JP2001518310A

JP2001518310A - 核酸断片の効率的連結

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Publication number: JP2001518310A
Application number: JP2000513972A
Authority: JP
Inventors: リュー，チャン
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-25
Publication date: 2001-10-16
Also published as: DE69837711T2; DE69837711D1; EP1019540A1; AU9577998A; US6204025B1; EP1019540B1; WO1999016904A1; ATE361377T1; CA2303420A1

Abstract

(57)【要約】遺伝子断片連結は簡便で費用効率的な方法を提供し、単一遺伝子あるいは複数遺伝子の連結された断片を含む増幅されたDNA配列を産生する。本発明は、マルチプレックスPCRでの遺伝子配列の増幅、および単一反応におけるエクソンの連結を含む。遺伝子断片のマルチプレックスPCRは、一回のポリメラーゼ連鎖反応において遺伝子断片の連結および連結した遺伝子の増幅を可能とする相補的な尾部を持つプライマーを用いて行われる。二つのPCRステップにおいていくつかのイントロンを含むゲノムDNAから増幅されたDNAを構成する能力は、以前には多くの時間の浪費と費用のかかるステップが要求されていたDNA産生を迅速にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の背景技術分野本発明は、小さなエクソンを多く含む標的遺伝子に特に有利である標的DNA断片の効率的増幅の方法に関する。特に、本方法は、さらなる解析に適した大きな
DNA分子中の単一遺伝子または複数遺伝子からの、複数遺伝子断片を連結させるための迅速ポリメラーゼ連鎖反応技術を含む。

【０００２】背景的技術の記述ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）として知られる技術は、ゲノムDNAを増幅する方
法である（Saiki et al., Science: 1350-1354 (1985)）。典型的に、本方法は二つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、単一DNA断片を数百万倍に増幅する。オリジナルプライマーからDNAを複製する各サイクルは、プライマー依存性複製のためのテンプレートとしてさらに供される産物を生成する。本方法の
この特徴により、各増幅サイクルで所望のDNA産物が指数関数的に増加し、DNAが
急速に蓄積する。サーマルサイクラーと耐熱性DNAポリメラーゼを使用することで自動化された技術がおこなっているため、PCRは大量の合成DNAを準備する目的
で広く分子生物学者に使用されている。

【０００３】この革命的な技術は分子生物学において広く様々な分野で使用されており、疾
病関連遺伝子の迅速な同定を可能にしている。PCRを使用することで、遺伝性疾患や分子レベルでの疾病に対する感受性を診断することを可能にしてきている。
それにもかかわらず、ある遺伝子に対するこの技術とその応用にはいくつかの不
都合と制限が認識されている。

【０００４】慣例上、PCRを使用してゲノムDNAを増幅するときは、各々の遺伝子断片を別々
に増幅して解析する。目的の遺伝子が一つ以上のエクソンを含んでいるときは、
各々のエクソンは別個のPCRを使用して単独で増幅した後、一緒に連結させ、遺伝子全体を表している長いDNA分子を形成させなければならない（Ho, et al., 1
989; Horton, et al., 1989）。各々のつなぎPCRではわずか2つの遺伝子断片のみ一緒につなぎ合わせることしかできないため、目的の遺伝子がエクソンをより
多く含めば、それだけたくさん別個に増幅を独立して行わ無ければならず、また
、それだけ多くのPCRがその断片をつなぎ合わせるのに必要とされる。多くの小さいエクソンを含む遺伝子にとって、解析のために単一遺伝子を調製することは
非常に労働集約的となり、非常に多くの時間を要求する可能性がある。特に突然
変異または多型のために小さな標的エクソンを独立してスキャンしなければなら
ないときである。

【０００５】 1つ以上のDNA断片を同時に増幅することが、バクテリオファージM13mp18から採取した関連のない20のヌクレオチド配列で標識されたプライマーを使ったマル
チプレックスPCRを用いることで可能となっている（Shuber et al., 1995）。し
かし、この方法では、20のヌクレオチド配列を欠いたプライマーで増幅された産
物は、プライマー間のハイブリダイゼーション動態に違いが出るため、確実には
生成されていなかった。それゆえ、先行技術方法を使用して、同じ20のヌクレオ
チド配列でそれぞれのプライマーを標識することは、複数の配列を効率的に増幅
するために必要である。この先行技術方法によって、このように複数の増幅が可
能であるが、増幅産物は全て同じ無関係な配列を含んでおり、それらが目的の遺
伝子の全ての部分を含む一つの長いDNA分子を形成するように連結される前に取り除くかあるいは伸長しなければならないであろう。

【０００６】個々の遺伝子断片を別々に増幅した後、全遺伝子の解析の準備をする前に、よ
り小さな断片から、導入された突然変異があっても無くても、完全な所望の遺伝
子を再構築するためには、さらなる独立した工程が必要である。PCRを用いてDNA
断片を連結するための先行技術的方法は、同時に２つの断片を連結することを含
んでおり、各々のPCRの後、精製工程に入る（Ho et al., 1989; Kim et al., 19
96）。それゆえ、いくつかの遺伝子断片を一緒につなげるためには、複数回のPC
Rと複数回の精製の段階が必要である。例えば、１つの完全な遺伝子をつくるために、これらの先行技術的方法を使用して４つのエクソンをつなげるには、４回
の別々な増幅PCR、４回の別々な産生物の精製、そして３回の結合PCRが必要であ
る。本遺伝子中の各々の追加のDNA断片は、それを他と連結するために、追加のP
CRが必要であり、先行技術的方法を用いて解析するためのDNAの準備には時間と金の両方がますますかかる。

【０００７】要約すると、複数連結したエクソンで構成される全DNAを増幅したコピー、または一つ以上の遺伝子からの遺伝子断片で構成される長いDNA分子の増幅コピーを産生する先行技術的方法には、一般的にそれぞれの工程でマルチプレックスPC
Rを行う必要があるという不都合な点がある。以前は、複数の遺伝子断片を一回のPCRで効率的に増幅し、2回目の一回のPCRで容易に、迅速に連結させるために適した相補的な末端を有する状態にする産物を得ることは不可能であった。

【０００８】従って、本分野では、標的DNAの近接していない部分に起きるいくつかの連結したDNA断片を含むDNAを増幅することが可能な、簡単で迅速な方法が必要である
。例えば、DNA診断のために、ゲノムDNA由来の連結したエクソンの全遺伝子を含
む増幅されたDNAを生成することができる方法が必要である。

【０００９】本発明の概要本発明は、標的DNAの近接しない部分で起きるDNA断片をPCRによって連結させる方法であって、各々のDNA断片は連結される１つまたは複数のDNA断片の配列に
相補的な配列を含み、a）連結される最初のDNA断片のアンチセンス鎖に対して相
補的な第１プライマーと、連結される最後のDNA断片のセンス鎖に対して相補的な第２プライマー；とｂ）3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少な
くとも一つのポリメラーゼと、3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を含有してい
る少なくとも一つのポリメラーゼ、を使用することを含む、前記方法をを提供す
る。

【００１０】加えて、本発明は、標的DNAの近接しない部分で起きる、少なくとも３つの連結したDNA断片を含むDNAを産生して増幅する方法であって、a）増幅される各々のDNA断片のための第１プライマーと第２プライマーを提供し、i）前記第１プラ
イマー（Dプライマーと呼ぶ）はDNA断片のアンチセンス鎖の3'末端に相補的な3'
部分と、一つ前のDNA断片のための第２プライマーの5'末端に相補的な、あるいは一つ前のDNA断片に内部に存在する配列に対して相補的な5'尾部をもっている；ii）前記第２プライマー（Uプライマーと呼ぶ）はDNA断片のセンス鎖の3'末端
に相補的な3'部分と、次の断片のための第１プライマーの5'末端に相補的な、あ
るいは次のDNA断片に内部に存在する配列に対して相補的な5'尾部をもっている；b）前記第１プライマーと第２プライマーの組を使用するマルチプレックスPCR
によって、少なくとも３つのDNA断片を増幅する；そしてc）少なくとも３つの増
幅したDNA断片を、連結される最初の断片のアンチセンス鎖に相補的なセンスプライマーと、連結される最後の断片のセンス鎖に相補的なアンチセンスプライマ
ーを使用して、リンキングPCRにかけること、を含む前記方法を提供する。

【００１１】好ましい態様の詳細な説明本発明の遺伝子増幅方法は、いくつかのエクソンで構成される大量のDNAを、あるいは同一遺伝子もしくは異なる遺伝子からのいくつかの隣接しないDNA断片から構成されるDNAを、時間を消費する各々別々の遺伝子断片の増幅を必要とせずに産生するすることができる。本発明のもう一つの利点は簡便さで、遺伝子断
片の連結とその連結産物の増幅が一工程で行われることである。

【００１２】本発明は、以下のこと：i）長いイントロンによって分断された複数の短いエクソンが存在する遺伝子からゲノム遺伝子を解析する場合の、制限エンドヌクレ
アーゼフィンガープリンテイングのような方法による突然変異の効率的スキャン
ニング；ii）新たな特性を持つ組換え遺伝子/RNAを生成するための異なるタンパ
ク質ドメインの結合；そして、iii）cDNAを生成し、RNAプロモーター配列を含む
プライマーを使用してcDNAを連結し、そして連結した後RNAを生成するための連結断片を転写することにより、RNAを一緒に連結すること；を含むがそれに限定されない複数の使用法を持つ。

【００１３】マルチプレックスPCR マルチプレックスPCRは、それぞれ個々の領域におけるプライマーの組を使用することで、遺伝的材料の所望領域（例えば、エクソン）を増幅する方法である
。図1は、連結工程に先立ち、４組のプライマー対により４つのエクソンを同時に増幅することをスキーム形式で説明する。そのプライマーの組はD₁/U₁、D₂/U₂ ・・・D_n/U_nと呼ばれる。それぞれのプライマーはGCリッチな尾部と配列特異的領域を含んでおり、各々のUプライマーの尾部は次のDプライマーの尾部と相補的
である。プライマー尾部の三型は、本発明での使用のために企図されたものであ
る。I型プライマーでは、Dプライマーの尾部は一つ前のUプライマーの配列特異的領域とは重複していない。II型プライマーでは、Dプライマーの尾部は一つ前のUプライマーに隣接する配列特異的領域と重複する。図1B参照のこと。III型プ
ライマーは、一つ前の遺伝子断片の内部の配列に相補的である尾部を含んでいる
。スキーム形式の例として、図1Cを参照のこと。

【００１４】プライマーはOligo 5 ソフトウェア（National Biosciences, Inc.）とGCGプログラム（Genetic Computer Group, Inc.）を用いて設計した。Oligo 5は、50
mM KClと250 pM DNAにおいて最接近隣法（nearest neighbor method）を用いてプライマーの溶解温度（Tm）を計算する。それぞれのPCR DNAのTm値は、Wetmur の式（Tm^Product＝81.5＋16.6 log[K⁺]＋0.41（％G＋％C）−675/長さ（Wetmur,
1991）によって予測された。I型の尾部は、相補的プライマーの配列特異的領域
と重複しないが、一方II型の尾部は配列特異的領域と４塩基重複する。それより
多い塩基またはそれより少ない塩基が重複する尾部もまた、本開発での使用に適
している。III型の尾部は、一つ前の遺伝子断片内の配列と相補的である。

【００１５】プライマー作製のガイドライン適切なプライマーを設計することは、リンキングPCRを首尾よく行う上でとても重要な段階である。マルチプレックスPCRを用いた他の研究（Liu et al. 1997
）の上に構築されるこの研究を基礎として、プライマー設計のために以下のガイ
ドラインを開発し、首尾良く応用した。

【００１６】 a. 配列特異的領域配列特異的領域はマルチプレックスPCRの収量と特異性に影響する。基準は以下の通りに設定した。

【００１７】 1. T_m値は、標的領域の平均T_m値以下の約35℃とすべきである。これより低
いT_m値は、特に増幅される遺伝子断片の領域が高いGCパーセントを含んでいる場
合には、低いPCR収量を引き起こすかもしれない、 2. 3'末端の２量体化やヘアピン形成にとっての厳密さ（stringency）は、
好ましくは全てのプライマー間において４塩基対以下で設定されるべきである。
これは、単に二つのプライマーを用いた通常のPCRよりマルチプレックスPCRにお
いてより大きな問題を引き起こす可能性を持っている。

【００１８】 3. 3'末端での間違ったプライミングサイトにとっての厳密さ（stringency
）は、好ましくは全ての鎖および全ての領域に対して6塩基対以下で設定されるべきである。

【００１９】 4. 内在的安定は、Oligo 5ソフトウェアパッケージの指示に基づいて選択してもよい。

【００２０】 b. 尾部領域尾部は短く（好ましくは20塩基以下）、高いパーセントのGC塩基を含み、前記
尾部はマルチプレックスPCR産物の安定的でバランスのとれた高い収量、およびリンキングPCRのための効率的かつ特異的な「リンカー」を提供するために機能する。その基準は以下の通りに設定されるべきである。

【００２１】 1. GC含量は好ましくは60％から70％にすべきである。 2. 尾部の大きさは好ましくは10-15塩基の長さで、最も好ましいのは12塩基の長さである。

【００２２】 3. プライマーのアンチセンス配列の3'末端の配列での間違ったプライミン
グにとっての厳密さ（stringency）は、好ましくはいかなる鎖および標的にとっ
て6塩基以下とすべきである。

【００２３】 4. II型の尾部が好ましい。マルチプレックスPCRの最適化本PCRのパラメーターは、Shuber, et al.（Shuber et al., 1995）に従って最
適化されてもよく、あるいは経験的に決定されてもよい。以下の例は、アニーリ
ング温度を除いて、Shuber, et al.（Shuber et. al., 1995）の最適化の戦略に
従った。至適アニーリング温度は経験的に決定され、増幅される遺伝子領域の平
均的T_m値より約20-25℃低いと予想された（Liu et al., 1997）。マルチプレックスPCR工程の最適化にとって望ましい戦略は以下の通りである。

【００２４】 a. 各々のPCRのテスト：プライマー、Mg、DMSOの濃度およびTaqGold DNAポリメラーゼの量は、各々のポリメラーゼ連鎖反応で最適化されるべきである。至適アニーリング温度は増幅
される領域の平均的T_m値よりも約20-25℃低くすべきであるが、究極的には、経験的に決定すべきである。もし領域が効率的に増幅されないのなら、プライマー
の配列特異的領域に対してさらに1または2塩基を追加してその収量を増やしても
良い。

【００２５】 b. マルチプレックスPCRのテスト：各々のPCRの共通パラメーターは、特異的な所望のマルチプレックスPCR産物の
バランスのとれた高い収量を生み出すために、選ばれるべきである。Taq DNAポリメラーゼは、反応液の25μl毎に2-6ユニットもの高い量で存在してもよい。ま
れに、プライマー濃度は、それぞれのDNA断片の一様でバランスのとれた収量を得るためにさらに調整する必要があるかもしれない。もし満足な結果がまだ得ら
れていないなら、プライマー配列を変える必要があるかもしれない。

【００２６】ホットスタートでのTaqGoldは、プライマー２量体形成および間違ったプライミングを防ぐために大切であることが判明した。p53遺伝子における潜在的な困難は、800塩基対のイントロンによって分けられているエクソン10と11の増幅であった。しかし、我々の結果は、U₃プライマーとD₄プライマーの配列特異的領域
のT_m値が上昇して、それらの相対的な濃度が我々の望ましい最適化のスキームに
従って調節された場合には、2つのエクソンを含む長いPCR DNAがないことを示し
た。

【００２７】リンキングPCR マルチプレックスPCRあるいは他の適した方法で作成された増幅DNA断片は、組
み込まれなかったプライマーを除去するための精製をあらかじめ行うかどうかに
かかわらず、リンキングPCR方法で連結させることができる。最初に、U₁とD₂の尾部、U₂とD₃の尾部、およびU₃とD₄の尾部のアンチセンス鎖をアニールして伸長
し、そしてD₁U₁、D₂U₂、D₃U₃およびD₄U₄の４つのDNAを、番号順にD₁U₄内で連結させる。もしプライマーが連結するDNA断片の異なる領域に相補的であれば、その相補的な領域はアニールされて伸長される。次に、PCRはPおよびQなどのネスティッドプライマーを用いて結合したテンプレートを増幅する（図1A）。

【００２８】 10-15塩基あるいはそれ以上の幅のものが適しているが、12塩基サイズの尾部が効率的に機能する。プライマーPおよびQの尾部は「メガプリンティング」を防
ぐ。メガプリンティングは、より早期なサイクルで産生されるPQ産物が、続くサ
イクルにおいてより大きなD₁U₄テンプレートのプライマーとして振る舞うときに
起こる（Sarkar and Sommer, 1992; Sarkar and Sommer, 1990）。また、その尾
部は、プライマーがアニールするD₁U₄あるいはPQのどちらかのテンプレートに依
存して、低い増幅効率から高い効率へのスイッチとして働く（Liu, et al. 1997
）。

【００２９】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性が失活している３種のDNAポリメラーゼ（T
th、Taq（Boehringer Mannheim）およびTfl（Promega））の一つを、3'から5'の
エクソヌクレアーゼ活性を持つ２種の酵素（Vent（New England BioLabs）、Pfu
（Stratagene））の一つと組み合わせて、本発明の方法を行った。3'から5'のエ
クソヌクレアーゼ活性を欠く酵素の効果は、PCR産物の3'末端における潜在的な余剰の非テンプレートA塩基を除くと推測される（Wu et al., 1989）。当業者は
、他の酵素、PwoおよびPloなど、が本発明に使用されうると認識するだろうが、
ポリメラーゼ活性が、3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性の無い一つ（あるいは
それ以上）の酵素、および3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を持つ一つ（ある
いはそれ以上）の酵素による、ということが鍵である。これらの酵素および酵素
の組み合わせは、説明のための例としてのみ供され、本発明を限定するつもりの
ものではない。

【００３０】固体状あるいは液体状の高分子混合物は、リンキングPCR混合液に使用されうる。ポリエチレングリコール（PEG）などの高分子混合物は、満足のいく結果を得るために必要とされるテンプレート量を減少させうる。

【００３１】リンキングPCRの最適化次の好ましいパラメーターは本発明を限定するつもりのものではない。熟練し
た分子生物学者は異なるパラメーターが本発明でも使用しうることを認識するで
あろう。

【００３２】 a. プライマーネスティッドプライマーPおよびQは、配列特異的領域のT_m値はD₁U₄ DNA産物よ
りも約35-40℃低い方が好ましいこと以外は、DおよびUプライマーについて上記のものと同一の基準と方法を使用して設計するべきである。

【００３３】 b. ポリメラーゼ Tth/Vent DNAポリメラーゼは、25μl反応液中に約1 U/0.1 Uあるいは1 U/0.05 Uで存在することが好ましい。

【００３４】 c. 連結効率個々のDNA断片の連結は、連結を望む全ての領域および全てのより短く連結した断片の連結効率を測定することでテストすることが望ましい。例えば、所望の
完全なDNA配列が４断片で構成されている場合、4、3、および2断片の連結効率は
適切なプライマーの組によって測定されるであろう。表1はこの示唆的方法を説明する。

【００３５】

【表１】

【００３６】 D₁U₄プライマーに対するD₁U₂、D₂U₃、D₃U₄、D₁U₃、D₂U₃の各プライマーおよび
プライマー無しのモル比は、組み込まれた放射性³²P-dCTPの潜在的な量による比
収量を標準化することで得られる。

【００３７】 d. アニーリング温度至適アニーリング温度は、大量のDNAテンプレートを用いて測定するべきであり、一般的にそのDNAテンプレート中のGC塩基のパーセントに関係する。図5を参
照のこと。

【００３８】 e. DNAテンプレート濃度好ましいDNAテンプレート濃度は、図3で示されているように決定され、どのく
らいのDNA断片が一緒に連結するかによる。

【００３９】 f. サイクル数それぞれのリンキングPCRの至適サイクル数を決めるべきである。慣例的に、2
0-25サイクルが最も効率的であり、最も収量が多い。

【００４０】 g. 品質管理リンキングPCR産物の同一性と質は、ダイレクトシークエンシングで確認するのが好ましい。もし産物が正確な配列でなかったら、マルチプレックス工程から
のプライマー尾部とPおよびQプライマーの尾部をダブルチェックすべきである。

【００４１】実施例 1. p53遺伝子のエクソンのマルチプレックスPCR D₁/U₁、D₂/U₂、D₃/U₃およびD₄/U₄の４プライマーの組の各々（表1A）を使用し
て、p53遺伝子内でエクソン1、2-4、10および11を増幅した。それぞれのプライマーはGCリッチな尾部と配列特異的領域を含んでいた。Uプライマーの尾部はそれぞれ次のDプライマーの尾部と相補的であった。この実施例はI型の尾部を使用
し、そこではD₃プライマーの尾部はU₂プライマーの配列特異的領域と重複してい
ない（表1A、図1A）。92℃で10分間のホットスタートは酵素の活性化のために含
む。分離は94℃で15秒間、アニーリングは55℃で30秒間で、続く伸長は72℃で2 分間とし、Perkin Elmer社のモデル9600サーマルサイクラーで全部で35サイクル
した。PCR混合物は25μl反応液中に、50 mM KCl、10 mM Tris/HCl、pH 8.3、1.5
mM MgCl₂、200μMの各dNTP、5％ DMSO、3-4 UのTaqGold DNAポリメラーゼ（Per
kin Elmer）、および250 ngのゲノムDNAを含んだ。Centricon^R-100マイクロコン
セントレイター（Amicon）で精製した後、DNA量を分光光度計を用いて260 nmで測定した。４つの期待されるDNA産物は、同様な分子比率で得られ、その相補的尾部には明らかな問題はなかった。

【００４２】 2. F9遺伝子のエクソンのマルチプレックスPCR D₁/U₁、D₂/U₂、D₃/U₃およびD₄/U₄の４プライマーの組の各々（表1B）を使用し
て、F9遺伝子内でエクソン1、2-3、4および5を増幅した。上記の実施例と同様に
、それぞれのプライマーはGCリッチな尾部と配列特異的領域を含んでおり、Uプライマーの尾部はそれぞれ次のDプライマーの尾部と相補的であった。この実施例はII型の尾部を使用し、そこではD₁、D₂およびD₃プライマーの尾部は、対応す
るUプライマーの配列特異的領域と４塩基重複していた（表1B、図1B）。PCR混合
物および反応パラメーターは、反応混合液から5％DMSOを除くこと以外、実施例1
と同じであった。

【００４３】

【表２】

【００４４】 ^a. p53遺伝子のPCR産物は、D₁U₁（270 bp、58％ G+C）、D₂U₂（736 bp、59％ G+C）、D₃U₃（286 bp、55％ G+C）、D₄U₄（235 bp、54％ G+C）、およびPQ（14
33 bp、57％ G+C）である。番号化はGenBank Accesstion: X54156に基づく。F9 遺伝子のPCR産物は、D₁U₁（367 bp、40.6％ G+C）、D₂U₂（784 bp、31.4％ G+C ）、D₃U₃（371 bp、39.9％ G+C）、D₄U₄（330 bp、36.4％ G+C）、およびPQ（17
02 bp、35％ G+C）である。番号化はYoshitake et al.（Yoshitake, et al., 19
85）の記載に基づく。プライマー名の鍵は：5'UTは5'の非翻訳領域で開始するプ
ライマーを示す；数字を従える文字Iはそのイントロンで開始するプライマーを示す；括弧の数字は配列が始まるヌクレオチドを示す；それに続く数字は配列の
長さを示す；そして文字DあるいはUは下流プライマーあるいは上流プライマーを
示す。

【００４５】 ^b. 下線部の領域は尾部であり、大文字の領域は配列特異的領域である。 ^c. tT_mおよびcT_mはそれぞれ、尾部およびプライマーの配列特異的領域のT_m値
を表す。

【００４６】 ^d. ＃４プライマーのアンチセンス配列には3'末端に7 bpの誤ったプライミン
グサイトがある。

【００４７】 3. リンキングPCR リンキングPCRは以下の通りに行った。分離は94℃で15秒間、アニーリングは5
5℃で30秒間、1分以内に72℃にして、伸長は72℃で2-3分間で、全15サイクル行った。混合物は、他では言及していない場合、25μl反応液中に、100 mM KCl、1
0 mM Tris/HCl、pH 8.9、1.5 mM MgCl₂、50μg/ml BSA、0.05％（v/v）Tween 20
、200μMの各dNTP、1 UのTth（Boehringer Mannheim）、0.1 UのVent（New Engl
and Biolabs）DNAポリメラーゼ、20 ngの４つの各DNA、そして5μCiのalpha-³²P
-dCTP（300 Ci/mmol, Amershar）を含んだ。PCR産物は2％アガロースゲルで分離
し、そのゲルをエチジウムブロマイドで染色して、AlphaImager^TM 2000 CCDカメ
ラ（Alpha Innotech）でUV写真を撮った。そのPCR産物は、乾燥したゲルを30分間露光した後、ImageQuantソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いてPhosph
orImagerで定量した。PCR収量は「ランダムユニット」、すなわちバックグランドを引いたPCRバンドのピクセル数、として定量した。

【００４８】連結したPQ PCR産物の蓄積を定量するために、リンキングPCR反応混合液のアリコートを9サイクルから30サイクルの間で3サイクル毎にサーモサイクラーから
除いた。25μlの反応液容量中に４つのp53 DNAテンプレートを40 ng、20 ngおよ
び10 ng含む反応液を使用した（図4）。わずかなPQ産物の最初の出現は、反応混
合液中のDNAテンプレート量に依存しており、４成分の連結の動態の存在を支持した。遅いサイクルの間、PQ PCR産物はかなりの程度で蓄積し、飽和点に達した
。飽和に達した点はまた、初めから反応液に加えたDNAテンプレートの量に依存した。さらに、中間産物の相対的存在は、20サイクル後に大きく減少した（図4 ）。同様な結果はF9遺伝子でも得られた。

【００４９】 4. リンキングPCRパラメーターの最適化 a. 酵素型、濃度、および割合図2Aに見られるように、1 UのTth、TaqあるいはTflを0-0.2 UのVentと混合し、p53遺伝子のPCR産物の収量を、様々な酵素条件の下での15サイクル後にPhosph
orImagerで定量するすることでテストした。その結果は、Tth/Ventの比が1:0.1 および1:0.05（レーン2および3）の時に最も高い収量を得たことを示している。
相対的なリンキングPCRの効率は、Tth/VentあるいはTfl/Vent＞Tfl/Pfu＞Taq/Pf
u＞Tth/Pfu＞Taq/Ventであった。あらゆる単一の酵素はそれだけでは最適には働
かなかった。

【００５０】 TthおよびVentを用いたさらなるテストは、F9遺伝子のエクソンを連結させ、反応液中のそれら二つの酵素の量および割合を変化しながら行った（図2B）。Tt
hの量を0.125 Uから4 Uの範囲にし、Ventの量を0.0125 Uから0.4 Uまでの範囲に
したところ、4 UのTthと0.1 UのVentが最も高い収量であった（レーン7）。その
結果は、二つの酵素の絶対的な量とその割合の両方がリンキングポリメラーゼ連
鎖反応の効率に影響していることを示している。同様な結果は、リンキングPCR が相補的配列の15塩基対を含む断片を用いて行われる時、および49 ngのテンプレートDNAが使用される時に得られた。

【００５１】 b. DNAテンプレート濃度一定量のTth/Ventとともに４つのDNAテンプレート（D₁U₁、D₂U₂、D₃U₃、およびD₄U₄）のそれぞれの量を増やしつつ使用すると、25μlの反応液毎のテンプレートDNAが10 ngと20 ngの間で「閾値」になることが示された（レーン4および5 ）。テンプレート濃度を２倍にすると、連結されたp53産物は14-16倍に増加する
結果となった。従って、連結産物の収量はテンプレート濃度に対して4倍である（収量＝全テンプレートの総量⁴）。これは、連結およびそれに続く増幅の別々の工程を用いた実験を繰り返すことで確認された。加えて、より長い15塩基の尾
部を持つDNAテンプレートを使用した実験において、同様な効果が得られた。Taq
/PfuおよびTfl/Vent酵素をF9遺伝子（p53遺伝子における57％のGC含量に対して、40％のGC含量）に用いたときに、同様な「閾値」効果が起こり、その効果は使
用される酵素あるいは特定のDNAテンプレートのどちらにも依存しないことを示した（図3B）。

【００５２】 c. 異なるプライマーの組での連結 P/Qのプライマーの組の他にも、他のプライマーの組を比較した：D₁U₂、D₂U₃ 、およびD₃U₄は二つの連結領域を増幅した；D₁U₃およびD₂U₃は三つの連結領域を
増幅し、D₁U₄は四つの連結したテンプレートをそれぞれ増幅した。D₁U₂、D₂U₃、
およびD₃U₄のモル比；D₁U₃、D₂U₃のモル比；およびD₁U₄のモル比（標準化した比
収量、あるいは潜在的に組み込まれた放射性³²P-dCTPの数）は、2-、3-、および
4-テンプレート反応の相対連結効率を反映する。表2は、二つのテンプレートを連結するリンキングPCRは四つのテンプレートを連結するリンキングPCRよりも効
率的であることを示す。また、二つのテンプレートを連結するリンキングPCRは、テンプレート量にそれほど依存しない。

【００５３】 d. 尾部の長さ 10、12、あるいは15塩基の尾部は、60-70％のGC含量を含むように設計されており、F8遺伝子のエクソンを連結するテストをされた。12塩基を含む尾部は連結
に最も効率が良かった。p53遺伝子（T_m値は21.6℃から44.1℃）中の12-および15
-塩基の尾部、およびF9遺伝子（T_m値は29.6℃から32.3℃）中の12塩基の尾部を用いたさらなる実験では、同じ結果が得られた：12塩基の尾部は最も効率が良か
った。

【００５４】 e. アニーリング温度アニーリング温度の効果は、Gradient Robocycler（Stratagene）を使用して研究した。p53遺伝子には12塩基の尾部を持つ４つのテンプレートを使用し、アニーリング温度を50℃から58℃までにして高い収量を得た。F9遺伝子には、同じ
条件の下、アニーリング温度を47℃から55℃までにして連結産物の高い収量を得
た。至適アニーリング温度は比較的低く、広い幅を持っている。また、至適アニ
ーリング温度はテンプレートのGC含量と関係がある。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

図1Aは、本発明の手順のマルチプレックスPCRおよびリンキングPCRの工程のス
キーム描写である。p53の４領域はD₁/D₁、D₂/D₂、D₃/D₃およびD₄/D₄の４つのプライマーの組でマルチプレックスPCRによって増幅される。それぞれのプライマーはGCリッチな尾部と配列特異的領域を含んでいる。Uプライマーの尾部はその次のDプライマーの尾部と相補的である。簡単な精製工程の後、４回のPCRで増幅
されたDNA（D₁U₁、D₂U₂、D₃U₃およびD₄U₄）はネスティッドPおよびQプライマーによって連結されて、増幅される。図1Bは、本発明の手順で使用されうる２つの尾部の型を示している例を提供す
る。D₃プライマーのI型尾部はU₂プライマーの配列特異的領域とは重複していないが、一方II型尾部は４塩基が重複している。p53遺伝子のセンス鎖配列（SEQ I
D NO:21）とアンチセンス鎖配列（SEQ ID NO:22）、およびF9遺伝子のセンス鎖配列（SEQ ID NO:23）とアンチセンス鎖配列（SEQ ID NO:24）は尾部に含まれて
いる。図1C。このスキーム図はIII型尾部の使用を説明しており、その中で尾部の配列は連結されるDNA配列の内部部分と相補的である。図2Aは、様々な量のVentと固定量でのTth、TaqあるいはTfl酵素とのp53遺伝子
のPCR産物の比収量を示す。固定量のTth、TaqあるいはTfl酵素と増加しつつある
量のVentを使用して、p53遺伝子の断片を連結して増幅した。連結したPQ産物の比収量は15サイクルの後にPhosphorImager（Molecular Dynamics）を使用して定
量した。図2Bは、様々な比率のTth酵素とVent酵素を用いた場合のF9遺伝子のPCR産物の
比収量を示す。Tthと増加しつつある量のVentを使用して、F9遺伝子の断片を連結して増幅した。15サイクルの後に、再度、連結したPQ産物の比収量はPhosphor
Imagerを使用して定量した（M=120 ngΦx174/Hae III DNA marker）。図3は、PCR産物の収量におけるDNAテンプレートの量の違いによる効果を説明する。図3Aでは、p53遺伝子はTth/Vent DNAポリメラーゼを使用して増幅された。Tth/Vent DNAポリメラーゼはテンプレートDNAの増加しつつある量を適用され、p53 PQ産物が定量された。図3Bでは、Tth/Vent、Taq/PfuあるいはTfl/Vent DN
AポリメラーゼがF9遺伝子に適用された。Tth/Vent、Taq/PfuあるいはTfl/Ventは
F9遺伝子に適用された。図4は、PCR産物の比収量と蓄積を示す。同じ放射能でラベルされたリンキング
PCR混合物のアリコートは、9から30サイクルの間の3サイクル毎にサーモサイクラーから除去されて、そしてPQ PCR産物が定量された。25μlの反応液毎にp53 D
NAテンプレート40ナノグラム（4A）、20 ng（4B）または10 ng（4C）が使用され
た。図5は、異なるアニーリング温度でのp53およびF9遺伝子のPCR産物の比収量を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年３月２１日（２００１．３．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 1500 Ｅａｓｔ，ＤｕａｒｔｅＲｏａｄ，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 91010−0269，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａＦターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA14 HA19 HA20 4B063 QQ42 QR08 QR32 QR42 QS25 QS34 QX02 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 a. 連結される最初のDNA断片のアンチセンス鎖に対して相補的な第１プライマー、および連結される最後のDNA断片のセンス鎖に対して相補的な第２プライマー；および b. 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少なくとも一つのポリメ
ラーゼ、および3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一つのポリ
メラーゼの使用を含む、連結される各DNA断片が１つまたは複数のDNA断片中の配列と相補
的な配列を含んでいる、標的DNAの隣接しない部分において起きる、PCRによるDN
A断片の連結方法。
【請求項２】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少なくとも一
つのポリメラーゼが、Tth、Taq、およびTflからなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項３】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少なくとも一
つのポリメラーゼが、Pfu、Plo、およびPwoからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少なくとも一
つのポリメラーゼが、25μlの反応液毎に約0.125 Uから約4 Uの濃度で存在する、請求項１の方法。
【請求項５】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少なくとも一
つのポリメラーゼが、25μlの反応液毎に4 Uの濃度で存在する、請求項１の方法
。
【請求項６】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一つのポ
リメラーゼが、25μlの反応液毎に約0.0125 Uから約0.4 Uの濃度で存在する、請
求項１の方法。
【請求項７】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一つのポ
リメラーゼが、25μlの反応液毎に0.1 Uの濃度で存在する、請求項１の方法。
【請求項８】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少なくとも一
つのポリメラーゼ、および3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を含む少なくとも
一つのポリメラーゼが、約1:0.0125から約1:0.2の割合で存在する、請求項１の方法。
【請求項９】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少なくとも一
つのポリメラーゼ、および3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を含む少なくとも
一つのポリメラーゼが、1:0.05の割合で存在する、請求項１の方法。
【請求項１０】 3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を失っている少なくとも
一つのポリメラーゼ、および3'から5'のエクソヌクレアーゼ活性を含む少なくと
も一つのポリメラーゼが、1:0.1の割合で存在する、請求項１の方法。
【請求項１１】 DNA断片のアンチセンス鎖の3'末端に相補的な3'部分、および一つ前のDNA断片のための第２プライマーの5'末端に相補的な5'尾部を持つ第１プライマー；そして、そのDNA断片のセンス鎖の3'末端に相補的な3'部分、および次のDNA断片のための第１プライマーの5'末端に相補的な5'尾部を持つ第２プライマー；を使用してそのDNA断片が増幅される、請求項１の方法。
【請求項１２】 DNA断片のアンチセンス鎖の3'末端に相補的な3'部分、および一つ前のDNA断片の内部にある配列に相補的な5'尾部を持つ第１プライマー；そして、そのDNA断片のセンス鎖の3'末端に相補的な3'部分、および次のDNA断片
の内部にある配列に相補的な5'尾部を持つ第２プライマー；を使用してそのDNA 断片が増幅される、請求項１の方法。
【請求項１３】 DNA断片が単一遺伝子のエクソンである、請求項１の方法。
【請求項１４】 DNA断片が様々な遺伝子のエクソンである、請求項１の方法。
【請求項１５】 DNA断片が単一遺伝子の非エクソン部分である、請求項１の方法。
【請求項１６】 DNA断片が様々な遺伝子の非エクソン部分である、請求項１の方法。
【請求項１７】 DNA断片が同種の生物を起源とする、請求項１の方法。
【請求項１８】 DNA断片が１あるいはそれ以上の様々な生物を起源とする、請求項１の方法。
【請求項１９】 DNA断片が隣接したDNA断片の尾部と相補的な尾部を含む、請
求項１の方法。
【請求項２０】 a. 増幅する各々のDNA断片のための第１プライマーおよび第２プライマーを提供することであって、 i. 当該第１プライマー（Dプライマーと呼ぶ）は、DNA断片のアンチセンス
鎖の3'末端に相補的な3'部分、および一つ前のDNA断片のための第２プライマーの5'末端に相補的な5'尾部を持ち； ii. 当該第２プライマー（Uプライマーと呼ぶ）は、DNA断片のセンス鎖の3
'末端に相補的な3'部分、および次の断片のための第１プライマーの5'末端に相補的な5'尾部を持つ； b. 当該第１および第２プライマーの組を使用し、マルチプレックスPCRにより、少なくとも三つのDNA断片を増幅すること；および c. 少なくとも三つの増幅されたDNA断片を、連結される最初の断片のアンチセンス鎖に相補的なセンスプライマー、および連結される最後の断片のセンス鎖
に相補的なアンチセンスプライマーを使用して、リンキングPCRにかけることを含む、標的DNAの近接しない部分で起こる、少なくとも３つの連結したDNA断片
を含むDNAの産生および増幅方法。
【請求項２１】 a. 増幅する各々のDNA断片のための第１プライマーおよび第２プライマーを提供することであって、 i. 当該第１プライマー（Dプライマーと呼ぶ）は、DNA断片のアンチセンス
鎖の3'末端に相補的な3'部分、および一つ前のDNA断片の内部にある配列に相補的な5'尾部を持ち； ii. 当該第２プライマー（Uプライマーと呼ぶ）は、DNA断片のセンス鎖の3
'末端に相補的な3'部分、および次の断片の内部にある配列に相補的な5'尾部を持つ； b. 当該第１および第２プライマーの組を使用し、マルチプレックスPCRにより、少なくとも三つのDNA断片を増幅すること；および c. 少なくとも三つの増幅されたDNA断片を、連結される最初の断片のアンチセンス鎖に相補的なセンスプライマー、および連結される最後の断片のセンス鎖
に相補的なアンチセンスプライマーを使用して、リンキングPCRにかけることを含む、標的DNAの近接しない部分で起こる、少なくとも３つの連結したDNA断片
を含むDNAの産生および増幅方法。
【請求項２２】ステップbの後およびステップcの前において、組み込まれて
いないプライマーが増幅反応混合液から除去される、請求項20の方法。
【請求項２３】ステップbの後およびステップcの前において、組み込まれて
いないプライマーが増幅反応混合液から除去される、請求項21の方法。
【請求項２４】 5'尾部が、そのDNA断片のセンス鎖の3'末端と相補的な3'部分と重複しない、請求項20の方法。
【請求項２５】 5'尾部が、そのDNA断片のセンス鎖の3'末端と相補的な3'部分と重複する、請求項20の方法。
【請求項２６】 5'尾部が、そのDNA断片のセンス鎖の3'末端と相補的な3'部分と4ヌクレオチドが重複する、請求項20の方法。
【請求項２７】 5'尾部がGCリッチである、請求項20の方法。
【請求項２８】 5'尾部が約60％から約70％のGおよびCのヌクレオチドを含む
、請求項20の方法。
【請求項２９】 5'尾部が約10から約15ヌクレオチドの長さである、請求項20
の方法。
【請求項３０】 5'尾部が約10から約15ヌクレオチドの長さである、請求項21
の方法。
【請求項３１】 5'尾部が12ヌクレオチドの長さである、請求項20の方法。
【請求項３２】 5'尾部が12ヌクレオチドの長さである、請求項21の方法。
【請求項３３】 DNA断片がエクソンである、請求項20の方法。
【請求項３４】 DNA断片がエクソンである、請求項21の方法。
【請求項３５】 DNA断片が単一遺伝子のエクソンである、請求項20の方法。
【請求項３６】 DNA断片が単一遺伝子のエクソンである、請求項21の方法。
【請求項３７】 DNA断片が様々な遺伝子のエクソンである、請求項20の方法。
【請求項３８】 DNA断片が様々な遺伝子のエクソンである、請求項21の方法。
【請求項３９】 DNA断片が単一遺伝子の非エクソン部分である、請求項20の方法。
【請求項４０】 DNA断片が単一遺伝子の非エクソン部分である、請求項21の方法。
【請求項４１】 DNA断片が様々な遺伝子の非エクソン部分である、請求項20 の方法。
【請求項４２】 DNA断片が様々な遺伝子の非エクソン部分である、請求項21 の方法。
【請求項４３】 DNA断片が同種の生物を起源とする、請求項20の方法。
【請求項４４】 DNA断片が同種の生物を起源とする、請求項21の方法。
【請求項４５】 DNA断片が一つあるいはそれ以上の様々な種の生物を起源とする、請求項20の方法。
【請求項４６】 DNA断片が一つあるいはそれ以上の様々な種の生物を起源とする、請求項21の方法。
【請求項４７】連結したDNA産物が1コピーの長いイントロンを欠いた遺伝子
である、請求項20の方法。
【請求項４８】連結したDNA産物が1コピーの長いイントロンを欠いた遺伝子
である、請求項21の方法。
【請求項４９】連結したDNA産物が突然変異を含む、請求項20の方法。
【請求項５０】連結したDNA産物が突然変異を含む、請求項21の方法。
【請求項５１】リンキングポリメラーゼ連鎖反応混合液が固体あるいは液体
状の高分子混合物を含む、請求項20の方法。
【請求項５２】リンキングポリメラーゼ連鎖反応混合液が固体あるいは液体
状の高分子混合物を含む、請求項21の方法。
【請求項５３】高分子混合物がポリエチレングリコールである、請求項20の
方法。
【請求項５４】高分子混合物がポリエチレングリコールである、請求項21の
方法。