JP2002517258A - 変異分析用の核酸ハイブリッドを生ずる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 変異分析を目的とし種々の位置からハイブリッド分子に配列Ｘ₁、Ｘ₂…Ｘ_n[式中、ｎは３よりも大きいかまたは３に等しい]の集合を与える(例えば、配列を与える)ハイブリッドＤＮＡ分子を生ずる方法。当該方法には、(１)(ａ)ハイブリッド分子に集合する、配列Ｘ₁、Ｘ₂…Ｘ_nおよびその相補配列Ｘ₁'、Ｘ₂'…Ｘ_n'(ｂ)(ａ)で定義される各一対の相補配列の場合、それぞれプライミング配列を有する、各一対のＰＣＲプライマーであって、任意の２つの配列(Ｘ_i、Ｘ'_{(i+ 1)})[式中、ｉは１から(ｎ−１)である]の３'末端にハイブリダイズする当該プライマーが特異的な相補的リンカー配列を有する、各一対のＰＣＲプライマーの単一反応混合物を提供すること、(２)リンカー配列に提供されるプライマーが限定的な濃度で存在する、第１段階ＰＣＲ反応を実施すること、(３)一方がセンス鎖の５'末端を提供し、他方が必要とされるハイブリッド分子(required hybrid molecule)のアンチセンス鎖の３'末端を提供する、単一対のプライマーを用いる第２段階ＰＣＲ反応を実施すること、の段階が含まれ、当該ハイブリッド分子を生ずる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、所望の（または潜在的所望の）１以上の配列の隣接直線状アレイを
予め定められた相互関係で含むＤＮＡハイブリド分子をつくる方法に関する。

【０００２】 多くの適用において、所望の（または潜在的所望の）配列を予め定められた相
互関係で含むＤＮＡハイブリド分子が提供されることが望まれている。この１つ
の適用は変異検出であって、位置情報を提供する多数の変異スキャンニング技術
により一度に１.５ｋｂまで走査できる。例えば、ＣＣＭ、ＥＭＣ、ＮＩＲＣＡ
、ＰＴＴがある。しかし、大部分の遺伝子が、比較的大きい距離に広がっている
短いコード配列（エキソン）中に組織化されている。結果として、変異スキャン
ニング技術は、その完全な能力まで使用されておらず、費用／利益効率が利用を
制限しており、ＳＳＣＰやＨＡなどの感度の低いサイズ拘束法が好まれている。
これらの問題を回避する他の方法、ＲＴ−ＰＣＲなどでは、ＲＮＡを扱う問題や
常染色体条件での変異対立遺伝子の損失が数多くある。

【０００３】 ＤＮＡハイブリド分子の提供が望まれる別の適用は、ＤＮＡ配列決定について
である。

【０００４】 同一または相違のＤＮＡ分子中に離れた位置で存在するエキソンを含むＤＮＡ
分子をつくるための方法は、すでに多く知られている。その１つの方法は、重複
伸張による遺伝子「スプライシング」であって、US-A-5 023 171（さらにHorton
et al., 1989. Gene, 77, 61-68）に開示されている。この技法において、一緒
に「スプライスする」２つの遺伝子断片は、別個のＰＣＲ反応でまず増幅される
。各ＰＣＲ反応にとって、２つのプライマーの１つは、プライマーのゲノム特異
的配列の５’末端に付着し、他のＰＣＲ反応のプライマー上のリンカー配列に相
補的に設計されたリンカーを有する。

【０００５】 別個のＰＣＲ反応で増幅された遺伝子断片を次いで精製し、一緒に合わせて、
変性−リアニーリング−鎖合成の周期に供する。この周期の結果として、互いに
ハイブリダイズした相補的リンカー配列が伸張されて、リンカー配列により結合
した２つの遺伝子断片を含む２重鎖分子をつくる。

【０００６】 重複伸張によりつながれる遺伝子は、ひと組の方法で連結されるべき断片を必
要とする。この方法には、２つを越える遺伝子の構築体の作成のために精製およ
び再生成の追加という面倒な工程が含まれる。さらに、遺伝子融合法はＴａｑポ
リメラーゼを利用するが、Ｔａｑにより導入される３’ｄＡオーバーハングのプ
ライマー設計が考慮されていない。従って、US-A-5 023 171で用いられているプ
ライマー設計では、大部分の断片が、２つの断片の非効率的な融合となる誤対合
を有することになる。

【０００７】 ＤＮＡハイブリド分子をつくる別の方法は、単一の結合プライマーを用いて断
片を融合する遺伝子融合法である。Nucleic Acids Research, 17, 4895 (1989)
(Yon & Freide)に開示されている。２を越える断片の融合にはまったく非効率的
なようである。ＰＣＲ産物自体がプライマーの代わりとして働き、全体の融合反
応が非効率的な中間体形成を起こす。また、この公表方法では、２つの断片でも
反応中に非融合産物による汚染がある。

【０００８】 ＤＮＡハイブリド分子をつくる別の方法は、抗体をつくるためのジシストロン
ＤＮＡ分子（上流と下流のシストロンを含む）のライブラリーの創生についての
ＰＣＲ依存方法である。WO-A-9215678 (Stratagene)に開示されている。この開
示によると、単一の反応器中で下記のレパートリーを組み合す：

【０００９】 （ｉ）第１ポリペプチド遺伝子とそのＰＣＲプライマー対のレパートリー。プラ
イマーの１つは、リンク配列を提供する第１の５’末端非プライミング部分を有
する。 （ii）第２ポリペプチド遺伝子とそのＰＣＲプライマー対のレパートリー。プラ
イマーの１つは、リンク配列を提供する第２の５’末端非プライミング部分を有
する。

【００１０】 第１と第２の５’末端部分は、ハイブリダイズできて、上流と下流のシストロ
ンをリンクするための２重鎖シストロン橋をコードする二本鎖を形成するもので
ある。

【００１１】 反応において変性、塩基対形成、鎖合成がなされる条件で、ジシストロン分子
のライブラリーがつくられる。

【００１２】 本発明の第１態様は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有するハイブリドＤＮ
Ａ分子をつくる方法を提供する。センス鎖は配列ｘ₁、ｘ₂.....ｘ_n（ｎは３より
も大きいかまたは３に等しい）を有し、５’から３’の方向に読む。本方法は下
記の工程を含む：

【００１３】 （１）下記の単一反応混合物を準備する。 （ａ）ハイブリド分子に集合する、配列ｘ₁、ｘ₂.....ｘ_nおよびその相補的配列
ｘ'₁、ｘ'₂.....ｘ'_n （ｂ）（ａ）で定めた相補的配列の各対について、プライミング配列を有する各
ＰＣＲプライマーの各対。いずれの２つの配列（ｘ_i、ｘ'_(i+1)）（ｉは１から(
n-1)）の３’末端にもハイブリダイズするプライマーが、特異的相補性リンカー
配列を有するものである。

【００１４】 （２）第１段階ＰＣＲ反応を行う。ここでは、リンカーをもつプライマーが限定
的濃度で存在する。

【００１５】 （３）単一対のプライマーを用いて第２段階ＰＣＲ反応を行う。１つのプライマ
ーはセンス鎖５’末端を、別のプライマーはアンチセンス鎖３’末端を、必要な
ハイブリド分子において提供する。 これにより、該ハイブリド分子が生成する。

【００１６】 本発明の好ましい実施態様において、第１および第２の各ＰＣＲ反応で、熱安
定性の重合用酵素としてＴａｑを用いる。この場合、リンカー配列を有するこれ
らのプライマーは、リンカー配列がその各々のプライミング配列にアデノシン残
基を介して結合するように設計する。これには、伸張鎖の３’末端でＴａｑによ
り加えられた３’アデニン・オーバーハングを考慮する。余分のアデノシン残基
を包含するプライマーは、伸張鎖の３’末端で３’アデニン・オーバーハングを
加える他の重合用酵素、および加えない他の重合用酵素との両方でもちろん使用
できる。

【００１７】 このことは第２態様での本発明に重要な特徴を与える。従って、第２態様は、
、センス鎖およびアンチセンス鎖を有するハイブリドＤＮＡ分子をつくる方法を
提供する。センス鎖は配列ｘ₁、ｘ₂.....ｘ_n（ｎは３よりも大きいかまたは３に
等しい）を有し、５’から３’の方向に読む。この方法は下記の工程を含む：

【００１８】 （１）下記の単一反応混合物を準備する （ａ）ハイブリド分子に集合する、配列ｘ₁、ｘ₂.....ｘ_nおよびその相補的配列
ｘ'₁、ｘ'₂.....ｘ'_n （ｂ）（ａ）で定めた相補的配列の各対について、プライミング配列を有する各
ＰＣＲプライマーの各対。いずれの２つの配列（ｘ_i、ｘ'_(i+1)）（ｉは１から(
n-1)）の３’末端にハイブリダイズするプライマーは、アデニン残基を介して各
プライミング配列に結合した特異的相補性リンカー配列を有するものである

【００１９】 （２）３’アデニン・オーバーハングを伸張鎖の末端に加え得る、または加え得
ない熱安定性ポリメラーゼを使用してＰＣＲ反応を行う。

【００２０】 本発明は、配列ｘ₁、ｘ₂.....ｘ_n（およびその相補的配列ｘ'₁、ｘ'₂.....ｘ' _n ）を予め定めたリンク関係で含むＤＮＡハイブリド分子をつくり得る。この分
子は、同一または相違のＤＮＡ分子の様々な領域で提供された夫々個々の配列か
ら高収率でつくられる。用いるリンカー配列は、意図するハイブリド分子に集合
する配列とは無関係である。さらに、重合用酵素としてのＴａｑと合わせて使用
されるプライマーについて追加のアデノシン残基を包含すると、断片の非効率な
融合となる誤対合を回避できる。

【００２１】 配列ｘ₁、ｘ₂.....ｘ_nは、例えば、特定のＤＮＡ分子に沿って（おそらく未知
の配列で）なんらかの距離で離れているエキソンであり得る。一方、本発明方法
でつくられるハイブリド分子において、配列は互いに比較的短い既知の配列、例
えば、２０から３０塩基の配列で隔てられている。

【００２２】 本発明によりつくられるハイブリド分子を、例えば、変異検出の目的に構築で
きる。より詳細には、ハイブリド分子は、最高１.５ｋｂの長さを有する分子に
おいて複数のエキソン（１以上の変異が存在し得る）を含み、ＣＣＭ、ＥＭＣ、
ＮＩＲＣＡ、ＰＴＴなどの技法によって、これらのエキソンのすべての変異走査
を可能にする。別の可能性があるのは、エキソンのより効率的な配列決定(内因
性ＤＮＡ分子におけるその位置でのエキソンの配列決定に比して)をなし得るよ
うに構築された複数のエキソンを含むハイブリド分子である。

【００２３】 さらに可能性があるのは、ハイブリド遺伝子の構築における本発明方法の使用
である。 本発明方法は、２つの反応工程を有し、単一の反応混合物において準備された
個別の配列ｘ₁、ｘ₂.....ｘ_n（およびその相補的配列ｘ'₁、ｘ'₂.....ｘ'_n）か
ら所望のＤＮＡハイブリド分子をつくることができる。しかし、ある状態におい
ては、相補的配列（ｘ₁、ｘ₂.....ｘ_n）または（ｘ'₁、ｘ'₂.....ｘ'_n）の組の
一方または他方のみが第１ＰＣＲ反応の出発時に最初から存在し、その場合、「
欠如している」相補性配列は、最初のＰＣＲ反応段階でインシトゥで生成される
。

【００２４】 ＰＣＲ反応の第１段階のためには、意図するＤＮＡハイブリド分子中に存在す
べき相補性配列の各組(ｘ₁、ｘ'₁）(ｘ₂、ｘ'₂）....（ｘ_n、ｘ'_n)についてＰＣ
Ｒプライマー対がある。配列ｘ₁'およびｘ_nの３’末端にハイブリダイズしてい
るプライマーは、「標準的」ＰＣＲプライマーであって、配列ｘ₁'またはｘ_n（
この場合がそうであり)あるいはその外領域のいずれかにハイブリダイズされる(
ハイブリド分子に包含されるべき配列ｘ₁'またはおよびｘ_nの３’末端が、ＰＣ
Ｒ反応の第２段階(下記参照)で使用されるプライマーにより決定されるので)。

【００２５】 ＰＣＲ反応の第１段階のための他のプライマーは、事実上修飾されたＰＣＲプ
ライマーであり、リンカー配列に付着したプライミング配列(すなわち、標準的
ＰＣＲプライマーの方法において適当なｘおよびｘ’配列にハイブリダイズする
配列)を含む。（便宜的に、リンカー配列を包含するプライマーも本明細書では
「リンカープライマー」と呼ぶ）。リンカー配列は、なんらかの２つの配列(ｘ_i 、ｘ_(i+1))の３’末端にハイブリダイズするプライマーが、互いに特異的に相補
性であるリンカー配列を有するものである。すなわち、これらのリンカー配列は
、互いにハイブリダイズするが、反応混合物中のいかなる他の配列ともハイブリ
ダイズしない。必要とするＤＮＡハイブリド分子の集合をリンカー配列が提供す
る機能の形態は、図面と関連付けた下記の説明により、さらに完全に理解される
であろう。

【００２６】 この型のプライマー設計によって、所望のハイブリド分子中に包含される配列
ｘおよびｘ₁に無関係のリンカー配列の採用が可能となり、ハイブリド分子にリ
ンクされる配列ｘおよびｘ'の部分にリンカーがハイブリダイズすることを確保
する必要がない。リンカーのこの設計は不自然なものでない。

【００２７】 リンカー配列は、例えば、２０から３０の塩基を含み、理想的には、いかなる
２次構造(例えば、「ヘアピン」)を有しない。好ましくは、相補性対の塩基対形
成温度(Ｔｍ)は実質的に同じであって、配列ｘおよびｘ'に対するプライマーの
塩基対形成温度より２−５℃高い。

【００２８】 まったく例示として、ハイブリドＤＮＡ分子の集合(重合酵素としてＴａｑを
用いるＰＣＲ反応による)のためのリンカープライマーに包含され得る相補性リ
ンカー配列の相補性組を示す。これには、５つの配列ｘ_1-5およびその各々の相
補体が含まれる。下記において、用語「特異的配列」はリンカープライマーのプ
ライミング部分である。

【化２】

【００２９】 上記の配列において、太字の「ａ」は、プライマー中に組込まれた追加のアデ
ノシン残基である。伸張鎖の末端でＴａｑにより加えられた３’アデノシン・オ
ーバーハングがある。

【００３０】 第１段階ＰＣＲ反応において、配列ｘ₁’およびｘ_nの３’末端についてのリン
カープライマー、および好ましくは標準的ＰＣＲプライマーも、限定的濃度で準
備される。「限定的濃度」とは、非効率的な増幅をもたらすプライマーの濃度で
あって、濃度の増加が産物収量の増加となるものを言う。限定的ＰＣＲ反応にお
ける単一複写鋳型に対するプライマーの比率は、典型的には約１ｘ１０⁶：１か
ら約１ｘ１０⁸：１(例えば、約３ｘ１０⁷：１)であり得る。標準的な限定的濃度
は例えば４０ｎＭである。しかし、限定的濃度は、使用するプライマーの各組に
ついて経験的に容易に決めることができる。

【００３１】 上記の限定的プライマー濃度の使用に従って、第１段階ＰＣＲ反応を適当な条
件(例えば、ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチド、緩衝液、温度周期など）で実施
し得ることを、当業者は容易に理解するであろう。例えば、温度周期には、９０
℃での変性、６０℃でのハイブリダイゼーション、７２℃での鎖合成がある。

【００３２】 特に好ましくは、第１段階反応で使用されるポリメラーゼ酵素は、熱(例えば
、９０℃から９５℃)により活性化されるように調製されたもので、低温では非
特異的ハイブリダイゼーションがないものである。

【００３３】 熱活性ポリメラーゼ酵素は当技術分野で知られている。例えば、本発明方法で
用い得るそのような酵素に、AmpliTaq Gold (Perkin Elmer)およびPlatinum Taq
(Gibco BRL)がある。

【００３４】 本発明方法の好ましい実施態様において、第１段階ＰＣＲ反応の産物を、第２
段階の前に処置して、残渣のプライマーと鋳型ＤＮＡとの望まない非緊縮ハイブ
リダイゼーションが起きるのを防止する。このことにより、第２段階ＰＣＲ反応
についての「ホット・スタート」が確保される。この処理は、例えば、エキソヌ
クレアーゼ消化であって、エキソヌクレアーゼを第１段階反応混合物に加え、混
合物を３７℃(例えば、１５分間)、次いで８０℃(例えば、３０分間)インキュベ
ートし、すべての単一標準的分子を除去する。あるいは、さらに好ましくは、第
１段階反応混合物を例えば−２０℃に冷やし、残渣のＤＮＡポリメラーゼ活性を
不活化する。

【００３５】 第２段階反応において、過剰の２種のＰＣＲプライマーを用いる。１つは配列
ｘ₁’の３’末端にハイブリドし、今１つは配列ｘ_nの３’末端にハイブリドする
(したがって、意図したハイブリド分子のセンスおよびアンチセンス鎖の５’末
端をそれぞれ提供する)。過剰は、濃度の増加が収量の増加を起こさないような
プライマーの濃度についてである。「過剰」を当業者は容易に決め得るであろう
。例えば、典型的な反応について、濃度は５００ｎＭである。

【００３６】 新鮮なポリメライジング酵素を第２段階ＰＣＲ反応で使用する。好ましくは、
第１段階反応で記載したような熱活性化ポリメラーゼ酵素である。

【００３７】 第２段階反応は、第１段階で記載したような熱周期条件で行い得る。 添付の図面を引用しながら本発明をさらに説明する。

【００３８】 図１は、ＤＮＡハイブリド分子、およびその元の「天然に生ずる」ＤＮＡ分子
を示す。 図２は、「天然生成」ＤＮＡ分からハイブリド分子への転換を示す。 図３−７は、実施例の結果を示す。

【００３９】 本発明を、天然生成ＤＮＡ分子２(参照、図１)中に存在するエキソンを含むＤ
ＮＡハイブリド分子１(参照、図１)の合成に関してのみを例として説明する。具
体的には、分子２はセンスおよびアンチセンス鎖３および４をそれぞれ含んでい
る。前者は所望のエキソンｘ₁、ｘ₂、ｘ₃.....ｘ_nを包含している。これらの配
列ｘ₁、ｘ₂、ｘ₃.....ｘ_nは、その各々の相補的配列ｘ'₁、ｘ'₂、ｘ'₃.....ｘ'_n をアンチセンス鎖４中に有し、例えば、互いに何百の塩基に分離され得る。

【００４０】 図示したハイブリド分子１は、センスおよびアンチセンス鎖５および６をそれ
ぞれ有す。前者は配列ｘ₁、ｘ₂、ｘ₃.....ｘ_nを包含し、後者は配列ｘ'₁、ｘ'₂
、ｘ'₃.....ｘ'_nを包含している。図示するように、配列ｘ₁とｘ₂とは配列-t-L_{1 2} -a-を介して結合している(５’から３’の方向に読む)。ａおよびｔはそれぞれ
アデニンおよびチミジン残基を表し、L₁₂ はリンカー配列である(下付き「１２
」はリンカーが配列ｘ₁とｘ₂との間にあることを意味する)。同様に、配列ｘ₂と
ｘ₃とは配列-t-L₂₃-a-を介して結合している。以下同じである。

【００４１】 分子１を分子２から合成する方法を説明する図２を参照にする。より具体的に
、本合成は、ポリメライジング酵素として熱活性化Ｔａｑポリメラーゼを用いる
２段階ＰＣＲ反応に関し、第１段階が修飾ＰＣＲプライマーの多くの対の限定さ
れた濃度を利用し、各配列の一つの対(ｘ₁、ｘ₁')、(ｘ₂、ｘ₂')、(ｘ₃、ｘ₃')
……(ｘ_n、ｘ_n')をハイブリッド分子内に包含させる。ハイブリッド分子１(即ち
、(ｘ₁、ｘ₁')および(ｘ_n、ｘ_n')以外の全ての配列)の間にあるこのような各配
列(ｘ_j、ｘ_j')(ｊは２から(ｎ−１))に関して、プライマー対は (ｉ)“センス配列”ｘ_jの３'領域と特異的にハイブリダイズし、その５'末端で
リンカー配列Ｌ'_j,(j+1)に、アデニン残基(“ａ”)を介して結合するプライミン
グ配列を有する第１プライマー；および (ii)“アンチセンス配列”ｘ_j'の３'領域と特異的にハイブリダイズし、その５'
末端でリンカー配列Ｌ'_{j-1 j}に、アデニン残基(“ａ”)を介して結合するプライ
ミング配列を有する第２プライマーを有する。

【００４２】 配列(ｘ₁、ｘ₁')のプライマー対は、上記(ｉ)で定義のプライマー(結合配列は
Ｌ₁₂である)および、配列ｘ₁'の３'領域に特異的な慣用のＰＣＲプライマー(Ｐ
１)を含む。配列ｘ_n、ｘ_n'のためのプライマー対は、上記(ii)で定義のプライマ
ー(結合配列はＬ_(n-1),nである)、および配列ｘ_nの３'領域に特異的な慣用のＰ
ＣＲプライマー(Ｐ２)を含む。

【００４３】 記載のプライマーが開始ＤＮＡ分子２(その構成要素の鎖に変性されたときに)
とハイブリダイズすることが意図される方法は、図２に説明の通りである。

【００４４】 修飾ＰＣＲプライマーの部分を形成するリンカー配列は、それらが内部二次的
構造を有しないようなもの(例えば、“ヘアピン”)であり、二つのこのような相
補的配列は、プライミング配列およびその完成形よりも僅かに高いアニーリング
温度(Ｔ_m)を有する。適当なリンカーの例は上に示してある。

【００４５】 第１段階ＰＣＲ反応において、“開始”ＤＮＡ分子２を、記載のように１組の
プライマーで、熱活性化Ｔａｑポリメラーゼ(例えば、約９４℃の活性化温度を
有する)と共に、適当な緩衝液中で処理する。この第１段階において、全てのプ
ライマーが限定された濃度で存在する。

【００４６】 第１段階は、最初の、相対的に高い温度、変性段階(例えば、９５℃で)、続く
ハイブリダイゼーション段階(例えば、６０℃で)、続く鎖合成段階(例えば、７
７２℃で)のような温度サイクルの条件下で行う。

【００４７】 この一連の温度サイクル段階の結果、ＰＣＲ反応は、全てのｘおよびｘ'配列(
ｘ₁およびｘ_n'以外)の３'−末端がその各々のリンカー配列に、アデニン残基“
ａ”を介して結合し、全ての配列(ｘ₁'およびｘ_n以外)の５'末端がその各々のリ
ンカー配列にチミジン残基“ｔ”を介して結合している“短”生産物(図２参照)
の産生をもたらすのに有効である。更に、各々の短生産物の３'末端は、Ｔａｑ
ポリメラーゼで添加されたアデニン残基を有する。

【００４８】 特定の機械的解釈に限定することを望まないが、我々は、第１段階ＰＣＲ反応
がまた幾分かの“より長い”生産物をもたらすと考える。このような“より長い
”生産物が短生産物の選択された一つから形成される態様は、点線枠内に説明し
た反応の段階で説明する。より具体的に、相補的リンカー配列は互いにハイブリ
ダイズでき、そのフランキング“ｔ”および“ａ”残基は、各々相補的リンカー
配列の側面の“ａ”および“ｔ”残基とハイブリダイズすることは注目される。
このような“自己プライムド”構築物を産生し、伸長は“より長い”生産物を産
生することを可能にする方向で起こり得る。更に、このように産生したこのよう
なより長い生産物の末端結合配列は、更に“より長い”生産物または短生産物の
末端結合配列とハイブリダイズできる可能性があり、更なる伸長がより長い断片
の製造に可能であることは認められる。(より長い生産物の合成は、第１段階で
部分的におよび第２段階で部分的に置き得(下記)るが、我々はこれらの生産物が
完全に第１または第２段階反応のいずれかで形成される可能性を除外することは
望まない。)“より長い”生産物の産生は、点線で定義された枠内に説明し、Ｐ
ＣＲ反応の第１および第２段階は、点線矢印で繋がる。

【００４９】 第１段階反応の最後に、反応混合物を好ましくは−２０℃に凍結し、残ってい
るポリメラーゼ活性を不活性化する。

【００５０】 反応の第２段階に関して、意図するハイブリッド分子のセンスおよびアンチセ
ンス鎖の５'末端を定義する過剰のフランキングプライマーを、反応混合物に添
加する。図２、これらのフランキングプライマーをＦＰ１およびＦＰ２として、
それらがハイブリダイズする場所と共に説明している。第２段階反応にまた提供
されるのは、緩衝液、ヌクレオチド等と共に上昇した温度でのみ活性化する更な
るポリメラーゼである。反応混合物を次いで先に記載のような熱サイクル、即ち
、変性(例えば、９５℃で１分)、例えば、６０℃でのハイブリダイゼーション(
例えば、１分)および合成(例えば、７２℃で２分)に付す。

【００５１】 ポリメラーゼが上昇した温度でのみ活性化のため、反応混合物の最初の加熱中
に無作為にハイブリダイズする配列は、ポリメラーゼが活性化する温度の前に変
性し、これらのハイブリダイゼーションから実質的に伸長反応はもたらされない
。言い方を変えて、ポリメラーゼの活性化温度以上で起こるハイブリダイゼーシ
ョンのみが、下により完全に説明するような、ハイブリッド分子１の産生に必要
なものである。

【００５２】 第２段階の結果として、意図されるハイブリッド分子が産生される。

【００５３】 多くの修飾を説明のプロトコールになし得ることは認められるべきである。例
えば、少なくとも配列ｘ₁、ｘ₂……ｘ_nのいくつかは最初に別々の染色体に提供
し得る。

【００５４】 更に、プライマーｐ₁およびｐ₂は、各々配列ｘ₁およびｘ_n'の外側であり得る
。 本発明の続く非限定的実施例により更に説明する。

【００５５】 実施例１ １.１ 材料及び方法 １.１.１ プライマー設計 １組のプライマーは、神経芽細胞腫タイプ２(ＮＦ２)遺伝子のエキソン６、７
、８、９および１０の増幅のために設計した(補遺Ａ参照)。これらの５つのエキ
ソンは、遺伝子のコード配列のほぼ真中の３分の１を含む。プライマーを、Olig
o v ４.１プログラムMedProbe, Postboks 2640, St. Hanshaugen, N-0131, Oslo
, Norway)の助けを借りて設計した。プライマーのゲノム特異的セグメントは、
ほぼ等しいＴ_m(平均Ｔ_m＝６２.３℃＠１８０ｍＭ塩濃度)を有する様に選択した
。自己集合プライマーの相補的５'末端は、約５０％のＧＣ含量の無作為選択配
列で設計し、内部二次的構造を有さず、自己就業に好ましいようにゲノム特異的
セグメントよりも高いＴ_mを有する(平均Ｔ_m＝６４.９℃＠１８０ｍＭ塩濃度)。
補足的アデニン残基を、Ｔａｑポリメラーゼにより付加された３'アデニン突出
部を発生期のＤＮＡ鎖に収容させるために、自己集合プライマーのゲノムと５'
相補的セグメントの間に挿入した。全てのプライマーをＡｌｕ反復配列に対する
相同性に関して、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/egi-bin/BLAST/nph-blastから
入手可能なＢＬＡＳＴ分析プログラムを使用してチェックした。表１は、１ＮＴ
２エキソン６−１２アレイに使用した１２プライマーの配列およびＴ_mを示す。

【００５６】 プライマーは、全て０.０５μＭスケールで合成し、逆相カートリッジおよびH
PLC精製した(MWG Biotech)。

【００５７】 １.１.２ 自己集合アレイの増幅 ＤＮＡを、末梢血リンパ球からApplied Biosystems 380A DNAエクストラクタ
ーに抽出した。

【００５８】 自己集合ＤＮＡアレイのＰＣＲ増幅を２段階で行った。１次反応は、２０μl
容量で、６７ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８.３＠２５℃)、１６.６ｍＭ硫酸アンモ
ニウム、３.７ｍＭ ＭｇＣｌ₂および０.０８５mg.ｍＬ^-1 ＢＳＡ含有１×ＰＣ
Ｒ緩衝液中、５０ngのゲノムＤＮＡ、４０nmol.Ｌ^-1のプライマー１−１０(表１
)、７５０μmol.Ｌ^-1の各ｄＮＴＰ、０.６Ｕ Platinum Taqポリメラーゼ(Gibco
BRL)を使用して行った。ＰＣＲ増幅は、Perkin-Elmer 2400または9600熱サイク
ルで、以下のパラメーターを使用して行った：最初の変性９４℃(３分)、３０サ
イクルの９４℃(１分)；６０℃(１分)；７２℃(２分)、続いて最後の７２℃(１
０分)の合成。サイクルの完了直後、１次ＰＣＲ反応物を−２０℃に零頭し、残
っているＤＮＡポリメラーゼ活性を不活性化した。

【００５９】 表１：ＮＦ２エキソン６−１０自己集合アレイの増幅用プライマー配列。プライ
マー２から９は全て自己集合アレイに内在性であり、斜体で強調した相補的５'
末端の４つの対の一つを含む。Ｔａｑポリメラーゼにより添加された３'末端ア
デニン残基を発生期のＤＮＡ鎖に収容させるために包含させた余分のアデニンヌ
クレオチドを、太字で下線を引く。各々のプライマーの各々のゲノムまたはリン
カー部分の融点(Ｔ_m)をまた示す。

【表１】

【００６０】 ２次反応を別の２０μl容量で、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ９.０＠２５℃)
、２０ｍＭ硫酸アンモニウムおよび１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂含有１×ＰＣＲ緩衝液
中、２μＬの１次ＰＣＲ、５００nmol.Ｌ^-1のプライマー１１および１２(表１)
、２００μmol. Ｌ^-1の各ｄＮＴＰ、０.６Ｕ Platinum Taqポリメラーゼ(Gibco
BRL)を使用して行った。熱サイクル条件は、１次増幅で使用したのと同一であ
った。

【００６１】 １.１.３ ＤＮＡの標識 最終適用に依存して、内部プライマー(１１および１２)は非標識(配列決定お
よびＣＣＭプローブＤＮＡ)であるか、または５'ビオチン標識(ＣＣＭ試験ＤＮ
Ａ)した。内部標識蛍光ＣＣＭプローブＤＮＡの産生のために、２次ＰＣＲを正
常コントロールＤＮＡからの１次ＰＣＲで設定し、ＴＡＭＲＡ標識ｄＣＴＰ(Per
kin-Elmer)を添加して、２次ＰＣＲの最終濃度を８００nmol.Ｌ^-1とした。他の
反応条件は、先に２次ＰＣＲに関して記載のものと同じであった。

【００６２】 １.１.４ サイクル配列決定 配列決定のために、残りの生産物を次いで分取１％アガロースゲルで電気泳動
し、１０４６ｂｐバンドを切除し、QiaQuickゲル精製キット(Qiagen)を使用して
、回収効率を最大にするために結合段階中に溶解ゲル切片をカラムを３回通過さ
せた修飾以外、製造者のプロトコールにしたがって精製した。精製サンプルを次
いで４０μLの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)の添加によりカラムから溶
出させた。

【００６３】 各サンプル４０−６０ngを、プライマー１１または１２のいずれかを使用して
、両方の配向でBigDyeターミネーターサイクル配列決定キットを使用して配列決
定した(Perkin-Elmer, Applied Biosystems)。サイクル配列決定反応のアニーリ
ング温度を、プライマー１１および１２の高いＴ_mを反映させるために５０℃か
ら５５℃に上昇させた以外、温度製造者のプロトコールに従った。配列決定反応
を次いで電気泳動し、Applied Biosystems 377蛍光シークエンサーに、読取プレ
ートに４８cmウェルを使用して回収した。

【００６４】 １.１.５ ミスマッチの化学的開裂(ＣＣＭ) ヘテロ二本鎖を、非精製ビオチニル化試験ＤＮＡと非精製内部ＴＡＭＲＡ標識
正常コントロールプローブＤＮＡの等量の９４℃で５分の加熱、続く６４℃で１
２時間のアニーリングにより形成させた。

【００６５】 各サンプルを、１％低ゲル化温度アガロースゲルを介して電気泳動することに
よりヘテロ二本鎖ＤＮＡを精製し、１０４６ｂｐバンドを、滅菌メスを使用して
切断した。ゲル切片の容量を秤量により確認し、ゲル切片を２０分、等量の１０
ｍＭ ビス−トリスＨＣｌ(ｐＨ６.５)および１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１×β−Aga
rase緩衝液で平衡化した。β−Agarase緩衝液を次いで除去し、ゲル切片を７０
℃で１０分加熱し、アガロースを液化し、続いて３７℃に冷却した。更に等量の
１×β−Agarase緩衝液を添加し、続いてβ−Agarase I(USB Biochemical)に添
加した。ゲル切片を次いで一晩３７℃で消化させた。

【００６６】 ３０μＬの各消化へテロ二本鎖ＤＮＡサンプルを次いで、製造者の指示に従い
新たに洗浄し、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ８.０)、０.１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび０.４トゥイーン２０を含む３０μＬの結合および洗浄緩衝液
に再懸濁させた１０μgのDynabeads M-280 Streptavidin(Dynal)と合わせた。ヘ
テロ二本鎖を次いでビーズと１時間４２℃で複合させたままにした。次いでサン
プルをマグネット上に置きビーズを離して上清を注意深くピペットを使用して除
去した。

【００６７】 １.１.６ ヒドロキシルアミン修飾 結合ＤＮＡを伴うビーズを、４Ｍヒドロキシルアミン、２．３Ｍジエチルアミ
ンの溶液２０μＬに再懸濁し、３７℃で２時間インキュベーションした。次いで
、当該サンプルを磁石上に置き、ビーズを分離し、ピペットを使って当該上清を
注意深く取り除いた。次いで、修飾塩基のピペリジン切断を同時に行った。

【００６８】 １．１．７ 過マンガン酸カリウム修飾 結合ＤＮＡを伴うビーズを１ｍＭＫＭｎＯ₄、３Ｍ塩化テトラエチルアンモニ
ウムの溶液２０μＬに再懸濁し、２５℃で１０分間インキュベーションした。次
いで、当該サンプルを磁石上に置き、ビーズを分離し、ピペットを使って当該上
清を取り除いた。次いで、修飾塩基のピペリジン切断を同時に行った。

【００６９】 １．１．８ ピペリジン切断 ピペリジン切断より先に、当該ビーズをＴＥ緩衝液５０μＬで一度洗浄した。
次いで、当該ビーズを、Genescan 2500 Roxサイズスタンダード(Perkin-Elmer)
およびデキストランブルーローディング色素(Sigma)を加えた、脱イオン化ホル
ムアミド中の１Ｍピペリジン溶液５μＬ中に再懸濁した。当該サンプルを３０分
間９０℃で加熱し、修飾塩基を切断し、氷上で瞬時に冷却し、磁石上に置き、液
相中の非結合ＤＮＡからビーズを分離した。

【００７０】 １．１．９ 蛍光性断片分析 当該上清を２４ｃｍウェルにロードし、Applied Biosystems 373XL蛍光アナラ
イザーにおける４％変性ポリアクリルアミドゲルで測定した。当該ゲルを、２５
００Ｖ、３０ｍＡおよび３５Ｗで１２時間、電気泳動し、フィルターセットＡ(f
ilter set A)でデータを回収した。電気泳動後、各レーンをトラックし、参照と
して内部サイズスタンダードを用いサイズ測定(size calling)を行った。次いで
、Genescanソフトウェアを用い重ね合せることにより、通常切断生産物の存在に
ついて、試験サンプルを通常の対照サンプルと比較した。

【００７１】 １．２ 結果 １．２．１ 段階１．１．２の生産物の２μｌ部分を、１％アガロースゲルに適
用し、予測される１０４６ｂｐ断片の存在を確認した。

【００７２】 １．２．２ 通常の増幅条件下の、段階１．１．２の生産物由来のそれぞれ各エ
キソンのＰＣＲ増幅により、予測される大きさの一本鎖断片が生じ、プライマー
合成の完全性およびプライマー対の適合性を確認した(図３ａ参照)。

【００７３】 １．２．３ 図４ａおよび４ｂは、両末端から配列決定した段階１．１．２の生
産物を示す。図５ａは、プライマー１１を用い、前方向からの配列決定を示す。
図４ｂは、プライマー１２を用い、逆方向からの配列決定を示す。イントロンエ
キソンの境界、プライマーアニーリング部位およびリンカー配列の位置を電気泳
動図で示す。当該生産物には、予測されるエキソンが正しい方向で含まれ、見ら
れた。配列の確認できる分解は、一成分から次の成分への移行を通して観察され
なかった。

【００７４】 １．２．４ 段階１．１．２の工程をゲノムＤＮＡサンプルの範囲で繰り返し、
終始一貫して予測される大きさの断片を生じた。反応収率は、一般に高く(〜５
００ｎｇ／１０μｌ)、バックグラウンドは低い(図５ａ参照)。

【００７５】 実施例２ 変異スキャンニングのような下流域適用のための本発明工程により得られる生
産物の適合性を試験するために、ＮＦ２変異の一群の７つのヘテロ接合体由来の
生産物を５つのＮＦ２ＣＲエキソンの４つに広げ、直接塩基配列を決定し、ゲノ
ムＤＮＡに存在する遺伝子型が当該生産物中に正確に表現されることを確認した
。７つの変異ヘテロ接合体は、ｎｔ６００−３Ｃ＞Ｇ(エキソン７)、ｎｔ６７６
−７Ｔ＞Ｇ(エキソン８)、ｎｔ７１３ｄｅｌＣ(エキソン８)、ｎｔ７８４Ｃ＞Ｔ
(エキソン８)、ｎｔ８５５ｄｅｌＴ(エキソン９)、ｎｔ８８７ｄｅｌＴ(エキソ
ン１０)およびｎｔ９４８Ｇ＞Ｔ＋ｎｔ９４９Ｇ＞Ｔ(エキソン１０)といったも
のであった。７つすべての変異は、ヘテロ接合体の状態にあることが明らかであ
った。図６は、４つの典型的な変異ヘテロ接合体由来の実施例データである。我
々は、ゲル精製していない生産物における同様な性質のヘテロ接合体の配列決定
データもまた得られた(データ示さず)。そのため、ゲル精製段階が多くのプロト
コールで省略され得る。１１のＮＦ２変異ヘテロ接合体が、修飾した蛍光性固体
相ＣＣＭ法を用い、さかのぼって、スクリーニングした。その方法は、Genomics
30, 574-582に開示のRowleyらの方法に基く。当該生産物について、ＴＡＭＲＡ ｄＣＴＰを用い、末端標識よりも優先して内部標識した。この方法は、バック
グラウンド切断から生ずる偽陽性除去の助けとなる。内部標識生産物の切断によ
り、非切断生産物に相当する総分子量を有する２つの標識断片が生ずる。ヒドロ
キシルアミンを用いミスマッチシトシンを修飾した。しかし、安全性および利便
性に基づき、四酸化オスミウムよりも優先して過マンガン酸カリウムを用い、ミ
スマッチチミジンを修飾した。

【００７６】 当該結果を図６に示す。切断生産物は、以下の変異ヘテロ接合型由来の生産物
を含むレーンで明らかに見られる：レーン３−ｎｔ６００−３Ｃ＞Ｇ(エキソン
７)；レーン６−ｎｔ７１３ｄｅｌＣ(エキソン８)；レーン８−ｎｔ６７８ｉｎ
ｓＣ(エキソン８)；レーン１０−ｎｔ７７０ｄｅｌＣ(エキソン８)；レーン１１
−ｎｔ６７６−７Ｔ＞Ｇ(エキソン８)およびレーン１２−ｎｔ９４８Ｇ＞Ｔ＋ｎ
ｔ９４９Ｇ＞Ｔ(エキソン１０)。残りのサンプルは、通常の対照か、またはヒド
ロキシルアミン修飾により影響を受けないミスマッチを生ずると予測される変異
である。

【００７７】 １１の変異のうち、１０が、ヒドロキシルアミン修飾または過マンガン酸カリ
ウム修飾の何れかを用い、検出された(表２参照)。

【００７８】 表２：蛍光性固体相ＣＣＭによる１１のＮＦ２変異ヘテロ接合体の検出 塩基の予想され得るミスマッチ塩基／対が各変異体で生ずる。２つの修飾後の陽
性の切断が、あり−明らかに切断、(あり)−弱いが再現できる切断、なし−切断
が検出されず、の何れかで示される。

【表２】

【００７９】 何れかの条件でも検出されない変異、ｎｔ６７６−２Ａ＞Ｔについて、過マン
ガン酸カリウム修飾(Ｔ：Ｔ／Ａ：Ａミスマッチ)でのみ検出されるヘテロ二本鎖
が生ずることが予想される。更にミスマッチのチミジン(ｎｔ７８４Ｃ＞Ｔおよ
びｎｔ９０３Ｃ＞Ｔ)によりヘテロ二本鎖を生ずる２つの他の変異は、過マンガ
ン酸カリウム修飾後では、切断が検出されないレベルであった。しかし、これら
何れの変異もまた、ヒドロキシアミン修飾後検出されるミスマッチシトシンを生
ずる。すべての変異はミスマッチシトシンによりヘテロ二本鎖を生じ、ヒドロキ
シルアミン修飾後に明白な切断生産物を生じた。

【００８０】 実施例３ ３．１ 工程 段階１．１．１および１．１．２(実施例１参照)の工程を繰り返し、ヒトミス
マッチ修復、ｈＭＬＨ１遺伝子のエキソン８、９、１０、１１および１２を増幅
した。当該プライマーを表３に示す。

【００８１】 当該プライマーのゲノム特異的セグメントは、Ｔｍに極めて近くなるように選
択した(塩濃度１８０ｍＭで平均Ｔｍ＝６０．８℃に設定)。当該プライマーの相
補的５'末端セグメントまたはリンカーセグメントは、約５０％のＧＣ含有率の
ランダム配列で、内部に二次的構造が生じないように設計し、そして、ゲノム特
異的セグメントのＴｍを超えるように設計した(何れも塩濃度１８０ｍＭで平均
Ｔｍ＝６５．４℃に設定)。自己集合が好ましいからである。付加的非マッチア
デニン残基が、自己集合プライマーのゲノムセグメントと５'リンカーセグメン
トの間に挿入された。Ｔａｑポリメラーゼによって発生ＤＮＡ(nascentＤＮＡ)
鎖に３'アデニンオーバーハングが追加されることに適合させるためである。htt
p://www.ncbi/nlm.nih.gov/cgibin/BLAST/nph-blastで利用可能なＢＬＡＳＴ分
析プログラムを用い、すべてのプライマーについて、Ａｌｕリピート配列に対す
る相同性を調べた。

【表３】

【００８２】 ３．２ 結果 ３．２．１ 段階１．１．２の生産物の２μｌ部分を、１％アガロースゲルに適
用し、予測される１２４７ｂｐ断片の存在を確認した。

【００８３】 ３．２．２ 通常の増幅条件下の段階１．１．２の生産物由来のそれぞれ個々の
エキソンのＰＣＲ増幅により、予測される大きさの一本鎖断片が生じ、プライマ
ー合成の完全性およびプライマー対の適合性を確認した(図３ｂ参照)。

【００８４】 ３．２．３ 段階１．１．２の工程をゲノムＤＮＡサンプルの範囲で繰り返し、
終始一貫して予測される大きさの断片を生じた。反応収率は、一般に高く(〜５
００ｎｇ／１０μｌ)、バックグラウンドは低い(図５ｂ参照)。

【００８５】 補遺Ａ ＮＦ２エキソン６−１０のゲノム配列は自己集合アレイにより増幅した。エキ
ソン配列を大文字によって示す。イントロン配列は小文字である。第１ＰＣＲ反
応で使用するプライマーのアニーリング部位により、５つの自己集合ＤＮＡ断片
が生じ、その配列を太い下線で示す。第２ＰＣＲに使用する内部プライマー対の
アニーリング部位により、アレイアセンブリが生じ(drive)、その部位を、下線
を引いたイタリック体で示す。エキソン１０リバースオーバーラップの第１およ
び第２プライマー、当該オーバーラップ領域をボールドの、下線を引いたイタリ
ックで示す。

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【化７】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＤＮＡハイブリド分子、およびその元の「天然に生ずる
」ＤＮＡ分子を示す。

【図２】 図２は、「天然生成」ＤＮＡ分からハイブリド分子への転換を示
す。

【図３−７】 図３−７は、実施例の結果を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年９月１８日（２０００．９．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 アンドリュー・ウォレス イギリス、エム13・０ジェイエイチ、マン チェスター、ヘザーセイジ・ロード、デパ ートメント・オブ・メディカル・ジェネテ ィックス、アールエムジーエル Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 CA01 CA09 CA20 HA08 HA11 HA12 HA14 HA19 4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ42 QQ58 QR08 QR14 QR31 QR32 QR56 QR62 QR63 QS25 QS34

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 センス鎖およびアンチセンス鎖を有するハイブリッドＤＮＡ
   分子であって、５'から３'方向に読まれ、当該センス鎖が配列Ｘ₁、Ｘ₂…Ｘ_n[式
   中、ｎは３よりも大きいかまたは３に等しい]を有するハイブリッドＤＮＡ分子
   を生ずる方法であって、 (１)(ａ)ハイブリッド分子に集合する、配列Ｘ₁、Ｘ₂…Ｘ_nおよびその相補配列
   Ｘ₁'、Ｘ₂'…Ｘ_n' (ｂ)(ａ)で定義される各一対の相補配列の場合、それぞれプライミング配列
   を有する、各一対のＰＣＲプライマーであって、任意の２つの配列(Ｘ_i、Ｘ'_{(i+ 1)} )[式中、ｉは１から(ｎ−１)である]の３'末端にハイブリダイズする当該プラ
   イマーが特異的な相補的リンカー配列を有する、各一対のＰＣＲプライマー の単一反応混合物を提供すること、 (２)リンカー配列に提供されるプライマーが限定的な濃度で存在する、第１段階
   ＰＣＲ反応を実施すること、 (３)一方がセンス鎖の５'末端を提供し、他方が必要とされるハイブリッド分子(
   required hybrid molecule)のアンチセンス鎖の３'末端を提供する、単一対のプ
   ライマーを用いる第２段階ＰＣＲ反応を実施すること、 の段階を含み、当該ハイブリッド分子を生ずる、当該方法。
2. 【請求項２】 ポリメライジング酵素により、３'アデノシンオーバーハン
   グが伸張鎖に加えられ、リンカー配列を組込む当該プライマーが、アデノシン残
   基を介して各リンカー配列に結合するプライミング配列を有する、請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 ポリメライジング酵素がＴａｑである、請求項２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 リンカー配列のアニーリング温度(Ｔｍ)が、ＸおよびＸ'に
   対するプライミング配列のそれがよりも高い、請求項１から３の何れかに記載の
   方法。
5. 【請求項５】 リンカー配列のアニーリング温度が、ＸおよびＸ'配列に対
   するプライミング配列のそれよりも２ないし５℃高い、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 リンカー配列が、内在性の二次的構造を有しない、請求項１
   から５の何れかに記載の方法。
7. 【請求項７】 第１段階ＰＣＲ反応と第２段階ＰＣＲ反応との間で、当該反
   応混合物を凝固させ、残りのＰＣＲ活性を不活性化する、請求項１から６の何れ
   かに記載の方法。
8. 【請求項８】 第１段階ＰＣＲ反応と第２段階ＰＣＲ反応との間で、当該反
   応混合物をエキソヌクレアーゼＩで処理し、一本鎖分子を消化する、請求項１か
   ら６の何れかに記載の方法。
9. 【請求項９】 第１段階ＰＣＲおよび第２段階ＰＣＲのそれぞれにおいて、
   熱活性化ポリメラーゼを使用する、請求項１から８の何れかに記載の方法。
10. 【請求項１０】 変異を分析する方法であって、当該分析が、請求項１から
    ９の何れかに記載の方法に従って生ずるＤＮＡハイブリッド分子について実施さ
    れる、当該分析方法。
11. 【請求項１１】 下記の配列を組み込んでいる、一群のプライマー。 【化１】
12. 【請求項１２】 センス鎖およびアンチセンス鎖を有するハイブリッドＤＮ
    Ａ分子であって、５'から３'方向に読まれ、当該センス鎖が配列Ｘ₁、Ｘ₂…Ｘ_n[
    式中、ｎは３よりも大きいかまたは３に等しい]を有するハイブリッドＤＮＡ分
    子を生ずる方法であって、 (１)(ａ)ハイブリッド分子に集合する、配列Ｘ₁、Ｘ₂…Ｘ_nおよびその相補配列
    Ｘ₁'、Ｘ₂'…Ｘ_n' (ｂ)(ａ)で定義される各一対の相補性配列の場合、それぞれプライミング配
    列を有する、各一対のＰＣＲプライマーであって、任意の２つの配列(Ｘ_i、Ｘ'_{( i+1)} )[式中、ｉは１から(ｎ−１)である]の３'末端に対するプライマーが、アデ
    ノシン残基を介して各プライミング配列に結合する特異的な相補的リンカー配列
    を有する、各一対のＰＣＲプライマー の単一反応混合物を提供すること、 (２)伸張鎖の末端に３'アデノシンオーバーハングを加えるポリメラーゼを用い
    るＰＣＲ反応を実施すること、 の段階を含む当該方法。