FR3107282A1 - Trousses et procédés pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons complexes - Google Patents

Trousses et procédés pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons complexes Download PDF

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Viviane LUONG
Mégane SIMONNET
Laurent THIERY
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Abstract

TROUSSES ET PROC É D É S POUR L’EXTRACTION D’ACIDES NUCL É IQUES À PARTIR D’ É CHANTILLONS COMPLEXES La présente invention concerne une trousse et un procédé pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons complexes. Plus particulièrement, la trousse comprend : (i) un tampon de lyse comprenant une concentration de SDS comprise entre environ 1% et 25% ; (ii) un tampon comprenant une concentration d’un sel de potassium comprise entre environ 10 mM et 50 mM ; (iii) un tampon comprenant une concentration d’un sel de zinc comprise entre environ 0,5 M et 5,0 M ; (iv) un filtre ayant un diamètre de pores compris entre environ 1 µm et 10 µm ; et optionnellement, un élément choisi parmi une seringue destinée à être utilisée avec le filtre, un ou plusieurs tubes de réaction, un guide d’instruction, et leur combinaison.

Description

TROUSSES ET PROCÉDÉS POUR L’EXTRACTION D’ACIDES NUCLÉIQUES À PARTIR D’ÉCHANTILLONS COMPLEXES
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne le domaine de l’extraction d’acides nucléiques. Plus particulièrement, l’invention se rapporte à une trousse et un procédé permettant l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons complexes, de manière rapide, économique, sans nécessité de procéder à des étapes de purification fastidieuses et ne nécessitant pas un matériel sophistiqué et des locaux dédiés adaptés.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
La caractérisation des acides nucléiques à partir d’un échantillon issu d’un environnement particulier permet d’obtenir un grand nombre d’informations sur la nature de cet environnement. Par exemple, les progrès du séquençage haut débit ont récemment permis de rendre plus efficace le diagnostic de maladies génétiques ou infectieuses. En effet, la connaissance précise des informations génétiques permet d’apporter une approche thérapeutique ciblée. Ces progrès permettent également d’identifier les espèces peuplant un biotope donné avec une grande efficacité.
En règle générale, les acides nucléiques sont contenus dans des cellules, des virus, des parasites, et sont donc protégés des attaques externes par des systèmes de membranes ou de parois plus ou moins sophistiqués et robustes. Ainsi, les techniques actuelles d’analyse des acides nucléiques nécessitent obligatoirement une première étape d’extraction, c’est-à-dire la séparation des acides nucléiques des autres composants cellulaires. En pratique, il s’agit de lyser les membranes ou les parois pour libérer les acides nucléiques, lesquels peuvent être ensuite purifiés des autres composants cellulaires et/ou des autres composants de l’environnement d’origine.
Plusieurs méthodes d’extraction d’acides nucléiques ont été développées dans le passé, mettant en œuvre aussi bien des processus de lyse physique, tels que la pression ou les ultrasons, que des processus de lyse chimique. Une méthode de lyse chimique fréquemment utilisée est basée sur l’utilisation du dodécylsulfate de sodium (ou SDS), un détergent et tensioactif ionique fort, lequel est généralement associé à des protéases pour une lyse encore plus efficace. Cette méthode chimique basée sur l’utilisation de SDS permet d’éclater les membranes ou les parois et de libérer les acides nucléiques. Par exemple, des méthodes d’extraction basées sur une lyse par le SDS sont notamment employées dans des domaines variés, comme l’étude de la biomasse des fonds marins (Natarajanet al.; Front. Microbiol., 2016, 7:986), ou l’extraction d’ADN plasmidique bactérien (principe de la «minipréparation»; voir par exemple Green et Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 4èmeédition; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012). Cependant, la présence de SDS pose souvent problème lors des étapes ultérieures d’analyse des acides nucléiques. Le SDS est en particulier connu pour être un inhibiteur d’amplification par PCR («Polymerase Chain Reaction»). Ainsi, ont été développé des méthodes d’extraction spécifiquement compatibles avec des étapes ultérieures de PCR (voir par exemple Goldenbergeret al.; Genome Res., 1995, 4:368-370).
En pratique, les méthodes d’extraction basées sur le SDS incluent presque toujours des étapes de purification des acides nucléiques. La purification peut être réalisée sur des colonnes d’affinité ou d’exclusion, par l’utilisation d’un mélange phénol/chloroforme ou d’autres produits chimiques. Alternativement ou simultanément, des composés chimiques tels que l’acétamide, la bétaïne, l’albumine sérique bovine, le dextran, le DMSO, le Tween,etc, peuvent être incorporés au mélange réactionnel pendant la lyse si une étape ultérieure d’amplification par PCR est envisagée (voir par exemple Hedman et Rådström; PCR Detection of Microbial Pathogens: Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 943, Chapter 2; Abu Al-Soud et Rådström; Journal of Clinical Microbiology, 2000, Vol. 38, No. 12, p. 4463–4470).
Ces méthodes ont donc pour inconvénients d’être longues, fastidieuses, de mettre en œuvre des composés chimiques souvent toxiques pour le manipulateur et pour l’environnement, de nécessiter des matériels couteux, tels que des hottes aspirantes, des gants de protection, des centrifugeuses,etc, et d’être mises en œuvre dans des locaux adaptés, tels que des laboratoires.
Cependant, il existe de nombreuses situations dans lesquelles une extraction rapide, ne mettant pas en œuvre des étapes de purification longues et laborieuses et n’étant pas nécessairement effectuée dans le cadre d’un laboratoire, est avantageuse. A titre d’exemple particulièrement illustratif, il peut être cité le cas du vétérinaire souhaitant identifier rapidement un agent pathogène infectieux directement sur le lieu où se trouve l’animal malade. Cette approche dite «point-of-care testing» (POCT) fait l’objet d’une attention toute particulière auprès des professionnels concernés.
Par ailleurs, il apparait qu’en fonction de la nature de l’échantillon d’origine, les protocoles d’extraction doivent être adaptés. Par exemple, ont été développé sur le marché des kits d’extraction d’acides nucléiques spécifiques pour des échantillons de sang et pour des échantillons de fèces (voir par exemple le kit Qiagen® pour l’extraction d’acide nucléique à partir d’un échantillon de sang (QIAamp® DNA Mini and Blood Mini) ou d’un échantillon de fèces (QIAamp® Fast DNA Stool Mini)). A noter que ces kits permettent d’obtenir des acides nucléiques d’un haut degré de pureté, compatibles avec la plupart des techniques d’analyses disponibles, en environ 20 à 30 minutes.
Il existe donc un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une extraction d’acides nucléiques rapide, peu couteuse, peu nocive pour le manipulateur et pour l’environnement, et ne nécessitant pas la contrainte d’une mise en œuvre dans un laboratoire dédié.
Il existe également un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une extraction d’acides nucléiques «universelle», quelle que soit la nature de l’échantillon d’origine contenant les acides nucléiques.
RÉSUMÉ
Un premier aspect de l’invention se rapporte à une trousse d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe, ladite trousse comprend:
  • un tampon de lyse comprenant une concentration de SDS comprise entre environ 1% et 25%, de préférence comprise entre environ 5% et 20%;
  • un tampon comprenant une concentration d’un sel de potassium comprise entre environ 10 mM et 500 mM, de préférence comprise entre environ 60 mM et 400 mM;
  • un tampon comprenant une concentration d’un sel de zinc comprise entre environ 0,5 M et 5,0 M;
  • un filtre ayant un diamètre de pores compris entre environ 1 µm et 10 µm, de préférence compris entre environ 2 µm et 7 µm;
  • optionnellement, un élément choisi parmi une seringue destinée à être utilisée avec le filtre, un ou plusieurs tubes de réaction, un guide d’instruction, et leur combinaison.
Dans certains modes de réalisation, le sel de potassium est l’hydrogénocarbonate de potassium (CHKO3) et/ou le sel de zinc est le sulfate de zinc (ZnSO4).
L’invention se rapporte aussi à une utilisation d’une trousse selon la présente invention, dans un procédé d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe.
Dans un autre aspect, l’invention concerne un procédé d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe, ledit procédé comprend les étapes suivantes:
  • a) mettre en contact l’échantillon complexe avec un tampon de lyse comprenant une concentration de SDS comprise entre environ 1% et 25%, de sorte à ce que la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 0,01% et 10%;
  • b) optionnellement mettre en contact le mélange de l’étape a) avec un tampon comprenant une concentration d’un sel de zinc comprise entre environ 0,5 M et 5,0 M, de sorte à ce que la concentration finale en sel de zinc dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 10 mM et 70 mM;
  • c) mettre en contact le mélange de l’étape a) ou b) avec un tampon comprenant une concentration d’un sel de potassium comprise entre environ 0,1 M et 5,0 M, de sorte à ce que la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 10 mM et 500 mM;
  • d) filtrer le mélange réactionnel de l’étape c) de sorte à récolter des acides nucléiques solubles.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon biologique, environnemental, agroalimentaire, de préférence un échantillon biologique. Dans certains modes de réalisation, l’étape b) est mise en œuvre lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang. Dans certains modes de réalisation, la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 0,01% et 1%, de préférence entre environ 0,25% et 0,75%, lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang. Dans certains modes de réalisation, la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 10 mM et 500 mM, de préférence entre environ 25 mM et 150 mM, lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang. Dans certains modes de réalisation, la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 0,06% et 10%, de préférence entre environ 0,1% et 6,7%, lorsque l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon de fèces, un échantillon de salive et un échantillon de sécrétion nasopharyngé. Dans certains modes de réalisation, la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 60 mM et 300 mM, de préférence entre environ 100 mM et 270 mM, lorsque l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon de fèces, un échantillon de salive et un échantillon de sécrétion nasopharyngé.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante:
  • Le terme “Environ”, placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre.
  • Le terme“Extraction d’acides nucléiques” concerne l’action de séparer physiquement les acides nucléiques des autres constituants de l’entité biologique qui les contient. Les acides nucléiques étant contenus dans des entités biologiques et protégés de l’environnement par des parois, l’extraction d’acides nucléiques comprend généralement une étape de solubilisation des parois et la libération des acides nucléiques dans le milieu réactionnel; ces phénomènes sont également définis comme étant une lyse.
  • Le terme “Echantillon” concerne un matériel biologique obtenu, de préférence, préalablement obtenu par une technique de prélèvement appropriée sur un individu, dans un environnement, ou sur un produit agroalimentaire. Par extension, “Echantillon complexe” concerne un échantillon qui peut comprendre, outre les acides nucléiques d’intérêt, d’autres constituants, comme des polypeptides, des lipides, des polysaccharides, des sels, des métaux, des oligoéléments, des solvants, des acides, des bases.
  • Le terme “Tampon” concerne une solution qui permet de conserver son pH d’origine malgré l’ajout limité d’un acide ou d’une base ou malgré une dilution.
  • Le terme “Mélange réactionnel” concerne un environnement dans lequel se produit une réaction. Par exemple, des entités biologiques contenues dans un échantillon et comprenant des acides nucléiques d’intérêt peuvent être lysées au contact d’un tampon comprenant du SDS. Dans le cadre de l’invention, on entend par “Mélange réactionnel” le mélange de tous les ingrédients mis en œuvre par le procédé de l’invention, et comprend l’échantillon contenant les acides nucléiques d’intérêt, le tampon de lyse, le tampon comprenant le sel de potassium et optionnellement le tampon comprenant le sel de zinc.
  • Le terme “Amplification” concerne la multiplication ciblée du nombre de copies des acides nucléiques d’intérêt.
  • Le terme “Diagnostic” concerne à la fois le diagnostic médical et le diagnostic vétérinaire et se rapporte à l’identification de la nature de la pathologie chez un individu malade. Selon un mode de réalisation, les méthodes de diagnostic décrites ici sont des méthodes de diagnostic non-invasives,i.e.,in vitro. Dans ce mode de réalisation, un échantillon à analyser est préalablement prélevé sur le sujet avant la mise en œuvre des méthodes de l’invention.
  • Le terme “Individu” concerne un animal, vertébré ou invertébré, de préférence un mammifère. Le mammifère peut être un animal mammifère non-humain ou un humain.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
Les inventeurs ont observé qu’il était possible d’extraire des acides nucléiques contenus dans des échantillons complexes, et destinés à une analyse par amplification, de manière rapide et peu couteuse, sans que des étapes additionnelles de purification soient nécessaires. Par ailleurs, le procédé selon l’invention ne nécessite pas la mise en œuvre de composés destinés à piéger les inhibiteurs d’amplification susceptibles d’être contenus dans des échantillons complexes. Ce procédé d’extraction des acides nucléiques est ainsi compatible avec la recherche d’une infection par un microorganisme pathogène chez un individu malade, et le diagnostic qui s’ensuit.
La présente invention concerne une trousse d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe, ladite trousse comprend:
  • un tampon de lyse comprenant une concentration de SDS comprise entre environ 1% et 25%, de préférence comprise entre environ 5% et 20%;
  • un tampon comprenant une concentration d’un sel de potassium comprise entre environ 10 mM et 500 mM, de préférence comprise entre environ 60 mM et 400 mM;
  • un tampon comprenant une concentration d’un sel de zinc comprise entre environ 0,5 M et 5,0 M;
  • un filtre ayant un diamètre de pores compris entre environ 1 µm et 10 µm, de préférence compris entre environ 2 µm et 7 µm;
  • optionnellement, un élément choisi parmi une seringue destinée à être utilisée avec le filtre, un ou plusieurs tubes de réaction, un guide d’instruction, et leur combinaison.
Dans le cadre de l’invention, une concentration de SDS comprise entre 1% et 25% se comprend comme une concentration de SDS comprise entre 1 g/100 ml et 25 g/100 ml.
En pratique, les tampons de la trousse sont contenus dans des réceptacles dédiés, en particulier des flacons ou des tubes. Les réceptacles peuvent être dans une matière adaptée, telle que,e.g., le polypropylène, l’acrylique, le polychlorure de vinyle.
En pratique, les acides nucléiques concernés par l’invention sont les acides désoxyribonucléiques (ADNs), les acides ribonucléiques (ARNs), incluant les acides ribonucléiques messagers (ARNms), les acides ribonucléiques de transfert (ARNts), les acides ribonucléiques ribosomiques (ARNrs).
Dans un mode de réalisation, les acides nucléiques sont exclusivement des acides désoxyribonucléiques (ADNs). Dans un mode de réalisation, les acides nucléiques sont exclusivement des acides ribonucléiques (ARNs). Dans un mode de réalisation, les acides nucléiques sont un mélange d’acides désoxyribonucléiques (ADNs) et d’acides ribonucléiques (ADNs).
En pratique, l’échantillon peut être de nature très variée. De manière illustrative, l’échantillon complexe peut être d’origine biologique, environnementale, agroalimentaire.
Dans un mode de réalisation, l’échantillon est un échantillon biologique, en particulier un fluide biologique ou une biopsie. Dans certains modes de réalisation, l’échantillon est un échantillon d’un fluide biologique, par exemple sélectionné dans la liste non-exhaustive comprenant, la bile, les fèces, l’humeur aqueuse, le lait, le liquide amniotique, la lymphe, le liquide cérébro-spinal, le plasma, le produit d’un lavage respiratoire, le produit d’une poche gutturale, le pus, une sécrétion nasopharyngée, une sécrétion lacrymale, une sécrétion vaginale, la salive, le sang, le sérum, le sperme, et l’urine. Dans certains modes de réalisation, l’échantillon est une biopsie, par exemple sélectionnée dans la liste non-exhaustive comprenant une biopsie de foie, une biopsie intestinale, une biopsie de muscle, une biopsie osseuse, une biopsie de pancréas, une biopsie de peau, une biopsie de tissu pulmonaire, une biopsie de tissu vasculaire, une biopsie de la vessie.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon est un échantillon environnemental tel qu’une eau de mer, une eau douce, des eaux résiduaires, une glace, une boue, un sol.
Tel que défini dans le cadre de l’invention, le terme «eaux résiduaires» se rapporte aux eaux qui ont fait l’objet d’une utilisation domestique, agricole ou industrielle, et circulent dans un réseau d’assainissement.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon est un échantillon agroalimentaire destiné à l’alimentation animale ou humaine et contenant un ingrédient tel qu’une céréale,e.g., le blé, l’orge, l’avoine; une légumineuse,e.g.les lentilles; une viande,e.g.la viande de bœuf, la viande de veau, la viande de mouton, la viande d’agneau, la viande de porc, le lapin, la volaille; un poisson,e.g.le cabillaud, la truite, le saumon; les fruits de mer,e.g.les huitres, les moules, les crevettes, le homard; un végétal,e.g.l’abricot, l’aubergine, la banane, la carotte, la cerise, le choux, la courgette, la fraise, le haricot vert, le kiwi, la laitue, la poire, la pomme, la pomme de terre. Dans certains modes de réalisation, l’échantillon agroalimentaire peut être issu d’un produit alimentaire manufacturé, tel que,e.g., un plat cuisiné, une boite de conserve, un produit surgelé.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon est un échantillon susceptible de contenir des cellules animales et/ou végétales.
Dans un mode de réalisation, la cellule animale est sélectionnée dans la liste non-exhaustive comprenant un adipocyte; un fibroblaste; une cellule endothéliale; une cellule épithéliale; une cellule osseuse,e.g.un ostéoblaste, un ostéocyte, un ostéoclaste; une cellule musculaire,e.g.un myoblaste, un myocyte; une cellule sanguine,e.g.une hématie, un lymphocyte, un polynucléaire; un hépatocyte; un kératinocyte; une cellule nerveuse; et leur combinaison.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon est un échantillon susceptible de contenir un microorganisme, tels qu’une algue, une archée-bactérie, une bactérie, un champignon, un protozoaire, un virus. Dans un mode de réalisation, le microorganisme est un pathogène pour les plantes, pour les animaux, et en particulier pour l’homme.
Dans un mode de réalisation, une bactérie pathogène pour un animal est sélectionnée dans la liste non-exhaustive comprenant une bactérie de l’espèceAfipia felis; une bactérie du genreAnaplasma, de préférence une bactérie de l’espèceAnaplasma phagocytophilum,Anaplasma centrale,Anaplasma mesaeterum,Anaplasma platys,Anaplasma bovis, ouAnaplasma ovis; une bactérie du genreBacillus, de préférence une bactérie de l’espèceBacillus anthracisouBacillus cereus; une bactérie du genreBartonella, de préférence une bactérie de l’espèceBartonella henselae, ouBartonella clarridgeiae; une bactérie du genreBordetella, de préférence une bactérie de l’espèceBordetella pertussis,Bordetella parapertussisouBordetella bronchiseptica; une bactérie du genreBorrelia, de préférence une bactérie de l’espèceBorrelia burgdorferi,Borrelia recurrentis,Borrelia hispanica,Borrelia persica,Borrelia duttoniiouBorrelia crocidurae; une bactérie du genreBrucella, de préférence une bactérie de l’espèceBrucella melitensis,Brucella abortusouBrucella suis; une bactérie du genreBurkholderia, de préférence une bactérie de l’espèceBurkholderia malleiouBurkholderia pseudomallei; une bactérie du genreCampylobacter, de préférence une bactérie de l’espèceCampylobacter fetusouCampylobacter jejuni; une bactérie du genreChlamydia, de préférence une bactérie de l’espèceChlamydia trachomatis; une bactérie du genreChlamydophila, de préférence une bactérie de l’espèceChlamydophila pneumoniaeouChlamydophila psittaci; une bactérie du genreClostridium, de préférence une bactérie de l’espèceClostridium botulinum,Clostridium difficile,Clostridium perfringensouClostridium tetani; une bactérie du genreCorynebacterium, de préférence une bactérie de l’espèceCorynebacterium diphteriae; une bactérie du genreCoxiella, de préférence une bactérie de l’espèceCoxiella burnetii; une bactérie du genreEhrlichia, de préférence une bactérie de l’espèceEhrlichia chaffeensis,Ehrlichia equiouEhrlichia phagocytophila; une bactérie du genreErysipelothrix, de préférence une bactérie de l’espèceErysipelothrix rhusiopathiae; une bactérie du genreEscherichia, de préférence une bactérie de l’espèceEscherichia coli; une bactérie du genreFrancisella, de préférence une bactérie de l’espèceFrancisella tularensis; une bactérie du genreHaemophilus, de préférence une bactérie de l’espèceHaemophilus ducreyiouHaemophilus influenzae; une bactérie du genreHelicobacter, de préférence une bactérie de l’espèceHelicobacter pylori; une bactérie du genreLegionella, de préférence une bactérie de l’espèceLegionella pneumophila; une bactérie du genreLeptospira, de préférence une bactérie de l’espèceLeptospira interrogans; une bactérie du genreListeria, de préférence une bactérie de l’espèceListeria monocytogenes; une bactérie du genreMycobacterium, de préférence une bactérie de l’espèceMycobacterium leprae,Mycobacterium tuberculosis,Mycobacterium avium,Mycobacterium bovisouMycobacterium intracellulare; une bactérie du genreMycoplasma, de préférence une bactérie de l’espèceMycoplasma pneumoniaeouMycoplasma hominis; une bactérie du genreNeisseria, de préférence une bactérie de l’espèceNeisseria gonorrhoeaeouNeisseria meningitidis; une bactérie du genrePasteurella, de préférence une bactérie de l’espècePasteurella multocida; une bactérie du genrePseudomonas, de préférence une bactérie de l’espècePseudomonas aeruginosa; une bactérie du genreRickettsia; une bactérie du genreSalmonella, de préférence une bactérie de l’espèceSalmonella enterica; une bactérie du genreShigella, de préférence une bactérie de l’espèceShigella dysenteriae,Shigella flexneri,Shigella boydiiouShigella sonnei; une bactérie du genreSpirillum, de préférence une bactérie de l’espèceSpirillum minus; une bactérie du genreStaphylococcus; une bactérie du genreStreptococcus, de préférence une bactérie de l’espèceStreptococcus pneumoniae; une bactérie du genreTreponema, de préférence une bactérie de l’espèceTreponema pallidum; une bactérie du genreTropheryma, de préférence une bactérie de l’espèceTropheryma whipplei; une bactérie du genreUreaplasma, de préférence une bactérie de l’espèceUreaplasma urealyticum; une bactérie du genreVibrio, de préférence une bactérie de l’espèceVibrio cholerae; une bactérie du genreYersinia, de préférence une bactérie de l’espèceYersinia pestis,Yersinia enterocolitica, ouYersinia pseudotuberculosis.
Dans un mode de réalisation, un champignon pathogène pour un animal est sélectionné dans la liste non-exhaustive comprenant un champignon du genreAspergillus, un champignon du genreCandida.
Dans un mode de réalisation, un protozoaire pathogène pour un animal est sélectionnée dans la liste non-exhaustive comprenant un protozoaire du genreBabesia, un protozoaire du genrePlasmodium, un protozoaire du genreTheileria, un protozoaire du genreToxoplasma.
En pratique, le virus peut être un virus à ADN ou un virus à ARN.
Dans un mode de réalisation, le virus à ADN est sélectionné dans la liste non-exhaustive comprenant un virus de la famille desAdenoviridae, de préférence un virus du genreAdenovirus; de la famille desHepdnaviridae, de préférence un virus du genreHerpadnavirus; de la famille desHerpesviridae, de préférence un virus du genreHerpesvirus; de la famille desPapovaviridae, de préférence un virus du genrePolyomavirusouPapillomavirus; de la famille desParvoviridae, de préférence un virus du genreParvovirus; de la famille desPoxviridae, de préférence un virus du genrePoxvirus.
Dans un mode de réalisation, le virus à ARN est sélectionné dans la liste non-exhaustive comprenant un virus de la famille desArenaviridae, de préférence un virus du genreArenavirus; de la famille desBunyaviridae, de préférence un virus du genreBunyavirus,Phlebovirus,NairovirusouHantavirus; de la famille desCaliciviridae, de préférence un virus du genreCalicivirus; de la famille desCoronaviridae, de préférence un virus du genreCoronavirus; de la famille desFiloviridae, de préférence un virus du genreFilovirus; de la famille desFlaviviridae, de préférence un virus du genreFlavivirus,RibivirusouHepcivirus; de la famille desOrthomyxoviridae, de préférence un virus du genreInfluenzavirus ; de la famille desParamyxoviridae, de préférence un virus du genrePneumovirus,ParamyxovirusouMorbillivirus; de la famille desPicornaviridae, de préférence un virus du genreEnterovirus,HepatovirusouRhinovirus; de la famille desRhabdoviridae, de préférence un virus du genreLyssavirusouVesiculovirus; de la famille desReoviridae, de préférence un virus du genreReovirusouRotavirus; de la famille desRetroviridae, de préférence un virus du genreOncornavirus ou Lentivirus; de la famille desTogaviridae, de préférence un virus du genreAlphavirus.
Dans un mode de réalisation, le virus est sélectionné dans la liste non-exhaustive comprenant le virus de la peste équine, le virus de la peste porcine africaine, le virus Andes, le virus de l'influenza aviaire, le virus de la fièvre catarrhale ovine, le virus Chapare, le virus Chikungunya, le virus Choclo, le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo, le virus de la dengue, le virus Dobrava-Belgrade, le virus de l'encéphalite équine de l'Est, le virus Ebola, le virus de la fièvre aphteuse, le virus de la variole caprine, le virus Guanarito, virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus d'Hantaan, le virus Hendra, l’herpesvirus porcin (ou virus de la maladie d'Aujeszky), le virus de la peste porcine, le virus de l'encéphalite japonaise, le virus de Junin, le virus de la maladie de la forêt de Kyasanur, le virus Laguna negra, le virus de la fièvre de Lassa, le virus de l'encéphalomyélite ovine, le virus Lujo, le virus de la dermatose nodulaire contagieuse, le virus de la chorioméningite lymphocytaire, le virus Machupo, le virus de Marbourg, le virus de la variole du singe, le virus de l'encéphalite de Murray Valley, le virus de la maladie de Newcastle, le virus Nipah, le virus de la fièvre hémorragique d'Omsk, le virus Oropouche, le virus de la peste des petits ruminants, l’entérovirus porcin type 9 (ou virus de la maladie vésiculeuse du porc), le virus de l'encéphalite Powassan, le virus de la rage, le virus de la vallée du Rift, le virus de la peste bovine, le virus Rocio, le virus Sabia, le virus de Séoul, le virus de la variole ovine, le virus Sin Nombre, le virus de l'encéphalite de Saint-Louis, le virus de la maladie de Teschen, le virus de l'encéphalite à tiques, le virus de la variole, le virus de l'encéphalite équine du Venezuela, le virus de la stomatite vésiculeuse, le virus de l'encéphalite équine de l'Ouest et le virus de la fièvre jaune.
En pratique, l’échantillon peut être d’origine très variée.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon est issu d’un animal, de préférence un mammifère, de préférence un homme. Dans un mode de de réalisation le mammifère est sélectionné dans la liste non-exhaustive comprenant un chat, un cheval, une chèvre, un chien, un cochon d’inde, un lapin, un mouton, un porc, un rat, une souris, une vache, une volaille. Dans un mode de de réalisation le mammifère est un animal de compagnie sélectionné dans la liste non-exhaustive comprenant un chat, un chien, un cochon d’inde, un rat, une souris. Dans un mode de de réalisation le mammifère est un animal d’intérêt économique, par exemple sélectionné dans la liste non-exhaustive comprenant un cheval, un lapin, un mouton, un porc, une vache, une volaille.
Dans un mode de réalisation les échantillons biologiques, environnementaux ou agroalimentaires sont prélevés dans le respect des bonnes pratiques et éventuellement des usages réglementaires en vigueur.
Par exemple, les conditions de stérilités peuvent être souhaitées. Les échantillons peuvent être prélevés au moyen d’un instrument adapté, incluant mais non limité à, une seringue, un cure-dent, un écouvillon, une spatule, un réceptacle, une pince, un scalpel, un papier adhésif.
Dans un mode de réalisation, les échantillons de sang sont stockés dans des tubes adaptés, et contenant par exemple de l’héparine ou de l’EDTA, de sorte à éviter la coagulation des cellules sanguines.
Dans un mode de réalisation, l’échantillon est conservé avant la mise en œuvre des méthodes selon la présente invention à une température comprise entre -196°C et 50°C, de préférence entre -196°C et 25°C, entre -80°C et 25°C, entre -20°C et 25°C, entre 4°C et 25°C. Dans un mode de réalisation, l’échantillon est conservé à température ambiante avant la mise en œuvre des méthodes selon la présente invention.
Dans un mode de réalisation, l’échantillon est conservé avant la mise en œuvre des méthodes selon la présente invention pendant une durée n’excédant pas 7 jours, de préférence pendant une durée n’excédant pas 6 jours, 5, jours, 4 jours, 3 jours, 2 jours, 24 heures, 12 heures, 6 heures, 2 heures, 1 heure, 30 minutes, 15 minutes, 10 minutes, 2 minutes.
En pratique, le tampon de lyse comprend une concentration de SDS comprise entre environ 1% et 25%. Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 1% et 25%» inclut environ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% et 25%.
Dans le cadre de l’invention, le tampon de lyse est plus particulièrement destiné à favoriser la lyse des entité biologiques,e.g., des cellules, des virus, contenant les acides nucléiques d’intérêt.
En pratique, la concentration du tampon comprenant un sel de potassium est comprise entre environ 10 mM et 500 mM. Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 10 mM et 500 mM» inclut environ 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 nM, 120 mM, 140 mM, 160 mM, 180 mM, 200 mM, 220 mM, 240 mM, 260 mM, 280 mM, 300 mM, 320 mM, 340 mM, 360 mM, 380 mM, 400 mM, 420 mM, 440 mM, 460 mM, 480 mM et 500 mM.
Le tampon comprenant le sel de potassium est destiné à précipiter le SDS qui est incompatible avec des étapes d’analyse des acides nucléiques mises en œuvre dans de nombreuses méthodes, comme par exemple l’amplification, en particulier l’amplification par la PCR.
En pratique, le sel de potassium peut être avantageusement choisi parmi l’acétate de potassium (CH3CO2K), le chlorure de potassium (KCl), l’hydrogénocarbonate de potassium (CHKO3). Ces sels peuvent être préparés extratemporanément ou alternativement être acquis commercialement.
Dans un mode de réalisation, le sel de potassium est l’hydrogénocarbonate de potassium (CHKO3).
En pratique, la concentration du tampon comprenant un sel de zinc est comprise entre environ 0,5 M et 5,0 M. Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 0,5 M et 5,0 M» inclut environ 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M, 1,0 M, 1,2 M, 1,4 M, 1,6 M, 1,8 M, 2,0 M, 2,2 M, 2,4 M, 2,6 M, 2,8 M, 3,0 M, 3,2 M, 3,4 M, 3,6 M, 3,8 M, 4,0 M, 4,2 M, 4,4 M, 4,6 M 4,8 M et 5,0 M.
Dans le cadre de l’invention, le tampon comprenant le sel de zinc est particulièrement destiné à précipiter l’hémoglobine contenue dans des échantillons de sang ou certains échantillons contenant du sang, comme par exemple des biopsies. En effet, l’hémoglobine est connue pour être incompatible avec certaines étapes d’analyse des acides nucléiques mises en œuvre dans de nombreuses méthodes, comme par exemple l’amplification, en particulier l’amplification par la PCR.
En pratique, le sel de potassium peut être avantageusement choisi parmi le carbonate de zinc (ZnCO3), le chlorure de zinc (ZnCl), le sulfate de zinc (ZnSO4). Ces sels peuvent être préparés extratemporanément ou alternativement être acquis commercialement.
Dans un mode de réalisation, le sel de zinc est le sulfate de zinc (ZnSO4).
En pratique, le filtre ayant un diamètre de pores compris entre environ 1 µm et 10 µm. Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 1 µm et 10 µm» inclut environ 1 µm, 2 µm, 3 µm, 4 µm, 5 µm, 6 µm, 7 µm, 8 µm, 9 µm et 10 µm.
Dans un mode de réalisation, le filtre possède une membrane ayant des pores d’un diamètre compris entre environ 2 µm et 10 µm, en particulier un diamètre d’environ 5 µm.
Le filtre est plus particulièrement destiné à retenir le précipitât qui contient le SDS, le sel de potassium, et éventuellement les débris cellulaires non solubles. Lorsque l’échantillon est un échantillon de sang ou un échantillon contenant du sang, le filtre est également destiné à retenir le précipitât qui contient l’hémoglobine et le zinc. Au contraire, le filtre est destiné à laisser passer les acides nucléiques contenus dans l’échantillon.
Dans certains modes de réalisation, la membrane du filtre est en acétate de cellulose, nitrate de cellulose, nylon, polyamide, silice. Des filtres adaptés à la mise en œuvre de l’invention peuvent être acquis commercialement, par exemple auprès de Sartorius®, Hahnemühle®, Sebio®.
Dans un mode de réalisation, au moins un des tampons de la trousse, c’est-à-dire le tampon de lyse, le tampon contenant un sel de potassium, le tampon contenant un sel de zinc, comprend un inhibiteur de RNase. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux lorsque les acides nucléiques d’intérêt contenus dans l’échantillon sont des acides ribonucléiques (ARNs).
L’invention concerne également l’utilisation d’une trousse selon l’invention dans un procédé d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe.
Les procédés selon l’invention sont mis en œuvrein vitroouex vivo.
L’invention concerne un procédé d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe, ledit procédé mettant en œuvre la trousse selon l’invention.
L’invention concerne également un procédé d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe, ledit procédé comprend les étapes suivantes:
  • a) mettre en contact l’échantillon complexe avec un tampon de lyse comprenant une concentration de SDS comprise entre environ 1% et 25%, de sorte à ce que la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 0,01% et 10,0%;
  • b) optionnellement mettre en contact le mélange de l’étape a) avec un tampon comprenant une concentration d’un sel de zinc comprise entre environ 0,5 M et 5,0 M, de sorte à ce que la concentration finale en sel de zinc dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 10 mM et 70 mM;
  • c) mettre en contact le mélange de l’étape a) ou b) avec un tampon comprenant une concentration d’un sel de potassium comprise entre environ 0,1 M et 5,0 M, de sorte à ce que la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 10 mM et 500 mM;
  • d) filtrer le mélange réactionnel de l’étape c) de sorte à récolter des acides nucléiques solubles.
Dans le cadre de l’invention, l’échantillon complexe à l’étape a) comprend au moins 25 copies d’un acide nucléique, de préférence au moins 10 copies d’un acide nucléique, de préférence au moins 1 copie d’un acide nucléique à extraire.
Dans un mode de réalisation, le procédé est mis en œuvre au moyen d’une trousse selon l’invention.
Dans le cadre de l’invention, on entend par «mélange réactionnel» le mélange de tous les ingrédients à l’issue de l’étape c). Ainsi, le «mélange réactionnel» au sens de l’invention comprend l’échantillon contenant les acides nucléiques d’intérêt, le tampon de lyse, le tampon comprenant le sel de potassium et optionnellement le tampon comprenant le sel de zinc.
En pratique, la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 0,01% et 10,0%. Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 0,1% et 10,0%» inclut 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,2%, 1,4%, 1,6%, 1,8%, 2,0%, 2,2%, 2,4%, 2,6%, 2,8%, 3,0%, 3,2%, 3,4%, 3,6%, 3,8%, 4,0%, 4,2%, 4,4%, 4,6%, 4,8%, 5,0%, 5,2%, 5,4%, 5,6%, 5,8%, 6,0%, 6,2%, 6,4%, 6,6%, 6,8%, 7,0%, 7,2%, 7,4%, 7,6%, 7,8%, 8,0%, 8,2%, 8,4%, 8,8%, 9,0%, 9,2%, 9,4%, 9,6%, 9,8% et 10,0%.
En pratique, la concentration finale en sel de zinc dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 10 mM et 70 mM. Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 10 mM et 70 mM» inclut environ 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM et 70 mM.
En pratique, la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 10 mM et 500 mM. Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 10 mM et 500 mM» inclut environ 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 140 mM, 160 mM, 180 mM, 200 mM, 220 mM, 240 mM, 260 mM, 280 mM, 300 mM, 320 mM, 340 mM, 360 mM, 380 mM, 400 mM, 420 mM, 440 mM, 460 mM, 480 mM et 500 mM.
Dans un mode de réalisation, l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon biologique, environnemental, agroalimentaire, de préférence un échantillon biologique.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon est un échantillon d’un fluide biologique. Dans certains modes de réalisation, le fluide biologique est sélectionné dans le groupe comprenant, la bile, les fèces, l’humeur aqueuse, le lait, le liquide amniotique, la lymphe, le liquide cérébro-spinal, le plasma, le produit d’un lavage respiratoire, le produit d’une poche gutturale, le pus, une sécrétion nasopharyngée, une sécrétion lacrymale, une sécrétion vaginale, la salive, le sang, le sérum, le sperme, et l’urine. Dans un mode de réalisation, le fluide biologique est sélectionné dans le groupe comprenant les fèces, la salive, une sécrétion nasopharyngée, le sang.
Dans certains modes de réalisation, le fluide biologique est le sang.
Dans un mode de réalisation, l’étape b) est mise en œuvre lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang.
Dans un mode de réalisation, la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 0,01% et 1%, de préférence entre environ 0,25% et 0,75%, lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang.
Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 0,01% et 1%» inclut environ 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,035%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,055%, 0,06%, 0,065%, 0,07%, 0,075%, 0,08%, 0,085%, 0,09%, 0,095%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,55%, 0,6%, 0,65%, 0,7%, 0,75%, 0,8%, 0,85%, 0,9%, 0,95% et 1%.
Dans un mode de réalisation, la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 10 mM et 500 mM, de préférence entre environ 25 mM et 150 mM, lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang.
Dans certains modes de réalisation, le fluide biologique est sélectionné dans le groupe comprenant les fèces, la salive et une sécrétion nasopharyngée.
Dans un mode de réalisation, la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 0,06% et 10%, de préférence entre environ 0,1% et 6,7%, lorsque l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon de fèces, un échantillon de salive et un échantillon de sécrétion nasopharyngé.
Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 0,06% et 10%» inclut environ 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,55%, 0,6%, 0,65%, 0,7%, 0,75%, 0,8%, 0,85%, 0,9%, 0,95%, 1%, 1,2%, 1,4%, 1,6%, 1,8%, 2%, 2,2%, 2,4%, 2,6%, 2,8%, 3%, 3,2%, 3,4%, 3,6%, 3,8%, 4%, 4,2%, 4,4%, 4,6%, 4,8%, 5%, 5,2%, 5,4%, 5,6%, 5,8%, 6%, 6,2%, 6,4%, 6,6%, 6,8%, 7%, 7,2%, 7,4%, 7,6%, 7,8%, 8%, 8,2%, 8,4%, 8,6%, 8,8%, 9%, 9,2%, 9,4%, 9,6%, 9,8% et 10%.
Dans un mode de réalisation, la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 60 mM et 300 mM, de préférence entre environ 100 mM et 270 mM, lorsque l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon de fèces, un échantillon de salive et un échantillon de sécrétion nasopharyngé.
Dans le cadre de l’invention, le terme «entre environ 60 mM et 300 mM» inclut environ 60 mM, 80 mM, 100 mM, 120 mM, 140 mM, 160 mM, 180 mM, 200 mM, 220 mM, 240 mM, 260 mM, 280 mM et 300 mM.
Dans un mode de réalisation, le mélange à l’issu de l’étape a), optionnellement de l’étape b) et de l’étape c) est homogénéisé, de préférence par agitation délicate, de manière plus préférée par inversion du tube.
En pratique, la mise en œuvre du procédé selon l’invention permet d’obtenir une solution d’acides nucléiques en moins d’environ 5 min, de préférence en moins d’environ 3 min, de préférence en moins d’environ 2 min.
En pratique, le procédé peut être réalisé à la température ambiante. Dans le cadre de l’invention, l’expression «température ambiante» inclue une température comprise entre environ 5°C et 40°C, soit des températures d’environ 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 10°C, 12°C, 14°C, 16°C, 18°C, 20°C, 22°C, 24°C, 26°C, 28°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C, 38°C et 40°C.
La trousse et le procédé selon l’invention peuvent être mis en œuvre dans des circonstances variées:
  • Identifier la présence d’un microorganisme potentiellement pathogène dans un échantillon biologique, environnemental ou agroalimentaire;
  • Réaliser une analyse métagénomique, i.e. analyser la composition en organisme vivant dans un échantillon;
  • Identifier un ou plusieurs biomarqueur(s) associé(s) à une pathologie dans un échantillon biologique.
En pratique, le procédé selon l’invention sera privilégié lorsque l’accès à des équipements de laboratoires est difficile, ou que le caractère urgent de l’analyse des acides nucléiques d’intérêt nécessite la rapidité d’action.
Les acides nucléiques extraits par une trousse ou une méthode selon l’invention peuvent être ultérieurement analysés pour identifier la présence d’un microorganisme potentiellement pathogène et ainsi diagnostiquer une pathologie infectieuse.
Dans certains modes de réalisation l’extraction d’acides nucléiques selon l’invention peut être mise en œuvre pour le diagnostic d’une pathologie canine sélectionnée dans le groupe comprenant une anaplasmose (bactérie du genreAnaplasma), une coronavirose canine, un eczéma d’origine parasitaire, une ehrlichiose canine (bactérie de l’espèceEhrlichia canis), une gale (acariens:Otodecte cynotis,Sarcoptes scabiei,Dermodex canis), une gastro-entérite, une giardiose (parasite du genreGiardia), une hépatite (adénovirus CAV1), une hémobartonellose canine, une leishmaniose (Leshmania Infantum), une leptospirose (bactérie du genreLeptospira), une maladie de Carré (virus du genreMorbillivirus), une maladie de Lyme ou borréliose (bactérie de l’espèceBorrelia Burgdorferi), une otite, une parvovirose, une piroplasmose ou babésiose (parasiteBabesia canis), la rage (virus rabique Lyssavirus), une spirocercose (parasiteSpirocerca Lupi), la teigne (champignonMicrosporum canis,Trichophyton mentagrophytes,Microsporum gypseum), un ténia (verTænia,Dipylidium,Echinococcus), un tétanos (bactérieClostridium t e tani), la toux du chenil (association du virus Parainfluenza canin ou d’un adénovirus avec la bactérieBordetella BronchisepticaouPseudomona a eruginosa), et une tuberculose (bactérieMycobacterium bovisouMycobacterium tuberculosis).
Dans certains modes de réalisation l’extraction d’acides nucléiques selon l’invention peut être mise en œuvre pour le diagnostic d’une pathologie féline sélectionnée dans le groupe comprenant une anaplasmose, une bordetellose, une borréliose, une calicivirose, une chlamydophilose féline, une conjonctivite, une chlamydiose, une coronavirose, une échinococcose, une encéphalite, une giardiose, une gingivite, une Herpès virose, une hémobartonellose, une gale auriculaire ou otacariose ou otite auriculaire, une leucose féline (FeLV), une piroplasmose, la rage féline, une rhinotrachéite virale féline (RVF), une rickettsiose, le sida du chat (FIV), un syndrome urologique félin (SUF), une teigne, une toxoplasmose, une tritrichomonose féline, une tuberculose, et un typhus.
Dans certains modes de réalisation l’extraction d’acides nucléiques selon l’invention peut être mise en œuvre pour le diagnostic d’une pathologie équine sélectionnée dans le groupe comprenant une anaplasmose, une babésiose, une ehrlichiose, une grippe équine, une gourme, une leptospirose, la maladie de Lyme, une piroplasmose, une rhinopneumonie, une theilériose.
Les acides nucléiques extraits au moyen de la trousse ou du procédé selon l’invention peuvent être analysés par toute technique adaptée décrite dans l’état de l’art, ou une technique dérivée. A titre illustratif, une technique adaptée pour analyse un acide nucléique peut mettre en œuvre une réaction d’amplification, telle qu’une réaction d’amplification thermique. Des exemples de réactions d’amplification thermique incluent, mais ne sont pas limités à: la réaction de polymérisation en chaîne (ou ‘Polymerase Chain Reaction’, PCR) et ses variantes,e.g., Hot-start PCR, Touchdown PCR, Nested PCR, Fast PCR, Direct PCR, Multiplex PCR, Long PCR, GC-rich PCR, Inverse PCR, Quantitative PCR, Ligation-Mediated PCR, Multiplex ligation-dependent probe amplification PCR, Methylation-specific PCR, Anchored PCR, Asymmetric PCR, Thermal Asymmetric Interlaced PCR, Assembly PCR, Allel-Specific PCR, Arbitrarily Primed PCR.
En pratique, la réaction d’amplification peut être une réaction d’amplification isothermique. Des exemples de réactions d’amplification isothermique incluent, mais ne sont pas limités à: l’amplification isotherme en boucle (ou ‘Loop Mediated Isothermal Amplification’, LAMP), l’amplification par recombinase polymérase (ou ‘Recombinase Polymerase Amplification’, RPA), l’amplification d'acide nucléique basée sur la séquence (ou ‘Nucleic Acid Sequence-Based Amplification’, NASBA), l’amplification hélicase-dépendante (ou ‘Helicase-Dependent Amplification’, HDA), l’amplification circulaire (ou ‘Rolling Circle Amplification’, RCA), l’amplification par déplacement de brin (ou ‘Strand Displacement Amplification’, SDA) et l’amplification par déplacement multiple (ou ‘Multiple Displacement Amplification’, MDA).
En pratique, la réaction d’amplification est une réaction d’amplification isothermique de type amplification isotherme en boucle (‘Loop Mediated Isothermal Amplification’, LAMP), notamment telle que décrite par Notomiet al.(Nucleic Acids Res., 2000, 28(12):e63, par le brevet EP1020534, ou par Nagamineet al.(Mol Cell Probes., 2002, 16(3):223-9).
La réaction d’amplification LAMP utilise une polymérase à déplacement de brin, typiquement une polymérase Bst (extraite de la bactérieBacillus stearothermophilus), Aac, phi-29 Vent, ou un variant de ces polymérases. La réaction d’amplification LAMP peut également être mise en œuvre directement pour l’amplification d’ARN en ADN, en ajoutant une rétrotranscriptase au mélange réactionnel. Un exemple de rétrotranscriptase inclut, sans limitation, l’AMV reverse transcriptase. Dans un mode de réalisation, la polymérase utilisée possède une activité ADN polymérase à la fois ADN- et ARN-dépendante, et la réaction d’amplification ne requiert pas l’ajout d’une rétrotranscriptase.
Des kits permettant la mise en œuvre de la réaction d’amplification LAMP sont commercialement disponibles et accessibles à l’homme du métier.
A titre illustratif, la réaction d’amplification LAMP est mise en œuvre à une température constante de 50°C, 55°C, 60°C, 60,5°C, 61°C, 61,5°C, 62°C, 62,5°C, 63°C, 63,5°C, 64°C, 64,5°C, 65°C, 65,5°C, 66°C, 66,5°C, 67°C, 67,5°C, 68°C, 68,5°C, 69°C, 69,5°C, 69,5°C, 70°C, 75°C ou plus.
A titre illustratif, la réaction d’amplification LAMP est mise en œuvre pour une durée d’au moins 2 minutes, au moins 5 minutes, au moins 10 minutes, au moins 15 minutes, au moins 20 minutes, au moins 25 minutes, au moins 30 minutes, au moins 35 minutes, au moins 40 minutes, au moins 45 minutes ou plus. Dans un mode de réalisation, la réaction d’amplification LAMP est mise en œuvre pour une durée comprise entre 10 minutes et 60 minutes, de préférence entre 15 minutes et 45 minutes.
A titre illustratif, la réaction d’amplification LAMP est mise en œuvre à l’aide d’un système d’amplification isothermique. Plusieurs instruments de ce type sont disponibles sur le marché, et accessibles à l’homme du métier.
A titre illustratif, la réaction d’amplification des acides nucléiques extraits selon les méthodes de la présente invention comprennent une étape de détection de l’amplicon,i.e., une étape de détection du produit de l’amplification de la séquence nucléotidique cible.
Les techniques de détection d’un amplicon sont bien connues de l’homme du métier, et incluent, sans y être limitées: l’utilisation d’agents intercalant de l’ADN (e.g., bromure d’éthidium, iodure de propidium, SYBR green, SYBR gold, crystal violet, GelRed, DAPI), la mesure de la colorimétrie et/ou de la fluorescence, l’utilisation de sondes oligonucléotides marquées par la fluorescence, la présence d’un antigène ou la radioactivité, l’utilisation de dNTP marqués par la fluorescence ou la radioactivité, les tests enzymatiques, l’analyse de la variation de l’absorbance, la turbidimétrie et les tests à flux latéral.
En pratique, l’étape de détection de l’amplicon met en œuvre l’utilisation d’agents intercalant de l’ADN. Selon ce mode de réalisation, la détection de l’amplicon peut être réalisée à l’œil nu, en observant la colorimétrie de l’échantillon, ou en mesurant la fluorescence émise par l’agent intercalant. À titre d’exemple, l’ajout d’un agent intercalant de type SYBR green colore l’échantillon en orange en absence d’intercalation (i.e., en absence d’amplification d’une séquence cible) ou en vert/bleu en présence d’intercalation (i.e., en présence d’amplification d’une séquence cible) (voir par exemple, Iwamotoet al.; J Clin Microbiol., 2003, 41(6):2616-22). Ce type d’agent intercalant peut également être détecté par fluorescence, laquelle est émise uniquement lorsque l’agent s’intercale entre les bases nucléotidiques d’un double brin d’ADN (i.e., en présence d’amplification d’une séquence cible).
Alternativement, l’étape de détection de l’amplicon met en œuvre l’utilisation de sondes oligonucléotides marquées par la fluorescence et comprend la détection et/ou la mesure de la fluorescence. Selon ce mode de réalisation, les sondes oligonucléotides sont capables de s’hybrider sur l’amplicon.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 est un schéma montrant le protocole permettant l’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon complexe, selon l’invention. De gauche à droite, tout ou partie d’un échantillon est mis en contact avec un tampon de lyse, contenant du SDS, formant ainsi un premier mélange réactionnel (étape 1). Pour les échantillons de sang ou contenant du sang, la présence de Zinc, dans le premier mélange réactionnel, permet de précipiter l’hémoglobine. Le SDS contenu dans le premier mélange réactionnel est ensuite précipité au moyen d’un tampon contenant du potassium, lequel est introduit dans le premier mélange réactionnel (étape 2). Le deuxième mélange réactionnel à l’issue de l’étape de précipitation du SDS par le potassium est ensuite filtré à l’aide d’un filtre adapté (étape 3). Le précipitât SDS/potassium est retenu par le filtre, de même que le précipitât hémoglobine/Zinc, lorsque l’échantillon est un échantillon de sang ou contenant du sang. Les acides nucléiques contenus dans le deuxième mélange réactionnel et issus de l’échantillon ne sont pas retenus par le filtre et peuvent être récoltés dans un réceptacle adapté, par exemple un tube. Les acides nucléiques extraits à partir de l’échantillon peuvent faire l’objet d’une analyse ultérieure (étape 4).
EXEMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.
Ex e mple 1 : Extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de fèces de chat
1.1 Matériel et Méthodes
Un échantillon de fèces de chat est prélevé avec un cure-dent stérile. La matière fécale contenue sur le cure-dent est introduite dans un tube contenant 2 mL d’un tampon de lyse contenant du SDS. Le cure-dent est agité quelques secondes de sorte à déplacer la matière fécale du cure-dent vers le tampon de lyse. Le cure-dent est alors retiré. Le tube contenant le mélange réactionnel est alors agité, de sorte à homogénéiser la matière fécale dans le tampon. 1 mL d’un tampon contenant du CHKO3est ensuite ajouté au mélange réactionnel, lequel est délicatement agité par retournement du tube à 3 ou 4 reprises. Le mélange réactionnel a un volume final de 3 mL. Le contenu du tube est alors déversé dans une seringue de 5 mL au bout de laquelle se trouve un filtre en acétate de cellulose ayant un diamètre de pores d’environ 5 µm (Sartorius®). La filtration est réalisée de sorte à ce que le filtrat soit récupéré dans un tube stérile. Les acides nucléiques sont analysés comme suit. La présence du gène domestique félin codant la sous-unité 5 de la NADH déshydrogènase (ND5S) (numéro d’accès GenBank: NC_001700.1) est déterminée après une amplification isotherme à 65°C pendant 30 min.
1.2 Résultats
Table 1:détermination des concentrations effective en SDS et en CHKO3pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de fèces de chat

Conc . SDS (%) 1 		Amplification Conc. CHKO 3 (mM) 1 Amplification
0,067% + (2/2) 67 mM + (2/2)
0,67% + (3/3) 133 mM + (5/5)
1,3% + (3/3) 267 mM + (2/5)
3,33% + (2/2) 533 mM - (1/1)
6,67% + (1/2)
13,3% - (2/2)
1Concentration finale dans le milieu réactionnel final comprenant les fèces, le tampon comprenant le SDS et le tampon comprenant le CHKO3(volume final total du milieu réactionnel avant filtration 3 mL).
En conclusion, la concentration finale en SDS dans le milieu réactionnel est comprise entre environ 0,06% et 10%, et celle du CHKO3est comprise entre environ 60 mM et 300 mM, pour une extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de fèces animal.
Ex e mple 2 : Détermination de la concentration en SDS effective pour assurer l’e xtraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang
Les échantillons de sang fraichement prélevés sont immédiatement mis en contact avec un tampon comprenant 20% de SDS. Les concentrations en SDS finale dans le mélange réactionnel sont comprises entre 0,33% et 2,5%, soit 0,33%, 1,67%, 2,5%. La concentration finale en SDS de 0,33% permet l’obtention d’un lysat clair. En revanche, les concentrations finales en SDS de 1,67% et 2,5% conduisent à une coagulation des cellules sanguines.
En conclusion, la concentration finale en SDS dans le milieu réactionnel ne doit pas être supérieure à 1%, pour une extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang animal.
Exemple 3 : Détermination des concentrations effectives en ZnSO 4 et CHKO 3 pour l’e xtraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang de cheval
3.1 Matériel et Méthodes
Un échantillon de sang de cheval est prélevé selon le protocole habituel. A 0,6 mL de sang prélevé sont ajoutés 30 µL d’un tampon de lyse contenant 20% de SDS et un volume de 30 µL d’un tampon contenant du ZnSO4. Le tube contenant le mélange réactionnel est alors délicatement agité par inversion du tube à 3 ou 4 reprises, de sorte à l’homogénéiser. 1,14 mL d’un tampon contenant du CHKO3sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel, lequel est délicatement agité par inversion du tube à 3 ou 4 reprises. Lorsque la concentration en ZnSO4varie, la concentration finale en CHKO3est fixée à 100 mM. Lorsque la concentration en CHKO3varie, la concentration finale en ZnSO4est fixée à 33 mM. Le mélange réactionnel (volume final 1,8 mL) est filtré comme décrit dans l’exemple 1. La présence du gène domestique équin codant la microglobuline β2 (gène B2M) (numéro d’accès GenBank: AH011712.2) est déterminée après une amplification isotherme à 65°C pendant 30 min.
3.2 Résultats
Table 2:détermination des concentrations effective en ZnSO4et en CHKO3pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang de cheval
Conc . ZnSO 4 ( mM ) 1 Amplification Conc. CHKO 3 (mM) 1 Amplification
8 mM + (3/4) 0 mM - (1/1)
10 mM + (1/1) 8 mM + (1/1)
17 mM + (1/1) 17 mM + (1/1)
25 mM + (1/2) 25 mM + (2/2)
30 mM + (1/4) 32 mM + (1/1)
32 mM + (2/2) 37 mM + (1/1)
33 mM + (11/12) 40 mM + (1/1)
40 mM - (2/2) 47.5 mM + (1/1)
50 mM - (3/3) 50 mM + (1/1)
70 mM - (3/3) 100 mM + (11/12)
116 mM + (6/10)
133 mM + (1/2)
1Concentration finale dans le milieu réactionnel final comprenant le sang, le tampon comprenant le SDS, le tampon comprenant le ZnSO4et le tampon comprenant le CHKO3(volume final total avant filtration 1,8 mL).
En conclusion, la concentration finale en ZnSO4dans le milieu réactionnel est comprise entre environ 8 mM et 40 mM, et celle du CHKO3est supérieure à 8 mM, pour une extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang de cheval.
Exemple 4 : Extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang de chat
Un échantillon de sang de chat est prélevé selon les usages vétérinaires. A 1 mL de sang prélevé sont ajoutés 50 µL d’un tampon de lyse contenant 20% de SDS et 50 µL d’un tampon contenant du ZnSO4. Le tube contenant le mélange réactionnel est alors délicatement agité par inversion du tube à 3 ou 4 reprises, de sorte à l’homogénéiser. 2 mL d’un tampon contenant du CHKO3sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel, lequel est délicatement agité par inversion du tube à 3 ou 4 reprises. Le mélange réactionnel est alors filtré comme dans l’exemple 1 ou 3, et la présence du gène domestique félin codant ND5S est mise en évidence après une amplification isotherme à 65°C pendant 30 min.
Exemple 5 : Extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang de chien
5.1 Matériel et Méthodes
Un échantillon de sang de chien est prélevé selon les usages vétérinaires, et traité comme décrit dans l’exemple 4. Lorsque la concentration en ZnSO4varie, la concentration finale en CHKO3est fixée à 40 mM. Lorsque la concentration en CHKO3varie, la concentration finale en ZnSO4est fixée à 33 mM. La présence du gène domestique canin codant la sous-unité 5 du cœur de NADH:ubiquinone oxydoréductase (numéro d’accès GenBank: AAU12157.1) est déterminée après une amplification isotherme à 65°C pendant 30 min.
5.2 Résultats
Table 3:détermination des concentrations effective en ZnSO4et en CHKO3pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang de chien
Conc . ZnSO 4 ( mM ) 1 Amplification Conc. CHKO 3 (mM) 1 Amplification
25 mM + (1/1) 25 mM + (1/1)
33 mM + (51/54) 33 mM + (1/1)
42 mM - (1/1) 40 mM + (51/54)
43 mM - (1/1)
50 mM - (1/1)
59 mM - (1/1)
67 mM - (1/1)
1Concentration finale dans le milieu réactionnel final comprenant le sang, le tampon comprenant le SDS, le tampon comprenant le ZnSO4et le tampon comprenant le CHKO3(volume final total avant filtration 3 mL).
En conclusion, la concentration finale en ZnSO4dans le milieu réactionnel doit être inférieure à 42 mM, et celle du CHKO3peut être comprise entre environ 25 mM et 40 mM, pour une extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sang de chien.

Claims (10)

  1. Trousse d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe, ladite trousse comprend:
    • un tampon de lyse comprenant une concentration de SDS comprise entre environ 1% et 25%, de préférence comprise entre environ 5% et 20%;
    • un tampon comprenant une concentration d’un sel de potassium comprise entre environ 0,1 M et 5,0 M;
    • un tampon comprenant une concentration d’un sel de zinc comprise entre environ 0,5 M et 5.0 M;
    • un filtre ayant un diamètre de pores compris entre environ 1 µm et 10 µm, de préférence compris entre environ 2 µm et 7 µm;
    • optionnellement, un élément choisi parmi une seringue destinée à être utilisée avec le filtre, un ou plusieurs tubes de réaction, un guide d’instruction, et leur combinaison.
  2. Trousse selon la revendication1, dans lequel le sel de potassium est l’hydrogénocarbonate de potassium (CHKO3) et/ou le sel de zinc est le sulfate de zinc (ZnSO4).
  3. Utilisation d’une trousse selon l’une des revendications1ou2, dans un procédé d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe.
  4. Procédé d’extraction d’acides nucléiques contenus dans un échantillon complexe, ledit procédé comprend les étapes suivantes:
    • a) mettre en contact l’échantillon complexe avec un tampon de lyse comprenant une concentration de SDS comprise entre environ 1% et 25%, de sorte à ce que la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 0,01% et 10%;
    • b) optionnellement mettre en contact le mélange de l’étape a) avec un tampon comprenant une concentration d’un sel de zinc comprise entre environ 0,5 M et 5,0 M, de sorte à ce que la concentration finale en sel de zinc dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 10 mM et 70 mM;
    • c) mettre en contact le mélange de l’étape a) ou b) avec un tampon comprenant une concentration d’un sel de potassium comprise entre environ 0,1 M et 5,0 M, de sorte à ce que la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel soit comprise entre environ 10 mM et 500 mM;
    • d) filtrer le mélange réactionnel de l’étape c) de sorte à récolter des acides nucléiques solubles.
  5. Procédé selon la revendication4, dans lequel l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon biologique, environnemental, agroalimentaire, de préférence un échantillon biologique.
  6. Procédé selon la revendication4ou5, dans lequel l’étape b) est mise en œuvre lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang.
  7. Procédé selon l’une quelconque des revendications4à6, dans lequel la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 0,01% et 1%, de préférence entre environ 0,25% et 0,75%, lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang.
  8. Procédé selon l’une quelconque des revendications4à7, dans lequel la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 10 mM et 500 mM, de préférence entre environ 25 mM et 150 mM, lorsque l’échantillon complexe est un échantillon de sang.
  9. Procédé selon l’une quelconque des revendications4et5, dans lequel la concentration finale en SDS dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 0,06% et 10%, de préférence entre environ 0,1% et 6,7%, lorsque l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon de fèces, un échantillon de salive et un échantillon de sécrétion nasopharyngé.
  10. Procédé selon l’une quelconque des revendications4,5et9, dans lequel la concentration finale en sel de potassium dans le mélange réactionnel est comprise entre environ 60 mM et 300 mM, de préférence entre environ 100 mM et 270 mM, lorsque l’échantillon complexe est sélectionné dans le groupe comprenant un échantillon de fèces, un échantillon de salive et un échantillon de sécrétion nasopharyngé.
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