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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Synthetisieren
von Nukleinsäure,
die aus einer spezifischen Nukleotidsequenz aufgebaut ist, welches
nützlich
ist als ein Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäure.
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Stand der Technik
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Ein
Analyseverfahren, das auf der Komplementarität der Nukleotidsequenz von
einer Nukleinsaure basiert, kann genetische Merkmale direkt analysieren.
Demgemäß ist diese
Analyse ein sehr starkes Mittel zur Identifikation von genetischen
Krankheiten, Krebs, Mikroorganismen usw. Ferner ist ein Gen selbst
das Objekt der Detektion und somit können zeitraubende und komplizierte
Verfahren, wie beispielsweise eine Kultivierung, in einigen Fällen weggelassen
werden.
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Nichtsdestotrotz
ist die Detektion von einem Zielgen, das in einer sehr kleinen Menge
in einer Probe vorliegt, prinzipiell nicht einfach, so dass eine
Amplifikation von einem Zielgen selbst oder dessen Detektionssignal
notwendig ist. Als ein Verfahren zum Amplifizieren eines Zielgens
ist die PCR (Polymerase Kettenreaktion) bekannt (Science, 230, 1350-1354,
1985). Derzeitig ist das PCR-Verfahren das am häufigsten verwendete Verfahren
einer Technik zum Vervielfältigen
von Nukleinsäure
in vitro. Dieses Verfahren wurde nachhaltig als ein exzellentes
Detektionsverfahren etabliert durch den Vorteil von hoher Sensitivität, die auf
dem Effekt einer exponentiellen Amplifikation basiert. Da das Amplifikationsprodukt
als DNA gewonnen werden kann, wird dieses Verfahren ferner weit
verbreitet eingesetzt als ein wichtiges Werkzeug, das Gentechniken
unterstützt, wie
beispielsweise das Klonen von Genen und die Strukturaufklärung. In
dem PCR-Verfahren sind jedoch die folgenden Probleme bekannt: eine
spezielle Temperaturkontrolleinheit ist notwendig zur Durchführung; das
exponentielle Wachstum von der Amplifikationsreaktion führt zu einem
Problem in der Quantifizierung; und Proben und Reaktionslösungen werden
leicht von außen
kontaminiert, was es einer Nukleinsäure, die fälschlicherweise beigemischt
wird, erlaubt, als Matrize zu dienen.
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Während genetische
Informationen angesammelt werden, zieht die Analyse von einzelnen
Nukleotidpolymorphismen (single nucleotide polymorphism (SNPs) Aufmerksamkeit
auf sich. Der Nachweis von SNPs durch PCR wird möglich durch Entwerfen eines
Primers derart, dass dessen Nukleotidsequenz die SNPs enthält. Das
heißt,
ob eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu dem Primer ist, vorhanden
ist oder nicht, kann herausgefunden werden durch Ermitteln, ob ein
Reaktionsprodukt vorhanden ist oder nicht. Wenn jedoch einmal fälschlicherweise
zufällig
eine komplementäre
Kette in einer PCR synthetisiert wird, dient dieses Produkt als
eine Matrize in Folgereaktionen und verursacht dadurch ein fehlerhaftes
Ergebnis. In der Praxis wird gesagt, dass die strenge Kontrolle
von einer PCR schwierig ist bei einem Unterschied von nur einer
Base, die sich an einem Ende von dem Primer befindet. Entsprechend
ist es notwendig, die Spezifität
zu erhöhen,
um die PCR für
die Detektion von SNPs einzusetzen.
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Auf
der einen Seite wird ein Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure mit
einer Ligase ebenfalls praktisch eingesetzt. Das LCR-Verfahren (Ligase
Kettenreaktion, Laffler TG; Garrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol.
Clin. (Paris), 51:9, 821-6, 1993) basiert auf der Reaktion, in welcher
zwei benachbarte Sonden mit einer Zielsequenz hybridisiert werden
und durch eine Ligase miteinander verknüpft werden. Die zwei Sonden
können
nicht miteinander verknüpft
werden ohne die Zielnukleotidsequenz, und deshalb ist das Vorhandensein von
einem verknüpften
Produkt ein Indikator für
die Ziel-Nukleotidsequenz. Da das LCR-Verfahren ebenfalls die Regelung der
Temperatur zur Trennung von einer komplementären Kette von einer Matrize
erfordert, entstehen dieselben Probleme wie im PCR-Verfahren. Für eine LCR
gibt es ebenfalls einen Bericht über
ein Verfahren zum Verbessern der Spezifität durch Hinzufügen des
Schrittes des Bereitstellens eines Strangbruchs zwischen den benachbarten
Sonden und Schließen
des Strangbruchs durch eine DNA-Polymerase. Jedoch kann man in diesem
modifizierten Verfahren lediglich Spezifität erwarten und es verbleibt
immer noch das Problem, dass eine Regelung der Temperatur nötig ist.
Ferner führt
die Verwendung von dem zusätzlichen
Enzym zu einem Anstieg der Kosten.
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Ein
Verfahren, das SDA-Verfahren (Strangverdrängungsamplifikation) [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396, 1992] [Nucleic Acid. Res., 20,
1691-1696, 1992] genannt wird, ist ebenfalls bekannt als ein Verfahren zum
Amplifizieren von DNA, die eine Sequenz als Matrize aufweist, welche
Sequenz komplementär
zu einer Zielsequenz ist. In dem SDA-Verfahren wird eine spezielle
DNA-Polymerase verwendet, um eine komplementäre Kette ausgehend von einem
Primer, der komplementär
zu der 3'-Seite
von einer bestimmten Nukleotidsequenz ist, zu synthetisieren, während eine
doppelstrangige Kette verdrängt
wird, wenn eine an der 5'-Seite
von der Sequenz vorhanden ist. In der vorliegenden Beschreibung
beziehen sich die einfachen Ausdrücke "5'-Seite" oder "3'-Seite" auf die Seite von einer Kette, die
als Matrize dient. Weil eine doppelstrangige Kette an der 5'-Seite verdrängt wird
durch eine neu synthetisierte komplementäre Kette, wird diese Technik
SDA-Verfahren genannt. Der Schritt des Temperaturänderns,
welcher essentiell in dem PCR-Verfahren ist, kann in dem SDA-Verfahren
ausgelassen werden durch vorheriges Einfügen einer Restriktionsenzym-Erkennungssequenz in
eine angelagerte Sequenz als einen Primer. Das heißt, ein
Strangbruch, der durch ein Restriktionsenzym geschaffen wird, stellt
eine 3'-OH-Gruppe
bereit, die als Ausgangspunkt für
die Synthese von einer komplementären Kette dient, und die vorher
synthetisierte komplementäre
Kette wird als eine einzelstrangige Kette freigesetzt durch die
Strangverdrängunsgsynthese
und dann wieder verwendet als eine Matrize für folgende Synthesen von komplementären Ketten.
Auf diese Weise ist die komplizierte Regelung der Temperatur, die
in dem PCR-Verfahren essentiell ist, in dem SDA-Verfahren nicht
erforderlich.
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In
dem SDA-Verfahren sollte das Restriktionsenzym, welches einen Strangbruch
erzeugt, jedoch zusätzlich
zu der DNA-Polymerase von der Art der Strangverdrängung verwendet
werden. Dieses Erfordernis für ein
zusätzliches
Enzym ist einer der Hauptgründe
für höhere Kosten.
Weil das Restriktionsenzym nicht für die Spaltung von beiden Doppelstrangketten
verwendet wird, sondern zum Einfügen
von einem Strangbruch (das heißt,
Spalten von nur einer der Ketten), sollte ferner ein dNTP-Derivat,
wie beispielsweise α-thio-dNTP,
als ein Substrat für
die Synthese eingesetzt werden, um die andere Kette resistent gegenüber dem
Verdau mit dem Enzym zu machen. Demgemäß hat das Amplifikationsprodukt
einer SDA eine Struktur, die sich von der Struktur von natürlichen
Nukleinsäuren
unterscheidet, und es besteht eine Beschränkung gegenüber der Spaltung mit Restriktionsenzymen
oder gegenüber
der Anwendung von dem Amplifikationsprodukt für das Klonen von Genen. In
dieser Hinsicht besteht auch ein Hauptgrund für die höheren Kosten. Wenn das SDA-Verfahren
auf eine unbekannte Sequenz angewendet wird, besteht ferner die
Möglichkeit,
dass die gleiche Nukleotidsequenz wie die Restriktionsenzym-Erkennungssequenz,
die zum Einfügen
eines Strangbruchs verwendet wird, in einer Region, die synthetisiert
werden soll, vorhanden ist. In diesem Fall kann es vorkommen, dass
eine vollständig
komplementäre
Kette daran gehindert wird, synthetisiert zu werden.
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NASBA
(Nukleinsäure-basierte
Amplifikation, auch genannt das TMA/Transkriptionsvermittelte Amplifikationsverfahren),
ist bekannt als Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäure, wobei
die komplizierte Regelung der Temperatur nicht erforderlich ist.
NASBA ist ein Reaktionssystem, in welchem DNA durch eine DNA-Polymerase
in Gegenwart von einer Ziel-RNA als Matrize synthetisiert wird mit
einer Sonde, der ein T7-Promotor hinzugefügt ist, und in welchem das
Produkt mit einer zweiten Sonde in eine doppelstrangige Kette ausgebildet
wird, gefolgt von einer Transkription durch T7-RNA-Polymerase mit
der gebildeten doppelstrangigen Kette als eine Matrize, um eine
große
Menge von RNA zu amplifizieren (Nature, 350, 91-92, 1991). NASBA
erfordert einige Hitze-Denaturierungsschritte, bis die doppelstrangige
DNA komplettiert ist, jedoch die nachfolgende transkriptionale Reaktion
durch T7-RNA-Polymerase läuft
unter isothermen Bedingungen ab. Jedoch ist eine Kombination von
verschiedenen Enzymen, wie beispielsweise Reverse Transkriptase,
RNase H, DNA-Poiymerase und T7-RNA-Polymerase erforderlich, und
dies ist unvorteilhaft für
die Kosten, wie dies auch bei der SDA der Fall ist. Ferner, weil
es kompliziert ist, die Bedingungen für eine Vielzahl von Enzymreaktionen
aufzustellen, wird dieses Verfahren nur unwahrscheinlich Verbreitung
als ein generelles Analyseverfahren finden. In den bekannten Reaktionen
zur Amplifikation von Nukleinsäure
verbleiben also Probleme, wie beispielsweise die komplizierte Kontrolle
der Temperatur und die Notwendigkeit von mehreren Enzymen, wie sie
oben beschrieben sind.
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Für diese
bekannten Reaktionen zum Synthetisieren von Nukleinsäure gibt
es nur wenige Berichte über
einen Versuch zur weiteren Verbesserung der Effizienz der Synthese
von Nukleinsäure
ohne Einbußen der
Spezifität
oder einen Kostennachteil. Zum Beispiel, in einem Verfahren, das
RCA (Rolling-Circle Amplifikation) genannt wird, wurde es gezeigt,
dass einzelstrangige DNA, die eine Reihe von Nukleotidsequenzen
aufweist, die komplementär
zu einer Padlock-Sonde sind, kontinuierlich synthetisiert werden
kann in der Gegenwart von einer Zielnukleotidsequenz (Paul M. Lizardi
et al., Nature Genetics, 19, 225-232, Juli 1998). In der RCA, wird
eine Padlock-Sonde verwendet, die eine spezielle Struktur aufweist,
worin jedes von dem 5'-
und dem 3'-Ende
von einem einzelnen Oligonukleotid eine benachbarte Sonde in einer
LCR ausmacht. Dann wird die kontinuierliche Reaktion zum Synthetisieren
einer komplementären
Kette mit der Padlock-Sonde als eine Matrize, welche verbunden und
zyklisiert wurde in der Gegenwart von einer Zielnukleotidsequenz
gestartet durch Kombination mit einer Polymerase, die eine Reaktion
von der Art einer Strangverdrängung
zur Synthese einer komplementären
Kette synthetisiert. Einzelstrangige Nukleinsäure, die eine Struktur mit
einer Serie von Regionen aufweist, die jeweils aus der gleichen
Nukleotidsequenz bestehen, wird somit ausgebildet. Ein Primer wird
ferner angelagert an diese einzelstrangige Nukleinsäure, um
deren komplementäre
Kette zu synthetisieren und ein hoher Grad an Amplifikation wird
somit erreicht. Jedoch bleibt weiterhin das Problem der Notwendigkeit
von einer Vielzahl von Enzymen. Ferner hängt die Auslösung von
der Synthese der komplementären
Kette von der Reaktion des Verbindens zweier benachbarter Regionen
ab, und die Spezifität
ist grundsätzlich
die gleiche wie bei der LCR.
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Mit
dem Ziel des Bereitstellens von 3'-OH ist ein Verfahren bekannt, in welchem
eine Nukleotidsequenz an dem 3'-Ende
mit einer Sequenz versehen ist, die komplementär dazu ist, und in welchem
eine Haarnadel-Schleife an dem Ende ausgebildet wird (Gene, 71,
29-40, 1988). Die Synthese von der komplementären Kette mit einer Zielsequenz
selbst als eine Matrize startet an der Haarnadel-Schleife, um eine
einzelstrangige Nukleinsäure
auszubilden, die aus der komplementären Nukleotidsequenz besteht.
Zum Beispiel ist in der
PCT/FR95/00891 eine
Struktur realisiert, in welcher ein sich Anlagern in der gleichen
Kette an dem Ende auftritt, an welches Ende eine komplementäre Nukleotidsequenz
angebunden worden ist. In diesem Verfahren ist jedoch der Schritt
essentiell, in dem das Ende die Basenpaarung mit der komplementären Kette
aufgibt und eine Basenpaarung erneut in der selben Kette ausgebildet
wird. Es wird geschätzt,
dass dieser Schritt abläuft in
Abhängigkeit
von einem subtilen Gleichgewichtszustand von gegenseitig komplementären Nukleotidsequenzen
an dem Ende, die an Basenpaarungen beteiligt sind. Das heißt, ein
Gleichgewichtszustand, der zwischen Basenpaarung mit einer komplementären Kette
und Basenpaarung in der gleichen Kette aufrecht erhalten wird, wird
ausgenutzt, und nur ein sich Anlagern an die Nukleotidsequenz in
der gleichen Kette dient als Ausgangspunkt für die Synthese der komplementären Kette.
Demgemäß ist es
zu beachten, dass strenge Reaktionsbedingungen aufgestellt werden
sollten, um eine hohe Reaktionseffizienz zu erzielen. Ferner bildet
in diesem Stand der Technik der Primer selbst eine Schleifenstruktur
aus. Wenn einmal ein Primer-Dimer gebildet wurde, wird demgemäß die Amplifikationsreaktion
automatisch initiiert, ohne Rücksicht
darauf, ob eine Zielnukleotidsequenz vorhanden ist oder nicht, und
ein unspezifisches Syntheseprodukt wird somit ausgebildet. Dies kann
ein schwerwiegendes Problem sein. Weiterhin führt die Bildung von dem Primer-Dimer
und dem nachfolgenden Verbrauch von dem Primer durch eine unspezifische
Synthesereaktion zu einer Reduzierung in der Amplifikationseffizienz
von der erwünschten
Reaktion.
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Im Übrigen gibt
es einen Bericht, dass eine Region, die nicht als Matrize für eine DNA-Polymerase dient,
verwendet wurde, um eine 3'-terminale
Struktur zu realisieren, die sich an die gleiche Kette anlagert (
EP713922 ). Dieser Bericht
nennt die gleichen Probleme, die in der obigen
PCT/FR95/00891 genannt werden, in
Bezug auf die Verwendung eines dynamischen Gleichgewichts an dem
Ende oder der in Bezug auf die Möglichkeit
einer unspezifischer Synthesereaktion durch die Ausbildung von einem
Primer-Dimer. Ferner sollte eine spezielle Region, die nicht als
eine Matrize für
eine DNA-Polymerase dient, als ein Primer hergestellt werden.
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In
verschiedenen Signal-Amplifikationsreaktionen, auf welche das Prinzip
von der NASBA, das oben beschrieben ist, angewendet wird, wird weiterhin
oftmals ein Oligonukleotid verwendet, das eine Haarnadel-Struktur
an dessen Ende aufweist, um eine doppelstrangige Promoter-Reglon
zur Verfügung
zu stellen (
JP-A 5-211873 ).
Diese Techniken sind jedoch nicht solche, die eine ausreichende
Bereitstellung von 3'-OH
für die
Synthese von einer komplementären
Kette erlauben. In der
JP-A
10-510161 (
WO 96/17079 )
wird ferner eine Haarnadel-Schleifenstruktur, die ein 3'-Ende aufweist, das
sich an der gleichen Kette anlagert, eingesetzt zum Zwecke des Erhaltens
einer DNA-Matrize, die durch eine RNA-Polymerase transkribiert wird. In diesem Verfahren
wird die Matrize amplifiziert durch eine Transkription in RNA und
einer reversen Transkription von RNA in DNA. In diesem Verfahren
kann jedoch das Reaktionssystem nicht ohne die Kombination von einer Vielzahl
von Enzymen aufgestellt werden.
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Die
WO 97/04131 beschreibt ein
Verfahren zur exponentiellen Amplifikation einer Polynukleotid-Haarnadel,
welches einen einzigen Primer verwendet, der dazu in der Lage ist,
an einer Stelle von dem 3'-Teil
von dem Haarnadel-Polynukleotid zu hybridisieren, welche Stelle
für eine
Primer-Verlängerung
in den Stammbereich oder den Duplex-Teil von der Schleife geeignet
ist. Die Basenpaarung von dem Schleifen-Polynukleotid wird unterbrochen
und einer Hybridisierung mit dem Primer ausgesetzt und dann wird
der Primer verlängert, wodurch
ein verlängertes
Produkt erzeugt wird.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren zum Synthetisieren
von Nukleinsaure bereitzustellen, das auf einem neuen Prinzip basiert.
Eine mehr spezifische Aufgabe ist es ein Verfahren bereitzustellen,
das dazu in der Lage ist, die Synthese von einer Nukleinsäure, die
von einer Sequenz abhängt,
effizient bei geringen Kosten zu realisieren. Das heißt, eine
Aufgabe von der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereitzustellen,
das dazu in der Lage ist, die Synthese und Amplifikation von Nukleinsäure durch
ein einziges Enzym selbst unter isothermen Reaktionsbedingungen
bereitzustellen. Ein weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es ein Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure bereitzustellen,
welches eine hohe Spezifität
realisieren kann, die nur schwer mit den bekannten Reaktionsprinzipien
zur Synthese von Nukleinsäure
zu erreichen ist, sowie ein Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäure durch
Anwenden besagten Syntheseverfahrens.
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Die
vorliegenden Erfinder fokussierten ihre Aufmerksamkeit auf die Tatsache,
dass der Einsatz von einer Polymerase, die eine Reaktion von der
Art einer Strangverdrängung
zur Synthese einer komplementären Kette
katalysiert, geeignet ist für
die Nukleinsäuresynthese,
die nicht abhängig
ist von einer komplizierten Regelung der Temperatur. Solch eine
DNA-Polymerase ist
ein Enzym, welches in der SDA und der RCA eingesetzt wird. Jedoch,
selbst wenn so ein Enzym verwendet wird, ist in den bekannten Verfahren
immer eine weitere Enzymreaktion erforderlich, um, basierend auf
Primern, 3'-OH als
den Ausgangspunkt für
die Synthese bereitzustellen, wie beispielsweise der SDA.
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Unter
diesen Voraussetzungen untersuchten die vorliegenden Erfinder die
Bereitstellung von 3'-OH aus
einem komplett anderen Gesichtswinkel als dem der bekannten Ansätze. Als
ein Ergebnis fanden die vorliegenden Erfinder heraus, dass das Verwenden
eines Oligonukleotids, das eine spezielle Struktur aufweist, 3'-OH ohne eine weitere
Enzymreaktion bereit gestellt werden kann, wodurch die vorliegende
Erfindung vollendet wurde. Das heißt, die vorliegende Erfindung
bezieht sich auf ein Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure, ein
Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäure durch Anwenden des besagten
Verfahrens zum Synthetisieren von Nukleinsäure und ein Kit umfassend Oligonukleotide,
die besagte Verfahren ausführen,
so wie nachfolgend beschrieben:
- 1. Ein Verfahren
zum Synthetisieren von Nukleinsäure,
die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelsträngigen Kette
verknüpft
sind, umfassend:
a) den Schritt des Bereitstellens einer zweiten
Nukieinsäure,
welche zweite Nukleinsäure
an ihrem 3'-Ende mit
einer Region F1 ausgestattet ist, die in der Lage ist, sich an einen
Teil F1c in derselben Kette anzulagern und die, bei Anlagerung der
Region F1 an F1c, in der Lage ist, eine Schleife zu bilden, die
eine Region F2c enthält,
die zur Basenpaarung in der Lage ist, wobei die zweite Nukleinsäure durch
die folgenden Schritte bereitgestellt wird:
i) den Schritt
des Anlagerns einer Region F2 in einem ersten Oligonukleotid, das
wenigstens zwei Regionen F2 und F1 c umfasst, an eine Region F2c
in einer Nukleinsäure,
die als Matrize dient, wobei F1c verbunden ist mit der 5'-Seite von F2, und
wobei F2 eine Region ist, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die
komplementär
ist zu einer willkürlichen
Region F2c in der Matrizen-Nukleinsäure, die eine spezifische Nukleotidsequenz
besitzt, und F1 c eine Region ist, die im wesentlichen dieselbe
Nukleotidsequenz wie die Region F1c besitzt, die an der 5'-Seite von der Region
F2c in Matrizen-Nukleinsäure, die
eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, angeordnet ist,
ii)
den Schritt des Synthetisierens einer ersten Nukleinsäure, die
eine Nukleotidsequenz besitzt, die komplementär zu der Matrize ist, wobei
F2 in dem ersten Oligonukleotid als Ausgangspunkt der Synthese dient,
iii)
den Schritt, eine willkürliche
Region in der ersten Nukleinsäure,
die in Schritt ii) synthetisiert wurde, für eine Basenpaarung zugänglich zu
machen, wobei der Schritt durchgeführt wird durch eine Strangverdrängungssynthese
von einer komplementären
Kette durch eine Polymerase, welche die Strangverdrängungsreaktion
katalysiert, wobei ein erster äußerer Primer,
der sich an die 3'-Seite
von F2c in der Matrize anlagert, als Ausgangspunkt für die Synthese
dient,
iv) den Schritt des Anlagerns eines zweiten Oligonukleotides,
das eine Nukleotidsequenz besitzt, die komplementär ist zu
einer willkürlichen
Region in der ersten Nukleinsäure,
die in Schritt iii) für
eine Basenpaarung zugänglich
gemacht wurde, gefolgt vom Synthetisieren der zweiten Nukleinsäure mit
dem zweiten Oligonukleotid als Ausgangspunkt der Synthese, und
v)
dem Zugänglichmachen
der Region F1 an dem 3'-Ende
von der zweiten Nukleinsäure
für eine
Basenpaarung, wobei der Schritt durchgeführt wird durch die Strangverdrängungssynthese
von einer komplementären
Kette durch eine Polymerase, welche die Strangverdrängungsreaktion
katalysiert, wobei ein zweiter äußerer Primer
als Ausgangspunkt für
die Synthese dient, welcher zweite äußere Primer sich an die 3'-Seite von der Region
in der ersten Nukleinsäure
anlagert, an welche Region sich das zweite Oligonukleotid anlagert,
das in Schritt (iv) als Ausgangspunkt für die Synthese dient,
b)
den Schritt des Durchführens
einer Synthese von einer komplementären Kette, wobei das 3'-Ende von F1, das
an F1c angelagert ist, als Ausgangspunkt der Synthese dient,
c)
den Schritt des Anlagerns des ersten Oligonukleotides, das an seinem
3'-Ende mit der
Region F2 versehen ist, die aus einer Sequenz besteht, welche komplementär zur der
Region F2c ist, an die Region F2c von der zweiten Nukleinsäure, und
des Synthetisierens, mit dem gesagten Oligonukleotid als Ausgangspunkt
der Synthese, einer komplementären
Kette durch eine Polymerase, die die Strangverdrängungsreaktion katalysiert,
um die komplementäre
Kette zu verdrängen,
die im Schritt b) synthetisiert wurde, und
d) den Schritt des
Anlagerns eines Polynukleotides, das an dessen 3'-Ende mit einer Sequenz ausgestattet ist,
die komplementär
ist zu einer willkürlichen
Region in der Kette, die in Schritt c) verdrängt wurde, an die komplementäre Kette,
die in Schritt c) verdrängt
wurde und die für
eine Basenpaarung zugänglich
ist, und des Synthetisierens, mit dem 3'-Ende von dem Oligonukleotid als Ausgangspunkt
der Synthese, einer komplementären
Kette durch eine Polymerase, die eine Strangverdrängungsreaktion
katalysiert, um die komplementäre
Kette zu verdrängen,
die in Schritt c) synthetisiert wurde.
- 2. Das Verfahren gemäß Punkt
1, wobei die willkürliche
Region, die in Schritt iii) eine Basenpaarung ermöglicht,
eine Region R2c ist, und das zweite Oligonukleotid in Schritt iv)
wenigstens zwei Regionen R2 und R1c umfasst, wobei R1c verbunden
ist mit der 5'-Seite
von R2, und wobei R2 eine Region ist, die eine Nukleotidsequenz
besitzt, die komplementär
ist mit der Region R2c in der ersten Nukleinsäure, die eine spezifische Nukleotidsequenz
besitzt, und R1c eine Region ist, die im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie
eine Region R1c besitzt, die an der 5'-Seite von der Region R2c in der ersten
Nukleinsäure,
die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, lokalisiert ist.
- 3. Das Verfahren gemäß Punkt
2, wobei die Schmelztemperatur von jedem Oligonukleotid und dessen
komplementärer
Region in der Matrize, die in der Reaktion verwendet wird, im nachfolgenden
Verhältnis
unter derselben Stringenz liegt: (äußerer Primer/Region an der
3'-Seite in der
Matrize) ≤ (F2c/F2
und R2c/R2) ≤ (F1c/F1
und R1c/R1).
- 4. Das Verfahren gemäß einem
der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die als die Matrize dient,
RNA ist, und die Synthese der komplementären Kette in Schritt ii) durchgeführt wird
durch ein Enzym, das eine Reverse-Transkriptase-Aktivität besitzt.
- 5. Das Verfahren gemäß Punkt
1, wobei die Strangverdrängungsreaktion
des Synthetisierens einer komplementären Kette durchgeführt wird
in der Anwesenheit von einem Schmelztemperatur-Regulator.
- 6. Das Verfahren gemäß Punkt
5, wobei der Schmelztemperatur-Regulator Betain ist.
- 7. Das Verfahren gemäß Punkt
6, wobei 0,2 bis 3,0 M Betain in der Reaktionslösung zugelassen wird.
- 8. Ein Kit für
die Synthese von einer Nukleinsäure,
die komplementäre
Ketten besitzt, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette
verknüpft
sind, enthaltend die folgenden Elemente:
i) ein erstes Oligonukleotid
umfassend wenigstens zwei Regionen F2 und F1c, wobei F1c mit der
5'-Seite von F2
verbunden ist, und wobei F2 eine Region ist, die eine Nukleotidsequenz
besitzt, die komplementär ist
zu einer willkürlichen
Region F2c in einer Matrizen-Nukleinsäure, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt,
und F1 c eine Region ist, die im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz
wie eine Region F1 c besitzt, die an der 5'-Seite von der Region F2c in Matrizen-Nukleinsäure, die
eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, angeordnet ist;
ii)
ein zweites Oligonukleotid umfassend wenigstens zwei Regionen R2
und R1c, wobei R1c mit der 5'-Seite von
R2 verbunden ist, und wobei R2 eine Region ist, die eine Nukleotidsequenz
besitzt, die komplementär ist
mit einer willkürlichen Region
R2c in einer komplementären
Kette, synthetisiert mit dem ersten Oligonukleotid als Ausgangpunkt
der Synthese, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, und
R1c eine Region ist, die im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz
wie eine Region R1c besitzt, die an der 5'-Seite von der Region R2c in der komplementären Kette,
die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, lokalisiert ist;
iii)
ein erster äußerer Primer
mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Region F3c,
die lokalisiert ist an der 3'-Seite
von der Region F2c in der Nukleinsäure, die als Matrize dient;
iv)
eine DNA-Polymerase, die eine Reaktion von der Art einer Strangverdrängung, zur
Synthese einer komplementären
Kette katalysiert;
v) ein Nukleotid, das als Substrat für das Element
iv) dient, und
vi) ein zweiter äußerer Primer mit einer Nukleotidsequenz,
die komplementär
ist zu einer Region R3c, die lokalisiert ist an der 3'-Seite von der willkürlichen
Region R2c in der komplementären
Kette, die mit dem ersten Oligonukleotid als Ausgangspunkt für die Synthese
synthetisiert wird.
- 9. Das Kit gemäß Punkt
8 umfassend ein Nachweismittel zum Nachweisen des Produktes von
der Nukleinsäuresynthesereaktion.
- 10. Ein Verfahren zum Synthetisieren eines Nukleinsäuremoleküls umfassend:
a.
Zugeben der Elemente i) bis vi) von dem Kit gemäß Punkt 8 zu einer einzelstrangigen
oder doppelstrangigen Nukleinsäure,
die als Matrize dient; und
b. Inkubieren des Gemisches von
Schritt a) bei solch einer Temperatur, dass die Nukleotidsequenz,
welche das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid ausbildet,
stabile Basenpaarung mit dessen komplementären Nukleotidsequenzen bilden
kann, während
die Enzymaktivität
erhalten bleiben kann.
- 11. Das Verfahren gemäß Punkt
10, wobei das Gemisch ferner einen Regulator für die Schmelztemperatur umfasst.
- 12. Das Verfahren gemäß Punkt
11, wobei der Regulator für
die Schmelztemperatur Betain ist.
- 13. Das Verfahren gemäß Punkt
12, wobei 0,2 bis 3,0 M Betain vorhanden ist.
- 14. Das Verfahren gemäß Punkt
10, wobei das Gemisch ferner umfasst ein Nachweismittel zum Nachweisen
des Produktes von der Nukleinsäuresynthese,
welche gemäß dem Verfahren
nach Punkt 10 erstellt wird.
- 15. Das Verfahren gemäß Punkt
10, wobei die Matrizen-Nukleinsäure
RNA ist und die DNA-Polymerase Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist.
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Die
Nukleinsäure,
die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind, welche die Aufgabe von der Synthese in der vorliegenden Erfindung
ist, bedeutet eine Nukleinsäure,
die gegenseitig komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die Seite an Seite in einer einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind. In der vorliegenden Erfindung sollte die Nukleinsäure ferner
eine Nukleotidsequenz zum Ausbilden einer Schleife zwischen den
komplementären
Ketten enthalten. In der vorliegenden Erfindung wird diese Sequenz
die schleifen-bildende Sequenz genannt. Die Nukleinsäure, die
durch die vorliegende Erfindung synthetisiert wird, ist im Wesentlichen
aufgebaut aus abwechselnd komplementären Ketten, die über die
schleifen-bildende Sequenz miteinander verknüpft sind. Im Wesentlichen wird
ein Strang, der nicht in zwei oder mehr Moleküle durch Dissoziation von Basenpaarung
getrennt wird, eine einzelstrangige Kette genannt, unabhängig davon,
ob ein Strang teilweise an Basenpaarungen beteiligt ist oder nicht.
Die komplementäre
Nukleotidsequenz kann Basenpaarungen in der gleichen Kette ausbilden.
Ein intramolekulares Basenpaarungsprodukt, welches dadurch erhalten
werden kann, dass es der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung,
die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette
verknüpft
sind, erlaubt wird, eine Basenpaarung in der gleichen Kette einzugehen,
erzielt eine Region, die augenscheinlich eine doppelstrangige Kette
darstellt, und eine Schleife, die nicht an Basenpaarung beteiligt
ist.
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Das
heißt,
die Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung, die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind, enthält
komplementäre
Nukleotidsequenzen, die zur Anlagerung in der gleichen Kette in
der Lage sind, und deren angelagerte Produkte können definiert werden als einzelstrangige
Nukleinsäuren,
die eine Schleife ausbilden, die keine Basenpaarung an ihrer gekrümmten Schleifenregion
aufweist. Ein Nukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die
komple mentär
dazu ist, kann sich an die Schleife, welche nicht in Basenpaarung
verwickelt ist, anlagern. Die schleifen-bildende Sequenz kann eine
beliebige Nukleotidsequenz sein. Die schleifen-bildende Sequenz
ist zu einer Basenpaarung in der Lage, um so die Synthese von einer
komplementären
Kette zur Verdrängung
zu initiieren, und die schleifen-bildende Sequenz ist vorzugsweise
versehen mit einer Sequenz, die unterscheidbar ist von einer Nukleotidsequenz,
die in der anderen Region angeordnet ist, um eine spezifische Anlagerung
zu erzielen. In der vorliegenden Erfindung enthält die schleifen-bildende Sequenz
zum Beispiel im Wesentlichen die gleiche Nukleotidsequenz wie eine
Region F2c (oder R2c), die an der 3'-Seite von einer Region (das heißt F1c oder
R1c), lokalisiert ist, die von einer Nukleinsäure einer Matrize abgeleitet
ist, und die sich in der gleichen Kette anlagert.
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In
der vorliegenden Erfindung sind die im Wesentlichen gleichen Nukleotidsequenzen
wie folgt definiert. Das heißt,
wenn sich eine komplementäre
Kette, die mit einer bestimmten Sequenz als Matrize synthetisiert
wurde, an eine Zielnukleotidsequenz anlagert, um den Ausgangspunkt
für die
Synthese einer komplementären
Kette bereitzustellen, ist diese bestimmte Sequenz im Wesentlichen
die gleiche wie die Zielnukleotidsequenz. Zum Beispiel schließt im Wesentlichen
die gleiche Sequenz wie F2 nicht nur absolut die gleiche Nukleotidsequenz
wie F2 mit ein, sondern schließt
auch eine Nukleotidsequenz mit ein, die dazu in der Lage ist, als
eine Matrize zu dienen, welche eine Nukleotidsequenz ausmacht, die
dazu in der Lage ist, sich an F2 anzulagern und als ein Ausgangspunkt
für die
Synthese einer komplementären
Kette zu dienen. Der Ausdruck "Anlagern" in der vorliegenden
Erfindung bedeutet die Ausbildung von einer doppelstrangigen Struktur
von Nukleinsäuren
durch Basenpaarung auf der Grundlage von dem Gesetz nach Watson-Crick.
Dementsprechend, selbst wenn eine Nukleinsäurekette, die Basenpaarung
ausbildet, eine einzelstrangige Kette ist, erfolgt ein Anlagern,
wenn intramolekulare komplementäre
Nukleotidsequenzen basengepaart werden. In der vorliegenden Erfindung
haben Anlagern und Hybridisieren die gleiche Bedeutung, in dem Sinne,
dass die Nukleinsäure
eine doppelstrangige Struktur durch Basenpaarung ausbildet.
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Die
Anzahl der Paare von der komplementären Nukleotidsequenz, welche
die Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung ausmachen, ist wenigstens 1. Gemäß einer gewünschten Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung kann die Anzahl 2 oder mehr sein.
In diesem Fall besteht theoretisch keine obere Grenze für die Anzahl
der Paare von komplementären
Nukleotidsequenzen, welche die Nukleinsäure ausmachen. Wenn die Nukleinsäu re als
das Syntheseprodukt der vorliegenden Erfindung durch mehrere Sätze von komplementären Nukleotidsequenzen
festgelegt wird, besteht diese Nukleinsäure aus sich wiederholenden identischen
Nukleotidsequenzen.
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Die
Nukleinsäure,
die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind, die durch die vorliegende Erfindung synthetisiert wird, braucht
nicht die gleiche Struktur wie natürlich vorkommende Nukleinsäuren zu
haben. Es ist bekannt, dass, wenn ein Nukleotidderivat durch die
Aktion von einer DNA-Polymerase als Substrat beim Synthetisieren
von Nukleinsäure
verwendet wird, ein Nukleinsäurederivat
synthetisiert werden kann. Das Nukleotidderivat schließt Nukleotide
ein, die mit einem Radioisotop markiert sind, oder Nukleotidderivate,
die mit einem Bindungsligand wie Biotin oder Digoxin markiert sind.
Diese Nukleotidderivate können
verwendet werden, um Nukleinsäurederivate
als die Produkte zu markieren. Alternativ kann die Nukleinsäure des
Produktes, wenn fluoreszierende Nukleotide als Substrat verwendet
werden, ein fluoreszierendes Derivat sein. Dieses Produkt kann ferner
entweder DNA oder RNA sein. Welches davon ausgebildet wird, bestimmt
sich durch eine Kombination aus der Struktur von einem Primer, der
Art von einem Substrat für
die Polymerisation und den Reagenzien der Polymerisation zum Durchführen der
Polymerisation von Nukleinsäure.
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Die
Synthese der Nukleinsäure,
die die oben beschriebene Struktur aufweist, kann initiiert werden durch
die Verwendung von einer DNA-Poiymerase, die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist,
und einer Nukleinsäure,
welche an ihrem 3'-Ende
mit einer Region F1 versehen ist, die dazu in der Lage ist, sich
an einen Teil F1c in der gleichen Kette anzulagern, und welche Nukleinsäure beim
Anlagern von der Region F1 an F1c, dazu in der Lage ist, eine Schleife
auszubilden, welche Schleife eine Region F2c enthält, die
zur Basenpaarung in der Lage ist. Es gibt viele Berichte über die
Reaktion zum Synthetisieren einer komplementären Kette, wobei eine Haarnadel-Schleife
ausgebildet wird, und eine Probensequenz selbst als Matrize verwendet
wird, wohingegen in der vorliegenden Erfindung der Teil von der
Haarnadel-Schleife bereitgestellt wird mit einer Region, die zur
Basenpaarung in der Lage ist, und das ist ein neues Merkmal des
Verwendens von dieser Reaktion beim Synthetisieren einer komplementären Kette.
Durch Verwendung von dieser Region als dem Ausgangspunkt der Synthese,
wird eine komplementäre
Kette, die zuvor mit einer Probensequenz selbst als eine Matrize synthetisiert
wurde, verdrängt.
Danach ist eine Region R1c (willkürliche Region), die an dem
3'-Ende von der verdrängten Kette
lokalisiert ist, in einem Zustand, der zur Basenpaarung in der Lage
ist. Eine Region, die eine komplementäre Kette zu dieser R1c aufweist,
wird an diese angelagert, was in der Ausbildung von einer Nukleinsäure (2 Moleküle) resultiert,
die eine Nukleotidsequenz aufweist, die sich von F1 bis R1c erstreckt
und deren komplementäre
Kette abwechselnd über
die schleifen-bildende Sequenz verknüpft ist. In der vorliegenden Erfindung
kann die willkürliche
Region, wie beispielsweise R1c, willkürlich ausgewählt werden,
unter der Voraussetzung, dass diese an ein Polynukleotid angelagert
werden kann, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu dieser
Region ist, und dass eine komplementäre Kette, die mit dem Polynukleotid
als Ausgangspunkt für
die Synthese synthetisiert wurde, die erforderlichen Funktionen
der vorliegenden Erfindung aufweist.
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In
der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Nukleinsäure" verwendet. Die Nukleinsäure der
vorliegenden Erfindung schließt
im Allgemeinen DNA und RNA ein. Aber auch Nukleinsäure, deren
Nukleotide durch ein artifizielles Derivat ersetzt wurde, oder modifizierte
Nukleinsäure
von natürlicher
DNA oder RNA sind ebenfalls in der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
eingeschlossen, insoweit sie als eine Matrize zur Synthese von einer
komplementären
Kette dienen. Die Nukleinsäure
der vorliegenden Erfindung ist grundsätzlich in einer biologischen
Probe enthalten. Die biologische Probe schließt Tiere, Pflanzen oder mikrobielle
Gewebe, Zellen, Kulturen oder Ausschnitte oder Extrakte dieser ein.
Die biologische Probe der vorliegenden Erfindung schließt intrazelluläre parasitische
genomische DNA oder RNA ein, wie beispielsweise Viren oder Mycoplasmen.
Die Nukleinsäure
der vorliegenden Erfindung kann von Nukleinsäure, die in besagter mikrobieller Probe
enthalten ist, abgeleitet werden. Zum Beispiel sind cDNA, die aus
mRNA synthetisiert wurde, oder Nukleinsäure, die auf der Basis von
Nukleinsäure
amplifiziert wurde, welche Nukleinsäure von der biologischen Probe
abgeleitet wurde, typische Beispiele für die Nukleinsäure der
vorliegenden Erfindung.
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Die
charakteristische Nukleinsäure
der vorliegenden Erfindung, welche an ihrem 3'-Ende mit einer Region F1 versehen ist,
die dazu in der Lage ist, sich an einen Teil F1c in der gleichen
Kette anzulagern, und die, beim Anlagern von der Region F1 an F1c,
dazu in der Lage ist, eine Schleife auszubilden, die eine Region
F2c enthält,
die zur Basenpaarung in der Lage ist, kann durch verschiedene Verfahren
erhalten werden. In der vorliegenden Erfindung kann die Reaktion
des Synthetisierens einer komplementären Kette, unter Verwendung ei nes
Oligonukleotids mit der nachfolgenden Struktur, eingesetzt werden,
um die Struktur zu erhalten.
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Das
heißt,
das verwendbare Oligonukleotid in der vorliegenden Erfindung besteht
aus wenigstens zwei Regionen X2 und X1c, wie unten beschrieben,
wobei X1c mit der 5'-Seite
von X2 verbunden ist.
- X2: eine Region, die eine Nukleotidsequenz
aufweist, die komplementär
zu einer Region X2c in einer Nukleinsäure ist, die eine spezifische
Nukleotidsequenz besitzt.
- X1c: eine Region, die im Wesentlichen die gleiche Nukleotidsequenz
wie eine Region X1c aufweist, die an der 5'-Seite von der Region X2c in der Nukleinsäure mit
einer spezifischen Nukleotidsequenz angeordnet ist.
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Hier
bezieht sich die Nukleinsäure
mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, durch welche die Struktur von
dem Oligonukleotid gemäß der Erfindung
bestimmt wird, auf eine Nukleinsäure,
die als eine Matrize dient, wenn das Oligonukleotid der vorliegenden
Erfindung als ein Primer verwendet wird. In dem Fall der Detektion von
Nukleinsäure
basierend auf dem synthetischen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
ist die Nukleinsäure
mit einer spezifischen Nukleotidsequenz ein Ziel der Detektion oder
eine Nukleinsäure,
die von dem Detektionsziel abgeleitet ist. Die Nukleinsäure mit
einer spezifischen Nukleotidsequenz bezieht sich auf eine Nukleinsäure, von
welcher wenigstens ein Teil von der Nukleotidsequenz offenbart oder
vorhersagbar ist. Der Teil von der Nukleotidsequenz, der bekannt
ist, ist die Region X2c und die Region X1c, die an deren 5'-Seite lokalisiert
ist. Es kann angenommen werden, dass diese zwei Regionen benachbart
oder beabstandet voneinander angeordnet sind. Durch die die Lage
betreffende Anordnungsbeziehung von diesen beiden relativ zueinander
wird der Zustand von einer Schleife, die beim Selbst-Anlagern von
Nukleinsäure
als Produkt ausgebildet wird, bedingt. Der Abstand zwischen den
beiden ist vorzugsweise nicht sehr weit auseinander, damit die Nukleinsäure vorzugsweise
als das Produkt einer Selbst-Anlagerung gegenüber einem intermolekulares
Anlagern ausgebildet wird. Demzufolge ist das die Lage betreffende
Anordnungsverhältnis
von den beiden vorzugsweise so, dass diese einander benachbart sind
in einen Abstand von normalerweise 0 bis 100 Basen. Jedoch kann
bei der Ausbildung von einer Schleife durch Selbst-Anlagern, die
nachfolgend beschrieben wird, der Fall auftreten, dass es nachteilhaft
für die
Ausbildung von einer Schleife in einem gewünschten Zustand wäre, dass
die beiden zu nahe beieinander liegen.
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In
der Schleife besteht eine Notwendigkeit für eine Struktur für die Anlagerung
von einem neuen Oligonukleotid und für die Bereitschaft zum Initiieren
der Strangverdrängungsreaktion
zum Synthetisieren einer komplementären Kette mit besagtem Oligonukleotid
als Ausgangspunkt der Synthese. Insbesondere ist der Abstand zwischen
der Region X2c und der Region X1c, die an der 5'-Seite von X2c lokalisiert ist, ausgestaltet auf
0 bis 100 Basen, besonders wünschenswert
auf 10 bis 70 Basen. Diese numerischen Werte zeigen eine Länge exklusive
der X1c und der X2. Die Anzahl der Basen, welche den Teil von einer
Schleife ausmachen, ist die Anzahl von dieser Länge plus einer Region, die
X2 entspricht.
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Die
beiden Ausdrücke "die gleiche bzw.
dieselbe" und "komplementär", die zur Charakterisierung
von der Nukleotidsequenz verwendet werden, die das Oligonukleotid
gemäß der vorliegenden
Erfindung ausmacht, bedeuten nicht, dass diese absolut die gleichen
oder absolut komplementär
sind. Das heißt,
die gleiche Sequenz wie eine bestimmte Sequenz schließt Sequenzen
mit ein, die komplementär
zu Nukleotidsequenzen sind, die dazu in der Lage sind, sich an eine
bestimmte Sequenz anzulagern. Auf der anderen Seite bedeutet die
komplementäre
Sequenz eine Sequenz, die dazu in der Lage ist, sich unter stringenten
Bedingungen anzulagern, um ein 3'-Ende
bereitzustellen, das als ein Ausgangspunkt für die Synthese von einer komplementären Kette
dient.
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Herkömmlicherweise
sind die Regionen X2 und X1c, welche das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung für
die Nukleinsäure
mit einer spezifischen Nukleotidsequenz ausmachen, benachbart angeordnet
ohne zu überlappen.
Wenn ein gemeinsamer Teil in beiden Nukleotidsequenzen auftritt,
können
die beiden abschnittsweise überlappen.
Weil X2 als ein Primer fungieren soll, sollte X2 immer ein 3'-Ende sein. Andererseits
sollte X1c die Funktion von einem Primer, wie nachfolgend beschrieben,
an dem 3'-Ende von
einer komplementären
Kette ermöglichen,
die mit der Nukleinsäure
als Matrize synthetisiert wird, und daher sollte X1c an dem 5'-Ende angeordnet
sein. In dem nächsten
Schritt dient die komplementäre
Kette, die mit diesem Oligonukleotid als Ausgangspunkt der Synthese
erhalten worden ist, als eine Matrize zur Synthese von einer komplementären Kette
in der umgekehrten Richtung, und schließlich wird der Teil von dem
Oligonukleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung als eine Matrize in eine komplementäre Kette kopiert. Das 3'-Ende, das beim Kopieren
erzeugt wird, hat die Nukleotidsequenz X1, welche sich an X1c in
der gleichen Kette anlagert, um eine Schleife zu bilden.
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet das Oligonukleotid ein solches,
das zwei Erfordernisse erfüllt, nämlich, es
muss dazu in der Lage sein, komplementäre Basenpaarungen auszubilden,
und dazu in der Lage sein, eine -OH-Gruppe bereitzustellen, die
als Ausgangspunkt der Synthese einer komplementären Kette an dem 3'-Ende dient. Demgemäß ist das
Rückgrat
des Oligonukleotids nicht notwendigerweise auf eines beschränkt, das über Phosphodiesterbindungen
verfügt.
Zum Beispiel kann das Rückgrat
aufgebaut sein aus einem Phosphothioatderivat mit S anstelle von
0 als ein Rückgrat
oder einer Peptid-Nukleinsäure, die
auf Peptidbindungen basiert. Die Basen können solche sein, die zur Basenpaarung
mit komplementären
Basen in der Lage sind. In der Natur gibt es fünf Basen, nämlich A, C, T, G und U, aber
die Base kann auch ein Analogon sein, wie beispielsweise Bromdeoxyuridin.
Das Oligonukleotid, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird,
fungiert vorzugsweise nicht nur als der Ausgangspunkt der Synthese,
sondern ebenfalls als Matrize für die
Synthese einer komplementären
Kette. Der Ausdruck Polynukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung schließt Oligonukleotide
mit ein. Der Begriff "Polynukleotid" wird in dem Fall
verwendet, dass die Kettenlänge nicht
begrenzt ist, während
der Begriff "Oligonukleotid" so verwendet wird,
dass er sich auf ein Nukleotidpolymer bezieht, das eine relativ
kurze Kettenlänge
aufweist.
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Das
Oligonukleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung hat solch eine Kettenlänge,
dass es dazu in der Lage ist, Basenpaare mit einer komplementären Kette
auszubilden, und die erforderliche Spezifität unter dem gegebenen Umfeld
in den verschiedenen Reaktionen des Synthetisierens von Nukleinsäure, die
nachfolgend beschrieben sind, beizubehalten. Insbesondere besteht
das Oligonukleotid aus 5 bis 200 Basenpaaren, vorzugsweise aus 10
bis 50 Basenpaaren. Die Kettenlänge
von einem Primer, der die bekannte Polymerase erkennt, welche die
Sequenzabhängige
Synthesereaktion der Nukleinsäure
katalysiert, beträgt
wenigstens etwa 5 Basen, so dass die Kettenlänge des sich anlagernden Teils
länger
als dies sein sollte. Zusätzlich
ist eine Länge
von 10 oder mehr Basen statistisch gesehen erwünscht, um eine Spezifität der Nukleotidsequenz
zu erwarten. Andererseits ist die Herstellung von einer zu langen
Nukleotidsequenz mittels chemischer Synthese schwierig und daher
ist die oben beschriebene Kettenlänge als eine gewünschte Bereichsangabe
beispielhaft erläutert.
Diese beispielhaft erläuterte
Kettenlänge
bezieht sich auf die Kettenlänge
von einem Teil, der sich an eine komplementäre Kette anlagert. Wie nachfolgend
beschrieben ist, kann sich das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung schließlich
an wenigstens zwei Regionen individuell anlagern. Demgemäß ist es
so zu verstehen, dass die hier beispielhaft erläuterte Kettenlänge die
Kettenlänge
von jeder Region ist, welche das Oligonukleotid ausmacht.
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Ferner
kann das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung mit einer bekannten Markierungssubstanz markiert sein.
Die Markierungssubstanz schließt
Bindungsliganden, wie beispielsweise Digoxin und Biotin, Enzyme,
fluoreszierende Substanzen und lumineszierende Substanzen und Radioisotope
ein. Die Techniken des Ersetzens einer Base, welche ein Oligonukleotid
ausmacht, durch ein fluoreszierendes Analogon ist ebenfalls bekannt
(
WO95/05391 , Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91, 6644-6648, 1994).
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Andere
Oligonukleotide gemäß der vorliegenden
Erfindung können
auch an eine feste Phase gebunden sein. Alternativ kann ein willkürlicher
Teil von dem Oligonukleotid mit einem Bindungsliganden wie beispielsweise
Biotip markiert sein und das Oligonukleotid kann indirekt über einen
Bindungspartner, wie beispielsweise immobilisiertes Avidin, immobilisiert
sein. Wenn das immobilisierte Oligonukleotid als der Ausgangspunkt
der Synthese verwendet wird, wird die Nukleinsäure des synthetisierten Reaktionsproduktes
an der festen Phase gefangen, was dessen Trennung erleichtert. Das
abgetrennte Produkt kann durch einen Nukleinsäure-spezifischen Indikator
oder durch Hybridisierung mit einer markierten Sonde detektiert
werden. Fragmente der Zielnukleinsäure können auch durch Verdau des
Produktes mit willkürlich
ausgewählten
Restriktionsenzymen wiedergewonnen werden.
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Der
Begriff "Matrize", der in der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, bedeutet eine Nukleinsaure, die als eine
Matrize zum Synthetisieren einer komplementären Kette dient. Eine komplementäre Kette,
welche eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu der
Matrize ist, hat die Bedeutung als eine Kette, die der Matrize entspricht,
aber diese Beziehung zwischen den beiden ist rein relativ. Das heißt, eine
Kette, die als die komplementäre
Kette synthetisiert wurde, kann wiederum als eine Matrize verwendet
werden. Das heißt, die
komplementäre
Kette kann selbst eine Matrize werden.
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Das
Oligonukleotid, das in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist,
ist nicht limitiert auf die zwei Regionen, die oben beschrieben
sind, und kann eine zusätzliche
Region enthalten. Während
X2 und X1c an dem 3'-
bzw. 5'-Ende angeordnet
sind, kann eine willkürliche
Sequenz dazwischen liegen. Zum Beispiel kann diese eine Erkennungsstelle
für ein
Restriktionsenzym, ein Promoter, der von RNA-Polymerase erkannt
wird, oder DNA, die für
Ribozyme kodiert, sein. Wenn eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym
verwendet wird, kann die Nukleinsäure des Syntheseproduktes der
vorliegenden Erfindung, die eine komplementäre Sequenz aufweist, die abwechselnd
in einer einzelstrangigen Kette verknüpft ist, in doppelstrangige
Nukleinsäuren
von der gleichen Länge
gespalten werden. Durch Anordnen einer Promotersequenz, die von
RNA-Polymerase erkannt wird, dient das Syntheseprodukt von der vorliegenden
Erfindung als eine Matrize, um ferner Transkription in RNA zu ermöglichen.
Wenn ferner DNA, die für
ein Ribozym kodiert, angeordnet wird, realisiert man ein System,
in welchem das transkriptionale Produkt sich selbstspaltend ist.
Diese zusätzlichen
Nukleotidsequenzen sind solche, die in Funktion treten, nachdem
diese in einer doppelstrangigen Kette ausgebildet wurden. Demgemäß haben
diese Sequenzen keine Funktion, während die einzelstrangige Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Schleife ausgebildet hat. Sie erfüllen keine Funktion, bis die
Nukleinsäure
verlängert
wurde und sich, in Abwesenheit von einer Schleife, an eine Kette
mit einer komplementären
Nukleotidsequenz anlagert.
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Wenn
ein Promoter mit dem Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung in
solch einer Richtung kombiniert wird, dass dies die Transkription
von der synthetisierten Region ermöglicht, realisiert das Reaktionsprodukt
gemäß der vorliegenden
Erfindung, in welchem sich die gleiche Nukleotidsequenz wiederholt,
ein effizientes Transkriptionssystem. Wenn man dieses System mit
einem geeigneten Expressionssystem kombiniert, ist ebenfalls eine
Translation in ein Protein praktikabel. Das heißt, das System kann zur Transkription
und Translation in ein Protein in Bakterien oder tierischen Zellen
oder in vitro eingesetzt werden.
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Das
Oligonukleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung, das die oben beschriebene Struktur aufweist, kann chemisch
synthetisiert sein. Alternativ kann eine natürliche Nukleinsäure gespalten
werden, beispielsweise mit Restriktionsenzymen, und so modifiziert
werden, dass diese aus der oben beschriebenen Nukleotidsequenz besteht
oder in diese ein- bzw. angebunden ist.
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Das
grundsätzliche
Prinzip von der Reaktion zum Durchführen der Synthese durch Verwenden
der verwendbaren Oligonukleotide, die oben beschrieben sind, zusammen
mit DNA-Poly-merase,
die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist,
in der Reaktion zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
ist beschrieben mit Bezug auf die 5 bis 6.
Das oben beschriebene Oligonukleotid (erstes Oligonukleotid FA in 5)
lagert sich an X2 (entsprechend F2) an die Nukleinsäure der
Matrize an, um den Ausgangspunkt der Synthese der komplementären Kette
bereitzustellen. In 5 wird eine komple mentäre Kette,
die von FA als dem Ausgangspunkt der Synthese synthetisiert wurde,
verdrängt
durch die Synthese der komplementären Kette (nachfolgend beschrieben)
ausgehend von einem äußeren Primer
(erster äußerer Primer
F3), um eine einzelstrangige Kette (5-A)
auszubilden. Wenn die Synthese der komplementären Kette bis zu der resultierenden
komplementären
Kette weiter fortgeführt
wird, weist das 3'-Ende
der Nukleinsäure, die
als komplementäre
Kette in 5-A synthetisiert wurde,
eine Nukleotidsequenz auf, die komplementär zu dem ersten Oligonukleotid
der vorliegenden Erfindung ist. Das heißt, weil das 5'-Ende von dem ersten
Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung die gleiche Sequenz wie
eine Region X1c (entsprechend F1c) aufweist, weist das 3'-Ende von der Nukleinsäure, die
mit dem ersten Oligonukleotid synthetisiert wird, eine komplementäre Sequenz
X1 (F1) auf. 5 zeigt, dass die komplementäre Kette,
die vom zweiten Oligonukleotid R1 als dem Ausgangspunkt der Synthese
synthetisiert wurde, verdrängt
wird durch die Synthese der komplementären Kette mittels eines zweiten äußeren Primers
R3 als dem Ausgangspunkt der Synthese. Wenn der 3'-terminale Bereich
durch diese Verdrängung
für eine
Rasenpaarung zugänglich
gemacht ist, lagert sich X1 (F1) an dem 3'-Ende an X1c (F1c) in der gleichen Kette
an, und die Verlängerungsreaktion
(Elongation) mit sich selbst als Matrize läuft ab (5-B).
Dann ist X2c (F2c), das an dem 3'-Ende
davon angeordnet ist, als eine Schleife übrig, die nicht an Basenpaarung
beteiligt ist. X2 (F2) in dem ersten Oligonukleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung lagert sich an diese Schleife an und eine komplementäre Kette
wird synthetisiert mit besagtem ersten Oligonukleotid als dem Ausgangspunkt
der Synthese (5-B). Ein Produkt der
Synthesereaktion der komplementären
Ketten mit dem zuvor synthetisierten Produkt als Matrize wird verdrängt durch
die Strangverdrängungsreaktion,
so dass dieses Produkt für
eine Basenpaarung zugänglich
gemacht ist.
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Durch
diese grundlegende Ausgestaltung, welche eine Art von Oligonukleotid
und einen willkürlichen Rückwärtsprimer
verwendet, welcher Rückwärtsprimer
dazu in der Lage ist, eine Nukleinsäuresynthese auszuführen, bei
der eine komplementäre
Kette, die mit besagtem Oligonukleotid als ein Primer synthetisiert
werden, als eine Matrize verwendet wird, können eine Vielzahl von Nukleinsäuresyntheseprodukte,
wie sie in 6 gezeigt sind, erhalten werden.
Wie in 6 zu sehen ist, ist (D) das erwünschte Nukleinsäureprodukt der
Erfindung, das komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette
verknüpft
sind. Wenn dieses Produkt erst in eine einzelstrangige Kette durch
eine Behandlung, wie beispielsweise Hitzedenaturierung umgewandelt
wurde, dienen die anderen Produkte (E) erneut als eine Matrize zur
Ausbildung von (D). Wenn das Produkt (D) als Nukleinsäure in der
Form von einer doppelstrangigen Kette in eine einzelstrangige Kette
durch Hitzedenaturierung umgewandelt wird, erfolgt ein Anlagern
innerhalb der gleichen Kette mit einer hohen Wahrscheinlichkeit
ohne Ausbilden der ursprünglichen
doppelstrangigen Kette. Dies ist der Fall, weil eine komplementäre Kette,
welche die gleiche Schmelztemperatur (Tm) aufweist, bevorzugt eine
intramolekulare Reaktion anstatt einer intermolekularen Reaktion
durchführt.
Jede einzelstrangige Kette, die von dem Produkt (D) abgeleitet wird,
das sich in der gleichen Kette anlagert, lagert sich in der gleichen
Kette an und kehrt in den Zustand von (B) zurück, und jede Kette stellt ferner
ein Molekül
aus (D) bzw. (E) entsprechend bereit. Durch Wiederholen dieser Schritte
ist es möglich,
sukzessive die Nukleinsäure
zu synthetisieren, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist,
die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind.
Die Matrize und das Produkt, die in einem Zyklus ausgebildet werden,
steigen exponentiell an, wodurch diese Reaktion sehr effizient ist.
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Um
den Zustand der 5(A) zu realisieren,
sollte die ursprünglich
synthetisierte Kette, zumindest in dem Teil, an welchen sich der
Rückwärtsprimer
anlagert, für
eine Rasenpaarung zugänglich
sein. Dieser Schritt kann durch ein beliebiges Verfahren erreicht
werden. Das heißt,
ein erster äußerer Primer
(F3), der sich an die erste Matrize in einer Region F3c anlagert,
die an der 3'-Seite
von der Region F2c liegt, an welche sich das erste Oligonukleotid
der vorliegenden Erfindung anlagert, wird separat hergestellt. Wenn
dieser erste äußere Primer
verwendet wird als der Ausgangspunkt für die Synthese zum Synthetisieren
einer komplementären
Kette durch eine Polymerase, die eine Reaktion von der Art einer
Strangverdrängung
zur Synthese einer komplementären
Kette katalysiert, wird die komplementäre Kette verdrängt, die
ausgehend von F2c als dem Ausgangspunkt der Synthese gemäß der Erfindung
synthetisiert wurde, und als ein Ergebnis ist die Region R1c, an
welche sich R1 Anlagern soll, zugänglich gemacht für Basenpaarung
(5). Durch Verwendung von der Strangverdrängungsreaktion
kann die Reaktion bis hierher unter isothermen Bedingungen ablaufen.
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Wenn
ein äußerer Primer
verwendet wird, sollte die Synthese von dem äußeren Primer (F3) nach der Synthese
ausgehend von F2c gestartet werden. In dem einfachsten Verfahren
ist die Konzentration von dem inneren Primer höher als die Konzentration von
dem äußeren Primer.
Insbesondere werden die Primer gewöhnlich in 2- bis 50-fach, vorzugsweise
4- bis 10-fach unterschiedlichen Konzentration verwendet, wodurch die
Reaktion wie erwünscht ablaufen
kann. Ferner ist die Schmelztemperatur (Tm) von dem äußeren Primer niedriger
ausgelegt als die Tm von dem X1 (entsprechend F1 und R1) des inneren
Primers, wodurch die Zeitsteuerung der Synthese kontrolliert werden
kann. Das heißt,
(äußerer Primer
F3 : F3c) ≤ (F2c/F2) ≤ (F1 c/F1) oder
(äußerer Primer/Region
an der 3'-Seite
in der Matrize) ≤ (X2c
: X2) ≤ (X1c
: X1). Hierbei ist die Ursache dafür, dass (F2c/F2) ≤ (F1c/F1)
ist, dass das Anlagern zwischen F1c/F1 vor dem Anlagern von F2 an
die Schleife erfolgt. Die Anlagerung zwischen F1c/F1 ist eine intramolekulare
Reaktion und kann daher bevorzugt bei einer hohen Wahrscheinlichkeit
ablaufen. Es ist jedoch bedeutsam Tm zu berücksichtigen, um mehr erwünschte Reaktionsbedingungen
zu erzielen. Selbstverständlich
sollten vergleichbare Bedingungen auch bei dem Design von einem
Rückwärtsprimer
berücksichtigt
werden. Unter Verwenden solch eines Verhältnisses können statistisch ideale Reaktionsbedingungen
erhalten werden. Wenn die anderen Bedingungen festgelegt sind, kann
die Schmelztemperatur (Tm) theoretisch berechnet werden durch eine
Kombination von der Länge einer
sich anlagernden komplementären
Kette und den Basen, welche Basenpaarungen ausbilden. Demgemäß können die
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung bevorzugte Bedingungen auf
der Basis von der Offenbarung dieser Beschreibung herleiten.
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Ferner
kann auch das "Contiguous
Stacking" genannte
Phänomen
angewendet werden, um den Zeitpunkt des Anlagerns von dem äußeren Primer
zu regeln. Contiguous Stacking ist ein Phänomen, bei welchem ein Nukleotid,
das nicht dazu in der Lage ist, sich unabhängig anzulagern, in die Lage
versetzt wird, sich anzulagern, wenn dieses benachbart zu dem Teil
von einer doppelstrangigen Kette ist (Chiara Borghesi-Nicoletti et
al., Bio Techniques, 12, 474-477 (1992)). Das heißt, der äußere Primer
ist so auszugestalten, dass er benachbart zu F2c (X2c) ist, und
nicht dazu fähig
ist, sich unabhängig
anzulagern. Wenn man dieses tut, findet ein Anlagern von dem äußeren Primer
solange nicht statt, bis F2c (X2c) sich anlagert und somit findet
das Anlagern von F2c (X2c) zuerst statt. Auf der Grundlage von diesem
Prinzip zeigen die Beispiele das Einrichten von der Nukleotidsequenz
von einem Oligonukleotid, das als ein Primer für eine Reihe von Reaktionen
erforderlich ist. Dieser Schritt kann ebenfalls durch Denaturierung
bei Hitze oder mit einer DNA-Helikase erreicht werden.
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Wenn
die Matrizen-Nukleinsäure,
die F2c (X2c) aufweist, RNA ist, kann der Zustand der 5-(A) auch mittels eines anderen Verfahrens
realisiert werden. Wenn zum Beispiel diese RNA-Kette gespalten wird, wird
R1 zugänglich
gemacht für
Basenpaarung. Das heißt,
F2 ist an F2c in der RNA angelagert und eine komplementäre Kette
wird als DNA synthetisiert durch eine Reverse-Transkriptase. Die
RNA, die als Matrize dient, wird durch alkalische Denaturierung
oder durch eine enzymatische Behandlung mit einer Ribonuklease,
die auf die RNA in einer doppelstrangigen Kette von DNA/RNA einwirkt,
abgebaut, wobei die DNA, die ausgehend von F2 synthetisiert wurde,
als eine einzelstrangige Kette ausgebildet wird. Als das Enzym,
welches RNA in einer doppelstrangigen Kette von DNA/RNA selektiv
zersetzt, kann die Ribonukleaseaktivität von RNase H oder einiger
Reverse-Transkriptasen verwendet werden. Auf diese Weise kann der
Rückwärtsprimer
an R1c, welches für
eine Basenpaarung zugänglich
gemacht wurde, angelagert werden. Demgemäß wird der äußere Primer, welcher R1c für eine Basenpaarung
zugänglich
macht, überflüssig.
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Alternativ
kann die Strangverdrängungsaktivität von der
Reverse-Transkriptase verwendet werden, um die Strangverdrängung durch
einen äußeren Primer,
wie oben beschrieben, auszunutzen. In diesem Fall kann ein Reaktionssystem
nur durch eine Reverse-Transkriptase
ausgemacht werden. Das heißt,
bei Verwenden von RNA als Matrize ist es möglich, durch eine Reverse-Transkriptase,
eine komplementäre
Kette ausgehend von F2, das an F2c in der Matrize angelagert ist,
zu synthetisieren und eine komplementäre Kette von dem äußeren Primer
F3 als dem Ausgangspunkt der Synthese, der an F3c angelagert ist,
das sich an der 3'-Seite
von F2c befindet, zu synthetisieren, und gleichzeitig die zuvor
synthetisierte komplementäre
Kette zu verdrängen.
Wenn die Reverse-Transkriptase die Reaktion des Synthetisierens
einer komplementären
Kette mit DNA als Matrize durchführt,
laufen alle die Reaktionen des Synthetisierens komplementärer Ketten
durch die Reverse-Transkriptase
ab, einschließlich
der Synthese von einer komplementären Kette mit R1 als dem Ausgangspunkt
der Synthese, das an R1c in der verdrängten komplementären Kette
als die Matrize angelagert ist, der Synthese von einer komplementären Kette
mit R3 als dem Ausgangspunkt der Synthese, das an R3c angelagert
ist, welches an der 3'-Seite
von R1c lokalisiert ist, und der gleichzeitigen Verdrängungsreaktion. Wenn
es nicht möglich
ist zu erwarten, dass die Reverse-Transkriptase eine DNA/RNA Strangverdrängungsaktivität unter
gegebenen Reaktionsbedingungen aufweist, kann eine DNA-Polymerase
mit einer Strangverdrängungsaktivität, wie oben
beschrieben, damit kombiniert werden. Die Ausführungsform des Erhaltens einer ersten
einzelstrangigen Nukleinsäure
mit RNA als Matrize, wie oben beschrieben, stellt eine bevorzugte
Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung dar. Andererseits, wenn eine DNA-Polymerase,
wie beispielsweise Bca DNA-Polymerase, die beides, Strangverdrängungsaktivität und Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist,
verwendet wird, läuft
nicht nur die Synthese von einer ersten einzelstrangigen Nukleinsäure aus RNA,
sondern auch die anschließende
Reaktion mit DNA als eine Matrize durch das gleiche Enzym ab.
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Das
oben beschriebene Reaktionssystem führt verschiedene Variationen
von dem Rückwärtsprimer, der
eine spezielle Struktur aufweist, herbei, die der vorliegenden Erfindung
zu eigen sind. Die effektivste Variation wird nachfolgend beschrieben.
Das heißt,
das Oligonukleotid, welches wie in [5] beschrieben erstellt wurde,
wird als der Rückwärtsprimer
in der am vorteilhaftesten Ausführung
von der vorliegenden Erfindung verwendet. Das Oligonukleotid gemäß [5] ist
ein Oligonukleotid, worin willkürliche
Regionen R2c und R1c in einer komplementären Kette, die mit F2 als ein
Primer synthetisiert wurden, X2c bzw. X1c sind. Bei Verwenden von solch
einem Rückwärtsprimer
läuft eine
Reihe von Reaktionen zum Ausbilden einer Schleife und zum Synthetisieren
und Verdrängen
einer komplementären
Kette von dieser Schleife in beiden Ketten, der Vorwärts-(sense)
und der Rückwärts-(antisense)Kette
(Vorwärtsseite
und Rückwärtsseite)
ab. Als ein Ergebnis ist die Reaktionseffizienz zur Synthese von
der Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung, die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelnen
einzelstrangigen Kette verknüpft
sind, wesentlich verbessert, während
eine Reihe von diesen Reaktionen unter isothermen Bedingungen durchführbar ist. Hieran
anschließend
wird diese Ausführungsform
beschrieben in einer detaillierteren Weise unter Bezugnahme auf
die 1 bis 3, wo diese Ausführung zusammengefasst
ist.
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In
der folgenden Ausführung
werden zwei Arten von Oligonukleotiden auf Grundlage der vorliegenden Erfindung
präpariert.
Zur Erklärung
werden diese FA und RA genannt. Die Regionen, welche FA und RA ausmachen,
sind wie folgt:
X2 X1c
FA F2 F1c
RA R2 R1c
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Hierbei
ist F2 eine komplementäre
Nukleotidsequenz zu einer Region F2c in der Nukleinsäure der
Matrize. R2 ist eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer
willkürlichen
Region R2c ist, die in einer komplementären Kette enthalten ist, die
mit F2 als Primer synthetisiert wird. F1c und R1c sind willkürliche Nukleotidsequenzen,
die abwärts
von F2c bzw. R2c lokalisiert sind. Der Abstand zwischen F2 und R2
kann willkürlich sein.
Selbst wenn dessen Länge
in etwa 1 kbp ist, ist eine ausführbare
Synthese unter geeigneten Bedingun gen möglich, wobei dies abhängig ist
von der Synthese-Aktivität
der DNA-Polymerase zur Durchführung
der Synthese von einer komplementären Kette. Insbesondere wenn
Bst DNA-Polymerase
verwendet wird, wird das erwünschte
Produkt sicherlich synthetisiert, wenn der Abstand zwischen F2 und
R2c 800 bp beträgt,
vorzugsweise 500 bp oder weniger. In einer PCR, welche einen Temperaturzyklus
einschließt,
wird die Reduktion der enzymatischen Aktivität, die durch den Stress der
Temperaturänderungen
bedingt ist, erachtet, die Effizienz von der Synthese von einer
langen Nukleotidsequenz zu reduzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung ist ein Temperaturzyklus in dem Schritt
des Amplifizierens von Nukleinsäure
nicht erforderlich, und somit kann die Synthese und die Amplifikation
von selbst langen Nukleotidsequenzen sicherlich erreicht werden.
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Zuerst
wird F2 in FA an die Nukleinsäure
der Matrize angelagert und als der Ausgangspunkt der Synthese von
einer komplementären
Kette verwendet. Die anschließenden
Reaktionsschritte bis 1(4) sind die gleichen
wie in der zuvor beschriebenen Basis-Ausführung (5) der vorliegenden
Erfindung. Die Sequenz, die als F3 in 1(2) angelagert
ist, ist der erste äußere Primer,
der oben beschrieben ist. Eine DNA-Polymerase zum Durchführen der
Synthese, von der Art einer Strangverdrängung, zur Synthese von einer
komplementären
Kette mit diesem Primer als dem Ausgangspunkt der Synthese wird
verwendet, so dass die komplementäre Kette, die ausgehend von
FA synthetisiert wurde, verdrängt
und für
eine Basenpaarung zugänglich gemacht
wird.
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Wenn
R2c in (4) für
eine Basenpaarung zugänglich
gemacht ist, lagert sich das zweite Oligonukleotid RA als Rückwärtsprimer
daran in der Kombination von R2c/R2 an. Die Synthese von einer komplementären Kette
mit dieser Stelle als dem Ausgang von der Synthese läuft ab,
bis die Kette F1 c an dem 5'-Ende
von FA erreicht. Anschließend
an diese Reaktion des Synthetisierens einer komplementären Kette
lagert sich der zweite äußere Primer
R3 für
die Verdrängung
daran an, um eine komplementäre
Kette zu synthetisieren, während
welcher ebenfalls Strangverdrängung
auftritt, so dass die komplementäre
Kette, die ausgehend von RA als dem Ausgangspunkt der Synthese synthetisiert
wurde, verdrängt
wird. In der komplementären
Kette, die so verdrängt
wurde, ist RA an deren 5'-Seite
lokalisiert und eine Sequenz, die komplementär zu FA ist, ist an ihrem 3'-Ende lokalisiert.
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An
der 3'-Seite von
der einzelstrangigen Nukleinsäure,
die so verdrängt
wurde, ist eine Sequenz F1, die komplementär ist zu F1c in der gleichen
Kette. F1 lagert sich schnell an F1c in dem gleichen Molekül an, um
die Synthese von einer komplementären Kette zu initiieren.
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Wenn
das 3'-Ende (F1)
sich an F1c in der gleichen Kette anlagert, wird eine Schleife enthaltend
F2c ausgebildet. Wie aus 2-(7) ebenfalls
ersichtlich ist, bleibt ein Teil von dieser Schleife zugänglich für Basenpaarung.
Das erste Oligonukleotid FA gemäß der Erfindung,
das eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu F2c
ist, lagert sich an diesen Teil von der Schleife an und dient als
der Ausgangspunkt der Synthese von einer komplementären Kette
(7). Die Synthese von einer komplementären Kette läuft ausgehend von der Schleife
ab, während
das Reaktionsprodukt der zuvor von F1 ausgehend abgelaufenen Synthese
der komplementären
Ketten verdrängt
wird. Als ein Ergebnis wird die komplementäre Kette, die mit sich selbst
als Matrize synthetisiert wurde, für eine Basenpaarung an dem
3'-Ende erneut zugänglich gemacht.
Dieses 3'-Ende ist
versehen mit einer Region R1, die dazu in der Lage ist, sich an
R1 c in der gleichen Kette anzulagern, und die Zwei lagern sich
bevorzugt aufgrund der schnell ablaufenden intramolekularen Reaktion
aneinander an. Die gleiche Reaktion, wie die oben beschriebene Reaktion,
die von dem 3'-Ende
ausgeht, das mit FA als Matrize synthetisiert wurde, läuft in dieser
Region ebenfalls ab. Als ein Ergebnis wird die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung, die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in der gleichen einzelstrangigen
Kette angeordnet sind, von R1 als dem Startpunkt an dem 3'-Ende durch sukzessive
Synthese von einer komplementären
Kette und anschließender
Verdrängung
dieser fortlaufend verlängert.
Da R2c immer in der Schleife enthalten ist, die durch intramolekulares
Anlagern von dem 3'-terminalen
R1 ausgebildet wird, lagert sich das zweite Oligonukleotid (RA),
das mit R2 versehen ist, an diese Schleife an dem 3'-Ende in der anschließenden Reaktion
an.
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Wenn
man die Nukleinsäure
beachtet, die als komplementäre
Kette synthetisiert wird von dem Oligonukleotid, das sich an die
Schleife in der einzelstrangigen Nukleinsäure anlagert, die mit sich
selbst als Matrize verlängert
wurde, läuft
auch hier die Synthese von der Nukleinsaure gemäß der vorliegenden Erfindung,
die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in der gleichen einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind, ab. Das heißt,
die Synthese von einer komplementären Kette ausgehend von der
Schleife wird vollendet, wenn die Synthese RA in, zum Beispiel 2-(7), erreicht. Dann, wenn die Nukleinsäure, die
durch diese Nukleinsäuresynthese
verdrängt
wurde, die Synthese einer komplementären Kette initiiert (3-(8)), erreicht die Reaktion die Schleife, welche
einmal der Ausgangspunkt der Synthese gewesen war, und Verdrängung wird
erneut ausgelöst.
Auf diese Weise wird auch die Nukleinsäure verdrängt, die ausgehend von der Schleife
initiiert wurde synthetisiert zu werden, und als ein Resultat erhält man das
3'-terminale R1,
das dazu in der Lage ist, sich in der gleichen Kette anzulagern
(3-(10)). Dieses 3'-terminale R1 lagert
sich an R1c in der gleichen Kette an, um die Synthese von einer
komplementären
Kette zu starten. Diese Reaktion ist die gleiche wie in 2-(7), mit der Ausnahme, dass F anstelle von R
verwendet wird. Demgemäß kann die
Struktur, die in 3-(10) gezeigt
ist, als eine neue Nukleinsäure
fungieren, welche die Selbst-Verlängerung und Ausbildung neuer
Nukleinsäure
fortsetzt.
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Die
Reaktion des Synthetisierens von Nukleinsäure, ausgehend von der in 3-(10) gezeigten Nukleinsäure, bewirkt die Verlängerung
von dem 3'-terminalen
F1 als dem Ausgangspunkt der Synthese, im Unterschied zu der oben
beschriebenen Reaktion. Das heißt,
in der vorliegenden Erfindung, wenn eine Nukleinsäure verlängert wird,
läuft die
Reaktion des Fortsetzens zum Bereitstellen einer neuen Nukleinsäure, welche eine
Verlängerung
initiiert, getrennt weiter. Während
die Kette verlängert
wird, werden ferner eine Vielzahl von schleifen-bildenden Sequenzen
bereitgestellt, nicht nur an den Enden, sondern auch in der gleichen
Kette. Wenn diese schleifen-bildenden Sequenzen für eine Basenpaarung
zugänglich
gemacht sind durch die Strangverdrängungssynthesereaktion, lagert
sich ein Oligonukleotid daran an, um als Basis für die Reaktion des Ausbildens
einer neuen Nukleinsäure
zu dienen. Ferner wird eine effiziente Amplifikation durch die Synthesereaktion
erzielt, die nicht nur an den Enden, sondern auch in der Kette startet.
Das zweite Oligonukleotid RA gemäß der vorliegenden
Erfindung ist kombiniert als der Rückwärtsprimer, wie oben beschrieben,
wobei Verlängerung
und anschließende
Ausbildung von einer neuen Nukleinsäure stattfinden. In der vorliegenden Erfindung
wird ferner diese neu ausgebildete Nukleinsäure selbst verlängert und
ermöglicht
die anschließende Ausbildungen
von einer neuen Nukleinsaure. Die Reihe von diesen Reaktionen setzt
sich theoretisch permanent fort, um eine sehr effiziente Amplifikation
von Nukleinsäure
zu erreichen. Zusätzlich
kann die Reaktion gemäß der vorliegenden
Erfindung unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden.
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Die
so angesammelten Reaktionsprodukte weisen eine Struktur auf, die
eine Nukleotidsequenz zwischen F1 und R1 aufweist, und deren komplementäre Sequenzen
abwechselnd darin verknüpft
sind. Jedoch weisen beide Enden von der Wiederholungseinheit eine
Region auf, die aus den sich anschließenden Nukleotidsequenzen F2-F1
(F2c-F1c) und R2-R1 (R2c-R1c) besteht. In 3-(9) sind
zum Beispiel die Sequenzen (R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c) in dieser Reihenfolge
ausgehend von der 5'-Seite
miteinander verknüpft.
Dies kommt daher, weil die Amplifikationsreaktion gemäß der vorliegenden
Erfindung auf dem Prinzip basiert, dass die Reaktion eingeleitet
wird von F2 (oder R2) mit einem Oligonukleotid als dem Ausgangspunkt der
Synthese und dann eine komplementäre Kette durch die Synthesereaktion
von F1 (oder R1) mit dem 3'-Ende
als Ausgangspunkt der Synthese verlängert wird.
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In
der am meisten bevorzugten Ausführungsform
wurden hierbei die Oligonukleotide FA und RA gemäß der vorliegenden Erfindung
als Oligonukleotide, die sich an den Teil von einer Schleife anlagern,
verwendet. Jedoch, selbst wenn diese Oligonukleotide, die eine limitierte
Struktur aufweisen, nicht verwendet werden, kann die Amplifikationsreaktion
gemäß der vorliegenden
Erfindung durchgeführt
werden durch Verwenden von einem Oligonukleotid, das dazu in der
Lage ist, die Synthese von einer komplementären Kette ausgehend von der
Schleife zu starten. Das heißt,
das sich verlängernde
3'-Ende, wenn es
erst einmal durch eine komplementäre Kette, die ausgehend von
der Schleife synthetisiert wurde, verdrängt wurde, wird erneut zu einem
Teil von einer Schleife. Weil die Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen
aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind,
immer als eine Matrize in der Synthese der komplementären Kette, die
von der Schleife startet, verwendet wird, ist es offensichtlich,
dass die gewünschte
Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung synthetisiert werden kann. Jedoch führt die Nukleinsäure, die
so synthetisiert wurde, die Synthese von einer komplementären Kette
unter Ausbilden einer Schleife nach der Verdrängung durch, aber da ist kein
3'-Ende für die anschließende Ausbildung
von einer Schleife vorhanden, und somit kann dieses nicht als neue
Matrize dienen. Demgemäß kann von
dem Produkt in diesem Fall, anders als die Nukleinsäure, die
durch FA oder RA initiiert wurde, synthetisiert zu werden, nicht
erwartet werden, dass diese exponentiell vervielfältigt wird.
Aus diesem Grund ist ein Oligonukleotid mit der Struktur von FA
oder RA nützlich
zur höchst effizienten
Synthese von Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
-
Eine
Reihe von diesen Reaktionen läuft
durch Zugeben der folgenden Komponenten zu einer einzelstrangigen
Nukleinsäure
als Matrize und dem anschließenden
Inkubieren der Mischung bei solch einer Temperatur, dass die Nukleotidsequenz,
welche FA und RA ausmacht, eine stabile Rasenpaarung mit deren komplementärer Nukleotidsequenz
ausbildet, während
die Enzymaktivität
erhalten bleiben kann, ab.
- • 4 Arten von Oligonukleotiden:
FA
(erstes Oligonukleotid),
RA (zweites Oligonukleotid),
erster äußerer Primer
F3, und
zweiter äußerer Primer
R3,
- • DNA-Polymerase
zum Durchführen
der Synthese, von der Art einer Strangverdrängung, zur Synthese von einer
komplementären
Kette,
- • ein
Oligonukleotid, das als Substrat für die DNA-Polymerase dient.
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Demgemäß ist ein
Temperatur-Zyklus, wie beispielsweise in der PCR, nicht erforderlich.
Die stabile Basenpaarung, auf die sich hierin bezogen wird, bedeutet
einen Zustand, in welchem wenigstens ein Teil von einem Oligonukleotid,
das in dem Reaktionssystem vorhanden ist, den Ausgangspunkt der
Synthese von der komplementären
Kette leisten kann. Zum Beispiel ist die gewünschte Bedingung zum Ausbilden
stabiler Basenpaarung festgesetzt auf unterhalb der Schmelztemperatur
(Tm). Im Allgemeinen wird die Schmelztemperatur (Tm) angesehen als
die Temperatur, bei welcher 50 % der Nukleinsäuren, die gegenseitig komplementäre Nukleotidsequenzen
aufweisen, basengepaart sind. In der vorliegenden Erfindung ist
die Einstellung auf die Schmelztemperatur (Tm) oder weniger keine
essentielle Bedingung, aber dies ist eine von den Reaktionsbedingungen,
die zum Erhalten einer hohen Effizienz der Synthese zu berücksichtigen
sind. Wenn die Nukleinsäure,
die als Matrize verwendet werden soll, eine doppelstrangige Kette
ist, sollte die Nukleinsäure,
zumindest in einer Region, an welche sich die Oligonukleotide anlagern,
für eine
Rasenpaarung zugänglich
gemacht sein. Dazu wird prinzipiell Hitzedenaturierung durchgeführt und
dies kann nur einmal als Vorbehandlung durchgeführt werden, bevor die Reaktion
initiiert wird.
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Diese
Reaktion wird durchgeführt
in der Gegenwart von einem Puffer, der einen geeigneten pH für die Enzymreaktion
einstellt, Salzen, die zum Anlagern oder zum Instandhalten der katalytischen
Aktivität
von den Enzymen notwendig sind, einem Schutzstoff für die Enzyme,
und, wenn notwendig, einem Regulator für die Schmelztemperatur (Tm).
Als Puffer wird zum Beispiel Tris-HCl verwendet, das eine Pufferwirkung
im neutralen bis leicht alkalinen Bereich aufweist. Der pH wird
in Abhängigkeit
von der verwendeten DNA-Polymerase eingestellt. Als Salze sind KCl,
NaCl, (NH4)2SO4 usw. in geeigneter Form hinzugefügt, um die
Aktivität
der Enzyme beizubehalten, und um die Schmelztemperatur (Tm) der
Nukleinsäure
zu regulieren. Als Schutzstoff für die
Enzyme kommen Rinderserumalbumin oder Zuckern zum Einsatz. Ferner
wird Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Formamid prinzipiell als Regulator
der Schmelztemperatur (Tm) verwendet. Durch Verwenden von dem Regulator
der Schmelz temperatur (Tm) kann ein sich Anlagern von den Oligonukleotiden
unter begrenzten Temperaturbedingungen geregelt werden. Ferner ist
Betain (N,N,N-trimethylglycin) oder ein tetraalkylisches Ammoniumsalz
durch deren Isostabilisation ebenfalls effektiv zum Verbessern der
Effizienz der Strangverdrängung.
Durch Hinzufügen
von Betain in einer Menge von 0,2 bis 3,0 M, vorzugsweise 0,5 bis
1,5 M zu der Reaktionslösung
kann dessen fördernde
Wirkung auf die Nukleinsäure-Amplifikation
gemäß der vorliegenden
Erfindung erwartet werden. Weil diese Schmelztemperatur-Regulatoren
so wirken, dass die Schmelztemperatur heruntergesetzt wird, werden
solche Bedingungen, die eine geeignete Stringenz und Reaktivität erzielen,
empirisch ermittelt unter Berücksichtigung
von den Konzentrationen der Salze, der Reaktionstemperatur etc.
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Ein
wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass eine Reihe
von Reaktionen nicht ablaufen, bis nicht die die Lage betreffende
Anordnungsbeziehung von einer Vielzahl von Regionen erreicht ist.
Durch dieses Merkmal werden unspezifische Synthesereaktionen, die
von der unspezifischen Synthese von komplementären Ketten begleitet werden,
effektiv verhindert. Das heißt,
selbst wenn eine bestimmte unspezifische Reaktion abläuft, ist
die Wahrscheinlichkeit minimiert, dass dieses Produktes als ein
Startmaterial im folgenden Amplifikationsschritt dient. Die Steuerung
des Fortschreitens der Reaktionen durch viele Regionen bewirkt ferner
die Wahrscheinlichkeit, dass ein Detektionssystem, das zur strengen
Identifikation von dem gewünschten Produkt
in analogen Nukleotidsequenzen in der Lage ist, willkürlich verfasst
werden kann.
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Dieses
Merkmal kann zur Detektion von Mutationen in einem Gen verwendet
werden. In der Ausführung
der vorliegenden Erfindung, in welcher der äußere Primer verwendet wird,
werden 4 Primer, das heißt,
2 äußere Primer
und zwei Primer bestehend aus den Oligonukleotiden der vorliegenden
Erfindung, verwendet. Das bedeutet, bis nicht die 6 Regionen, die
in den 4 Oligonukleotiden enthalten sind, wie beabsichtigt arbeiten, läuft die
Synthesereaktion der vorliegenden Erfindung nicht ab. Insbesondere
sind die Sequenzen an dem 3'-Ende
von jedem Oligonukleotid, als die Ausgangspunkte der Synthese einer
komplementären
Kette, und an dem 5'-Ende
von der X1c Region, wo die komplementäre Kette als Ausgangspunkt
der Synthese dient, wichtig. Daher sind diese wichtigen Sequenzen
so ausgestaltet, dass diese einer zu detektierenden Mutation entsprechen,
und das Produkt der Synthesereaktion von der vorliegenden Erfindung
beobachtet wird, wodurch das Vorhandensein oder das Fehlen von einer
Mutation, wie beispielsweise einer Basendeletion oder Insertion, oder
ge netischer Polymorphismen, wie beispielsweise SNPs, verständlich analysiert
werden können.
Insbesondere sind die Basen, von welchen vermutet wird, dass diese
eine Mutation oder ein Polymorphismus aufweisen, so gestaltet, dass
diese der Umgebung von dem 3'-Ende
von einem Oligonukleotid entsprechen, das als der Ausgangspunkt
der Synthese einer komplementären
Kette dient, oder von dessen 5'-Ende,
wenn eine komplementäre
Kette der Ausgangspunkt der Synthese ist. Wenn ein Mismatch an dem
3'-Ende des Ausgangspunktes
der Synthese der komplementären
Kette oder in dessen Umgebung vorhanden ist, wird die Reaktion der
Synthese einer komplementären
Kette zu Nukleinsäure
signifikant inhibiert. In der vorliegenden Erfindung wird ein hoher
Grad an Amplifikationsreaktion nicht erreicht, bis die Struktur
von den Enden von einem Produkt in der ersten Reaktion wiederholte
Reaktionen bewirkt. Demgemäß wird,
selbst wenn eine fehlerhafte Synthese abläuft, die Synthese der komplementären Kette,
welche die Amplifikationsreaktion ausmacht, immer unterbrochen in
einigen von den Schritten, und somit wird kein hoher Grad an Amplifikationsreaktion
in Gegenwart von einem Mismatch erreicht. Als ein Ergebnis inhibiert
das Mismatch effektiv die Amplifikationsreaktion und ein genaues
Resultat wird letztendlich erzielt. Das heißt, es kann gesagt werden,
dass die Amplifikationsreaktion von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
einen höchst
vollständigen
Mechanismus zum Prüfen
der Nukleotidsequenz hat. Diese Merkmale sind ein Vorteil, der nur
schwerlich in beispielsweise dem PCR-Verfahren erwartet werden kann,
wo die Amplifikationsreaktion in nur 2 Regionen erfolgt.
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Die
Region X1c, welche die in der vorliegenden Erfindung verwendeten
Oligonukleotide charakterisiert, kann als der Ausgangspunkt der
Synthese dienen, nachdem eine komplementäre Kette synthetisiert ist, und
diese komplementäre
Kette lagert sich an diese Sequenz X1 in der gleichen neu synthetisierten
Kette an, wobei eine Synthesereaktion mit sich selbst als Matrize
abläuft.
Deshalb wird, selbst wenn das so genannte Primer-Dimer, welches
oftmals problematisch im Stand der Technik ist, ausgebildet wird,
dieses Oligonukleotid keine Schleife ausbilden. Demgemäß können unspezifische
Amplifikationen, die dem Primer-Dimer zuzuordnen sind, theoretisch
nicht passieren, und somit stellt das vorliegende Oligonukleotid
eine Verbesserung in der Spezifität von der Reaktion bereit.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden die äußeren Primer,
die als F3 (1-(2)) oder R3 (2-(5)) gezeigt sind, ferner kombiniert, wobei
eine Reihe von Reaktionen, die oben beschrieben sind, unter isothermen
Bedingungen durchgeführt
werden können.
Das heißt, die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Amplifizieren von
Nukleinsäure,
die komplementäre
Sequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette
verknüpft
sind, bereit, welches die Schritte, die im obigen Gegenstand 9 gezeigt
sind, umfasst. In diesem Verfahren werden Temperaturbedingungen
ausgewählt,
bei denen stabile Anlagerungen auftreten zwischen F2c/F2, zwischen
R2c/R2, zwischen F1c/F1, und zwischen R1c/R1, und bevorzugt werden F3c/F3
und R3c/R3 so festgelegt, dass es diesen gemäß dem Phänomen des Contiguous Stacking,
erst durch Anlagern von F2c/F2 bzw. R2c/R2 ermöglicht ist, sich anzulagern.
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In
der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe "Synthese" und "Amplifikation" von Nukleinsäure verwendet. Die Synthese
von Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung bedeutet die Verlängerung
von Nukleinsäure
ausgehend von einem Oligonukleotid, das als der Ausgangspunkt der
Synthese dient. Wenn nicht nur diese Synthese, sondern ebenfalls
die Ausbildung von anderen Nukleinsäuren und die Elongationsreaktionen
von diesen gebildeten Nukleinsäuren
gleichzeitig ablaufen, wird eine Reihe von diesen Reaktionen üblicherweise
Amplifikation genannt.
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Die
einzelstrangige Nukleinsäure,
welche an ihrem 3'-Ende
mit einer Region F1 versehen ist, die dazu in der Lage ist, sich
an einen Teil F1 c in der gleichen Kette anzulagern, und welche
beim sich Anlagern der Region F1 an F1c in der gleichen Kette dazu
in der Lage ist, eine Schleife auszubilden, die eine Region F2c enthält, welche
zur Basenpaarung in der Lage ist, ist ein wichtiges Element der
vorliegenden Erfindung. Solch eine einzelstrangige Nukleinsäure kann
auch gemäß dem folgenden
Prinzip bereitgestellt werden. Das heißt, der Synthese von einer
komplementären
Kette wird es gestattet, auf der Basis von einem Primer mit der
folgenden Struktur abzulaufen. 5'-[Region
X1 angelagert an die Region X1 c, die im Primer lokalisiert ist]-[schleifen-bildende
Sequenz, die für
Basenpaarung zugänglich
ist]-[Region X1c]-[Region,
die eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer Matrize ist]-3'.
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Als
die Region, die eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer
Matrize ist, werden zwei Nukleotidsequenzen hergestellt, das heißt, eine
Nukleotidsequenz (Primer FA), die komplementär zu F1 ist, und eine Nukleotidsequenz
(Primer RA), die komplementär
zu R1 c ist. Die Nukleotidsequenz, welche die zu synthetisierende
Nukleotidsequenz ausmacht, enthält
eine Nukleotidsequenz, die sich von der Region F1 zu der Region
R1 c erstreckt, und eine Nukleotidsequenz, die sich von der Region
R1, die eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu dieser Nukleotidsequenz
ist, bis zu der Region F1c erstreckt. X1c und X1, die dazu in der Lage
sind, sich an der Innenseite von dem Primer anzulagern, können willkürliche Sequenzen
sein. In dem Bereich zwischen Primern FA und RF ist jedoch die Sequenz
bevorzugt abweichend von der Region X1c/X1.
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Zuerst
wird die Synthese von einer komplementären Kette durch den Primer
FA ausgehend von der Region F1 in der Matrizen-Nukleinsäure durchgeführt. Danach
ist die Region R1c in der synthetisierten komplementären Kette
für Basenpaarung
zugänglich
gemacht, an welche sich der andere Primer anlagert, um den Ausgangspunkt
der Synthese einer komplementären
Kette auszubilden. Das 3'-Ende
von der komplementären Kette,
die in diesem Schritt synthetisiert wird, weist eine Nukleotidsequenz
auf, die komplementär
zu dem Primer FA ist, der das 5'-Ende
von der ursprünglich
synthetisierten Kette ausmachte, und so ist die komplementäre Kette
an deren 3'-Ende
mit der Region X1 versehen worden, welche sich an die Region X1c
in der gleichen Kette anlagert, um eine Schleife auszubilden. Die
charakteristische 3'-terminale
Struktur gemäß der vorliegenden
Erfindung ist somit bereitgestellt, und die anschließenden Reaktionen
legen das Reaktionssystem fest, das zuvor als die am meisten bevorzugte
Ausführungsform
gezeigt wurde. Das Oligonukleotid, das sich an den Teil der Schleife
anlagert, ist an seinem 3'-Ende
mit der Region X2 versehen, die komplementär zu der Region X2c ist, die
in der Schleife lokalisiert ist, und an seinem 5'-Ende mit der Region X1 versehen. In
dem vorherigen Reaktionssystem wurden die Primer FA und RA verwendet,
um eine Kette zu synthetisieren, die komplementär zu einer Matrizen-Nukleinsäure ist,
und dabei eine Schleifenstruktur an dem 3'-Ende von der Nukleinsäure auszubilden.
In diesem Verfahren wurde die terminale Struktur, die für die vorliegende
Erfindung charakteristisch ist, durch die kurzen Primer zur Verfügung gestellt.
In dieser Ausführungsform
wird andererseits eine Nukleotidsequenz, welche eine Schleife ausmacht,
in Gänze
von einem Primer zur Verfügung
gestellt, und die Synthese von diesem längeren Primer ist erforderlich.
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Wenn
eine Nukleotidsequenz, die Restriktionsenzym-Erkennungsregionen
enthält,
als ein Rückwärtsprimer
verwendet wird, kann eine andere Ausführungsform gemäß der vorliegenden
Erfindung erstellt werden. Die Reaktion mit einem Rückwärtsprimer,
der eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz enthält, ist
im Speziellen unter Bezugnahme auf 6 beschrieben.
Wenn 6-(D) vervollständigt ist,
wird durch ein Restriktionsenzym ein Strangbruch erzeugt, der einer
Erkennungsstelle eines Restriktionsenzyms in dem Rückwärtsprimer
entspricht. Die Reaktion von der Art der Strangverdrängung zum
Synthetisieren einer komplementären
Kette wird eingeleitet ausgehend von diesem Strangbruch als dem
Aus gangspunkt der Synthese. Weil die Rückwärtsprimer an den beiden Enden
von der doppelstrangigen Nukleinsäure lokalisiert sind, die (D)
ausmacht, wird die Reaktion des Synthetisierens komplementärer Ketten
ebenfalls von den beiden Enden eingeleitet. Auch wenn dies prinzipiell
auf dem SDA-Verfahren basiert, das als Stand der Technik beschrieben
ist, hat die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung,
die als Matrize dient, eine Struktur, die komplementäre Nukleotidsequenzen
aufweist, die abwechselnd verknüpft
sind, so dass das Nukleinsäure-Synthesesystem,
welches der vorliegende Erfindung eigen ist, aufgestellt wird. Ein
Teil, der als eine komplementäre
Kette für
den Rückwärtsprimer
dient, der einen Strangbruch aufweisen soll, sollte so ausgestaltet
sein, dass dieser Teil eine dNTP-Derivat enthält, so dass diesem Teil eine
Nuklease-Resistenz verliehen wird, um die Aufspaltung von der doppelstrangigen
Kette durch das Restriktionsenzym zu verhindern.
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Es
ist ferner möglich,
einen Promoter für
RNA-Polymerase in den Rückwärtsprimer
einzufügen.
Die Transkription von den beiden Enden in 6-(D) wird
durchgeführt
durch eine RNA-Polymerase, welche diesen Promoter erkennt, in diesem
Fall ebenfalls vergleichbar mit der vorherigen Ausführung, wo
das SDA-Verfahren angewendet wurde.
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Die
Nukleinsäure,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung synthetisiert wird, ist eine einzelstrangige Kette, die
aber aus partiell komplementären
Sequenzen besteht, und daher die Mehrzahl von diesen Sequenzen Basenpaarungen
eingeht. Durch Verwenden von diesem Merkmal kann das Syntheseprodukt
detektiert werden. Wenn man das Verfahren des Synthetisierens von
Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung in der Gegenwart von einem fluoreszierenden Pigment, das
ein Doppelstrang-Ketten-spezifischer Interkalator ist, wie beispielsweise
Ethidiumbromid, SYBR Green I oder Pico Green, wird eine erhöhte Fluoreszenzdichte beobachtet,
wenn sich die Menge des Produktes erhöht. Durch Überwachen der Fluoreszenzdichte
ist es möglich,
die Synthesereaktion in einem geschlossenen System in Echtzeit zu
verfolgen. Die Anwendung von dieser Art eines Detektionssystems
für das
PCR-Verfahren wird auch berücksichtigt,
es wird jedoch erachtet, dass da viele Probleme bestehen, weil das
Signal von dem Produkt nicht vom Signal von Primer-Dimern etc. unterschieden
werden kann. Wenn dieses System jedoch auf die Erfindung angewendet
wird, ist die Möglichkeit des
Ansteigens unspezifischer Basenpaarung sehr gering, und daher können eine
hohe Sensitivität
und geringe Störsignale
gleichzeitig erwartet werden. Gleichartig zum Verwenden von dem
Doppelstrang-Ketten-spezifischen Interkalator kann auch der Ü bergang
der Fluoreszenzenergie für
ein Verfahren zum Realisieren eines Detektionssystems in einem uniformen
System verwendet werden.
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Das
Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
wird unterstützt
durch die DNA-Polymerase, welche eine Reaktion von der Art einer
Strangverdrängung
zur Synthese einer doppelstrangigen Kette katalysiert. Während der
oben beschriebenen Reaktion ist ebenfalls ein Reaktionsschritt enthalten,
der nicht notwendigerweise die Polymerase von der Art der Strangverdrängung erfordert. Zur
Vereinfachung von einem grundlegenden Reagenz und aus ökonomischer
Sicht ist es jedoch vorteilhaft, nur eine Art von DNA-Polymerase
zu verwenden. Als diese Art von DNA-Polymerase sind die folgenden
Enzyme bekannt. Ferner können
verschiedene Mutanten von diesen Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung
insoweit verwendet werden, als diese sowohl die Sequenzabhängige Aktivität für die Synthese
einer komplementären
Kette als auch die Strangverdrängungsaktivität aufweisen.
Die Mutanten, auf welche hierin verwiesen wird, schließen auch
solche ein, die nur eine Struktur aufweisen, welche die katalytische
Aktivität, die
von dem Enzym gefordert wird, bewirkt, oder solche mit Modifikationen
der katalytischen Aktivität,
Stabilität oder
Thermostabilität
durch zum Beispiel Mutationen in Aminosäuren.
Bst DNA Polymerase
Bca
(exo-) DNA Polymerase
DNA Polymerase I Klenow Fragment
Vent
DNA Polymerase
Vent (exo-) DNA Polymerase (Vent DNA Polymerase
mit einer ungenügenden
Exonuklease-Aktivität)
Deep
Vent DNA Polymerase
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase (Deep Vent
DNA Polymerase mit einer ungenügenden
Exonuklease-Aktivität)
Φ29 Phagen
DNA Polymerase
MS-2 Phagen DNA Polymerase
Z-Taq DNA Polymerase
(Takara Shuzo Co., Ltd.)
KOD DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.)
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Unter
diesen Enzymen sind Bst DNA Polymerase und Bca (exo-) DNA Polymerase
besonders erwünschte
Enzyme, weil diese einen bestimmten Grad an Thermostabilität und eine
hohe katalytische Aktivität aufweisen.
Die Reaktion gemäß dieser
Erfindung kann isother misch in einer bevorzugten Ausführungsform
ablaufen, aber wegen der Anpassung der Schmelztemperatur (Tm) etc.
ist es nicht immer möglich,
Temperaturbedingungen zu verwenden, die für die Stabilität von dem
Enzym erwünscht
sind. Demgemäß ist es
eine von den gewünschten
Bedingungen, dass das Enzym thermostabil ist. Auch wenn die isothermische
Reaktion praktikabel ist, kann Hitzedenaturierung durchgeführt werden,
um Nukleinsäure
als erste Matrize bereitzustellen, und in dieser Hinsicht erweitert
die Verwendung von einem thermostabilen Enzym auch die Auswahlmöglichkeiten
des Assay-Protokolls.
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Vent
(exo-) DNA-Polymerase ist ein Enzym, das beides, Strangverdrängungsaktivität und einen
hohen Grad an Thermostabilität,
aufweist. Es ist bekannt, dass die Synthesereaktion der komplementären Kette,
welche eine Strangverdrängung
durch DNA-Polymerase beinhaltet, begünstigt wird durch Hinzufügen eines
Proteins, das Einzelstränge
bindet (Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics, 19, 225-232, Juli,
1998). Diese Wirkung wird auf die vorliegende Erfindung angewendet
und durch Hinzufügen
des Einzelstrang-bindenden Proteins kann der Effekt des Förderns der
Synthese der komplementären
Kette erwartet werden. Zum Beispiel ist T4 Gen 32 wirksam als ein
Einzelstrang-bindendes Protein für
Vent (exo-) DNA-Polymerase.
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Für eine DNA-Polymerase,
die keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität aufweist,
gibt es ein bekanntes Phänomen,
wo die Synthese der komplementären
Kette nicht an dem 5'-Ende
von der Matrize anhält,
was zu der Herstellung von einem Ein-Basen Überhang führt. In der vorliegenden Erfindung
ist dieses Phänomen
nicht wünschenswert,
weil, wenn die Synthese von der komplementären Kette das Ende erreicht,
die Sequenz des 3'-Endes
die Initiierung der nächsten
Synthese einer komplementären
Kette ausführt.
Weil eine Base "A" mit großer Wahrscheinlichkeit
an das 3'-Ende durch
die DNA-Polymerase angefügt
wird, kann die Sequenz so ausgewählt
werden, dass die Synthese von dem 3'-Ende am "A" startet,
so dass da kein Problem auftritt, wenn eine zusätzliche Base fälschlicherweise
durch dATP hinzugefügt
wird. Ferner, selbst wenn das 3'-Ende überhängt während der
Synthese der komplementären
Kette, kann die 3'→5' Exonuklease-Aktivität verwendet
werden zum Abbauen des Überhangs,
um die Enden stumpf zu machen. Weil die natürliche Vent DNA-Polymerase
diese Aktivität
aufweist, kann dieses Enzym zum Beispiel in einem Gemisch mit Vent
(exo-) DNA-Polymerase verwendet werden, um dieses Problem zu lösen.
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Verschiedene
Reagenzien, die für
das Verfahren zum Synthetisieren oder Amplifizieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung notwendig sind, können
zuerst verpackt werden und als ein Kit bereitgestellt werden. Insbesondere
wird ein Kit für
die vorliegende Erfindung bereitgestellt, das verschiedene Arten
von Oligonukleotiden, die als Primer zur Synthese der komplementären Kette
und als äußere Primer
zur Verdrängung
notwendig sind, dNTP als ein Substrat zur Synthese der komplementären Kette,
eine DNA-Polymerase zum Ausführen
der Synthese der komplementären
Kette nach Art der Strangverdrängung,
ein Puffer, der geeignete Bedingungen für die Enzymreaktion bereitstellt,
und gegebenenfalls Reagenzien, die zum Detektieren des Synthesereaktionsproduktes
notwendig sind, umfasst. Insbesondere ist die Zugabe von Reagenzien
während
der Reaktion notwendig gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung, und somit werden die Reagenzien,
die für
eine Reaktion notwendig sind, nach Pipettieren in ein Reaktionsgefäß bereitgestellt,
wodurch die Reaktion gestartet werden kann nur durch Hinzugeben
einer Probe. Durch Verfassen eines Systems, in welchem das Reaktionsprodukt
in situ detektiert werden kann in einem Reaktionsgefäß durch
Verwenden eines Lumineszenzsignals oder eines Fluoreszenzsignals,
ist es nicht notwendig, das Gefäß nach der
Reaktion zu öffnen
und zu schließen.
Dies ist sehr wünschenswert
zur Vermeidung von Kontamination.
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Die
Nukleinsäure,
die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind, welche gemäß der vorliegenden
Erfindung synthetisiert wird, hat zum Beispiel die folgende Nützlichkeit.
Das erste Merkmal ist die Anwendung des Vorteils, der aus der speziellen
Struktur mit komplementären
Sequenzen in einem Molekül
ergibt. Dieses Merkmal sollte zu einer erleichterten Detektion führen. Das
heißt,
es gibt ein bekanntes System zum Detektieren von Nukleinsäure, wobei
das Signal in Abhängigkeit
von den Basenpaarungen mit einer komplementären Nukleotidsequenz variiert.
Durch die Kombination, zum Beispiel, mit dem Verfahren des Verwendens
eines Doppelstrang-Ketten-spezifischen Interkalators als ein Detektor,
wie dies oben beschrieben ist, kann ein Detektionssystem realisiert
werden, das die Charakteristika von dem Syntheseprodukt der vorliegenden
Erfindung voll ausnutzt. Wenn das Produkt der Synthesereaktion gemäß der vorliegenden
Erfindung einmal im besagten Detektionssystem Hitze-denaturiert
ist, und man zu der Ausgangstemperatur zurückkehrt, erfolgt bevorzugt
ein intramolekulares sich Anlagern und somit wird es komplementären Ketten
gestattet, schnell Basenpaarungen einzugehen. Wenn unspezifische Reaktionsprodukte
vorliegen, weisen diese keine komplementären Ketten in ihrem Molekül auf, so
dass, nachdem sie in zwei oder mehr Moleküle durch Hitze-Denaturierung
getrennt wurden, diese nicht unmittelbar in die ursprüngliche
doppelstrangige Kette zurückkehren
können.
Durch Vorsehen des Schrittes der Hitze- Denaturierung vor der Detektion können Störsignale,
welche die unspezifische Reaktion begleiten, reduziert werden. Wenn
eine DNA-Polymerase, die nicht resistent gegenüber Hitze ist, verwendet wird,
bedeutet der Schritt des Hitzedenaturierens die Beendigung von der
Reaktion und dies ist vorteilhaft für die Regelung von der Reaktionstemperatur.
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Das
zweite Merkmal ist, dass immer eine Schleife gebildet wird, die
zur Rasenpaarung in der Lage ist. Die Struktur von einer Schleife,
die zur Basenpaarung in der Lage ist, ist in 4 gezeigt.
Wie in 4 zu sehen ist, besteht die Schleife aus der Nukleotidsequenz
F2c (X2c), an welche sich der Primer anlagern kann, und einer Nukleotidsequenz,
welche zwischen F2c-F1c (X1c) tritt. Die Sequenz zwischen F2c-F1c
(oder zwischen X2c-X1c in einer allgemeineren Form) ist eine Nukleotidsequenz,
die von der Matrize abgeleitet ist. Wenn demgemäß eine Sonde, die komplementäre Nukleotidsequenzen
aufweist, mit dieser Region hybridisiert, ist eine Matrizen-spezifische
Reaktion möglich.
Zusätzlich
ist diese Region immer für
Basenpaarung zugänglich,
und daher ist Hitzedenaturierung vor der Hybridisierung nicht erforderlich.
Die Nukleotidsequenz, welche eine Schleife in dem Produkt der Amplifikationsreaktion
gemäß der vorliegenden
Erfindung ausmacht, kann eine willkürliche Länge haben. Wenn demgemäß eine Hybridisation
mit einer Sonde erwünscht
ist, werden eine Region, an die der Primer hybridisieren soll, und
eine Region, an die sich die Sonde anlagern soll, getrennt voneinander
angeordnet, um deren Konkurrenz zu verhindern, wodurch ideale Reaktionsbedingungen
festgelegt werden können.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung sind eine große Anzahl von Schleifen, die
zur Basenpaarung fähig
sind, in einem einzelnen Strang von Nukleinsäure vorhanden. Dies bedeutet,
dass eine große
Anzahl von Sonden mit einem Molekül der Nukleinsäure hybridisieren
kann, um eine hohe Detektionsempfindlichkeit zu erlauben. Es ist
somit möglich,
nicht nur die Empfindlichkeit zu verbessern, sondern auch ein Verfahren
zum Detektieren von Nukleinsäure,
das auf einem speziellen Reaktionsprinzip, wie beispielsweise Aggregation,
basiert, zu verbessern. Zum Beispiel wird eine Sonde, die auf kleinen
Partikeln, wie beispielsweise Polystyrollatex, immobilisiert ist,
zu dem Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung
hinzugegeben, und die Aggregation von Latex-Partikeln wird beobachtet,
wenn die Hybridisierung von dem Produkt mit der Sonde abläuft. Eine
hochsensitive und quantitative Beobachtung ist möglich durch optisches Messen
der Stärke
von der Aggregation. Weil die Aggregation ebenso mit dem bloßen Auge
beobachtet werden kann, kann auch ein Reaktionssystem, das keine
optischen Messgeräte
verwendet, eingesetzt werden.
-
Ferner
ermöglicht
das Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung, welches es gestattet, viele Marker pro Nukleinsäuremolekül daran
zu binden, eine chromatographische Detektion. Auf dem Gebiet der Immunoassays
wird normalerweise ein Analyseverfahren (Immunochromatographie)
eingesetzt, welches ein chromatographisches Medium verwendet, das
einen visuell detektierbaren Marker verwendet. Dieses Verfahren
basiert auf dem Prinzip, dass ein Analyt zwischen einem Antikörper, der
auf einem chromatographischen Medium immobilisiert ist, und einem
markierten Antikörper
angeordnet wird, und die markierten Stoffe, die nicht reagiert haben,
ausgewaschen werden. Das Reaktionsprodukt der vorliegenden Erfindung
macht dieses Prinzip anwendbar zur Analyse von Nukleinsäure. Das
heißt,
eine markierte Sonde für
einen Teil von einer Schleife wird hergestellt und auf ein chromatographisches
Medium immobilisiert, um eine Einfang-Sonde zum Fangen herzustellen,
wodurch eine Analyse in dem chromatographischen Medium erlaubt wird.
Als die Einfang-Sonde kann eine Sequenz, die komplementär zu dem
Teil von der Schleife ist, verwendet werden. Weil das Reaktionsprodukt
der vorliegenden Erfindung eine große Anzahl an Schleifen aufweist,
bindet das Produkt eine große
Anzahl von markierten Sonden, und gibt ein visuell erkennbares Signal.
-
Das
Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung, welches immer eine Region einer Schleife aufweist, die
zur Basenpaarung fähig
ist, ermöglicht
eine große
Vielzahl von anderen Detektionssystemen. Zum Beispiel ist ein Detektionssystem,
welches Oberflächenplasmonresonanz
verwendet, möglich
beim Verwenden einer immobilisierten Sonde für diesen Schleifenabschnitt.
Ferner, wenn eine Sonde für
den Schleifenabschnitt mit einem für doppelstrangige Ketten spezifischen
Interkalator markiert ist, kann eine sensitivere Fluoreszenzanalyse
durchgeführt
werden. Alternativ ist es auch möglich,
die Fähigkeit
der Nukleinsäure,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung synthetisiert wird, eine Schleife auszubilden, die zur
Basenpaarung fähig ist,
an beiden, der 3'-
und der 5'-Seite
positiv auszunutzen. Zum Beispiel wird eine Schleife so ausgestaltet, dass
diese eine herkömmliche
Nukleotidsequenz von einem normalen Typ und einem abnormalen Typ
aufweist, während
die andere Schleife so ausgestaltet ist, dass ein Unterschied zwischen
diesen beiden Typen ausgestaltet wird. Es ist möglich, ein charakteristisches
analytisches System zu verfassen, in welchem die Gegenwart von einem
Gen durch die Sonde für
den herkömmlichen
Teil bestätigt wird,
während
die Gegenwart von einer Abnormalität in der anderen Region bestätigt wird.
Weil die Reaktion zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung auch isothermisch ablaufen kann, ist es ein sehr wichtiger
Vorteil, dass eine Echtzeitanalyse mit einem herkömmlichen
Fluoreszenz-Photometers ausgeführt
werden kann. Vordem ist die Struktur der Nukleinsäure bekannt,
die sich in der gleichen Kette anlagern soll. Die Nukleinsäure, die
komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die in einer einzelstrangigen Kette
abwechselnd verknüpft sind,
die man gemäß der vorliegenden
Erfindung erhält,
ist jedoch insofern neu, als dass diese eine große Anzahl von Schleifen aufweist,
die zur Basenpaarung mit anderen Oligonukleotiden in der Lage sind.
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Andererseits
kann die große
Anzahl von Schleifen selbst, die durch das Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung gegeben sind, als Sonden verwendet werden. In einem DNA-Chip
sollten zum Beispiel Sonden in hoher Dichte auf einer begrenzten
Fläche
angehäuft
sein. Bei den derzeitigen Technologien ist jedoch die Anzahl an
Oligonukleotiden, welche auf einer bestimmten Fläche immobilisiert werden können, limitiert.
Durch Verwenden von dem Reaktionsprodukt von der vorliegenden Erfindung
kann somit eine große
Anzahl von Sonden, die zum Anlagern in der Lage sind, in hoher Dichte
immobilisiert werden. Das heißt,
das Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung kann als Sonden auf einem DNA-Chip immobilisiert werden. Nach
der Amplifikation kann das Reaktionsprodukt durch eine aus dem Stand
der Technik bekannte Technik immobilisiert werden, oder das immobilisierte
Oligonukleotid wird als das Oligonukleotid in der Amplifikationsreaktion
gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt, was zu der Erzeugung des immobilisierten Reaktionsprodukts
führt.
Durch Verwenden der so immobilisierten Probe kann eine große Anzahl
von Proben DNAs auf einer begrenzten Fläche hybridisiert werden und
als ein Ergebnis sind starke Signale zu erwarten.
-
Kurze Beschreibung von den
Abbildungen
-
1 ist
eine Darstellung von einem Teil (1) bis (4) von dem Reaktionsprinzip
in einer bevorzugten Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung.
-
2 ist
eine Darstellung von einem Teil (5) bis (7) von dem Reaktionsprinzip
in einer bevorzugten Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung.
-
3 ist
eine Darstellung von einem Teil (8) bis (10) von dem Reaktionsprinzip
in einer bevorzugten Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung.
-
4 ist
eine Darstellung von der Struktur von einer Schleife, die durch
die einzelstrangige Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung ausgebildet wird.
-
5 ist
eine Darstellung von einem Teil (A) bis (B) in einer Basisform von
der vorliegenden Erfindung.
-
6 ist
eine Darstellung von einem Teil (C) bis (D) in einer Basisform von
der vorliegenden Erfindung.
-
7 ist
eine Zeichnung, welche die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung
von jeder Nukleotidsequenz zeigt, welche ein Oligonukleotid in der
Zielnukleotidsequenz von M13mp18 ausmacht.
-
8 ist
eine Photographie, welche das Ergebnis einer Agarose-Elektrophorese
von einem Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren
von einzelstrangiger Nukleinsäure
mit M13mp18 als Matrize gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten wurde. Bahn 1: XIV Größenmarker Bahn 2: 1 fmol M13mp18 dsDNA
Bahn 3: Kein Ziel
-
9 ist
eine Photographie, welche das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese
des Produktes von einem Restriktionsenzym-Verdau zeigt, welches
Produkt in Beispiel 1 durch die Nukleinsäuresynthesereaktion gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten wurde.
- Bahn 1: XIV Größenmarker
- Bahn 2: BamHI-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
- Bahn 3: PvuII-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
- Bahn 4: HindIII-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
-
10 ist
eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese
von einem Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren
von einzelstrangiger Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung unter Verwendung von M13mp18 als eine Matrize in der Gegenwart
von Betain zeigt. 0, 0,5, 1 und 2 gibt die Konzentration (M) an,
in welcher Betain zu der Reaktionslösung hinzugefügt wurde.
N gibt die Negativkontrolle an, und – 21 gibt die Konzentration
10–21 mol
der Matrizen-DNA an.
-
11 ist
eine Zeichnung, welche die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung
von jeder Nukleotidsequenz zeigt, welche ein Oligonukleotid in einer
Zielnukleotidsequenz ausmacht, die von HVB abgeleitet ist.
-
12 ist
eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese
von einem Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren
von einzelstrangiger Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt, wobei HBV-M13mp18, integriert in M13mp18, als eine
Matrize verwendet wurde.
- Bahn 1: XIV Größenmarker
- Bahn 2: 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA
- Bahn 3: Kein Ziel
-
13 ist
eine Photographie, die das Ergebnis von einer Gelelektrophorese
von einem Base-denaturierten Produkt zeigt, das durch das Verfahren
zum Synthetisieren von einzelstrangiger Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
erhalten wurde.
- Bahn 1: HindIII-verdautes Fragment von einem
Lambda-Phagen
- Bahn 2: Das Reaktionsprodukt aus Beispiel 1.
- Bahn 3: Das Reaktionsprodukt aus Beispiel 3.
-
14 ist
eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese
von einem Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren
von einzelstrangiger Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten wurde, wobei die Konzentration des Ziels M13mp18
variiert wurde. Die obere und die untere Photographie zeigen das
Ergebnis von der Reaktion nach 1 bzw. 3 Stunden.
- Bahn 1:
M13mp18 dsDNA 1 × 10–15 mol/Röhrchen
- Bahn 2: M13mp18 dsDNA 1 × 10–16 mol/Röhrchen
- Bahn 3: M13mp18 dsDNA 1 × 10–17 mol/Röhrchen
- Bahn 4: M13mp18 dsDNA 1 × 10–18 mol/Röhrchen
- Bahn 5: M13mp18 dsDNA 1 × 10–19 mol/Röhrchen
- Bahn 6: M13mp18 dsDNA 1 × 10–20 mol/Röhrchen
- Bahn 7: M13mp18 dsDNA 1 × 10–21 mol/Röhrchen
- Bahn 8: M13mp18 dsDNA 1 × 10–22 mol/Röhrchen
- Bahn 9: Kein Ziel
- Bahn 10: XIV Größenmarker
-
15 ist
eine Zeichnung, welche die Stelle von einer Mutation und welche
die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von jeder Region zu
einer Zielnukleotidsequenz (Ziel) zeigt. Das unterstrichene Guanin ist
ersetzt durch Adenin in der Mutante.
-
16 ist
eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese
eines Produktes gemäß der Amplifikationsreaktion
von der vorliegenden Erfindung zeigt:
- M: 100 bp Leiter (New
England Biolabs)
- N: Keine Matrize (Reinstwasser)
- WT: 1 fmol Wildtyp-Matrize M13mp18
- MT: 1 fmol Mutanten-Matrize M13mp18FM
-
17 ist
eine Zeichnung, welche die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung
von jeder Nukleotidsequenz zeigt, die ein Oligonukleotid in einer
Nukleotidsequenz ausmacht, die für
die Ziel-mRNA kodiert.
-
18 ist
eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese
eines Produktes zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren
einzelstrangiger Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung unter Verwendung von mRNA als Ziel erhalten wurde.
-
Beste Ausführungsform zum Durchführen der
Erfindung
-
Beispiel 1. Amplifikation von einer Region
in M13mp18
-
Das
Verfahren zum Synthetisieren der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung,
die komplementäre
Ketten aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette
angeordnet sind, wurde untersucht unter Verwendung von M13mp18 als
eine Matrize. Vier Arten von Primern, nämlich M13FA, M13RA, M13F3 und
M13R3 wurden in dem Experiment verwendet. M13F3 und M13R3 waren
die ersten und zweiten äußeren Primer
zum Verdrängen
der ersten und der zweiten Nukleinsäure, die entsprechend mit dem
ersten Oligonukleotid M13FA bzw. dem zweiten Oligonukleotid M13RA
als dem Ausgangspunkt für
die Synthese erhalten wurden. Weil die äußeren Primer Primer sind, die
als Ausgangspunkt der Synthese einer komplementären Kette nach der Synthese
mit M13FA (oder M13RA) dienen, wurden diese durch Verwenden von
dem Phänomen
des "Contiguous
Stacking" so ausgestaltet,
dass sie sich an einer Region anlagern, die benachbart zu M13FA
(oder M13RA) ist. Ferner wurde die Konzentration von diesen Primern
so hoch angesetzt, dass das sich Anlagern von M13FA (oder M13RA)
bevorzugt ablief.
-
Die
Nukleotidsequenz, welche jeden Primer ausmacht, ist in dem Sequenzprotokoll
gezeigt. Die strukturellen Charakteristika von den Primern sind
nachfolgenden zusammengefasst. Ferner ist die die Lage betreffende
Anordnungsbeziehung von jeder Region hinsichtlich der Zielriukieotidsequenz
(Ziel) in
7 gezeigt.
Primer | Region an der 5'-Seite/Region an
der 3'-Seite |
M13FA | Die gleiche wie die Region
F1c in der komplementären
Kette, die durch M13FA synthetisiert wird/komplementär zu der
Region F2c in M13mp18 |
M13RA | Die gleiche wie die Region
R1c in der komplementären
Kette, die durch M13RA synthetisiert wurde/komplementär zur Region
R2c in der komplementären Kette,
die durch M13FA synthetisiert wird |
M13F3 | Komplementär zu F3c,
die benachbart an der 3'-Seite von
der Region F2c in M13mp18 ist |
M13R3 | Komplementär zu R3c,
die benachbart zu der 3'-Seite von
der Region F2c in der komplementären
Kette ist, die durch M13FA synthetisiert wird. |
-
Mit
solchen Primern wird Nukleinsäure
synthetisiert, in welcher eine Region, die sich von F1c bis R1c in
M13mp18 erstreckt, und dessen komplementäre Nukleotidsequenz, abwechselnd über eine
schleifen-bildende Sequenz, die F2c enthält, in einer einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind. Die Zusammensetzung von einer Reaktionslösung für das Verfahren zum Synthetisieren
von Nukleinsäure
mittels dieser Primer gemäß der vorliegenden
Erfindung ist nachfolgend gezeigt.
-
Zusammensetzung von der Reaktionslösung (in
25 μL)
-
- 20 mM Tris-HCl pH 8,8
- 10 mM KCl
- 10 mM (NH4)2SO4
- 6 mM MgSO4
- 0,1 % Triton X-100
- 5 % Dimethylsulfoxid (DMSO)
- 0,4 mM dNTP
-
Primer:
-
- 800 nM M13FA/Seq. ID Nr.: 1
- 800 nM M13RA/Seq. ID Nr.: 2
- 200 nM M13F3/Seq. ID Nr.: 3
- 200 nM M13R3/Seq. ID Nr.: 4
- Ziel: M13mp18 dsDMA/Seq. ID Nr.: 5
-
Reaktion:
Die obige Reaktionslösung
wurde auf 95 °C
für 5 Minuten
erhitzt und das Ziel wurde in eine einzelstrangige Kette denaturiert.
Die Reaktionslösung
wurde in eiskaltes Wasser transferiert und 4 U von Bst DNA-Polymerase
(NEW ENGLAND Biolabs) wurde dazu hinzugefügt und das Gemisch wurde bei
65 °C für 1 Stunde
reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde die Reaktion bei 80 °C für 10 Minuten
beendet und erneut in eiskaltes Wasser überführt.
-
Bestätigung von
der Reaktion: 1 μl
Beladungspuffer wurde zu 5 μl
der obigen Reaktionslösung
hinzugefügt
und die Probe wurde einer Elektrophorese unterzogen für 1 Stunde
bei 80 mV auf einem 2 % Agarose-Gel (0,5 % TBE). Als molekularer
Gewichtsmarker wurde XIV (100 bp Leiter, Boehringer Mannheim) verwendet.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit SYBR Green I (Molecular
Probes, Inc.) angefärbt,
um die Nukleinsäure
zu bestätigen.
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die entsprechenden
Bahnen entsprechen den folgenden Proben.
- 1.
XIV Größenmarker
- 2. 1 fmol M13mp18 dsDNA
- 3. Kein Ziel
-
In
Bahn 3 wurde keine Bande bestätigt,
außer
dass die nicht reagierten Primer angefärbt wurden. In Bahn 2 wurden,
in der Gegenwart von dem Ziel, die Produkte bestätigt als eine Leiter von Banden
mit geringer Größe, als
eine verschmierte Verfärbung
bei einer hohen Größe und als
eine Bande, die nur schwer in dem Gel elektrophoretisch getrennt
wurde. Unter den Banden kleiner Größen entsprechen die Banden
im Bereich von 290 bp und 450 bp den Produkten, die in der Synthesereaktion
gemäß dieser
Erfindung erwartet wurden, das heißt, die doppelstrangigen Ketten
gemäß Seq. ID
Nr. 11 und 12 (entsprechend der doppelstrangigen Ketten, die so
ausgebildet wurden, wie in 2-(7) und 2-(10) gezeigt) und eine einzelstrangige Kette
von Seq. ID Nr. 13 (entsprechend der langen einzelstrangi gen Kette
aus 3-(9)), und es wurde somit bestätigt, dass
die Reaktion so ablief, wie erwartet. Es wurde erwartet, dass die
Elektrophoreseergebnisse von dem verschmierten Muster bei der hohen
Größe und die
Bande, was nicht elektrophoresiert wurde, zu Stande kamen, weil
diese Reaktion prinzipiell eine kontinuierliche Reaktion war, welche
variierende Molekulargewichte von den Reaktionsprodukten gestattet,
und ferner weil das Produkt eine komplexe Struktur hat, die eine
teilweise einzelstrangige Kette und einen doppelstrangigen Komplex
aufweist.
-
Beispiel 2. Bestätigung von den Reaktionsprodukten
durch Verdau mit Restriktionsenzymen
-
Zum
Zwecke des Klarstellens der Struktur von der Nukleinsäure, die
komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind, welche in Beispiel 1 gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten wurde, wurde ein Verdau von dem Produkt mit Restriktionsenzymen durchgeführt. Wenn
die Fragmente durch Verdau der Produkte mit Restriktionsenzymen
theoretisch generiert werden und wenn gleichzeitig das verschmierte
Muster mit hoher Größe und die
Bande, die nicht elektrophoretisch getrennt wurde, wie sie in Beispiel
1 beobachtet wurden, verschwinden, dann kann erwartet werden, dass
jedes von diesen Produkten die Nukleinsäuren sind, welche komplementäre Ketten
aufweisen, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind,
welche gemäß der vorliegenden
Erfindung synthetisiert wurden.
-
Die
Reaktionslösung
(200 μl)
aus 8 Röhrchen
des Beispiels 1 wurde zusammengefügt und aufgereinigt durch Behandlung
mit Phenol und Ausfällen
mit Ethanol. Die erhaltenen Niederschläge wurden wiedergewonnen und
erneut aufgelöst
in 200 μl
TE-Puffer und ein 10 μl
Aliquot wurde verdaut bei 38 °C
für 2 Stunden mit
den Restriktionsenzymen BamHI, PvuII und HindIII. Der Verdau wurde
für 1 Stunde
bei 80 mV auf einem 2 % Agarose-Gel (0,5 % TBE) elektrophoretisch
getrennt. Als ein molekularer Marker wurde Super Ladder-Low (100
bp Leiter) (Gensura Laborstories, Inc.) verwendet. Nach der Elektrophorese
wurde das Gel mit SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) angefärbt, um
die Nukleinsäure
zu bestätigen.
Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Die einzelnen Bahnen
entsprechen den folgenden Proben.
- 1. XIV Größenmarker
- 2. BamHI-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
- 3. PvuII-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
- 4. HindIII-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
-
Es
wird angenommen, dass die Nukleotidsequenzen, welche relativ kurze
Amplifikationsprodukte ausmachen, diejenigen der Seq. ID Nr. 13,
14, 15 und 16 sind. Von diesen Nukleotidsequenzen sind die geschätzten Größen von
jedem Fragment, das mit den Restriktionsenzymen verdaut wurde, in
Tabelle 1 gezeigt. "L" in der Tabelle bezeichnet,
dass dessen Position in der Elektrophorese nicht ermittelt wurde,
weil L ein Fragment ist, das eine Schleife enthält (einzelstrangige Kette). Tabelle 1. Fragmente des Restriktionsenzym-Verdaus
von den Amplifikationsprodukten gemäß der vorliegenden Erfindung
Seq.
ID Nr. | BamHI | PvuII | HindIII |
13
14
15
16
Zusammenfassung |
177
+L
15+101 +L
171+101 +L
11+101+230+1
101, 177,
230 |
56
+L
-
56 +L
237 +1
56, 237 |
147
+L
142 +L
147+161 +L
142+170+1
142, 147, 161,
170 |
- (11, 15; nicht bestätigt)
-
Weil
nahezu alle Banden, die vor dem Verdau sichtbar waren, umgewandelt
wurden in die zu erwartenden Banden, wurde es bestätigt, dass
die beabsichtigten Reaktionsprodukte vervielfältigt wurden. Ferner wurde
es ebenfalls gezeigt, dass eine oder nur wenig unspezifische Produkte
vorhanden waren.
-
Beispiel 3. Unterstützung der Amplifikationsreaktion
durch Zugabe von Betain
-
Es
wurde ein Experiment durchgeführt,
um den Effekt von Betain (N,N,N-trimethylglycin, Sigma), das zu
der Amplifikationsreaktionslösung
hinzugefügt
wird, auf die Amplifikationsreaktion der Nukleinsäure zu untersuchen.
Die Synthese von der Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung, die komplementäre
Ketten aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette
verknüpft
sind, wurde durchgeführt
unter Verwendung von M13mp18 als eine Matrize, entsprechend dem
Beispiel 1, in der Gegenwart von Betain bei verschiedenen Konzentrationen.
Die in dem Experiment verwendeten Primer waren identisch zu denen,
die in Beispiel 1 verwendet wurden. Die Menge von der Matrizen-DNA
war 10-21 mol (M13mp18) und Wasser wurde als Negativkontrolle verwendet.
Betain wurde in Konzentrationen von 0, 0,5 und 1 und 2 M zu der
Reaktionslösung hinzugefügt. Die
Zusammensetzung von der Reaktionslösung ist nachfolgend gezeigt.
-
Zusammensetzung von der Reaktionslösung (in
25 μL)
-
- 20 mM Tris-HCl pH8,8
- 4 mM MgSO4
- 0,4 mM dNTPs
- 10 m MKCl
- 10 mM (NH4)2SO4
- 0,1 % Triton X-100
-
Primer:
-
- 800 nM M13FA/Seq. ID Nr.: 1
- 800 nM M13RA/Seq. ID Nr.: 2
- 200 nM M13F3/Seq. ID Nr.: 3
- 200 nM M13R3/Seq. ID Nr.: 4
- Ziel: M13mp18 dsDMA/Seq. ID Nr.: 5
-
Die
Polymerase, die Reaktionsbedingungen, und die Bedingungen der Elektrophorese
nach der Reaktion waren identisch zu denen, die in Beispiel 1 beschrieben
sind.
-
Die
Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Bei der Reaktion
in der Gegenwart von Betain in einer Konzentration von 0,5 oder
1,0 M war die Menge des Amplifikationsproduktes erhöht. Ferner,
wenn die Konzentration auf 2,0 M Betain erhöht wurde, wurde keine Amplifikation
beobachtet. Es wurde somit gezeigt, dass die Amplifikationsreaktion
gefördert
wurde in der Gegenwart von Betain bei einer geeigneten Konzentration.
Der angenommene Grund dafür,
dass die Menge des Amplifikationsproduktes gesunken war, wenn die
Konzentration von Betain 2 M war, ist, dass die Schmelztemperatur
zu gering wurde.
-
Beispiel 4. Amplifikation einer HBV-Gensequenz
-
Das
Verfahren zum Synthetisieren der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung,
wurde, wobei M13mp18 dsDNA, die eine Teilsequenz des HBV-Gens darin
integriert aufweist, als eine Matrize verwendet wurde. Vier Arten
von Primern, nämlich
HB65FA (Seq. ID Nr. 6), H665RA (Seq. ID Nr. 7), HBF3 (Seq. ID Nr. 8)
und HBR3 (Seq. ID Nr. 9) wurden in dem Experiment verwendet. HB65F3
und HB65R3 waren die ersten und zweiten äußeren Primer zum Verdrängen der
ersten und der zweiten Nukleinsäure,
die entsprechend mit dem ersten Oligonukleotid HB65FA bzw. dem zweiten
Oligonukleotid HB65RA als dem Ausgangspunkt für die Synthese erhalten wurden.
Weil die äußeren Primer
Primer sind, die als Ausgangspunkt der Synthese einer komplementären Kette
nach der Synthese mit M13FA (oder M13RA) dienen, wurden diese so
ausgestaltet, dass sie sich durch Verwenden von dem Phänomen des "Contiguous Stacking" an einer Region
anlagern, die benachbart zu HB65FA (oder HB65RA) ist. Ferner wurde
die Konzentration von diesen Primern so hoch angesetzt, dass das
sich Anlagern von HB65FA (oder HB65RA) bevorzugt ablief. Die Zielsequenz
(430 bp) dieses Beispiels, die von HBV abgeleitet ist, welches in
M13mp18 integriert wurde, ist in Seq. ID Nr. 10 gezeigt.
-
Die
Nukleotidsequenz, welche jeden Primer ausmacht, ist in dem Sequenzprotokoll
gezeigt. Die strukturellen Charakteristika von den Primern sind
nachfolgenden zusammengefasst. Ferner ist die die Lage betreffende
Anordnungsbeziehung von jeder Region hinsichtlich der Zielnukleotidsequenz
(Ziel) in
7 gezeigt.
Primer | Region
an der 5'-Seite/Region
an der 3'-Seite |
HB65FA | Die
gleiche wie die Region F1c in der komplementären Kette, die durch HB65FA
synthetisiert wird/komplementär
zu der Region F2c in HBV-M13mp18 |
HB65RA | Die
gleiche wie die Region R1c in der komplementären Kette, die durch HB65RA
synthetisiert wurde/komplementär
zur Region R2c in der komplementären
Kette, die durch HB65FA synthetisiert wird |
HBF3 | Komplementär zu F3c,
die benachbart an der 3'-Seite von
der Region F2c in HBV-M13mp18 ist |
HBR3 | Komplementär zu R3c,
die benachbart zu der 3'-Seite von
der Region F2c in der komplementären
Kette ist, die durch HB65FA synthetisiert wird. |
-
Mit
solchen Primern wird Nukleinsäure
synthetisiert, in welcher eine Region, die sich von F1c bis R1c in
M13mp18, das eine Teilsequenz von dem HBV-Gen darin integriert aufweist
(HBV-M13mp18), erstreckt, und dessen komplementäre Nukleotidsequenz über eine
schleifen-bildende Sequenz, die F2c enthält, abwechselnd in einer einzelstrangigen
Kette ver knüpft
sind. Die Reaktion wurde durchgeführt unter den gleichen Bedingungen
wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass die oben beschriebenen
Primer verwendet wurden, und die Reaktionslösung wurde Mittels Agarose-Elektrophorese
analysiert. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die
einzelnen Bahnen entsprechen den folgenden Proben.
- 1. XIV Größenmarker
- 2. 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA
- 3. Kein Ziel
-
Entsprechend
zu Beispiel 1 wurden Produkte nur in Gegenwart von dem Ziel bestätigt als
eine Leiter von Banden geringer Größe, als eine verschmierte Färbung mit
hoher Größe und als
eine Bande, die nur schwerlich in dem Gel elektrophoretisch getrennt
wurde (Bahn 2). Unter den Banden geringer Größe stimmen die Banden in der
Nähe von
310 bp und 480 bp mit den erwarteten Produkten der synthetischen
Reaktion gemäß dieser
Erfindung überein,
das heißt
den doppelstrangigen Ketten gemäß Seq. ID
Nr. 17 und 18, und es wurde somit bestätigt, dass die Reaktion wie
erwartet abläuft.
Wie bereits bei den Ergebnissen von Beispiel 1 beschrieben, ist
es anzunehmen, dass das verschmierte Muster mit hoher Größe und die
Bande, die nicht elektrophoretisch getrennt wurde, verursacht wurden
durch die Struktur von dem Syntheseprodukt, das für die vorliegende
Erfindung charakteristisch ist. Mit diesem Experiment wurde es bestätigt, dass
die vorliegende Erfindung durchgeführt werden kann, selbst wenn
eine andere Sequenz (Ziel) für
die Amplifikation verwendet wird.
-
Beispiel 5. Bestätigung der Größe von den
Produkten der Synthesereaktion
-
Um
die Struktur von der Nukleinsäure
zu bestimmen, die gemäß der vorliegenden
Erfindung synthetisiert wurde, wurde deren Länge Mittels Elektrophorese
unter alkalischdenaturierenden Bedingungen analysiert. 1 μl alkaliner
Beladungspuffer wurde zu 5 μl
von jeder Reaktionslösung
in der Gegenwart von dem Ziel des Beispiels 1 oder 4 hinzugefügt, und
bei 50 mA in 0,7 % Agarosegel (50 mM NaOH, 1 mM EDTA) für 14 Stunden
elektrophoretisch getrennt. Als Größenmarker für das Molekulargewicht wurden
HindIII-verdaute Lambda-Phagenfragmente verwendet. Nach der Elektrophorese
wurde das Gel mit 1 M Tris, pH 8 neutralisiert und mit SYBR Green
I (Molecular Probes, Inc.) angefärbt,
um die Nukleinsäure
zu bestätigen.
Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Die einzelnen Bahnen
entsprechen den folgenden Proben.
- 1. HindIII-verdautes
Fragment vom Lambda-Phagen.
- 2. Das Reaktionsprodukt aus Beispiel 1.
- 3. Das Reaktionsprodukt aus Beispiel 4.
-
Wenn
das Reaktionsprodukt unter alkalisch-denaturierenden Bedingungen
elektrophoretisch getrennt wurde, konnte dessen Größe in dem
einzelstrangigen Zustand bestätigt
werden. Es wurde bestätigt,
dass die Größen von
den Hauptprodukten in sowohl Beispiel 1 (Bahn 2) als auch Beispiel
4 (Bahn 3) beide im Bereich von 2 kBasen waren. Ferner wurde aufgezeigt,
dass das Produkt gemäß der vorliegenden
Erfindung verlängert worden
ist auf eine Größe von wenigstens
6 kBasen oder mehr innerhalb des Bereichs, den diese Analyse zu bestätigen in
der Lage ist. Zusätzlich
wurde erneut bestätigt,
dass die Banden, die unter nicht-denaturierenden Bedingungen
in Beispiel 1 und 4 nicht elektrophoretisch getrennt wurden, in
dem denaturierten Zustand in einzelne einzelstrangige Ketten von
geringerer Größe aufgetrennt
wurden.
-
Beispiel 6. Bestätigung der Amplifikation in
Abhängigkeit
von der Konzentration von einem Ziel bei der Amplifikation von einer
Region in M-13mp13
-
Der
Einfluss von unterschiedlichen Konzentrationen des Ziels auf das
Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
wurde untersucht. Das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1
ausgeführt,
mit der Ausnahme, dass die Menge von M13mp18 dsDNA als das Ziel
von 0 bis 1 fmol war und die Reaktionsdauer 1 Stunde oder 3 Stunden
betrug. Entsprechend zu Beispiel 1 wurde die Probe elektrophoretisch
in einem 2 % Agarosegel (0,5 % TBE) getrennt und mit SYBR Green
I (Molecular Probes, Inc.) angefärbt, um
die Nukleinsäure
zu bestätigen.
Als ein molekularer Größenmarker
wurde XIV (100 bp Leiter, Boehringer Mannheim) verwendet. Die Ergebnisse
sind 14 gezeigt (oben: 1-stündige Reaktion, unten: 3-stündige Reaktion).
Die einzelnen Bahnen entsprechen den folgenden Proben:
- 1. M13mp18 dsDNA 1 × 10–15 mol/Röhrchen
- 2. M13mp18 dsDNA 1 × 10–16 mol/Röhrchen
- 3. M13mp18 dsDNA 1 × 10–17 mol/Röhrchen
- 4. M13mp18 dsDNA 1 × 10–18 mol/Röhrchen
- 5. M13mp18 dsDNA 1 × 10–19 mol/Röhrchen
- 6. M13mp18 dsDNA 1 × 10–20 mol/Röhrchen
- 7. M13mp18 dsDNA 1 × 10–21 mol/Röhrchen
- 8. M13mp18 dsDNA 1 × 10–22 mol/Röhrchen
- 9. Kein Ziel
- 10. XIV Größenmarker
-
Eine
gemeinsame Bande tauchte in den einzelnen Bahnen in dem unteren
Teil des elektrophoretischen Profils auf und zeigt die nicht reagierten
angefärbten
Primer. Unabhängig
von der Reaktionszeit wurde kein Amplifikationsprodukt beobachtet
in der Abwesenheit von dem Ziel. Ein Färbungsmuster der Amplifikationsprodukte,
abhängig
von der Konzentration des Ziels, wurde nur in der Gegenwart von
dem Ziel erhalten. Ferner konnten Amplifikationsprodukte bei niedrigen
Konzentrationen bestätigt
werden, wenn die Reaktionszeit verlängert wurde.
-
Beispiel 7. Detektion von einer Punktmutation
-
(1) Herstellung von M13mp18FM (Mutante)
-
Die
verwendete Ziel-DNA war M13mp18 (Wildtyp) und M13mp18FM (Mutante).
Für die
Erzeugung von der Mutante M13mp18FM wurde das LA PCR in vitro Mutagenesekit
(Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet, um ein Nukleotid für die Mutation
zu ersetzen. Danach wurde die Sequenz durch Sequenzieren bestätigt. Die Sequenz
von der F1-Region ist nachfolgend gezeigt:
Wildtyp: CCGGGGATCCTCTAGAGTCG
(Seq. ID Nr. 19)
Mutante: CCGGGGATCCTCTAGAGTCA (Seq. ID Nr.
20)
-
(2) Ausgestaltung der Primer
-
Die
FA-Primer, die für
den Wildtyp und die Mutante verwendet wurden, wurden an deren 5'-Ende von der Region
F1c mit entsprechend verschiedenen Nukleotidsequenzen versehen.
Die Lage von der Mutation und die die Lage betreffenden Anordnungsbeziehung
von jeder Region hinsichtlich der Ziel-Nukleotidsequenz (Target)
sind in 15 gezeigt.
-
(3) Amplifikationsreaktion
-
Ein
Experiment wurde durchgeführt,
um zu untersuchen, ob eine Matrizen-spezifische Amplifikationsreaktion
abläuft
unter Verwendung einer Kombination von spezifischen Primern, die
nachfolgend gezeigt sind, durch Verwenden von M13mp18 (Wildtyp)
und M13mp18FM (Mutante) als Primern.
-
Primersatz
für die
Amplifikation des Wildtyps: FAd4, RAd4, F3, R3 Primersatz für die Amplifikation
der Mutante: FAMd4, RAd4, F3, R3 Die Nukleotidsequenz von jedem
Primer ist wie folgt:
-
- FAd4: CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT
(Seq.
ID Nr. 21
- FAMd4: TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT
(Seq.
ID Nr. 22)
- RAd4: CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC
(Seq.
ID Nr. 23)
- F3: ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA (Seq. ID Nr. 24)
- R3: GTTGGGAAGGGCGATCG (Seq. ID Nr. 25)
-
(4) Detektion von der Punktmutation in
M13mp18
-
Die
Zusammensetzung von der Reaktionslösung ist wie folgt:
| | Endkonzentration |
D2W | 3,75 μl | |
10× Thermo
pol Puffer (NEB) | 2,5 μl | 20
mM Tris-HCl pH 8,8 |
| | 10
mM KCl |
| | 10
mM (NH4)2SO4 |
| | 6
mM MgSO4 |
| | 0,1
% TritonX-100 |
2,5
mM dNTP | 4 μl | 400 μM |
100
mM MgSO4 | 0,5 μl | |
4 M
Betain | 6,25 μl | 1
M |
M13FAd4
Primer (10 pmol/μl
oder | | |
M13FAMd4
Primer (10 pmol/μl) | 2 μl | 800
nM |
M13RAd4
Primer (10 pmol/μl) | 2 μl | 800
nM |
M13F3
Primer (10 pmol/μl) | 0,5 μl | 200
nM |
M13R3
Primer (10 pmol/μl) | 0,5 μl | 200
nM |
Gesamtmenge | 22 μl | |
-
1
fmol (2 μl)
von dem Ziel M13mp18 oder M13mp18FM wurde zu der Reaktionslösung hinzugeben
und auf 95 °C
für 5 Minuten
erhitzt, wodurch das Ziel in eine einzelstrangige Kette denaturiert
wurde. Die Reaktionslösung
wurde ein eiskaltes Wasser überführt und
1 μl (8
U) von Bst DNA-Polymerase (NEW ENGLAND Biolab) wurde dazu hinzugefügt und eine
Reaktion wurde für
1 Stunde bei 68 °C
oder 68,5 °C
durchgeführt. Nach
der Reaktion wurde die Reaktion beendet bei 80 °C für 10 Minuten, und die Reaktionslösung wurde
erneut in eiskaltes Wasser überführt.
-
Wie
in 16 gezeigt ist, wurde eine effektive Amplifikation
nur in der Gegenwart von der Wildtyp-Matrize beobachtet, wenn FAd4
für den
Wildtyp als der FA Primer verwendet wurde.
-
Andererseits,
wenn FAMd4 für
die Mutante als der FA Primer verwendet wurde, wurde eine effektive Amplifikation
nur in der Gegenwart von der Wildtyp [sic.!]-Matrize beobachtet.
-
Mit
den oben beschriebenen Ergebnissen wurde gezeigt, dass die Punktmutation
effizient detektiert werden kann, bei Verwenden der Amplifikationsreaktion
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
-
Beispiel 8. Amplifikationsreaktion von
mRNA als ein Ziel
-
Das
Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
wurde untersucht unter Verwenden von mRNA als die Ziel-Nukleinsäure. Um
die Ziel-mRNA herzustellen wurden Zellen der Prostatakrebs-Zelllinie
LNCaP (ATCC Nr. CRL-1740), welche das Prostata-spezifische Antigen
(PSA) exprimieren, gemischt mit Zellen der chronischen myeloischen
Leukämiezelllinie
K562 (ATCC Nr. CCL-243) als nicht-exprimierende Zellen bei 1: 106 bis 100: 106, gefolgt
von der Extraktion von der Gesamt-RNA durch Verwenden von dem RNeasy
Mini Kit von Qiagen (Deutschland). Vier Arten von Primern, nämlich PSAFA,
PSARA, PSAF3 und PSAR3, wurden in diesem Experiment verwendet. PSAF3 und
PSAR3 sind äußere Primer zum
Verdrängen
der ersten Nukleinsäure,
die entsprechend mit PSAFA bzw. PSARA als dem Ausgangspunkt der
Synthese erhalten wurden. Ferner wurden die Konzentrationen von
diesen Primer so hoch gesetzt, dass die Anlagerung von PSAFA (oder
PSARA) bevorzugt ablief. Die Nukleotidsequenzen, welche die entsprechenden
Primer ausmachen, sind wie folgt.
-
Primer:
-
- PSAFA: TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG
(Seq.
ID Nr. 26)
- PSARA: TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG
(Seq.
ID Nr. 27)
- PSAF3: TGCTTGTGGCCTCTCGTG (Seq. ID Nr. 28)
- PSAR3: GGGTGTGGGAAGCTGTG (Seq. ID Nr. 29)
-
Die
strukturellen Merkmale von den Primern sind nachfolgend zusammengefasst.
Ferner sind die die Lage betreffende Anordnungsbeziehungen von jedem
Primer hinsichtlich der DNA-Nukleotidsequenz, welche für die Ziel-mRNA
kodiert, und die Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym Sau3Al
in
17 gezeigt.
Primer | Region
an der 5'-Seite/Region
an der 3'-Seite |
PSAFA | Die
gleiche wie Region F1c in der komplementären Kette, die durch PSAFA
synthetisiert wird/komplementär
zur Region F2c in der Ziel-Nukleotidsequenz |
PSARA | Die
gleiche wie Region R1c in der komplementären Kette, die mit PSARA synthetisiert
wird/komplementär zur
Region R2c in der komplementären
Kette, die mit PSAFA synthetisiert wird |
PSAF3 | Komplementär zu F3c,
die benachbart zu der 3'-Seite der
Region von der Region F2c in der Ziel-Nukleotidsequenz ist |
PSAR3 | Komplementär zu R3c,
die benachbart zu der 3'-Seite von
der Region R2c in der komplementären
Kette ist, die mit PSAFA synthetisiert wird |
-
Die
Zusammensetzung von einer Reaktionslösung für das Verfahren zum Synthetisieren
von Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist wie folgt:
-
Zusammensetzung der Reaktionslösung (in
25 μL)
-
- 20 mM Tris-HCl pH 8,8
- 4 mM MgSO4
- 0,4 mM dNTPs
- 10 mM KCl
- 10 mM (NH4)2SO4
- 0,1 % Triton X-100
- 0,8 M Betain
- 5 mM DTT
- 1600 nM PSAFA & PSARA
Primer
- 200 nM PSAF3 & PSAR3
Primer
- 8 U Bst DNA-Polymerase
- 100 U Rever Tra Ace (Toyobo Co., Ltd., Japan)
- 5 μg
Total RNA
-
Alle
Inhaltsstoffe wurden auf Eis gemischt. In diesem Experiment wurde
mRNA (einzelstrangige Kette) als ein Ziel verwendet und somit ist
der Schritt des Herstellens einer einzelstrangigen Kette durch Hitzedenaturierung
nicht erforderlich. Die Reaktion wurde durchgeführt bei 65 °C für 45 Minuten und die Reaktion
wurde beendet bei 85 °C
für 5 Minuten.
-
Nach
der Reaktion wurden 5 μl
von der Reaktionslösung
in 2 % Agarose elektrophoretisch getrennt und detektiert durch SYBR
Green I.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 18 gezeigt. Die einzelnen Bahnen entsprechen
den folgenden Proben.
Bahn | Bst | Rt | Anzahl
von LNCaP Zellen/106 K562 Zellen |
1 | - | + | 0 |
2 | - | + | 10 |
3 | + | - | 0 |
4 | + | - | 10 |
5 | + | + | 0 |
6 | + | + | 1 |
7 | + | + | 10 |
8 | Sau3Al-Verdau
von einem 1 μL
Aliquot von der Reaktionslösung
der Bahn 6 |
9 | Sau3Al-Verdau
von einem 1 μl
Aliquot von der Reaktionslösung
der Bahn 7 |
10 | Größenmarker,
100 bp Leiter (New England Biolabs) |
-
In
der Abwesenheit von entweder Bst DNA Polymerase oder Rever Tra Ace,
konnten keine Amplifikationsprodukte erhalten werden (Bahnen 1 bis
4). In der Gegenwart von beiden Enzymen wurde ein Amplifikationsprodukt
detektiert (Bahnen 5 bis 7), wenn die von LNCaP abgeleitete RNA
vorhanden war. RNA, die von einer LNCaP Zelle pro eine Millionen
K562 Zellen extrahiert wurde, konnte detektiert werden (Bahn 6).
Wenn das Amplifikationsprodukt an den Stellen des Restriktionsenzyms
Sau3AI verdaut wurde, die im Inneren von dem Ziel liegen, wurde
das Produkt in ein Fragment der erwarteten Größe verdaut (Bahnen 8 und 9).
-
Mit
den oben beschriebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass das erwünschte Reaktionsprodukt
in dem Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
erhalten werden kann, selbst wenn RNA als ein Ziel verwendet wird.
-
Gewerbliche Anwendbarkeit
-
Gemäß dem neuen
Kit von Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden
Erfindung und dem Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure durch
Verwenden besagter Oligonukleotide wird ein Verfahren zum Synthetisieren
von Nukleinsäure,
die komplementäre
Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen
Kette verknüpft
sind, bereitgestellt, ohne dass eine komplizierte Temperaturregelung
erforderlich ist. Eine komplementäre Kette, die mit dem Oligonukleotid
als einen Primer basierend auf der vorliegenden Erfindung synthetisiert
wurde, dient als der Ausgang zum Synthetisieren einer neuen komplementären Kette
mit dem 3'-Ende
von besagter synthetisierter Kette als eine Matrize. Dies wird begleitet
durch die Ausbildung von einer Schleife, welche das sich Anlagern
von einem neuen Primer bewirkt, und ein Produkt von der Reaktion des
Synthetisierens einer komplementären
Kette mit der zuvor synthetisierten Kette als eine Matrize wird
durch die Synthese der komplementären Kette ausgehend von der
Schleife wieder verdrängt
und wird für
Basenpaarung zugänglich
gemacht. Die somit erhaltene Nukleinsäure, die mit sich selbst als
Matrize synthetisiert wurde, wird kombiniert mit zum Beispiel einem
bekannten Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure, wie
beispielsweise SDA, um zu einer Verbesserung der Effizienz der Nukleinsäuresynthese
beizutragen.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
von der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren zum Synthetisieren
von Nukleinsäure
bereitgestellt, welches eine Verbesserung der Effizienz von bekannten Verfahren
zum Synthetisieren von Nukleinsäure
erreicht, welches keine komplizierte Temperaturregelung erfordert,
von welchem erwartet wird, dass es eine hohe Amplifikationseffizienz
aufweist, und welches eine hohe Spezifität erzielt. Das heißt, die
Oligonukleotide von dem Kit gemäß der vorliegenden
Erfindung werden auf einer Zielkette und deren komplementäre Kette
angewendet, wodurch Nukleinsäure,
die komplementäre
Ketten aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette
verknüpft
sind, erfolgreich synthetisiert werden kann. Diese Reaktion setzt
sich theoretisch solange fort, bis das Ausgangsmaterial, das für die Synthese
erforderlich ist, verbraucht ist, während dieser Reaktion wird
kontinuierlich neue Nukleinsäure
ausgebildet, deren Synthese von der Schleife gestartet wird. Die
Verlängerung
von dem Oligonukleotid, das sich an die Schleife angelagert hat,
führt eine
Strangverdrängung
aus, um 3'-OH für die Elongation
von langen einzelstrangigen Nukleinsäuren bereitzustellen (das heißt, Nukleinsäure, die
viele Paare von komplementären
Ketten aufweist, die darin verknüpft
sind). Auf der anderen Seite führt
die 3'-OH von der
langen einzelstrangigen Kette die Reaktion des Synthetisierens der
komplementären
Kette mit sich selbst als eine Matrize aus, wobei deren Verlängerung
erzielt wird, während
derer eine neue komplementäre
Kette, deren Synthese von der Schleife startet, verdrängt wird.
Solch ein Schritt der Amplifikationsreaktion läuft unter isothermen Bedingungen
ab, während
eine hohe Spezifität
erhalten bleibt.
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Die
Oligonukleotide in dem Kit der vorliegenden Erfindung können, wenn
zwei benachbarte Regionen so wie ausgelegt angeordnet sind, als
Primer für
die Reaktion zur Synthese von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
fungieren. Dies trägt
signifikant zur Erhaltung der Spezifität bei. Beim Vergleich mit,
zum Beispiel PCR, wo eine unspezifische Amplifikationsreaktion ausgelöst wird
durch unspezifisches Falsch-Anlagern, unabhängig von der beabsichtigten
die Lage betreffenden Anordnungsbeziehung der zwei Primer, kann es
einfach erklärt
werden, dass eine hohe Spezifität
der vorliegenden Erfindung zu erwarten ist. Dieses Merkmal kann
dazu verwendet werden, SNPs mit hoher Sensitivität und Genauigkeit zu detektieren.
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Die
charakteristischen Merkmale von der vorliegenden Erfindung liegen
darin, dass diese Reaktion einfach erreicht werden kann durch eine
sehr einfache Beschaffenheit der Reagenzien. Zum Beispiel haben die
Oligonukleotide von dem Kit gemäß der vorliegenden
Erfindung eine spezielle Struktur, aber dies ist eine Frage der
Auswahl der Nukleotidsequenz, und es ist ein einfaches Oligonukleotid
als Stoff. Ferner kann, in einer bevorzugten Ausführungsform,
die Reaktion mit nur einer DNA-Polymerase ablaufen, welche eine
Reaktion nach Art der Strangverdrängung zur Synthese komplementärer Ketten
katalysiert. Ferner, wenn die vorliegende Erfindung mit RNA als
eine Matrize durchgeführt
wird, wird eine DNA-Polymerase,
wie beispielsweise Bca DNA-Polymerase, die beides, Reverse-Transkriptase-Aktivität und DNA-Polymerase-Aktivität nach Art
der Strangverdrängung
aufweist, verwendet, so dass alle Enzymreaktionen durch ein einziges
Enzym durchgeführt
werden können.
Das Reaktionsprinzip zum Realisieren des hohen Grades an Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion
durch solch eine einfache Enzymreaktion ist nicht bekannt. Selbst
für die
Anwendung von der vorliegenden Erfindung für eine bekannte Nukleinsäure-Synthesereaktion,
wie beispielsweise SDA, ist kein zusätzliches Enzym für deren
Kombination erforderlich, und solch eine einfache Kombination mit
den Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden
Erfindung kann auf verschiedene Reaktionssysteme angewendet werden. Demgemäß kann gesagt
werden, dass das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung auch vorteilhaft in Bezug auf die Kosten ist.
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Wie
oben beschrieben, stellt das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung und stellen die Oligonukleotide dafür ein neues Prinzip dar, das
gleichzeitig eine Vielzahl von schwierigen Problemen löst, wie
beispielsweise die Funktionsfähigkeit
(Temperaturregelung ist nicht erforderlich), Verbesserung der Effizienz
der Synthese, Einsparung und hohe Spezifität.
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