzung des polymorphen Lokus einer Start-Nukleinsäurekette und einem korrespondierenden Sequenzsegment im Controller-Oligonukleotid erfolgt eine spezifische charakteristische Amplifikation. Bei fehlender Übereinstimmung bzw. mismatch Komplementarität zwischen der Sequenzzusammensetzung des polymorphen Lokus einer Start-Nukleinsäurekette und einem korrespondierenden Sequenzsegment im Controller-Oligonukleotid verläuft Amplifikation anders als eine spezifische charakteristische Amplifikation.
Ein Allel-spezifisches Controller-Oligonukleotid wird somit nicht nur zielsequenzspezifisch, sonder auch allel-spezifisch bereitgestellt. Je nach Komplexität eines polymorphen Lokus einer Zielsequenz können somit mehrere, für jeweilige allel-Variante einer Zielsequenz spezifische Controller-Oligonukleotide konstruiert werden.
Vorzugsweise umfasst ein Controller-Oligonukleotid mindestens ein Sequenzsegment, welches zu einer spezifischen Allel-Variante einer Zielsequenz komplementäre Sequenzzusammensetzung aufweist. Weiterhin umfasst ein Controller-Oligonukleotid vorzugsweise mindestens ein Sequenzsegment, welches für alle Sequenzvarianten einer Zielsequenz einheitliche komplementäre Sequenz umfasst. In einer Ausführungsform umfasst ein Controller-Oligonukleotid, welches mindestens ein Sequenzsegment umfasst, welches komplementär an eine Variante eines polymorphen Lokus einer Zielsequenz komplementär binden kann.
In einer Ausführungsform werden mehrere Controller-Oligonukleotide bereitgestellt, welche jeweils allel-spezifische Sequenzsegmente umfassen.
Die Länge eines zum polymorphen Lokus einer Start-Nukleinsäureke komplementären Sequenzsegmentes eines Controller-Oligonukleotide kann Bereiche von einem Nukleotid bis zu 100 Nukleotiden, besser von einem Nukleotid bis zu 50 Nukleotiden, bevorzugt von einem Nukleotid bis zu 20 Nukleotiden umfassen. Die Länge von mindestens einem Sequenzsegment eines Controller-Oligonukleotides, welches zu einheitlichen Sequenzsegmenten einer Zielsequenz (erstes und zweite einheitliches Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäure) komplementär ist, kann folgende Bereiche umfassen: von 4 bis 100 Nukleotide, besser von 6 bis 100 Nukleotide, bevorzugt von 8 bis 50 Nukleotide.
In einer Ausführungsform wird ein Sequenzsegment eines Controller-Oligonukleotide, welches zu mindestens einer Variante eines polymophen Lokus einer Zielsequenz komplementär ist, im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides lokalisiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Sequenzsegment eines Controller-Oligonukleotide, welches zu mindestens einer Variante eines polymophen Lokus einer Zielsequenz komplementär ist, im zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotides lokalisiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Sequenzsegment eines Controller-Oligonukleotide, welches zu mindestens einer Variante eines polymophen Lokus einer Zielsequenz komplementär ist, teilweise und / oder vollständig im zweiten und im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides lokalisiert.
Die Ausbildung von Basenpaaren unter zwei Nukleinsäuresträngen kann im Wesentlichen komplementär erfolgen, das bedeutet, dass zwischen 70% und 100%, besser zwischen 90% und 100%, bevorzugt zwischen 95% und 100% von Nukleotiden eines Stranges komplementär aneinander binden können. Bespielsweise kann eine Nukleotid-Position in einem Strang von 20 Nukleotiden keine komplementäre Bindung aufweisen, das entspricht 95% Komplementarität.
Bei Perfekt-Match-Bindung von zwei Sequenzen erfolgt vorzugsweise Ausbildung von komplementären Basenpaarungen zu 100% zwischen beiden Strängen einer Duplex. Eine perfekt-match Duplex, umfasst somit einen Mismatch zwischen Strängen.
Allgemeine Strukturmerkmale eines Controller-Oligonukleotid/Primer-Systems (Feedback-System) und eines Primer-Matrize-Systems (Synthesesystem).
Die Controller-Oligonukleotide dienen vorzugsweise nicht als Matrizen für Primer-Verlängerung. Die Verlängerung von korrespondierenden Primern an Controller-Oligonukleotiden wird vorzugsweise durch eine Modifikation von Controller-Strängen verhindert. Das Controller-Oligonukleotid ist in der Lage, an einen Überhang am Primer zu binden (der erster Bereich des Controller-Oligonukleotides bindet vorzugsweise spezifisch an den zweiten Bereich des entsprechenden Primers) und kann mit dem Primer eine komplementäre Bindung eingehen (der zweiter Bereich des Controller-Oligonukleotids bindet an den ersten Bereich des Primers). Weiter kann Controller mit seinem dritten Bereich an das synthetisierte Anteil des Primerverlängerungsproduktes vorwiegend sequenzspezifisch binden.
In einer besonderen Ausführungsform haben die verwendeten Primer einen Schwanz bzw. Überhang, welcher mit der Matrize keinen stabilen Doppelstrang bildet kann (der Primerüberhang verbleibt bei einer Primerbindung an die Primer-Bindungsstelle der Matrize vollständig oder teilweise frei) und damit für die Interaktion mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides zur Verfügung steht. Dieser Primerüberhang dient als Bindungsstelle für jeweils einen spezifischen Controller-Oligonukleotidstrang (erster Bereich des Controller-Oligonukleotides). Das Controller-Oligonukleotid bindet an diesen Überhang und wird damit in eine räumliche Nähe mit dem Doppelstrang gebracht. Damit werden die Voraussetzungen geschaffen, bei welchen das Controller-Oligonukleotid eine Doppelstrang-Invasion unter Bildung eines komplementären Doppelstranges eingehen kann (dieser Vorgang wird auch als branch migration bezeichnet oder sequenzabhängige Strang-Verdrängung). Die Stranginvasion erfolgt unter Bildung eines neuen Doppelstranges zwischen einem Controller-Oligonukleotid und dem korrespondierenden Strang der synthetisierten Amplifikationsfragmente. Aufgrund einer starken Sequenzabhängigkeit einer solchen Doppelstrangbildung erfolgt die Öffnung der synthetisierten Doppelstränge mit hoher Abhängigkeit von Sequenzübereinstimmung mit der jeweiligen Controller-Sequenz.
In einer besonderen Ausführungsform haben die Primer einen Schwanz bzw. Überhang haben, welcher nicht von einer Polymerase kopiert wird. Die Polymerase wird durch entsprechende Primer-Modifikationen am Kopieren des Überhangs gehindert.
Primer- Verlängerungs-System:
Ein Primer-Verlängerungs-System umfasst mindestens ein zielsequenz-spezifisches Controller-Oligonukleotid und mindesten ein erstes Primer-Oligonukleotid sowie mindestens eine matrizenabhängige Polymerase, welche in der Lage ist, unter Verwendung einer Matrize, welche mindestens eine charakteristische Zielsequenz oder Zielsequenz-Variante umfasst, unter geeigneten Reaktionsbedingungen eine vorwiegend spezifische Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette zu unterstützen, wobei vorwiegend zielsequenz spezifische erste Primer-Verlängerungsprodukte synthetisiert werden.
Ein allel-spezifisches Primer-Verlängerungs-System umfasst mindestens ein allel-spezifisches Controller-Oligonukleotid und mindesten ein erstes Primer-Oligonukleotid (wobei Primer können je nach Design zielsequenzspezifisch und / oder allel-spezifisch sein), sowie mindestens eine matrizenabhängige Polymerase, welche in der Lage ist, unter Verwendung einer Matrize, welche mindestens eine Zielsequenz-Variante umfasst, unter geeigneten Reaktionsbedingungen eine vorwiegend spezifische Amplifikation der Zielsequenz-Variante (ein Allel) der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette zu unterstützen, wobei vorwiegend spezifische erste Primer-Verlängerungsprodukte synthetisiert werden.
Ein Primer-Verlängerungs-System kann mehrere allel-spezifische Primer-Verlängerungs-System umfassen, wobei jedes allel-spezifsiches Primer-Verlängerungs-System bevorzugt mindestens eine der Zielsequenz-Variante kopiert.
Strangverdrängung (Strand Displacement):
Hiermit wird ein Vorgang bezeichnet, welcher durch Einwirkung eines geeigneten Mittels zu einer vollständigen oder partiellen Trennung eines ersten Doppelstranges (bestehend beispielsweise aus A1 und B1-Strang) führt, und zur gleichzeitigen / parallelen Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges, wobei mindestens einer der Stränge (A1 oder B1) an der Ausbildung dieses neuen zweiten Stranges beteiligt sind. Man kann hier zwei Formen der Strangverdrängung unterschieden.
In einer ersten Form der Strangverdrängung kann die Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges unter Verwendung eines bereits existierenden komplementären Stranges erfolgen, welcher zu Beginn der Reaktion im Allgemeinen in einzelsträngiger Form vorliegt. Dabei wirkt das Mittel der Strangverdrängung (beispielsweise ein vorgebildeter einzelsträngiger Strang C1, welcher eine komplementäre Sequenz zum Strang A1 aufweist, auf den ersten bereits ausgebildeten Doppelstrang (A1 und B1) und geht mit dem Strang A1 eine komplementäre Bindung ein, wodurch der Strang B1 aus der Bindung mit dem Strang A1 verdrängt wird. Falls die Verdrängung des B1 vollständig abläuft, so ist das Ergebnis der C1-Wirkung ein neuer Doppelstrang (A1:C1) und ein einzelsträngiger Strang B1. Falls die Verdrängung von B1 unvollständig abläuft, so hängt das Ergebnis von mehreren Faktoren ab. Beispielsweise kann ein Komplex aus partiell doppelsträngigen A1:B1 und A1:C1 als Zwischenprodukt vorliegen.
In einer zweiten Form der Strangverdrängung kann die Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges unter einer gleichzeitig ablaufenden enzymatischen Synthese des komplementären Stranges erfolgen, wobei ein Strang des ersten vorgebildeten Doppelstranges als Matrize für die Synthese durch die Polymerase auftritt. Dabei wirkt das Mittel der Strangverdrängung (beispielsweise Polymerase mit einer Strangverdrängungs-Fähigkeit), auf den ersten bereits vorgebildeten Doppelstrang (A1 und B1) und synthetisiert einen zu Strang A1 neuen komplementären Strang D1, wobei gleichzeitig der Strang B1 aus der Bindung mit dem Strang A1 verdrängt wird.
Unter dem Begriff „nukleinsäurevermittelte Strang-Verdrängung“ wird eine Summe / Reihe von Zwischenschritten zusammengefasst, welche untereinander im Gleichgewicht stehen können, und im Ergebnis zur vorübergehenden oder dauerhaften Öffnung einer ersten vorgeformten Duplex (bestehend aus komplementären Strängen A1 und B1) und Ausbildung einer neuen zweiten Duplex (bestehend aus komplementären Strängen A1 und C1), wobei A1 und C1 einander komplementär sind.
Es ist bekannt, dass eine wesentliche strukturelle Voraussetzung für die Initiierung einer Strangverdrängung die Herbeiführung einer räumlichen Nähe zwischen einem Duplex-Ende (vorgeformter erster Duplex aus A1 und B1) und einem einzelsträngigen Strang (C1) ist, welcher die Strangverdrängung initiiert (wobei A1 und C1 einen komplementären Strang bilden können). Eine solche räumliche Nähe kann vorzugsweise mittels eines einzelsträngigen Überhanges (in der Literatur sind Beispiele mit kurzen Überhängen bekannt, im Englischen genannt „Toehold“,) herbeigeführt werden, welcher den einzelsträngigen Strang (C1) vorübergehend oder dauerhaft komplementär bindet, und somit komplementäre Seqmente des Stranges C1 und A1 in hinreichende Nähe bringt, so dass eine erfolgreiche Strangverdrängung des Stranges B1 initiiert werden kann. Die Effizienz der Initiierung der nukleinsäurevermittelten Strang-Verdrängung ist im Allgemeinen um so höher, je näher die komplementäre Segmente des Stranges A1 und C1 zueinander positioniert werden.
Eine weitere wesentliche strukturelle Voraussetzung für die effiziente Fortführung einer nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung in inneren Segmenten liegt in hoher Komplementarität zwischen Strängen (z.B. zwischen A1 und C1), welche einen neuen Doppelstrang ausbilden müssen. So können beispielsweise einzelne Nukleiotid-Mutationen (in C1) zur Unterbrechung einer Strangverdrängung (beschrieben z.B. für Branch-Migration) führen.
Die vorliegende Erfindung macht Gebrauch von der Fähigkeit komplementärer Nukleinsäuren zu einer sequenzabhängigen nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung.
Ausführungsformen für Zusammenwirken von einzelnen Komponenten bei Primer-Verlängerungsreaktionen
Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes und Interaktion mit Controller in vorwiegend sequenzieller Reihenfolge:
Die technische Aufgabe dieser Ausführungsform besteht in der Synthese eines Primer-Verlängerungsproduktes und einer anschließenden Trennung des Primer-Verlängerungsproduktes von seiner Matrize. Die Trennung des Primer-Verlängerungsprodukte erfolgt unter Mitwirkung eines Controller-Oligonukleotides und ist somit vorzugsweise sequenzspezifisch.
Die Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes und Überprüfung mittels eines Controller-Oligonukleotides erfolgt zwar vorzugsweise im gleichen Ansatz (homogener Assay), wobei die einzelnen Reaktionen allerdings zeitlich getrennt sind. Zunächst erfolgt die Synthese des P1-Ext (Synthese-Phase) und anschließend erfolgt die Öffnung des Doppelstranges mittels eines Controllers (Controlling-Phase). Die beiden Phasen können beispielsweise durch Änderung der Reaktions-Temperatur des Reaktionsansatzes in eine gewünschte Abfolge gebraucht werden (bei homogenem Assay) oder durch sequenzielle Zugabe auch als heterogenes Format.
Gleichzeitige Präsenz von einem ersten Primer und einem Controller in einem Ansatz in Anwesenheit eines Primer-Verlängerung-katalysierenden Agentes (einer Polymrease) und geeigneten Substraten erfordert Verwendung eines dahingehend modifizierten Controllers, dass der erste Primer, wenn hybridisiert an das Controller-Oligonukleotid, nicht von einer Polymerase verlängert wird.
Im Folgenden wird eine bevorzugte Form beschrieben mit homogenem Format, bei welchem mindestens ein Matrizenstrang, mindestens ein Controller-Oligonukleotid, mindestens ein Primer-Oligonukleotid, mindestens ein Polymerase und dNTPs als Substrate in einem geeigneten Puffer-System zu Beginn der Reaktion vorliegen.
Synthese-Phase:
Das Ziel der Synthese-Phase ist ein spezifisches Primer-Verlängerungsprodukt mittels durch eine Polymerase vermittelten Synthese unter Verwendung eines geeigneten Matrizenstranges zu synthetisieren.
Eine Primer-Verlängerungs-Reaktion umfasst eine vorzugsweise spezifische Primerbindung (erster Bereich des Primer-Oligonukleotides) an Matrizenstrang an einer geeigneten Primer-Bindungsstelle (Sequenzsegment, welches in der Lage ist, vorwiegend komplementär zum ersten Bereich des Primer-Oligonukleotides zu binden), wobei der zweite Bereich des Primers (Primer-Überhang) bevorzugt nicht an den Matrizenstrang bindet, und somit für eine spätere Interaktion mit Controller zur Verfügung steht. Die Primer-Bindungsstelle kann vollständig einzelsträngig oder partiell einzelsträngig, so dass zumindest ein Teil des ersten Bereichs des Primers vorwiegend sequenzspezifisch an die Primer-Bindungsstelle via Ausbildung komplementärer Basenpaare (Watson-Crick-Regel) binden kann.
Die Polymerase kann nun die an die Primer-Bindungsstelle gebundenen Primer-Oligonukleotide in einer matrizenabhängigen Synthese unter Anküpfung von komplementären Nukleotiden in den wachsenden Strang des Primers (3'-OH Ende) verlängern, dabei entsteht ein zum Matrizenstrang komplementäres Primer-Verlängerungsprodukt (P1-Ext). Die Synthese des komplementären Stranges erfolgt unter geeigneten Reaktionsbedinungen in der Regel solange bis die Polymerase genügend Substrat im Ansatz vorfindet und bis genügende Sequenzsegmente im Matrizenstrang in geeigneter Form für Polymerase als Matrize zur Verfügung stehen. Je nach Polymerase kann dabei eine der Bedingungen an Sequenzsegmente sein, dass Matrizenstrang einzelsträngig ist (unter Verwendung von Polymerasen ohne Strang-Verdrängungseigenschaften) oder auch partiell oder gar vollständig doppelstängig sein (unter Verwendung von Polymerasen mit Strang-Verdrängungseigenschaften). Die Synthese erfolgt häufig unter über die Hinreichende Zeit, so dass mehr als 5%, besser mehr als 50%, vorteilhafter mehr als 90% der Matrizenstränge ein Primer-Verlängerungsprodukt synthetisiert werden kann.
Unmittelbar nach der Synthese liegt das Primer-Verlängerungsprodukt (P1-Ext) im Komplex mit dem Matrizenstrang in doppelsträngiger Form vor (P1-Ext / Matrizenstrang-Komplex). Dieser doppelsträngiger Komplex umfassend P1-Ext und Matrizenstrang ist vorzugsweise unter gewählten Reaktionsbedingungen der Primer-Verlängerungsphase stabil und kann nicht spontan in seine Bestandteile dissoziieren, oder diese spontane Dissoziation erfolgt sehr langsam und kann dadurch vernachlässigt werden.
In einer Ausführungsform erfolgt die Primer-Bindung unter Reaktionsbedingungen, welche eine thermodynamisch stabile Bindung des ersten Bereichs des Primer-Oligonukleotids an die entsprechende komplementäre Position in der Matrize zulassen. Solche Bedingungen liegen beispielsweise bei Reaktionstemperaturen vor, welche deutlich unter der Schmelztemperatur (Tm) eines solchen Komplexes (P1 / Matrizen-Strang) liegen. Die Tm soll dabei unter gleichen Pufferbedingungen gemessen worden sein. Beispielsweise können die Reaktionstemperaturen im Bereich von Tm minus 50 °C bis Tm minus 5 °C liegen. Bei hinreichenden Komplementarität des 3'-Segmentes des Primers mit der Matrize erfolgt die Verlängerung des Primers durch eine Polymerase in der Regel schnell und problemlos, wenn die Reaktionsbedingungen auch für die Polymerase gut geeignet sind und hinreichende Mengen an dNTPs im Ansatz vorhanden sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt auch Komplex umfassend Primer/Controller-Oligonukleotid unter solchen Reaktions-Bedingungen in doppelsträngiger Form vor. Da Primer-Oligonukleotid und Controller-Oligonukleotid sowohl im ersten Primer-Bereich und im zweiten Primer-Bereich (Überhang / Primer-Schwanz) interagieren, so ist die Bindung zwischen dem ersten Primer und dem Controller in der Regel stabiler, als zwischen dem ersten Primer-Bereich und der Matrize. Bei solchen Reaktionsbedingungen sollte Primer im Überschuss vorliegen, damit genügend Primer in einzelsträngiger Form im Ansatz verbleibt und mit der Primerbindungs-Stelle des Matrizenstrang reagieren kann, so dass eine Primer-Verlängerungsreaktion stattfinden kann. Beispielsweise beträgt die Konzentration eines Controller-Oligonukleotides ca. 1 µmol/l, dann kann die Konzentration des ersten Primers von ca. 1,1 bis 5 µmol/l betragen. Bei Reaktionsbedingungen, welche eine stabile Duplex-Formation zwischen einem Controller und einem ersten Primer bedingen, wird der Controller vom Primer abgesättigt. Es verbleiben allerdings immer noch genügend freie einzelsträngige erste Primer-Oligonukleotide in der Lösung, welche mit einer geeigneten Matrize interagieren können.
Das Controller-Oligonukleotid liegt somit während der Synthese-Phase vorzugsweise im Komplex umfassend Primer/Controller-Oligonukleotid vor und ist dadurch in einer inerten Form. In dieser Ausführungsform interferiert das Controller nicht mit dem Synthese-Vorgang. In diesem Zustand sind der erste und der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotides vom Primer-Oligonukleotid (entsprechend dessen erster und zweiter Bereich) durch Ausbildung eines komplementären Stranges besetzt und stehen somit für Interaktionen mit gebildeten Primer-Verlängerungsprodukten während der Synthese-Phase nicht zur Verfügung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Primer-Bindung unter Reaktions-Bedingungen, welche keine thermodynamisch stabile Bindung des ersten Bereichs der Primer-Oligonukleotids an die entsprechende komplementäre Position in der Matrize zulassen. Es besteht somit ein Gleichgewicht aus Bindungsereignissen und Dissoziierungsereignissen. Bei Bindungsereignissen werden Komplexe gebildet, die den ersten Bereich des Primers und die entsprechenden Primer-Bindungspositionen der Matrize umfassen. Bei Dissoziierungsereignissen trennen sich diese Komplexe in einzelne Komponenten auf, so dass keine Primer-Verlängerungsreaktion mittels Polymerase starten kann. Solche Bedingungen liegen beispielsweise bei Reaktionstemperaturen vor, welche etwa um die den Schmelztemperatur (Tm) eines solchen Komplexes (P1 / Matrizenstrang) liegen. Die Schmelztemperatur (Tm) sollte dabei unter gleichen Pufferbedingungen und Konzentrationen gemessen werden. Beispielsweise können die Reaktionstemperaturen im Bereich von Tm -5 °C bis Tm +5 °C liegen, in besonderen Ausführungsformen im Bereich von Tm -5 °C bis etwa Tm +15 °C, in einer weiteren besonderen Ausführungsform im Bereich von Tm -5 °C bis Tm +30 °C. Auch unter solchen Bedingungen kann die Verlängerung des Primers durch eine Polymerase bei hinreichender Komplementarität des 3'-Segmentes des Primers mit der Matrize erfolgen. Die Reaktion kann allerdings etwas langsamer oder auch signifikant langsamer verlaufen, verglichen mit Reaktionsbedingungen, bei welchen eine stabile Primer-Bindung erfolgt. Bei Reaktionstemperaturen über Tm +30 °C (P1/ Matrize) verläuft die Primer-Verlängerungs-Reaktion in der Regel dermaßen ineffizient, dass solche Bedingungen selten bei Primer-Verlängerungsreaktionen zum Einsatz kommen. Auch bei Reaktionstemperaturen von Tm -5 °C bis etwa Tm +15 °C kann es vorteilhaft sein, Primer im Überschuss vorliegen, damit genügend Primer in einzelsträngiger Form verbleibt und mit dem Matrizenstrang reagieren kann, so dass eine Primer-Verlängerungsreaktion stattfinden kann.
Die Struktur der ersten Primer und der Controller-Oligonukleotide, sowie die Reaktionsbedingungen der Synthese-Phase sind dermaßen gewählt, dass der doppelsträngige Komplex umfassend Primer/Controller-Oligonukleotid vorwiegend in doppelsträngiger Form vorliegt. Durch Primer-Überschuss kann das Controller-Oligonukleotid dadurch abgesättigt sein und somit aus Interaktionen mit gebildeten Primer-Verlängerungsprodukten vorzugsweise ausgeschlossen werden. Da Primer-Oligonukleotid und Controller-Oligonukleotid sowohl im ersten Primer-Bereich und im zweiten Primer-Bereich (Überhang/Primer-Schwanz) interagieren, ist die Bindung zwischen dem Primer und dem Controller in der Regel stabiler, als zwischen dem ersten Primer-Bereich und der Matrize. Dadurch ist die Schmelztemperatur (Tm) des Komplexes umfassend Primer/ Controller-Oligonukleotid in der Regel höher als die der Komplexe umfassend Primer / Matrize.
Polymerasen:
Es können sowohl thermostabile Polymerasen wie Taq Polymerase / Pfu Polymerasen als auch thermolabile (wie Klenow Polymerase-Fragment oder MMLV Reverse Transcriptase) oder mesophile Polymerasen (z.B. Bst Polymerase) verwendet werden. Die Polymerasen können sowohl eine 3'-Exonuklease-Aktivität (Proofreading Polymerasen) umfassen oder auch nicht. Je nach Art der verwendeten Matrize können DNA-abhängige Polymerasen oder RNA-abhängige Polymerase verwendet werden.
Bei Polymerasen können sowohl Enzyme verwendet werden, welche den natürlichen Enzymen gleich sind (z.B. Pfu Polymerase oder Bst DNA Polymerase) als auch ihre Modifikationen oder Fragmente oder Fusionen mit anderen Proteinen (z.B. AmpliTaq, Bst Large Fragment Polymerase, Klenow Large Fragment oder Phusion Polymerase).
Es können sowohl Polymerase mit (z.B. Bst-Polymerase und ihre Modifikation, wie z.B. Bst Large-Fragment) oder ohne Strangverdrängungs-Eigenschaften (wie z.B. Taq-Polymerase oder Pfu-Polymerase oder MMLV reverse Transcriptase) verwendet werden.
Es können sowohl vorwiegend prozessive Polymerasen oder deren Modifikationen (z.B. Bst-Large Fragment oder Phusion Polymerase) als auch weniger prozessive Polymerase verwendet werden (Taq Polymerase bzw. Pfu Polymerase).
Da die Synthese-Phase und Controlling-Phase zeitlich getrennt sind, wird die Synthesereaktion so lange durchgeführt (Synthese-Phase), bis gewünschte Menge an Primer-Verlängerungsprodukt vorliegt. Erst danach erfolgt die Controlling-Phase. Dadurch hat die Reaktion genügend Zeit, hinreichende Menge an Produkt zu bilden, wobei die Polymerasen in der Regel in katalytischen Mengen vorliegen können.
Matrizenstrang:
Der Matrizenstrang umfasst eine Primer-Bindungsstelle, so dass unter gewählten Reaktionsbedingungen eine Bindung des ersten Bereichs des ersten Primer stattfinden kann und eine durch Polymerase vermittelte Synthese des Stranges stattfinden kann. Weiterhin umfasst ein Matrizenstrang eine Zielsequenz. Diese Zielsequenz umfasst in der Regel das Sequenzsegment des Matrizenstranges, welcher die Matrizenfunktion für die Synthese des komplementären Stranges übernimmt. Vorzugsweise ist der Matrizenstrang und Primer-Oligonukleotid in ihrem Design an einander dermaßen angepasst, dass der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotids nicht an die Matrizenstrang komplementär bindet oder zumindest keine stabile komplementäre Bindung eingeht und somit potenziell in der Lage ist, mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotids zu interagieren. Im Allgemeinen können sowohl DNA als auch RNA als Matrizenstränge auftreten.
Die Primer-Bindungsstelle der Matrize liegt vorzugsweise in einer einzelsträngigen Form und lässt eine sequenzspezifische Bindung des ersten Bereichs des Primer-Oligonukleotids an die Matrize zu. In einer Ausführungsform umfasst die Zielsequenz des Matrizenstrange zumindest ein Segment der Primer-Bindungsstelle, so dass 3'-Segment des ersten Primers komplementär zur Zielsequenz binden kann.
Das Segment des Matrizen-Stranges, welches als Matrize für die Synthese des komplementären Stranges durch die Polymerase dient, kann in einer Ausführungsform vollständig oder überwiegend (zu mehr als 50%) einzelsträngig unter Reaktionsbedingungen vorliegen. In einer anderen Ausführungsform ist dieses Segment überwiegend (zu mehr als 50%) oder vollständig doppelsträngig. Die bei der Synthese verwendeten Polymerasen müssen entsprechend gewählt werden: bei einzelsträngigen Matrizen können Polymerasen ohne Strangverdrängung verwendet werden, z.B. Taq-Polymerase oder Pfu-Polymerase. Bei überwiegend doppelsträngigen Segmenten der Matrize werden bevorzugt Polymerasen mit Strangverdrängenden Eigenschaften verwendet, z.B. Bst-Polymerase Large Fragment oder Vent-Polymerase oder Klenow-Fragment. Es können auch Kombinationen aus mehreren Polymerasen verwendet werden, z.B. Taq-Polymerase und Vent-Polymerase oder Taq-Polymerase und Bst-Polymerase, oder Pfu-Polymerase und Bst-Polymerase. Bei verwendeten Polymerasen richtet sich ihre Auswahl an Vorgaben der Herstellern. Dabei können sowohl in der Natur vorkommende Polymerasen als auch ihre Teilkomponenten (z.B. Klenow-Fragment oder Bst-Polymerase Large Fragment) oder auch Modifikationen, z.B. Bst-2.0 Polymerase oder AmpliTaq-Polymerase) verwendet werden.
In einer Ausführungsform kann die Primerbindungsstelle für den Primer im 3'-Segment der Matrize liegen. In einer solchen Ausführungsform ist es vorteilhaft, wenn das Primer-Oligonukleotid eine Modifikation umfasst (genannt erste Blockierungs-Einheit), welche die Polymerase am Kopieren des zweiten Primer-Bereichs hindert.
In einer anderen Ausführungsform kann die Matrize in ihrem 3'-Segment deutlich über die Primer-Bindungsstelle des Primers hinausgehen. Die Länge eines solchen Überhangs kann von wenigen Nukleotiden bis hin zu mehreren Kilobasen reichen. Die Struktur eines solchen Matrizenstranges führt dazu, dass der Primer-Überhang, ausgehend vom 3'-Ende der Matrize, nicht von Polymerase kopiert wird. Daher muss der Primer bei einer solchen Ausführungsform nicht zwingend eine Block-Gruppe (genannt erste Blockierungs-Einheit) im zweiten Bereich des Primers umfassen. Der zweite Bereich kann somit unmittelbar in den ersten Bereich übergehen und via 5'-3'-phosphat-Verknüpfung an das 5'-Ende des ersten Bereichs angeknüpft sein.
Die Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes erfolgt via Polymerase als matrizenabhängige Synthese. In manchen Ausführungsformen ist vorteilhaft, wenn der Fortschritt der Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes begrenzt wird und somit ein gewünschtes Primer-Verlängerungsprodukt in seiner Länge begrenzt wird.
Die Länge des Primer-Verlängerungsproduktes wird vorzugsweise durch Verfügbarkeit eines Sequenzsegmentes der Matrize begrenzt, welcher von Polymerase zur Synthese verwendet werden kann. Das kann beispielsweise durch die Begrenzung des Matrizenstranges im Sequenzsegment, welcher als Matrize für komplementäre Synthese zur Verfügung steht, in seinem 5'-Segment erreicht werden. Diese Begrenzung hindert dabei die verwendete Polymerase eine Fortsetzung der Synthese über dieses Hindernis hinaus fortzuführen. Diese Begrenzung kann beispielsweise durch ein Strang-Ende (Strang-Abbruch) erreicht werden oder durch Verwendung einer oder mehrerer Modifikationen im Strang (z.B. Spacer oder Linker oder abasische Zurcker-Phosphat Reste), welche die Polymerase an der Synthese hindern, oder durch Nukleotid-Modifikationen (z.B. Nukleobasen-Modifikation, wie Iso-C oder Iso-G, oder der Zucker-Phosphat-Anteile, wie 2'-O-Me, 2'-MOE, Morpholino, PNA etc.).
Unter Verwendung von langen Matrizensträngen, z.B. genomischer DNA oder mRNA oder langen PCR-Fragmenten, kann die Synthese der Polymerase durch Verwendung von zusätzlichen Oligonukleotiden an vorbestimmten Sequenz-Segmenten angehalten bzw. gestoppt werden. In einer solchen Ausführungsform wird der Fortschritt der Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes durch Verwendung von mindest einem sogenannten Block-Oligonukleotids limitiert. Ein solches Block-Oligonukleotid kann unter den Reaktionsbedingungen der Synthese-Phase vorzugsweise vorwiegend sequenzspezifisch an den Matrizenstrang via komplementäre Bindung hybridisiert verbleiben. Ein solches Block-Oligonukleotid, wenn komplementär gebunden an den Matrizenstrang, hindert die Polymerase daran, den Matrizenstrang im von diesem Oligonukleotid gebundenen Sequenzabschnitt und entsprechend darüber hinaus abzulesen. Je nach verwendeter Art der Polymerase und ihrer Ausstattung kommen dafür verschiedene Ausführungsformen von Block-Oligonukleotiden in Frage. Die Auswahl der Oligonukleotid-Struktur, der Polymerase und der Reaktionsbedingungen richten sich dabei danach, dass die fortschreitende Synthese durch Polymerase gehindert bzw. blockiert wird. Die Länge des Block-Oligonukleotides und die Beschaffenheit der Sequenzzusammensetzung richten sich darauf, dass das Block-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen der Synthese-Phase stabil an seine komplementäre Position eines Matrizenstranges gebunden bleiben muss und vorzugsweise nicht spontan von der Matrize dissoziieren kann. Ein solches Oligonukleotid wird in der Regel in 3'-Richtung vom ersten Primer-Oligonukleotid vor Beginn einer Synthese-Phase einer Primer-Verlängerungsreaktion in wirksamen Konzentrationen in Kontakt mit Matrizenstrang gebracht und hinreichende Zeit bei geeigneten Reaktionsbedingungen inkubiert, so dass es an seine komplementäre Position im Strang binden kann.
Beispiele für solche zum Stopp einer polymerasen-abhängigen Synthese führenden Oligonukleotide sind einem Fachmann bekannt.

• Beispielsweise können Oligonukleotide mit exonuklease-resistente Modifikationen (z.B. Phosphorothioate (PTO) oder 2'-O-Me Modifikationen, welche vorwiegend im 5'-Segment des Oligonukleotids positioniert sind) dazu führen, dass, beispielsweise, die Taq-Polymerase das Block-Oligonukleotid nicht abbauen kann (mit ihrer 5'-3'-Exonuklease-Aktivität) und somit die Synthese über die Bindungsstelle des Oligonukleotids nicht fortführen kann. Beispielsweise können zur Matrize komplementäre Oligonukleotide mit einer Länge von ca. 15 - 70 Nukleotiden mit ca. 2 - 50 PTO-Modifikationen lokalisiert vorwiegend im 5'-Segment eines solchen Block-Oligonukleotides die Taq Polymerase daran hindern, dieses Oligonukleotid via 5'-'3-Exonuklease-abhängige Degradation zu spalten bzw. von der Matrize abzulösen. Ein solches Nukleotid ist in der Regel in der Lage, eine Taq-Polymerase daran zu hindern, das vom Block-Oligonukleotid gebundenes Matrizenstrang-Segment abzulesen.
• Ein weiteres Beispiel stellt die Hinderung von Polymerasen mit Strang-Verdrängungseigenschaften dar. Oligonukleotide mit mehreren doppelstrangstabilisierenden Modifikationen, z.B. LNA oder PNA, führen in der Regel dazu, dass die Polymerase die Synthese über die Bindungsstelle des Oligonukleotids nicht fortführen kann. Beispielsweise können zur Matrize komplementäre Oligonukleotide mit einer Länge von ca. 15 - 50 Nukleotiden mit ca. 7 - 30 LNA-Modifikationen, beispielsweise, die Bst Polymerase (large fragment) daran hindern, dieses Oligonukleotid via polymerase-abhängiger Strangverdrängung von der Matrize abzulösen. Weitere Beispiele für solche Block-Oligonukleotide sind bekannt. Beispielsweise wurden PNA-Modifikationen oder LNA-Modifikationen bei Clamping-PCR Verfahren zur Blockade der Polymerase-Synthese verwendet.

Die Länge des während der matrizenabhängigen Synthese entstandenen P1-Ext und die Länge des dazu passenden Controller-Oligonukleotids kann unterschiedlich gewählt werden.
In einer Ausführungsform wird die Länge des Controller-Oligonukleotids und die Länge des zu erwartenden Primer-Verlängerungsproduktes dermaßen aufeinander abgestimmt, dass das Controller-Oligonukleotid vollständigden von der Polymerase synthetisierten Bereich abdeckt. In dieser Ausführungsform kann ein Controller-Oligonukleotid das P1-Ext von der Matrize vollständig ablösen. Im 3'-Segment des P1-Ext verbleiben keine freien Nukleotide zur Interaktion mit der Matrize während der Controlling-Phase (s.u.).
In einer weiteren Ausführungsform wird die Länge des Controller-Oligonukleotids und die Länge des zu erwartenden Primer-Verlängerungsproduktes dermaßen aufeinander abgestimmt, dass die Länge des synthetisierten Bereichs des Primer-Verlängerungsproduktes über die Länge des Controller-Oligonukleotids hinausgeht. Das 3'-Segment des Primer-Verlängerungsproduktes umfasst somit ein Sequenzsegment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid überprüft wird. Bei der Interaktion des P1-Ext mit dem Controller-Oligonukleotid verbleibt somit ein doppelsträngiges Segment aus P1-Ext und Matrize, welcher nicht vom Controller-Oligonukleotid überprüft wird. Dieses doppelsträngige Segment kann unter den Reaktionsbedingungen der Controlling-Phase spontan dissoziieren, z.B. infolge einer temperaturbedingten Strang-Öffnung (z.B. bei Temperaturen von ca. 50 - 80°C). Die Länge dieses 3'-Segmentes des Primer-Verlängerungsproduktes (ohne Interaktion mit Controller-Oligonukleotid) kann beispielsweise Sequenzlängen umfassen, welche in folgenden Bereichen liegen: von 1 bis 10 Nukleotiden, von 10 bis 20 Nukleotiden, von 30 bis 40 Nukleotiden, von 40 bis 50 Nukleotiden, von 50 bis 70 Nukleotiden, von 70 bis 100 Nukleotiden.
Das synthetisierte Primer-Verlängerungsprodukt soll nun mittels Controller-Oligonukleotide von der Matrize abgelöst und damit für weitere Schritte zur Verfügung gestellt werden.
Controlling-Phase:
Das Ziel der Controlling-Phase besteht darin, das synthetisierte Primer-Verlängerungsprodukt auf seine Übereinstimmung mit der vorgegebenen Sequenz zu überprüfen. Dabei dient die Sequenzabhängigkeit der Doppelstrangausbindung aus Primer-Verlängerungsprodukt und Controller-Oligonukleotid zur Überprüfung der Synthese-Qualität während der Primer-Verlängerungsreaktion.
Als Ergebnis der Controlling-Phase wird das Primer-Verlängerungsprodukt vollständig oder partiell von der Matrize sequenzabhängig abgelöst. Dabei erfolgt gleichzeitig eine Ausbildung eines Doppelstrangs umfassend Primer-Verlängerungsproduktes/ Controller-Oligonukleotid.
Somit stellt die erfolgreiche Ausbildung des Komplexes aus Primer-Verlängerungsprodukt und Controller-Strang (P1-Ext / Controller) eine Voraussetzung für die Öffnung des Doppelstranges (aus Matrize / Primer-Verlängerungsfragment) nach der Primer-Extension dar. Die Kontrolle der Sequenzen erfolgt in dieser Ausführungsform erst nach der Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes in einem separaten Reaktionsschritt (Controlling-Phase). Dabei soll das Controller-Oligonukleotid einen Doppelstrang mit dem nun in der Synthese-Phase synthetisierten P1-Ext ausbilden.
Vorzugsweise befindet sich Controller-Oligonukleotid bereits zu Beginn der Synthese Reaktion im Reaktions-Ansatz. Aufgrund eines Überschusses des Primer-Oligonukleotids, liegt das Controller-Oligonukleotid als Komplex umfassend Primer/ Controller vor.
Die Ausbildung des Komplexes aus Controller-Oligonukleotid/Primer-Verlängerungsprodukt erfordert eine Freisetzung des Controller-Oligonukleotids aus dem Primer-/Controller-Komplex. Zu diesem Zweck kann beispielsweise Temperatur des Reaktions-Ansatzes erhöht werden, so dass die Primer/Controller-Komplexe thermodynamisch instabil werden. Die Reaktionstemperatur soll allerdings dermaßen gewählt werden, dass die vollständig doppelsträngigen Komplexe aus Primer-Verlängerungsprodukt und Matrizenstrang nicht spontan zerfallen.
Durch Erhöhung der Reaktionstemperatur werden die Controller-Oligonukleotide aus Komplexen (Primer/Controller) freigesetzt und stehen im Gleichgewicht mit der Neubildung dieser Komplexe (z.B. bei Temperaturen um den Tm der Komplexen aus Primer/Controller ± 3 bis 8 °C).
Die nun frei im Ansatz verfügbaren Controller-Oligonukleotide können mit Komplexen aus Primer-Verlängerungsprodukten und Matrizensträngen im zweiten Primer-Bereich (Primer-Überhang) interagieren. Die Interaktion beginnt ausgehend vom Primer-Überhang. Damit wird eine räumliche Nähe zwischen dem Controller-Strang und dem Ende des doppelsträngigen Bereichs zwischen Primer-Verlängerungsprodukt / Matrizenstrang herbeigeführt. Dadurch kann sich Doppelstrang-Bildung zwischen dem Controller und dem ersten Primer-Bereich übertragen (sequenzabhängige Strang-Verdrängung). Bei gegebener Sequenz-Übereinstimmung mit dem synthetisierten Bereich des Primer-Verlängerungsproduktes breitet sich die Doppelstrang-Bildung zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem Primer-Verlängerungsprodukt weiter aus.
Das Fortschreiten dieser Interaktion zwischen dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt und dem Controller-Oligonukleotid führt zu einer zunehmenden Freisetzung des Matrizenstranges aus dem Komplex mit dem Primer-Verlängerungsprodukt. Vorzugsweise kommt es bei hinreichender Übereinstimmung in der Komplementarität zu einer Dissoziation des Komplexes der Matrize und Primer-Verlängerungsprodukt. Es wird dabei ein neuer Komplex gebildet, welcher das Primer-Verlängerungsprodukt und das Controller-Oligonukleotid umfasst.
In einer Ausführungsform verbleibt ein 3'-Segment des Primer-Verlängerungsproduktes in der Bindung mit dem Matrizenstrang, auch wenn das Controller-Oligonukleotid vollständig an das Primer-Verlängerungsprodukt gebunden hat. Die Dissoziierung dieses Komplexes (umfassend das 3'-Segment des Primer-Verlängerungsproduktes und die entsprechenden komplementären Bereiche der Matrize) hängt von den gewählten Reaktionsbedingungen während der Controlling-Phase (s.u.) ab. Das erfolgreiche Zusammenwirken von Komponenten bei der Interaktion des Controller-Oligonukleotids mit dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt und die spontane Dissoziation des Komplexes aus dem 3'-Segment des P1-Ext und der Matrize können zur Ablösung des Primer-Verlängerungsproduktes (im Komplex aus P1-Ext und COntrolelr-Strang) von der Matrize führen.
Diskriminierende Wirkung des Controller-Oligonukleotids:
Bei ggf. auftretenden Abweichungen in der Komplementarität zwischen dem P1-Ext und dem Controller-Oligonukleotid kann der Vorgang der sequenzabhängigen Strangverdrängung allerdings massiv gehindert werden. Je höher die Sequenzunterschiede zwischen dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt und dem entsprechenden Controller-Oligonukleotid sind, umso stärker wird die Ausbildung eines Komplexes aus Controller-Oligonukleotid und P1-Ext beeinflusst. Das Ausmaß des Einflusses kann von geringfügiger Verlangsamung bis zum vollständigen Stopp im Fortschritt der Komplex-Bildung kommen.
Aufgrund einer Reversibilität in der Doppelstrang-Ausbildung kann das Controller-Oligonukleotid durch den Matrizenstrang aus der Bindung mit dem Primer-Verlängerungsprodukt vollständig oder teilweise abgelöst werden (Verdrängung durch Matrize). Eine solche Verdrängung kann in einer Ausführungsform vollständig erfolgen. Dies kann beispielsweise dann erfolgen, wenn unter den verwendeten Reaktionsbedingungen in der Controlling-Phase die Stabilität des Komplexes aus dem zweiten Bereich des Primers und dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotids nicht hinreichend hoch ist und dieser Komplex in seine Teilkomponente spontan dissoziieren kann. Damit wirkt der Matrizenstrang entgegen dem Controller-Oligonukleotid. Da die Reaktionsbedingungen dermaßen gewählt sind, dass der Komplex aus Matrize und P1-Ext nicht spontan dissoziieren soll, können nur solche Primer-Verlängerungsprodukte aus diesem Komplex durch das Controller-Oligonukleotid abgelöst werden, welche eine hinreichend komplementäreBindung mit dem Controllers-Oligonukleotids aufweisen. Eine solche diskriminierende Wirkung kann unter mehreren Gesichtspunkten ausgenutzt werden.
Beispiele für potenzielle Quellen der Abweichungen in Primer-Verlängerungsprodukten.
Abweichungen in der Sequenz eines Primer-Verlängerungsproduktes können durch mehrere Ursachen bedingt sein, beispielsweise durch das Vorliegen von mehreren Matrizensträngen mit gleichen oder ähnlichen Primer-Bindungsstellen und Sequenzvarianten an einer oder mehreren Positionen im Segment des Matrizenstranges, z.B. bei Anwesenheit eines polymorphen Lokus im Zielsequenz-Segment. Eine andere Ursache für Abweichungen können beispielsweise durch Polymerasen eingeführte Synthesefehler / Einbaufehler sein.
Bei Vorliegen von Sequenzabweichungen in den Primer-Verlängerungsprodukten von der Vorgabe durch die Sequenzzusammensetzung des Controller-Oligonukleotids verbleiben solche Primer-Verlängerungsprodukte während der Controlling-Phase vorzugsweise in doppelsträngigen Komplexen mit der Matrize. Somit können solche doppelsträngige Komplexe umfassend einen Matrizenstrang und ein Primer-Verlängerungsprodukt (welches nicht vom Controller abgelöst werden konnte) für weitere Analyse-Schritte keine aktive Form darstellen. Damit kann eine Differenzierung zwischen Primer-Verlängerungsprodukten erfolgen: von Matrize abgelöste Primer-Verlängerungsprodukte stellen eine aktive Form von Primer-Verlängerungsprodukten dar. Primer-Verlängerungsprodukte im Komplex mit ihrer Matrize stellen vorzugsweise eine inaktive Form dar.
Die Verwendung eines Primer-Verlängerungsproduktes in weiteren Reaktionen kann beispielsweise erforderlich machen, dass bestimmte Bereiche des P1-Ext in einzelsträngiger Form vorliegen. Dies kann beispielsweise für Bindung eines Primers oder einer Sonde notwendig sein. Diese Ausführungsform kann daher beispielsweise zu Überführung der Sequenzen im 3'-Segments des P1-Ext in einzelsträngigen Zustand verwendet werden.
Das Primer-Verlängerungsprodukt wird nur bei korrekter Ausführung der Synthese bzw. nur bei einer bestimmten Übereinstimmung in der Komplementarität mit dem Controller-Oligonukleotid von Matrize abgelöst. Bei Abweichungen in der Sequenz verbleibt das Primer-Verlängerungsprodukt im Komplex mit der Matrize und die Sequenzen im 3'-Segments des P1-Ext nicht in einzelsträngigen Zustand überführt werden können (unter verwendeten Bedingungen).
Diese diskriminierende Wirkung des Controller-Oligonukleotids nach einer Primer-Verlängerungs-Reaktion (Synthese-Phase) kann für mehrere technische Aufgaben verwendet werden. Die Verfügbarkeit von Controller-Oligonukleotide im Ansatz (homogenes Assay-Format) ermöglicht sowohl eine kontaminationsarme Integration in andere Verfahren der molekularen Analysen als auch Kombination mit anderen Verfahren, z.B. mit Amplifikations-Verfahren oder Detektionsverfahren. Einige Ausführungsformen sollen daher in mehr Detail dargestellt werden.
Ein an einen Controller gebundenes vollkomplementäres Primer-Verlängerungsprodukt kann beispiesweise vor Nuklease-Einwirkung partiell oder vollständig geschützt werden, wenn die Beschaffenheit des Controller-Stranges entsprechend gewählt wurde. Beispielsweise bei Verwendung von Nuklease-Resistenten Modifikationen an bestimmten Sequenz-Segmenten des dritten Bereichs des Contollers oder durchgehend über den gesamten dritten Bereich des Controllers, z.B. PTO oder 2'-O-Alkyl Modifikationen kann ein solcher Kontroller das komplementäre Primer-Verlängerungsprodukt vor einer Nuklease-Spaltung schützen.
Die an Matrizenstrang verbleibende gebundene Primer-Verlängerungsprodukte können dagegen selektiv durch Einwirkung einer Nuklease (z.B. Restriktions-Endonuklease oder einer Exonuklease) enzymatsich gespalten werden. Dadurch können spezifische Primer-Verlängerungsprodukte mit vorgegebener Sequenz mit höherer Spezifität isoliert werde.
Ein Controller kann weiterhin einen Affinität-Marker umfassen, z.B. ein Biotin-Rest (beispielseise kovalent an das 3'-Ende oder 5'-Ende gekoppelt). Damit kann ein an Controller gebundenes Primer-Verlängerungsprodukt durch Verwendung einer Festen phase beschichtet beispielsweise mit Streptavidin isoliert werden.
Mehrere unterschiedliche Matrizenstränge mit im Wesentlichen einheitlicher Primerbindungsstelle und einem einheitlichen Primer
Die Ausführungsform beruht auf der sequenzspezifische Ablösung/ Trennung des Primer-Verlängerungsproduktes von seinem Matrizenstrang bei gleichzeitigem Vorliegen von mehreren unterschiedlichen Primer-Verlängerungsprodukten im gleichen Reaktionsansatz.
Matrizenstränge:
In dieser Ausführungsform werden mehrere Matrizenstränge (mindestens zwei) mit einer im Wesentlichen gleichen Primer-Bindungsstelle verwendet, die sich aber in der Sequenz des als Matrize dienenden Sequenzsegments unterscheiden. Die Unterschiede zwischen Matrizensträngen liegen vorzugsweise in 3'-Richtung vom 3'-Ende des Primers. Die Unterschiede können umfassen beispielsweise Einzelnukleotid-Variationen (z.B. SNVs: Substitutionen, Deletionen, Insertionen), oder auch Insertionen, Deletionen, Duplikationen, Inversionen von Sequenzsegmenten mit mehreren Nukleotiden (z.B. 2 bis 200 Nukleotiden).
Somit umfasst ein Matrizenstrang eine Zielsequenz, welche mindestens einen polymorphen Lokus umfasst und weiterhin mindestens ein Sequenzsegment umfasst, welches für alle Sequenz-Vaianten einer Zielsequenz einheitlich. Die Primer-Bindungsstelle kann beispielsweise im einheitlichen Sequenz-Segment liegen. Der polymorpher Lokus liegt somit in 3'-Richtung von 3'-Primer-Ende.
Primer:
Es wird vorzugsweise ein einheitliches Primer-Oligonukleotid verwendet, welches in der Lage ist, an einheitliche Primer-Bindungsstellen aller im Ansatz vorliegenden Matrizenstränge vorwiegend komplementär zu binden und einen Start einer Synthese-Reaktion durch eine Polymerase zu initiieren.
Controller:
Es wird mindestens ein Controller-Oligonukleotid verwendet, welches dermaßen in seinem dritten Bereich konstruiert ist, dass es in der Lage ist, nur mit einer bestimmen Variante der Sequenz eines möglichen Primer-Verlängerungsproduktes komplementär im synthetisierten Bereich des Primer-Verlängerungsprodukts zu binden. Falls mehrere Controller-Oligonukleotide verwendet werden, wird jedes Controller-Oligonukleotid sequenzspezifisch zu einer bestimmte Variante der Sequenz konstruiert.
Synthese-Phase:
Während der Synthese-Phase kann die Primer-Bindung (durch ersten Bereich des Primer-Oligonukleotids) im Wesentlichen ohne Diskriminierung von einzelnen Matrizensträngen stattfinden. Die Polymerase ist in der Lage von solchen gebundenen Primern eine Synthese zu starten und synthetisiert jeweils komplementäre Stränge anhand des jeweiligen Matrizenstranges. Dabei resultieren Primer-Verlängerungsprodukte, welche zum jeweiligen Matrizenstrang im Wesentlichen komplementär sind und somit jeweils komplementäre Segmente zu einzelnen Sequenz-Varianten der Matrizenstränge umfassen . Während der Synthese kann die Polymerase zwischen diesen Sequenz-Unterschieden der Matrizenstränge nicht unterscheiden.
Das Controller-Oligonukleotid liegt während der Synthese-Phase in doppelsträngiger Form im Primer/Controller-Komplex vor und interferiert nicht mit dem Synthese-Vorgang.
Controlling-Phase:
Nach Abschluss der Synthese-Phase erfolgt die Freisetzung des Controller-Oligonukleotids aus dem doppelsträngigen Komplex Primer/Controller, z.B. durch Temperatur-Erhöhung (bei einer Temperatur, bei welcher die Primer/Controller-Komplexe zumindest teilweise dissoziiert sind, aber Komplexe umfassend Primer-Verlängerungsprodukte/Matrizenstränge im Wesentlich stabil sind. Das Controller-Oligonukleotid, was nun zumindest teilweise in einzelsträngiger Form vorliegt, kann durch seinen ersten Bereich mit dem zweiten Bereich des Primers interagieren, und somit Strang-Verdrängung starten. Der Fortschritt der Ausbildung des Doppelstranges zwischen dem ersten Primer-Verlängerungsproduktes und dem Controller-Oligonukleotid hängt von der Übereinstimmung der Sequenzen des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotid und des synthetisierten Anteils der jeweiligen Primer-Verlängerungsprodukte. Der zweite Bereich des Controllers ist dabei voll-komplementär zum ersten Bereich des ersten Primers.
Die Synthese-Produkte (Primer-Verlängerungsprodukte) unterscheiden sich je nach verwendeten Matrizenstrang. Diese Unterschiede können von Unterschieden an nur einer Nukleobase bis hin zu vollständig unterschiedlichen Sequenzzusammensetzung des Primer-Verlängerungsproduktes reichen. Aufgrund dieser Unterschiede in den Primer-Verlängerungsprodukten ist das Ergebnis der Controlling-Phase unterschiedlich. Vorwiegend werden Primer-Verlängerungsprodukte mit einer hinreichenden Übereinstimmung in der Komplementarität mit dem dritten Bereich des Controller von ihrem Matrizenstrang abgelöst. Damit findet eine Differenzierung zwischen synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten in der Controlling-Phase statt: Die Controller-Oligonukleotide bilden vorzugsweise mit komplementären Primer-Verlängerungsprodukten doppelsträngige Komplexe. Bei einer Sequenzabweichung findet diese Doppelstrang-Bildung nur unzureichend statt. Aufgrund gewählter Reaktionsbedingungen (eine Temperatur, bei welcher Primer/Controller-Komplexe zumindest teilweise dissoziiert sind, aber stabile Komplexe umfassend Primer-Verlängerungsprodukte/Matrizenstränge vorliegen, verbleiben Primer-Verlängerungsprodukte mit Sequenzunterschieden zu den Controller-Strängen vorwiegend an ihre Matrizenstränge gebunden.
Das nun vollständig oder teilweise abgelöste Primer-Verlängerungsprodukt kann in weiteren Analysen verwendet werden. Beispielsweise kann es aus dem Reaktionsansatz isoliert werden (in gebundener Form an Controller-Oligonukleotid). Weiterhin kann es als Bindungspartner für andere Oligonukleotide verwendet werden, z.B. Sonden. Weiterhin kann es selbst als Matrizen Strang auftreten, z.B. nach Bindung eines neuen Primers im 3'-Segment des Primerverlängerungsprodukts.
Mehrere unterschiedliche Matrizenstränge mit allel-diskriminierenden Primern
Die Ausführungsform beruht auf der sequenzspezifischen Ablösung/ Trennung des Primer-Verlängerungsproduktes von seinem Matrizenstrang bei gleichzeitigem Vorliegen von mehreren unterschiedlichen Primer-Verlängerungsprodukten im gleichen Reaktionsansatz.
Matrizenstränge:
Auch in dieser Ausführungsform werden mehrere Matrizenstränge (mindestens zwei) mit einer Primer-Bindungsstelle verwendet, wobei sich die Primer-Bindungsstelle bei einzelnen Matrizen unterscheidet. Die Unterschiede zwischen Matrizensträngen liegen vorzugsweise in an einer Position, welche bevorzugt mit dem 3'-Segment des Primers interagiert (beispielsweise Positionen 0, -1, -2, -3, -4, -5). Die Unterschiede können beispielswiese Einzelnukleotid-Variationen (z.B. SNVs: Substitutionen, Deletionen, Insertionen), oder Insertionen, Deletionen, Duplikationen, oder Inversionen von Sequenzsegmenten von mehreren Nukleotiden (z.B. 2 bis 10 Nukleotiden) umfassen.
Erstes Primer-Oligonukleotid:
In der Primer-Verlängerungsreaktion werden mehrere erste Primer-Oligonukleotide (mehr als zwei) verwendet. Die jeweiligen ersten Primer-Oligonukleotide sind in ihrem 3'-Segment des ersten Primer-Bereichs dermaßen konstruiert, dass jedes verwendete Primer-Oligonukleotid eine spezifische für eine bestimmte Sequenz-Variante der in Frage kommenden Matrizenstränge komplementäre Sequenz umfasst (z.B. allel-spezifische Primer). Solche erste Primer sind in der Lage, an ihre spezifische Primer-Bindungsstellen der jeweiligen Matrizenstränge vorwiegend komplementär zu binden und einen Start einer Synthese-Reaktion durch eine Polymerase zu initiieren.
Die ersten Primer-Oligonukleotide können einheitliche oder unterschiedliche zweite Bereiche umfassen (Primer-Überhang, Oligonukleotid-Schwanz). Dabei wird die Zusammensetzung der jeweils spezifsichen Controller-Oligonukleotide im jeweiligen ersten Bereich dermassen angepasst, dass eine spezifische Paarbildung aus einem allel-spezifsichen ersten Primer und einem entsprechenden Controller möglich ist und jedes Controller in einem solchen Paar eine spezifische Basesequenz im ersten Bereich des Controller umfasst und jedes erste Primer-Oligonukleotid in einem solchen Paar eine entsprechend komplementäre Sequenz im zweiten Bereich. Damit können die Primer-Oligonukleotide mit Controller-Oligonukleotiden vorwiegend spezifisch während der Controlling-Phase interagieren.
Kompetitor-Primer-Oligonukleotid:
In der Primer-Verlängerungsreaktion kann mindestens ein weiterer Primer verwendet werden, welches kein erstes Primer-Oligonukleotid ist. Ein solcher Primer wird als Kompetitor-Primer-Oligonukleotid genannt. Es ist in der Lage an mindestens eine Sequenz-Variante eines polymorphen Lokus einer Zielsequenz komplementär zu binden und dabei ein perfekt match Duplex zu bilden, wobei diese Sequenz-Variante vorzugsweise eine Sequenz ist, welche mit dem ersten Primer-Oligonukleotid mindestens an einer Stelle ein Mismatch ausbilden kann.
Die jeweiligen Kompetitor-Primer-Oligonukleotide sind vorzugsweise in ihrem 3'-Segment dermaßen konstruiert, dass jedes verwendete Kompetitor-Primer-Oligonukleotid eine spezifische für eine bestimmte Sequenz-Variante der in Frage kommenden Matrizenstränge komplementäre Sequenz umfasst (z.B. allel-spezifische Primer). Solche Kompetitor-Primer sind in der Lage, an ihre spezifische Primer-Bindungsstellen der jeweiligen Matrizenstränge vorwiegend komplementär zu binden und einen Start einer Synthese-Reaktion durch eine Polymerase zu initiieren.
Im Wesentlichen sind Kompetitor-Primer ebenfalls allel-spezifische Primer, welche nicht mit dem ersten Bereich des jeweils spezifischen Controller-Oligonukleotides interagieren und somit keine Strang-Trennung initiieren können.
Kompetitor-Primer soll im Wesentlichen um die Bindung an die Primer-Bindungs-Stelle der Matrizenstranges mit dem ersten Primer-Oligonukleotid konkurrieren und bei komplementären Bindung an seine komplementäre Variante des Matrizenstranges von einer Polymerase verlängert werden, so dass dabei ein Kompetitor-Primer-Verlängerungsprodukt entsteht.
Die Wahl der Sequenz eines Kompetitor-Primer-Oligonukleotides richtet sich hauptsächlich nach der Erfordernis, eine spezifische Sequenz-Variante eines polymorphen Lokus spezifisch aus der Interaktion mit dem ersten Primer-Oligonukleotid auszugrenzen und somit die unspezifische Interaktion zwischen einem spezifsichen ersten Primer-Oligonukleotid und einer in der Sequenz abweichenden Primer-Bindungsstelle einer anderen Sequenz-Variante zu verhindern bzw. zu minimieren.
Ein Kompetitor-Primer-Oligonukleotid umfasst vorzugsweise kein Sequenzsegment-Anteil, welches mit dem für das erste Primer-Oligonukleotid spezifischen Controller-Oligonukleotid interagieren kann.
Controller:
Es wird mindestens ein Controller-Oligonukleotid verwendet, welches derartig in seinem zweiten Bereich konstruiert ist, dass es in der Lage ist, nur mit einer bestimmen Variante der Sequenz eines Sequenz-Varianten-spezifischen ersten Primer-Oligonukleotides und somit nur mit einer bestimmten Variante der Sequenz eines möglichen ersten Primer-Verlängerungsproduktes komplementär im ersten Bereich des Primer-Verlängerungsprodukts zu binden. Falls mehrere Controller verwendet werden, wird jedes Controller-Oligonukleotid sequenzspezifisch für eine bestimmte Variante der Sequenz konstruiert.
Es können mehrere Controller-Oligonukleotide verwendet werden, welche sich weiterhin dadurch unterscheiden, dass sie in ihrem ersten Bereich eine spezifische Sequenz aufweisen, welche in der Lage ist, vorwiegend an das spezifische erste Primer-Oligonukleotid komplementär zu binden. Somit besteht eine Möglichkeit zu einer Multiplexing-Kodierung mit verschiedenen Primer/ Controlling-Oligonukleotid-Paaren. Beide Partner weisen jeweils für dieses Paar spezifische Sequenzabschnitte im ersten Primer-Bereich und im zweiten Primer-Bereich, sowie entsprechend im ersten und im zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotids.
Synthese-Phase:
Während der Synthese-Phase kann die Primer-Bindung (durch ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids) im Wesentlichen / bevorzugt unter Diskriminierung der einzelnen Sequenz-Varianten von Matrizensträngen stattfinden. Dazu werden bevorzugt geeignete Reaktionsbedingungen verwendet (sogenannte stringente Reaktionsbedingungen). Die Polymerase ist in der Lage, von solchen korrekt komplementär gebundenen Primern eine Synthese zu starten und synthetisiert jeweils komplementäre Stränge anhand des jeweiligen Matrizenstranges. Dabei resultieren Primer-Verlängerungsprodukte, welche zum jeweiligen Matrizenstrang im Wesentlichen komplementär sind. Während der Synthese kann die Polymerase zwischen diesen Unterschieden der Matrizenstränge nicht unterscheiden.Das Controller-Oligonukleotid liegt während der Synthese-Phase in doppelsträngiger Form im Primer/Controller-Komplex vor und interferiert nicht mit dem Synthese-Vorgang.
In der Ausführungsform mit Kompetitor-Oligonukleotiden erfolgt in der Synthese-Phase ergänzend einer Kompetitor-Primer-Bindung und Verlängerung:
Während der Synthese-Phase kann die Kompetitor-Primer-Bindung im Wesentlichen / bevorzugt unter Diskriminierung der einzelnen Sequenz-Varianten von Matrizensträngen stattfinden. Dazu werden bevorzugt geeignete Reaktionsbedingungen verwendet (sogenannte stringente Reaktionsbedingungen). Die Polymerase ist dabei in der Lage, von solchen korrekt komplementär gebundenen Kompetitor-Primern eine Synthese zu starten und synthetisiert jeweils komplementäre Stränge anhand des jeweiligen Matrizenstranges. Dabei resultieren Kompetitor-Primer-Verlängerungsprodukte, welche zum jeweiligen Matrizenstrang im Wesentlichen komplementär sind. Während der Synthese kann die Polymerase zwischen diesen Unterschieden der Matrizenstränge nicht unterscheiden.
Controlling-Phase:
Nach Abschluss der Synthese-Phase erfolgt Freisetzung des Controller-Oligonukleotides aus dem doppelsträngigen Komplex Primer/Controller, z.B. durch Temperatur-Erhöhung (bei einer Temperatur, bei welcher die Primer/Controller-Komplexe zumindest teilweise dissoziiert sind, aber stabile Komplexe umfassend Primer-Verlängerungsprodukte/Matrizenstränge vorliegen. Das Controller-Oligonukleotid, welches nun zumindest teilweise in einzelsträngiger Form vorliegt, kann durch seinen ersten Bereich mit dem zweiten Bereich des Primers interagieren, der und somit Strang-Verdrängung starten. Der Fortschritt der Ausbildung des Doppelstranges zwischen dem Primer-Verlängerungsproduktes und dem Controller hängt von der Übereinstimmung der Sequenzen des zweiten Bereichs des Controllers und des synthetisierten Anteils der jeweiligen Primer-Verlängerungsprodukten ab.
Die Synthese-Produkte (Primer-Verlängerungsprodukte) unterscheiden sich je nach verwendeten Primern und Matrizensträngen. Aufgrund dieser Unterschiede in den Primer-Verlängerungsprodukten ist das Ergebnis der Controlling-Phase unterschiedlich. Vorwiegend werden Primer-Verlängerungsprodukte mit einer hinreichenden Übereinstimmung in der Komplementarität mit dem zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotids von ihrem Matrizenstrang abgelöst. Damit findet eine Differenzierung zwischen den synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten in Controlling-Phase statt: Die Controller-Oligonukleotide bilden vorzugsweise mit komplementären Primer-Verlängerungsprodukten doppelsträngige Komplexe. Bei einer Sequenzabweichung findet diese Doppelstrang-Bildung unzureichend statt. Aufgrund der gewählten Reaktionsbedingungen (bei einer Temperatur, bei welcher Primer/Controller-Komplexe zumindest teilweise dissoziiert sind, und stabile Komplexe umfassend Primer-Verlängerungsprodukte/Matrizenstränge vorliegen, verbleiben die Primer-Verlängerungsprodukte mit Sequenzunterschieden zu Controller-Strängen vorwiegend an ihre Matrizensträngen gebunden.
Die spezifsich gebildeten Kompetitor-Primer-Verlängerungsprodukte können nicht unter Mirwirkung eines Controllers von ihren Matrizensträngen gelöst werden, da den Kompetitor-Primern entsprechende zweite Bereiche (Primer-Überhang) fehlen, welche komplementär mit dem ersten Bereich des Controllers interagieren könnten.
Das nun vollständig oder teilweise abgelöste sequenzspezifische Primer-Verlängerungsprodukt kann in weiteren Analysen verwendet werden. Beispielsweise kann es aus dem Reaktionsansatz isoliert werden (in gebundener Form am Controller-Oligonukleotid). Weiterhin kann es als Bindungspartner für andere Oligonukleotide verwendet werden, z.B. Sonden. Weiterhin kann es selbst als Matrizen Strang auftreten, z.B. nach Bindung eines neuen Primers im 3'-Segment des Primerverlängerungsproduktes.
Die in einer Primer-Verlängerungsreaktion synthetisierten spezifischen Primer-Verlängerungsprodukte können beispielsweise als eine Start-Nukleinsäure in nachfolgenden Amplifikations-Verfahren verwendet werden.
Synthese des Primerverlängerungsproduktes und Interaktion mit Controller erfolgen parallel zu einander (on-line Controlling)
Eine fehlerhafte Synthese von Primer-Verlängerungsprodukten durch Polymerasen stellt eine signifikante Problematik für die genetischen Analysen dar. Dabei werden beispielsweise einzelne Nukleotide durch die Polymerase während der Synthese ausgetauscht (z.B. statt eines korrekten C wird ein T eingebaut oder statt eines A wird ein G eingebaut, etc.). Diese Polymerase-Fehler können zu Verfälschung des Ergebnisses der Analyse führen, da sie Inhalt der Sequenzen verändern. Die vorliegende Ausführungsform soll zu Verringerung der Synthese-Fehlern in vollständig synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten bei einer Primer-Verlängerungsreaktion führen.
Die technische Aufgabe dieser Ausführungsform wird dadurch gelöst, dass die Synthese eines Primer-Verlängerungsproduktes und Elimination der fehlerhaft synthetisierten Stränge parallel zu Synthese stattfindet. Die Eliminierung der fehlerhaft synthetisierten Stränge erfolgt durch Trennung des Primer-Verlängerungsproduktes von seiner Matrize bevor das Primer-Verlängerungsprodukt seine volle Länge erreicht hat. Diese Trennung des Primer-Verlängerungsprodukte erfolgt unter Mitwirkung eines Controller-Oligonukleotids.
Die Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes und Überprüfung mittels eines Controller-Oligonukleotides erfolgt im gleichen Ansatz (homogenes Assay), wobei die einzelnen Reaktionen im Wesentlichen parallel zu einander verlaufen. Damit erfolgt eine Einflussnahme der Controller-Oligonukleotide auf die Synthese während des Synthese-Vorganges. Die Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes (P1-Ext) während der Synthese-Phase und die Öffnung des Doppelstranges mittels eines Controller-Oligonukleotids (Controlling-Phase) sind derartig aneinander angepasst, dass vorwiegend eine prozessiv stattfindende korrekte Primer-Verlängerung in einer vollständigen Synthese in einem zum Matrizenstrang komplementären Primer-Verlängerungsprodukt resultiert. Bei einer nicht-prozessiven, vor allem fehlerhaften Primerverlängerung bzw. bei einer Synthese mit einem durch die Polymerase eingeführten Fehler in den synthetisierten Strang kommt es dagegen vorwiegend zu einer frühzeitigen Ablösung des teilweise verlängerten Primers vom Matrizenstrang durch das Controller-Oligonukleotid, wobei die Synthese des jeweiligen Primer-Verlängerungsproduktes dadurch vorzeitig unterbrochen wird. Das Produkt der vorzeitig abgebrochenen Synthese ist vorzugsweise an Controller-Oligonukleotid gebunden und bildet mit diesem einen unter Reaktionsbedingungen stabilen doppelsträngigen Komplex. Damit wird dieses unvollständige Produkt der weiteren Primer-Verlängerungsreaktion entzogen. Bevorzugt sollen dabei vollständige Primer-Verlängerungsprodukte bereitgestellt werden, welche eine höhere Komplementarität zum Matrizenstrang aufweisen.
Im Ergebnis sollen vollständige Primer-Verlängerungsprodukte mit höherer Genauigkeit synthetisiert werden. Die fehlerhaften Primer-Verlängerungsprodukte umfassend mindestens einen Einbau-Fehler, der während der Synthese durch eine Polymerase eingeführt wird, sollen ausselektiert werden.
Im Folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform mit homogenem Format beschrieben, bei welcher mindestens ein Matrizenstrang, mindestens ein Controller-Oligonukleotid, mindestens ein Primer-Oligonukleotid, mindestens ein Polymerase und dNTPs als Substrate in einem geeigneten Puffer-System zu Beginn der Reaktion vorliegen.
Synthese-Phase.
Das Ziel der Synthese-Phase ist ein spezifisches Primer-Verlängerungsprodukt mittels einer polymerase-vermittelten Synthese unter Verwendung eines Matrizenstranges zu synthetisieren.
Eine Primer-Verlängerungs-Reaktion umfasst eine vorzugsweise spezifische Primerbindung (erster Bereich des Primer-Oligonukleotides) an den Matrizenstrang an einer geeigneten Primer-Bindungsstelle (Sequenzsegment, welches in der Lage ist, komplementär den ersten Bereich des Primer-Oligonukleotides zu binden), wobei der zweite Bereich des Primers (Primer-Überhang) bevorzugt nicht an den Matrizenstrang bindet somit für eine spätere Interaktion mit Controller zur Verfügung steht. Die Primer-Bindungsstelle kann vollständig einzelsträngig oder partiell einzelsträngig, so dass zumindest ein Teil des ersten Bereichs des Primers sequenzspezifisch an die Primer-Bindungsstelle binden via Ausbildung komplementärer Basenpaare (Watson-Crick-Regel) kann.
Die Polymerase kann solche an die Primer-Bindungsstelle gebundenen Primer-Oligonukleotide in einer matrizenabhängigen Synthese unter Anknüpfung von komplementären Nukleotiden in den wachsenden Strang des Primers (3'-OH Ende) verlängern, dabei entsteht ein zum Matrizenstrang komplementäres Primer-Verlängerungsprodukt (P1-Ext). Die Synthese des komplementären Stranges erfolgt in der Regel solange die Polymerase genügend Substrat im Ansatz vorfindet und bis genügende Sequenzsegmente im Matrizenstrang in geeigneter Form für die Polymerase als Matrize zur Verfügung stehen. Je nach Polymerase kann dabei eine der Bedingungen an das Sequenzsegmente der Matrize sein, dass der Matrizenstrang einzelsträngig ist (unter Verwendung von Polymerasen ohne Strang-Verdrängungseigenschaften) oder auch partiell doppelsträngig (unter Verwendung von Polymerasen mit Strang-Verdrängungseigenschaften). Die Synthesereaktion erfolgt häufig unter über eine hinreichende Zeit (Gesamtzeit der Reaktion), so dass an mehr als 1%, besser an mehr als 10%, vorteilhafter an mehr als 30%, besonders vorteilhaft an mehr als 50% der Matrizenstränge ein vollständiges Primer-Verlängerungsprodukt synthetisiert werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Primer-Bindung unter Reaktions-Bedingungen, welche keine thermodynamisch stabile Bindung des ersten Bereichs der Primer-Oligonukleotides an die entsprechende komplementäre Position in der Matrize zulassen. Es besteht somit ein Gleichgewicht aus Bindungsereignissen und Dissoziierungsereignissen zwischen dem ersten Bereich des Primer-Oligonukleotides und der entsprechenden Primer-Bindungsstelle im Matrizenstrang. Bei Bindungsereignissen werden Komplexe gebildet, die den ersten Bereich des Primers und die entsprechenden Primer-Bindungspositonen am Matrizenstrang umfassen. Bei Dissoziierungsereignissen trennen sich diese Komplexe in einzelne Komponenten auf, so dass keine Primer-Verlängerungsreaktion mittels Polymerase starten kann. Solche Bedingungen liegen beispielsweise bei Reaktionstemperaturen vor, welche etwa um die Schmelztemperatur (Tm) eines solchen Komplexes (P1/Matrizenstrang) liegen. Die Schmelztemperatur (Tm) sollte dabei unter gleichen Pufferbedingungen und Konzentrationen gemessen werden. Beispielsweise kann die Reaktion unter Reaktionstemperaturen im Bereich von Tm -5 °C bis Tm +30 °C durchgeführt werden, in besonderen Ausführungsformen im Bereich von Tm - 5 °C bis etwa Tm +20 °C, in einer weiteren besonderen Ausführungsform im Bereich von Tm -5 °C bis Tm +10 °C. Auch unter solchen Bedingungen kann die Verlängerung des Primers durch eine Polymerase bei hinreichender Komplementarität des 3'-Segmentes des Primers mit der Matrize erfolgen.
Die Struktur der Primer und der Controller-Oligonukleotide, sowie die Reaktionsbedingungen der Synthese-Phase sind derartig gewählt, dass der Komplex umfassend Primer/Controller-Oligonukleotid vorwiegend im Gleichgewicht mit seinen Einzelkomponenten liegt (Komplex-Bildung und Komplex-Dissoziation erfolgen parallel zu einander). Solche Bedingungen liegen beispielsweise bei Reaktionstemperaturen vor, welche etwa um die Schmelztemperatur (Tm) eines solchen Komplexes (Primer/Controller-Oligonukleotid) liegen. Die Schmelztemperatur (Tm) sollte dabei unter gleichen Pufferbedingungen und Konzentrationen gemessen werden. Beispielsweise kann die Reaktion unter Reaktionstemperaturen im Bereich von Tm -5 °C bis Tm +30 °C durchgeführt werden, in besonderen Ausführungsformen zwischen etwa Tm - 5 °C bis etwa Tm +20 °C, in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zwischen etwa Tm -5 °C bis etwa Tm +10 °C, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform zwischen etwa Tm -5 °C bis etwa Tm +5 °C, in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform zwischen etwa Tm - 5°C bis etwa Tm -2 °C. Die Wahl solcher Bedingungen kann im Einzelfall experimentell durch Messung der Schmelztemperaturen (Tm) für solche Komplexe ermittelt werden.
Auch wenn der Primer im Überschuss zum Controller-Oligonukleotid eingesetzt wird, erfolgt vorzugsweise keine vollständige Absättigung des Controller-Oligonukleotids durch das Primer-Oligonukleotid.
Bei solchen Reaktionsbedingungen erfolgt sowohl Bildung und Dissoziation von Primer / Primer-Bindungsstelle-Komplexen als auch Bildung und Dissoziation von Primer/ Controller-Oligonukleotid-Komplexen. Die Strukturen und Reaktionsbedingungen sind derartig aufeinander angepasst, dass bei solchen Bedingungen die Verlängerung des Primers durch eine Polymerase bei hinreichender Komplementarität des 3'-Segmentes des Primers mit der Matrize erfolgen kann.
Vorteilhaft sind dabei Kombinationen von Strukturen der einzelnen Komponenten und der Reaktionsbedingungen, welche bereits bei einer Primer-Verlängerung von nur wenigen Nukleotiden dazu führen, dass sogar ein unvollständig verlängertes Primer-Verlängerungsprodukt an das Controller-Oligonukleotid fester gebunden werden kann als ein noch unverlängerter Primer. Dies erfolgt in der Regel dadurch, dass das Controller-Oligonukleotid mit seinem dritten Bereich komplementäre Bindung mit einem Primer-Verlängerungsprodukt eingehen kann und somit zusätzliche Bindungspositionen verglichen mit einem Primer/ Controller-Komplex aufweist. Dank einer solchen stabileren Bindung können auch unvollständig verlängerte Primer mit Controller-Oligonukleotiden Komplexe bilden und werden dank einer hinreichenden Stabilität dieser Komplexe der Reaktion entzogen. Da das Controller-Oligonukleotid keine Matrizenfunktion unterstützt (z.B. durch Modifikation), werden unvollständig verlängerte, an das Controller-Oligonukleotid gebundene Primer nicht vervollständigt. Aus diesem Grund umfasst vorzugsweise der gesamte dritte Bereich des Controller-Oligonukleotides solche Modifikationen. Die Fortführung der Synthese an solchen unvollständig verlängerten Primer-/Controller-Komplexen kann erst dann erfolgen, wenn diese erneut aus dem Komplex mit dem Controller-Oligonukleotid freigesetzt werden. Aufgrund vorteilhaft gewählter Reaktionsbedingungen erfolgt dies allerdings nur in einem sehr begrenzten Maß. Somit können unvollständig Primer-Verlängerungsprodukte während der Synthese-Reaktion in Komplexen mit Controller-Oligonukleotiden gebunden werden.
Das Controller-Oligonukleotid kann während ablaufenden Primer-Verlängerungsreaktion (parallel zu dieser Reaktion) sowohl mit Primer-Oligonukleotiden, mit teilweise verlängerten Primern als auch mit vollständig verlängerten Primern interagieren. Diese Interaktion beginnt am zweiten Bereich des Primers.
Polymerasen:
In dieser bevorzugten Ausführungsform werden vorwiegend hinreichend prozessive Polymerasen verwendet, z.B. Bst-Large-Fragment, Phi29 Polymerase oder Polymerasen mit verbesserter Prozessivität (z.B. Phusion Polymerase ist Ergebnis einer Kopplung mit einem Bindung der Polymerase an DNA erhöhenden Protein) oder ihre Modifikationen. Dadurch erfolgt eine Strang-Synthese rasch, so dass auch während der Synthese entstehende Einbaufehler zügig überwunden werden. Bevorzugt werden Controller-Oligonukleotide in Konzentrationen von etwa 0,1 µM bis etwa 20 µM eingesetzt. Dies ermöglich eine hinreichend häufige Interaktion mit Primer-Verlängerungsprodukten, so dass Einfluss auf die Qualität der Primer-Verlängerungsprodukte zu erwarten ist.
In einer anderen Ausführungsform werden Polymerasen mit geringerer Prozessivität (z.B. Taq Polymerase, Vent-Polymerase, Pfu-Polymerase) verwendet. Dadurch verläuft die Synthese in der Regel langsamer und erfordert wiederholte Bindungsereignisse der Polymerase. Aus diesem Grund werden hier bevorzugt Controller-Konzentrationen von etwa 5 nM biis etwa 1 µM verwendet.
Polymerasen sind vorwiegend in der Lage, bei nur einem Bindungsereignis an einen Primer-/ Matrizenstrang-Komplex mehrere Nukleotide (z.B. mehr als 15 Nukleotide, besser mehr als 30 Nukleotide, bevorzugt mehr als 50 Nukleotide) an das wachsende Ende des Primers bzw. Primer-Verlängerungsproduktes anzuknüpfen. Im Gegensatz dazu stehen gering-prozessive Polymerasen, wie Taq Polymerase und Klenow Polymerase, oder gänzlich distributive Polymerasen, welche nur wenige Nukleotide bei einem Bindungsereignis anknüpfen (in der Regel unter 8 bis 15 Nukleotide). Eine vorwiegend prozessive Synthese ist somit mit der Synthese innerhalb eines Bindungsereignisses der Polymerase an den Primer-Matrizen-Komplex assoziiert.
Weiterhin wird die hohe Prozessivität der Polymerase durch ausreichende Komplementarität des 3'-Endes des wachsenden Primer-Verlängerungsproduktes begünstigt. In der Regel erfolgt die Synthese mit hoher Geschwindigkeit und prozessiv besonders dann vorteilhaft, wenn das 3'-Ende des zu verlängernden Stranges mit einer durch die Matrize vorgegebene Strukturanforderungen hinsichtlich der Komplementarität erfüllt (in der Regel sind damit komplementäre, Perfekt-Match-Situation bei Nukleobasen zwischen dem 3'-Ende bzw. 3'-Segment des zu verlängernden Stranges und der entsprechenden Matrize gemeint). Abweichungen davon, d.h. Mismatches zwischen dem 3'-Ende oder 3'-Segment des zu verlängernden Stranges (z.B. Positionen -1 bis -5) und dem Matrizenstrang führen in der Regel zu einer mehr oder weniger ausgeprägten Verlangsamung bzw. gar Pausieren der Synthese durch die Polymerase. Diese Verlangsamung in der Katalysegeschwindigkeit der Polymerase ist einem Fachmann bekannt. Das Ausmaß einer solchen Verlangsamung bzw. Pausieren in der Katalyse hängt sowohl von der Polymerase als auch von Reaktionsbedingungen (z.B. Konzentration von dNTPs) sowie von der Art des Mismatches ab. Die Fortführung der Synthese über ein solches Mismatch hinaus erfordert in der Regel eine längere Reaktionszeit.
Da alle Polymerasen mit nur einer beschränkten Präzision die matrizenabhängige Katalyse durchführen, erfolgt bei jeder Primer-Verlängerung eine mehr oder weniger ausgeprägte Fehlsynthese eines Primerverlängerungsproduktes. Während einer matrizenabhängigen Synthese finden Fehl-Einbau-Ereignissen statt (z.B. es wird ein dCTP eingebaut statt eines dTTP gegenüber eines Adenosines im Matrizenstrang). Dabei kommt es zu mehr oder weniger ausgeprägten Pausen in der Synthese.
Bei Verwendung einer ausreichend langen Reaktionszeit kann eine solche Mismatch-Position (umfassend in der Regel ein bis zwei Nukleotide) von der Polymerase überwunden werden und die matrizenabhängige Synthese kann in der Regel fortgeführt werden. Das Ausmaß der Überwindung hängt sowohl von der Art des Mismatches als auch von Polymerase ab.
Polymerasen können sowohl eine 3'-Exonuklease-Aktivität (Proofreading Polymerasen, z.B. Phusion Polymerase) umfassen oder auch nicht (Bst-Large Fragment). Je nach Art der verwendeten Matrize können DNA-abhängige Polymerasen oder RNA-abhängige Polymerase verwendet werden.
Matrizenstrang:
Der Matrizenstrang umfasst eine Primer-Bindungsstelle, so dass unter gewählten Reaktionsbedingungen eine Bindung des ersten Bereichs des Primers stattfinden und eine durch Polymerase vermittelte Synthese des Stranges stattfinden kann. Weiterhin umfasst ein Matrizenstrang eine Zielsequenz. Diese Zielsequenz stellt in der Regel das Sequenzsegment des Matrizenstranges dar, welcher die Matrizenfunktion für die Synthese des Komplementären Stranges übernimmt. Vorzugsweise ist der Matrizenstrang und Primer-Oligonukleotid in ihrem Design derartig einander angepasst, dass der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides nicht an die Matrizenstrang bindet oder zumindest keine stabile Bindung eingeht und somit potenziell in der Lage ist, mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides zu interagieren. Im Allgemeinen können sowohl DNA als auch RNA als Matrizenstränge auftreten.
Die Primer-Bindungsstelle der Matrize liegt vorzugsweise in einer einzelsträngiger Form und lässt eine sequenzspezifische Bindung des ersten Bereichs des Primer-Oligonukleotides an die Matrize zu.
Das Segment des Matrizen-Stranges, welches als Matrize für die Synthese des komplementären Stranges durch die Polymerase dient, kann in einer Ausführungsform vollständig oder überwiegend (zu mehr als 50%) einzelsträngig unter Reaktionsbedingungen vorliegen. In einer anderen Ausführungsform ist dieses Segment überwiegend (zu mehr als 50%) doppelsträngig. Die bei der Synthese verwendeten Polymerasen müssen entsprechend gewählt werden. Bei einzelsträngigen Matrizen können Polymerasen ohne ausgeprägten Strangverdrängung verwendet werden, z.B. Phusion Polymerase. Bei überwiegend doppelsträngigen Segmenten der Matrize werden bevorzugt Polymerasen mit Strangverdrängenden Eigenschaften verwendet, z.B. Bst-Polymerase Large Fragment.
Primer:
In einer Ausführungsform kann die Primerbindungsstelle für den Primer im 3'-Segment der Matrize liegen. In einer solchen Ausführungsform ist es vorteilhaft, wenn das Primer-Oligonukleotid eine Modifikation umfasst, welche die Polymerase am Kopieren des zweiten Primer-Bereichs hindert.
In einer anderen Ausführungsform kann die Matrize in ihrem 3'-Segment deutlich über die Primer-Bindungsstelle des Primers hinausgehen. Die Länge eines solchen Überhangs kann von wenigen Nukleotiden bis hin zu mehreren Kilobasen reichen. Die Struktur eines solchen Matrizenstranges führt dazu, dass der Primer-Überhang nicht von Polymerase kopiert wird, ausgehend vom 3'-Ende der Matrize. Daher muss Primer bei einer solchen Ausführungsform nicht zwingend eine Block-Gruppe im zweiten Bereich des Primers umfassen.
Die Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes erfolgt via Polymerase als matrizenabhängige Synthese. Es ist vorteilhaft, wenn der Fortschritt der Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes begrenzt wird und somit ein gewünschtes Primer-Verlängerungsprodukt in seiner Länge begrenzt wird.
Die Länge des vollständigen Primer-Verlängerungsproduktes wird vorzugsweise durch Verfügbarkeit eines Sequenzsegmentes der Matrize begrenzt, welcher von Polymerase zur Synthese verwendet werden kann. Das kann beispielsweise durch die Begrenzung des Matrizenstranges im Sequenzsegment, welcher als Matrize für komplementäre Synthese zur Verfügung steht, in seinem 5'-Segment erreicht werden. Diese Begrenzung hindert dabei die verwendete Polymerase eine Fortsetzung der Synthese fortzuführen. Eine solche Begrenzung kann beispielsweise durch einen Strang-Ende (Strang-Abbruch) erreicht werden oder durch Verwendung einer oder mehrerer Modifikationen im Strang (z.B. Spacer oder Linker), welche die Polymerase an der Synthese hindern, oder durch Nukleotid-Modifikationen (z.B. Nukleobasen-Modifikation, wie Iso-C oder Iso-G, oder der Zucker-Phosphat-Anteile, wie 2'-O-Me, 2'-MOE, Morpholino, PNA etc.).
Unter Verwendung von langen Matrizensträngen, z.B. genomische DNA oder mRNA oder langen PCR-Fragmenten, ist es vorteilhaft, wenn die Synthese der Polymerase durch Verwendung von zusätzlichen Oligonukleotiden an vorbestimmten Segmenten angehalten bzw. gestoppt werden. In einer solchen Ausführungsform wird der Fortschritt der Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes durch Verwendung eines sogenannten Block-Oligonukleotides limitiert. Ein solches Block-Oligonukleotid kann unter Reaktionsbedingungen der Synthese-Phase vorzugsweise vorwiegend sequenzspezifisch an den Matrizenstrang via komplementäre Bindung hybridisieren. Ein solches Block-Oligonukleotid, wenn gebunden an den Matrizenstrang, hindert die Polymerase daran, den Matrizenstrang über dieses Oligonukleotid hinaus abzulesen. Je nach verwendete Art der Polymerase und ihre Ausstattung kommen dafür verschiedene Oligonukleotide in Frage. Die Auswahl der Oligonukleotid-Struktur, der Polymerase und der Reaktioinsbediungen richten sich dabei danach, dass die fortschreitende Synthese durch Polymerase gehindert bzw. blockiert wird.
Beispiele für solche zum Stopp führenden Oligonukleotide sind einem Fachmann bekannt.

• Ein Beispiel stellt die Hinderung von Polymerasen mit Strang-Verdrängungseigenschaften dar. Oligonukleotide mit mehreren doppelstrangstabilisierenden Modifikationen, z.B. LNA oder PNA, führen in der Regel dazu, dass die Polymerase die Synthese über die Bindungsstelle des Oligonukleotids nicht fortführen kann. Beispielsweise können zur Matrize komplementäre Oligonukleotide mit einer Länge von ca. 20 - 50 Nukleotiden mit ca. 7 - 30 LNA-Modifikationen, beispielsweise eine Bst Polymerase (Large Fragment) daran hindern, dieses Oligonukleotid via polymeraseabhängiger Strangverdrängung von der Matrize abzulösen.

Die Länge des vollständigen während der matrizenabhängigen Synthese entstandenen P1-Ext und die Länge des dazu passenden Controller-Oligonukleotides kann unterschiedlich gewählt werden.
In einer Ausführungsform wird die Länge des Controller-Oligonukleotides und die Länge des zu erwartenden vollständig synthetisierten Primer-Verlängerungsproduktes derartig aufeinander abgestimmt, dass das Controller-Oligonukleotid vollständig den von Polymerase synthetisierten Bereich abdeckt. Bei dieser Ausführungsform kann ein Controller-Oligonukleotid das P1-Ext von der Matrize vollständig ablösen. Im 3'-Segment des P1-Ext verbleiben keine freie Nukleotide zur Interaktion mit der Matrize während der Controlling-Phase (s.u.)
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Länge des Controller-Oligonukleotides und die Länge des zu erwartenden Primer-Verlängerungsproduktes derartig aufeinander abgestimmt, dass die Länge des synthetisierten Bereichs des Primer-Verlängerungsproduktes über die Länge des Controller-Oligonukleotids hinausgeht. Das 3'-Segment des Primer-Verlängerungsproduktes umfasst damit ein Sequenzsegment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotides überprüft wird. Bei der Interaktion des P1-Ext mit dem Controller verbleibt somit ein doppelsträngiges Segment aus P1-Ext und Matrize, welcher nicht von Controller überprüft wird.
In einer Ausführungsform kann dieses doppelsträngige Segment unter der Reaktionsbedingungen der Controlling-Phase spontan dissoziieren, z.B. infolge einer temperaturbedingten Strangöffnung (z.B. bei Temperaturen von ca. 50 - 70°C). Die Länge dieses 3'-Segmentes des Primer-Verlängerungsproduktes (ohne Interaktion mit Controller-Oligonukleotid) kann beispielsweise Sequenzlängen umfassen, welche in folgenden Bereichen liegen: von 1 bis 10 Nukleotiden, von 10 bis 20 Nukleotiden, von 30 bis 40 Nukleotiden, von 40 bis 50 Nukleotiden, von 50 bis 70 Nukleotiden, von 70 bis 100 Nukleotiden.
In einer weiteren Ausführungsform kann dieses doppelsträngige Segment unter der Reaktionsbedingungen der Controlling-Phase nicht spontan dissoziieren, z.B. infolge einer temperaturbedingten Strangöffnung (z.B. bei Temperaturen von ca. 50 - 70°C). Die Länge dieses 3'-Segmentes des Primer-Verlängerungsproduktes (ohne Interaktion mit Controller-Oligonukleotid) kann beispielsweise Sequenzlängen umfassen, welche in folgenden Bereichen liegen: mehr als 20 Nukleotiden, mehr als 30 Nukleotiden, mehr als 40 Nukleotiden, mehr als 50 Nukleotiden, mehr als 100 Nukleotiden. mehr als 200 Nukleotiden, mehr als 500 Nukleotiden. Die Maximallänge bis zu etwa 10.000 Nukleotide reichen.
Controlling-Phase.
Das Ziel der Controlling-Phase besteht darin, das synthetisierte Primer-Verlängerungsprodukt auf seine Übereinstimmung mit der vorgegebenen Sequenz während der ablaufenden Synthese zu überprüfen (Real-Time Kontrolle). Die korrekten, vollkomplementären Primer-Verlängerungsprodukte sollen in voller Länge synthetisiert werden. Dabei sollen die während der Synthese entstehenden Fehl-Einbauereignisse durch die Polymerase aus der weiterer Verlängerungsreaktion ausgeschlossen sein. Insbesondere sollen während der Synthese durch eine Polymerase entstehende Mismatches zwischen Primer-Verlängerungsprodukten an ihrer Verlängerung am Matrizenstrang gehindert werden. Dazu dient die Bildung eines Komplexes aus einem solchen mismatch umfassenden Primer-Verlängerungsprodukt und Controller-Oligonukleotid während der Primer-Verlängerungsreaktion. Die an das Controller-Oligonukleotid gebundenen terminales mimatch umfassende Primer-Verlängerungsprodukte sollen unter Reaktionsbedingungen vorzugsweise in diesen Komplexen verbleiben. Damit werden Primer-Verlängerungsprodukte, bei welchen der Fortschritt der Synthese-Reaktion verlangsamt ist (z.B. infolge eines Mismatch-Einbaus durch Polymerase, dh. Polymerase-Fehler) von ihrem Matrizenstrang vorzeitig abgelöst, noch bevor ihre Synthese in voller Länge abgeschlossen werden kann. Dadurch wird verhindert, dass es zu einer vollständigen Synthese eines fehlerhaften Primer-Verlängerungsproduktes kommt.
Durch wiederholte Interaktionen zwischen dem Controller-Oligonukleotid und den Primer-Oligonukleotide sowie zwischen dem Controller-Oligonukleotid und den Primer-Verlängerungsprodukten (die Interaktion beginnt mit der Bindung des Controllers an den Primer-Überhang) während ihrer Entstehung kommt es zur Konkurrenz zwischen Synthese-Vorgang und einem Strand-Verdrängungsvorgang durch das Controller-Oligonukleotid. Diese Reaktionen können durch Veränderung der Konzentrationen der einzelner Komponenten einander angepasst werden. So kann beispielsweise Konzentration von Controller-Oligonukleotiden variiert werden zwischen 0.001 µmol/l und 50 µmol/l, besser zwischen 0,01 µmol/ l und 10 µmol/l. Damit kann beispielsweise bei konstant gehaltener Primer-Verlängerungsreaktion das Ausmaß der der Controller-Abhängigen Strang-Verdrängung beeinflusst werden.
Die im Ansatz frei verfügbaren Controller-Oligonukleotide können mit dem zweiten Primer-Bereich (Primer-Überhang) interagieren. Dabei kommt unter anderem zu Interaktionen mit Komplexen, die Primer-Verlängerungsprodukte und Matrizenstränge umfassen. Die Interaktion beginnt ausgehend vom Primer-Überhang. Damit wird eine räumliche Nähe zwischen dem Controller-Strang und dem Ende des doppelsträngigen Bereichs zwischen Primer-Verlängerungsprodukt / Matrizenstrang herbeigeführt. Dadurch kann sich die Doppelstrang-Bildung zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Bereich übertragen (sequenzabhängige Strang-Verdrängung). Bei gegebener Sequenz-Übereinstimmung mit dem synthetisierten Bereich des Primer-Verlängerungsproduktes breitet sich die Doppelstrang-Bildung zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem Primer-Verlängerungsprodukt weiter aus.
Das Fortschreiten dieser Interaktion zwischen dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt und dem Controller-Oligonukleotid führt zu zunehmender Freisetzung des Matrizenstranges aus dem Komplex mit dem Primer-Verlängerungsprodukt. Bei einem unvollständigen Primer-Verlängerungsprodukt kommt es zu einer Dissoziation des Komplexes aus Matrize und unvollständigem Primer-Verlängerungsprodukt . Es wird dabei ein neuer Komplex aus Primer-Verlängerungsprodukt und dem Controller-Oligonukleotid gebildet. Die Fortführung der matrizenabhängigen Synthese eines solchen Primer-Verlängerungsproduktes wird somit gehindert.
Die Verwendung von prozessiven Polymerasen führt in der Regel dazu, dass Primer-Verlängerungsreaktion durch die Polymerase mit vollständiger Übereinstimmung des synthetisierten wachsenden Strangs mit seiner Matrize schneller verlaufen kann, als die Ausbildung eines doppelsträngigen Komplexes aus Primer-Verlängerungsprodukt und Controller-Oligonukleotid.
Weiterhin wird zeitliche Verzögerung der enzymatischen Synthese ausgenutzt, welche in der Regel bei einem Strangverlängerungsprozess stattfindet, wenn dieser Strang einen Mismatch als Folge eines Polymerase-Fehlers umfasst. Die Perfekt-Match umfassenden Stränge werden in der Regel schneller synthetisiert, als solche, welche im Primer-Verlängerungsprodukt einen Mismatch aufweisen.
Dabei kommt es nach einem Fehleinbau in den wachsend Strang zu einer vorübergehenden Verlangsamung bzw. gar einer Pause in der Synthese, so dass der Vorgang der Doppelstrangbildung zwischen Controller-Oligonukleotid und Primer-Verlängerungsprodukt diesen „pausierten Strang“ von der Matrize ablösen kann, bevor eine weitere Synthese stattfinden kann. Die Bindung eines solchen unvollständigen Primer-Verlängerungsproduktes an das Controller-Oligonukleotid ist vorzugsweise hinreichend stabil unter verwendeten Reaktionsbedingungen, so dass dieses unvollständige Produkt den weiteren matrizenabhängigen Synthesen durch die Polymerase entzogen werden kann. Da das Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize dient, verbleibt ein solches unvollständige Primer-Verlängerungsprodukt im Komplex mit dem Controller-Oligonukleotid.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Länge des Controller-Oligonukleotides und die Länge des zu erwartenden, vollständigen Primer-Verlängerungsproduktes derartig aufeinander abgestimmt, dass die Länge des synthetisierten Bereichs des Primer-Verlängerungsproduktes über die Länge des Controller-Oligonukleotids hinausgeht. Das 3'-Segment des Primer-Verlängerungsproduktes umfasst somit ein Sequenzsegment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotides überprüft wird. Bei der Interaktion des P1-Ext mit dem Controller verbleibt somit ein doppelsträngiges Segment aus P1-Ext und Matrize. In dieser Ausführungsform kann dieses doppelsträngige Segment unter der Reaktionsbedingungen der Controlling-Phase spontan dissoziieren, z.B. infolge einer temperaturbedingten Strangöffnung (z.B. bei Temperaturen von ca. 50 - 70°C). Die Länge dieses 3'-Segmentes des Primer-Verlängerungsproduktes (ohne Interaktion mit Controller-Oligonukleotid) kann beispielsweise Sequenzlängen umfassen, welche in folgenden Bereichen liegen: von 1 bis 10 Nukleotiden, von 10 bis 20 Nukleotiden, von 30 bis 40 Nukleotiden, von 40 bis 50 Nukleotiden. Das Zusammenwirken der Interaktion des Controller-Oligonukleotides mit dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt und der spontaner Dissoziation des Komplexes aus 3'-Segment des P1-Ext mit Matrize kann zur Ablösung des Primer-Verlängerungsproduktes (im Komplex aus P1-Ext und Controller-Strang) von der Matrize führen.
Das 3'-Segment kann in nachfolgenden Analysen / Reaktionen eine funktionelle Rolle spielen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die gebildeten Komplexe Controller-Oligonukleotid und unvollständigem Primer-Verlängerungsprodukt unter den gewählten Reaktionsbedingungen vorzugsweise hinreichend stabil, so dass dieses unvollständige Primer-Verlängerungsprodukt von einer Fortsetzung seiner Synthese am Matrizenstrang ausgeschlossen werden kann bzw. wird durch die Komplex-Form mit dem Controller stark an der Fortsetzung der matrizenabhängigen Synthesereaktion gehindert. Damit kann die Synthese von fehlerhaften Primer-Verlängerungsprodukte bis zu vollen Synthese-Länge verhindert werden. Wegen einer unzureichenden Länge umfassen solche unvollständige P1-Ext vorzugsweise nicht ein erforderliches 3'-Sequenzsegment, um an anderen oder folgenden Reaktionen teilzunehmen. Dieses fehlende 3'-Segment kann beispielsweise für eine Interaktion mit einer Sonde oder einem weiteren Primer fehlen. Dadurch können fehlerhafte Primer-Verlängerungsprodukte nicht volle erforderliche Funktionalität in nachfolgenden Reaktionen entfalten, z.B. in einem Detektionsvorgang oder einer Amplifikation.
Diskriminierende Wirkung des Controller-Oligonukleotides:
Auch bei gleichzeitiger Synthese-Reaktion und Controlling-Phase hängt die Interaktion zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem Primer-Verlängerungsprodukt von der Komplementarität zwischen dem Primer-Verlängerungsprodukt und dem Controller-Oligonukleotid ab. Bei Abweichungen kann der Vorgang der sequenzabhängigen Strangverdrängung massiv gehindert werden. Je höher die Sequenzunterschiede zwischen dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt und dem entsprechenden Controller-Oligonukleotid ist, umso stärker wird die Ausbildung eines Komplexes aus Controller-Oligonukleotid und P1-Ext beeinflusst. Das Ausmaß des Einflusses kann von geringfügiger Verlangsamung bis zum vollständigen Stopp im Fortschritt der Komplex-Bildung kommen.
Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, wenn das Controller-Oligonukleotid an das gewünschte Primer-Verlängerungsprodukt angepasst wird und in der Lage ist, mit seinem dritten Bereich eine im Wesentlich komplementäre Bindung an das synthetisierte Sequenzsegment des Primer-Verlängerungsproduktes einzugehen.
Nach Abschluss der Primer-Verlängerungsreaktion kann das korrekt synthetisierte Primer-Verlängerungsprodukt von der Matrize abgelöst werden, beispielsweise wie in obigen Ausführungsformen dargestellt.
Die Verwendung eines Primer-Verlängerungsproduktes in weiteren Reaktionen kann beispielsweise erforderlich machen, dass bestimmte Bereiche des Primer-Verlängerungsproduktes in einzelsträngiger Form vorliegen. Dies kann beispielsweise für Bindung eines Primers oder einer Sonde notwendig sein. Diese Ausführungsform kann daher beispielsweise zu Überführung der Sequenzen im 3'-Segments des Primer-Verlängerungsproduktes in einzelsträngigen Zustand verwendet werden.
Diese diskriminierende Wirkung von Controller nach einer Primer-Verlängerungs-Reaktion kann für mehrere technische Aufgaben verwendet werden. Die Verfügbarkeit von Controller-Oligonukleotide im Ansatz (homogenes Assay-Format) ermöglicht sowohl eine kontaminationsarme Integration in andere Verfahren der Molekularen Analysen als auch Kombination mit anderen Verfahren, z.B. mit Amplifikations-Verfahren oder Detektionsverfahren.
Die in einer Primer-Verlängerungsreaktion synthetisierten spezifischen Primer-Verlängerungsprodukte können beispielsweise als eine Start-Nukleinsäure in nachfolgenden Amplifikations-Verfahren verwendet werden.
Bevorzugte Ausführungsformen von Strukturen einzelner Komponenten:
Die hier beschriebene Primer-Verlängerungsreaktion umfasst mindestens einen ersten Primer und mindestens ein Controller-Oligonukleotid.
Das Produkt der Primer-Verlängerungsreaktion, das Primer-Verlängerungsprodukt, kann beispielsweise in einer nachfolgenden Amplifikationsreaktion verwendet werden, welche ebenfalls unter Mitwirkung eines Controller-Oligonukleotid abläuft.
Aus diesem Grund ist es daher vorteilhaft, dass Komponenten des Primer-Verlängerungsreaktion (erster Primer und Controlelr-Oligonukleotid) auch bei eine Amplifikationsreaktion verwendet werden können.
Nachfolgend werden daher Ausführungsformen beschrieben, welche für beide Reaktionen, sowohl für eine Primer-Verlängerungsreaktion als auch für eine spezifische Amplifikation, geeignet sein können. Bei Bedarf können allerding auch unterschiedliche Komponenten einzelne Reaktionen verwendet werden.
Reaktionsbedingungen
Reaktionsbedingungen umfassen unter anderem Puffer-Bedingungen, TemperaturBedingungen, Zeitdauer der Reaktion und Konzentrationen von jeweiligen Reaktionskomponenten.
Die Reaktion umfassend die Synthese der Verlängerungsprodukte kann zur Produktion der gewünschten Menge der spezifischen Nukleinsäurequenz so lange wie nötig durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt kontinuierlich durchgeführt. In bevorzugter Ausführungsform läuft die Amplifikations-Reaktion bei gleicher Reaktionstemperatur ab, wobei die Temperatur bevorzugt zwischen 50°C und 75°C liegt. In einer anderen Ausführungsform kann die Reaktions-Temperatur auch variabel gesteuert werden, so dass einzelne Schritte der Primer-Verlängerungsreaktion bei jeweils unterschiedlichen Temperaturen verlaufen.
Bevorzugt werden keine Helicasen oder Recombinasen in der Reaktionsmischung zur Trennung der neu synthetisieren Doppelstränge der zu amplifizierenden Nukleinsäure verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Reaktionsmischung keine biochemischen Energie-spendenden Verbindungen wie ATP.
Die Menge der zu Beginn der Reaktion vorliegenden zu amplifizierenden Nukleinsäure kann zwischen wenigen Kopien und mehreren Milliarden Kopien in einem Ansatz vorliegen. Bei diagnostischen Einsätzen kann die Menge einer Zielsequenz umfassenden Matrize unbekannt sein.
In der Reaktion können auch weitere, nicht zu amplifizierende Nukleinsäuren vorliegen. Diese Nukleinsäuren können von natürlichen DNA oder RNA oder ihren Äquivalenten abstammen. In einer Ausführungsform liegen Kontroll-Sequenzen im gleichen Ansatz vor, welche parallel zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure ebenfalls amplifiziert werden sollen.
Es kann ein molarer Überschuss von ungefähr 10³:1 bis ungefähr 10¹⁵:1 (Verhältnis Primer: Matrize) der eingesetzter Primer und des Controller-Oligonukleotides zu der Reaktionsmischung gegeben, welche Matrizen-Stränge umfasst.
Es kann die Menge der Zielnukleinsäuren nicht bekannt sein, wenn das erfindungsgemäße Verfahren in diagnostischen Anwendungen benutzt wird, so dass die relative Menge des Primers und des Controller-Oligonukleotides bezüglich des komplementären Stranges nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Die Menge des zugefügten Primers wird im Allgemeinen im molaren Überschuss bezüglich der Menge des komplementären Stranges (Matrize) vorhanden sein, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch von komplizierten langkettigen Nukleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuss wird bevorzugt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern.
Die verwendeten Konzentrationen von Primer-1 und Controller-Oligonukleotide liegen beispielsweise in Bereichen zwischen 0,01 µmol/l und 100 µmol/l, bevorzugt zwischen 0,1 µmol/l und 100 µmol/l, bevorzugt zwischen 0,1 µmol/l und 50 µmol/l, besser zwischen 0,1 µmol/l und 20 µmol/l. Die hohe Konzentration von Komponenten kann die Geschwindigkeit der Amplifikation erhöhen. Die jeweiligen Konzentrationen einzelner Komponenten können unabhängig von einander variiert werden, um das gewünschte Reaktionsergebnis zu erzielen.
Die Konzentration von Polymerase liegt in Bereichen zwischen 0,001 µmol/l und 50 µmol/l, vorzugsweise zwischen 0,01 µmol/l und 20 µmol/l, besser zwischen 0,1 µmol/l und 10 µmol/l.
Die Konzentration von einzelnen dNTP-Substraten liegt in Bereichen zwischen 10 µmol/l und 10 mmol/l, vorzugsweise zwischen 50 µmol/l und 2 mmol/l, besser zwischen 100 µmol/l und 1 mmol/l. Die Konzentration von dNTP kann die Konzentration von divalenten Metal-Kationen beeinflußen. Gegebenenfalls wird diese entsprechend angepasst.
Als divalente Metal-Kationen werden beispielsweise Mg2+ verwendet. Als entsprechendes Anion können beispielsweise Cl, Acetat, Sulfat, Glutamat etc. verwendet werden.
Die Konzentration von divalente Metal-Kationen wird beispielsweise an den für jeweilige Polymerase optimalen Bereich angepasst und umfasst Bereiche zwischen 0,1 mmol/l und 50 mmol/l, besser zwischen 0,5 mmol/l und 20 mmol/l, bevorzugter zwischen 1 mmol/l und 15 mmol/l.
Die enzymatische Synthese erfolgt im Allgemeinen in einer gepufferten wässrigen Lösung. Als Puffer-Lösungen können gelöste konventionelle Puffer-Substanzen, wie Tris-HCI, Tris-Acetat, Kalium-Glutamat, HEPES-Puffer, Natrium-Glutamat in gängigen Konzentrationen verwendet werden. Der pH-Wert dieser Lösungen liegt üblicherweise zwischen 7 und 9,5, bevorzugt etwa bei 8 bis 8,5. Die Puffer-Bedingungen können beispielsweise nach Empfehlung des Herstellers der verwendeten Polymerase angepasst werden.
Weitere Substanzen, wie sogenannte Tm-Depressoren (z.B. DMSO, Betaine, TPAC) etc. können zum Puffer zugegeben werden. Solche Substanzen verringern die Schmelztemperatur („Tm-Depressoren“) von Doppelsträngen und können somit einen positiven Einfluss auf die Öffnung von Doppelsträngen haben. Auch Polymerase-stabilisierende Komponenten, wie Tween 20 oder Triton 100 können in üblichen Mengen zum Puffer zugegeben werden. EDTA oder EGTA kann zu Komplexierung von Schwermetallen in konventionellen Mengen zugegeben werden. Polymerase-stabilisierende Substanzen, wie Trehalose oder PEG 6000 können ebenfalls zum Reaktionsgemisch zugegeben werden.
Vorzugsweise enthält die Reaktionsmischung keine Inhibitoren der Strangverdrängungsreaktion und keine Inhibitoren einer Polymerasenabhängigen Primer-Verlängerung.
In einer Ausführungsform enthält die Reaktionsmischung DNA-bindende Farbstoffe, bevorzugt interkalierenden Farbstoffe, wie z.B. EvaGreen oder SybrGreen. Solche Farbstoffe können ggf. bei Detektion der Neubildung von Nukleinsäureketten ermöglichen.
Die Reaktionsmischung kann weiterhin Proteine bzw. andere Substanzen enthalten, welche beispielsweise aus einem Original-Material stammen und welche die Amplifikation vorzugsweise nicht beeinflussen.
Die Reaktionstemperaturen der einzelnen Schritte der Amplifikationsreaktion können im Bereich von ca. 15°C bis ca. 85°C, besser im Bereich von ca. 15°C bis ca. 75°C, bevorzugt im Bereich von ca. 25°C bis ca. 70°C liegen.
Im Allgemeinen kann für die Reaktionstemperatur für jeden einzelnen Reaktionsschritt optimal eingestellt werden, so dass für jeden Reaktionsschritt eine solche Temperatur herbeigeführt wird. Die Amplifikationsreaktion umfasst somit eine sich wiederholende Änderung von Temperaturen, welche zyklisch wiederholt werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden Reaktionsbedingungen für mehrere Reaktionsschritte vereinheitlicht, so dass die Anzahl von Temperatur-Schritten geringer ist als die Anzahl von Reaktionsschritten. In einer solchen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt mindestens einer der Schritte der Amplifikation bei einer Reaktionstemperatur, welche sich von der Reaktionstemperatur anderer Schritte der Amplifikation unterscheidet. Die Reaktion verläuft somit nicht isothermal, sondern die Reaktionstemperatur wird zyklisch geändert.
Es werden beispielsweise während Amplifikation mindestens zwei Temperatur-Bereiche verwendet, welche abwechselnd herbeigeführt werden (zyklische Änderung von Temperaturen zwischen einzelnen Temperatur-Bereichen). In einer Ausführungsform umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 25°C und 60°C, besser zwischen 35°C und 60°C, bevorzugt zwischen 50°C und 60°C und der obere Temperatur-Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 60°C und 75°C, besser zwischen 60°C und 70°C.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 15°C und 50°C, besser zwischen 25°C und 50°C, bevorzugt zwischen 30°C und 50°C und der obere Temperatur-Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 50°C und 75°C, besser zwischen 50°C und 65°C.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 15°C und 40°C, besser zwischen 25°C und 40°C, bevorzugt zwischen 30°C und 40°C und der obere Temperatur-Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 40°C und 75°C, besser zwischen 40°C und 65°C.
Die Temperatur kann im jeweiligen Bereich konstant gehalten werden oder als TemperaturGradient (abfallend oder aufsteigend) geändert werden.
Weitere Erläuterungen zu Temperatur-Einstellungen werden in folgenden Abschnitten bei Ausführungsformen im Einzelnen angeführt.
Jede herbeigeführte Temperatur kann eine gewisse Zeit aufrechterhalten werden, so dass dabei ein Inkubations-Schritt resultiert. Das Reaktionsgemisch kann somit während einer Amplifikation bei einer ausgewählten Temperatur eine gewisse Zeit inkubiert werden. Diese Zeit kann unterschiedlich lange für jeweiligen Inkubations-Schritt sein und kann sich an den Fortschritt der jeweiligen Reaktion bei gegebener Temperatur richten (z.B. Primer-Verlängerung oder Strangverdrängung usw.). Die Zeit eines Inkubationsschrittes kann folgende Bereiche umfassen: zwischen 0,1 sec und 10.000 sec, besser zwischen 0,1 sec und 1000 sec, bevorzugt zwischen 1 sec und 300 sec, noch bevorzugter zwischen 1 sec und 100 sec.
Durch eine solche Temperatur-Änderung können einzelne Reaktionsschritte bevorzugt bei einer ausgewählten Temperatur ausgeführt werden. Dadurch können Ausbeuten von einem jeweiligen Reaktionsschritt verbessert werden. Innerhalb eines Synthese-Zyklus kann Temperatur-Änderung bzw. Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Temperatur-Bereichen ggf. mehrmals herbeigeführt werden. Synthese-Zyklus kann somit mindestens ein Temperatur-Wechsel umfassen. Ein solcher Temperatur-Wechsel kann beispielsweise in einem PCR-Gerät / Thermocycler routinemäßig als zeitliches Programm ausgeführt werden.
In einer Ausführungsform wird ein Amplifikationsverfahren bevorzugt, bei welchem mindestens eines der Schritte, welche Strangverdrängung umfassen, und mindestens eines der Schritte, welche Primer-Verlängerungsreaktionen umfassen, gleichzeitig bzw. parallel stattfinden und unter gleichen Reaktionsbedingungen erfolgen. In einer solchen Ausführungsform kann beispielsweise eine Primer-Verlängerungsreaktion von mindestens einem Primer-Oligonukleotid (z.B. vom ersten Primer-Oligonukleotid) bevorzugt bei Temperaturbedinungen im unteren Temperatur-Bereich erfolgen. Hingegen erfolgt die Strangverdrängung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukletid und die eine weitere Primer-Verlängerungsreaktion (z.B. vom zweiten Primer-Oligonukleotid) bevorzugt im Reaktionsschritt im oberen Temperatur-Bereich.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Amplifikationsverfahren bevorzugt, bei welchem mindestes eines der Schritte, welche Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid umfassen und mindestens eines der Schritte, welche Primer-Verlängerungsreaktion umfassen, bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt. In einer solchen Ausführungsform können beispielsweise Primer-Verlängerungsreaktionen von mindestens einem Primer-Oligonukleotid (z.B. vom ersten Primer-Oligonukleotid und / oder von zweiten Primer-Oligonukleotid) bevorzugt bei Temperaturbedinungen im unteren Temperatur-Bereich erfolgen. Hingegen erfolgt die Strangverdrängung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukletid bevorzugt im Reaktionsschritt im oberen Temperatur-Bereich.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verlaufen sämltliche Schritte einer Amplifikatons-Reaktion unter gleichen Reaktionsbedingungen.
In einer solchen Ausführungsform kann das Amplifikationsverfahren unter isothermalen Bedingungen durchgeführt werden, d.h. dass keine Temperaturänderungen für die Ausführung des Verfahrens erforderlich sind. In einer solchen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die gesamte Amplifikationsreaktion unter konstanter Temperatur, d.h. die Reaktion ist isothermal. Die Zeit einer solchen Reaktion umfasst beispielsweise folgende Bereiche: zwischen 100 sec und 30.000 sec, besser zwischen 100 sec und 10.000 sec, noch besser zwischen 100 sec und 1000 sec.
Einzelne Verfahrensschritte können jeweils hintereinander durch Zugabe von einzelnen Komponenten ausgeführt werden. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform liegen sämtliche für die Ausführung einer Amplifikation notwendige Reaktions-Komponenten zu Beginn einer Amplifikation in einem Reaktionsgemisch vor.
Der Start einer Amplifikations-Reaktion kann durch Zugabe einer Komponente erfolgen, z.B. durch Zugabe einer Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (z.B. eine Start-Nukleinsäurekette), oder einer Polymerase oder divalenten Metal-Ionen, oder auch durch Herbeiführung von Reaktions-Bedingungen, welche für Amplifikation notwendig sind, z.B. Einstellung einer erforderlichen Reaktionstemperatur für einen oder mehrere Verfahrenschritte.
Die Amplifikation kann so lange ausgeführt werden, bis die gewünschte Menge an zu amplifizierenden Nukleinsäure erreicht ist. In einer anderen Ausführungsform wird die Amplifikationsreaktion über eine Zeit ausgeführt, welche bei Vorliegen einer zu amplifizierenden Nukleinsäure ausgereicht hätte, um eine ausreichende Menge zu bekommen. In einer anderen Ausführungsform wird die Amplifikationsreaktion über eine hinreichede Anzahl von Synthese-Zyklen (Verdoppelungszeiten) ausgeführt, welche bei Vorliegen einer zu amplifizierenden Nukleinsäure ausgereicht hätte, um eine ausreichende Menge zu bekommen.
Die Reaktion kann durch verschiedene Eingriffe gestoppt werden. Beispielsweise durch Änderung der Temperatur (z.B. Abkühlen oder Erhitzen, wobei beispielsweise Polymerase in ihrer Funktion gestört wird) oder durch Zugabe einer Substanz, welche eine Polymerase-Reaktion stoppt, z.B. EDTA oder Formamid.
Im Anschluss an die Amplifikation kann die amplifizierte Nukleinsäurekette für weitere Analysen verwendet werden. Dabei können synthetisierte Nukleinsäureketten durch verschiedene Detektionsverfahren analysiert werden. Beispielsweise können fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonden verwendet werden oder Sequenzierungsverfahren (Sanger-Sequenzierung oder Next-Generation Sequenzierung), fest-Phasen-Analysen wie Microarray oder Bead-Array-Analysen usw. Die synthetisierte Nukleinsäurekette kann als Substrat / Matrize in weiteren Primer-Verlängerungsreaktionen verwendet werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird der Fortschritt der Synthese-Reaktion während der Reaktion überwacht. Das kann beispielsweise durch Einsatz von interkalierenden Farbstoffen erfolgen, z.B. Sybrgreen oder Evagreen, oder unter Einsatz von markierten Primern (z.B. Lux-Primer oder Scorpion-Primer) oder unter Einsatz von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid-Sonden.
Die Detektion der Veränderung der Fluoreszenz während der Amplifikation wird in einem Detektions-Schritt des Verfahrens umgesetzt. Dabei kann die Temperatur und die Dauer dieses Schritte an die jeweiligen Erfordernisse der einer Oligonukleotid-Sonde angepasst werden. Die Temperaturen des Detektions-Schrittes umfassen beispielsweise Bereiche zwischen 20°C und 75°C, besser zwischen 40 und 70°C, bevorzugt zwischen 55 und 70°C.
Während des Detektionschrittes erfolgt Beleuchtung der Reaktion mit Licht einer Wellenlänge, welche in der Lage in ein verwendetes Fluorophor des Detektions-Systems (ein Donor oder ein Fluoreszenzreporter) anzuregen. Die Signal-Erfassung erfolgt in der Regel parallel zu Anregung, wobei das spezifische Fluoreszenzsignal detektiert wird und seine Intensität quantifiziert wird.
Das Amplifikationsverfahren kann zur Überprüfung der Anwesenheit einer Zielnukleinsäurekette in einem biologischen Material oder einem diagnostischen Material im Rahmen eines diagnostischen Verfahrens eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform werden Reaktionsbedinungen von mindestens einem Reaktionsschritt, bei welchem mindestens ein allel-spezifsicher Primer an eine allel-spezifische Sequenzvariante hybridisieren soll und eine Primer-Verlängerungsreaktion durch eine Polymerase stattfinden soll, dermassen gewählt, dass eine vorwiegend spezifische Hybridisierung eines solchen Primers an seine Primer-Bindungsstelle stattfinden kann. Solche Bedinungen können auch als stringente Bedinungen bezeichnet werden. Beispielsweise liegt die Temperatur in einem solchen Schritt etwa bei Tm der respektiven Primer / Primerbindungsstelle oder die Temperatur liegt über einer solchen Tm. Beispielsweise kann die Temperatur bei etwa Tm +5 bis etwa Tm + 15°C liegen.
Bevorzugte Ausführungsformen des ersten Primer-Oligonukleotids (Primer-1)
Das erste Primer-Oligonukleotid (Primer-1) ist eine Nukleinsäurekette welche mindestens folgende Bereiche einschließt:

• Einen ersten Primer-Bereich im 3'-Segment des ersten Primer-Oligonukleotides, der an einen Strang einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann
• Einen zweiten Bereich, gekoppelt direkt oder via einen Linker an das 5'-Ende des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, welcher einen Polynukleotid-Schwanz umfasst, welcher zur Bindung eines Controller-Oligonukleotids und Unterstützung der Strangverdrängung (Schritt c) durch Controller-Oligonukleotids geeignet ist, wobei der Polynukleotid-Schwanz unter Reaktionsbedingungen im wesentlichen einzelsträngig bleibt, d.h. keine stabile Hairpin-Struktur oder ds-Strukturen ausbildet, und vorzugsweise nicht von Polymerase kopiert wird.

Die Gesamtlänge des ersten Primer-Oligonukleotides liegt zwischen 10 und 80, vorzugsweise zwischen 15 und 50, besser zwischen 20 und 30 Nukleotiden oder ihren Äquivalenten (z.B. Nukleotid-Modifikationen). Die Struktur des ersten Primer-Oligonukleotids ist dermaßen angepasst, dass es unter gewählten Reaktionsbedinungen eine reversible Bindung an Controller-Oligonukleotid eingehen kann. Weiterhin ist die Struktur des ersten Primer-Oligonukletides an seine Primer-Funktion angepasst. Weiterhin ist die Struktur so angepasst, dass eine Strangverdrängung mittels Controller-Oligonukleotid ausgeführt werden kann. Insgesamt sind Strukturen des ersten und des zweiten Bereichs aneinander angepasst, so dass eine exponentielle Amplifikation ausgeführt werden kann.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind der erste und der zweite Bereich des Primers in einer konventionellen 5'-3' Anordnung gekoppelt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kopplung von beiden Abschnitten über eine 5'-5'-Bindung, so dass der zweite Bereich eine umgekehrte Richtung hat als der erste Bereich.
Die Kopplung von Bereichen zwischeneinander/untereinander erfolgt vorzugsweise kovalent. In einer Ausführungsform ist die Kopplung zwischen dem ersten und zweiten Bereich eine für DNA konventionelle 5'-3'-Phosphodiester-Kopplung. In einer weiteren Ausführungsform ist es eine 5'-5'-Phosphodiester-Kopplung. In einer weiteren Ausführungsform ist es eine 5'-3'-Phosphodiester-Kopplung, wobei zwischen benachbarten endständigen Nukleotiden bzw. Nukleotid-Modifikationen der beiden Bereiche mindestens ein Linker (z.B. ein C3, C6, C12 oder ein HEG-Linker oder eine abasische Modifikation) positioniert ist.
Einzelne Bereiche können unterschiedliche Nukleotid-Modifikationen einschließen. Dabei können individuelle Elemente von Nukleotiden modifiziert sein: Nukleobase und Rückgrad (Zucker-Anteil und / oder Phosphat-Anteil). Weiterhin können Modifikationen verwendet werden, welchen mindestens eine Komponente der Standard-Nukleotid-Bausteine fehlt oder modifiziert ist, z.B. PNA.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein zweiter Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides weitere Sequenzen, die nicht an das Controller-Oligonukleotid binden. Diese Sequenzen können zu anderen Zwecken verwendet werden, z.B. zu Bindung an die feste Phase. Diese Sequenzen sind vorzugsweise am 5'-Ende des Polynukleotid-Schwanzes lokalisiert.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein erstes Primer-Oligonukleotid charakteristische Markierung umfassen. Beispiele für eine solche Markierung stellen Farbstoffe dar (z.B. FAM, TAMRA, Cy3, Alexa 488 etc.) oder Biotin bzw. andere Gruppen, die spezifisch gebunden werden können, z.B. Digoxigenin.
Der erste Primer-Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides
Die Sequenz-Länge liegt zwischen ca. 3-30 Nukleotiden, vorzugsweise zwischen 5 und 20 Nukleotiden, wobei die Sequenz vorwiegend komplementär zum 3'-Segment eines Stranges der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette ist. Im Einzelnen, muss dieser Primer-Bereich in der Lage sein, an das komplementäre 3'-Segment eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes spezifisch zu binden. Dieser erste Bereich soll bei Rücksynthese kopiert werden können und dient auch als Matrize für 2. Strang. Die Nukleotid-Bausteine sind vorzugsweise untereinander via übliche 5'-3' Phosphodieser-Bindung oder Phosphothioester-Bindung verknüpft.
Der erste Primer-Bereich schließt bevorzugt Nukleotid-Monomere ein, welche Funktion der Polymerase nicht oder nur unwesentlich beeinflussen, dazu gehöhren beispielsweise:

• natürliche Nukleotide (dA, dT, dC, dG etc.) oder deren Modifikationen ohne veränderte Basen-Paarung
• Modifizierte Nukleotide, 2-Amino-dA, 2-thio-dT oder andere Nukleotid-Modifikationen mit abweichender Basen-Paarung.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende dieses Bereichs vorzugsweise frei von Modifikationen und hat eine funktionsfähige 3'-OH Gruppe, welche von Polymerase erkannt werden kann. Der erste Primer-Bereich dient als Initiator der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes in der Amplifikation. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der erste Bereich mindestens eine Phosphorothioat-Verbindung, so dass kein Abbau von 3'-Ende des Primern durch 3'-Exonuclease Aktivität von Polymerasen erfolgen kann.
Die Sequenz des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids und die Sequenz des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides sind vorzugsweise einander komplementär.
In einer Ausführungsform kann der erste Primer-Bereich oder sein 3'-Segment an Sequenzsegmente einer Zielsequenz binden.
In einer Ausführungsform wird ein Allel-spezifischer erster Primer in Kombination mit einem allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid verwendet.
Der erste Primer-Bereich des ersten Primers kann an die ensprechende komplementäre Position einer Start-Nukleinsäure oder einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette binden. Bevozugt umfasst ein erster Primer Bereich zumindest eine Sequenzsegment, welches bevorzugt spezifisch unter verwendeten Reaktionsbedinungen an eine allel-spezifische Sequenzvariante der Zielnukleinsäure binden kann, wobei Polymerase in der Lage ist, einen dabei gebildeten perfekt-match Komplex zu verlängert, so dass dabei ein erster Primer-Verlängerungsprodukt resultiert.
Die Position einer alle-spezifischen Sequenz im Primer umfasst in einer Ausführungsform das 3'-Terminalen Nukleotid. In einer weiteren Ausführungsfrom umfasst die Position einer allel-spezifischen Sequenz im Primer die mindestens eine der Positionen -1 bis -6 Nukleotide im 3'-terminalen Segment des ersten Bereichs des ersten Primers. In einer weiteren Ausführungsfrom umfasst die Position einer allel-spezifischen Sequenz im Primer mindestens eine der Positionen von -6 bis mindestens -15 im 3'-terminalen Segment des ersten Bereichs des ersten Primers.
Ein solcher Primer umfasst weiterhin Sequenzsegmente, welche komplementär an alle Allel-Varianten einer Zielsequenz einheitlich binden können. Somit umfasst der erste Bereich eines erster allel-spezifsicher Primer Sequenzsegmente, welche sowohl zielsequenzspezifisch sind als auch solche, welche allel-spezifisch sind.
Bevorzugt wird eine Kombination eines allel-spezifischen Primers und eines allel-spezifischen Controller-Oligonukleotides verwendet, wobei der erste Bereich des ersten Primer-Oligonukleotide vollständig komplementär ist zum zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotides.
Einzelne allel-spezifische Primer können zu einer Gruppe zusammengefasst werden, welche sämtliche Varianten einer Zielsequenz abdecken. Eine solche Gruppe von allel-spezifischen Primern umfasst zumindest zwei unterschiedliche allel-spezifische Primer, da ein polymorpher Lokus an einer vorgegeben Position in der Zielsequenz mindestens zwei Sequenzvarianten umfasst. Die allel-spezifischen Primer sind dahingehend konstruiert, dass sie unter stringenten Reaktionsbedinungen vorzugsweise mit ihrer jeweils spezifischen Matrize eine perfekt-match Bindung eingehen und somit diese spezifische perfekt-Match Matrize zur Ausbildung der jeweiligen Primer-Verlängerungsprodukte unter katalytischer Wirkung der Polymerase verwenden. Vorzugsweise können 3'-terminale Nukleotide und / oder 3'-Terminale Segmente von allel-spezifischen Primern zur Diskriminierung von Varianten von Zielsequenzen verwendet werden und dabei dermassen in ihrer Sequenzzusammensetzung an die jeweiligen Varianten angepasst, dass solche Primer einen perfekt-match Doppelstrang unter stringenten Bedingungen mit der jeweiligen Variante ausbilden. Solche perfekt-match Doppelstränge können in der Regel von einer Polymerase gut erkannt werden und unter geeigneten Reaktionsbedingungen kommt es zu einer Primer-Verlängerung. Bei der Interkation eines allel-spezifischen Primers mit einer anderen Variante einer Zielsequenz entsteht somit ein Mismatch- Doppelstrang. Solche Mismatches führen in der Regel zu einer Verzögerung der Verlängerung durch eine Polymerase bzw. zu einer Verlangsamung der Gesamtreaktion. In einer Ausführungsform können allel-spezifischen Primer im 3'-Segment mindestens eine phosphoro-thioat-Bindung umfassen, welche allel-spezifische Primer vor 3'-5'-Nuklease-Abbau durch eine Polymerase schützt.
Mehrere Allel-spezifische Primer umfassen somit Sequenzsegmente, welche für eine Gruppe von allel-spezifischen Primern im Wesentlichen identisch bzw. einheitlich sind, sowie Sequenzsegmente, welche unter den Primern einer Gruppe unterschriedlich sind und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariante einer Zielsequenz. Unter Einbeziehung von einheitlichen Sequenzsegmenten können solche Primer an die jeweilige Zielsequenz unter Reaktionsbedinungen hybridisieren. Unter Einbeziehung von charakteristischen Sequenzsegmenten kann ein jeweiliger Primer spezifisch an eine Sequenzvariante der Zielsequenz unter Ausbildung eines perfekt-match Doppelstranges binden. Vorzugsweise sind die Primer dermassen konstruiert, dass unter verwendeten Reaktionsbedinungen die Bindung an eine Zielsequenz unter Ausbildung eines perfekt-match Doppelstranges bevorzugt wird und die Bindung an einer Zielsequenz unter Ausbildung eines Mismatch-Doppelstranges weniger bevorzugt wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein zielsequenz spezifischer erster Primer, (aber kein allel-spezifischer erter Primer) in Kombination mit einem allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid verwendet.
Der erste Primer-Bereich des ersten Primers kann an die ensprechende komplementäre Position einer Start-Nukleinsäure oder einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette binden. Bevozugt umfasst ein erster Primer Bereich zumindest eine Sequenzsegment, welches bevorzugt sequenz-spezifisch unter verwendeten Reaktionsbedinungen an Sequenzsegmente einer Zielnukleinsäurekette (beispielsweise umfassend eine Start-Nukleinsäure und / oder die zu amplifizierende Nukleinsäurekette) binden kann, wobei diese Bindung im wesentlichen unabhängig von potenziell vorhandenen Sequenzunterschieden im polymorphen Lokus erfolgt, wobei Polymerase in der Lage ist, einen dabei gebildeten perfekt-match Komplex zu verlängert, so dass dabei ein erster Primer-Verlängerungsprodukt resultiert.
Die Bindung eines solchen Primers erfolgt im Wesentlichen im Sequenzsegment der Zielnukleinsäure, welches für mindestens zwei Allel-Varianten dieser Zielnukleinsäureketten einheitlich ist. Bevorzugt erfolgt die Primer-Bindung im Sequenzsegment der Zielnukleinsäure, welches für alle Allel-Varianten dieser Zielnukleinsäure einheitlich ist.
Die Bindung erfolgt dabei dermassen, dass der polymorphe Lokus der Zielsequenz in 3'-Richtung vom ersten Bereich des ersten Primers liegt, so dass bei einer Primer-Verlängerungsreaktion dieser polymorphe Lokus von Polymerase kopiert wird. Ein resultierendes erstes Primer-Verlängerungsprodukt umfasst somit eine komplementäre Sequenz zum polymorphen Lokus. Diese Sequenz liegt in 3'-Richtung vom ersten Primer.
Ein solcher Primer umfasst somit Sequenzsegmente, welche bevorzugt komplementär an alle Allel-Varianten einer Zielsequenz einheitlich binden können. Damit eine Differenzierung von allel-Varianten stattfinden kann, muss ein solcher Primer mit mindestens mit einem allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid kombiniert werden. Die Allel-Diskriminierung erfolgt somit durch Wirkung von Controller-Oligonukleotid. Die Positionierung des polymorphen Lokus in 3'-Richtung vom Primer lokalisiert ist, bedingt seine Lokalisation im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides.
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides ist vorzugsweise eine Nukleinsäurequenz, welche mindestens einen Polynukleotid-Schwanz umfasst, welcher vorzugsweise während der Synthesereaktion von Polymerase unkopiert bleibt und welcher zur Bindung mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides fähig ist. Das Segment des zweiten Bereichs, welches überwiegend diese Bindung mit dem Controller-Oligonukleotid eingeht, kann als Polynukleotid-Schwanz bezeichnet werden.
Weiterhin muss der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids nicht nur das Controller-Oligonukleotides unter Reaktionsbedinungen spezifisch binden, sondern auch beim Vorgang der Strangverdrängung mittels Controller-Oligonukleotid mitwirken. Die Struktur des zweiten Bereichs muß folglich für die Herbeiführung einer räumlichen Nähe zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem entsprechenden Doppelstrang-Ende (im Einzelnen, dem 3'-Ende des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes) geeignet sein.
Die Gestaltung der Struktur des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids wird in mehreren Ausführungsformen genauer dargestellt. Dabei werden Anordnung der Oligonukleotid-Segmente und verwendete Modifikationen berücksichtigt, welche zu einem Stopp in der Polymerase-katalysierten Synthese führen.
Die Länge des zweiten Bereichs liegt zwischen 3 und 60, vorzugsweise zwischen 5 und 40, bevorzugt zwischen 6 und 15 Nukleotiden oder ihren Äquivalenten.
Die Sequenz des zweiten Bereichs kann willkürlich gewählt sein. Vorzugsweise ist sie nicht komplementär mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder mit dem zweiten Primer-Oligonukleotid und/oder mit dem ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid. Weiterhin enthält sie vorzugsweise keine selbstkomplementären Segmente, wie Hairpins oder Stemmloops.
Die Sequenz des zweiten Bereichs ist vorzugsweise auf die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids abgestimmt, so dass beide Sequenzen unter Reaktionsbedingungen eine Bindung eingehen können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Bindung unter Reaktionsbedingungen reversibel: es besteht somit ein Gleichgewicht zwischen aneinander gebundenen Komponenten und nicht-gebundenen Komponenten.
Die Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides ist vorzugsweise dermaßen gewählt, dass die Anzahl von komplementären Basen, welche mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotid binden können, zwischen 1 und 40, besser zwischen 3 und 20, bevorzugt zwischen 6 und 15 liegt.
Die Funktion des zweiten Bereichs besteht unter anderem in Bindung des Controller-Oligonukleotides. In einer Ausführungsform ist diese Bindung vorzugsweise spezifisch, so dass ein zweiter Bereich eines ersten Primer-Oligonukleotides ein spezifisches Controller-Oligonukleotid binden kann. In einer anderen Ausführungsform kann ein zweiter Bereich mehr als nur ein Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedinungen binden.
Es besteht im Allgemeinen keine Notwendigkeit in einer perfekten Übereinstimmung in der Sequenz zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides. Das Maß der Komplementarität zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides kann zwischen 20 % und 100 %, besser zwischen 50 % und 100 %, bevorzugt zwischen 80 % und 100 % liegen. Die jeweils komplementären Bereiche können unmittelbar aneinander anschließend positioniert sein oder auch nicht-komplementäre sequenz-Segmente dazwischen umfassen.
In einer Ausführungsform werden vorzugsweise spezifsiche Sequenzsegmente im zweiten Bereich des ersten Primers verwendet. Diese sequenzspezifische und damit charakteristische Sequenzsegmente sind vorzugsweise nicht komplementär zu Zielnukleinsäurekette uund werden dermassen an die Sequenzsegmente des ersten Bereichs eines allel-spezifischen Controller-Oligonukleotides angepasst, dass dabei vorwiegend spezifische komplementäre Duplexe zwischen dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides und dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotdies gebildet werden können. Dadurch kann beispielsweise bei Anwesenheit von mehreren Controller-Oligonukleotiden (z.B. welche allel-spezifisch sind), eine Paar-Bildung aus einem bestimmten ersten Primer und einem bestimmten Controller-Oligonukleotid erfolgen. Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides kann somit zu einer charakteristischen Kodierung besonders bei multiplexen Analysen verwendet werden.
Durch Verwendung von vorwiegend sequenzspezifischen Sequenzsegmenten im zweiten Primer-Bereich und einer gleichzeitigen Verwendung von entsprechend komplementären Sequenzsegmenten im ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides, kann somit eine verbesserte Zuordnung von potenziell resultierenden Primer-Verlängerungsprodukten und charakteristischen Controller-Oligonukleotiden erfolgen.
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides kann in einer Ausführungsform mindestens eine Tm-modifizierende Modifikation einschließen. Durch Einführung solcher Modifikationen kann die Stabilität der Bindung zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides modifiziert werden. Beispielsweise können Tm-erhöhende Modifikationen (Nukleotid-Modifikationen oder nicht-Nukleotid-Modifikationen) verwendet werden, wie LNA-Nukleotide, 2-Amino-Adenosine oder MGB-Modifikationen. Andererseits können auch Tm-Senkende Modifikationen verwendet werden, wie beispielsweise Inosine-Nukleotid. In der Struktur des zweiten Bereichs können auch Linker (z.B. C3, C6, HEG-Linker) intergriert werden.
Für die Strangverdrängung muss das Controller-Oligonukleotid in räumliche Nähe des Doppelstrang-Endes der zu amplifizierenden Nukleinsäure gebracht werden. Dieses Doppelstrang-Ende besteht aus Segmenten des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und einem entsprechend komplementären dazu 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Der Polynukleotid-Schwanz bindet vorwiegend komplementär das Controller-Oligonukleotides unter Reaktionsbedingungen und bewirkt damit eine vorübergehende Annäherung des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides und des ersten Bereichs eines verlängerten Primer-Verlängerungsproduktes, so dass eine komplementäre Bindung zwischen diesen Elementen im Rahmen eines Strangverdrängungsvorgangs initiiert werden kann.
In einer Ausführungsform führt die Bindung des Controller-Oligonukleotides an den Polynukleotid-Schwanz des ersten Primer-Oligonukleotides unmittelbar zu einem solchen Kontakt. Das bedeutet, dass der Polynukleotid-Schwanz und der erste Primer-Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides unmittelbar aneinander gekoppelt sein müssen. Dank einer solchen Anordnung kann nach einer Bindung eines Controller-Oligonukleotids im seinem ersten Bereich unmittelbar zu einem Kontakt zwischen komplementären Basen des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides und zu entsprechenden Basen des ersten Primer-Bereichs kommen, so dass eine Strangverdrängung initiiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform liegen zwischen Strukturen des Polynukleotid-Schwanzes und dem ersten Primer-Bereich andere Strukturen des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides. Nach einer Bindung eines Controller-Oligonukleotids an den Polynukleotid-Schwanz ist dieser somit nicht unmittelbar an den ersten Primer-Bereich positioniert, sondern in einer gewissen Distanz dazu. Die Strukturen zwischen dem unkopierbarem Polynukleotid-Schwanz und dem kopierbaren ersten Primer-Bereich des Primer-Oligonukleotides können einen solchen Abstand generieren. Dieser Abstand hat einen Wert, welcher zwischen 0,1 und 20 nm, vorzugsweise zwischen 0,1 und 5 nm, besser zwischen 0,1 und 1 nm liegt.
Solche Strukturen stellen beispielsweise Linker (z.B. C3 oder C6 oder HEG-Linker) oder nicht zu Controller-Oligonukleotid komplementäre Segmente dar (z.B. in Form von nichtkomplementären, nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen). Die Länge dieser Strukturen kann im Allgemeinen in Ketten-Atomen ausgemessen werden. Diese Länge beträgt zwischen 1 und 200 Atomen, vorzugsweise zwischen 1 und 50 Kettenatomen, bevorzugt zwischen 1 und 10 Kettenatomen.
Damit der Polynukleotid-Schwanz von Polymerase unter Amplifikationsbedinungen unkopierbar bleibt, umfasst der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides im allgemeinen Sequenz-Anordnungen bzw. Strukturen, welche zu einem Stopp der Polymerase in der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes bewirken, nachdem die Polymerase den ersten Primer-Bereich erfolgreich kopiert hat. Diese Strukturen sollen das Kopieren des Polynukleotid-Schwanzes des zweiten Bereichs verhindern. Der Polynukleotid-Schwanz bleibt somit vorzugsweise von der Polymerase unkopiert.
In einer Ausführungsform liegen solche Strukturen zwischen dem ersten Primer-Bereich und dem Polynukleotid-Schwanz.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Sequenz des Polynukleotid-Schwanzes Nukleotid-Modifikationen einschließen, welche zum Stopp der Polymerase führen. Dadurch kann ein Sequenzsegment des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids beide Funktionen umfassen: es ist sowohl ein Polynukleotid-Schwanz als auch eine zum Stopp der Polymerase führende Sequenz aus Nukleotid-Modifikationen.
Modifikationen im zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid, welche zu einem Synthese-Stopp führen und somit den Polynukleotid-Schwanz unkopierbar lassen, werden in dieser Anmeldung unter dem Begriff „erste Blockierungs-Einheit oder einen ersten Stopp-Bereich“ zusammengefasst.
Nachfolgend sind weitere Ausführungsformen von Strukturen angeführt, welche zum Stopp in der Synthese des zweiten Stranges führen können.
Mehrere Bausteine bei der Oligonukleotid-Synthese sind bekannt, welche die Polymerase beim Ablesen der Matrize hindern und zur Termination von Polymerase-Synthese führen. Beispielsweise sind nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen oder Nicht-Nukleotid-Modifikationen bekannt. Es gibt auch Synthese-Arten/Anordnungen von Nukleotid-Monomeren innerhalb eines Oligonukleotides, welche zum Stopp der Polymerase führen (z.B. 5'-5-Anordnung oder 3'-3'Anordnung). Primer-Oligonukleotide mit einem nicht kopierbaren Polynukleotid-Schwanz sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt (z.B. Scorpion-Primer-Strukturen bzw. Primer für Bindung an die feste Phase). Beide Primer-Varianten beschreiben Primer-Oligonukleotid-Strukturen, welche in der Lage sind, einerseits die Synthese eines Stranges zu initiieren, so dass eine Primer-Verlängerungsreaktion stattfinden kann. Es resultiert ein erster Strang, welcher im Primer-Verlängerungs-Produkt auch die Primer-Struktur mit Schwanz integriert. Bei der Synthese eines komplementären Stranges zum ersten Primer-Verlängerungs-Produkt, z.B. im Rahmen einer PCR-Reaktion, wird der zweite Strang bis zur „Blockierungs-Einheit/Stopp-Struktur“ der Primer-Struktur verlängert. Beide beschriebene Primer-Strukturen sind dermaßen konzipiert, dass der 5'-Anteil des Primer-Oligonukleotides einzelsträngig bleibt und nicht von der Polymerase kopiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welche in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'- nach 3'- aufweist und nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen einschließt. Zu solchen nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen zählen beispielsweise 2'-O-Alkyl-RNA Modifikationen, PNA, Morpholino. Diese Modifikationen können unterschiedlich im zweiten Primer-Bereich verteilt sein.
Der Anteil von nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen kann im Polynukleotid-Schwanz zwischen 20 % und 100 % liegen, vorzugsweise beträgt er mehr als 50% der Nukleotid-Bausteine. Vorzugsweise liegen diese Nukleotid-Modifikationen im 3'-Segment des zweiten Bereichs und grenzen somit an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides.
In einer Ausführungsform ist die Sequenz der nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen zumindest teilweise komplementär zu der Sequenz im Matrizenstrang, so dass die Primer-Bindung an die Matrize unter Einbeziehung von zumindest einem Teil dieser Nukleotid-Modifikationen stattfindet. In einer weiteren Ausführungsform ist die Sequenz der nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen nicht-komplementär zu der Sequenz im Matrizenstrang.
Die nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen werden vorzugsweise aneinander kovalent gekoppelt und stellen somit ein Sequenz-Segment im zweiten Bereich dar. Die Länge dieses Segments umfasst zwischen 1 und 40, bevorzugt zwischen 1 und 20 Nukleotid-Modifikationen, bevorzugter zwischen 3 und 10 Nukleotid-Modifikationen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'-3' aufweist und nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen einschließt (z.B. 2'-O-Alkyl-Modifikationen) und mindestens einen Nicht-Nukleotid-Linker (z.B. C3, C6, HEG-Linker) einschließt. Ein Nicht-Nukleotid-Linker hat die Funktion, benachbarte Nukleotide oder Nukleotid-Modifikationen kovalent zu verbinden und gleichzeitig die Synthese-Funktion der Polymerase ortspezifisch zu unterbrechen.
Ein solcher Nicht-Nukleotid-Linker soll die Strukturen des Polynukleotid-Schwanzes und des ersten Primer-Bereichs nicht zu weit voneinander entfernen. Vielmehr sollte der Polynukleotid-Schwanz in einer räumlichen Nähe vom ersten Primer-Bereich sein. Unter einem Nicht-Nukleotid-Linker werden Modifikationen zusammengefasst, welche in ihrer Länge nicht länger sind als 200 Ketten-Atome, noch vorteilhafter nicht länger als 50 Ketten-Atome, besonders bevorzugt nicht länger als 10 Ketten-Atome umfassen. Die Minimal-Länge eines solchen Linkers kann ein Atom betragen. Ein Beispiel für solche Nicht-Nukleotid-Linker stellen gerade oder verzweigte Alkyl-Linker mit einer Alkyl-Kette dar, welche mindestens ein Kohlenstoff-Atom einschließt, vorteilhafter mindestens 2 bis 30, bevorzugter 4 bis 18. Solche Linker sind in der Oligonukleotid-Chemie hinreichend bekannt (z.B. C3, C6 oder C12 Linker) und können während einer Festphasen-Synthese von Oligonukleotiden zwischen der Sequenz des Polynukleotid-Schwanzes und der Sequenz des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides eingeführt werden. Ein anderes Beispiel für solche Nicht-Nukleotid-Linker stellen Lineare oder verzweigte Polyethylen-Glykol-Derivate dar. Ein bekanntes Beispiel in der Oligonukleotid-Chemie stellt Hexaethylenglycol (HEG) dar. Ein weiteres Beispiel für solche Nicht-Nukleotid-Linker stellen abasische Modifikationen dar (z.B. THF-Modifikation, als Analog von dRibose).
Wenn eine oder mehrere solche Modifikationen in einen zweiten Bereich integriert sind, können sie eine Polymerase in ihrer Kopier-Funktion während ihrer Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts effektiv stören, so dass stromabwärts gelegene Segmente nach einer solchen Modifikation unkopiert bleiben. Die Anzahl von solchen Modifikationen im zweiten Bereich kann zwischen 1 und 100 liegen, vorzugsweise zwischen 1 und 10, bevorzugt zwischen 1 und 3.
Die Position eines solchen Nicht-Nukleotid-Linker kann am 3'-Ende des zweiten Bereichs liegen und somit den Übergang zum ersten Bereich und dem zweiten Bereich des Primer-Oligonukleotid darstellen.
Die Lage des Nicht-Nukleotid-Linkers im mittleren Segment des zweiten Bereichs kann ebenfalls verwendet werden. Damit wird ein Polynukleotid-Schwanz in mindestens zwei Segmente geteilt. In dieser Ausführungsform schließt das 3'-Segment des Polynukleotid-Schwanzes mindestens eine, besser mehrere, z.B. zwischen 2 und 20, vorzugsweise zwischen 2 und 10 nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen ein. Diese nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen liegen vorzugsweise am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des Primer-Oligonukleotides.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in seiner gesamten Länge eine Anordnung von 5'-nach 3'- aufweist und zumindest ein Nukleotid-Monomer in einer „umgekehrten“ Anordnung von 3'-nach 5'- einschließt und welche am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides positioniert sind.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, wobei ein solcher Polynukleotid-Schwanz vollständig aus Nukleotiden besteht, welche in umgekehrten Anordnung direkt an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides angrenzen, so dass die Kopplung des ersten und des zweiten Bereichs durch 5'-5' Position erfolgt. Ein Vorteil einer solchen Anordnung ist, dass die Polymerase nach einer Kopierung des ersten Bereichs an eine „umgekehrte“ Anordnung von Nukleotiden trifft, was typischerweise zu Termination der Synthese an dieser Stelle führt.
Bei einer „umgekehrten“ Anordnung von Nukleotiden in der Gesamtlänge des Polynukleotid-Schwanzes soll vorzugsweise das 3'-terminales Nukleotid des Polynukleotid-Schwanzes an seinem 3'-OH-Ende blockiert sein, um Nebenreaktionen vorzubeugen. Alternativ kann auch ein terminales Nukleotid verwendet werden, welches gar keine 3'-OH Gruppe aufweist, z.B. ein Dideoxy-Nukleotid.
In einer solchen Ausführungsform soll natürlich auch die entsprechende Nukleotid-Anordnung im Controller-Oligonukleotid angepasst werden. In einem solchen Fall müssen der erste und der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotids in 3'-3' Anordnung verknüpft werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welche in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'-nach 3'- aufweist und mindestens eine Nukleotid-Modifikation einschließt, welche für die Polymerase keine komplementäre Nukleobase darstellt, wenn die Synthese mit ausschließlich natürlichen dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP oder dUTP) durchgeführt wird.
Beispielsweise können Iso-dG bzw. Iso-dC Nukleotid-Modifikationen als einzelne, vorzugsweise aber mehrere (mindestens 2 bis 20) Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids integriert sein. Weitere Beispiele für Nukleobasen-Modifikationen stellen verschiedene Modifikationen des erweiterten genetischen Alphabets dar. Solche Nukleotid-Modifikationen unterstützen vorzugsweise keine komplementäre Basen-Paarung mit natürlichen Nukleotiden, so dass eine Polymerase (zumindest theoretisch) kein Nukleotid aus der Reihe (dATP, dCTP, dGTP, dTTP oder dUTP) einbaut. In der Realität kann es dennoch zum rudimentären Einbau kommen, insbesondere bei höheren Konzentrationen von dNTP-Substraten und prolongierten Inkubationszeiten (z.B. 60 min oder länger). Daher sollen bevorzugt mehrere solche Nukleotid-Modifikationen positioniert an benachbarten Stellen zum Einsatz kommen. Der Stopp der Polymerase-Synthese wird durch Fehlen von passenden komplementären Substraten für diese Modifikationen bewirkt. Oligonukleotide mit Iso-dC bzw. Iso-dG können mit Standardverfahren synthetisiert werden und sind von mehreren kommerziellen Anbietern erhältlich (z.B. Trilink-Technologies, Eurogentec, Biomers GmbH). Wahlweise kann auch die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids an die Sequenz eines solchen zweiten Primer-Bereichs angepasst werden. Dabei können komplementäre Nukleobasen des erweiterten genetischen Alphabets in den ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides entsprechend während der chemischen Synthese intergriert werden. Beispielsweise kann Iso-dG im zweiten Bereich des ersten Primer-Nukleotids integriert sein, sein komplementäres Nukleotid (Iso-dC-5-Me) kann an der passenden Stelle im ersten Bereich des Controller-Oligonukleotids platziert werden.
Zusammenfassend, kann die Termination der Synthese von Polymerase im zweiten Bereich auf verschiedene Art und Weise erreicht werden. Diese Blockade erfolgt bevorzugt allerdings erst, wenn Polymerase den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides kopiert hat. Damit wird sichergestellt, dass ein zweites Primer-Verlängerungsprodukt eine passende Primer-Bindungsstelle in seinem 3'-Segment besitzt. Diese Primer-Bindungsstelle wird im Rahmen der Strangverdrängung freigelegt und steht somit für eine erneute Bindung eines weiteren ersten Primer-Oligonukleotids zur Verfügung.
Bei der Synthese des komplementären Stranges zum ersten Primer-Verlängerungsprodukt bleibt die Primer-Verlängerungsreaktion vor dem Polynukleotid-Schwanz stehen. Da dieser Polynukleotid-Schwanz für die Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid dadurch einzelsträngig bleibt und somit für Bindung zur Verfügung steht, unterstützt dieser die Initiierung der Strangverdrängungs-Reaktion durch das Controller-Oligonukleotid, indem er den entsprechenden komplementäre Segmente des Controller-Oligonukleotids in unmittelbare Nähe des passenden Duplex-Endes bringt. Der Abstand zwischen dem komplementären Teil des Controller-Oligonukleotides (zweiter Bereich) und dem komplementären Teil des verlängerten Primer-Oligonukleotid (erster Bereich) wird dadurch auf ein Minimum reduziert. Solche räumliche Nähe erleichtert die Initiierung der Strangverdrängung.
Im Rahmen einer schematischen Darstellung einer nukleinsäurevermittelten Strangverdrängungs-Reaktion liegt nun eine komplementäre Sequenz von Controller-Oligonukleotid unmittelbar in der Nähe des passenden Duplex-Endes. Dabei kommt es zu Konkurrenz um die Bindung an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids zwischen dem Strang des Controller-Oligonukleotides und dem zum Primer komplementären Matrizenstrang. Durch repetetive Schließung und Formierung von Basenpaarung zwischen dem Primer-Bereich und dem komplementären Segment des Controller-Oligonukleotids (zweiter Bereich des Controller-Nukleotides) bzw. dem komplementären Segment des Matrizenstranges kommt es zur Initiierung des nukleinsäurevermittelten Strangverdrängungs- Vorgangs.
Im Allgemeinen ist die Ausbeute der Initiierung der Stang-Verdrängung ist umso höher, je näher der entsprechende komplementäre Sequenzabschnitt des Controller-Oligonukleotides zum komplementären Segment des Primer-Bereichs liegt. Bei Vergrößerung dieses Abstandes sinkt dagegen die Ausbeute der Initiierung der Strangverdrängung.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es nicht zwingend notwendig, dass die Initiierung der Strangverdrängung mit maximaler Ausbeute funktioniert. Daher können Abstände zwischen dem 5'-Segment des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotid, welcher eine Bindung mit einem komplementären Strang der Matrize eingeht und eine komplementäre Duplex bildet, und einem entsprechend komplementären Sequenzabschnitt im Controller-Oligonukleotides, wenn gebunden an Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides in folgenden Bereichen liegen: zwischen 0,1 und 20 nm, besser zwischen 0,1 und 5 nm, noch besser zwischen 0,1 und 1 nm. Im bevorzugten Fall beträgt diese Distanz weniger als 1 nm. In anderen Einheiten ausgedruckt entspricht dieser Abstand einer Strecke von weniger als 200 Atomen, noch besser weniger als 50 Atomen, noch besser weniger als 10 Atomen. Im bevorzugten Fall ist diese Distanz ein Atom. Die Angaben zur Distanz sollen lediglich zur Orientierung dienen und veranschaulichen, dass kürzere Distanzen zwischen diesen Strukturen bevorzugt werden. Die Messung dieser Distanz ist in vielen Fällen nur durch Analyse der genauen Strukturen von Oligonukleotiden und Ausmessung der Messung von Sequenzabständen bzw. von Linker-Längen möglich.
Der erste Primer kann auch noch weitere Sequenzabschnitte umfassen, welche nicht zu Interaktion mit Controller-Oligonukleotid oder Matrizen Strang benötigt werden. Solche Sequenzabschnitte können beispielsweise weitere Oligonukleotide binden, welche als Detektionssonden oder Immobilisierungspartner bei einer Bindung an die feste Phase verwendet werden.
Primer-Funktion des ersten Primer-Oligonukleotides
Das erste Primer-Oligonukleotid kann in mehreren Teil-Schritten verwendet werden. In erster Linie übernimmt es eine Primer-Funktion in der Amplifikation. Dabei wird Primer-Verlängerungsreaktion unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize ausgeführt. In einer weiteren Ausführungsform kann das erste Primer-Oligonukleotid zu Beginn der Amplifikationsreaktion die Start-Nukleinsäurekette als Matrize verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann das erste Primer-Oligonukleotid bei der Erstellung / Bereitstellung einer Start-Nukleinsäurekette verwendet werden.
Im Rahmen der Amplifikation dient der erste Primer als Initiator der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize. Das 3'-Segment des ersten Primers umfasst eine Sequenz, welche vorwiegend komplementär an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt binden kann. Die enzymatische Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotid unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize führt zu Ausbildung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes. Ein solches erstes Primer-Verlängerungsprodukt umfasst die Zielsequenz bzw. ihre Sequenz-Anteile. Im Verlauf der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes wird die Sequenz des kopierbaren Anteils des ersten Primer-Oligonukleotid von Polymerase als Matrize erkannt und eine entsprechende komplementäre Sequenz synthetisiert wird, so dass eine entsprechende Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid resultiert. Die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes erfolgt bis einschließliech 5'-Segment des zweiten Primer-Oligonukleotids. Unmittelbar nach der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes ist dieses Produkt an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt gebunden und bildet doppelsträngigen Komplex. Das zweite Primer-Verlängerungsprodukt wird aus diesem Komplex sequenzspezifisch durch das Controller-Oligonukleotid verdrängt. Dabei bindet das Controller-Oligonukleotid an das erste Primer-Verlängerungsprodukt. Nach einer erfolgreichen Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid kann das zweite Primer-Verlängerungsprodukt wiederum selbst als Matrize für die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes dienen. Das nun frei gewordene 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes kann ein weiteres zweites Primer-Oligonukleotid binden, so dass eine neue Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes initiiert werden kann.
Weiterhin kann das erste Primer-Oligonukleotid als Initiator der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes ausgehend von Start-Nukleinsäurekette zu Begin der Amplifikation dienen. In einer Ausführungsform ist die Sequenz des ersten Primers vollständig komplementär zum entsprechenden Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäurekette. In einer weiteren Ausführungsform ist die Sequenz des ersten Primer-Oligonukleotides nur teilweise komplementäre zum entsprechenden Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäurekette. Diese abweichende Komplementarität soll das erste Primer-Oligonukleotid allerdings nicht daran hindern, eine vorwiegend sequenzspezifische Primer-Verlängerungsreaktion zu starten. Die jeweiligen Unterschiede in Komplementarität des ersten Primer-Oligonukleotides zur jeweiligen Position in der Start-Nukleinsäurekette liegen vorzugsweise im 5'-Segment des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, so dass im 3'-Segment vorwiegend komplementäre Basenpaarung und Initiierung der Synthese möglich ist. Für die Initiierung der Synthese sollen beispielsweise besonders die ersten 4 - 10 Positionen im 3'-Segment vollkomplementär zu Matrize (Start-Nukleinsäurekette) sein. Die restlichen Nukleotidpositionen können von perfekten Komplementarität abweichen. Das Ausmaß einer perfekten Komplementarität im restlichen 5'-Segment des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides kann somit Bereiche umfassen zwischen 50% bis 100%, besser zwischen 80% und 100% der Basenzzusammensetzung. Je nach Länge des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, umfassend die Sequenz-Abweichungen von 1 bis maximal 15 Positionen, besser 1 bis maximal 5 Positionen. Das erste Primer-Oligonukleotid kann somit eine Synthese von einer Start-Nukleinsäukette initiieren. Bei einer darauffolgenden Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes werden kopierbare Sequenzabschnitte des ersten Primer-Oligonukleotides von Polymerase kopiert, so dass wiederum in darauf folgenden Synthese-Zyklen eine vollkomplementäre Primer-Bindungsstelle innerhalb des zweiten Primer-Verlängerungsprodukte für die Bindung des ersten Primer-Oligonukleotides ausgebildet wird und in darauf folgenden Synthese-Zyklen zur Verfügung steht.
In einer weiteren Ausführungsform kann das erste Primer-Oligonukleotid im Rahmen der Vorbereitung einer Start-Nukleinsäurekette verwendet werden. Dabei kann ein solches erste Primer-Oligonukleotid an eine Nukleinsäure (z.B. eine einzelsträngige genomische DNA oder RNA oder ihre Äquivalente umfassend eine Zielsequenz) vorwiegend / bevorzugt sequenzspezifisch binden und in Anwesenheit einer Polymerase eine matrizenabhängige Primer-Verlängerungsreaktion initiieren. Die Bindungsposition ist dermassen gewählt, dass das Primer-Verlängerungsprodukt eine gewünschte Zielsequenz umfasst. Durch die Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotides resultiert ein Nukleinsäure-Strang, welcher zu Matrize komplementäre Sequenz aufweist. Ein solcher Strang kann von der Matrize abgelöst werden (z.B. durch Hitze oder Alkalie) und damit in eine einzelsträngige Form überführt werden. Eine solche einzelsträngige Nukleinsäurekette kann als Start-Nukleinsäurekette zu Beginn der Amplifikation dienen. Eine solche Start-Nukleinsäurekette umfasst in ihrem 5'-Segment die Sequenzanteile des ersten Primer-Oligonukleotides, weiterhin umfasst sie eine Zielsequenz oder ihre Äquivalente und eine Primer-Bindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid. Weitere Schritte sind im Abschnitt „Start-Nukleinsäurekette“ erläutert.
Die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes ist eine Primer-Verlängerungsreaktion und bildet einen Teilschritt in der Amplifikation. Die Reaktionsbedinungen während dieses Schrittes sind entsprechend angepasst. Die Reaktions-Temperatur und die Reaktions-Zeit sind dermassen gewählt, dass die Reaktion erfolgreich stattfinden kann. Die jeweils bevorzugte Temperatur in diesem Schritt hängt von der verwendeten Polymerase ab und der Bindungsstärke des jeweiligen ersten Primer-Oligonukleotides an seine Primer-Bindungsstelle und umfasst beispielsweise Bereiche von 15°C bis 75°C, besser von 20 bis 65°C, bevorzugt von 25°C bis 65°C. Die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides umfasst Bereiche von 0,01 µmol/l bis 50 µmol/l, besser von 0,1 µmol/l bis 20 µmol/l, bevorzugt von 0,1 µmol/l bis 10 µmol/l.
In einer Ausführungsform verlaufen alle Schritte der Amplifikation unter stringenten Bedinungen, welche Ausbildung von unspezifischen Produkten / Nebenprodukten verhindern bzw. verlangsamen. Zu solchen Bedinungen zählen beispielsweise höhere Temperaturen, beispielsweise über 50°C.
Falls mehr als eine spezifische Nukleinsäurekette in einem Ansatz amplifiziert werden müssen, werden in einer Ausführungsform bevorzugt jeweils sequenzspezifische Primer-Oligonukleotide für Amplifikation von entsprechenden jeweiligen Zielsequenzen verwendet.
Vorzugsweise sind Sequenzen des ersten, des zweiten Primer-Oligonukleotides und des Controller-Oligonukleotides dermassen aneinander angepasst, dass Nebenreaktionen, z.B. Primer-Dimer-Ausbildung, minimiert sind. Zu diesem Zweck sind beispielsweise die Sequenz des ersten und des zweiten Primer-Oligonukleotides aneinander demassen angepasst, daß beide Primer-Oligonukleotide nicht in der Lage sind, eine Amplifikations-Reaktion in Abwesenheit einer passenden Matrize und/oder einer Zielsequenz und/oder einer Start-Nukleinsäurekette zu starten bzw. zu unterstützen. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass das zweite Primer-Oligonukleotid keine Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid umfasst und das erste Primer-Oligonukleotid keine Primer-Bindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid umfasst. Weiterhin soll vermieden werden, dass die Primer-Sequenzen ausgedehnte eigen-komplementäre Strukturen (Selfcomplement) umfassen.
In einer Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes bei gleicher Temperatur. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes bei unterschiedlichen Temperaturen. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei unterschiedlichen Temperaturen.
Verwendung eines ersten Primer-Oligonukleotides in Kombination mit einem ersten Kompetitor-Pimer -Oligonukleotides:
Bevorzugte Ausführungsformen des ersten Kompetitor-Primer-Oligonukleotids (Primer-1) Ein erstes Kompetitor-primer-Oligonukleotid konkurriert mit dem ersten Primer-Oligonukleotid um die Bindung an ein Sequenzsegment einer Zielsequenz umfassenden Nukleinsäurekette, welche zumindest zwei Varianten einer Zielnukleinsäurekette umfasst.
Das erste Primer-Oligonukleotid bindet dabei an die gewünschte bzw. zu erwartende Sequenzvariante und wird bevorzugt unter stringenten Reaktionsbedinungen durch eine Polymerase verlängert. Das erste Kompetitor-Oligonukleotid bindet an die zweite potenzielle bzw. erwartende Sequenzvariante und wird bevorzugt unter stringenten Reaktionsbedinungen durch eine Polymerase verlängert. Es entstehen somit zwei Primer-Verlängerungsprodukte: das eine vom ersten Primer-Oligonukleotid, welches weiter in der Amplifikation vermehr werden soll und das andere vom ersten Kompetitor-Primer-Oligonukleotid, welches in einer Amplifikation nicht vermehrt werden soll.
Durch die Konkurrenz von zwei Primern um eine Primerbindungssequenz in der Zielnukleinsäurekette kann Spezifität der Analyse verbessert werden.
Die beiden Primer (der erste Primer und der erste Kompetitor-Primer) stellen somit allelspezifsiche Primer in Bezug auf potenzielle bzw. zu erwartende Sequenzvarianten dar. Der wesentliche Unterschied besteht vor allem darin, dass der Kompetitor-Primer nicht in der Lage ist, unter Mitwirkung eines allel-spezifischen Controller-Oligonukleotdies eine Strang-Trennung zu initiieren.
In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Kompetitor-Primer-Oligonukleotid (Kompetitor-Primer-1) eine Nukleinsäurekette welche mindestens folgende Eigenschaften einschließt:

• Einen ersten Kompetitor-Primer-Bereich im 3'-Segment des ersten Kompetitor-Primer-Oligonukleotides, der an einen Strang einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann und somit konkurrierend mit dem ersten Primer-Oligonukleotid um seine Primer-Bindungsstelle wirken kann.
• 3'-Ende des Kompetitor-Primers, welches nach einer Bindung an die Primer-Bindungsstelle in der Zielsequenz sequenzspezifisch von Polymerase verlängert werden kann unter Ausbildung eines Kompetitor-Primer-Verlängerungsproduktes
• 3'-Ende des Kompetitor, welches von der zweiten Blockierungs-Einheit“ und / oder von der „vierten Blockierungs-Einbeit“ des Controller-Oligonukleotides am Verlängern durch eine Polymerase verhindert wird, wenn das erste Kompetitor-Primer Oligonukleotid an Controller-Oligonukleotid komplementär gebunden ist

Die Gesamtlänge des ersten Kompetiro-Primer-Oligonukleotides liegt zwischen 10 und 80, vorzugsweise zwischen 15 und 50, besser zwischen 20 und 30 Nukleotiden oder ihren Äquivalenten (z.B. Nukleotid-Modifikationen). Die Länge des 3'-Segments, welches eine komplementäre Bindung an eine zu erwartende Sequenzvariante einer Zielsequenz eingehen kann, umfasst im Wesentlichen die gleichen Bereiche, wie der erste Bereich des ersten Primers. Damit wird sichergestellt, dass beide Primer konkurrierend an die Zielsequenz binden können und diese Bindung etwa im gleichen Temperatur-Bereich erfolgt. Die konkurrierende Bindung und vor allem konkurrierende Primer-Verlängerung unter Verwendung von allel-spezifischen Sequenzsegmente von Zielnukleinsäure führt in der Regel zu einer weiteren Steigerung der Spezifität.
Die Struktur des ersten Kompetitor-Primer-Oligonukleotids ist dermaßen angepasst, dass es unter gewählten Reaktionsbedinungen eine reversible Bindung an Controller-Oligonukleotid eingehen kann. In einer Ausführungsform umfasst der erste Kompetitor-Primer Sequenzsegmente, welche mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides keine komplementäre Bindung eingehen sollen. Somit kann dieses erste Kompetitor-Oligonukleotid nicht als Initiatiator eine Strang-Verdrängung durch ein Controller-Oligonukleotide auftreten.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist der erste Kompetiro-Primer-Oligonukleotid ein DNA-Oligonukleotid mit einer konventionellen 5'-3' Anordnung von Nukleotiden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Kompetitor-Primer-Oligonukleotid weitere Sequenzen, die nicht an das Controller-Oligonukleotid binden. Diese Sequenzen können zu anderen Zwecken verwendet werden, z.B. zu Bindung an die feste Phase. Diese Sequenzen sind vorzugsweise am 5'-Ende des 3'-Segmentes lokalisiert.
Der erste Primer-Bereich des ersten Kompetiror-Primer-Oligonukleotides
Die Sequenz-Länge liegt zwischen ca.15-30 Nukleotiden, vorzugsweise zwischen 5 und 20 Nukleotiden, wobei die Sequenz vorwiegend komplementär zum 3'-Segment eines Stranges der in der Amplifikation zu unterdrückenden Allel-Variante einer Zielnukleinsäure ist. Der erste Primer-Bereich kann Nukleotid-Monomere einschließen, welche Funktion der Polymerase nicht oder nur unwesentlich beeinflussen, dazu gehöhren beispielsweise:

In einer Ausführungsform wird ein Allel-spezifsicher erster Primer in Kombination mit einem allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid und einem allel-spezifischen Kompetitor-Primer-Oligonukleotid verwendet.
Bevorzugte Ausführungsformen des Controller-Oligonukleotids
Ein Controller-Oligonukleotid (29) umfasst:

• Einen ersten einzelsträngigen Bereich, welcher an den Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides binden kann,
• einen zweiten einzelsträngigen Bereich, welcher an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides im wesentlich komplementär binden kann,
• einen dritten einzelsträngigen Bereich, welcher zumindest zu einem Segment des Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Verlängerungsprodukts im Wesentlichen komplementär ist,

Im Allgemeinen wird die Sequenz des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotides an die Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure angepasst, da diese als Matrize für die Reihenfolge der Nukleotide im Verlängerungsprodukt eines ersten Primers maßgeblich ist. Die Sequenz des zweiten Bereichs von Controller-Oligonukleotid wird an die Sequenz des ersten Primer-Bereiches angepasst. Die Struktur des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides wird an die Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides angepasst, vor allem an die Beschaffenheit des Polynukleotid-Schwanzes.
Ein Controller-Oligonukleotid kann auch weitere Sequenz-Segmente einschließen, welche nicht zum ersten, zweiten oder dritten Bereich gehören. Diese Sequenzen können beispielsweise als flankierende Sequenzen am 3'- und am 5'-Ende angebracht werden. Vorzugsweise stören diese Sequenzsegmente die Funktion des Controller-Oligonukleotids nicht.
Die Struktur des Controller-Oligonukleotids weist bevorzugt folgende Eigenschaften auf:
Die einzelnen Bereiche sind untereinander kovalent gebunden. Die Bindung kann beispielsweise via konventionelle 5'-3' Bindung erfolgen. Es kann beispielsweise eine Phospho-Diesterbindung oder eine Nuklease-resistente Phospho-Thioester Bindung verwendet werden.
Ein Controller-Oligonukleotid kann mittels seines ersten Bereichs an den Polynukleotid-Schwanz des ersten Primer-Oligonukleotides binden, wobei die Bindung vorwiegend durch Hybridisierung komplementärer Basen vermittelt wird. Die Länge dieses ersten Bereichs beträgt 3 - 80 Nukleotide, vorzugsweise 4 - 40 Nukleotide, besonders bevorzugt 6 - 20 Nukleotide. Das Ausmaß an Sequenzübereinstimmung zwischen der Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids und der Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotide kann zwischen 20 % und 100 %, vorzugsweise zwischen 50 % und 100 %, besonders bevorzugt zwischen 80 % und 100 % liegen. Die Bindung des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids sollte vorzugsweise spezifisch an den zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen erfolgen.
Die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids ist vorzugsweise dermaßen gewählt, dass die Anzahl von komplementären Basen, welche mit dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids komplementär binden können, zwischen 1 und 40, besser zwischen 3 und 20, bevorzugt zwischen 6 und 15 liegt.
Da das Controller-Oligonukleotid keine Matrize für Polymerase darstellt, kann es Nukleotid-Modifikationen einschließen, welche die Polymerase-Funktion nicht unterstützen, welche sowohl Basenmodifikationen und / oder Zucker-Phosphat-Rückgrad-Modifikationen sein können. Das Controller-Oligonukleotid kann beispielsweise in seinem ersten Bereich Nukleotide und/oder Nukleotid-Modifikationen einschließen, welche aus der folgenden Liste ausgewählt sind: DNA, RNA, LNA („locked nucleic acids“ Analoga mit 2'-4' Brückenbindung im Zuckerrest), UNA („unlocked nucleid acids“ ohne Bindung zwischen 2'-3'-Atomen des Zuckerrestes), PNA („peptide nucleic acids“ Analoga), PTO (phosphorothioate), Morpholino-Analoga, 2'-O-Alkyl-RNA Modifikationen (wie 2'-OMe, 2'-O Propargyl, 2'-O-(2-Methoxyethyl), 2'-O-Propyl-Amin), 2'-Halogen-RNA, 2'-Amino-RNA etc. Diese Nukleotide oder Nukleotid-Modifikationen sind untereinander beispielsweise durch konventionelle 5'-3'-Bindung oder 5'-2' Bindung verknüpft. Es kann beispielsweise eine Phospho-Diesterbindung oder eine nuklease resistente Phospho-Thioester Bindung verwendet werden.
Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nukleotide und/oder Nukleotid-Modifikationen einschließen, wobei die Nukleobasen aus der folgenden Liste ausgewählt sind: Adenine und seine Analoga, Guanine und seine Analoga, Cytosine und seine Analoga, Uracil und seine Analoga, Thymine und seine Analoga, Inosine oder andere Universalbasen (z.B. Nitroindol), 2-Amino-Adenin und seine Analoga, Iso-Cytosine und seine Analoga, Iso-Guanine und seine Analoga.
Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nicht-Nukleotid-Verbindungen einschließen, welche aus der folgenden Liste ausgewählt sind: Interkallierende Stoffe, welche Bindungsstärke zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid beeinflussen können, z.B. MGB, Naphthalene etc. Gleiche Elemente können auch im zweiten Bereich des ersten Primers verwendet werden.
Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nicht-Nukleotid-Verbindungen einschließen, z.B. Linker wie C3, C6, HEG Linker, welche einzelne Segmente des ersten Bereichs untereinander verknüpfen.
Das Controller-Oligonukleotid kann mittels seines zweiten Bereichs an den ersten Primer-Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids binden, wobei die Bindung im Wesentlichen durch Hybridisierung komplementärer Basen vermittelt wird.
Die Länge des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotids ist an die Länge des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotid angepasst und stimmt mit dieser vorzugsweise überein. Sie liegt zwischen ca. 3-30 Nukleotiden, vorzugsweise zwischen 5 und 20 Nukleotiden. Die Sequenz des zweiten Bereichs von Controller-Oligonukleotid ist vorzugsweise komplementär zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid. Das Maß der Übereinstimmung in Komplementarität liegt zwischen 80 % und 100 %, vorzugsweise zwischen 95 % und 100 %, bevorzugt bei 100 %. Der zweite Bereich von Controller-Oligonukleotid schließt vorzugsweise Nukleotid-Modifikationen ein, welche Polymerase bei Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotides verhindern allerdings Ausbildung von komplementären Doppelsträngen nicht blockieren oder nicht wesentlich verhindern, beispielsweise 2'-O-Alkyl RNA-Analoga (z.B. 2'-O-Me, 2'-O-(2-Methoxyethyl), 2'-O-Propyl, 2'-O-Propargyl Nukleotid-Modifikationen), LNA, PNA oder Morpholino Nukleotid-Modifikationen. Einzelne Nukleotid-Monomere sind vorzugsweise via 5'-3'-Bindung verknüpft, aber auch alternative 5'-2'-Bindung zwischen Nukleotid-Monomeren kann verwendet werden.
Die Sequenz-Länge und ihre Beschaffenheit des ersten und des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides sind vorzugsweise dermassen gewählt, dass die Bindung dieser Bereiche an das erste Primer-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen zumindestens in einem Reaktions-Schritt des Verfahrens reversibel ist. Das bedeutet, dass Controller-Oligonukleotid und das erste Primer-Oligonukleotid zwar spezifisch an einander binden können, diese Bindung soll allerdings nicht zu Ausbildung eines unter Reaktionsbedingungen dauerhaft stabilen Komplexes aus beiden Elementen führen.
Vielmehr soll ein Gleichgewicht zwischen einer gebunden Komplex-Form aus Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und einer freien Form von einzelnen Komponenten unter Reaktionsbedingungen zumindest in einem Reaktions-Schritt angestrebt bzw. ermöglicht werden. Damit wird sichergestellt, dass zumindest ein Anteil der ersten Primer-Oligonukleotide unter Reaktionsbedingungen in freier Form vorliegt und mit der Matrize interagieren kann, um eine Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Andererseits, wird damit sichergestellt werden, dass entsprechende Sequenzbereiche des Controller-Oligonukleotides zu Bindung mit einem verlängerten Primer-Oligonukleotid zur Verfügung stehen.
Durch Temperatur-Wahl während der Reaktion kann der Anteil von freien, einzelsträngigen und somit reaktionsfähigen Komponenten beeinflusst werden: durch Absenkung der Temperatur binden erste Primer-Oligonukleotide an die Controller-Oligonukleotide, so dass beide Teilnehmer einen komplementären doppelsträngigen Komplex binden. Damit kann Konzentration einzelsträngiger Formen einzelner Komponenten abgesenkt werden. Eine Erhöhung der Temperatur kann zu Dissoziation beider Komponenten in einzelsträngige Form führen. Im Bereich der Schmelz-Temperatur des Komplexes (Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid) liegen ca. 50% der Komponenten in einzelsträngiger Form und ca. 50% als doppelsträngiger Komplex vor. Durch Verwendung entsprechender Temperaturen kann somit die Konzentration einzelsträngiger Formen im Reaktionsgemisch beeinflusst werden.
Bei Ausführungsformen des Amplifikationsverfahrens, welche Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Reaktions-Schritten umfassen, können gewünschte Reaktionsbedingungen während entsprechender Reaktions-Schritte herbeigeführt werden. Beispielsweise durch Verwendung von Temperatur-Bereichen etwa in Höhe von Schmelztemperatur von Komplexen aus Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid können Anteile von jeweils freien Formen einzelner Komponenten beeinflusst werden. Dabei führt verwendete Temperatur zu einer Destabilisierung von Komplexen umfassend Controller-Oligonukleotid / erster Primer-Oligonukleotid, so dass während dieses Reaktionsschrittes einzelne Komplex-Komponente zumindest vorübergehend einzelsträngig werden und damit in die Lage versetzt werden, mit anderen Reaktionspartnern zu interagieren. Beispielsweise kann erster Sequenzbereich des Controller-Oligonukleotides aus dem doppelsträngigen Komplex mit einem nicht-verlängerten ersten Primer freigesetzt werden und kann somit mit dem zweiten Sequenzbereich eines verlängerten ersten Primer-Oligonukleotides interagieren und damit eine Strangverdrängung initiieren. Andererseits, führt Freisetzung eines ersten, nicht verlängerten Primer-Oligonukleotides aus einem Komplex umfassend Controller-Oligonukleotid / erster Primer-Oligonukleotid dazu, dass der erster Primer-Bereich einzelsträngig wird und somit mit der Matrize interagieren kann, so dass eine Primer-Verlängerung durch eine Polymerase initiiert werden kann.
Die verwendete Temperatur muss dabei nicht exakt der Schmelztemperatur des Komplexes aus Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid entsprechen. Es genügt, wenn Temperatur in einem Reaktionsschritt etwa im Bereich der Schmelztemperatur verwendet wird. Beispielsweise umfasst die Temperatur in einem der Reaktionsschritte Bereiche von Tm +/- 10°C, besser Tm +/- 5°C, bevorzugt Tm +/- 3°C des Komplexes aus Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid.
Eine solche Temperatur kann beispielsweise im Rahmen des Reaktions-Schrittes eingestellt werden, welcher eine sequenzspezifische Strandverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid umfasst.
Bei Ausführungsformen des Amplifikationsverfahrens, welche keinen Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Reaktions-Schritten umfassen und Amplifikation unter isothermalen Bedinungen verläuft, werden über die Gesamtdauer der Amplifikationsreaktion Reaktionsbedinungen aufrechterhalten, bei welchen ein Gleichgewicht zwischen einer Komplex-Form aus Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und einer freien Form von einzelnen Komponenten möglich ist.
Das Verhältnis zwischen einer Komplex-Form aus Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und freien Formen einzelner Komponenten kann sowohl durch Reaktionsbedinungen (z.B. Temperatur und Mg2+ Konzentration) als auch durch Strukturen und Konzentrationen einzelner Komponenten beeinflusst werden.
Die Sequenz-Länge und ihre Beschaffenheit des ersten und des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides sind in einer Ausführungsform so gewählt, dass unter gegebenen Reaktionsbedinungen (z.B. im Reaktionsschritt einer Strangverdängung durch das Controller-Oligonukleotid) das Verhältnis zwischen einem Anteil eines freien Controller-Oligonukleotids und einem Anteil eines Controller-Oligonukleotid im Komplex mit einem ersten Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst: von 1:100 bis 100:1, vorzugsweise von 1:30 bis 30:1, besonders bevorzugt von 1:10 bis 10:1. Das Verhältnis zwischen einem Anteil eines freien ersten Primer-Oligonukleotid und einem Anteil eines ersten Primer-Oligonukleotids im Komplex mit einem Controller-Oligonukleotid umfasst Bereiche von 1:100 bis 100:1, vorzugsweise von 1:30 bis 30:1, besonders bevorzugt von 1:10 bis 10:1.
In einer Ausführungsform ist die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides höher als die Konzentration des Controller-Oligonukleotides. Dadurch liegt ein Überschuß des ersten Primers in der Reaktion vor und Controller-Oligonukleotid muss für seine Wirkung aus der Bindung mit dem ersten Primer durch Wahl entsprechender Reaktionstemperatur freigesetzt werden. Im Allgemeinen erfolgt das durch eine Temperaturerhöhung, bis hinreichende Konzentrationen von freien Formen des Controller-Oligonukleotids vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides niedriger als die Konzentration des Controller-Oligonukleotides. Dadurch liegt ein Überschuss des Controller-Oligonukleotids vor und das erste Primer-Oligonukleotid muss für seine Wirkung aus der Bindung mit dem Controller-Oligonukleotid durch Wahl entsprechender Reaktionstemperatur freigesetzt werden. Im Allgemeinen erfolgt das durch eine Temperaturerhöhung, bis hinreichende Konzentrationen von freien Formen des ersten Primer-Oligonukleotids vorliegen.
Bei isothermalen Bedingungen liegt ein Gleichgewicht vor: gewisse Anteile des ersten Primer-Oligonukleotides und Controller-Oligonukleotides sind aneinander gebunden, andere dagegen sind als einzelsträngige Form in der Reaktion vorhanden.
Das Controller-Oligonukleotid kann mittels seines dritten Bereichs an mindestens ein Segment des spezifisch synthetisierten Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotids binden. Die Bindung erfolgt bevorzugt durch Hybridisierung komplementärer Basen zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem von Polymerase synthetisierten Verlängerungsprodukt.
Zu Unterstützung der Strangverdrängungsreaktion soll die Sequenz des dritten Bereichs vorzugsweise eine hohe Komplementarität zum Verlängerungsprodukt aufweisen. In einer Ausführungsform ist die Sequenz des dritten Bereichs zu 100 % dem Verlängerungsprodukt komplementär.
Die Bindung des dritten Bereichs erfolgt vorzugsweise an das Segment des Verlängerungsproduktes, welches unmittelbar an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides anschließt. Somit liegt das Segment des Verlängerungsprodukts vorzugsweise im 5'-Segment des gesamten Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotids.
Die Bindung des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotids erfolgt vorzugsweise nicht über die gesamte Länge des Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotides. Vorzugsweise bleibt ein Segment am 3'-Ende des Verlängerungsproduktes ungebunden. Dieses 3'-ständige Segment ist für die Bindung des zweiten Primer-Oligonukleotides notwendig.
Die Länge des dritten Bereichs ist entsprechend dermassen angepasst, dass der dritte Bereich zum einen an das 5'-ständige Segment des Verlängerungsproduktes bindet, andererseits das 3'-ständige Segment des Verlängerungsproduktes nicht bindet.
Die Gesamtlänge des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotids beträgt von 2 bis 100, vorzugsweise von 6 bis 60, besonders bevorzugt von 10 bis 40 Nukleotide oder ihrer Äquivalente. Das Controller-Oligonukleotid kann mit dem Segment des Verlängerungsproduktes über diese Länge komplementäre Bindung eingehen und damit dieses 5'-ständige Segment des Verlängerungsprodukts aus der Bindung mit seinem komplementären Matrizen-Strang verdrängen.
Die Länge des 3'-ständigen Segments des Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, umfasst beispielsweise Bereiche zwischen 5 und 200, besser zwischen 5 und 100, noch besser 5 und 60 Nukleotide, vorzugsweise zwischen 10 und 40, bevorzugt zwischen 15 und 30 Nukleotide.
Dieses 3'-ständige Segment des Verlängerungsprodukts wird nicht vom Controller-Oligonukletid aus der Bindung mit dem Matrizenstrang verdrängt. Auch bei vollständig gebundenem dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids an sein komplementäres Segment des Verlängerungsproduktes kann das erste Primer-Verlängerungsprodukt via sein 3'-ständiges Segment mit dem Matrizenstrang gebunden bleiben. Die Bindungsstärke dieses Komplexes ist vorzugsweise so gewählt, dass er unter Reaktionsbedinungen (Schritt e)) beispielsweise spontan dissoziieren kann. Dies kann bespielsweise dadurch erreicht werden, dass die Schmelztemperatur dieses Komplexes aus dem 3'-ständigen Segment des Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotid und seinem Matrizenstrang etwa im Bereich der Reaktionstemperatur liegt oder unterhalb der Reaktionstemperatur bei einem entsprechenden Reaktionsschritt (Reaktionsschritt e). Bei geringer Stabilität dieses Komplexes im 3'-Segment des Verlängerungsprodutkes führt eine vollständige Bindung des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotid an das 5'-ständige Segment des Verlängerungsproduktes zu einer schnellen Dissoziation der ersten Primer-Verlängerungsprodukts von seinem Matrizenstrang.
Das Controller-Oligonukleotid hat insgesamt eine passende Struktur, um seine Funktion auszuführen: unter entsprechenden Reaktionsbedinungen ist es in der Lage, das verlängerte erste Primer-Oligonukleotid aus der Bindung mit dem Matrizenstrang sequenzspezifisch zu verdrängen, wodurch der Matrizenstrang in einzelsträngige Form überführt wird und somit für weitere Bindungen mit einem neuen ersten Primer-Oligonukleotid und deren zielsequenzspezifische Verlängerung durch Polymerase zur Verfügung steht.
Um die Funktion der Strangverdrängung zu erfüllen, sollten Bereiche ein, zwei und drei des Controller-Oligonukleotids vorwiegend in einzelsträngiger Form unter Reaktionsbedingungen vorliegen. Daher sollten doppelsträngige selbstkomplementäre Strukturen (z.B. Hairpins) in diesen Bereichen nach Möglichkeit vermieden werden, da sie Funktionalität des Controller-Oligonukleotides herabsetzen können.
Das Controller-Oligonukleotid soll im erfindungsgemäßen Verfahren nicht als Matrize auftreten, daher soll das erste Primer-Oligonukleotid, wenn angelagert an das Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen, nicht von Polymerase verlängert werden.
Dies wird vorzugsweise durch Verwendung von Nukleotid-Modifikationen erreicht, welche die Polymerase am Kopieren des Stranges hindern. Vorzugsweise bleibt das 3'-Ende des ersten Primer-Oligonukleotid nicht verlängert, wenn das erste Primer-Oligonukleotid an das Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen bindet.
Das Ausmaß der Blockade/Hinderung/Verlangsamung/Erschwerung der Reaktion kann zwischen vollständiger Ausprägung dieser Eigenschaft (z.B. 100 % Blockade unter gegebenen Reaktionsbedingungen) und einer partiellen Ausprägung dieser Eigenschaft liegen (z.B. 30-90 % Blockade unter gegebenen Reaktionsbedingungen). Bevorzugt werden Nukleotid-Modifikationen, welche einzeln oder in einer Reihe aneinander gekoppelt (z.B. als Sequenzfragment bestehend aus modifizierten Nukleotiden)mehr als 70 %, bevorzugt mehr als 90 %, bevorzugter mehr als 95 %, und besonders bevorzugt 100 % die Verlängerung eines ersten Primers verhindern können.
Die Nukleotid-Modifikationen können Basen-Modifikationen und/oder Zucker-Phosphat-Rest Modifikationen umfassen. Die Zucker-Phosphat-Modifikationen sind bevorzugt, da durch Kombination mit konventionellen Nukleobasen eine beliebige komplementäre Sequenz eines Controller-Oligonukleotides zusammengestellt werden kann. Die Nukleotide mit Modifikationen im Zucker-Phosphat-Rest, welche zu Hinderung bzw. Blockade der Synthese der Polymerase führen können, schließen beispielsweise ein: 2'-O-Alkyl-Modifikationen (z.B. 2'-O-Methyl, 2'-O-(2-Methoxyethyl), 2'-O-Propyl, 2'-O-Propargyl Nukleotid-Modifikationen), 2'-Amino-2'-Deoxy-Nukleotid-Modifikationen, 2'-Amino-Alkyl-2'-Deoxy-Nukleotid-Modifikationen, PNA, Morpholino-Modifikationen usw.
Die Blockade kann sowohl durch eine einzelne Nukleotid-Modifikation erfolgen oder erst durch Kopplung von mehreren Nukleotid-Modifikationen in Reihe erfolgen (z.B. als Sequenzfragment bestehend aus modifizierten Nukleotiden). Beispielsweise können mindestens 2, vorzugsweise mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 solcher Nukleotid-Modifikationen nebeneinander im Controller-Oligonukleotid gekoppelt sein.
Ein Controller-Oligonukleotid kann eine einheitliche Art von Nukleotid-Modifikationen aufweisen oder auch mindestens zwei verschiedene Arten der Nukleotid-Modifizierung umfassen.
Die Position solcher Nukleotid-Modifikationen im Controller-Oligonukleotid soll vorzugsweise die Polymerase daran hindern, das 3'-Ende eines am Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer-Oligonukleotids zu verlängern.
In einer Ausführungsform sind solche Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotids lokalisiert. In einer weiteren Ausführungsform sind solche Nukleotid-Modifikationen im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids lokalisiert. In einer weiteren Ausführungsform sind solche Nukleotid-Modifikationen im zweiten und im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids lokalisiert.
Beispielsweise besteht der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotids zu mindestens 20 % seiner Positionen aus solchen Nukleotid-Modifikationen, vorzugsweise zu mindestens 50 %.
Beispielsweise besteht der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids zu mindestens 20 % seiner Positionen aus solchen Nukleotid-Modifikationen, vorzugsweise zu mindestens 50 %, besonders bevorzugt zu mindestens 90%. In einer Ausführungsform umfasst der gesamte dritte Bereich Nukleotid-Modifikationen, welche eine Polymerase daran hindern, einen an einen solchen Bereichen gebundenen Primer unter Verwendung des Controller-Oligonukleotides als Matrize zu verlängern. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der gesamte dritte und zweite Bereich solche Nukleotid-Modifikationen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der gesamte erste, zweite und dritte Bereich solche Nukleotid-Modifikationen. Somit kann das Controller-Oligonukleotid vollständig aus solchen Nukleotid-Modifikationen bestehen. Solch modifizierten Controller-Oligonukleotide können beispielsweise bei Multiplex-Analysen verwendet werden, bei welchen weitere Primer verwendet werden. Dadurch soll verhindert werden, dass es zu unbeabsichtigten Primer-Verlängerungs-Reaktionen an einem oder mehreren Controller-Oligonukleotiden kommt.
Die Sequenz der Nukleobasen von diesen Nukleotid-Modifikationen ist den Anforderungen an die Sequenz im jeweiligen Bereich angepasst.
Den restlichen Anteil können beispielsweise natürliche Nukleotide ausmachen, oder Nukleotid-Modifikationen, welche die Polymerasen-Funktion gar nicht oder nur unwesentlich hindern z.B. DNA-Nukleotide, PTO-Nukleotide, LNA-Nukleotide, RNA-Nukleotide. Dabei können weitere Modifikationen, beispielsweise Basenmodifikationen wie 2-Amino-Adenosin, 2-Aminopurine, 5-Methyl-Cytosine, Inosine, 5-Nitroindole, 7-Deaza-Adenosin, 7-Deaza-Guanosin, 5-Propyl-Cytosin, 5-Propyl-Uridin oder Nicht-Nukleotid-Modifikationen wie Farbstoffe, oder MGB-Modifikationen etc. z.B. zur Anpassung von Bindungsstärken von einzelnen Bereichen der Controller-Oligonukleotide verwendet werden. Die einzelnen Nukleotid-Monomere können via konventionelle 5'-3'-Bindung untereinander gekoppelt werden oder auch abweichend via 5'-2'-Bindung.
Ein Segment des Controller-Oligonikleotids mit Nukleotid-Modifikationen, welche Verlängerung von 3'-Ende eines an Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer-Oligonukleotids durch Polymerase verhindern, wird als „zweite Blockierungs-Einheit“ bezeichnet. Die Länge dieses Segments kann zwischen 1 bis 50 Nukletid-Modifikationen einschließen, vorzugsweise zwischen 4 und 30. Dieses Segment kann beispielsweise dermaßen im Controller-Oligonukleotid lokalisiert sein, dass das 3'-Ende des gebundenen ersten Primer-Oligonukleotids in diesem Segment liegt. Somit kann dieses Segment die Bereiche zwei und drei überspannen. Bei Verwendung weiterer Primer (z.B. Kompetitor-Primer), welche ebenfalls an das Controller-Oligonukleotid komplementär binden können, können weitere Blockierungs-Einheiten eingeführt werden, beispielsweise eine vierte Blockierungs-Einheit, welche an der gleichen Position im Controller-Oligonukleotid liegen kann wie die zweite Blockierungs-Einheit oder eine abweichende Position umfasst. Beispielsweise kann die vierte Blockierungs-Einheit in 5'-Richtung von der zweiten Blockierungs-Einheit liegen. Die Primer-Blockade durch eine solche vierte Blockierungs-Einheit erfolgt nach dem gleichen Prinzip wie bei der zweiten Blockierungs-Einheit: ein Primer, welcher zwar in der Lage ist, an das Controller-Oligonukleotid komplementär zu binden, wird von Polymerase nicht verlängert. Somit wird verhindert, dass Controller-Oligonukleotid für weitere Primer, z.B. einen Kompetitor-Primer, als Matrize dient.
Ein Segment des Controller-Oligonikleotids mit Nukleotid-Modifikationen, welche Verlängerung von 3'-Ende eines an Controller-Oligonukleotid gebundenen weiteren Primer-Oligonukleotids (z.B. eines Kompetitor-Primer-Oligonukleotides) durch Polymerase verhindern, wird als „vierte Blockierungs-Einheit“ bezeichnet. Die Zusammensetzung einer solchen „vierten Blockierungs-Einheit“ kann analog zu der „zweiten Blockierungseinheit“ ausgeführt werden.
In einer Ausführungsform werden vorzugsweise keine Linker-Strukturen oder Spacer-Strukturen, wie C3, C6, HEG-Linker zur Verhinderung der Verlängerung des 3'-Ende eines an das Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer-Oligonukleotids verwendet.
Das Controller-Oligonukleotid kann außer Bereichen eins, zwei und drei noch weitere Sequenzsegmente umfassen, welche beispielsweise im 5'-Segment oder 3'-Segment des Controller-Oligonukleotid die oben genannten Bereiche flankieren. Solche Sequenzelemente können beispielsweise für weitere Funktionen verwendet werden, wie beispielsweise Interaktion mit Sonden, Bindung an feste Phase etc. Solche Bereiche stören vorzugsweise die Funktion der Bereiche eins bis drei nicht. Die Länge dieser flankierenden Sequenzen kann beispielsweise zwischen 1 bis 50 Nukleotide betragen. Weiterhin kann ein Controller-Oligonukleotid mindestes ein Element zu Immobilisierung an einer festen Phase umfassen, z.B. ein Biotin-Rest. Weiterhin kann ein Controller-Oligonukleotid mindestes ein Element zu Detektion umfassen, z.B. ein Fluoreszenz-Farbstoff.
In Anwesenheit von einem Controller-Oligonukleotid werden neusynthetisierte Sequenzen auf ihre Sequenz-Inhalte durch Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid überprüft.

• Bei korrekter Übereinstimmung mit vorgegebenen Sequenzinhalten des Controller-Oligonukleotides erfolgt eine Strangverdrängung, wobei die Matrizen-Stränge von neusynthetisierten Strängen abgelöst werden. Dabei werden Primer-Bindungsstellen in einzelsträngigen Zustand überführt und stehen für neue Interaktion mit Primern und somit für eine weitere Synthese zur Verfügung. Somit wird das System aus beiden Primer-Verlängerungsprodukten in einen aktiven Zustand versetzt. Das Controller-Oligonukleotid hat somit eine aktivierende Wirkung auf das System.
• Bei fehlender Übereinstimmung mit vorgegebenen Sequenzinhalten des Controller-Oligonukleotides wird Strangverdrängung der Matrizen-Stränge von neusynthetisierten Strängen beieinflusst. Die Strangverdrängung und /oder Ablösung wird entweder quantitativ verlangsamt oder komplett aufgehoben. Es kommt somit gar nicht oder seltener zu Überführung von Primer-Bindungsstellen in einzelsträngigen Zustand. Somit stehen für neue Interaktion mit Primern gar keine oder quantitativ gesehen wenige Primer-Bindungsstellen zur Verfügung. Somit wird das System aus beiden Primer-Verlängerungsprodukten seltener in einen aktiven Zustand versetzt bzw. aktiver Zustand wird gar nicht erreicht.

Die Effizienz der Doppelstrang-Öffnung der neusynthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte nach jedem einzelnen Synthese-Schritt wirkt sich auf die potenziell erreichbare Ausbeuten in darauf folgenden Zyklen aus: je weniger freier/einzelsträngiger Primer-Bindungsstellen einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette zu Beginn eines Synthese-Schrittes zu Verfügung gestellt werden, um so geringer ist die Anzahl von neusynthetisierten Stränge der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette in diesem Schritt. Anders ausgedrückt: Die Ausbeute eines Synthese-Zyklus ist proportional der Menge von Primer-Bindungsstellen, welche für Interaktion mit entsprechenden komplementären Primern zur Verfügung stehen. Insgesamt kann dadurch ein Regelungs-Kreis realisiert werden.
Dieser Regelungs-Kreis entspricht einer Echtzeit-Kontrolle (real-time / on-line control) von synthetisierten Fragmenten: Sequenz-Kontrolle erfolgt im Reaktionsansatz während Amplifikation stattfindet. Diese Sequenzkontrolle erfolgt nach einem vorgegebenen Muster und das Oligonukleotid-System (durch Strang-Öffnende Wirkung von Controller-Oligonukleotid) kann ohne äußere Einmischung zwischen „korrekten“ und „nicht-korrekten“ Zuständen entscheiden. Im korrekten Zustand wird die Synthese von Sequenzen fortgesetzt, im nicht-korrekten Zustand wird die Synthese entweder verlangsamt oder vollständig verhindert. Die resultierenden Unterschiede in Ausbeuten an „korrekten“ und „nicht-Korrekten“ Sequenzen nach jedem Schritt wirken sich auf die gesamte Amplifikation aus, welche eine Vielzahl solcher Schritte umfasst.
Bei einer exponentiellen Amplifikation ist diese Abhängigkeit exponentiell, so dass sogar geringfügige Unterschiede in der Effizienz im Rahmen eines einzelnen Synthese-Zyklus aufgrund Sequenzunterschiede eine signifikante zeitliche Verzögerung der Gesamtamplifikation bedeuten können, bzw. das vollständige Ausbleiben einer detektierbaren Amplifikation in einem vorgegebenen Zeitrahmen bewirken.
Dieser Effekt der Echtzeit-Kontrolle der neusynthetisierten Nukleinsäureketten ist verbunden mit dem Einsatz des Controller-Oligonukleotides und der Einfluss von Controller-Oligonukleotid im Rahmen einer Amplifikation geht somit über die Länge von Primer-Oligonukleotide deutlich hinaus.
Sequenz- Varianten-spezifische Controller-Oligonukleotide:
Zielsequenz-spezifisches Controller-Oligonukleotid wird vorzugsweise dermassen in seinen Bereichen konstruiert, dass es in der Lage ist, bei Amplifikation von zumindest einer vordefinierten Sequenz-Variante einer Zielsequenz mitzuwirken.
In einer bevorzugten Form wird ein Amplifikations-System umfassend mindestens ein Controller-Oligonukleotid dermassen gestaltet, dass die zu erwartende Position einer Allel-Variante einer Zielsequenz einem korrespondierendes Segment bzw. einer korrespondierende Position im Controller-Oligonukleotid entspricht.
Allel-spezifisches Controller-Oligonukleotid wird vorzugsweise dermassen konstruiert, dass es in der Lage ist, die Amplifikation einer Sequenz-Varianten einer Zielsequenz (z.B. Allel 1) bevorzugt zu bewirken, wobei bei einer anderen Sequenz-Variante dergleichen Zielsequenz (z.B. Allel 2) verläuft Amplifikation gar nicht bzw. nur mit verminderter Effizient bzw. findet in der vorgegebener Zeit gar nicht statt, bzw. resultiert in einer nicht für eine Detektion hinreichender Ausbeute an Amplifikationsprodukten.
Ein Allel-spezifisches Controller-Oligonukleotid wird somit nicht nur Zielsequenzspezifisch, sonder auch allel-spezifisch bereitgestellt. Ein solches Controller-Oligonukleotid umfasst somit Zielsequenzspezifische Sequenz-Segmente als auch allel-spezifische Sequenzsegmente. Je nach Komplexität eines polymorphen Lokus einer Zielsequenz können somit mehrere, für jeweilige allel-Variante einer Zielsequenz spezifische Controller-Oligonukleotide konstruiert werden.
Vorzugsweise umfasst ein Controller-Oligonukleotid mindestens ein Sequenzsegment, welches zu einer spezifischen Allel-Variante einer Zielsequenz komplementäre Sequenzzusammensetzung aufweist. Weiterhin umfasst ein Controller-Oligonukleotid vorzugsweise mindestens ein Sequenzsegment, welches für alle Sequenzvarianten einer Zielsequenz einheitliche komplementäre Sequenz umfasst. In einer Ausführungsform umfasst ein Controller-Oligonukleotid, welches mindestens ein Sequenzsegment umfasst, welches komplementär an eine Variante eines polymorphen Lokus einer Zielsequenz komplementär binden kann.
In einer Ausführungsform werden mehrere Controller-Oligonukleotide bereitgestellt, welche jeweils allel-spezifische Sequenzsegmente umfassen.
Die Länge eines zum polymorphen Lokus einer Start-Nukleinsäureke vollständig komplementären Sequenzsegmentes eines Controller-Oligonukleotide kann Bereiche von einem Nukleotid bis zu 100 Nukleotiden, besser von einem Nukleotid bis zu 50 Nukleotiden, bevorzugt von einem Nukleotid bis zu 20 Nukleotiden umfassen. Die Länge von mindestens einem Sequenzsegment eines Controller-Oligonukleotides, welches zu einheitlichen Sequenzsegmenten einer Zielsequenz (erstes und zweite einheitliches Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäure) komplementär ist, kann folgende Bereiche umfassen: von 4 bis 100 Nukleotide, besser von 6 bis 100 Nukleotide, bevorzugt von 8 bis 50 Nukleotide.
In einer Ausführungsform wird ein Sequenzsegment eines Controller-Oligonukleotide, welches zu mindestens einer Variante eines polymophen Lokus einer Zielsequenz komplementär ist, im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides lokalisiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Sequenzsegment eines Controller-Oligonukleotide, welches zu mindestens einer Variante eines polymophen Lokus einer Zielsequenz komplementär ist, im zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotides lokalisiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Sequenzsegment eines Controller-Oligonukleotide, welches zu mindestens einer Variante eines polymophen Lokus einer Zielsequenz komplementär ist, teilweise und / oder vollständig im zweiten und im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides lokalisiert.
Die Position von Allel-spezifischen Sequenzsegmenten eines Controller-Oligonukleotides kann somit in drei Gruppen aufgeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst allel-Spezifische Sequenzsegmente, welche sowohl im ersten Primer-Oligonukleotid als auch im Controller-Oligonukleotid erfasst werden. Diese Position umfasst somit zumindest partiell den zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotides und den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides.
Die zweite Gruppe umfasst allel-spezifische korrespondierende Sequenzsegmente, welche nur vom Controller-Oligonukleotid abgedecket sind, beide Primer (der erste Primer und der zweite Primer) sind lediglich zielsequenzspezifisch, aber nicht allel-spezifisch. Die Position umfasst somit zumindest zum Teil den dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides, welches mit dem 5'-Segment des von Polymerase synthetisierten Anteils des ersten Primer-Verlängerungspdoruktes komplementär binden soll.
Die dritte Gruppe umfasst allel-Spezifische Sequenzsegmente, welche sowohl im zweiten Primer-Oligonukleotid als auch im Controller-Oligonukleotid erfasst werden. Diese Position umfasst somit zumindest partiell den dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides vorwiegend im 5'-Segment des Controller-Oligonukleotides.
Diskriminierung zwischen Allel-Varianten einer Zielsequenz umfasst in diesen Gruppen unterschiedliche Mechanismen, welche beispielsweise bei der Wahl von Reaktionsbedinungen zu berücksichtigen sind.
Bei der ersten und der dritten Gruppe spielen Primer eine wesentliche Rolle bei der Diskriminierung. Die komplementäre Primer-Bindung an eine entsprechende Primer-Bindungsstelle einer Allel-Variante der Zielsequenz und Initiierung einer Synthese eines Primer-Verlängerungsprodutes durch die Polymerase bestimmen das Ausmass der unterschiedlichen Amplifikation. Das Controller-Oligonukleotid interagiert lediglich mit dem ersten Primer (erste Gruppe) und mit dem komplementären Sequenzsegment zum 3'-Segment des zweiten Primers (dritte Gruppe). Die erfolgreiche Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid hängt somit in erster Linie vom entsprechenden komplementären Design dieser Anteile von Primern und des Controller-Oligonukleotide ab. Der synthetisierte Segment-Anteil des jeweiligen Primer-Verlängerungsproduktes, welches zwischen beiden Primern liegt repräsentiert eine einheitliche Sequenzzusammensetzung für eine Allel-Varianten einer gemeinsamen Zielsequenz. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, die Amplifikation bei stringenten Hybridisierungs-Bedinungen auszuführen, welche eine allel-spezifische Initiierung einer Synthese unterstützen. Eine Verwendung eines weiteren allel-spezifischen Kompetitor-Pimers kann eine spezifische Initiierung der Synthese weiter verbessern.
Bei der zweiten Gruppe spielt Initiierung der Synthese von Primer-Verlängerungsprodukten eine eher sekundäre Rolle, da verwendete Primer an Primer-Bindungsstellen binden, welche eine einheitliche Zusammensetzung für alle potenziellen Allel-Varianten einer Zielsequenz darstellen. Die Diskriminierung erfolgt lediglich unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotides, welches durch sequenzspezifsiche bzw. vorwiegend spezifische Strangverdrängung bei der Trennung des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes mitwirkt.
In einer Ausführungsform wird bevorzugt eine voll-komplementäre Sequenz des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotides verwendet, welche einen perfekt-match mit mindestens einer Allel-Variante der Zielsequenz bilden kann. Amplifikation von verschiedenen Allel-Varianten erfordert somit bei dieser Ausführungsform eine Kombination aus je einem allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid.
In der Regel führt eine Abweichung von voll-komplementären Sequenzzusammensetzungen zu abweichenden Amplifikatons-Effizienzen. Am korrespondierenden Sequenz-Segmenten eines Controller-Oligonukleotides erfolgt eine Konkurrenz um die Bindung an das erste Primer-Verlängerungsprodukt (bestehend vorwiegend aus DNA) mit dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (umfasst ebenfalls DNA). Allel-spezifische Sequenz-Gestalung dieses zu einer Allel-Variante korrekpondierenden Sequenzsegmentes des Controller-Oligonukleotides ermöglicht für beide konkurrierende Stränge eine perfekt-match / perfektmach Bindung an das erste Primer-Verlängerungsprodukt. Damit ist ein Controller-Oligonukleotid in der Lage, mit seinem korrespondierenden Sequenz-Segment das zweite Primer-Verlängerungsprodukt aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt zu erfolgreich verdrängen. Die Trennung von beiden Primer-Verlängerungsprodukten ermöglicht eine exponentielle Amplifikation.
Bei einer Abweichung in der Zusammensetzung des korrepondierenden Segmentes des Controller-Oligonukleotides (z.B. bei einer Bindung an eine nicht-komplementäre Allel-Variante eines Primer-Verlängerungsprodukte) ändert sich die Situation in der Regel. Die Interaktion zwischen perfekt-match des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (bestehend aus DNA) und des ersten Primer-Verlängerungsproduktes (bestehend aus DNA) kann nur schlecht oder auch gar nicht durch ein mismatch umfassendes Segment eines Controller-Oligonukleotides überwunden werden. Durch preferrierte Bindung eines perfekt-match Doppelstranges zwischen beiden Primer-Verlängerungsprodukten erfolgt somit keine hinreichende Strangtrennung unter Mitwirkung eines mismatch-Controller-Oligonukleotides, was in der Regel zu einer unzureichenden bzw. eine verlangsamten Amplifikation führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das zu einer Allel-Variante korrespondierende Sequenz-Segment im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides, welches vorwiegend oder ausschließlich DNA-Monomeren umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform liegt das zu einer Allel-Variante korrespondierende Sequenz-Segment im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides, welches sowohl DNA als auch DNA-Modifikationen umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform liegt das zu einer Allel-Variante korrespondierende Sequenz-Segment im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides, welches vorwiegend oder ausschließlich DNA-Modifikationen umfassen. Beispielsweise bei Lokalisation eines zu einer Allel-Variante korrekspondierenden Sequenzsegmentes innerhalb einer zweiten Blockierungs-Einheit, welche mehrere 2'-O-Alkyl-Modifikation von Nukleotiden umfasst, können solche Modifikationen einen Einfluss auf Bindung des Controller-Oligonukleotide an allel-spezifischen Variaten von Primer-Verlängerungsprodukten ausüben.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das zu einer Allel-variante korrekspondierende Segment eines Controller-Oligonukleotides im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides, wobei dieses Segment des Stranges des Controller-Oligonukleotides vorwiegend aus DNA-Nukleotiden zusammengesetzt ist. Vorzugsweise liegt dieses Segment in 5'-Richtung von der zweiten Blockierungs-Einheit. Die Länge dieses zum polymorphen Lokus korrespondierenden Segmentes umfasst vorzugsweise 1 bis 20 Nukleotide. Die Zusammensetzung der Nukleotide in diesem vollkomplementären korrespondierenden Segment des Controller-Oligonukleotides umfasst dabei mindestens 70% DNA Nukleotide, besser 80%, bevorzugt mehr als 95% DNA-Nukleotide.
Bevorzugt liegt auch bei einer Allel-Variante, welche nur eine Nukleobase umfasst (z.B. SNP oder eine Punkt-Mutation), die korrespondierende Position im Mittleren Bereich des Controller-Oligonukleotid-Stranges, welche auf beiden Seiten zu dieser korrespondiernden Position von zu Zielsequenz komplementären DNA-Monomeren umgeben ist, wobei der Strang des Controller-Oligonukleotides mindestens 4 DNA-Monomere, besser mindestens 6 DNA-Nukleotide,bevorzugt mindestens 10 in beide Richtungen von der zu erwartenden SNP bzw. Punkt-Mutation umfasst. Solche Anordnung von DNA-Monomeren um eine zu erwartende SNP-Stelle bzw. Punkt-Mutation bzw. Einzelnukleotid-Allel-Variante ermöglicht Aufrechterhaltung einer Einzelstrang-Konformation, welche für B-Form charakteristisch ist (sogenannte single strand persistence length). Damit erfolgt eine Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid unter Verwendung eines korrespondierenden Segmentes, welches DNA-Monomere umfasst.
In einer Ausführungsform wird ein Controller-Oligonukleotid verwendet, welches mit seinem 5'-Ende eine komplementäre Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt eingehen kann. Bei Alle-Varianten, welche nur eine Nukleobase umfassen, z.B. SNP oder Punktmutationen, wird das korrespondierende Sequenzsegment bevorzugt in einem Abstand vom 5'-Ende des Controller-Oligonukleotides angeordnet, welcher Längen von 10 bis 60 Nukleotide, besser 20 bis 50 Nukleotide, bevozugt 30 bis 40 Nukleotide umfasst.
Verwendung von DNA-Nukleotiden als Monomeren von Controller-Oligonukleotiden darf allerdings nicht dazu führen, dass Controller-Oligonukleotid als Matrize für eine Primer-Verlängerung unter Verwendung eines der eingesetzten Primers durch eine verwendete Polymerase genutzt wird.
Verwendung von DNA-Nukleotiden (beispielsweie A, C, T oder G) innerhalb des zu einer Allel-Variante korrespondierenden Segments im Controller-Oligonukleotid-Strang bringt dadurch einige Vorteile, dass Diskriminierungsverhalten eines Amplifikations-Systems leichter abzuschätzen ist.
Beispielsweise kann Verhalten von perfekt-match Varianten eines Controller-Oligonukleotides zu bestimmten Allel-Varianten bei Punkt-Mutationen leicher abzuschätzen sein. Dabei folgt die Diskriminierung zwischen Allel-Varianten weit anerkannten Regeln von Watson-Crick-Basenpaarung: Controller-Oligonukleotide welche komplementäre Basenpaare (A:T, G:C) mit den ersten Primer-Verlängerungsprodukten ausbilden können, führen in der Regel zu Amplifikationsreaktionen in guten Ausbeuten.
Potenzielle Mismatches zwischen einem allel-spezifischen Controller-Oligonukleotid und einem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (z.B. A:C oder G:G) führen hingegen zu einer unzureichenden oder verzögerten Amplifikation. Beim Vorliegen von Allel-Varianten, welche in einerm potenziellen ersten Primer-Verlängerungsprodukt mehr als ein Nukleotid-Unterschied zum Controller-Oligonukleotid ausmachen können (z.B. kurze InDels) wird in der Regel keine hinreichende Amplifikation erreicht.
Die Auswirkung eines Mismatches auf eine Amplifikation kann abgeschätzt werden, indem man Stablitäten von potenziellen Duplexen umfassend ein allel-spezifisches Controller-Olgonukleotid mit einer definierten Sequenz und einen potenziellen Primer-Verlängerungsprodukt oder seinen Anteilen, z.B. nur den synthetisierten Anteil eines Primer-Verlängerungsproduktes. Die Duplexe werden in Abwesenheit von zweiten Primer-Verlängerungsprodukten gebildet. Bei Hybridisierung eines allel-spezifischen Controller-Oligonukleotides an ein potenzielles Primer-Verlängerungsprodukt mit vollständiger Komplementarität (perfekt-match) ist die Bindung solcher Duplexe stabiler als die Bindung von Duplexen, welche mindsten eine Mismatch-Positionen umfasst. Diese Stabilität kann mittels Schmelztemperatur-Messung erfasst werden. Unterschiede in zwischen Amplifiktionsreaktion von Allel-Varianten sind n der Regel um so größer, je größer die Differenz in der Stabiliät zwischen einer perfekt-match Duplex und einer mismatch Duplex umfassend ein allel-spezifisches Controller-Oligonukleotid und ein potenzielles erstes Primer-Verlängerungsprodukt. Solche Unterschiede zwischen Reaktionen können beispielsweise durch die für eine Reaktion erforderliche Zeit bis zum erreichen einer gewissen Menge an Produkten gemessen werden. Solche Unterschiede in Zeit zwischen Amplifikations-Reaktionen von perfekt-match und mismatch Allel-Varianten können auch als Fähigkeit zur Diskriminierung aufgefasst werden: je größer die Zeitdifferenz, um so höher die Diskriminierung zwischen einzelnen Allel-Varianten.
Aufgrund der Verwendung von Modifikationen im Controller-Oligonukleotid, z.B. im Bereich der zweiten Blockierungseinheit zur Verhinderung der Verlängerung des ersten Primers oder eines Kompetitor-Primers, kann eine abweichende Diskriminierung bzw. sogar Toleranz zu bestimmten Mismatches erfolgen. Dabei können beispielsweise 2'-O-Alkyl-Modifikationen innerhalb der zweiten Blockierungs-Einheit verwendet werden. Solche Nukleotid-Modifikationen können Konformation eines Doppelstranges verändern (von B-Form einer DNA:DNA-Duplex auf A-like-Form eines DNA:RNA oder DNA:mod. DNA-Duplex). Dabei kann es vor allem in der Basenpaarung zwischen G:C und G:U bzw. G:T eine Änderung der Diskriminierung erfolgen.
Beispielsweise Verwendung von Modfikationen im Controller-Oligonukleotid führt zu Änderung im Diskriminierungs-Verhalten bei einzelnen Basen-Paaren. Ein ähnliches Verhalten ist aus der Erforschung von RNA bekannt: so ändert sich das Verhalten der G:U je nach Strang-Form: bei RNA bildet G:U Basenpaar in der Regel eine hinreichend stabile Basenpaarung, Bei DNA führt ein G:T-Mismatch in der Regel zu einer Abschwächung der Bindung von beiden Strängen.
Die dieser Anmeldung werden beispielsweise 2'-Alkyl-Nukleotid umfassende Modifikationen im Controller-Oligonukleotid verwendet (z.B. innerhalb der zweiten Blockierungs-Einheit). Dabei wird ein 2'-O-Me Cytosine (C*) oder 2'-O-Me Adenosine (A*) verwendet. Solche modifizierte Nukleotide ermöglichen eine gute Diskriminierung zwischen einzelnen Sequenzvarianten (wobei perfekt match Bindung C*:dG und A*:U oder A*:T umfasst und Mismatch z.B. C*:dA oder A*:dC umfassen).
Hingegen Verwendung von 2'-O-Me-G (G*) oder 2'-O-Me-U (U*) zu abweichenden Ergebnissen führt. Beispielsweise eine Amplifikation unter Verwendung von Controller-Oligonukleotides mit einem G* an der korrespondierenden Stelle im Strang führt zu gleichzeitigen Amplifikation von Allel-Varianten mit dC und dU an korrespondierenden Stellen im ersten Primer-Verlängerungsprodukt.
Somit läßt sich nicht nur eine allel-diskriminierende, sonder auch eine allel-tolerante Funktion eines Controller-Oligonukleotides darstellen.
Bei Verwendung von Nukleotid-Modifikationen, welche eine unzureichende Diskriminierung von Allel-Varianten zulassen, können somit mehrere Allel-Varianten gleichzeitig amplifiziert werden. Neben einem 2'-O-Me Guanosine oder 2'-O-Me Uridine gehören auch UniversalBasen, wie Inosine oder 5-Nitro-Indol Monomere zu Kandidaten mit Toleranz zu Allel-Zusammensetzung. Solche Modifikationen eines Controller-Oligonukleotid-Stranges können an zu erwartenden Korrespondierenden Positionen zu bestimmten Allel-Varianten angeordnet werden. Beim Vorliegen eines der Allel-Varianten kann eine Amplifikation, welche mindestens zwei unterschiedliche Alle-Varianten vermehrt.
Somit kann diese fehlende Diskriminierung bei einigen Modifikationen wie folgt berücksichtigt werden:
In einer weiteren Ausführungsform liegt das zu einer Allel-Variante korrespondierende Sequenz-Segment im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides, welches vorwiegend oder ausschließlich 2'-O-Alkyl-Modifikationen umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das zu einer Allel-variante korrekspondierende Segment eines Controller-Oligonukleotides im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotides, wobei dieses Segment des Stranges des Controller-Oligonukleotides vorwiegend aus 2'-O-Alkyl-Modifikationen zusammengesetzt ist. Vorzugsweise liegt dieses Segment innerhalb der zweiten Blockierungs-Einheit oder in 5'-Richtung von der zweiten Blockierungs-Einheit. Die Länge dieses zum polymorphen Lokus korrespondierenden Segmentes umfasst vorzugsweise 1 bis 20 Nukleotide. Die Zusammensetzung der Nukleotide in diesem vollkomplementären korrespondierenden Segment des Controller-Oligonukleotides umfasst dabei mindestens 50% 2'-O-Alkyl-Modifikationen, besser 80%, bevorzugt mehr als 95% 2'-O-Alkyl-Modifikationen.
Bevorzugt liegt auch bei einer Allel-Variante, welche nur eine Nukleobase umfasst (z.B. SNP oder eine Punkt-Mutation), die korrespondierende Position im Mittleren Bereich des Controller-Oligonukleotid-Stranges, welche auf beiden Seiten zu dieser korrespondiernden Position von zu Zielsequenz komplementären 2'-O-Alkyl-Modifikationen umgeben ist, wobei der Strang des Controller-Oligonukleotides mindestens vier 2'-O-Alkyl-Modifikationen, besser mindestens sechs 2'-O-Alkyl-Modifikationen, bevorzugt mindestens 10 2'-O-Alkyl-Modifikationen in beide Richtungen von der zu erwartenden SNP bzw. Punkt-Mutation umfasst. Solche Anordnung von DNA-Monomeren um eine zu erwartende SNP-Stelle bzw. Punkt-Mutation bzw. Einzelnukleotid-Allel-Variante ermöglicht Aufrechterhaltung einer Einzelstrang-Konformation, welche als A-like-Form bezeichnet werden kann. Damit erfolgt eine Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid unter Verwendung eines korrespondierenden Segmentes, welches Nukleotide mit 2'-0-Alkyl-Modifikationen umfasst.
In einer Ausführungsform wird ein Controller-Oligonukleotid verwendet, welches mit seinem 5'-Ende eine komplementäre Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt eingehen kann. Bei Alle-Varianten, welche nur eine Nukleobase umfassen, z.B. SNP oder Punktmutationen, wird das korrespondierende Sequenzsegment bevorzugt in einem Abstand vom 5'-Ende des Controller-Oligonukleotides angeordnet, welcher Längen von 10 bis 60 Nukleotide, besser 20 bis 50 Nukleotide, bevozugt 30 bis 40 Nukleotide umfasst.
Bei Lokalisation eines zu einer Allel-Variante erwartenden Sequenzsegmenten innerhalb eines solchen mehrere 2'-O-Alkyl-Modifikationen umfassenden Segmentes wird eine ggf. abweichende Basenpaarung berücksichtigt. Bei einem Unterschied zwischen Allel-Varianten von nur einem Nukleotid wird folgende Regel angewandt:
Controller-Oligonukleotide umfassend 2'-O-Alkyl-Modifikationen von Cytosine können in der Regel eine hinreichende Basenpaarung mit dG-Nukleotid an korrespondierenden Stellen im ersten Primer-Verlängerungsprodukt ausbilden und somit die Amplifikation solcher Allel-Varianten unterstützen.
Controller-Oligonukleotide umfassend 2'-O-Alkyl-Modifikationen von Adenosine können in der Regel eine hinreichende Basenpaarung mit dT- oder dU-Nukleotid an korrespondierenden Stellen im ersten Primer-Verlängerungsprodukt ausbilden und somit die Amplifikation solcher Allel-Varianten unterstützen.
Controller-Oligonukleotide umfassend 2'-O-Alkyl-Modifikationen von Guanosine können in der Regel eine hinreichende Basenpaarung mit dC- und dU-Nukleotid an korrespondierenden Stellen im ersten Primer-Verlängerungsprodukt ausbilden und somit die Amplifikation beider Allel-Varianten unterstützen.
Controller-Oligonukleotide umfassend 2'-O-Alkyl-Modifikationen von Uridine können in der Regel eine hinreichende Basenpaarung mit dA- und dG-Nukleotid an korrespondierenden Stellen im ersten Primer-Verlängerungsprodukt ausbilden und somit die Amplifikation beider Allel-Varianten unterstützen.
Aufgrund einer Strang-Komplementarität einer doppelsträngigen Zielnukleinsäure, können Strang-Spezifische Amplifikations-Systeme erstellt werden, wobei an korrespondierenden Stellen jeweils entweder 2'-O-Alkyl-Modifikationen von Cytosine oder 2'-O-Alkyl-Modifikationen von Adenosine verwendet wird. Somit kann man fehlende Diskriminierung von G- und U-Nukleotid-Analoga umgehen.
Reaktionsbedingungen bei Strangverdrängungsreaktion
Die Verdrängung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mittels einer sequenzabhänigen Strangverdängung durch das Controller-Oligonukleotid bildet einen Teilschritt in der Amplifikation. Die Reaktionsbedinungen während dieses Schrittes sind entsprechend angepasst. Die Reaktions-Temperatur und die Reaktions-Zeit sind dermassen gewählt, dass die Reaktion erfolgreich stattfinden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform verläuft die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bis zur Ablösung / Dissoziation des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt. Eine solche Dissoziation des 3'-Segment des ersten Primer-Verlängrungsproduktes von komplementären Anteilen des zweiten Primerverlängerungsproduktes kann spontant erfolgen im Rahmen einer temperaturabhängigen / temperatur-bedingten Trennung von beiden Primer-Verlängerungprodukten. Eine solche Dissoziation wirkt sich günstig auf Kinetik der Amplifikationsreaktion und kann durch die Wahl der Reaktionsbedinungen beeinflusst werden, z.B. mittels Temperatur-Bedinungen. Die Temperatur-Bedinungen werden deshalb dermassen gewählt, dass eine erfolgreiche Strangverdrängung durch komplementäre Bindung des Controller-Oligonukleotides eine Dissoziation des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes vom 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes begünstigt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verläuft die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bis zur Ablösung / Dissoziation eines 3'-Segmentes des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1-Ext) oder Matrizenstrang (M1) aus der komplementären Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext), wobei dieses 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1-Ext) bzw. des Matrizenstrangs (M1) zumindest einen komplementeren Bereich zum ersten Primer umfasst und ein komplementäres Segment zum ersten Primerverlängerungsprodukt (P1.1-Ext), welches erst bei der enzymatsichen Synthese entstanden ist. Dabei kommt es zu Ausbildung eines Komplexes (C1.1/ P1.1-Ext / P2.1.-Ext) bzw. (C1.1/ P1.1-Ext / M1), welches sowohl das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext), das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) / bzw. Matrizenstrang (M1) sowie das Controller-Oligonukleotid (C1.1) umfasst. In einem solchen Komplex liegt das 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes zumindest vorübergehend in einer einzelsträngiger Form vor, da es vom Controller-Oligonukleotid aus seiner Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt verdrängt werden kann. Schematisch dargestellt, besteht ein Gleichgewicht zwischen Bindung und Ablösung des P2.1-Ext / bzw. M1 an das P1.1-Ext. Das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1.1-Ext) liegt in einem solchen Komplex komplementär hybridisiert an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) bzw. an einen Matrizenstrang (M1).
Aufgrund einer teilweise offenen Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid (3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsprodukte) kann ein neues Primer-Verlängerungsprodukt (P1.2) an eine dieses einzelsträngigers Sequenzsegment des noch im Komplex liegenden (P2.1-Ext) unter Reaktionsbedinungen binden und somit eine Synthese eines neuen ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1.2-Ext) durch eine Polymerase initiieren. In der Regel verläuft Initiierung dieser Reaktion mit verminderter Effizienz, da 3'-Segment des P2.1-Ext nicht dauerhaft einzelsträngig vorliegt, sondern im kompetetiven Verhalten mit Controller-Oligonukleotid steht und damit abwechselnd einzelsträngige und doppelsträngige Zustände durch Bindung an das P1.1-Ext aufweist.
Fortführung dieser neugestarteten Synthese von P1.2-Ext unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize (P2.1-Ext) kann durch Polymerase-bedingte Strandverdrängung ebenfalls zu Dissoziiereung des Komplexes (C1.1/ P1.1-Ext / P2.1.-Ext) führen. Dabei wirken Controller-Oligonukleotid, temperatur-abhängige doppelstrangdestabilisierung und Strang-Verdrängung durch die Polymerase synnergistisch und komplementär. Es resultiert eine Dissoziation des 3'-Segment des ersten Primer-Verlängrungsproduktes (P1.1-Ext) von komplementären Anteilen des zweiten Primerverlängerungsproduktes (P2.1-Ext).
Eine solche Dissoziation wirkt sich günstig auf Kinetik der Amplifikationsreaktion und kann durch die Wahl der Reaktionsbedinungen beeinflusst werden, z.B. mittels Temperatur-Bedinungen. Das Mitwirken der Polymerase-vermittelten syntheseabhängigen Strangverdrängung an der Dissoziierung von P1.1-Ext und P2.1-Ext hat einen begünstigenden Effekt bei der Strangtrennung.
Die Temperatur in diesem Schritt umfasst beispielsweise Bereiche von 15°C bis 75°C, besser von 30°C bis 70°C, bevorzugt von 50°C bis 70°C.
Bei gegebener Länge des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides und des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides (umfassend beispielsweise Bereiche von 3 bis 25 Nukleotid-Monomere, besser von 5 bis 15 Nukleotid-Monomere) kann eine Strangverdrängungsreaktion im allgemeinen erfolgreich initiiert werden. Bei vollständigen Komplementarität des Controller-Oligonukleotid zu entsprechenden Anteilen des ersten Primer-Verlängerungsproduktes kann das Controller-Oligonukleotid an das erste Primer-Verlängerungsprodukt bis auf das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes binden und das zweite Primer-Verlängerungsprodukt verdrängen. Das zweite Primer-Verlängerungsprodukt verbleibt somit in Verbindung mit dem 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes. Diese Stärke dieser Verbindung kann temperatur-abhängig beeinflusst werden. Beim Erreichen einer kritischen Temperatur kann diese Verbindung zerfallen und beide Primer-Verlängerungsprodukte dissoziieren. Je kürzer die Sequenz des 3'-Segmentes ist, umso instabiler ist diese Verbindung und umso niedriger kann die Temperatur sein, welche eine spontane Dissoziation herbeiführt.
Eine spontane Dissozialtion kann beispielsweise im Temperatur-Bereich erreicht werden, welcher etwa bei der Schmelztemperatur liegt. In einer Ausführungsform liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid etwa bei der Schmelztemperatur (Tm +/- 3°C) des Komplexes umfassend das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht von Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer-Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt.
In einer Ausführungsform liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid etwa bei der Schmelztemperatur (Tm +/- 5°C) des Komplexes umfassend das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht von Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer-Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt.
In einer Ausführungsform liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid über der Schmelztemperatur des Komplexes umfassend das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht von Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer-Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt. Eine solche Temperatur umfasst Temperatur-Bereiche von etwa Tm + 5°C bis Tm+20°C, besser von Tm+5°C bis Tm +10°C. Durch Verwendung einer höheren Temperatur kann das Gleichgewicht in diesem Reaktionsschritt in Richtung Dissoziation verschoben werden. Dadurch kann die Kinetik der Reaktion günstig beeinflusst werden. Verwendung von zu niedrigen Temperaturen im Schritt der Strangverdrängung mittels Controller-Oligonukleotides kann zu einer signifikanten Verlangsamung der Amplifikation führen.
In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'-Segment, welches nicht von Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches Sequenzlängen von 9 bis etwa 18 Nukleotiden umfasst. Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur-Bereichen zwischen 40°C und 65°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'-Segment, welches nicht von Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches Sequenzlängen von 15 bis etwa 25 Nukleotiden umfasst. Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur-Bereichen zwischen 50°C und 70°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'-Segment, welches nicht von Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches Sequenzlängen von 20 bis etwa 40 Nukleotiden umfasst. Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur-Bereichen zwischen 50°C und 75°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
Die Zusammensetzung des 3'-Segmentes des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und ggf. eine Einführung von Schmelztemperatur-beeinflussenden Oligonukleotid-Modifikationen (z.B. MGB) bzw. Reaktionsbedinungen (z.B. TPAC, Betaine) kann die Wahl der Temperatur beeinflussen. Entsprechende Anpassung kann daher vorgenommen werden.
In einer Ausführungsform verlaufen alle Schritte der Amplifikation unter stringenten Bedinungen, welche Ausbildung von unspezifischen Produkten / Nebenprodukten verhindern bzw. verlangsamen. Zu solchen Bedinungen zählen beispielsweise höhere Temperaturen, beispielsweise über 50°C.
In einer Ausführungsform verläufen die Einzelschritte der Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotide bei gleicher Temperatur wie die Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes. In einer weiteren Ausführungsform verläufen die Einzelschritte der Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotide bei Temperatur, welche von der Temperatur der jeweiligen Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes abweicht. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes und Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur.
Die Konzentration des Controller-Oligonukleotides umfasst Bereiche von 0,01 µmol/l bis 50 µmol/l, besser von 0,1 µmol/l bis 20 µmol/l, bevorzugt von 0,1 µmol/l bis 10 µmol/l.
Beispiele
Figurenbeschreibung
In 1 zeigt die Sequenzkomponenten einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung. Primer 1.1 kann mit seinem ersten Bereich (in 3'-Segmenten) an jeweiligen Primerbindungsstelle am Matrizenstrang (M1.1) vorwiegend komplementär binden. Der Polynukleotid-Schwanz (Primer-Überhang) des zweiten Bereichs bindet nicht an Matrizenstrang (M1.1). Controller (1.1.) umfasst einen ersten, zweiten und dritten Bereich.
In 2 ist schematisch die Topographie des vollständigen Primer-Verlängerungsproduktes (P1-Ext.) dargestellt, wobei das Verlängerungsprodukt einem von Primer 1.1 gebildeten Bereich und einen der Polymerase synthetisiertes Segment umfasst.
Die Synthese eines P1-Ext Primer-Verlängerungsproduktes ist in 3 schematisch dargestellt. Der Synthesefortschritt wird hierbei durch ein Block-Oligonukleotid sequenzspezifisch gestoppt. Der Primer / Controller-Komplex ist unter verwendeten Reaktionsbedingungen während der Synthese-Phase stabil. Die Synthese des P1-Ext durch Polymerase geht bis zum Block-Oligonukleotid (B1.1), so dass die Länge des synthetisierten Segments des P1-Ext begrenzt wird.
Die sequenzspezifische Kontrolle der Primerverlängerung wird insbesondere durch die Bindung des Controller-Oligonukleotid vermittelt. Die Controller-Bindung an das Primer-Verlängerungsprodukt während der Controllling-Phase ist schematisch in 4 dargestellt, wobei A) Freisetzung des Controllers aus dem Komplex: Primer-/ Controller; B-C) Bindung des Controllers an zweiten Bereich des Primers am Primer-Verlängerungsprodukt, und D-E) Sequenzspezifische Strangverdrängung durch Controller unter Freisetzung des Matrizenstranges illustriert.
In 5 wird schematisch eine Sonden-Bindung an das Primer-Verlängerungsprodukt nach seiner Freisetzung vom Matrizenstrang dargestellt. Durch die Freisetzung vom Matrizenstrang kann das 3'-Segment des P1-Ext mit einem anderen Oligonukleotid interagieren, z.B. eine Fluoreszenz-Sonde (S1.1), oder anderen Primer oder eine Affinitäts-Sonde. Durch eine Bindung kann es beispielsweise zum Zuwachs eines Fluoreszenzsignals kommen.
Als Sonde kann beispielsweise ein zum 3'-Segment des gebildeten Primer-Verlängerungsproduktes komplementäres Oligonukleotid mit einem Quencher (z.B. BHQ1) und einem Reporter (z.B. FAM) verwendet werden. Als Reporter kann beispielsweise ein molecular beacon mit Self-Quenching Eigenschaften verwendet werden. Das Signal wird erst bei einer komplementären Bindung generiert. Dadurch können beispielsweise vollständige P1-Ext von nicht vollständigen unterschieden werden.
Die Synthese-Phase und die Controlling-Phase kann gleichzeitig stattfinden, wie durch den in 6 dargestellten Reaktionsansatz illustriert. Controller und Primer sowie deren Komplex liegen im Gleichgewicht während der Reaktion vor (6 A)). Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes wird durch Zugabe einer Polymerase initiiert. Bei Primer-Bindung an Primer-Bindungsstelle kann Polymerase die Synthese eines komplementäres Primer-Verlängerungsproduktes starten (6 B)). Die von Polymerase katalysiere Synthese von voll-Komplementären Produkten erfolgt schneller, als die Synthese von Produkten, welche einen Mismatch infolge eines während der Synthese entstandenen Fehlers umfassen. Die Mismatch-Stränge werden langsamer synthetisiert.
In 7 und 8 sind weitere schematische Darstellung eines Reaktionsansatzes mit gleichzeitiger Synthese-Phase und Controlling-Phase gezeigt. n Controller und Primer sowie deren Komplex liegen im Gleichgewicht während der Reaktion vor (7 A), 8 A)). Die frei im Ansatz vorliegenden Controller können während der Synthese-Phase mit den Primer-Verlängerungsprodukten interagieren. Die Interaktion beginnt am zweiten Primer-Bereich eines jeweiligen Primer-Verlängerungsproduktes (7 B), 8 B)). Das Ergebnis der Interaktion der Controller mit den Primer-Verlängerungsprodukten ist je nach SyntheseFortschritt am Primer-Verlängerungsprodukt unterschiedlich: bei vollständig synthetisierten P1-Ext kann es zu einer Ablösung dieses Produktes kommen. Dabei kann ein vollständig synthetisiertes P1-Ext durch sein 3'-Segment mit anderen Oligonukleotiden interagieren, z.B. Sonden, Primern etc. (7 C), 8 C)). Bei unvollständig synthetisierten P1-Ext kommt es ebenfalls zu einer Ablösung dieses Produktes vom Matrizenstrang. Der gebildete Komplex ist unter Reaktionsbedingungen hinreichend stabil, so dass dieses unvollständige Primer-Verlängerungsprodukt von einer Fortsetzung seiner Synthese am Matrizenstrang ausgeschlossen werden kann bzw. wird durch die Komplex-Form mit dem Controller stark an der Fortsetzung der matrizenabhängigen SyntheseReaktion gehindert. Damit kann die Synthese von fehlerhaften Primer-Verlängerungsprodukte bis zu vollen Synthese-Länge verhindert werden. Wegen einer unzureichenden Länge umfassen solche unvollständige P1-Ext beispielsweise nicht erforderlichen Sequenzsegment, um an anderen Reaktionen teilzunehmen. Z.B. hier fehlt ein 3'-Segment im Primer-Verlängerungsprodukt (7 D), 8 D)).
9A bis C zeigen schematisch Topographie eines Matrizenstranges (umfassend eine Zielsequenz) mit einem polymorphen Lokus (N2) und zwei einheitlichen Zielsequenzsegmenten (N1 und N3). Der Matrizenstrang mit der ersten Variante (M 1.1) und Matrizenstrang mit der zweiten Variante (M 1.2) zeigen schematisch Topographie einer Zielsequenz innerhalb von Matrizensträngen. Beide Matrizenstränge umfassen Zielsequenzsegmentene N1 und N3, welche bei beiden Matrizenstränge identisch und einheitlich sind. Das jeweilige Sequenzsegment N2 ist bei jedem Matrizenstrang charakteristisch und spezifisch, so dass beide Matrizenstrange dadurch unterschieden werden können. N2 umfasst mindestens zwei Sequenzvarianten eines polymorphen Lokus einer Zielsequenz.
In dieser Ausführungsform umfasst eine Zielsequenz, welche mehrere Sequenzvarianten in einem polymorphen Lokus (N2) umfassen kann, weiterhin mindestens ein erstes Zielsequenzsegment (N1), welches für alle Zielsequenzvarianten einer Zielsequenz (Zielsequenz-Gruppe umfassend hier M 1.1 und M 1.2) charakteristisch und einheitlich ist. Weiterhin umfasst eine Zielsequenz mindestens ein zweites Zielsequenzsegment (N3), welches für alle Zielsequenzvarianten einer Zielsequenz (Zielsequenz-Gruppe umfassend hier M 1.1 und M 1.2) charakteristisch und einheitlich ist. Solche einheitliche Zielsequenzsegmente sind vorzugsweise auf beiden Seiten eines polymorphen Lokus lokalisiert und flankieren somit einen polymorpehen Lokus (mit Sequenzvarianten) einer Zielsequenz von beiden Seiten. Vorzugsweise unterscheiden sich das erste einheitliche Zielsequenzsegment (N1) in seiner Sequenzzusammensetzung von der Sequenzzusammensetzung des zweiten einheitlichen Zielsequenzsegments (N3) in mindestens einer Nukleotid-Position.
10 (A - C) zeigen schematisch Topographie eines Matrizenstranges mit einem polymorphen Lokus (N2) und zwei einheitlichen Zielsequenzsegmenten (N1 und N3) wie in 9 dargestellt.
10 D zeigt das Ergebnis einer Strangtrennung nach einer Primer-Verlängerung durch zwei jeweils für eine sequenz-Variante charakteristischen und spezifischen Controller-Oligonukleotide (C1.1 und C1.2), wobei jedes dieser Controller-Oligonukleotide einen zum polymorphen Lokus der Zielsequenz (N2) korrespondierendes Sequenzsegment umfasst, wobei C1.1 und C1.2 sich in diesem Sequenzsegment unterscheiden. Daraus folgt eine spezifische und charakteristische Paarbildung einer spezifischen und charakteristischen Sequenz-Variante (einer Allel-Variante) einer spezifischen Zielsequenz und eines für diese Sequenz-Variante charakteristischen und spezifsichen Controller-Oligonukleotides.
Die Abbildung fasst schematisch zusammen, welche Wirkung die Anwesenheit des voll-komplementären Stranges (Matrizenstrang) auf die mögliche Mismatch-Duplex hat: Wegen voll-komplementären Natur des von einer Polymerase synthetisierten Primer-Verlängerungsprodutkes, umfassen beide während der Synthese entstandenen Primer-Verlängerungsprodukte jeweils voll-komplementäre Sequenzen. Bindung von solchen voll-komplementären Sequenzen an einander erfolgt effektiver, als bei Sequenzen, welche ein Mismatch umfassen. Die Strang-Trennung verläuft somit nur über eine kürzere Distanz und ist weniger Effektiv, als bei vollkomplementären Strängen.
11 zeigt schematisch eine andere Topographie eines N2 einer Zielnukleinsäurekette in Bezug auf Controller-Oligonukleotid und den ersten Primer.
Bei diesem Ausführungsbeispiel umfasst das zum N2 korrespondierendes Sequenzsegment des Controller-Oligonukleotides teilweise den dritten Bereich als auch teilweise den zweiten Bereich. Auch das 3'-Segment des ersten Primers wird sequenzspezifsich und charakteristisch für eine spezifische und charakteristische Sequenz-Variante der Zielnukleionsäure gestaltet. An der Allel-Diskriminierung nehmen also sowohl Controller-Oligonukleotid als auch das erste Primer-Oligonukleotid teil. Für jede spezifische Sequenzvariante des polymorphen Lokus kann somit sowohl ein spezifisches Controller-Oligonukleotid als auch ein spezifisches erstes Primer-Oligonukleotid konstruiert werden.
12 zeigt schematisch potenzielle Positionen eines polymorphen Lokus innerhalb einer Zielsequenz (Position 1 bis 6) und ihre korrespondierenden Sequenzsegment-Positionen in einzelnen Komponenten eines Primer-Verlängerungs-Systems. Die hier schematisch dargestellten polymorphen Loki einer Zielsequenz umfassen 2 bis 50 Nukleotide, besser 4 bis 30 Nukleotide welche für eine Allel-Variante einer Zielsequenz charakteristisch und spezifsich sind. Insgesamt kann die Anordnung von einezlenen Amplifikations-Komponenten dermassen gestaltet werden, dass mehrere Varianten / Kombinationen möglich sind:
Anordnung 1 (P1): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den ersten Primer (ersten Bereich) und Controller-Oligonukleotid (zweiten Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden.
Anordnung 2 (P2): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den ersten Primer (ersten Bereich) und Controller-Oligonukleotid (zweiten Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Anordnung P2 unterscheidet sich von P1 vor allem dadurch, dass N2 vorwiegend im 3'-Terminalen Sequenz-Segment des ersten Primers liegt. Dadurch kann ggf. eine bessere Spezifität der Amplifikation erzeicht werden.
Anordnung 3 (P3): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert nur das Controller-Oligonukleotid (dritten Bereich), wobei das korrespondierende Sequenzsegment des Controller-Oligonukleotides im 5'-Segment des synthetisierten Anteils des ersten Primer-Verlängerungsproduktes liegt. Das Controller-Oligonukleotid des Amplifikations-Systems kann somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifsicher erster Primer verwendet, welche aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch sind. Aufgrund der möglichen Nähe der zweiten Blockierungs-Einheit kann Bindung des Controller-Oligonukleotide an das erste Primer-Verlängerungsprodukt durch Nukleotid-Modifikationen der zweiten Blockierungs-Einheit beeinflusst werden.
Anordnung 4 (P4 - P6): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert nur das Controller-Oligonukleotid (dritten Bereich). Das Controller-Oligonukleotid des Amplifikations-Systems kann somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifsicher erster Primer verwendet, welche aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch sind. Dieses Sequenzsegment des Controller-Oligonukleotides liegt in 5'-Richtung von der zweiten Blockierungs-Einheit und kann mehrere DNA-Nukleotid-Monomere umfassen, z.B. von 5 bis 30.
13 - 14 zeigen schematisch Topographie einer Zielnukleinsäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) und zwei einheitlichen Zielsequenzsegmenten (N1 und N3), wobei der polymorphe Lokus nur eine Nukleotid-Position umfasst (z.B. ein SNV oder ein SNP oder eine Punkt-Mutation etc.). Die Unterschiede zwischen einzelnen Sequenzvarianten betragen somit lediglich nur ein Nukleotid (hier als 4.1 und 4.2 bezeichnet). Ein solcher Lokus (N2) kann zu ähnlichen Anordnungen einzelner Komponenten führen wie ein Lokus mit mindestens 2 Nukeotiden. Bei einer Bindung des Controller-Oligonukleotides an ein komplementäres erstes Primer-Verlängerungsprodukt (perfekt-Match) kann somit eine Strangtrennung nach einer Primer-Verlängerung erfolgen. Bei der Ausbildung eines Mismatches wird Strang-Trennung gehemmt oder Verlangsamt bzw. sogar unterbrochen.
15 zeigt schematisch potenzielle Positionen eines polymorphen Lokus mit Sequenz-Varianz von nur einem Nukleotid innerhalb einer Zielsequenz (Position 1 bis 6) eines Matrizenstrangs und ihre korrespondierenden Sequenzsegment-Positionen in einzelnen Komponenten eines Primer-Verlängerungs-Systems.
Insgesamt kann die Anordnung von einezlenen Amplifikations-Komponenten dermassen gestaltet werden, dass mehrere Varianten / Kombinationen möglich sind:
Anordnung 1 (P1): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den ersten Primer (ersten Bereich) und Controller-Oligonukleotid (zweiten Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden.
Anordnung 2 (P2): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den ersten Primer (ersten Bereich) und Controller-Oligonukleotid (zweiten Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Anordnung P2 unterscheidet sich von P1 vor allem dadurch, dass N2 vorwiegend im 3'-Terminalen Sequenz-Segment des ersten Primers liegen kann oder sogar das 3'-Terminale Nukleotid umfasst. Dadurch kann ggf. eine weitere Erhöhnung der Spezifität der Amplifikation erzeicht werden.
Anordnung 3 (P3): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert nur das Controller-Oligonukleotid (dritten Bereich), wobei das korrespondierende Sequenzsegment des Controller-Oligonukleotides im 5'-Segment des synthetisierten Anteils des ersten Primer-Verlängerungsproduktes liegt. Das Controller-Oligonukleotid des Amplifikations-Systems kann somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifsicher erster Primer verwendet, welche aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch sind. Aufgrund der möglichen Nähe der zweiten Blockierungs-Einheit kann Bindung des Controller-Oligonukleotide an das erste Primer-Verlängerungsprodukt durch Nukleotid-Modifikationen der zweiten Blockierungs-Einheit beeinflusst werden.
Anordnung 4 (P4 - P6): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert nur das Controller-Oligonukleotid (dritten Bereich). Das Controller-Oligonukleotid des Amplifikations-Systems kann somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifsicher erster Primer verwendet, welche aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch sind. Dieses Sequenzsegment des Controller-Oligonukleotides liegt in 5'-Richtung von der zweiten Blockierungs-Einheit. Dieses Segment des Controller-Oligonukleotides kann mehrere DNA-Nukleotid-Monomere umfassen, z.B. von 5 bis 30, wobei das N2-korrespondierende Sequenzsegment von mindestens 3 bis 15 DNA-Nukleotid-Bausteinen auf beiden Seiten flankiert sein kann.
16 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt. Ein spezifischer P1.1 kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifsichen Sequenz-Variante des Matrizenstranges (S1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. P1.1-Ext kann komplementär an C1.1 binden und unter seiner Mitwirkung von Matrizenstrang abgelöst werden.
17 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt. Ein spezifischer P1.1 kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifsichen Sequenz-Variante des Matrizenstranges (M 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Primer-Verlängerung kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Bindung an eine andere Sequenz-Variante (M 1.2) erfolgt weniger Effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der M 1.2. Die Primer-Verlängerung wird somit unter stringenten Reaktionsbedinungen weniger effizient gestartet.
18 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt (2). N2-Lokus umfasst auch das 3'-Terminale Nukleotid des ersten Primers. Ein spezifischer P1.1, mit einem komplementären 3'-terminalen Nukleotid kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifsichen Sequenz-Variante des Matrizenstranges (M 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Primer-Verlängerung kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Bindung an eine andere Sequenz-Variante (SN 1.2) erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der M 1.2. Die Primer-Verlängerung wird somit unter stringenten Reaktionsbedingungen weniger effizient gestartet.
19 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotide im dritten Bereich liegt (3). Es werden zielsequenzspezifsiche aber nicht sequenz-Varianten spezifsiche erster Primer verwendet. Ein für alle Sequenz-Varianten einer Zielnukleinsäure einheitlicher P1.1, kann an den Matrizenstran binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Primer-Verlängerung kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Trennung von Primer-Verlängerungsprodukten P1.1-Ext vom Matrizenstrang erfolgt vorzugsweise spezifsich durch komplementäre Bindung des P1.1-Ext an das Controller-Oligonukleotid. Die Trennung von Strängen einer anderen Sequenz-Variante, welche unter Verwendung von (M 1.2) synthetisiert wurden, erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) zum korrespondierenden Sequenz-Segment des Controller-Oligonukleotides. Die Position des Sequenz-Segmentes (3), welches zu N2 der Zielsequenz korrespondiert, liegt in der Nähe der zweiten Blockierungseinheit, so dass Interaktion zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem jeweiligen ersten Primer-Verlängerungsprodukt von verwendeten Modifikationen in der zweiten Blockierungseinheit beeinflusst werden kann.
20 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotide im dritten Bereich liegt (4). Es werden zielsequenzspezifsiche aber nicht sequenz-Varianten spezifsiche erster Primer verwendet. Ein für alle Sequenz-Varianten einer Zielnukleinsäure einheitlicher P1.1, kann an die Matrizenstränge binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Primer-Verlängerung kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Trennung von Primer-Verlängerungsprodukten P1.1-Ext vom Matrizenstrang erfolgt vorzugsweise spezifsich durch komplementäre Bindung des P1.1-Ext an das Controller-Oligonukleotid. Die Trennung von Strängen einer anderen Sequenz-Variante, welche unter Verwendung von (M 1.2) synthetisiert wurden, erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) zum korrespondierenden Sequenz-Segment des Controller-Oligonukleotides. Die Position des Sequenz-Segmentes (4), welches zu N2 der Zielsequenz korrespondiert, liegt in einer Entfernung von der zweiten Blockierungseinheit, so dass Interaktion zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem jeweiligen ersten Primer-Verlängerungsprodukt von verwendeten Modifikationen in der zweiten Blockierungseinheit im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt. Das Segment des Controller-Oligonukleotides, welches zu N2 korrepondiert besteht vorzugsweise aus DNA-Monomeren, wobei zwischen 4 bis 20 DNA Monomeren verwendet werden und mindestens 4 bis 10 DNA-Monomere um die Position-4 auf beiden Seiten lokalisiet sind.
21 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt. Ein spezifischer P1.1 kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifsichen Sequenz-Variante des Matrizenstranges (M 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Primer-Verlängerung kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext. Die Bindung an eine andere Sequenz-Variante (M 1.2) erfolgt weniger Effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der M 1.2. Die Primer-Verlängerung wird somit unter stringeten Bedinungen weniger effizient gestartet.
Zur weiteren Erhöhung der Spezifität wird ein Kompetitor-Primer-Oligonukleotid (P 5.1) in die Reaktion zugegeben, welches in der Lage ist, vorwiegend komplementär an die Sequenz-Varianten der Zielsequenz bindet, wessen Kopie-Erstellung mit anschließender Trennung vom Matrizenstrang unterdrückt werden muss. Aufgrund einer komplementären Bindung mit solchen Primer-Bindungsstellen kann ein Kompetitor-Primer bevorzugt binden und von Polymerase verlängert werden. Das dabei resultierende Produkt (hier P5.1-Ext) blockiert die einzelsträngigen Primer-Bindungsstellen für eine Interaktion des ersten Primers.
In einer Ausführungsform bindes das 3'-Ende eines Kompetitor-Primer innerhalb der zweiten Blockeirungs-Einheit des Controller-Oligonukleotides, so dass keine Verlängerung dieses Primers am Controller-Oligonukleotid erfolgen kann. Dabei kann die genaue Position des 3'-Endes. Der Kompetitor-Primer umfasst kein Sequenzsegment, welches mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotid interagieren kann. Dadurch wird verhindert, dass das Verlängerungsprodukt des Kompetitor-Oligonukleotides von Matrize abgelöst wird.
22 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt (2). N2-Lokus umfasst auch das 3'-Terminale Nukleotid des ersten Primers. Ein spezifischer P1.1, mit einem komplementären 3'-terminalen Nukleotid kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifsichen Sequenz-Variante des Matrizenstrangs (M 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Primer-Verlängerung kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext. Die Bindung an eine andere Sequenz-Variante (M 1.2) erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der SN 1.2. Die Primer-Verlängerung wird somit unter stringenten Bedinungen weniger effizient gestartet.
Zur Erhöhung der Spezifität wird ein Kompetitor-Primer (P5.2) in die Reaktion zugegeben, welches in der Lage ist, vorwiegend komplementär an die Sequenz-Varianten der Zielsequenz bindet, wessen Primer-Verlängerung und anschließende Trennung vom Matrizenstrang unterdrückt werden muss. Aufgrund einer komplementären Bindung mit solchen Primer-Bindungsstellen kann ein Kompetitor-Primer bevorzugt an bestimmte Sequenz-Varianten binden (hier mit N bezeichnet) und von Polymerase verlängert werden. Das dabei resultierende Produkt (P5.2-Ext) blockiert die einzelsträngigen Primer-Bindungsstellen für eine Interaktion des ersten Primers.
In einer Ausführungsform bindes das 3'-Ende eines Kompetitor-Primer innerhalb der zweiten Blockeirungs-Einheit des Controller-Oligonukleotides, so dass keine Verlängerung dieses Primers am Controller-Oligonukleotid erfolgen kann. Der Kompetitor-Primer umfasst kein Sequenzsegment, mit welchem es mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotid interagieren kann. Damit wird verhindert, dass das Verlängerungsprodukt des Kompetitor-Oligonukleotides von Matrize abgelöst wird.
23 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Controller-Oligonukleotide im dritten Bereich liegt (3). Es werden zielsequenzspezifsiche aber nicht sequenz-Varianten spezifsiche erster Primer verwendet. Ein für alle Sequenz-Varianten einer Zielnukleinsäure einheitlicher P1.1 kann an die Matrizenstränge binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Primer-Verlängerung kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext. Die Trennung von synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten P1.1-Ext vom Matrizenstrang erfolgt vorzugsweise spezifsich durch komplementäre Bindung des P1.1-Ext an das Controller-Oligonukleotid. Die Trennung von Strängen einer anderen Sequenz-Variante, welche unter Verwendung von (M 1.2) synthetisiert wurden, erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) zum korrespondierenden Sequenz-Segment des Controller-Oligonukleotides. Die Position des Sequenz-Segmentes (3), welches zu N2 der Zielsequenz korrespondiert, liegt in der Nähe der zweiten Blockierungseinheit, so dass Interaktion zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem jeweiligen ersten Primer-Verlängerungsprodukt von verwendeten Modifikationen in der zweiten Blockierungseinheit beeinflusst werden kann.
Zur Erhöhung der Spezifität wird ein Kompetitor-Primer (P5.3) in die Reaktion zugegeben, welches in der Lage ist, vorwiegend komplementär an die Sequenz-Varianten der Zielsequenz bindet (N), wessen Kopie-Erstellung und anschließende Strang-Trennung unterdrückt werden muss. Aufgrund einer komplementären Bindung mit solchen Primer-Bindungsstellen kann ein Kompetitor-Primer bevorzugt an bestimmte Sequenz-Varianten binden (hier mit N bezeichnet) und von Polymerase verlängert werden. Das dabei resultierende Produkt blockiert die einzelsträngigen Primer-Bindungsstellen für eine Interaktion des ersten Primers.
In einer Ausführungsform ist das Kompetitor-Primer-Oligonukleotid (P5.3) länger als das erste Primer-Oligonukleotid, so dass sein 3'-Ende innerhalb der vierten Blockeirungs-Einheit des Controller-Oligonukleotides binden (vierte Blockierungseinheit ist analog zu zweiten Blockeirungseinheit zusammengesetzt und blockiert eine Primer-Verlängerung am Controller-Oligonukleotid), so dass keine Verlängerung dieses Primers am Controller-Oligonukleotid erfolgen kann. Der Kompetitor-Primer umfasst kein Sequenz-Segment welches mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotid interagieren kann. Dadurch wird verhindert, dass das Verlängerungsprodukt des Kompetitor-Oligonukleotides von Matrize abgelöst wird.
24 zeigt schematisch eine selektive Primer-Verlängerungsreaktion von mehreren Sequenz-Varianten bei Verwendung von mehreren selektiven Controller-Oligonukleotiden (C1.1 und C1.2).
25 - 29 zeigen schematisch die Struktur des ersten Primer-Oligonukleotids und des Controller-Oligonukleotides, sowie die Interaktion zwischen dem ersten Primer-Oligonukleotid und der Matrize, sowie die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsprodukts.
30 zeigt schematisch die Interaktion zwischen Strukturen während der Primer-Verlängung des ersten Primer-Oligonukleotids.
31 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 1
32 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 2
33 zeigt schematisch einige Ausführungsformen von Strukturen einer Start-Nukleinsäurekette und ihre Verwendung als Matrize zu Beginn der Reaktion. Unter Verwendung von P1.1, ohne Block-Oligonukleotid.
34 zeigt schematisch einige Ausführungsformen von Strukturen einer Start-Nukleinsäurekette und ihre Verwendung als Matrize zu Beginn der Reaktion. Unter Verwendung von P1.1, mit Block-Oligonukleotid.
35 zeigt schematisch das Zusammenwirken der Strukturen während der Nukleinsäureamplifikation durch einerseits die Amplifikation von erstem Primer-Oligonukleotid und zweitem Primer-Oligonukleotid und weiterhin die Einwirkung des Controller-Oligonukleotids und dabei resultierende Strangverdrängung.
36 - 38 zeigen Ergebnisse aus Beispiel 4
39 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Primer-Verlängerungs-Systems und eines Matrizenstrangs mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, ergänzend zu anderen Abbildung wird hier Folgende Numenklatur von Reaktions-Komponenten und von Sequenzsegmenten verwendet:

a) eine Probe, die ein Nukleinsäurepolymer umfassend die Zielsequenz M umfasst, wobei die Zielsequenz in 5'-3'-Orientierung die Sequenzabschnitte MS und MP umfasst und MP unmittelbar in 3' von MS angeordnet ist, mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
b) ein Oligonukleotidprimer P, welcher in 5'-3'-Orientierung die Sequenzabschnitte PC und PM umfasst und PM unmittelbar in 3' von PC angeordnet ist, wobei PM die zum Sequenzabschnitt MP komplementäre [die hybridisierende] Sequenz aufweist [im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann] und PC nicht an M [oder eine in 3' unmittelbar an MP anschließende Sequenz] binden kann;
c) ein Controller-Oligonukleotid C, welches in 5'-3'-Orientierung die Sequenzabschnitte CS, CP und CC umfasst, wobei CP unmittelbar in 3' von CS und unmittelbar in 5' von CC angeordnet ist, und wobei CS identisch mit MS ist und CP identisch mit MP ist und CC die zum Sequenzabschnitt PC komplementäre [die hybridisierende] Sequenz aufweist und wobei CS modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass CS nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann;
d) eine matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase sowie Substrate der DNA-Polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren,

- entweder die Reaktionsbedingungen so gewählt sind, und/oder
- die Längen und Schmelztemperatur von PC und ggf. MS so gewählt sind,

Das Verfahren gemäß einer Ausführungsform, wobei der Sequenzabschnitt CS an seinem 3' Ende unmittelbar 5' des Sequenzabschnitts CP einen Sequenzabschnitt CS' von 5 bis 15 Nukleotidpositionen Länge enthält, welcher aus Nukleinsäureanaloga, insbesondere aus 2'O-Alkyl-ribonucleotiden, besteht.
Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ausführunsformen, wobei M einen Sequenzabschnitt MB unmittelbar in 5' von MS umfasst, und wobei weiterhin ein Block-Oligonukleotid B, das an MB hybridisieren kann, mit der Probe in Kontakt gebracht wird, und wobei

a. B Nukleosidanaloga umfasst, die so ausgewählt sind, dass ein Hybrid von B mit MB die Reaktion der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase auf MB nicht erlaubt oder
b. die matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase so ausgewählt ist, dass ein Hybrid von B mit MB [auch wenn B aus natürlichen Nukleosiden oder Deoxynukleosiden besteht] die Reaktion der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase auf MB nicht erlaubt.

Beispiele:
Material und Methoden:
Reagenzien wurden von folgenden kommerziellen Anbietern bezogen:

• nicht modifizierte und modifizierte Oligonukleotide (Eurofins MWG, Eurogentec, Biomers, Trilink Technologies, IBA Solutions for Life Sciences)
• Polymerasen NEB (New England Biolabs)
• dNTP's: Jena Bioscience
• interkallierender EvaGreen Farbstoff: Jena Bioscience
• Puffer-Substanzen und andere Chemikalien: Sigma-Aldrich
• Plastikware: Sarstedt

Lösung 1 (Amplifikationsreaktion Lösung 1) :

• Kalium Glutamat, 50 mmol/l, pH 8,0
• Magnesium Acetat, 10 mmol/l
• dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), je 200 µmol/l
• Polymerase (Bst 2.0 WarmStart, 120.000 U/ml NEB), 12 Units / 10 µl
• Triton X-100, 0,1% (v/v)
• EDTA, 0,1 mmol/l
• TPAC (Tetrapropylammonium Chloride), 50 mmol/l, pH 8,0
• EvaGreen Farbstoff (Farbstoff wurde entsprechend Anleitung des Herstellers in Verdünnung 1:50 eingesetzt).

Lösung 2 (Amplifikationsreaktion Lösung 2) :

• 1x Isothermal Puffer (New England Biolabs); in einfacher Konzentration enthält der Puffer:
- 20 mM Tris-HCI
- 10 mM (NH4)2SO4
- 50 mM KCl
- 2 mM MgSO4
- 0.1% Tween® 20
- pH 8.8@25°C)
• dNTP (dATP, dCTP, dUTP, dGTP), je 200 µmol/l
• EvaGreen Farbstoff (Farbstoff wurde entsprechend Anleitung des Herstellers in Verdünnung 1:50 eingesetzt)

Alle Konzentrationen sind Angaben der Endkonzentrationen in der Reaktion. Abweichungen von der Standard-Reaktion werden entsprechend angegeben.
Die Schmelztemperatur (Tm) von beteiligten Komponenten wurde bei Konzentration von 1 µmol/l von jeweiligen Komponenten in Lösung 1 oder 2 bestimmt. Abweichende Parameter sind jeweils angegeben.
Allgemeine Informationen zu Reaktionen
Primer-Verlängerungsreaktionen und Amplifikation wurden standardmäßig bei zwei Reaktionstemperaturen von 55°C und / oder 65°C durchgeführt. Abweichungen sind angegeben.
Der Reaktionsstart erfolgte durch Erhitzen der Reaktionslösungen auf Reaktionstemperatur, da Bst 2.0 Polymerase Warmstart bei niedrigeren Temperauren größtenteils in ihrer Funktion durch ein temperatur-sensitives Oligonukleotid gehemmt ist (ein „Aptamer“ laut Hersteller-Angaben). Die Polymerase wird zunehmend aktiver ab einer Temperatur von ca. 45°C, bei einer Temperatur von 65°C konnten keine Unterschiede zwischen Polymerase Bst 2.0 und Bst 2.0 Warmstart festgestellt werden. Um der extensiven Bildung von Nebenprodukten (z.B. Primer-Dimeren) während der Vorbereitungsphase einer Reaktion vorzubeugen, wurde Polymerase Bst 2.0 Warmstart verwendet. Abweichungen davon werden speziell angegeben.
Reaktionsstopp erfolgte durch Erhitzen der Reaktionslösung auf über 80°C, z.B. 10 min bei 95°C. Bei dieser Temperatur wird Polymerase Bst 2.0 irreversible denaturiert und das Ergebnis der Synthese-Reaktion kann nachträglich nicht geändert werden.
Reaktionen wurden in einem Thermostat mit einer Fluoreszenz-Messvorrichtung ausgeführt. Zu diesem Zweck wurde ein kommerzielles Real-Time PCR Gerät verwendet, StepOne Plus (Applied Biosystems, Thermofischer). Das Reaktionsvolumen betrug standardmäßig 10 µl. Abweichungen davon werden angegeben.
Sowohl Endpunkt-Bestimmung als auch kinetische Beobachtungen wurden vorgenommen. Bei Endpunktbestimmungen wurde das Signal beispielsweise von an Nukleinsäuren gebundenen Farbstoffen registriert, z.B. von TMR (Tetramethyl-Rhodamine, auch TAMRA genannt) oder von FAM (Fluorescein). Die Wellenlängen zur Anregung und Messung der Fluoreszenzsignale von FAM und TMR sind als Werkeinstellungen bei StepOne Plus Real-Time PCR Gerät gespeichert. Ebenfalls wurde ein interkallierender Farbstoff (EvaGreen) bei Endpunktmessungen vorgenommen, z.B. bei Messung einer Schmelzkurve). EvaGreen ist ein interkallierender Farbstoff und ist ein Analogon des häufig eingesetzten Farbstoff Sybrgreen, allerdings mit etwas geringerer Inhibierung von Polymerasen. Die Wellenlängen zur Anregung und Messung der Fluoreszenzsignale von SybreGreen und EvaGreen sind identisch und sind als Werkeinstellungen bei StepOne Plus Real-Time PCR Gerät gespeichert. Die Fluoreszenz kann mittels eingebauter Detektoren fortlaufend, d.h. „online“ oder „Real-Time“ detektiert werden. Da die Polymerase während ihrer Synthese einen Doppelstrang synthetisiert, konnte diese Technik zu kinetischen Messungen (Real-Time Monitoring) der Reaktion verwendet werden. Aufgrund von einem gewissen Cross-Talk zwischen Farb-Kanälen bei StepOne Plus Gerät wurde teilweise erhöhte basale Signal-Intensität bei Messungen beobachtet, bei welchen z.B. TMR-markierte Primer in Konzentration von über 1 µmol/l (z.B. 10 µmol/l) eingesetzt waren. Es wurde beobachtet, dass TMR-Signal in Sybre-Green-Kanal zu erhöhten Grundwerten führt. Diese erhöhten Grundwerte wurden bei Berechnungen berücksichtigt.
Die kinetischen Beobachtungen von Reaktionsverläufen wurden routinemäßig mittels Fluoreszenzsignalen von Fluoreszein (FAM-TAMRA Fret-Paar) bzw. interkallierenden Farbstoffen (EvaGreen) aufgenommen. Zeitabhängigkeit des Signal-Verlaufs wurde registriert (Real-Time Signal Erfassung bei StepOne plus PCR Gerät). Ein Anstieg des Signals während einer Reaktion verglichen mit einer Kontroll-Reaktion wurde je nach Aufbau des Ansatzes interpretiert. Beispielsweise, eine Zunahme des Signals bei Verwendung von Evagreen-Farbstoff wurde als Hinweise auf Zunahme der Menge an doppelsträngigen Nukleinsäureketten während der Reaktion interpretiert, und somit als Ergebnis einer stattfindenden Synthese durch DNA-Polymerase gewertet.
Bei einigen Reaktionen wurde in der Regel im Anschluss an die Reaktion eine Schmelzkurvenbestimmung durchgeführt. Solche Messungen erlauben Rückschlüsse auf das Vorliegen von Doppelsträngen, welche beispielsweise interkallierende Farbstoffe aufnehmen können und dadurch die Signalintensität von Farbstoffen deutlich verstärken. Mit der steigenden Temperatur sinkt der Anteil von Doppelsträngen und die Signal-Intensität sinkt ebenfalls. Das Signal ist von der Länge von Nukleinsäureketten und von der Sequenzzusammensetzung abhängig. Diese Technik ist einem Fachmann hinreichend bekannt.
Bei Verwendung der Schmelzkurven-Analyse im Zusammenhang mit Reaktionen, welche signifikante Anteile von modifizierten Nukleinsäureketten (z.B. Controller-Oligonukleotide oder Primer) enthielten, wurde festgestellt, dass sich das Signal von Farbstoff EvaGreen beispielsweise unterschiedlich zwischen B-Form der DNA und A-Form von modifizierten Nukleinsäureketten verhalten kann. Beispielsweise wurde bei B-Form der doppelsträngigen Nukleinsäureketten (gewöhnlich angenommen für klassische DNA-Abschnitte) eine höhere Signal-Intensität beobachtet, als bei doppelsträngigen Nukleinsäureketten mit der gleichen Sequenz von Nukleobasen, welche eine A-Form ähnliche Konformation annehmen können (z.B. durch mehrere 2'-O-Me Modifikationen von Nukleotiden). Diese Beobachtung wurde beim Einsatz von interkallierenden Farbstoffen berücksichtigt.
Bei Bedarf wurde die Reaktion mittels Kapillarelektrophorese analysiert und die Länge von gebildeten Fragmenten mit einem Standard verglichen. Als Vorbereitung auf die Kapillarelektrophorese wurde die Reaktionsmischung in einem Puffer (Tris-HCI, 20 mmol/l, pH 8,0, und EDTA, 20 mmol/l, pH 8,0) dermaßen verdünnt, dass die Konzentration von markierten Nukleinsäuren ca. 20 nmol/l betrug. Die Kapillar-Elektrophorese wurde bei Firma GATC-Biotech (Konstanz, Deutschland) als Auftragsleistung durchgeführt. Nach Angaben des Anbieters wurde die Kapillarelektrophorese auf einem ABI 3730 Cappilary Sequencer unter Standard-Bedingungen für eine Sanger-Sequenzierung unter Verwendung von POP7 Gelmatrix, bei ca. 50°C durchgeführt und konstanter Spannung (ca. 10 kV) durchgeführt. Die verwendeten Bedingungen führten zu Denaturierung von Doppelsträngen, so dass in der Kapillarelektrophorese die einzelsträngige Form von Nukleinsäureketten separiert wurde. Die Elektrophorese ist eine Standardtechnik in der genetischen Analyse. Die automatisierte Kapillar-Elektrophorese wird heute routinemäßig bei Sanger-Sequenzierung eingesetzt. Das Fluoreszenz-Signal wird während der Kapillar-Elektrophorese kontinuierlich aufgezeichnet (gewöhnlich unter Verwendung von virtuellen Filtern), so dass ein Elektrophorogramm entsteht, bei welchem die Signal-Intensität mit der Dauer der Elektrophorese korreliert. Bei kürzeren Fragmenten, z.B. nicht verbrauchte Primer, beobachtet man einen frühren Signal-Peak, bei verlängerten Fragmenten kommt es zu einer zeitlichen Verschiebung der Signale proportional der Länge des extendierten Bereichs. Dank mitgeführten Kontrollen mit bekannten Längen lässt sich die Länge von extendierten Fragmenten ausmessen. Diese Technik ist einem Fachmann bekannt und wird ebenfalls standardmäßig bei Fragment-Längen-Polymorphismus eingesetzt.
Beispiel 1:
Primer-Verlängerungs-Reaktion zur Herstellung eines Primerverlängerungsproduktes unter Verwendung von Sequenz-Varianten einer Zielsequenz und anschließende Verwendung des synthetisierten Primer-Verlängerungsproduktes in einer Amplifikations-Reaktion.
In diesem Beispiel wurde Einfluss von Sequenzdifferenzen in zwei Matrizen auf die Interaktion mit dem Controller nach einer Synthese-Phase untersucht. Es wurden zwei Matrizen bereitgestellt, welche an einer Nukleotid-Position eine Sequenzdifferenz umfassten. Bei Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotides wurde jeweils ein komplementärer Strang gebildet, welcher eine komplementäre Sequenz zur jeweiligen Matrize aufwies und somit ebenfalls diese Sequenzdifferenz in der Sequenz umfasste. Beide Matrizen umfassten eine einheitliche Primer-Bindungsstelle, so dass ein einheitlicher Primer verwendet werden konnte. Diskriminierung zwischen einzelnen Sequenz-Varianten der Zielsequenz erfolgte somit mittels eines spezifsichen Controller-Oligonukleoitides.
Die während der Synthese-Phase generierten Primer-Verlängerungsprodukte können durch Controller vorwiegend spezifisch von Matrizensträngen abgelöst werden. Die Primer-Verlängerungsprodukte umfassen ein 3'-Segment, welches nicht von einem Controller-Oligonukleotid gebunden wird. Dieses 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes kann von einem anderen Oligonukleotid, z.B. Primer komplementär gebunden werden. Auf diese Weise generierten erste Primer-Verlängerungsprodukte können in einer anschließenden Amplifikations-Reaktion unter Verwendung eines weiteren, zweiten Primers amplifiziert werden. Die Amplifikations-Reaktion dient somit zur Veranschaulichung einer Auswirkung einer Controlling-Phase (Strang-Trennung durch einen Controller) nach einer Synthese-Phase.
Folgende Matrizen wurden verwendet:
Matrize (SEQ ID NO) mit Sequenzzusammensetzung, welche zu einem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mit einem Perfekt-Match Übereinstimmung mit Controller-Oligonukleotid führt:

M2SF5-M001-200
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA AAAAA 3' (SEQ ID NO:)
A = 2'-deoxy-Adenosin
C = 2'-deoxy-Cytosin
G = 2'-deoxy-Guanosin
T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)

Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen.
Matrize (SEQ ID NO) mit Sequenzzusammensetzung, welche zu einem ersten Primer-Verlängerungsprodukt führt, das an einer einzelnen Basenposition (fett gedruckt) ein Mismatch mit dem Controller-Oligonukleotid bildet:

M2SF5-WT01 -200
5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC GA GGAATACAGGTA AAAAA 3' (SEQ ID NO:)
A = 2'-deoxy-Adenosin
C = 2'-deoxy-Cytosin
G = 2'-deoxy-Guanosin
T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)

Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen.
Folgende Primer wurden verwendet:
Das erste Primer-Oligonukleotid (SEQ ID NO:2):


 P1F5-200-AE2053
 5' AACTCAGACAAGATGTGATTTTTTTACCTGTAT [CUCU GAUGCUUC] 1TACCTGTATTCC 3

Der als Primer in der Reaktion verwendetes Segment ist unterstrichen.

A = 2'-deoxy-Adenosin
C = 2'-deoxy-Cytosin
G = 2'-deoxy-Guanosin
T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)

Dieses Oligonukleotid umfasste folgende Modifikationen:

1= C3-Linker

Segment des Primers [CUCU GAUGCUUC] umfasste 2'-O-Me-Modifikationen und diente als zweiter Primer-Bereich zur Bindung des ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides:

A = (2'-O-Methyl-Adenosine)
G = (2'-O-Methyl-Guanosine)
C = (2'-O-Methyl-Cytosine)
U = (2'-O-Methyl-Uridine)

Folgendes Controller-Oligonukleotid (SEQ ID NO:4) wurde verwendet:

 AD-F5-1001-503
 5' [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]AGGTAGAAGCATC AGAG X
 3'

Das 5'-Segment des Oligonukleotids [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC] umfasste 2'-O-Me-Nukleotid-Modifikationen:

Modifikationen:

A = (2'-O-Methyl-Adenosine)
G = (2'-O-Methyl-Guanosine)
C = (2'-O-Methyl-Cytosine)
U = (2'-O-Methyl-Uridine)
X = 3'-Phosphat-Gruppe zur Blockade einer möglichen Verlängerung durch Polymerase.

Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft. Das 3'-Ende des Controller-Oligonukleotdies ist mit einer Phosphat-Gruppe blockiert, um eine mögliche Verlängerung durch die Polymerase zu verhindern.

Die Primer-Verlängerungs-Reaktion wurde direkt als Amplifikations-Reaktion fortgeführt (homogenes Assay).

Zu diesem Zweck wurde vor Beginn der Primer-Verlängerungs-Reaktion ein weiterer Primer (Primer 2) in das Reaktions-Gemisch gegeben. Dieser zweite Primer kann an das 3'-Segment des in der Primer-Verlängerungsreaktion synthetisierten Primer-Verlängerungsproduktes komplementär binden. Weiterhin ist dieser zweite Primer eine Amplifikations-Reaktion zu unterstützen, ausgehend vom während der Synthese-Phase matrizenspezifisch synthetisierten ersten Primer-Verlängerungsprodukt, welches anschließend in der Controlling-Phase von seinem Matrizen-Strang durch Controller abgelöst wird.

Primer 2:

 P2G3-5270-7063
 5' CTACAGAACTCAGACAAGATGTGAACTACAATGTT 6
 GCTCATACTACAATGTCACTTACTGTAAGAGCAGA 3' (SEQ ID NO:8)

Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:

6 = HEG-Linker

Das als Primer in der Reaktion verwendete Segment ist unterstrichen. Dieses Segment ist in der Lage, an das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes zu komplementär zu binden unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize eine zweite Primer-Verlängerungsreaktion zu generieren.

Aus der ersten Primer-Verlängerungs-Reaktion und der zweiten Primer-Verlängerungsreaktion resultiert dabei ein Doppelstrang, umfassend das erste und das zweite Primer-Verlängerungsprodukte. Bei weiterer Verwendung von beiden Primern und des Controller-Oligonukleotides (und wiederholten Temperaturen von 55°C und 65°C) resultierte eine exponentielle Amplifikation, welche sowohl Primer-Verlängerungs-Schritte als auch Strang-Trennung mittels Controller-Oligonukleotides umfasst. Während der Amplifikations-Phase diente das erste Primer-Oligonukleotid weiterhin als Amplifikations-Primer.

Es wurden vier Ansätze vorbereitet:

Ansatz 1 enthält als Matrize M2SF5-M001-200 (Perfect Match Situation) in Konzentration von 300 fmol/l (entspricht ca. 2×10^6 Kopien/ Ansatz).
Ansatz 2 enthält die Matrize M2SF5-M001-200 (Perfect Match Situation) in Konzentration von 300 amol/l (entspricht ca. 2×10^3 Kopien/ Ansatz).
Ansatz 3 enthält keine Matrize und bildet somit eine Kontrolle.
Ansatz 4 enthält als die Matrize M2SF5-WT01-200 (single Mismatch Situation) in 300 pmol/l Konzentration (ca. 2× 10^9 Kopien pro Ansatz).

Primer 1 wurde mit 5 µmol/l, das Controller-Oligonukleotid mit 2 µmol/l und Primer 2 mit 1 µmol/l eingesetzt. Die weiteren Reaktionsbedingungen waren: Amplifikations-Lösung 2.

Um die Anwesenheit von genomischer DNA im Assay nachzustellen wurden pro Reaktion 100 ng frisch denaturierte Fisch-DNA (Lachs-DNA) zugegeben.

Eine Primer-Verlängerungs-Reaktion (Synthese-Phase und Controlling-Phase).

Die thermischen Reaktionsbedingungen waren 2 min bei 55 °C (Synthese-Phase) und anschließend 5 min bei 65 °C (Controlling-Phase).

Die Synthese-Phase der Primer-Verlängerungs-Reaktion des ersten Primers fand in erster Linie bei 55°C statt. Bei dieser Temperatur lag der Controller in Komplex mit dem ersten Primer und war damit in einem nicht-aktiven Zustand. Die Controlling-Phase fand bei 65°C statt. Bei dieser Temperatur dissoziierte der Controller zumindest teilweise vom ersten Primer-Oligonukleotid und konnte somit mit gebildeten Primer-Verlängerungsprodukten interagiren. Die Schmelztemperatur des ersten Bereichs des ersten Primers mit seiner Primer-Bindungsstelle an der Matrize betrug ca. 45°C in Amplifikations-Lösung 2. Somit wurde Synthese-Phase bei einer Reaktions-Temperatur von etwa Tm +10°C durchgeführt, bezogen auf Tm von Matrize / erster Primer-Komplex. Aufgrund einer höheren Konzentration des ersten Primers (5 µmol) lag in der Synthese-Phase genügende Menge des ersten Primers frei, um an die Matrize zu binden und die Reaktion zu starten. Bei Erhöhung der Temperatur auf 65°C sank die Ausbeute der Synthese-Phase signifikant. Bei dieser Temperatur wurde Controller aus seiner Bindung mit dem Primer teilweise freigesetzt (Tm des Komplexes umfassend erstes Primer und Controller in Amplifikations-Lösung 1 betrug 63°C). Daher verlief die Controlling Phase bei ca. Tm +2°C. bezogen auf Tm von Controller / erster Primer - Komplex).

Amplifikations-Reaktion (Wiederholung von Primer-Verlängerungs-Reaktionen)

Die thermischen Reaktionsbedingungen waren zyklisch, alternierende Temperaturänderungen, wobei jeweils auf ein 2 min Zeitintervall bei 55 °C ein 5 min Zeitintervall bei 65 °C folgte. Die Amplifikation wurde über 100 Zyklen verfolgt. Detektion erfolgte bei 65°C für EvaGreen-Fluoreszenzsignal.

Die erfolgreiche Synthese von Primer-Verlängerungs-Produkten (hier als Amplifikation bezeichnet) konnte durch einen Anstieg des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit festgestellt werden. Die Temperatur-Änderungen und Real-Time Monitoring wurde mit StepPne Plus Real-Time PCR Gerät von Thermofisher durchgeführt.

31 zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Signals. Auf der Y-Achse ist die Zunahme des Fluoreszenzsignal (Delta Rn) und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Pfeile markieren einzelne Reaktionsansätze. Dabei gehören die markierten Positionen zu folgenden Ansätzen:

Pfeil 1:	300 fmol/l perfekt-Match Matrize	(ca. 2×10^6 Kopien/Ansatz)
Pfeil 2:	300 amol/l perfekt-Match Matrize	(ca. 2×10^3 Kopien/Ansatz)
Pfeil 3:	keine Matrize
Pfeil 4:	300 pmol/l Mismatch Matrize	(ca. 2× 10^9 Kopien pro Ansatz).

Man sieht den Anstieg des Fluoreszenz-Signals sowohl bei perfekt-Match als auch bei Mismatch-Variante der Matrize, wobei das Signal der Mismatch-Variante (4) trotz 1000fachen Überschußes später erscheint. Beim Single Mismatch wird eine Verzögerung von ca. 15 Zyklen beobachtet. Die zeitliche Verzögerung (=Zyklusanzahl) ist ein unmittelbares Maß für die Diskriminierung durch Wirkung von Controller. Bei Verwendung einer Perfect-Match Matrize kommt es zur Synthese eines komplementären Stranges eines Primer-Verlängerungsproduktes. Dieses Verlängerungsprodukt ist sowohl zu Perfect-Match-Matrize komplementär als auch zum verwendeten Controller-Oligonukleotid. Im Gegensatz dazu, unter Verwendung einer Mismatch-Sequenz kommt es bei der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes zu Generierung eines komplementären Stranges des Verlängerungsproduktes, welches zwar eine vollständige Komplementarität zu Mismatch-Matrize aufweist, aber dadurch von der Komplementarität mit dem dritten Bereich des Controller-Oligonukleotid abweicht. Diese Abweichung findet im 5'-ständigen Segment des Verlängerungsproduktes statt, welches mit Controller-Oligonukleotid reagieren sollte, damit Strangverdrängungsvorgang voranschreiten kann. Wie im vorliegenden Beispiel gezeigt wird, stört das Mismatch eine Strangtrennung durch das Controller-Oligonukleotid.

Dieses Ergebnis veranschaulicht die Bedeutung der Basenzusammensetzung im Controller-Oligonukleotid: Abweichungen von der Komplementarität zwischen Controller-Oligonukleotid und dem Primer-Verlängerungsprodukt können zu Verlangsamung oder sogar Unterbrechung der Amplifikation führen.

In diesem Beispiel wurde gezeigt, dass obwohl Sequenz-Enden von Perfect-Match-Matrize und Mismatch-Matrize komplett übereinstimmten und somit das Potenzial zu Bindung von beiden Primer-Oligonukleotide gleich war, sind beide Reaktionen vollkommen unterschiedlich gelaufen: bei einer vollständigen Komplementarität zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem 5'-Segment des Verlängerungsproduktes des ersten Primer-Oligonukleotides verlief die Amplifikation planmäßig. Eine Unterbrechung der Strangtrennung während der Controlling-Phase durch eine nicht-komplementäre Sequenzvariante (in diesem Fall durch ein Mismatch) führte Minderung der Strang-Trennung, was sich in Unterdrückung der Amplifikations-Kinetik äußerte.

Somit kann ein in einer Primer-Verlängerungs-Reaktion hergestelles Primer-Verlängerungsprodukt in einem Amplifikations-Verfahren als Start-Nukleinsäure verwendet werden.

Beispiel 2:

Einfluss eines Mismatches zwischen einem ersten Primer und einem Controller auf Strang-Trennung (Controlling-Phase).

Ähnlich wie im ersten Beispiel wurde eine Amplifikations-Reaktion zur Veranschaulichung einer Auswirkung einer Controlling-Phase (Strang-Trennung durch einen Controller) nach einer Synthese-Phase verwendet.

Die Synthese-Phase findet unter Reaktionsbedinungen statt, welche eine Primer-Verlängerungsreaktio an einer Matrize ermöglichen. Zu jeweiligen Strang-Trennung (Controller-Phase) wurden allerdings verschiedene Controller verwendet: Perfekt-Match- und Mismatch-Controller-Oligonukleotid zum verwendeten Primer während der Synthese-Phase. Um den Effekt eines solchen einzelnen Mismatches zwischen einem ersten Primer und einem Controller zu demonstrieren, wurden wiederholten Primer-Verlängerungsreaktionen (Synthese-Phasen) und Controlling-Phasen unter zyklischen Temperaturbedingungen durchgeführt. Es resultierte somit eine Amplifikation von einem ersten Primer-Verlängerungsprodukt.

Die Amplifikation diente dabei als Detektions-Methode für die Controlling-Phase: nur wenn Strang-Trennung erfolgreich verlaufen kann und das zweite Primer-Oligonukleotid an das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes binden kann, findet eine Amplifikation statt. Aufgrund einer hohen Sensitivität dieser Methode (wegen exponentiellen Charakters) und einer Quantifizierungs-Möglichkeit (Zeit-Abhänigkeit von Signal-Detektion je nach Konzentration) wurde Amplifikation als Detektions-Methode für eine erfolgreiche bzw. nicht erfolgreiche Strang-Trennung während einer Controlling Phase verwendet. Das Real-Time-Monitoring der Synthese von entstehenden Amplifikationsprodukten erfolgte in diesem Beispiel mit dem interkalierenden Farbstoff Eva Green.

Folgende Matrize wurde verwendet:

• Matrize (SEQ ID NO) mit Sequenzzusammensetzung, welche zu einem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mit einer Perfekt-Match-Übereinstimmung mit dem Controller-Oligonukleotid führt:

 M2SF5-M001-200
 5' GCT CATA CTACAATGTCA CT TA CTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA
 GGAATACAGGTA AAAAA 3'

Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen. Das zweite Primer-Oligonukleotid bindet an das Reverse-Complement der doppelt unterstrichen Sequenz.

Folgende Primer wurden verwendet:

Das erste Primer-Oligonukleotid (SEQ ID NO:2), diente als Primer-Verlängerungsprimer und als Amplifikations-Primer.

 P1F5-200-AE2053
 5' AACTCAGACAAGATGTGATTTTTTTACCTGTAT [CUCU GAUGCUUC] 1TACCTGTATTCC 3'

Der als Primer in der Reaktion verwendetes Segment ist unterstrichen.

Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:

1= C3-Linker diente zur Terminierung der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.

• Das zweite Primer-Oligonukleotid (SEQ ID NO XW) - diente als zweiter Amplifikations-Primer:

 P2G3-5270-7063
 5' CTACAGAACTCAGACAAGATGTGAACTACAATGTT 6
 GCTCATACTACAATGTCACTTACTGTAAGAGCAGA 3'

Modifikationen:

6 = HEG-Linker

Sowohl erster Primerals auch zweiter Primer sind in der Lage, eine Amplifikation mit einem perfekt-match Controller-Oligonukleotid zu unterstützen.

Folgendes Perfekt-Match-Controller-Oligonukleotid (SEQ ID NO:4) wurde verwendet:

 AD-F5-1001-503
 5' [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]AGGTAGAAGCATC AGAG X
 3'

Modifikationen:

Folgendes Mismatch-Controller-Oligonukleotid (SEQ ID NO XU) wurde verwendet:

MD2AD-F5-011-5
 5'- GCTC TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTG [GAC AGGC AA AGAAUACAGG] TA
 GAAGCATC AGAG X 3'

Das mittlere Segment des Oligonukleotids [GAC AGGC AA AGAAUACAGG] umfasste 2'-O-Me-Nukleotid-Modifikationen:

Modifikationen:

Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft. Das 3'-Ende ist mit einer Phosphat-Gruppe blockiert, um eine mögliche Verlängerung durch die Polymerase zu verhindern.

Im Mismatch Controller-Oligonukleotid wurde in der Position -24 (vom 3'-Ende) wurde ein A-Nukleotid (Mismatch-Variante) anstatt eines G-Nukleotides (perfekt Match Variante) eingesetzt. Das Nukleotid ist durch Fettschrift hervorgehoben. Diese Position bildet ein Mismatch mit dem 3'-Terminalen Nukleotide des eingesetzten ersten Primers.

Die Matrize wurde in Konzentrationen von 1-3 pmol/l eingesetzt. In der Kontroll-Reaktion wurde keine Matrize eingesetzt (= Negativkontrolle). Primer 1 wurde mit 5 µmol/l, das jeweilige Controller-Oligonukleotid mit 2 µmol/l und Primer 2 mit 1 µmol/l eingesetzt.

Die weiteren Reaktionsbedingungen waren:

• Amplifikations-Lösung 2
• Um die Anwesenheit von genomischer DNA im Assay nachzustellen wurden pro Reaktion 100 ng frisch denaturierte Fisch-DNA (Lachs-DNA) zugegeben.

Die Synthese-Phase der Primer-Verlängerungs-Reaktion des ersten Primers fand in erster Linie bei 55°C statt. Bei dieser Temperatur lag der Controller in Komplex mit dem ersten Primer und war damit in einem nicht-aktiven Zustand. Die Controlling-Phase fand bei 65°C statt. Bei dieser Temperatur dissoziierte der Controller zumindest teilweise vom ersten Primer-Oligonukleotid und konnte somit mit gebildeten Primer-Verlängerungsprodukten interagiren. Die Schmelztemperatur des ersten Bereichs des ersten Primers mit seiner Primer-Bindungsstelle an der Matrize betrug ca. 45°C in Amplifikations-Lösung 2. Somit wurde Synthese-Phase bei einer Reaktions-Temperatur von etwa Tm +10°C durchgeführt, bezogen auf Tm von Matrize / erster Primer-Komplex. Aufgrund einer höheren Konzentration des ersten Primers (5 µmol) lag in der Synthese-Phase genügende Menge des ersten Primers frei, um an die Matrize zu binden und die Reaktion zu starten. Bei Erhöhung der Temperatur auf 65°C sank die Ausbeute der Synthese-Phase signifikant. Bei dieser Temperatur wurde Controller aus seiner Bindung mit dem Primer teilweise freigesetzt (Tm des Komplexes umfassend erstes Primer und Controller in Amplifikations-Lösung 1 betrug 63°C). Daher verlief die Controlling Phase bei ca. Tm +2°C. bezogen auf Tm von Controller/ erster Primer - Komplex).

In der Amplifikation waren die thermischen Reaktionsbedingungen zyklisch, alternierende Temperaturänderungen, wobei jeweils auf ein 1 min Zeitintervall bei 55 °C ein 5 min Zeitintervall bei 65°C folgte. Die Amplifikation wurde typischerweise über 120 Zyklen, d.h. 120 × (1 min 55°C + 5 min 65°C) = 120 × 6 min = 12 h verfolgt. Die erfolgreiche Amplifikation konnte durch einen Anstieg des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit festgestellt werden.

Analyse der Primer-Verlängerungs-Reaktion (und Amplifikationsreaktion)

Zur Analyse der Amplifikationsreaktion und zur Bewertung der entstandenen Amplifikationsprodukte wurden folgende Techniken genutzt:

• Fluoreszenzsignal eines interkalierenden Farbstoffes (EvaGreen)
• Schmelzkurvenanalyse von den entstandenen Amplifikationsprodukten

32 A zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe einer Allel-spezifischen Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines Perfekt-Match-Controller-Oligonukleotids. Auf der Y-Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Pfeil 1 markiert in 32 A einen Perfekt-Match-Amplifikationsansatz. Aufgrund des Perfekt-Match-Controller-Oligonukleotids kann die Matrize amplifiziert werden und es kommt ab Zyklus 27 zu einem Anstieg des Fluoreszenzsignals. Pfeil 2 markiert einen Negativkontrolle-Ansatz, der keine Matrize enthält und daher im Laufe des Experiments auch kein Amplifikationssignal generiert.

32 B zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe einer Allel-spezifischen Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines Mismatch-Controller-Oligonukleotids. Auf der Y-Achse ist das Fluoreszenzsignal des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Pfeil 1 markiert einen Mismatch-Amplifikationsansatz. Aufgrund des Mismatch-Controller-Oligonukleotids kann die Matrize nicht amplifiziert werden. Pfeil 2 markiert einen Negativkontrolle-Ansatz, der keine Matrize enthält und daher im Laufe des Experiments auch kein Amplifikationssignal generiert. Das Fluoreszenzsignal von Mismatch-Controller-Oligonukleotid-Ansatz und Negativkontrolle sind nahezu deckungsgleich, was zeigt, wie stark die Amplifikation in der Mismatch-Situation unterdrückt wird.

32 C zeigt die Schmelzkurven der Allel-spezifischen Amplifikationsprodukte aus 32A und 32 B. Auf der Y-Achse ist die Ableitung des Fluoreszenzsignals gegen die Temperatur und auf der X-Achse ist die Temperatur aufgetragen. Es wurden zwei charakteristische Peaks gefunden, markiert mit Pfeil 1 und 2. Der Peak bei Position 1 mit einem Schmelzpunkt in der Nähe von 65 °C gehört zum Mismatch-Controller-Oligonukleotid-Ansatz. Der Signalverlauf ist nicht von Negativkontroll-Ansätzen (= Amplifikationsreaktion ohne Matrize) zu unterscheiden. Dem gegenüber zu stellen ist der Peak bei Position 2 mit einem Schmelzpunkt in der Nähe von etwa 85 °C. Dieser Peak gehört zum Perfekt-Match-Controller-Oligonukleotid-Ansatz und ist spezifisch für das gebildete Amplifikationsprodukt. Die Ergebnisse legen nahe, dass in der Perfekt-Match-Situation spezifische Amplifikationsprodukte mit einem definierten Schmelzpunkt in der Nähe von etwa 85 °C entstehen. Dagegen wird bei Mismatch-Controller-Oligonukleotiden die Amplifiktionsreaktion unterdrückt. Die Fluoreszenzsignale der Mismatch-Controller-Oligonukleotid-Ansätze waren in diesem Beispiel nicht von der Negativ-Kontrolle zu unterscheiden. Dies zeigt wie stark die Amplifikationsunterdrückung in der Mismatch-Situation ist.

Zusammenfassend wird festgehalten: ein Nukleotid-Mismatch im Controller-Oligonukleotid positioniert im zweiten Bereich des Controller-Oligonukleotides zum korrespondierenden ersten Bereich des Primers kann bei eine Amplifikation verhindern.

Ausgehend von diesem Beispiel kann man erkennen, dass Sequenz-Varianten-spezifische Amplifikations-Systeme umfassend ein Sequenz-Variante-spezifsichen Primer und einem entsprechenden komplementären Sequenz-Variante -spezifisches Controller-Oligonukleotid zusammengestellt werden können.

Beispiel 3

Primer Verlängerungs-Reaktion unter Verwendung einer Matrize und Block-Oligonukleotiden mit LNA-Modifikationen zu einer Begrenzung einer Primer- Verlängerungsreaktion.

In diesem Beispiel wird Verwendung humaner genomischer DNA (hgDNA) als Quelle einer Zielsequenz gezeigt, wobei die Primer-Verlängerungsreaktion unter Verwendung von einem ersten Primer-Oligonukleotid und einem Controller-Oligonukleotid durchgeführt wird. Zur Begrenzung des Synthese-Fortschrittes wurden Block-Oligonukleotide verwendet, welche komplementär an den Matrizen-Strang in 3'-Richtung von Primer vor dem Start einer Primer-Verlängerungsreaktion durch Hybridisierung gebunden wurden. Die Synthese wurde für 15 min bei 55°C durchgeführt. Während dieser Synthese-Phase bindet der erste Primer-Bereich an die Primer-Bindungsstelle in der Matrize und wird von der Polymerase verlängert, so dass dabei ein Primer-Verlängerungsprodukt resultiert. Der Controller wurde vor Beginn der Primer-Verlängerungsreaktion zugegeben und lag im doppelsträngigen Komplex mit dem Primer während dieser Synthese-Phase in einer nicht-aktiven Form im Ansatz vor.

Nach Abschluss der Synthese-Phase wurde die Reaktionstemperatur auf 65°C für 5 min erhöht, so dass Komplex umfassend den Controller und Primer bei dieser Temperatur dissoziieren konnte und der Controller nun mit dem während der Synthese-Phase gebildeten Primer-Verlängerungsprodukt interagieren konnte und es vom Matrizen Strang trennen konnte.

Als Zielsequenz wurde ein Sequenzsegment des Faktor-V-Leiden Genes (Homo sapiens coagulation factor V (F5), mRNA, hier als FVL-Gen bezeichnet) gewählt.

Zielsequenz:

 5'

 TGACGTGGAC ATCATGAGAG ACATCGCCTC TGGGCTAATA GGACTACTTC TAATCTGTAA
 GAGCAGATCC CTGGACAGGC AAGGAATACA GGTATTTTGT CCTTGAAGTA ACCTTTCAGA
 3'

Die Bindungssequenz für das erste Primer-Oligonukleotid ist unterstrichen (Primer-Bindungsstelle). Die Bindungsstelle für das Block-Oligonukleotid ist doppel-unterstrichen.

Das Block-Oligonukleotid:

 P1-EXB-1000-101
 5' {CCA GAGGCGATG}T ATCTCATGAT GTCCACAACA CTGTAGTATG GTCTTGTTAA
 GCAAAAA 3' X

Sequenzsegment {CCA GAGGCGATG} umfasste LNA-Modifikationen.

Der erste Primer sowie Controller-Oligonukletid wurden für FVL-Mutation Variante des Genes designet und synthetisiert.

Das erste Primer-Oligonukleotid (SEQ ID NO:2):

P1F5-200-AE2053
 5' AACTCAGACAAGATGTGATTTTTTTACCTGTAT [CUCU GAUGCUUC] 1TACCTGTATTCC 3'

Der als Primer in der Reaktion verwendetes Segment ist unterstrichen.

Dieses Oligonukleotid umfasst folgende Modifikationen:

Segment des Primers [CUCU GAUGCUUC] umfasste 2'-0-Me-Modifikationen und diente als zweiter Primer-Bereich zur Bindung des ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides: Diese Sequenz kann nicht an die Matrize im Bereich neben der Primer-Bindungs-Stelle komplementär binden und steht somit für die Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid zur Verfügung.

Der erste Primer umfasst in seinem ersten Bereich eine Sequenz, welche spezifisch an die Sequenz des Faktor-V-Leiden Genes innerhalb der genomichen DNA binden kann, so dass eine Synthese durch eine Polymerase gestartet werden kann. Der zweite Bereich des ersten Primers umfasst eine Sequenz, welche nicht an die Sequenz von FVL-Genes spezifisch hybridisiert. Weiterhin umfasst der erste Primer ein weiteres Sequenzsegment, welches an das 5'-Ende des zweiten Bereichs anknüpft. Dieses Segment nimmt an der spezifischen Primer-Verlängerung des Faktor-5-Leiden Segments nicht teil. Die Funktion dieses Segments wird vor allem in der Verzögerung von Nebenreaktionen gesehen.

Folgendes Controller-Oligonukleotid (SEQ ID NO:) wurde verwendet:

 AD-F5-1001-503
 5' [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]AGGTAGAAGCATC AGAG X
 3'

Modifikationen:

Die Nukleotide und Nukleotid-Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft. Das 3'-Ende des Controller-Oligonukleotdies ist mit einer Phosphat-Gruppe blockiert, um eine mögliche Verlängerung durch die Polymerase zu verhindern. Dieser Controller kann mit seinem Segment an das erste zu erwartende Primer-Verlängerungsprodukt komplementär binden:

 [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]AGGTA

Controller-Oligonukleotid wurde dermassen konstruiert, dass eine Perfekt-Match-Situation zur Sequenz der Faktor-V-Leiden Mutation des FVL-Gens resultiert. Das Controller-Oligonukleotid umfasst einen ersten, zweiten und dritten Bereich.

Alle Reaktionen wurden in Amplifikations-Lösung 2 durchgeführt.

Die verwendeten dNTPs umfassten: dATP, dGTP, dCTP, dUTP (anstatt von dTTP).

Als Polymerase wurde Bst 2.0 Warm-Start Polymerase von NEB verwendet.

Primer-Verlängerungsreaktion wurde wie folgt angesetzt:

Etwa 50000 haploider genom Äquivalente (HGE), 150 ng hgDNA in 40 µl, FVL-WHO-Standard, doppelsträngig, wurden im Reaktions-Lösung 2 in Kontakt mit einem Block-Oligonukleotid (0,3 µmol/l) gebracht und durch Erhitzung zunächst denaturiert (5 min bei 95°C) und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt.

Anschließend wurden in die Reaktion der erste Primer (2 µmol/l) zusammen mit Controller-Oligonukleotid (1 µmol/L) zugegeben und anschließend Bst-2.0 Warm Start Polymerase (etwa 1 unit), sowie dNTPs (ca. 250 µmol/l) gegeben und das Reaktionsvolumen auf 50 µl gebracht. Das resultierende Reaktions-Gemisch wurde unter stringenten Primer-Verlängerungsbedingungen (Amplifikationslösung 2, Temperatur von etwa 55°C) für ca. 15 min inkubiert. Während dieser Phase erfolgt eine Verlängerung des ersten Primers, wobei die genomische DNA als Matrize diente. Es resultierte ein Primer-Verlängerungsprodukt. Da während dieser Phase das Controller-Oligonukleotid vom ersten Primer komplexiert wird (und somit in einem inaktiven Zustand vorliegt), lag das gebildete Primer-Verlängerungsprodukt im doppelsträngigen Komplex mit der Matrize. Um dieses Produkt von der Matrize sequenzspezifisch abzulösen, wurde das Reaktionsgemisch auf 65°C erhitzt und ca. 5 min inkubiert. Während dieser Phase wurde das Primer-Verlängerungsprodukt aus der Bindung mit der Matrize durch den Controller zumindest teilweise verdrängt. Das 3'-Segment des Primer-Verlängerungsproduktes dissoziierte spontant unter gewählten Reaktionsbedinungen. Ein solches Primer-Verlängerungsprodukt kann beispielsweise in einer nachfolgenden Amplifikations-Reaktion in Analogie zum Beispiel 1 verwendet werden.

Eine solche Anordnung von Block-Oligonukleotiden an einer Matrize und somit eine Begrenzung der Länge eines Primer-Verlängerungsproduktes kann beispielsweise bei Bereitstellung eines Nukleinsäure-Fragmentes verwendet werden, welches als Start-Nukleinsäure in einer spezifischen exponentiellen Amplifikation verwendet werden soll. Zwar kann eine solche Start-Nukleinsäure als Primer-Verlängerungs-Reaktion auch ohne eines Block-Oligonukleotides erfolgen (33 A und B). Die undefinierte Länge eines Primer-Verlängerungsfragmenten, welches beim Kopieren des Matrizenstranges dabei entstehen kann, kann allerdings eine sequenz-unspezifische, z.B. eine temperatur-bedingte Strang-Trennung erforderlich machen (33 C). Die Bindung eines zweiten Amplifikations-Primers erfolgt dabei im mittleren Bereich eines solchen Primer-Verlängerungsproduktes (33 C und D).

Verwendung eines Block-Oligonukleotides erlaubt dagegen eine beinahe willkürliche spezifische Begrenzung der Länge eines Primer-Verlängerungsproduktes, ungeachtet der Länge eines Matrizenstranges (34 A und B). Weiterhin begünstigt das Block-Oligonukleotid eine sequenzabhängige Trennung von gebildeten Primer-Verlängerungsprodukten bereits vor Beginn einer Amplifikation. Dabei erfolgt beispielsweise zunächst eine Synthese-Phase einer Primer-Verlängerung und anschließend eine Controlling-Phase (Sequenzielle Anordnung von Schritten). In einer anderen Ausführungsform kann Synthese-Phase und Controlling-Phase mit der Trennung des Primer-Verlängerungsproduktes in einem Schritt ablaufen und parallel zu einander stattfinden).

Im Ergebnis wird ein spezifisches Primer-Verlängerungsprodukt erzeugt und sequenzspezifisch von der Matrize unter Mitwirkung eines Controllers getrennt, ohne dabei ein unspezifischen Denaturierungs-Schritt einsetzten zu müssen (34 B und C). Ein solches Primer-Verlängerungsprodukt kann als Start-Nukleinsäure für weitere Amplifikation verwendet werden (34 D und E). Dadurch kann die Spezifität der Erstellung einer Start-Nukleinsäure erhöht werden.

Das Block-Oligonukleotid dient vorzugsweise selbst nicht als Primer. Das kann beispielsweise durch Blockade seiner 3'-OH Gruppe erfolgen. Das Block-Oligonukleotide umfasst somit mindestens ein Sequenzsegment, welches zum Matrizen-Strang komplementär ist, an welchem auch die Primer-Verlängerungs-Reaktion erfolgt. Dieses Segment (Blockierendes Segment) ist vorzugsweise hinreichend lang bzw. umfasst ggf. Modifikationen, um bei Reaktionsbedingungen einer Primer-Verlängerungsreaktion mit dem Matrizenstrang einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Weiterhin kann ein solches Block-Oligonukloetid auch Sequenzen-Segmente umfassen, welche nicht um Matrizen-Strang komplementär sind. Solche Sequenzsegmente können beispielsweise das Segment, welches an die Matrize binden soll und Primer-Verlängerungs-Reaktion blockieren soll, auf beiden Seiten flankieren. Das Block-Oligonukleotid kann beispielsweise in einem Sequenzsegment einer Zielnukleinsäure lokalisiert sein oder an einem ihren Enden platziert werden. Das Block-Oligonukleotid ist somit dermassen angeordnet, dass es in 3'-Richtung vom zu erwartenden Primer-Verlängerungsprodukt an der Matrize lokalisiert ist und die Polymerase am weiteren Kopieren des Matrizenstranges hindert.

Das Ziel einer Primer-Verlängerngsreaktion kann die Herstellung einer Start-Nukleinsäurekette für eine anschließende Amplifikations-Reaktion darstellen. Eine solche Start-Nukleinsäurekette wird zu Beginn einer Amplifikations-Reaktion eingesetzt. Ihre Funktion kann dahingehend gesehen werden, dass sie die anfängliche Matrize darstellt, welche eine korrekte Positionierung von Primern, der Synthese-Abschnitte zwischen beiden Primern, sowie die Initiierung von Bindungs- und Verlängerungsvorgängen ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Start-Nukleinsäurekette eine Zielsequenz.

Durch Bindung von Primern an ihre entsprechenden Primer-Bindungsstellen (PBS 1 und PBS 2) und Initiierung von entsprechenden Primer-Verlängerungsreaktionen erfolgt durch Generierung von ersten Primer-Verlängerungsprodukten. Diese werden als spezifische Kopien der zu Begin der Reaktion vorliegenden Nukleinsäurekette synthetisiert.

In einer Ausführungsform kann diese in das Reaktionsgemisch vor Beginn der Amplifikatons-Reaktion einzusetzende Nukleinsäurekette (Start-Nukleinsäurekette) mit der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette identisch sein. Durch die Amplifikations-Reaktion wird lediglich die Menge einer solchen Nukleinsäurekette vermehrt.

In einer weiteren Ausführungsform unterscheiden sich die zu amplifizierende Nukleinsäure und die Start-Nukleinsäurekette dahingehend, dass die Start-Nukleinsäurekette zwar die Anordnung einzelner Sequenzelemente der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette vorgibt, doch kann die Sequenzzusammensetzung der Start-Nukleinsäurekette von der Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette abweichen. Beispielsweise können im Rahmen der Primer-Bindung und Verlängerung während einer Amplifikation neue Sequenzinhalte (bezogen auf Start-Nukleinsäurekette) in die zu amplifizierende Nukleinsäurekette integriert werden. Weiterhin können sich Sequenzelemente einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette von solchen Sequenzelementen einer Start-Nukleinsäurekette in ihrer Sequenzzusammensetzung unterscheiden (z.B. Primer-Bindungsstellen oder Primer-Sequenzen). Die Start-Nukleinsäure dient nur als initiale Matrize für die spezifische Synthese der zu amplifizierenen Nukleinsäurekette. Diese initiale Matrize kann im Reaktionsgemisch bis zum Ende der Amplifikation verbleiben. Durch den exponentiellen Charakter der Amplifikation überwiegt allerdings die Menge der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette am Ende einer Amplifikationsreaktion die Menge einer in die Reaktion zugegebenen Start-Nukleinsäurekette.

Die Start-Nukleinsäurekette umfasst in einer Ausführungsform eine Zielsequenz oder ihre Teil-Segmente, welche zumindest eine zu erwartende Sequenz-Variante eines polymorphen Lokus der Zielsequenz umfassen.

Eine Start-Nukleinsäure umfasst weiterhin zumindest ein vorwiegend einzelsträngiges Sequenzsegment, zu weilchem mindestens eines der Primer des Amplifikations-Systems mit seinem 3'-Segment vorwiegend komplementär binden kann, so dass verwendete Polymerase einen solchen Primer, wenn hybridisiert an die Start-Nukleinsäurekette, matrizenspezifsiche unter Einbau von dNTPs verlängern kann.

Eine Start-Nukleinsäure, welche mehrere Sequenzvarianten in einem polymorphen Lokus einer Zielsequenz umfassen kann, umfasst vorzugsweise weiterhin mindestens ein erstes Zielsequenzsegment, welches für alle Zielsequenzvarianten charakteristisch und einheitlich ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Start-Nukleinsäure mindestens zwei Zielsequenzsegmente (ein erstes Zielsequenzsegment und ein zweites Zielsequenzsegment), welche auf beiden Seiten eines polymorphen Lokus einer Zielsequenz lokalisiert sind und somit die Sequenzvarianten einer Zielsequenz von beiden Seiten flankieren.

Die Länge eines polymorphen Lokus einer Start-Nukleinsäureke kann Bereiche von einem Nukleotid bis zu 200 Nukleotiden, besser von einem Nukleotid bis zu 50 Nukleotiden, bevorzugt von einem Nukleotid bis zu 20 Nukleotiden umfassen. Die Längen von einheitlichen Sequenzsegmenten (erstes und zweite einheitliches Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäure) kann zumindest für eines der beiden einheitlichen Sequenz-Segmente folgende Bereiche umfassen: von 4 bis 200 Nukleotide, besser von 6 bis 100 Nukleotide, bevorzugt von 8 bis 50 Nukleotide.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Start-Nukleinsäurekette mindestens einen Sequenzabschnitt umfassen, welcher nicht amplifiziert wird. Eine solche Start-Nukleinsäurekette ist somit nicht mit der zu amplifizierenden Sequenz identisch. Solche nicht zu amplifizierenden Abschnitte können beispielsweise als Folge von Sequenzvorbereitungsschritten bzw. als Folge von vorangegangenen Sequenz-Manipulations-Schritten einen Sequenzabschnitt einer Start-Nukleinsäurekette repräsentieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die in das Reaktionsgemisch vor Beginn der Reaktion einzusetzende Start-Nukleinsäurekette mindestens eine Zielsequenz ein.

In einer weiteren Ausführungsform schließt eine solche Start-Nukleinsäurekette mindestens eine Zielsequenz (engl. Target-Sequence) und noch weitere Sequenzen ein, welche nicht Zielsequenz (engl. Non-target Sequences) sind. Während der Amplifikation werden Sequenzsegmente umfassend die Zielsequenz exponentiell vermehrt und andere Sequenzsegmente werden dabei entweder gar nicht oder nur teilweise exponentiell vermehrt.

Aufbau einer Start-Nukleinsäurkette

Beispiel für eine solche Start-Nukleinsäurekette stellt eine Nukleinsäurekette dar, welche eine Zielsequenz einschließt und welche ein Sequenzfragment-A umfasst und ein Sequenzfragment-B umfasst.

Das Sequenzfragment-A der Start-Nukleinsäurekette umfasst eine Sequenz, die mit der Sequenz eines der beiden in der Amplifikation verwendeten Primer eine signifikante Homologie aufweist oder im Wesentlichen mit dem kopierbaren Anteil des 3'-Segments des einen Primers identisch ist. Bei Synthese eines komplementären Stranges zu diesem Segment wird eine komplementäre Sequenz generiert, welche eine entsprechende Primer-Bindungs-Stelle darstellt.

Das Sequenzfragment-B der Start-Nukleinsäurekette umfasst eine Sequenz, welche zur komplementären Bindung eines entsprechenden weiteren Primers oder seines 3'-Segmentes unter Ausbildung eines extensionsfähigen Primer-Matrizen-Komplexes geeignet ist, wobei Sequenzfragment-A und Sequenzfragment-B im Verhältnis zu einander vorwiegend / bevorzugt nicht komplementär sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird zum Reaktionsgemisch eines Amplifikationsverfahrens eine Start-Nukleinsäurekette gegeben, welche folgende Eigenschaften aufweist:

• Sequenzsegment-5 (genannt Segment 5,S5 in 34), welches eine Sequenz umfasst, die mit der Sequenz des ersten Bereichs des ersten Primers eine signifikante Homologie aufweist oder im Wesentlichen mit dem kopierbaren Anteil des ersten Bereichs des ersten Primers identisch ist. Dieses Segment-5 liegt im 5'-Segment der Start-Nukleinsäurekette und ist von einem nicht kopierbaren Oligonukleotid-Schwanz flankiert (analog zum ersten Primer-Oligonukleotid), vorzugsweise bildet dieses Segment - 5 eine Begrenzung des kopierbaren Nukleinsäurekette-Stranges in 5'-Richtung.
• Das Sequenzfragment-7 (genannt Segment 7, S7), welches eine Sequenz umfasst, welche zur komplementären Bindung eines zweiten Primers oder seines 3'-Segmentes unter Ausbildung eines extensionsfähigen Primer-Matrizen-Komplexes geeignet ist. Vorzugsweise liegt das Segment 7 stromabwärts vom Segment 5.
• Zielsequenz , welche teilweise oder ganz zwischen Segment 5 und Segment 7 liegt (in 34 dieser Anteil der Zielsequenz wird als Segment 6, S6, bezeichnet). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zielsequenz mindestens eines von Segment 5 und / oder Segment 7.
• Start-Nukleinsäurekette kann im 3'-Segment flankierende Sequenzabschnitte umfassen (in 33 als Segment 8 bezeichnet), welche nicht amplifiziert werden.

Funktionsweise der Start-Nukleinsäurekette

Zu Beginn der Amplifikations-Reaktion dient die Start-Nukleinsäurekette als Matrize für initiale Entstehung von jeweiligen Primer-Verlängerungsprodukten. Sie stellt somit die Ausgangs-Matrize für die zu amplifizierende Nukleinsäurekette dar. Die Start-Nukleinsäurekette braucht nicht zwingend mit der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette identisch zu sein. Durch Bindung und Verlängerung von beiden Primern während der Amplifikations-Reaktion bestimmen im Wesentlichen die beiden Primer, welche Sequenzen an beiden endständigen Segmenten der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette im Rahmen der Amplifikation generiert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden für einen Doppelstrang nichtdenaturierenden Reaktions-Bedinungen während des exponentiellen Amplifikationsvorgangs aufrechterhalten. Daher ist es vorteilhaft, wenn Start-Nukleinsäurekette eine Begrenzung in ihrem durch eine Polymerase verlängerbaren 5'-Sequenzsegment aufweist, was zu einem Stopp in der enzymatischen Verlängerung eines entsprechenden Primers führt. Damit wird die Länge der unter Reaktionsbedinungen generierten Primer-Verlängerungsfragmente begrenzt. Das kann sich vorteilhaft auf Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotid auswirken und zu einer Dissoziation des jeweiligen Stranges führen, so dass Primer-Bindungsstellen in einzelsträngigen Zustand überführt werden und somit für eine erneute Bindung von Primern zugängig werden.

Beispiel 4

Einfluss eines Controller-Oligonukleotide auf Primer-Verlängerungs-Reaktion bei einer parallel stattfindenden Synthese-Phase und Controlling-Phase:

Die Reaktionen wurden in der Amplifikations-Lösung 2 durchgeführt.

Folgende Matrizen wurden verwendet (DNA-Matrizen):

 P1Ex-400-4001 

 C TTACAG TAAGTGACATTGTAG TATG AGC GATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA A 3'

P1EX-400-4002
 C TTACAG TAAGTGACATTGTAG TATG AGC GATCC CTGGACAGGC AA GAATACAGGTA A

 P1EX-400-4003
 C TTACAG TAAGTGACATTGTAG TATG AGC GATCC CTGGACAGGC AA AATACAGGTA A

 P1EX-400-4004
 C TTACAG TAAGTGACATTGTAG TATG AGC GATCC CTGGACAGGC AA GGAATAAAGGTA A

 P1EX-400-4005
 C TTACAG TAAGTGACATTGTAG TATG AGC GATCC CTGGACAGGC AA AGAATACAGGTA A

DNA-Matrizen mit Iso-dC

 P1EX-400-4201
 C TTACAG TAAGTGACATTGTAG TATG AGC GATCC CTGGACAGGC AA 1GAATACAGGTA A

 P1EX-400-4202
 C TTACAG TAAGTGACATTGTAG TATG AGC GATCC CTGGACAG1C AA GGAATACAGGTA A

1 = 5-Me-Iso-dC (Nukleotid kann nur mit Iso-dG eine komplementäre Nukleobase bilden. Es bildet keine „typische Watson-Crick“ Basenpaarung mit einem der verwendeten dNTP's, so dass Überwindung dieser Position nur Mismatch-Bildung erfoglen kann).

Die Matrizen wurden dermassen in ihrer Sequenzzusammensetzung variiert, so dass daraus resultierende Primer-Verlängerungsprodukte unterschiedlich mit dem Controller-Oligonukleotid interagieren können. Je nach Sequenzzusammensetzung der Matrize konnte somit entweder eine perfekt-match Übereinstimmung oder auch Mismatch im Komplex aus Primer-Verlängerungsprodukt / Controller generiert werden.

Zur Testung eines Polymerase-Fehlers wurden Matrizen verwendet, welche an bestimmten Positionen ein Iso-dC einschließen. Da dieses Nukleotid kein natürliches Korrelat umfasst, muss eine Polymerase ein Mismatch generieren und erst bei Überwindung dieses Mismatches kann die Verdrängung der Sonde (s.u.) stattfinden. Somit repräsentieren Matrizzen mit Iso-dC ein Beispiel für die Primer-Verlängerungs-Reaktionen, welche unter einer Mismatch-Bildung (z.B. infolge eines Polymrease-Fehlers) entstehen. Matrizen mit Iso-dC sollen lediglich die Änderungen im Verhalten der Primer-Verlängerungs-Reaktionen veranschaulichen und den Einfluss von Controller auf das Verhalten der Polymerasen / Synthese von komplementären Strängen.

Folgende Primer wurden verwendet:

 SEQP1F5 300-35X 

 5 AC GAAG CTCGCAAGAAC TCAG AG TGTG CTCGAC AC TACCTGTATTCC 3'

Erster Primer-Bereich ist unterstrichen. Mit diesem Segment kann der Primer an pefektmatch Templates binden.

Dieser Primer umfasst kein Segment, welches mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides interagieren kann. Somit kann ein Controller-Oligonukleotid bei Verlängerung dieses Primers das gebildete Primer-Verlängerungsprodukt nicht vom Matrizenstrang trennen.

 P1F5-001-1003
 5' TMR - [CU GAUGCUUC] 1 TACCTGTATTCC 1 = C3-LINKER

Segment [CU GAUGCUUC] umfasste 2'-O-Me-Modifikationen und stellte den zweiten Bereich des Primers dar.

A = (2'-O-Methyl-Adenosine)
G = (2'-O-Methyl-Guanosine)
C = (2'-O-Methyl-Cytosine)
U = (2'-O-Methyl-Uridine)
TMR = Tetramethyl-Rhodamin am 5'-Ende

Folgendes Controller-Oligonukleotid wurde verwendet:

 AD-F5-1001-503
 5' [UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]AGGTAGAAGCATC AGAG X
 3'

Modifikationen:

Das Controller-Oligonukleotid kann in diesem Beispiel mit bestimmten primer-Verlängerungsprodukten ein perfekt-match bilden. Mit anderen Primer-Verlängerungsprodukten kann es ein Mismatch bilden.

Zur Überwachung des Fortschrittes der Primer-Verlängerungs-Reaktiion wurde eine Fluoreszenz-Sonde verwendet, welche an das 5'-Segment der verwendeten Matrizen binden kann. Bei Verdrängung dieser Sonde aus der Bindung mit diesem 5'-Segment der jeweiligen Matrize kommt es zu Minderung des Signals der Sonde (Intramolekulares Quenchinng zwischen dT-BHQ1 und FAM-Reporter)

Fluoreszenz-Sonde:

 P2D-LUX-1000-101
 FAM- 5' TAGTATGAGC TTTT 1 GCTCATAC2ACAATGTCACTTA CTGTAA GAGCAGA

1 = HEG
2 = dT-BHQ1

Die Sonde wurde in 0,2 µmol/L Konzentration verwendet. Die Matrizen wurden in Konzentration von 0,5 µmol/l verwendet, die Primer wurden in 1 µmol/l Konzentration eingesetzt und Controller (wenn verwendet, wie indiziert) wurden bei 2 µmol/l verwendet. Bst-2.0 Warm-Start (NEB) wurde in Konzentration eingesetzt 4 Units /10 µl.

Die Reaktionen wurden in StepOne Plus Gerät durchgeführt bei Temperatur von 55°C. Die Signal-Detektion erfolgte via FAM-Kanal. Die Reaktion wurde kontinuierlich überwacht (Sampling-Interval = 10 sec). Als Kontrolle der Signal-Intensität dienten zum einen Reaktions-Ansätze ohne Polymerase (aber mit allen anderen Komponenten) oder alternativ mit Polymerase aber ohne Matrize.

Die Tm von PBS (perfekt match) der Matrize mit dem ersten Bereich des Primers betrug ca. 45°C. Die Tm von Controller-Oligonukleotid / Primer (P1F5-001-1003) betrug ca. 57°C. Die Reaktionstemperatur der Primer-Verlängerungs-Reaktion war 55°C. Die Reaktion verlief über 100 min.

Die Ergebnisse von einzelnen Reaktionen sind in 36 zusammengefasst.

Die Kinetik einzelner Reaktionen wurde anhand der Veränderung von Fluoreszenzsignal ausgewertet.

Nachfolgend wird die Auswertung von representativen Datensätzen dargestellt:

Reaktion	Matrize	Primer	Controller	Polymerase
1	P1Ex-400-4001	P1F5-001-1003	nein	Ja
2	P1Ex-400-4001	P1F5-001-1003	AD-F5-1001-503	ja
3	P1Ex-400-4001	P1F5-001-1003	nein	nein

Reaktion 1 (36 A): Bei perfekt-match Bindung eines Primers in Abwesenheit eines Controllers erfolgte eine rasche Primer-Verlängerung und Sonden-Verdrängung, so dass bereits bei der ersten Signal-Erfassung mehr als 70% der Sonden vom 5'-Segment der Matrizen abgelöst waren und das Signal stark gemindert war bereits zu Beginn der Messung.

Reaktion 2 (36 A): Bei perfekt-match Bindung eines Primers in Anwesenheit eines Controllers erfolgte ebenfalls eine schnelle Primer-Verlängerung und Sonden-Verdrängung, welche allerdings langsamer verläuft verglichen mit Reaktion 1 ohne Controller.

Reaktion 3 (36 A): diente als Referenz-Signal für Sonde in Abwesenheit einer Polymerase.

Reaktion	Matrize	Primer	Controller	Polymerase
4	P1Ex-400-4001	SEQP1F5 300-35X	nein	Ja
5	P1Ex-400-4001	SEQP1F5 300-35X	AD-F5-1001-503	ja
6	P1Ex-400-4001	SEQP1F5 300-35X	nein	nein

Reaktionen 4 - 6 (36 B) zeigen Reaktionen mit einem Primer, welches nicht mit dem Controller im ersten Bereich interagieren kann (dieser Primer hat keinen zweiten Bereich, welches komplementär an den ersten Bereich des Controllers binden kann). Die Anwesenheit des Controllers scheint keinen detektierbaren Einfluss auf den Verlauf dieser Reaktion zu haben. Bei gewählten Reaktionsbedinungen stört der Controller den Verlauf dieser Reaktion kaum.

Einführung eines Mismatches in Primer-Bindungs-Stelle in der Matrize

Reaktion	Matrize	Primer	Controller	Polymerase
7	P1EX-400-4002	P1F5-001-1003	nein	Ja
8	P1EX-400-4002	P1F5-001-1003	AD-F5-1001-503	ja
9	P1EX-400-4002	P1F5-001-1003	nein	nein

Reaktionen 7 und 8 zeigen, dass das Fehlen eines komplementren Nukleotides in der Matrize (3'-terminales Mismatch) führt zu einer vollständigen Verhinderung der Primer-Verlängerungs-Reaktion (37A). Analoges Reaktionsverhalten wurde bei Matrizen _P1EX-_400-4003, _{P1EX-400-4004,} _{P1EX-400-4005,} _{P1EX-400-4201} beobachet (Fehlen von 2 terminalen Nukleotiden, ein Mismatch in der Mitte von PBS, eine Substitution von G auf A (Mismatch), eine Substitution von G auf Iso-dC). In keiner der Reaktion wurde die Sonde verdrängt. Das zeigt, dass sich die Anwesenheit von Controller-Oligonukleotid nicht negativ auf Diskriminierung auswirkt.

Reaktion	Matrize	Primer	Controller	Polymerase
10	P1EX-400-4202	P1F5-001-1003	nein	Ja
11	P1EX-400-4202	P1F5-001-1003	AD-F5-1001-503	ja
12	P1EX-400-4202	P1F5-001-1003	nein	nein

Reaktion 10 (37 B): Zeigt Überwindung einer Iso-dC-Position in der Matrize in Abwesenheit eines Controllers und Fortsetzunng der Synthese bis zur Verdrängung der Sonde unter Verwendung eines ersten Primer-Oligonukleotides (P1F5-001-1003). Man sieht zwar eine verzögerte Reaktionskinetik (Verdrängung der Sonde erfolgt wesentlich langsamer, als bei perfekt-Match Matrize), dennoch kann ein komplementäres Primer-Verlängerungsprodukt in guten Ausbeuten synthetisiert weren (Sonde wurde verdrängt).

Reaktion 11 (37 B): Zeigt Einfluss des in der Reaktion anwesenden Controllers: Die Überwindung der Mismatch-Position gelingt wesentlich langsamer. Dies wird damit in Verbindung gebracht, dass das während der Reaktion entstehendes Primer-Verlängerungsprodukt während der Reaktion abgelöst werden kann und bindet mit dem Controller einen Komplex, welches eine höhere Tm hat, als Primer / Controller-Complex. Das vorzeitig abgelöste, nicht vollständiges Primer-Verlängerungsprodukt verbleibt bevorzugt im Komplex mit Controller und wird damit aus der Reaktion entzogen („Trapping“ von unvollständigen Primer-Verlängerungsprodukten). Damit wird verhindert, dass Polymerase das Iso-dC Nukleotid überwinden kann. Die Anwesenheit des Controllers übt somit eine „korregierende Wirkung“ auf die Polymerase: zwar ist eine Polymerase grundsätzlich in der Lage, ein solches Mismatch zu überwinden, doch in Kombination mit Controller wird diese Eigeschaft des Primer-Verlängerungs-Systems dermassen verändert, dass eine vollständige Synthese von fehlerhaften Primer-Verlängerungsprodukten interdrückt wird. Die zwischenzeitlich entstehenden Primer-Verlängerungsprodukte werden aus der weiteren Verlängerung entzogen während einer Primer-Verlängerungs-Reaktion läuft (On-line Kontrolle).

Reaktion 12: diente als Referenz-Signal für Sonde in Abwesenheit einer Polymerase.

Reaktion	Matrize	Primer	Controller	Polymerase
13	P1EX-400-4202	SEQP1F5 300-35X	nein	Ja
14	P1EX-400-4202	SEQP1F5 300-35X	AD-F5-1001-503	ja
15	P1EX-400-4202	SEQP1F5 300-35X	nein	nein

Reaktion 13 (38 A): Zeigt Überwindung einer Iso-dC-Position in der Matrize in Abwesenheit eines Controllers und Fortsetzunng der Synthese bis zur Verdrängung der Sonde unter Verwendung eines Primer-Oligonukleotides, welches keinen zweiten Bereich umfasst (SEQP1 F 300-35X). Man sieht zwar eine verzögerte Reaktionskinetik (Verdrängung der Sonde erfolgt wesentlich langsamer, als bei perfekt-Match Matrize), dennoch kann ein komplementäres Primer-Verlängerungsprodukt in guten Ausbeuten synthetisiert weren (Sonde wurde verdrängt).

Reaktion 14: Die Anwesenheit eines Controller-Oligonukleotides scheint bei einem solchen Primer-Design allerdings keine Auswirkung auf das Verhalten des Primer-Verlängerungs-Systems zu haben: das verwendete Primer hat keinen zweiten Bereich, im Gegensatz zum in der Reaktion 11 verwendeten Primer.

Insgesamt wurde in diesem Beispiel die Fähigkeit eines Primer-Verlängerungs-Systems demonstriert, die Überwindung eines Mismatch durch die Polymerase in Anwesenheit eines Controller-Oligonukleotides und eines ersten Primers zu modifizieren / zu verhindern.

Beispiel 4:

Anwendung einer synthetisierten Nukleinsäurekette als Start-Nukleinsäurekette in einem Amplifikationsverfahren.

Die durch eine Primer-Verlängerungsreaktion erhaltene Nukleinsäurekette kann vom Matrizenstrang abgelöst werden und in einem weiteren Verfahren verwendet werden.

Beispielsweise in einerm Verfahren zur Vermehrung von Nukleinsäureketten mit einem Controller-Oligonukleotid (siehe Beispiele 1 und 2). Ein solches Amplifikationsverfahren umfasst dabei mehrere Schritte in 40 - 42. Diese Figuren zeigen schematisch das Zusammenwirken von Komponenten bei einer exponentiellen Amplifikation einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette in einzelnen Schritten.

Damit kann die durch eine Primer-Verlängerung bereitgestellte Nukleinsäurekette beispielsweise als Start-Nukleionsäurekette in eine Amplifikation mit Allel-Diskriminierung als Matrize verwendet werden.

Fig. 43A

Zeigt schematisch eine Start-Nukleinsäurekette und Komponenten des Amplifikationssystems im Ansatz vor Amplifikationsstart:

Start-Nukleinsäure (Start-NS), welche eine Zielsequenz umfasst.
Primer 1 (P1.1), Primer 2 (P2.1), ein Aktivator-Oligonukleotid (C1.1).
Komponenten für Primer-Verlängerungsreaktion: Polymerase (Pol) und dNTPs

Fig. 43B

Zeigt schematisch Ergebnis der Amplifikation:

Primer-Verlängerungsprodukt P1.1-Ext ausgehnd von P1.1, Primer-Verlängerungsprodukt 2.1-Ext. Diese Produkte (P1.1-Ext, P2.1-Ext) können untereinader und mit Aktovator-Oligonukleotid unterschiedliche Komplexformen ausbilden (je nach Konzentrations-Verhältnis und Reaktionsbedingugnen). Im Einzelnen, können diese Formen Komplese aus P1.1-Ext / C1.1 und / oder P1.1-Ext und / oder P1.1-Ext/ C1.1/ P2.1-Ext umfassen.

Das P1-Ext umfasst ein 3'-Segment, welches nicht vom Aktivator-Oligonukleotid komplementär gebunden wird. Dieses Segment dient als Bindungspartner für die Oligonukleotid-Sonde.

44 zeigt schematisch potenzielle Positionen eines polymorphen Lokus innerhalb einer Zielsequenz (Position 1 bis 6) und ihre korrespondierenden Sequenzsegment-Positionen in einzelnen Komponenten eines Amplifikations-Systems. Die hier schematisch dargestellten polymorphen Loki einer Zielsequenz umfassen 2 bis 50 Nukleotide, besser 4 bis 30 Nukleotide welche für eine Allel-Variante einer Zielsequenz charakteristisch und spezifisch sind.

Insgesamt kann die Anordnung von einzelnen Amplifikations-Komponenten dermaßen gestaltet werden, dass mehrere Varianten/Kombinationen möglich sind:

Anordnung 1 (P1): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den ersten Primer (ersten Bereich) und Aktivator-Oligonukleotid (zweiten Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer zweiter Primer verwendet, welcher aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch ist.

Anordnung 2 (P2): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den ersten Primer (ersten Bereich) und Aktivator-Oligonukleotid (zweiten Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein Zielsequenzspezifischer zweiter Primer verwendet, welcher aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch ist. Anordnung P2 unterscheidet sich von P1 vor allem dadurch, dass N2 vorwiegend im 3'-Terminalen Sequenz-Segment des ersten Primers liegt. Dadurch kann ggf. eine bessere Spezifität der Amplifikation erzeicht werden.

Anordnung 3 (P3): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert nur das Aktivator-Oligonukleotid (dritter Bereich), wobei das korrespondierende Sequenzsegment des Aktivator-Oligonukleotides im 5'-Segment des synthetisierten Anteils des ersten Primer-Verlängerungsproduktes liegt. Das Aktivator-Oligonukleotid des Amplifikations-Systems kann somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer erster und zweiter Primer verwendet, welche aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch sind. Aufgrund der möglichen Nähe der zweiten Blockierungs-Einheit kann Bindung des Aktivator-Oligonukleotide an das erste Primer-Verlängerungsprodukt durch Nukleotid-Modifikationen der zweiten Blockierungs-Einheit beeinflusst werden.

Anordnung 4 (P4): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert nur das Aktivator-Oligonukleotid (dritter Bereich). Das Aktivator-Oligonukleotid des Amplifikations-Systems kann somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer erster und zweiter Primer verwendet, welche aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch sind. Dieses Sequenzsegment des Aktivator-Oligonukleotides liegt in 5'-Richtung von der zweiten Blockierungs-Einheit und kann mehrere DNA-Nukleotid-Monomere umfassen, z.B. von 5 bis 30.

Anordnung 5 (P5): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den zweiten Primer und Aktivator-Oligonukleotid (dritter Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer erster Primer verwendet, welcher aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch ist.

Anordnung 6 (P6): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den zweiten Primer und Aktivator-Oligonukleotid (dritten Bereich, nahe dem 5'-Ende). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariate der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer erster Primer verwendet, welcher aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch ist.

Aus den Design-Unterschieden einzelner Elemente ergeben sich auch Unterschiede für während einer Amplifikation synthetisierte Primer-Verlängerungsprodukte (7C).

45 zeigt schematisch potenzielle Positionen eines polymorphen Lokus mit Sequenz-Varianz von nur einem Nukleotid innerhalb einer Zielsequenz (Position 1 bis 6) und ihre korrespondierenden Sequenzsegment-Positionen in einzelnen Komponenten eines Amplifikations-Systems.

Anordnung 1 (P1): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den ersten Primer (ersten Bereich) und Aktivator-Oligonukleotid (zweiten Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für die jeweilige Sequenzvarianten der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein Zielsequenzspezifischer zweiter Primer verwendet, welcher aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch ist.

Anordnung 2 (P2): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den ersten Primer (ersten Bereich) und Aktivator-Oligonukleotid (zweiten Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvarianten der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein Zielsequenzspezifischer zweiter Primer verwendet, welcher aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch ist. Anordnung P2 unterscheidet sich von P1 vor allem dadurch, dass N2 vorwiegend im 3'-terminalen Sequenz-Segment des ersten Primers liegen kann oder sogar das 3'-terminale Nukleotid umfasst. Dadurch kann ggf. eine weitere Erhöhnung der Spezifität der Amplifikation erzeicht werden.

Anordnung 3 (P3): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert nur das Aktivator-Oligonukleotid (dritten Bereich), wobei das korrespondierende Sequenzsegment des Aktivator-Oligonukleotides im 5'-Segment des synthetisierten Anteils des ersten Primer-Verlängerungsproduktes liegt. Das Aktivator-Oligonukleotid des Amplifikations-Systems kann somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariante der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer erster und zweiter Primer verwendet, welche aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch sind. Aufgrund der möglichen Nähe der zweiten Blockierungs-Einheit kann Bindung des Aktivator-Oligonukleotide an das erste Primer-Verlängerungsprodukt durch Nukleotid-Modifikationen der zweiten Blockierungs-Einheit beeinflusst werden.

Anordnung 4 (P4): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert nur das Aktivator-Oligonukleotid (dritten Bereich). Das Aktivator-Oligonukleotid des Amplifikations-Systems kann somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariante der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer erster und zweiter Primer verwendet, welche aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch sind. Dieses Sequenzsegment des Aktivator-Oligonukleotides liegt in 5'-Richtung von der zweiten Blockierungs-Einheit. Dieses Segment des Aktivator-Oligonukleotides kann mehrere DNA-Nukleotid-Monomere umfassen, z.B. von 5 bis 30, wobei das N2-korrespondierende Sequenzsegment von mindestens 3 bis 15 DNA-Nukleotid-Bausteinen auf beiden Seiten flankiert sein kann.

Anordnung 5 (P5): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den zweiten Primer und Aktivator-Oligonukleotid (dritter Bereich). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariante der Zielsequenz konstruiert werden. Die Anordnung kann dermaßen gestaltet werden, dass das 3'-terminale Nukleotid des zweiten Primers mit dem N2-Lokus korrespondiert. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer erster Primer verwendet, welcher aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch ist.

Anordnung 6 (P6): polymorpher Lokus (N2) der Zielsequenz überlagert den zweiten Primer und Aktivator-Oligonukleotid (dritter Bereich, nahe dem 5'-Ende). Diese Komponenten des Amplifikations-Systems können somit spezifisch und charakteristisch für jeweilige Sequenzvariante der Zielsequenz konstruiert werden. Bei dieser Anordnung wird ein zielsequenzspezifischer erster Primer verwendet, welcher aber nicht Sequenz-Varianten spezifisch ist.

Aus den Design-Unterschieden einzelner Elemente ergeben sich auch Unterschiede für während einer Amplifikation synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte.

Fig. 46 - 54

46 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleisäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Aktivator-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt. Ein spezifischer P1.1 kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifischen Sequenz-Variante der Start-Nukleinsäure (SN 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet.

47 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleinsäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Aktivator-Oligonukleotides im zweiten Bereich liegt. Ein spezifischer P1.1 kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplementäre Position einer spezifischen Sequenz-Variante der Start-Nukleinsäure (SN 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zur Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Bindung an eine andere Sequenz-Variante (SN 1.2) erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der SN 1.2. Die Amplifikation wird somit weniger effizient gestartet.

48 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleinsäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Aktivator-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt (2). N2-Lokus umfasst auch das 3'-Terminale Nukleotid und / oder das 3'-terminales Segment des ersten Primers. Ein spezifischer P1.1, mit einem komplementären 3'-terminalen Nukleotid kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifischen Sequenz-Variante der Start-Nukleinsäure (SN 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zur Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Bindung und Initiierung der Primer-Verlängerung an einer anderen Sequenz-Variante (SN 1.2) erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der SN 1.2. Die Amplifikation wird somit weniger effizient gestartet.

49 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleisäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Aktivator-Oligonukleotide im dritten Bereich liegt (3). Es werden zielsequenzspezifische aber nicht Sequenz-Varianten spezifische erster und zweiter Primer verwendet. Ein für alle Sequenz-Varianten einer Zielnukleinsäure einheitlicher P1.1 und P2.1, kann an die Start-Nukleinsäurekette binden und die Synthese des P1.1-Ext bzw. P2.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Trennung von beiden synthetisierten komplementären Primer-Verlängerungsprodukten P1.1-Ext und P2.1-Ext erfolgt vorzugsweise spezifisch durch komplementäre Bindung des P1.1-Ext an das Aktivator-Oligonukleotid. Die Trennung von Strängen einer anderen Sequenz-Variante, welche unter Verwendung von (SN 1.2) synthetisiert wurden, erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) zum korrespondierenden Sequenz-Segment des Aktivator-Oligonukleotides. Die Amplifikation von SN 1.2 Sequenz-Variante erfolgt somit weniger effizient bzw. nur unwesentlich bzw. gar nicht. Die Position des Sequenz-Segmentes (3), welches zu N2 der Zielsequenz korrespondiert, liegt in der Nähe der zweiten Blockierungseinheit, so dass Interaktion zwischen dem Aktivator-Oligonukleotid und dem jeweiligen ersten Primer-Verlängerungsprodukt von verwendeten Modifikationen in der zweiten Blockierungseinheit beeinflusst werden kann.

50 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleinsäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Aktivator-Oligonukleotides im dritten Bereich liegt (4). Es werden zielsequenzspezifische aber nicht sequenz-Varianten spezifische erster und zweiter Primer verwendet. Ein für alle Sequenz-Varianten einer Zielnukleinsäure einheitlicher P1.1 und P2.1, kann an die Start-Nukleinsäurekette binden und die Synthese des P1.1-Ext bzw. P2.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zur Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Trennung von beiden synthetisierten komplementären Primer-Verlängerungsprodukten P1.1-Ext und P2.1-Ext erfolgt vorzugsweise spezifisch durch komplementäre Bindung des P1.1-Ext an das Aktivator-Oligonukleotid. Die Trennung von Strängen einer anderen Sequenz-Variante, welche unter Verwendung von (SN 1.2) synthetisiert wurden, erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) zum korrespondierenden Sequenz-Segment des Aktivator-Oligonukleotides. Die Amplifikation von SN 1.2 Sequenz-Variante erfolgt somit weniger effizient bzw. nur unwesentlich bzw. gar nicht. Die Position des Sequenz-Segmentes (4), welches zu N2 der Zielsequenz korrespondiert, liegt in einer Entfernung von der zweiten Blockierungseinheit, so dass Interaktion zwischen dem Aktivator-Oligonukleotid und dem jeweiligen ersten Primer-Verlängerungsprodukt von verwendeten Modifikationen in der zweiten Blockierungseinheit im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt. Das Segment des Aktivator-Oligonukleotides, welches zu N2 korrespondiert besteht vorzugsweise aus DNA-Monomeren, wobei zwischen 4 bis 20 DNA Monomeren verwendet werden und mindestens 4 bis 10 DNA-Monomere um die Position-4 auf beiden Seiten lokalisiet sind.

51 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleinsäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Aktivator-Oligonukleotides im dritten Bereich liegt (5). N2-Lokus umfasst auch das 3'-Terminale Nukleotid des zweiten Primers. Ein spezifischer P2.1, mit einem komplementären 3'-terminalen Nukleotid kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifischen Sequenz-Variante ausgehend von komplementären zu Start-Nukleinsäure (SN 1.1) Strängen binden und die Synthese des P2.1-Ext vorzugsweise spezifisch initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Es wird kein Kompetitor-Primer verwendet. Die Bindung an eine andere Sequenz-Variante (SN 1.2) erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der SN 1.2. Die Amplifikation wird somit weniger effizient gestartet.

52 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleisäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Aktivator-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt. Ein spezifischer P1.1 kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifischen Sequenz-Variante der Start-Nukleinsäure (SN 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Die Bindung an eine andere Sequenz-Variante (SN 1.2) erfolgt weniger Effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der SN 1.2. Die Amplifikation wird somit weniger effizient gestartet.

Zur Erhöhung der Spezifität wird ein Kompetitor-Primer (P 5.1) in die Reaktion zugegeben, welcher in der Lage ist, vorwiegend komplementär an die Sequenz-Varianten der Zielsequenz zu binden, dessen Amplifikation unterdrückt werden muss. Aufgrund einer komplementären Bindung mit solchen Primer-Bindungsstellen kann ein Kompetitor-Primer bevorzugt binden und von Polymerase verlängert werden. Das dabei resultierende Produkt blockiert die einzelsträngigen Primer-Bindungsstellen für eine Interaktion des ersten Amplifikations-Primers. In einer Ausführungsform bindet das 3'-Ende eines Kompetitor-Primer innerhalb der zweiten Blockierungs-Einheit des Aktivator-Oligonukleotides, so dass keine Verlängerung dieses Primers am Aktivator-Oligonukleotid erfolgen kann. Der Kompetitor-Primer umfasst keinen zweiten Bereich und kann somit nicht mit dem ersten Bereich des Aktivator-Oligonukleotid interagieren. Dadurch wird verhindert, dass das Verlängerungsprodukt des Kompetitor-Oligonukleotides von Matrize unter Mitwirkung eines Aktivator-Oligonukleotides abgelöst wird.

53 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleisäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment der Aktivator-Oligonukleotide im zweiten Bereich liegt (2). N2-Lokus umfasst auch das 3'-Terminale Nukleotid des ersten Primers. Ein spezifischer P1.1, mit einem komplementären 3'-terminalen Nukleotid kann unter Reaktionsbedingungen bevorzugt spezifisch an die komplemenäre Position einer spezifischen Sequenz-Variante der Start-Nukleinsäure (SN 1.1) binden und die Synthese des P1.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Die Bindung an eine andere Sequenz-Variante (SN 1.2) und die Verlängerung durch eine Polymerase erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) innerhalb der Pimer-Bindungsstelle der SN 1.2 . Die Amplifikation wird somit weniger effizient gestartet.

Zur Erhöhung der Spezifität wird ein Kompetitor-Primer (P 5.2) in die Reaktion zugegeben, welcher in der Lage ist, vorwiegend komplementär an die Sequenz-Varianten der Zielsequenz zu binden, dessen Amplifikation unterdrückt werden muss. Aufgrund einer komplementären Bindung mit solchen Primer-Bindungsstellen kann ein Kompetitor-Primer bevorzugt an bestimmte Sequenz-Varianten binden (hier mit N bezeichnet) und von Polymerase verlängert werden. Das dabei resultierende Produkt blockiert die einzelsträngigen Primer-Bindungsstellen für eine Interaktion des ersten Amplifikations-Primers.

In einer Ausführungsform bindet das 3'-Ende eines Kompetitor-Primer innerhalb der zweiten Blockierungs-Einheit des Aktivator-Oligonukleotides, so dass keine Verlängerung dieses Primers am Aktivator-Oligonukleotid erfolgen kann. Der Kompetitor-Primer umfasst keinen zweiten Bereich und kann somit nicht mit dem ersten Bereich des Aktivator-Oligonukleotid interagieren. Dadurch wird verhindert, dass das Verlängerungsprodukt des Kompetitor-Oligonukleotides der Matrize abgelöst wird.

54 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit Topographie eines spezifischen Amplifikations-Systems und einer Start-Nukleinsäurekette mit einem polymorphen Lokus (N2) in einer Ausführungsform, bei welcher das zu N2 korrespondierende Segment des Aktivator-Oligonukleotide im dritten Bereich liegt (3). Es werden zielsequenzspezifische aber nicht sequenz-Varianten spezifische erster und zweiter Primer verwendet. Ein für alle Sequenz-Varianten einer Zielnukleinsäure einheitlicher P1.1 und P2.1, kann an die Start-Nukleinsäurekette binden und die Synthese des P1.1-Ext bzw. P2.1-Ext initiieren. Im Verlauf der Amplifikation kommt es dabei zu Ausbildung von P1.1-Ext und P2.1-Ext. Die Trennung von beiden synthetisierten komplementären Primer-Verlängerungsprodukten P1.1-Ext und P2.1-Ext erfolgt vorzugsweise spezifisch durch komplementäre Bindung des P1.1-Ext an das Aktivator-Oligonukleotid. Die Trennung von Strängen einer anderen Sequenz-Variante, welche unter Verwendung von (SN 1.2) synthetisiert wurden, erfolgt weniger effizient aufgrund des Mismatches mit Position (N) zum korrespondierenden Sequenz-Segment des Aktivator-Oligonukleotides. Die Amplifikation von SN 1.2 Sequenz-Variante erfolgt somit weniger effizient bzw. nur unwesentlich bzw. gar nicht. Die Position des Sequenz-Segmentes (3), welches zu N2 der Zielsequenz korrespondiert, liegt in der Nähe der zweiten Blockierungseinheit, so dass Interaktion zwischen dem Aktivator-Oligonukleotid und dem jeweiligen ersten Primer-Verlängerungsprodukt von verwendeten Modifikationen in der zweiten Blockierungseinheit beeinflusst werden kann.

Zur Erhöhung der Spezifität wird ein Kompetitor-Primer (P 5.3 oder P5.4)in die Reaktion zugegeben, welches in der Lage ist, vorwiegend komplementär an die Sequenz-Varianten der Zielsequenz bindet (N), dessen Amplifikation unterdrückt werden muss. Aufgrund einer komplementären Bindung mit solchen Primer-Bindungsstellen kann ein Kompetitor-Primer bevorzugt an bestimmte Sequenz-Varianten binden (hier mit N bezeichnet) und von Polymerase verlängert werden. Das dabei resultierende Produkt blockiert die einzelsträngigen Primer-Bindungsstellen für eine Interaktion des ersten Amplifikations-Primers.

In einer Ausführungsform ist das Kompetitor-Primer-Oligonukleotid (P 5.3) länger als der erste Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid, so dass sein 3'-Ende innerhalb der vierten Blockeirungs-Einheit des Aktivator-Oligonukleotides bindet (vierte Blockierungseinheit ist analog zu zweiten Blockeirungseinheit zusammengesetzt und blockiert eine Primer-Verlängerung am Aktivator-Oligonukleotid), so dass keine Verlängerung dieses Primers am Aktivator-Oligonukleotid erfolgen kann. Der Kompetitor-Primer kann das Segment der Matrize, welches P1.1 vorwiegend komplementär binden kann, vollständig (P 5.3) oder teilweise (P 5.4) abdecken. Der Kompetitor-Primer umfasst keinen zweiten Bereich und kann somit nicht mit dem ersten Bereich des Aktivator-Oligonukleotid interagieren. Dadurch wird verhindert, dass das Verlängerungsprodukt des Kompetitor-Oligonukleotides von der Matrize unter Mitwirkung eines Aktivator-Oligonukleotides abgelöst wird.

Eine solche Amplifikation kann alleine oder in Kombination beispielsweise mit einer nachgeschalteter PCR durchgeführt werden.

55 - 57 zeigt schematisch die Topographie von Komponenten des ersten Amplifikations-Systems.

Die Start-Nukleinsäure 1.1 umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: M1.Y, M1.5, M1.4, M1.3, M1.2, M1.1, M1.X.

Das erste Primer-Oligonukleotid umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: den ersten Bereich (P1.1.1) und den zweiten Bereich (P1.1.2).

Das Controller-Oligonukleotid (C1.1) umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: den dritten Bereich (C1.1.3), den zweiten Bereich (C1.1.2), den ersten Bereich (C.1.1.1);

Das Controller-Oligonukleotid (C1.2) umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: den dritten Bereich (C1.2.3), den zweiten Bereich (C1.2.2), den ersten Bereich (C.1.2.1);

Das zweite Primer P2.1 umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P2.1.1

Das zweite Primer P2.2 umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P2.2.1

Das zweite Primer P2.3 umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P2.3.1

Das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P1.1E6, P1.1E5, P1.1E4, P1.1E3, P1.1E2, P1.1E1.

Das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P2.1E5, P2.1E4, P2.1E3, P2.1E2, P2.1E1.

Die während der ersten Amplifikation vorzugsweise erhaltenen Primer-Verlängerungsprodukte P1.1-Ext und P2.1-Ext können komplementären Doppelstrang bilden und stellen zusammen das zweite Amplifikations-Fragment 1.1 dar, welches als Start-Nukleinsäure 2.1 für die zweite Amplifikation dienen kann.

Wobei P1.1.1 komplementär an M1.1 vorwiegend komplementär binden kann und von Polymerase verlängert werden kann. P2.1.1 an P1.1E1 komplementär binden kann und verlängert werden kann. P1.1-Ext und P2.1-Ext stellen die zu amplifizierende Nukleinsäure dar, welche als Start-Nukleinsäure 2.1 für die zweite Amplifikation dient. P2.1, P2.2. und P2.3 stellen Varianten von zweiten Primer und führen zu gleichen Amplifikations-Fragmetnen.

56 zeigt schematisch Topographie des zweiten Amplifikations-Systems:

Das dritte Primer-Oligonukleotid umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P3.1.2, P3.1.1, wobei P3.1.2 nicht komplementär zu Start-Nukleinsäure 1.1 oder zu P2.1-Ext ist. P3.1.1 ist im Wesentlichen komplementär zu P2.1E1 des P2.1-Ext.

Das vierte Primer-Oligonukleotid umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P4.1.2, P4.1.1, wobei P4.1.2 nicht komplementär zum komplementären Strang der Start-Nukleinsäure 1.1 oder zu P1.1-Ext ist. P4.1.1 ist im Wesentlichen komplementär zu P1.1E1 des P1.1-Ext.

Die während der zweiten Amplifikation vorzugsweise erhaltenen Primer-Verlängerungsprodukte P3.1-Ext und P4.1-Ext können komplementären Doppelstrang bilden und stellen zusammen das zweite Amplifikations-Fragment 2.1 dar.

P3.1-Ext umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P3.1E7, P3.1E6, P3.1E5, P3.1E4, P3.1E3, P3.1E2, P3.1E1. Die Segmente P3.1.E5 bis P3.1E3 sind in ihrer Sequenz identisch zu P1.1E4 bis P1.1E2.

P4.1-Ext umfasst (in 5'-3'-Richtung) folgende Segmente: P4.1E7, P4.1E6, P43.1E5, P4.1E4, P4.1E3, P43.1E2, P4.1E1. Die Segmente P4.1.E5 bis P4.1E3 sind in ihrer Sequenz identisch zu P2.1E4 bis P2.1E2.

57 zeigt Varianten von Varianten des dritten Primers (P3.1, P3.2, P3.3) und des vierten Primers (P4.1, P4.2, P4.3), wobei das 3'-Segment des jeweiligen Primers verschoben sein kann in Bedzug auf zu einander.

Die Kopplung von beiden Amplifikationen kann man wie folg zusammenfassen:

Das Verfahren umfasst die Schritte:

A) Bereitstellung eines Nukleinsäurefragmentes umfassend eine erste Zielsequenz (eine Start-Nukleinsäurekette)
B) Bereitstellung eines ersten Amplifikations-Systems, umfassend:
- • Ein erstes Primer-Oligonukleotid
- • Ein zweites Primer-Oligonukleotid
- • Ein Controller-Oligonukleotid
- • Eine erste Polymerase
- • Substrate für erste Polymerase (dNTPs) und geeigneten Puffer-Lösung
C) Bereitstellung eines zweiten Amplifikations-Systems, umfassend:
- • Ein drittes Primer-Oligonukleotid
- • Ein viertes Primer-Oligonukleotid
- • Eine zweite Polymerase, welche eine thermostabile Polymerase umfasst
- • Substrate für zweite Polymerase (dNTPs) und geeigneten Puffer-Lösung
- • Ein Detektions-System
D) Durchführung einer ersten Amplifikation unter Verwendung der Start-Nukleinsäurekette als initialen Matrizenstrang und des ersten Amplifikationssystems, unter Erhalt eines ersten Amplifikations-Fragmetnes 1.1, umfassend die erste Zielsequenz, und umfassend ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt und ein zweites Primer-Verlängerungsprodukt, welche einen komplementären Doppelstrang bilden können, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt resultiert aus matrizenabhängigen Verlängerung eines ersten Primers mittels Polymerase unter Verwendung der Start-Nukleinsäurekette und / oder des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize und das das zweite Primer-Verlängerungsprodukt resultiert aus matrizenabhängigen Verlängerung eines zweiten Primers mittels Polymerase unter Verwendung des ersten Primer-Verlängeungsproduktes als Matrize, wobei das erste und das zweite Primer-Verlängerungsprodukte gegenseitig als Matrizen für die jeweilige Primer-Verlängerung dienen können und wobei beide komplementären Stränge des ersten Amplifikations-Produktes 1.1 unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotides zumindest teilweise in einzelsträngige Form überführt werden können, so dass erneute Primer-Bindung an jeweils komplementäre Seqmente der synthetisierten Primer-Verlängerungsprodutke möglich ist und die verwendeten Reaktionsbedingen der ersten Amplifikation mindestens einen Temperatur-Schritt umfassen, welcher Hybridisierung und matrizenabhängige Primer-Verlängerung von beiden Primern des ersten Amplifikations-Systems zuläßt und mindestens einen Temperatur-Schritt umfassen, bei welchen das erste Primer-Verlängerungsprodukt vom zweiten Primer-Verlängerungsprodukt unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotides getrennt wird, wobei die verwendeten Reaktionsbedingungen keine spontante Trennung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes vom zweiten Primer-Verlängerungsprodukt in Abwesenheit des Controller-Oligonukleotides zulassen. Wobei die erste Amplifikation so lange durchgeführt wird bis die gewünschte Menge des ersten Amplifikationsproduktes 1.1 synthetisiert wird.
E) Durchführung einer zweiten Amplifikation unter Verwendung von mindestens einem der beiden Stränge des ersten Amplifikations-Fragmentes 1.1 als initialer Matrizenstrang und unter Verwendung des zweiten Amplifikations-Systems unter Erhalt eines zweiten Amplifikations-Fragmenten 2.1, umfassend ein drittes Primer-Verlängerungsprodukt und ein viertes Primer-Verlängerungsprodukt, welche einen komplementären Doppelstrang bilden können, wobei beide Stränge des Amplifikations-Fragmenten 2.1 gegenseitig als Matrizen bei Primer-Verlängerung dienen können, wobei die verwendeten Reaktionsbedingungen der zweiten Amplifikation mindestens in einem Temperatur-Schritt eine Hybridisierung der beiden Primer des zweiten Amplifikations-Systems und eine matrizenabhängige Primer-Verlängerung des jeweils an komplementäre Bereiche gebundenen Primers des zweiten Amplifikations-Systems zulassen und mindestens in einem weiteren Temperatur-Schritt eine Trennung eines Doppelstranges zulassen, umfassend ein drittes Primer-Verlängerungsprodukt und ein viertes Primer-Verlängerungsprodukt, wobei das dritte und das vierte Primer-Verlängerungsprodukte in einzelstränige Form überführt werden, so dass eine erneute Primer-Bindung und Verlängerungs stattfinden kann. Wobei die zweite Amplifikation so lange durchgeführt wird bis die gewünschte Menge des zweiten Amplifikationsproduktes 2.1 synthetisiert wird.

Im Einzelnen bestimmen die Eigenschaften von Komponenten des jeweiligen Amplifikations-Systems, des Nukeinsäurefragmentes umfassend eine erste Zielsequenz, sowie verwendeten Reaktionsbedinungen den Verlauf der beiden Amplifikations-Reaktionen.

Im Allgemeinen, erfolgt die erste Amplifikation unter Mitwirkung des Controller-Oligonukleotides. Dabei erfolgt die Trennung des beiden synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte zumindest teilweise in Abhängigkeit von der Sequenzusammensetzung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und ihrer Komplementarität zur Zusammensetzung des Controller-Oligonukleotides.

Während der zweiten Amplifikation wird ein zweites Amplifikations-Fragment 2.1 im Wesentlichen ohne Mitwirkung des Controller-Oligonukleotide amplifiziert.

Im Verlauf von beiden Amplifikations-Reaktionen können sowohl gewünschte AmplifikationsProdukte (Amplifikation-Fragment 1.1 und Amplifikations-Fragment 2.1) gebildet werden, als auch ihre Zwischen-Stufen (Zwischenprodukte). Die Zusammensetzung der Zwischenprodukte hängt im Wesentlichen von den bereitgestellten Komponenten des ersten und des zweiten Amplifikations-Systeme ab.

Nachfolgend werden einige molekulare Vorgänge und dabei resultierende Produkte und die potenzielle Zwischenstufen exemplarisch und schematisch erläutert.

Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifikation zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte:

1) eine erste Amplifikation mit den Schritten
- 1.A) Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids an das 3'-Segment eines als Matrize dienenden Nukleinsäurefragments (Matrizenstrang, Start-Nukleinsäurekette) einer ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure, welche eine erste Zielsequenz umfasst, wobei das erste Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
  - • einen ersten Bereich, der sequenzspezifisch an das 3' -Segment eines Matrizenstranges der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure binden kann und komplementär zumindest zu einem Teil der Zielsequenz ist;
  - • einen zweiten Bereich, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotids gebunden werden kann und von einer für die ersten Amplifikation verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt;
- 1.B) Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids wenn hybridisiert an komplementäre Segmente einer ersten zu amplifizierenden Nukleionsäure durch die erste matrizenabhängige Polymerase unter Erhalt eines ersten Primer-Verlängerungsprodukt, welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid einen von Polymerase synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum Matrizenstrang der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure ist, welcher eine erste Zielsequenz umfasst, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt und der Matrizenstrang der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure im Wesentlichen als Doppelstrang unter verwendeten Reaktionsbedingungen der ersten Amplifikation vorliegen;
- 1.C) Bindung eines Controller-Oligonukleotids an das erste Primer-Verlängerungsprodukt, wobei das Controller-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
  - • einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich des ersten Primers und / oder des ersten Primer-Verlängerungsprodukts binden kann;
  - • einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid und / oder des ersten Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär oder vollständig komplementär ist, und
  - • einen dritten Bereich, der zumindest zu einen Teil des von Polymerase synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsprodukts im Wesentlichen komplementär oder vollständig komplementär ist;
  wobei das Controller-Oligonukleotide nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids dient, und das Controller-Oligonukleotid ein Sequenzsegment umfasst, welches zu einem Strang der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure komplementär oder im Wesentlichen komplementär ist, und das Controller-Oligonukleotid an den ersten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts bindet und und Controller-Oligonukleotid an den zweiten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodutkes, sowie zumindest teilweise an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsproduktes unter Verdrängung von komplementären Anteilen des Matrizenstrangs der ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure bindet; wobei der von Polymerase synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsproduktes umfassend das zum zweiten Primer-Oligonukleotid komplementäres Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes unter Reaktionsbedingungen einzelsträngig wird
- 1.D) Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids an das einzelsträngige komplementäre Segment des ersten Primer-Verlängerungsprodukts, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid einen Bereich umfasst, der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts hybridisieren kann und mindestens einen Anteil einer Zielsequenz umfasst
- 1.E) Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids durch die erste Polymerase unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize unter Erhalt eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes , welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid einen von Polymerase synthetisierten Bereich umfasst, der zumindest einen Anteil der ersten Zielsequenz umfasst, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt und das zweite Primerverlängerungsprodukt unter Reaktionsbedingungen der ersten Amplifikation ein erstes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt bilden; und;
- 1.F) Ggf. Wiederholung der Schritte der ersten Amplifikation
2) eine zweite Amplifikation mit den Schritten (58):
- 2.A) Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt des ersten Amplifikationsprodukts, wobei das dritte Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an ein Segment des zweiten Primer-Verlängerungsprodukt binden kann;
- 2.B) Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids durch eine zweite Polymerase unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsprodutkes als Matrize unter Erhalt eines dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext Teil 1), welches neben dem dritten Primer-Oligonukleotid einen von Polymerase synthetisierten Bereich umfasst, der ein Sequenzsegment umfasst, welches im Wesentlichen komplementär zum zweiten Primer-Verlängerungsprodukt bzw. zur ersten zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zu einem Anteil der ersten Zielsequenz ist, wobei das zweite Primer-Verlängerungsprodukt und das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext Teil 1) als Doppelstrang vorliegen;
- 2C) Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids an das erste Primer-Verlängerungsprodukts des ersten Amplifikationsprodukts, wobei das vierte Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an den von Polymerase synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts binden kann;
- 2D) Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids durch die zweite Polymerase unter Verwendung des ersten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize unter Erhalt eines vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1-Ext Teil 1), welches neben dem vierten Primer-Oligonukleotid einen von Polymerase synthetisierten Bereich umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Primer-Verlängerungsprodukt und Anteile der Zielsequenz umfasst, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt und das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext Teil 1) als Doppelstrang vorliegen;
- 2E) Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext Teil 1) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext Teil 1);
- 2.F) Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids an das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (erhalten im Schritt 2D, P4.1-Ext Teil 1), wobei das dritte Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an ein Segment des vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext Teil 1) binden kann;
- 2.G) Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids durch eine zweite Polymerase unter Verwendung des vierten Primer-Verlängerungsprodutkes (P4.1 -Ext Teil 1) als Matrize unter Erhalt eines vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext), wobei das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) und das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext Teil 1) als Doppelstrang vorliegen;
- 2H) Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids an das dritte Primer-Verlängerungsprodukts (erhalten im Schritt 2B, P3.1-Ext Teil 1), wobei das vierte Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an den von Polymerase synthetisierten Bereich des dritten Primer-Verlängerungsprodukts binden kann;
- 2I) Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids durch die zweite Polymerase unter Verwendung des dritten Primer-Verlängerungsproduktes (P3.1-Ext Teil 1) als Matrize unter Erhalt eines vollständigen vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1 -Ext), wobei das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext Teil 1) und das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) als Doppelstrang vorliegen;
- 2J) Trennung des Doppelstrangs aus dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext Teil 1) und dem vollständigen vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) und des Doppelstrangs aus dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext Teil 1) und dem vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext);
- 2.K) Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids an das vollständige vierte Primer-Verlängerungsprodukt (erhalten im Schritt 2I, P4.1-Ext), wobei das dritte Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an ein Segment des vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) binden kann;
- 2.L) Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids durch eine zweite Polymerase unter Verwendung des vollständigen vierten Primer-Verlängerungsprodutkes (P4.1 -Ext) als Matrize unter Erhalt eines vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext), wobei das vollständige dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) und das vollständige vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) als Doppelstrang vorliegen;
- 2M) Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids an das vollständige dritte Primer-Verlängerungsprodukts (erhalten im Schritt 2G, P3.1-Ext), wobei das vierte Primer-Oligonukleotid einen ersten Bereichs umfasst, der im Wesentlichen sequenzspezifisch an den von Polymerase synthetisierten Bereich des vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukts binden kann;
- 2N) Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids durch die zweite Polymerase unter Verwendung des vollständigen dritten Primer-Verlängerungsproduktes (P3.1-Ext ) als Matrize unter Erhalt eines vollständigen vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1-Ext), wobei das vollständige dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) und das vollständige vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) als Doppelstrang vorliegen;
- 2O) Trennung der in Schritt 2L und 2N gebildeten Doppelstränge aus dem vollständigen dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) und dem vollständigen vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext)
- 2.P) Ggf. Wiederholung der Schritte der zweiten Amplifikation unter Vermehrung des vollständigen dritten Primer-Verlängerungsproduktes (P3.1 -Ext) und des vollständigen vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.1-Ext).

wobei der Reaktionsmischung ein Detektionssystem zugegeben wird.

Der Umfang von Ausbeuten an einzelnen Produkten und Zwischenprodukten hängt von mehreren Faktoren ab. Beispielsweise begünstigen höhere Konzentrationen von einzelnen Primern im Allgemeinen die Ausbeuten an Produkten / Zwischenprodukten. Weiterhin kann die Bildung von Produkten / Zwischenprodukten durch Reaktions-Temperatur sowie Bindung-Affinität einzelner Reaktionsteilnehmer zu einander beeinflusst werden (Affinität der Bindung einzelner Primer an ihre komplementäre Primerbindungsstellen innerhalb von Matrizensträngen): im Allgemeinen binden beispielsweise längere Oligonukleotide bei höheren Temperaturen besser als kürzere Oligonukleotide, weiterhin kann CG-Gehalt bei komplementären Sequenzsegmenten eine Rolle spielen: CG-reichere Sequenzen binden ebenfalls bei höheren Temperaturen stärker als AT-Reiche Sequenzen. Weiterhin können Modifikationen, wie MGB oder 2-Amino-dA oder LNA, die Bindugnsstärke von Primern an ihre respektive komplementäre Segmente erhöhen, was ebenfalls in bevorzugter Bindung von Primern bei höheren Temperaturen resultiert.

Daraus lässt sich ableiten, dass durch die Gestaltung von Sequenzsegmenten einzelner Primer-Sequenzen kann man Einfluss auf die Ausbeuten bestimmter Produkte / Zwischenprodukte nehmen und somit ihre Anreicherung während der Amplifikation beeinflussen.

Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure (56), umfassend die Schritte:

a) eine erste Amplifikation mit den Schritten:
- - Bereitstellung einer Start-Nukleinsäure 1.1, welche eine Zielsequenz umfasst
- - Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1) an eine zu amplifizierenden Nukleinsäure mit einer Zielsequenz (entweder Start-Nukleinsäure 1.1 oder P2.1-Ext), wobei das erste Primer-Oligonukleotid (P1.1) folgende Bereiche umfasst:
  - • einen ersten Bereich (P1.1.1), der sequenzspezifischen an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure (P2.1E1) binden kann,
  - • einen zweiten Bereich (P1.1.2), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und für die verwendete Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlich unkopiert bleibt;
- - Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1) durch eine erste Polymerase unter Erhalt eines ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext), welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid (P1.1) einen synthetisierten Bereich umfasst (P1.1E1 bis P1.1E4), der im Wesentlichen komplementär zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt und die zu amplifizierenden Nukleinsäure als Doppelstrang vorliegen;
- - Bindung eines Controller-Oligonukleotids (C1.2) an das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext), wobei das Controller-Oligonukleotid (C1.2) folgende Bereiche umfasst:
  - • einen ersten Bereich (C1.2.1), der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1E6) binden kann,
  - • einen zweiten Bereich (C1.2.2), der zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid (P1.1.1) komplementär ist, und
  - • einen dritten Bereich (C1.2.3), der zumindest zu einen Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1E4) im Wesentlichen komplementär ist; und
  wobei das Controller-Oligonukleotide (C1.1) nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids (P1.1) dient, und das erste Controller-Oligonukleotid (C1.1) an den ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1E6, P1.1E5, P1.1E4) unter Verdrängung des zu diesem Bereich komplementären Bereich (P2.1E1, P2.1E2) der zu amplifizierenden Nukleinsäure bindet;
- - Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids (P1.1) an das erste Primer-Verlängerungsprodukt, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1) einen Bereich umfasst (P2.1.1), der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1E1) binden kann,
- - Verlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids (P.2.1) durch die erste Polymerase unter Erhalt eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1-Ext), welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid (P2.1) einen synthetisierten Bereich (P2.1E4 bis P2.1E1) umfasst, der im Wesentlichen identisch zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) und das zweite Primerverlängerungsprodukt (P2.1) ein erstes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt bilden; und
- - Schritte der ersten Amplifikation wiederholt werden, bis die gewünschte Menge an ersten Amplifikationsprodukten synthetisiert wurde.
b) eine zweite Amplifikation mit den Schritten:
- - Hybridisieren eines dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das zweite und / oder das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext. oder P4.1-Ext), wobei der dritte Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen ersten Bereichs (P3.1.1) umfasst, der sequenzspezifisch an einen Bereich des zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1E1) und des vierten Primer-Verlängerungsprodukts (P4.1E2) binden kann,
- - Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) durch eine zweite Polymerase unter Erhalt eines dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext), welches neben dem dritten Primer-Oligonukleotid (P3.2) einen synthetisierten Bereich (P3.1E5 bis P3.1E2 bzw. P3.1E5 bis P3.1E1) umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) oder zur Zielsequenz ist, wobei das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1) und das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1) als Doppelstrang vorliegen;
- - Hybridisieren eines vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) an das erste Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1-Ext) und / oder an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) wobei das vierte Primer-Oligonukleotid (P4.2) einen ersten Bereichs umfasst (P4.1.1), der sequenzspezifisch an den synthetisierten Bereich des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1.1E1) und des dritten Primerverlängerungsproduktes (P1.1E2) binden kann,
- - Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) durch die zweite Polymerase unter Erhalt eines vierten Primer-Verlängerungsproduktes (P4.2-Ext), welches neben dem vierten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich (P4.1 E5 bis P4.1E2 oder P4.1E5 bis P4.1E1) umfasst, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) oder identisch zur Zielsequenz ist, wobei das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) und das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1-Ext) als Doppelstrang vorliegen;
- - Trennung des Doppelstrangs aus dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt (P1.1-Ext) und dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und des Doppelstrangs aus dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext) und des Doppelstrangs aus dem vierten Primer-Verlängerungsprodukt (P4.1 -Ext) und dem dritten Primer-Verlängerungsprodukt (P3.1-Ext);
- - Hybridisieren des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) an das vierte Primer-Verlängerungsprodukt (P4.2-Ext) und Verlängerung des dritten Primer-Oligonukleotids (P3.2) durch die zweite Polymerase; und
- - Hybridisieren des vierten Primer-Oligonukleotids an das dritte Primer-Verlängerungsprodukt (P3.2-Ext) und Verlängerung des vierten Primer-Oligonukleotids (P4.2) durch die zweite Polymerase.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

EP 2017/071011 PCT [0077, 0082]
EP 16185624 A [0077]

Claims

Ein Verfahren zur Synthese einer zu einer Zielsequenz komplementären Nukleinsäuresequenz, wobei a) eine Probe, die ein Nukleinsäurepolymer umfassend die Zielsequenz M umfasst, wobei die Zielsequenz in 5'-3'-Orientierung die Sequenzabschnitte MS und MP umfasst und MP unmittelbar in 3' von MS angeordnet ist, mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird: b) ein Oligonukleotidprimer P, welcher in 5'-3'-Orientierung die Sequenzabschnitte PC und PM umfasst und PM unmittelbar in 3' von PC angeordnet ist, wobei PM die zum Sequenzabschnitt MP komplementäre [die hybridisierende] Sequenz aufweist [im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann] und PC nicht an M [oder eine in 3' unmittelbar an MP anschließende Sequenz] binden kann; c) ein Controller-Oligonukleotid C, welches in 5'-3'-Orientierung die Sequenzabschnitte CS, CP und CC umfasst, wobei CP unmittelbar in 3' von CS und unmittelbar in 5' von CC angeordnet ist, und wobei CS identisch mit MS ist und CP identisch mit MP ist und CC die zum Sequenzabschnitt PC komplementäre [die hybridisierende] Sequenz aufweist und wobei CS modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass CS nicht als Matrize für die Aktivität der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann; d) eine matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase sowie Substrate der DNA-Polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren, wobei ein Primer-Verlängerungsprodukt P' erhalten wird, welches neben dem den Sequenzbereichen PC und PM einen synthetisierten Bereich PS umfasst, der im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz MS ist, und wobei - entweder die Reaktionsbedingungen so gewählt sind, und/oder - die Längen und Schmelztemperatur von PC und ggf. MS so gewählt sind, dass P' mit M einen Doppelstrang bilden kann und P' mit C einen Doppelstrang bilden kann und die Bildung des Doppelstranges aus P' und C gegenüber der Bildung des Doppelstrangs aus P' mit M bevorzugt ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Sequenzabschnitt CS an seinem 3' Ende unmittelbar 5' des Sequenzabschnitts CP einen Sequenzabschnitt CS' von 5 bis 15 Nukleotidpositionen Länge enthält, welcher aus Nukleinsäureanaloga, insbesondere aus 2'O-Alkyl-ribonucleotiden, besteht.
Das Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei M einen Sequenzabschnitt MB unmittelbar in 5' von MS umfasst, und wobei weiterhin ein Block-Oligonukleotid B, das an MB hybridisieren kann, mit der Probe in Kontakt gebracht wird, und wobei a. B Nukleosidanaloga umfasst, die so ausgewählt sind, dass ein Hybrid von B mit MB die Reaktion der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase auf MB nicht erlaubt oder b. die matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase so ausgewählt ist, dass ein Hybrid von B mit MB [auch wenn B aus natürlichen Nukleosiden oder Deoxynukleosiden besteht] die Reaktion der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase auf MB nicht erlaubt.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei B mit der Probe in Kontakt gebracht wird, bevor die matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase mit der Probe in Kontakt gebracht wird.
Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren im Wesentlichen isothermal durchgeführt wird.
Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass MS eine Länge von 20 Nukleotiden bis 200 Nukleotiden hat.
Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass P eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden hat.
Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass PC eine Länge im Bereich von 5 Nukleotiden bis 85 Nukleotiden hat, insbesondere dass PC zwischen 50% und 300% der Länge des Sequenzabschnitts PM hat.
Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, durch gekennzeichnet, dass C eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden hat.
Das Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, durch gekennzeichnet, dass die Probe eine Variante VM der Zielsequenz M umfasst, welche ≥85%, insbesondere ≥95%, ≥92%, ≥94%, ≥96% oder sogar ≥98% identisch zu M ist, wobei ein Abschnitt VMS der Variante dem Abschnitt MS hoch identitisch ist, und ein Abschnitt VMP dem Abschnitt MP hochidentisch ist, und M in einer Positition VMM von der Sequenz M verschieden ist, insbesondere eine oder mehrere Substitution(en), Insertion(en) und/oder Deletion(en) aufweist.