WO2014007402A1 - 眼細胞の分化マーカーおよび分化制御 - Google Patents

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cells
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中村　隆宏
範子 小泉
直毅 奥村
木下　茂
香菜 富永
諭 川崎
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京都府公立大学法人
学校法人同志社
千寿製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a marker for differentiation state of a cell, particularly an ophthalmic region, and a technique, method, and agent for suppressing differentiation and / or stimulating proliferation of an eye cell (particularly corneal endothelial cell which is difficult to control differentiation) And media.
  • Visual information is transmitted from the cornea, the transparent tissue in the foreground of the eyeball, to reach the retina and excite the neurons of the retina, and the generated electrical signals are transmitted to the visual cortex via the optic nerve.
  • the cornea needs to be transparent. The transparency of the cornea is maintained by keeping the water content constant by the pump function and the barrier function of corneal endothelial cells.
  • the cornea is located in front of the eyeball and is a transparent tissue mainly having a three-layer structure of a corneal epithelial cell layer, a corneal stroma layer, and a corneal endothelial cell layer.
  • the corneal endothelial cell layer is a single cell layer present in the deep corneal layer, has a barrier function and a pump function, and plays a role of maintaining the transparency of the cornea by keeping the water content of the cornea constant.
  • Human corneal endothelial cells exist at a density of about 3000 cells per square millimeter at birth, but do not have the ability to regenerate once damaged.
  • bullous keratopathy caused by corneal endothelial degeneration or corneal endothelial dysfunction due to various causes, the cornea becomes edema and turbidity, resulting in a significant loss of visual acuity.
  • full-thickness keratoplasty is performed in which all three layers of the corneal epithelium, parenchyma and endothelium are transplanted.
  • the cornea donation in Japan is insufficient, and the number of corneal transplants performed using domestic donor corneas is about 1700 per year for about 2600 waiting patients for corneal transplants.
  • corneal transplants deep surface corneal transplantation, which is a transplantation of parenchymal tissue, and Descemet's Stripping Automated Keratoplasty, which is a transplantation of corneal endothelial tissue, are performed.
  • cultured mucosal epithelial transplantation which transplants corneal epithelium or oral mucosa cultured in vitro instead of corneal epithelium, has already been clinically applied, and a method for transplanting corneal endothelium cultured in vitro has also been studied. Yes.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 Non-Patent Documents 1 to 4.
  • Non-Patent Document 5 describes that stem cell-like cells are present in corneal limbal epithelial cells, and that GPR49 / LGR5 can be a phenotypic marker of remaining human corneal limbal epithelial stem cells.
  • Non-patent document 6 mentions GPR49 / LGR5 as a stem cell marker. It has been described that GPR49 / LGR5 and ABCG2 are highly expressed in two cell populations of mouse corneal epithelial cells.
  • Non-Patent Document 7 describes GPR49 / LGR5 as a stem cell marker.
  • Non-Patent Document 8 discloses that intestinal epithelial stem cell culture has been established.
  • Non-Patent Document 9 discloses a method for stably and long-term culturing the intestines and the large intestine. It is described that the growth of the culture was remarkably promoted by a fusion protein (RSpo1-Fc) of R-spondin 1 and immunoglobulin Fc.
  • RSpo1-Fc fusion protein of R-spondin 1 and immunoglobulin Fc.
  • Non-Patent Document 10 Non-Patent Document 10
  • telomerase which is highly expressed in stem cells and progenitor cells
  • endothelial cells around the cornea responded faster when damaged (Non-patent Document 11).
  • Yokoo et al. Succeeded in collecting progenitor cells of corneal endothelial cells from adult human cornea using the sphere method, which is a method of collecting mesenchymal stem cells (Non-patent Document 12).
  • G protein-coupled receptor 49 (also referred to as “GPR49 / LGR5” in this specification) is a thyroid-stimulating hormone, follicle-stimulating hormone, follicle-stimulating hormone, It is a kind of 7-transmembrane receptor similar to luteinizing hormone (LH), and has a unique structure accompanied by an extracellular N-terminal domain containing a leucine-rich repeat (FIG. 1, Non-Patent Document 15).
  • GPR49 / LGR5 is a target gene of Wnt signal and hedgehog signal related to carcinogenesis.
  • GPR49 / LGR5 is increased due to abnormal Gnal (Non-patent document 16, Non-patent document 17 and Non-patent document 18). Furthermore, GPR49 / LGR5 is specifically expressed in intestinal epithelial stem cells. (Non-patent Document 8), it has been noted as a novel stem cell-specific protein. After that, it was confirmed that increased expression was observed specifically in stem cells even in tissues such as hair follicles (Non-patent Document 19) and gastric epithelium (Non-patent Document 20), and involved in the construction of stem cell niche and tissue formation. The possibility of being reported.
  • the present invention provides a technique for using GPR49 / LGR5 as a marker for proliferation / differentiation.
  • the present inventors found that GPR49 / LGR5 was strongly expressed in corneal endothelial cells (particularly in the peripheral part) in human corneal tissue, and the expression level of GPR49 / LGR5 was significant in cultured cells of human corneal endothelial cells. It was also found that the GPR49 / LGR5-positive cell group had a small cell size and high proliferation ability. Based on these, it applied to the technique which uses GPR49 / LGR5 as a marker of proliferation and differentiation.
  • the present invention also provides the use of R-spondins as differentiation inhibitors and growth promoters.
  • R-spondins tend to suppress the differentiation of human cultured corneal endothelial cells and promote proliferation.
  • R-spondins are used as a corneal preservation solution, a corneal endothelial cell culture solution, a therapeutic agent for corneal endothelial cell injury (eye drops, cell injection), and a technique for preventing progression of corneal endothelial cell injury. Applied.
  • GPR49 / LGR5 exists as a protein that is specifically expressed in progenitor cells of corneal endothelial cells, have verified the functional role in vivo and in vitro, and have applied it as a marker.
  • the present invention provides an agent for inhibiting cell differentiation and / or proliferation, comprising at least one selected from the group consisting of R-spondins and functional equivalents thereof.
  • the present invention comprises ocular cells, cells derived from neural crest cells (including corneal endothelial cells), comprising at least one selected from the group consisting of R-spondins and functional equivalents thereof.
  • the present invention provides an agent for suppressing differentiation and / or promoting proliferation of cells selected from neuronal cells, conjunctival epithelial cells, amniotic epithelial cells, oral mucosal epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, corneal epithelial cells and the like.
  • the present invention provides an agent for suppressing ocular cell differentiation and / or proliferation, comprising at least one member selected from the group consisting of R-spondins and functional equivalents thereof.
  • the R-spondins in the present invention include at least one selected from R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, and R-spondin 4.
  • the R-spondins include R-spondin 1.
  • the eye cell is a cell that is not proliferating in a steady state.
  • the eye cell comprises at least one cell selected from retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, and corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise primate corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise human corneal endothelial cells.
  • the eye cells are in a confluent state.
  • the present invention suppresses differentiation of cells, including at least one selected from the group consisting of SHH, an SHH agonist (for example, Frizzled family agonist such as purmorphamine) and functional equivalents thereof. And / or providing growth promoters.
  • the present invention relates to an ocular cell, a neural crest cell-derived cell (including a corneal endothelial cell) comprising at least one selected from the group consisting of SHH, purmorphamine and functional equivalents thereof.
  • An agent for suppressing differentiation and / or promoting proliferation of cells selected from epithelial cells such as neuronal cells, conjunctival epithelial cells, amniotic epithelial cells, oral mucosal epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, and corneal epithelial cells.
  • the present invention relates to an ocular cell comprising at least one selected from the group consisting of SHH, an agonist of SHH (eg, Frizzled family agonist such as purmorphamine) and functional equivalents thereof.
  • SHH eg, Frizzled family agonist such as purmorphamine
  • An agent for suppressing differentiation and / or promoting proliferation is provided.
  • the eye cell is a cell that is not proliferating in a steady state.
  • the eye cell comprises at least one cell selected from retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, and corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise primate corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise human corneal endothelial cells.
  • the eye cells are in a confluent state.
  • the present invention provides an agent for inhibiting cell differentiation and / or proliferation, comprising a factor that suppresses GPR49 / LGR5.
  • the present invention relates to a factor that suppresses GPR49 / LGR5, an eye cell, a nerve cell containing a neural crest cell-derived cell (including a corneal endothelial cell), a conjunctival epithelial cell, an amniotic epithelial cell, an oral mucosa.
  • an agent for inhibiting differentiation and / or promoting proliferation of cells selected from epithelial cells such as epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, and corneal epithelial cells.
  • the present invention provides an agent for suppressing differentiation and / or promoting proliferation of an eye cell comprising a factor that suppresses GPR49 / LGR5.
  • the factor that suppresses GPR49 / LGR5 is a nucleic acid, an antibody or an antibody fragment, or a functional equivalent thereof.
  • the eye cell is a cell that is not proliferating in a steady state.
  • the eye cell comprises at least one cell selected from retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, and corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise primate corneal endothelial cells.
  • the eye cells comprise human corneal endothelial cells.
  • the eye cells are in a confluent state.
  • the eye cells are provided in the form of corneal tissue.
  • the present invention provides a composition for corneal preservation or corneal endothelial cell culture, comprising the differentiation inhibitor and / or proliferation promoter of the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating corneal endothelial cell disorder or preventing progression of corneal endothelial cell disorder, comprising the differentiation inhibitor and / or proliferation promoter according to the present invention.
  • the present invention provides a corneal endothelial cell disorder therapeutic or progression preventive agent comprising corneal endothelial cells cultured using the differentiation inhibiting and / or proliferation promoting agent according to the present invention.
  • the cells are present as a population having a higher cell density than normal corneal endothelial cells and / or containing more undifferentiated cells.
  • the present invention provides a marker for distinguishing cells having high proliferation ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, including GPR49 / LGR5.
  • the cell having a high proliferation ability is an undifferentiated cell.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the present invention provides a corneal endothelial culture, wherein the corneal endothelium is present at a higher density than the confluent cell density.
  • the corneal endothelium culture in this case usually refers to a substance that exists in a state different from that existing in the living body.
  • the cell density is about 570 cells / mm 2 or more.
  • the cell density is about 700 cells / mm 2 or more.
  • the cell density is about 800 cells / mm 2 or more.
  • the cell density is about 1000 cells / mm 2 or more.
  • the present invention relates to a corneal tissue containing corneal endothelial cells, wherein Ki67 positive cells in the tissue are present in a higher ratio than in vivo, and / or the corneal endothelial cells.
  • Ki67 positive cells in the tissue are present in a higher ratio than in vivo, and / or the corneal endothelial cells.
  • the Ki67 positive cells are present at a rate of about 4% or more.
  • the Ki67 positive cells are present at a rate of about 7% or more.
  • the Ki67 positive cells are present at a rate of about 10% or more.
  • the density of the corneal endothelial cells is about 4000 cells / mm 2 or more.
  • the corneal endothelial cell density is about 4500 cells / mm 2 or more.
  • the corneal endothelial cell density is about 5000 cells / mm 2 or more.
  • the present invention provides a method for using GPR49 / LGR5 as an index for identifying cells having high proliferation ability among corneal endothelial cells and / or differentiation ability.
  • the cell having a high proliferation ability is an undifferentiated cell.
  • the cell having high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the present invention provides a detection agent for identifying cells having high proliferation ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, which contains a substance that binds to GPR49 / LGR5.
  • the detection agent is an antibody or a fragment or functional equivalent thereof, or a nucleic acid primer or probe.
  • the detection agent is labeled.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the present invention provides a marker for distinguishing cells having high proliferation ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, including SHH.
  • the cell having a high proliferation ability is an undifferentiated cell.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the present invention provides a method for using SHH as an index for identifying cells having high proliferation ability among corneal endothelial cells and / or differentiation ability.
  • the cell having a high proliferation ability is an undifferentiated cell.
  • the cell having high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the present invention provides a detection agent for identifying cells having high proliferation ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, which contains a substance that binds to SHH.
  • the detection agent is an antibody or a fragment or functional equivalent thereof, or a nucleic acid primer or probe.
  • the detection agent is labeled.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the present invention provides a marker for identifying a cell having high proliferative ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, including a hedgehog pathway factor.
  • the cell having a high proliferation ability is an undifferentiated cell.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by at least one characteristic selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the hedgehog pathway factor is selected from the group consisting of SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2.
  • the present invention provides a method for using a factor of the hedgehog pathway as an index for identifying a cell having high proliferation ability among corneal endothelial cells and / or a differentiation ability.
  • the cell having a high proliferation ability is an undifferentiated cell.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by at least one characteristic selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the hedgehog pathway factor is selected from the group consisting of SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2.
  • the present invention provides a detection agent for identifying cells having high proliferative ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, which contains a substance that binds to a factor of the hedgehog pathway.
  • the detection agent is an antibody or a fragment or functional equivalent thereof, or a nucleic acid primer or probe.
  • the detection agent is labeled.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by at least one characteristic selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the hedgehog pathway factor is selected from the group consisting of SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2.
  • the present invention provides a marker for identifying a highly proliferative cell and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, including a Wnt pathway factor.
  • the cell having a high proliferation ability is an undifferentiated cell.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by at least one characteristic selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the Wnt pathway factor is selected from the group consisting of LRP6 and ⁇ -catenin.
  • the present invention provides a method for using a factor of the Wnt pathway as an index for identifying a highly proliferative cell / or differentiation ability among corneal endothelial cells.
  • the cell having a high proliferation ability is an undifferentiated cell.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the Wnt pathway factor is selected from the group consisting of LRP6 and ⁇ -catenin.
  • the present invention provides a detection agent for identifying a cell having high proliferation ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, which contains a substance that binds to a factor of the Wnt pathway.
  • the detection agent is an antibody or a fragment or functional equivalent thereof, or a nucleic acid primer or probe.
  • the detection agent is labeled.
  • the cell having a high proliferation ability is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cell is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the Wnt pathway factor is selected from the group consisting of LRP6 and ⁇ -catenin.
  • the present invention provides a diagnostic agent, a detection kit, a diagnostic kit, a detection system, a diagnostic system, and the like using the detection agent and marker of the present invention.
  • the differentiation ability of cells existing in corneal endothelial cells can be identified, and cells having high proliferation ability can be identified.
  • undifferentiated cells existing in a small amount in corneal endothelium can be effectively treated.
  • the corneal endothelium can be proliferated, and corneal endothelium diseases and disorders that have been impossible or difficult in the past can be treated or prevented.
  • FIG. 1 shows the structure of GRP49 / LGR5 (see Barker N. et al., Gastroenterology, 2010 May; 138 (5): 1681-96).
  • FIG. 2 shows GPR49 / LGR5 expression in the human cornea. a. From the left, immunostaining of human corneal sections of GPR49 / LGR5, nestin and ABCG2 is shown. The scale bar indicates the portion corresponding to epithelium (Epi), parenchyma (Str), and endothelium (End) from the top in each photograph of 100 ⁇ m. b. From the left, real-time PCR of GPR49 / LGR5, nestin and ABCG2 is shown.
  • FIG. 2 shows GPR49 / LGR5 expression in the human cornea.
  • c It is a whole mount of immunostaining of GPR49 / LGR5.
  • Center indicates the center and Periphery indicates the peripheral portion.
  • d It is an enlarged view of the central region versus the peripheral region of the human cornea. Center indicates the center and Periphery indicates the peripheral portion.
  • FIG. 2 shows real-time PCR of GPR49 / LGR5 in the center (Center) and periphery (Periphery) of the human cornea.
  • the vertical axis shows the relative level of mRNA with corneal endothelium as 1.
  • N 3. Error bars are S.D. E. Indicates. * P ⁇ 0.05 with Student's t-test.
  • FIG. 3 shows the expression of GPR49 / LGR5 in cultured corneal endothelial cells.
  • FIG. 5 shows immunostaining of GPR49 / LGR5 and nestin on cultured human corneal endothelial cells (cHCEC). From the left, a phase difference image, a GPR49 PI image and a nestin PI image are shown.
  • FIG. 3 shows the expression of GPR49 / LGR5 in cultured corneal endothelial cells.
  • P0 primary culture
  • P1 passage 1st generation
  • FIG. 3 shows the expression of GPR49 / LGR5 in cultured corneal endothelial cells.
  • c. Fig. 3 shows immunostaining of GPR49 / LGR5 in cultured monkey corneal endothelial cells (cMCEC). A phase difference image and a GPR49 PI image are shown from the left. From the top, in vivo, primary culture (P0), and passage 1st generation (P1) are shown. The scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 3 shows the expression of GPR49 / LGR5 in cultured corneal endothelial cells.
  • d. The expression in CMCEC of GPR49 / LGR5 mRNA is shown. The vertical axis shows the relative level of mRNA with primary culture (P0) as 1.
  • FIG. 4 shows the characterization of GPR49 / LGR5 positive cells.
  • a The phase difference of GPR49 / LGR5 positive cells (GPR49 + ) after cell sorting is shown on the left, and the phase difference of negative cells (GPR49 ⁇ ) is shown on the right.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 4 shows the characterization of GPR49 / LGR5 positive cells.
  • b The surface area of each cell is shown.
  • GPR49 + is the average cell size is 184.6 ⁇ 45.8 ⁇ m 2, GPR49 - the average cell size of which is 326.78 ⁇ 78.8 ⁇ m 2.
  • N 35. Error bars are S.D. E. Indicates. * P ⁇ 0.01 with Student's t-test.
  • FIG. 4 shows the characterization of GPR49 / LGR5 positive cells. d.
  • FIG. 5 shows the hedgehog signaling pathway in cHCEC.
  • a The expression of hedgehog signal-related genes (Shh, Smo and Ptch1 from the left in the upper row, and Gli1 and Gli2 from the left in the lower row) is shown. The relative level of mRNA with the center being 1 is shown.
  • FIG. 5 shows the hedgehog signaling pathway in cHCEC.
  • b From left, control, GPR49 / LGR5 and Ki-67, 100 ng / ml rhShh (second from left), 10 ⁇ M purmorphamine (Pur) (third from left) and 10 ⁇ M cyclopamine (Cyc) (rightmost) Immunostaining in treated HCEC is shown.
  • the upper row shows GPR49 staining and the lower row shows Ki67 staining.
  • the control is 0.1% DMSO.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 5 shows the hedgehog signaling pathway in cHCEC. c.
  • FIG. 6 shows GPR49 / LGR5 expression (relative mRNA level) in cHCEC treated with rhSHH.
  • e Immunostaining of GPR49 / LGR5 in cHCEC treated with rhSHH.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 5 shows the hedgehog signaling pathway in cHCEC.
  • f From left, Ki-67 immunostaining in cHCEC treated with control, 100 ng / ml rhSHH, 2 ⁇ M Pur and 2 ⁇ M Cyc is shown.
  • the upper row shows GRP49 staining.
  • the lower platform shows Ki67 staining.
  • the control is 0.01% DMSO.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 shows the function of GPR49 / LGR5 in corneal endothelial cells. a. The knockdown effect of GPR49 / LGR5shRNA is shown. The relative mRNA level with control (NT) set to 1 is shown.
  • FIG. 6 shows the function of GPR49 / LGR5 in corneal endothelial cells.
  • b The expression of Ptch1, Gli1 and Gli2 treated with shRNA (589) (from left) is shown.
  • NT non-target.
  • FIG. 6 shows the function of GPR49 / LGR5 in corneal endothelial cells.
  • Figure 3 shows the effect of overexpression of GPR49 / LGR5 on cHCEC.
  • FIG. 6 shows the function of GPR49 / LGR5 in corneal endothelial cells.
  • d The expression of GPR49 / LGR5 and Ptch1 from the upper left and the expression of Gli1 and Gli2 mRNA from the lower left are shown.
  • NT indicates a control
  • ExpGPR49 indicates a GPR49 / LGR5 expression product.
  • N 3. Error bars are S.D. E. Indicates. * P ⁇ 0.01 with Student's t-test.
  • FIG. 6A shows the effect of shLGR5 on human corneal endothelial cells (CEC).
  • FIG. 6A shows the image shown in FIG. 6B in parallel with GPR49 / LGR5.
  • FIG. 6B shows the function of GPR49 / LGR5 and RSPO1 in corneal endothelial cells (CEC).
  • A Phase contrast microscopic image (leftmost), GPR49 / LGR5 (second from the left), Na + / K + ATPase (second from the right) in NT (upper) and shLGR-transfected human CEC (lower) ) And ZO1 (rightmost) immunostaining.
  • FIG. 6C shows RSPO expression and function in human corneal endothelial cells (CEC).
  • the upper panel shows RSPO1 (top row), RSPO2 (second row from the top), RSPO3 (top row) in human corneal epithelial cells (Epi), parenchymal cells (Stroma) and endothelial cells (Endo).
  • 3 shows the PCR results for RSPO4 (fourth row from the top).
  • the lower panel shows RSPO1 (top row), RSPO2 (second row from the top), RSPO3 (third row from the top) of the endothelial cells (Endo) in the center and the periphery (Periphery).
  • RSPO4 fourth row from the top).
  • FIG. 6D shows a schematic diagram of the molecular mechanism of CEC maintenance.
  • Human CEC shows regional diversity with respect to GRP49 / LGR5 expression.
  • GRP49 / LGR5 is uniquely expressed in the peripheral region of CEC, where HH signaling is clearly activated.
  • GRP49 / LGR5 is a target molecule of the HH pathway, and in vitro conditions, the HH pathway was able to induce CEC proliferation. However, in the in vivo situation, stimulation of the HH pathway alone was insufficient to induce CEC proliferation. Permanent GRP49 / LGR5 expression maintained a normal CEC phenotype by inhibition of the Wnt pathway.
  • FIG. 7 shows an outline of R-spondins 1 to 4.
  • FIG. 8 shows detection of proliferating cells using the Click-iT EdU Imaging kit in Example 9 (magnification x200). Cultured monkey cultured corneal endothelial cells were seeded and replaced with medium containing R-spondin 1 (0, 10, 50 ng / ml from the left) while the cells were almost confluent. Click- 24 hours after adding R-spondin 1, click- EdU was stained with iT EdU, and the percentage of EdU positive cells was counted.
  • FIG. 9 shows the EdU positive cell rate in FIG.
  • FIG. 10 shows the endothelial cell density of corneal endothelial cells cultured by the method shown in FIG. Photographs were taken with a phase contrast microscope, and the cell density was measured using a corneal endothelial cell density calculation software Konan Storage System KSS-400EB. From the left, no medium is added, 10 ng / ml R-spondin 1, 50 ng / ml R-spondin 1 are shown.
  • FIG. 10 shows the endothelial cell density of corneal endothelial cells cultured by the method shown in FIG. Photographs were taken with a phase contrast microscope, and the cell density was measured using a corneal endothelial cell density calculation software Konan Storage System KSS-400EB. From the left, no medium is added, 10 ng / ml R-spondin 1, 50 ng / ml R-spondin 1 are shown.
  • FIG. 11 shows the action of R-spondin1 in cultured human corneal endothelial cells.
  • the corneal endothelial cells added with RSPO1 50 ng / ml (upper right), 500 ng / ml (lower left)
  • the upper left shows a control
  • the upper right shows an example cultured with 50 ng / ml R-spondin 1
  • the lower left shows an example cultured with 500 ng / ml R-spondin 1
  • the lower right shows an example cultured with 1000 ng / ml R-spondin 1. Show.
  • FIG. 12 shows the action of R-spondin 2 in human cultured corneal endothelial cells.
  • the corneal endothelial cells to which RSPO2 was added had a slightly increased Ki67 positive cell rate compared to the control.
  • the left shows an example cultured with 50 ng / ml R-spondin 2
  • the right shows an example cultured with 100 ng / ml R-spondin 2
  • the upper shows the corneal limbus
  • the lower shows the center.
  • FIG. 13 shows the action of R-spondin 3 in human cultured corneal endothelial cells.
  • the Ki67 positive cell rate slightly increased compared to the control.
  • the left shows an example cultured with 50 ng / ml R-spondin 3
  • the right shows an example cultured with 200 ng / ml R-spondin 3
  • the upper shows the corneal limbus
  • the lower shows the center.
  • FIG. 14 shows the action of R-spondin 4 in human cultured corneal endothelial cells.
  • the Ki67 positive cell rate slightly increased compared to the control.
  • FIG. 15 shows that after subculture of human corneal endothelial cells, when confluence was reached and cultured for 2 weeks or more and no obvious change was observed in corneal endothelial density, R-spondin1 was added to the medium at 10 ng / The culture is continued by adding at a concentration of ml, and the cell morphology is observed with a phase contrast microscope, and the cell density is calculated.
  • the photograph shows the number of days after addition (from the left, day 0, day 7, day 14 and day 21).
  • the lower graph shows changes in the cell density of the addition group R-spondin 1 on the 0th day, the 7th day, the 14th day, and the 21st day in comparison with the non-addition group.
  • FIG. 16 shows an organ culture using a rabbit cornea piece in an incubator at 37 ° C. for one week in DMEM (INVITROGEN, catalog number: 12320) + 10% fetal bovine serum (FBS) (BIOEST, catalog number: S1820-500).
  • DMEM INVITROGEN, catalog number: 12320
  • FBS fetal bovine serum
  • Ki67 Sigma-Aldrich Co.
  • P6834 shows the results of immunostaining of corneal endothelial cells and observation with a fluorescence microscope. The result of nuclear staining with DAPI and calculation of the Ki67 positive cell rate is shown in the lower left panel. Moreover, the result of having performed immunostaining with ZO-1 and calculating the cell density is shown in the lower right panel.
  • GPR49 / LGR5 is a protein that is a seven-transmembrane LGR family member.
  • GPR49 / LGR5 is an unusual G protein coupling characterized by a large N-terminal extracellular domain containing leucine rich repeats that have been shown to be important for interaction with glycoprotein ligands in some cases
  • the name is based on the leucine rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 which is a type of receptor (GPCR), and the frequency of such names has recently increased, and these are also described in this specification. Also known as FEX HG38, GPR67.
  • GPR49 / LGR5 The amino acid sequence of human GPR49 / LGR5 and the gene sequence encoding it are disclosed in NCBI accession numbers NP_003658.1 (SEQ ID NO: 2) and NM_003667.2 (SEQ ID NO: 1), respectively. In this field, it is also called GPR49 or LGR5 as a single name. In this specification, “GPR49 / LGR5” is displayed, but it is understood that the same meaning is shown in any display. GPR49 / LGR5 can be identified by an accession number with OMIM: 606667. As used herein, “GPR49 / LGR5” is not only a protein having an amino acid sequence described in a specific sequence number or accession number (or a nucleic acid encoding it), but also functional. Active derivatives thereof, or functionally active fragments thereof, or homologues thereof, or variants encoded by nucleic acids that hybridize to nucleic acids encoding this protein under high or low stringency conditions Is also understood to
  • a given protein or nucleic acid name not only refers to a protein or nucleic acid as shown in the sequence listing, but also a functionally active derivative, or a functionally active fragment thereof, or a homologue thereof, or a high stringency. It also refers to a variant encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid encoding the protein under conditions of genency or low stringency, preferably under the conditions described above.
  • a “derivative” or “analog of a component protein” or “variant” preferably includes, but is not intended to be limited, a region that is substantially homologous to the component protein.
  • Such molecules in various embodiments, at least 30% when compared to sequences aligned over amino acid sequences of the same size or aligned by computer homology programs known in the art. , 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 99% identical or nucleic acid encoding such a molecule is moderately stringent under stringent conditions Can hybridize to sequences encoding component proteins under mild or non-stringent conditionsThis is a product of a naturally occurring protein modified by amino acid substitutions, deletions and additions, respectively, and derivatives thereof that do not necessarily exhibit the same degree of biological function of the naturally occurring protein. means. For example, the biological function of such proteins can be examined by suitable and available in vitro assays described herein or known in the art.
  • GPR49 / LGR5 is mainly discussed in humans.
  • chimpanzees Pan troglodytes
  • ENSPTRG 00000005223 XR_021586.1
  • Macaca mulatta ENSMMUG0000002092092
  • mice Mus01 musSMG000
  • Rattus norvegicus ENSRNOG000004004221 (LOC687868)
  • guinea pig Cavia porcellus
  • ENSCPOG00000000092 dog
  • Canis familiaris ENSCAFG0000000000001
  • cat Felis catus000000 (ENSFCAG000000) 8064
  • chickens Gallus gallus
  • GPR49 / LGR5 has been found to form part of a different protein complex that is involved in the abnormal processing of APP by gamma-secretase in Alzheimer's disease. Since GPR49 / LGR5 has been discovered to be part of the Aph1a complex, Fe65L2 complex, APP-C99 complex and BACE1 complex, GPR49 / LGR5 is also detected by detecting these complexes can do. These complexes are named after each important protein compound used as a TAP technology entry point.
  • “functionally active” as used herein refers to the structural function of a protein, such as biological activity, according to the embodiment to which the polypeptide of the invention, ie, fragment or derivative, relates. It refers to a polypeptide, ie a fragment or derivative, having a regulatory function or a biochemical function.
  • the GPR49 / LGR5 fragment is a polypeptide containing an arbitrary region of GPR49 / LGR5 and may not have the biological function of natural GPR49 / LGR5.
  • the fragment include a fragment containing the extracellular region of GPR49 / LGR5.
  • the extracellular region of GPR49 / LGR5 corresponds to the 1-556th, 615-637th, 704-722th, and 792-800th positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the transmembrane region corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at positions 557-579, 592-614, 638-660, 681-703, 723-745, 769-791, and 801-823. To do.
  • a representative nucleotide sequence of GPR49 / LGR5 is: (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof; (
  • amino acid sequence of GPR49 / LGR5 As the amino acid sequence of GPR49 / LGR5, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof; (B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having biological activity; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a) to (d) And a polypeptide having biological activity, It can be.
  • the biological activity typically means the activity of GPR49 / LGR5.
  • a substance that binds to GPR49 / LGR5 or “GPR49 / LGR5 interacting molecule” at least temporarily binds to GPR49 / LGR5 and preferably may indicate that it has bound (eg It is a molecule or substance that is labeled or labelable.
  • the substance that binds to GPR49 / LGR5 may be an inhibitor of GPR49 / LGR5, examples of which include antibodies, antisense oligonucleotides, siRNA, low molecular weight molecules (LMW), binding peptides, aptamers, ribozymes and Peptidomimetics and the like, for example binding proteins or binding peptides directed against GPR49 / LGR5, in particular directed against the active site of GPR49 / LGR5, and GPR49 / LGR5 gene Also included are nucleic acids directed against.
  • LMW low molecular weight molecules
  • Nucleic acid for GPR49 / LGR5 refers to, for example, a double-stranded or single-stranded DNA or RNA, or a modification or derivative thereof, that inhibits GPR49 / LGR5 gene expression or GPR49 / LGR5 activity, and without limitation Includes sense nucleic acids, aptamers, siRNA (small interfering RNA) and ribozymes.
  • binding protein or “binding peptide” for GPR49 / LGR5 refers to a type of protein or peptide that binds to GPR49 / LGR5 and is a polyclonal antibody directed against GPR49 / LGR5 or Including but not limited to monoclonal antibodies, antibody fragments and protein backbones.
  • R-spondin (class) refers to a gene group having the same structure and function as R-spondin 1 and the like, and is described in Non-Patent Document 4 (J. Yoon, J. Lee, Cellular Signaling 24 (2012). 369-377).
  • the structure is known to have domains of SP, CR, TSR, and BR from the N-terminus.
  • As a function it is known to be a ligand for GPR49. Therefore, R-spondins can be determined using such structure and function as an index.
  • R-spondin 1 (RSPO1 OMIM: 609595; nucleic acid sequence (gene sequence): SEQ ID NO: 3, 35, 37 or 39; amino acid sequence: SEQ ID NO: 4, 36, 38 or 40), R-spondin 2 (RSPO2 OMIM: 610575, SEQ ID NO: 5 and 6), R-spondin 3 (RSPO3 OMIM: 610574, SEQ ID NO: 7 and 8), R-spondin 4 (RSPO4 OMIM: 610573: nucleic acid sequence (gene sequence): SEQ ID NO: 9 Or 41; amino acid sequence: SEQ ID NO: 10 or 42) is known. From the information of Non-Patent Document 4, the R-spondins are collected as shown in FIG.
  • a representative nucleotide sequence of R-spondin 1 is (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 35, 37 or 39 or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 36, 38 or 40 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 36, 38 or 40 A polynucleotide encoding a variant polypeptide having biological activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence described in SEQ ID NO: 3, 35, 37 or 39 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of a polypeptide consisting of the amino acid sequence set
  • R-spondin 1 As an amino acid sequence of R-spondin 1, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 36, 38 or 40 or a fragment thereof; (B) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 36, 38 or 40, one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion, and biological activity Having a polypeptide; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 35, 37 or 39; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 36, 38 or 40; or (e) at least identity to any one polypeptide of (a) to (d) A polypeptide having an amino acid sequence which is 70% and having biological activity; It can be.
  • the biological activity typically means the activity of R-spondin 1.
  • a representative nucleotide sequence of R-spondin 2 is (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof; (F)
  • R-spondin 2 As an amino acid sequence of R-spondin 2, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof; (B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and having biological activity; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a) to (d) And a polypeptide having biological activity, It can be.
  • the biological activity typically refers to the activity of R-spondin 2.
  • a representative nucleotide sequence of R-spondin 3 is (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence described in SEQ ID NO: 7 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or a fragment thereof; (F) a
  • R-spondin 3 As an amino acid sequence of R-spondin 3, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or a fragment thereof; (B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and having biological activity; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a)-(d) And a polypeptide having biological activity, It can be.
  • the biological activity typically means the activity of R-spondin 3.
  • a representative nucleotide sequence of R-spondin 4 is (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 41 or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or 42 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 42, A polynucleotide encoding a variant polypeptide having biological activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 41 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or 42,
  • R-spondin 4 As an amino acid sequence of R-spondin 4, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or 42 or a fragment thereof; (B) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 42, one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion, and have a biological activity, peptide; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 41; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or 42; or (e) at least 70% identity to any one polypeptide of (a)-(d) A polypeptide having an amino acid sequence and having biological activity; It can be.
  • the biological activity typically refers to the activity of R-spondin 4.
  • SONIC HEDGEHOG is one of five types of proteins belonging to the hedgehog (HH) family, and the gene encoding this is denoted by shh.
  • SHH is the most important morphogen in development and plays a role in designing many organ systems such as limbs and cerebrospinal midline structures. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause a loss of ventral midline, leading to total forebrain fever (HPE), as well as polydactyly due to changes in cis-regulatory elements. ing.
  • Other proteins in this family include Desert Hedgehog (DHH) and Indian Hedgehog, (IHH) in mammals.
  • DHH Desert Hedgehog
  • IHH Indian Hedgehog
  • a representative nucleotide sequence of shh is (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or a fragment thereof; (F) a polynu
  • amino acid sequence of SHH As an amino acid sequence of SHH, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or a fragment thereof; (B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 and having biological activity; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a) to (d) And a polypeptide having biological activity.
  • the biological activity typically means the activity of SHH.
  • Hedgehog pathway factors include SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2.
  • PTCH1 is one of the factors of the hedgehog pathway, is a receptor called Patched-1, and is a receptor to which SHH binds.
  • the gene encoding this factor is expressed as ptch1.
  • SMO Smoothened
  • SMO Smoothened
  • Gli transcription factors It is said that it has become a physiological function.
  • the gamete mutation of PTCH1 is said to cause a genetic disease characterized by a small malformation called nevus basal cell carcinoma syndrome (NBCCS) (also called Gorlin syndrome) and high carcinogenesis.
  • NBCCS nevus basal cell carcinoma syndrome
  • PTCH1 is also a tumor suppressor gene. This gene is also known as PTC; BCNS; HPE7; PTC1; PTCH; NBCCS; PTCH11. As this factor, for example, the human one is NC_000000091 (NCBI Reference Sequence), and NC_000009 (Accession No.) and NM_0010833602.1 (Accession No.) (SEQ ID NOs: 43 and 44) are known. .
  • a typical nucleotide sequence of ptch1 is (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 43 ⁇ NM_0010833602.1> or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44; A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 43 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44
  • amino acid sequence of PTCH1 As the amino acid sequence of PTCH1, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44 or a fragment thereof; (B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44, and having biological activity; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 43; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a) to (d) And a polypeptide having biological activity, It can be.
  • the biological activity typically means the activity of PTCH1.
  • GLI1 is a factor of the hedgehog (HH) pathway and is one of transcription factor Gli families (GLI1, GLI2, GLI3, etc.).
  • the gene encoding GLI1 is designated gli1.
  • GLI1 is downstream of PTCH1, from which signals are transmitted to GPR49 / LGR5.
  • SMO Smoothened
  • SMO Smoothened
  • NM_0052699.2 NCBIReference Sequence
  • NM_005269 Gene Accession
  • NM_001167609 Genebank Accession
  • a typical nucleotide sequence of gli1 is (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 45 ⁇ NM_0011677609.1> or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46 or
  • amino acid sequence of GLI1 As the amino acid sequence of GLI1, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46 or a fragment thereof; (B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46, and having biological activity; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 45; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a) to (d) And a polypeptide having biological activity, It can be.
  • the biological activity typically refers to the activity of GLI1.
  • GLI2 is a factor of the hedgehog (HH) pathway and is one of transcription factor GLI families (GLI1, GLI2, GLI3, etc.).
  • the gene encoding GLI2 is represented by gli1. It is assumed that a signal is transmitted to GPR49 / LGR5 from downstream of PTCH1. The binding of Shh and PTCH1 results in the removal of Smothened (Smo), which is also a component of the Shh receptor complex, and signals are transmitted into the cell. Finally, transcription of various target genes is activated through Gli transcription factors. It is said that it has become a physiological function. For example, NM_005270.4 (NCBI Reference Sequence) NM_005270 (Genbank Access) (SEQ ID NOs: 47 and 48) is known as this factor.
  • a typical nucleotide sequence of gli2 is (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 47 ⁇ NM — 005270.4> or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 47 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48 or
  • amino acid sequence of GLI2 As the amino acid sequence of GLI2, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48 or a fragment thereof; (B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48, and having biological activity; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 47; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a) to (d) And a polypeptide having biological activity, It can be.
  • the biological activity typically means the activity of GLI2.
  • Wnt pathway factors examples include LRP6 and ⁇ -catenin.
  • LRP6 is one of the factors of the Wnt pathway, and is an abbreviation for Low-density lipoprotein receptor-related protein 6, and the gene encoding this is denoted by lrp6.
  • G ⁇ which is a G protein, activates GSK3 and promotes the transcriptional activity of ⁇ -catenin via LRP6.
  • NM_002336.2 NCBIReference Sequence
  • NM_002336 Genebank Access
  • LRP6 NM_002336.2 (SEQ ID NOs: 49 and 50) are known as human factors.
  • a typical nucleotide sequence of lrp6 is: (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 49 ⁇ NM_002336.2> or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof wherein one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 49 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50 or
  • A a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50 or a fragment thereof;
  • B a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50 and having biological activity;
  • C a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 49;
  • D a polypeptide which is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50; or (e) an amino acid sequence which is at least 70% identical to any one polypeptide of (a) to (d) And a polypeptide having biological activity, It can be.
  • biological activity typically refers to the activity of LRP6.
  • ⁇ -catenin is one of the factors of the Wnt pathway, and the gene encoding it is represented by beta-catenin / CTNNB1.
  • the Wnt / ⁇ -catenin pathway regulates cell fate decisions in vertebrate and invertebrate development.
  • Wnt-ligand is a secreted glycoprotein that binds to the Frizzled receptor. This binding initiates a cascade that releases the multifunctional kinase GSK-3 ⁇ from the APC / Axin / GSK-3 ⁇ complex.
  • ⁇ -catenin which is a transcriptional coupling factor and embedded in the cell membrane and is present as an adapter protein in cell-cell adhesion, is degraded by the APC / Axin / GSK-3 ⁇ complex. It is supposed to head.
  • ⁇ -catenin is appropriately phosphorylated by the cooperative action of CK1 and GSK-3 ⁇ , it is supposed to lead to ubiquitination and degradation by the proteasome via the ⁇ -TrCP / SKP complex.
  • Dvl disheveled
  • the Wnt / ⁇ -catenin pathway is said to aggregate signals from many other pathways such as retinoic acid, FGF, TGF- ⁇ , and BMP in many different types of cells and tissues.
  • NM_001904.3 NCBIReference Sequence
  • NM_001904 XM_942045 XM_945648XM_945650XM_945651 XM_945652 XM_945653 XM_945654 XM_945655 XM_945657 (GenbankAccession); as a variant 2 NM_001098209.1 (NCBI Reference Sequence) NM_001098209, XM_001133660, XM_001133664 , XM_001133673, XM_001133675 (Genbank Accession); NM_001098210.1 as variant 3 NCBI Reference Sequence) NM_001098210 (Genbank Accession), _ NM_131059.2 (CTNNB, Accession No.) (SEQ ID NO: 51 and 52) it is known.
  • a representative nucleotide sequence of ⁇ -catenin is: (A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 51 ⁇ NM — 131059.2> or a fragment sequence thereof; (B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52 or a fragment thereof; (C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity; (D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 51 or a fragment thereof; (E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO
  • amino acid sequence of ⁇ -catenin As the amino acid sequence of ⁇ -catenin, (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52 or a fragment thereof; (B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52, and having biological activity; (C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 51; (D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a) to (d) And a polypeptide having biological activity, It can be.
  • the biological activity typically refers to the activity of ⁇ -catenin.
  • purmorphamine is another name for N- (4-morpholinophenyl) -2- (1-naphthyloxy) -9-cyclohexyl-9H-purin-6-amine, and CAS.
  • the number is the compound known as 482367-10-8.
  • Frizzled family smoothened
  • Frizzled family of seven transmembrane proteins a membrane protein responsible for the hedgehog signaling pathway. Therefore, in the present invention, it can be used as an agonist of SHH, for example, as a Frizzled family agonist such as purmorphamine.
  • protein protein
  • polypeptide oligopeptide
  • peptide refers to a polymer of amino acids having an arbitrary length.
  • This polymer may be linear, branched, or cyclic.
  • the amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid.
  • the term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is done.
  • amino acid may be natural or non-natural as long as the object of the present invention is satisfied.
  • polynucleotide As used herein, “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a nucleotide polymer of any length. The term also includes “oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives”. “Oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives” refer to oligonucleotides or polynucleotides that include derivatives of nucleotides or that have unusual linkages between nucleotides, and are used interchangeably.
  • oligonucleotides include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotides, oligonucleotide derivatives in which phosphodiester bonds in oligonucleotides are converted to phosphorothioate bonds, and phosphodiester bonds in oligonucleotides.
  • oligonucleotide derivative in which ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond
  • uracil in oligonucleotide is C ⁇
  • Oligonucleotide derivatives substituted with 5-propynyluracil oligonucleotide derivatives wherein uracil in oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil
  • cytosine in oligonucleotide is C-5 propynylcytosine
  • oligonucleotide derivatives in which the cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine
  • oligonucleotide derivatives in which the ribose in DNA is replaced with 2'-O-prop
  • a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell .Probes 8: 91-98 (1994)).
  • nucleic acid is also used interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide.
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged in a certain order on the chromosome. A gene that defines the primary structure of a protein is called a structural gene, and a gene that affects its expression is called a regulatory gene. As used herein, “gene” may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid”.
  • homology of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally “having homology” means that the degree of identity or similarity is high. Say. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes are homologous.
  • a “homolog” or “homologous gene product” is a protein in another species, preferably a mammal, that performs the same biological function as the protein component of the complex further described herein. Means. Such homologues may also be referred to as “ortholog gene products”. Algorithms for detecting orthologous gene pairs from humans and mammals or other species use the entire genome of these organisms. First, paired best hits are recovered using the full Smith-Waterman parallel of the predicted protein. To further improve reliability, paired best hits including Drosophila melanogaster and C. elegans proteins may be used to form clusters of these pairs. Such an analysis is provided, for example, in Nature, 2001, 409: 860-921.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by a generally recognized one letter code.
  • BLAST is a sequence analysis tool.
  • the identity search can be performed, for example, using NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12.).
  • the identity value usually refers to a value when the BLAST is used and aligned under default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is the identity value. When identity is evaluated in a plurality of areas, the highest value among them is set as the identity value. Similarity is a numerical value calculated for similar amino acids in addition to identity.
  • polynucleotide hybridizing under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art. Such a polynucleotide can be obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method or the like using a polynucleotide selected from among the polynucleotides of the present invention as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then a 0.1 to 2-fold concentration was obtained. Means a polynucleotide that can be identified by washing the filter under the condition of 65 ° C.
  • SSC serum-sodium citrate
  • composition of 1-fold concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate.
  • Hybridization was performed in Molecular Cloning 2nd ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford, etc.
  • sequence containing only the A sequence or only the T sequence is preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions.
  • a polypeptide (for example, transthyretin) used in the present invention is a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule encoding a polypeptide particularly described in the present invention.
  • the polypeptide encoded by is also encompassed.
  • These low stringency conditions include 35% formamide, 5 ⁇ SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% BSA, 100 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, and 10% ( (Weight / volume) In a buffer containing dextran sulfate, hybridization was performed at 40 ° C.
  • a “purified” substance or biological factor refers to a substance from which at least a part of the factor naturally associated with the biological factor has been removed.
  • the purity of a biological agent in a purified biological agent is higher (ie, enriched) than the state in which the biological agent is normally present.
  • the term “purified” as used herein is preferably at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight, Means the presence of the same type of biological agent.
  • the materials used in the present invention are preferably “purified” materials.
  • a “corresponding” amino acid or nucleic acid has or has the same action as a predetermined amino acid or nucleotide in a reference polypeptide or polynucleotide in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule.
  • a reference polypeptide or polynucleotide in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule in particular, in the case of an enzyme molecule, it means an amino acid that is present at the same position in the active site and contributes similarly to the catalytic activity.
  • an antisense molecule can be a similar part in an ortholog corresponding to a particular part of the antisense molecule.
  • Corresponding amino acids are, for example, cysteinylated, glutathione, SS bond formation, oxidation (eg, oxidation of methionine side chain), formylation, acetylation, phosphorylation, glycosylation, myristylation, etc.
  • the corresponding amino acid can be an amino acid responsible for dimerization.
  • Such “corresponding” amino acids or nucleic acids may be regions or domains spanning a range. Thus, in such cases, it is referred to herein as a “corresponding” region or domain.
  • a “corresponding” gene eg, a polynucleotide sequence or molecule
  • a gene for example, a polynucleotide sequence or a molecule
  • a gene corresponding to a gene can be an ortholog of that gene. Therefore, RPG49 and R-spondins of mouse and rat can find corresponding RPG49 and R-spondins in humans, respectively.
  • Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art.
  • a corresponding gene in an animal is a reference gene of the corresponding gene (for example, RPG49, R-spondins, shh etc.) is represented by SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, It can be found by searching a sequence database of the animal (for example, human, rat) using the sequence of 9, 11, etc. as a query sequence.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n ⁇ 1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n).
  • the length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose.
  • the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg 11 etc.) are also suitable as lower limits obtain.
  • examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides.
  • Non-integer lengths may also be appropriate as a lower limit.
  • a fragment falls within the scope of the present invention as long as the full-length fragment functions as a marker, as long as the fragment itself also functions as a marker.
  • the term “activity” refers herein to the function of a molecule in the broadest sense. Activity is not intended to be limiting, but generally includes the biological function, biochemical function, physical function or chemical function of a molecule. Activity activates, promotes, stabilizes, inhibits, suppresses, or destabilizes, for example, enzyme activity, the ability to interact with other molecules, and the function of other molecules Ability, stability, and ability to localize to specific intracellular locations. Where applicable, the term also relates to the function of the protein complex in the broadest sense.
  • biological function refers to a specific function that a gene, nucleic acid molecule or polypeptide may have in vivo when referring to a gene or a nucleic acid molecule or polypeptide related thereto.
  • the antibody include, but are not limited to, generation of specific antibodies, enzyme activity, and imparting resistance.
  • GPR49 / LGR5 or the like can recognize R-spondin, but is not limited thereto.
  • a biological function can be exerted by “biological activity”.
  • biological activity refers to activity that a certain factor (eg, polynucleotide, protein, etc.) may have in vivo, and exhibits various functions (eg, transcription promoting activity). For example, an activity in which another molecule is activated or inactivated by interaction with one molecule. When two factors interact, their biological activity depends on the binding between the two molecules and the resulting biological change, eg, when one molecule is precipitated with an antibody, the other When molecules also coprecipitate, the two molecules are considered bound. Therefore, seeing such coprecipitation is one of the judgment methods. For example, when a factor is an enzyme, the biological activity includes the enzyme activity.
  • an agent when an agent is a ligand, the ligand includes binding to the corresponding receptor.
  • biological activity can be measured by techniques well known in the art.
  • “activity” indicates or reveals binding (either direct or indirect); affects the response (ie, has a measurable effect in response to some exposure or stimulus),
  • expression of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo to take another form.
  • a gene, polynucleotide or the like is transcribed and translated into a polypeptide form.
  • transcription and production of mRNA can also be an aspect of expression.
  • polypeptide forms may be post-translationally processed (derivatives as referred to herein).
  • the expression level of GPR49 / LGR5 can be determined by any method.
  • the expression level of GPR49 / LGR5 can be determined by evaluating the amount of GPR49 / LGR5 mRNA, the amount of GPR49 / LGR5 protein, and the biological activity of GPR49 / LGR5 protein.
  • the amount of GPR49 / LGR5 mRNA or protein can be determined by a method as described herein.
  • the “functional equivalent” refers to any object having the same target function but different structure from the target original entity. Therefore, when referring to “R-spondins or functional equivalents thereof” or “group consisting of R-spondins and functional equivalents thereof”, in addition to R-spondins themselves, mutants of R-spondins or Variants (for example, amino acid sequence variants, etc.) that have differentiation control and / or proliferation promoting action of eye cells, etc., and at the time of action, R-spondins themselves or of these R-spondins Including those that can be changed to mutants or variants (including, for example, R-spondins themselves or nucleic acids encoding R-spondins variants or variants, and vectors, cells, etc. containing the nucleic acids) It is understood that In the present invention, it is understood that the functional equivalent of R-spondin can be used in the same manner as R-spondin even if not specifically mentioned.
  • GPR49 / LGR5 or a functional equivalent thereof or “group consisting of GPR49 / LGR5 and a functional equivalent thereof”, in addition to GPR49 / LGR5 itself, a mutant or variant of GPR49 / LGR5 (for example, Amino acid sequence variants, etc.) that have differentiation control and / or proliferation promoting action of ocular cells, etc., or those that have a function as a marker described herein, and at the time of action, GPR49 / LGR5 itself, or a GPR49 / LGR5 mutant or variant thereof (for example, nucleic acid encoding GPR49 / LGR5 itself or GPR49 / LGR5 variant or variant, and a vector containing the nucleic acid) , Including cells, etc.) .
  • the functional equivalent of GPR49 / LGR5 can be used in the same manner as GPR49 / LGR5 even if not specifically mentioned.
  • SHH SONIC HEDGEHOG
  • group consisting of SONIC HEDGEHOG (SHH) and a functional equivalent thereof in addition to SHH itself, a variant or modified form of SHH (for example, Amino acid sequence variants, etc.) that have differentiation control and / or proliferation promoting action of ocular cells, etc., or those that have a function as a marker described herein, and at the time of action, Including SHH itself or one that can be changed to a mutant or variant of SHH (including, for example, nucleic acid encoding SHH itself or a variant or variant of SHH, and vectors, cells, etc. containing the nucleic acid) It is understood that In the present invention, it is understood that the functional equivalent of SHH can be used in the same manner as SHH even if not specifically mentioned.
  • a factor that suppresses GPR49 / LGR5 or a functional equivalent thereof or “a group consisting of a factor that suppresses GPR49 / LGR5 and a functional equivalent thereof”, in addition to the factor itself that suppresses GPR49 / LGR5, GPR49 / LGR5 suppressor mutants or modifications (for example, synthetic modifications, etc.) that change so as to have differentiation-controlling and / or proliferation-promoting action of eye cells etc. at the time of action (change)
  • GPR49 / LGR5 suppressor mutants or modifications for example, synthetic modifications, etc.
  • those that can be changed to factors that suppress GPR49 / LGR5 for example, precursors such as esters or prodrugs
  • a functional equivalent of a factor that suppresses GPR49 / LGR5 can be used in the same manner as a factor that suppresses GPR49 / LGR5 even if not specifically mentioned.
  • an agonist of SHH eg, Frizzled family agonist such as purmorphamine
  • an agonist of SHH eg, Frizzled family agonist such as purmorphamine
  • an SHH agonist for example, Frizzled family agonist such as purmorphamine
  • an SHH agonist for example, Frizzled family agonist such as purmorphamine
  • an SHH agonist for example, Frizzled family agonist such as purmorphamine
  • an SHH agonist for example, Frizzled family agonist such as purmorphamine
  • an SHH agonist for example, Frizzled family agonist such as purmorphamine mutants or variants (E.g., synthetic variants) that change at the time of action to have differentiation control and / or growth-promoting action of eye cells etc.
  • SHH agonists e.g., purmorphamine etc.
  • Friz led family agonist itself or an agonist or a variant of this SHH agonist (eg Frizzled family agonist such as purmorphamine) (eg precursor or prodrug such as ester))
  • SHH agonists e.g, Frizzled family agonists such as purmorphamine
  • functional equivalents of SHH agonists may be SHH agonists (eg, Frizzled family such as purmorphamine), even if not specifically mentioned. It is understood that it can be used in the same way as an agonist).
  • agonist refers to a substance that causes a biological action of a receptor to be exerted on a target entity (for example, a receptor).
  • target entity for example, a receptor
  • agonists also called ligands
  • synthesized ones and modified ones can be mentioned.
  • Antagonist refers to a substance that inhibits the biological action of a target entity (eg, receptor). In addition to those that inhibit competitively with agonists (or ligands), there are those that inhibit non-competitively. It can also be obtained by modifying the agonist. Antagonists can be included in the concept of inhibitors or suppressors because they inhibit physiological phenomena.
  • a factor that inhibits refers to a factor that can temporarily or permanently reduce or eliminate the function of a target GPR49 / LGR5 or the like.
  • factors include, but are not limited to, antibodies, antigen-binding fragments thereof, derivatives thereof, nucleic acids such as RNAi factors such as antisense and siRNA, and the like.
  • search refers to finding another nucleobase sequence having a specific function and / or property using a nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods.
  • Electronic search includes BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444-). 2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, microarrays affixed to glass plates (microarray assays), PCR and in situ hybridization, etc. It is not limited to. In the present specification, it is intended that the gene used in the present invention should include a corresponding gene identified by such an electronic search or biological search.
  • an amino acid sequence having one or more amino acid insertions, substitutions or deletions, or those added to one or both ends can be used.
  • insertion, substitution or deletion of one or a plurality of amino acids, or addition to one or both ends thereof in an amino acid sequence means a well-known technical method such as site-directed mutagenesis. It means that a modification has been made by substitution of a plurality of amino acids to the extent that can occur naturally by a method or by natural mutation.
  • GPR49 / LGR5, R-spondins, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and other hedgehog pathway factors, LRP6, ⁇ -catenin and other Wnt pathway factors such as 1-30 amino acid sequences, preferably 1 ⁇ 20, more preferably 1-9, still more preferably 1-5, particularly preferably 1-2 amino acids inserted, substituted, or deleted, or added to one or both ends Can be things.
  • the modified amino acid sequence is preferably such that the amino acid sequence is GPR49 / LGR5, R-spondins, hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2, Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin, etc.
  • the amino acid sequence may have an amino acid sequence having one or more (preferably one or several or 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions.
  • conservative substitution means substitution of one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the function of the protein. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like.
  • Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the term “marker (substance or gene)” refers to whether or not there is a certain state (eg, disease state, disorder state, proliferative ability, level of differentiation state, presence or absence, etc.). This refers to the substance that will be tracked. Such markers can include genes, gene products, metabolites, enzymes, and the like. In the present invention, detection, diagnosis, preliminary detection, prediction or pre-diagnosis for a certain condition (eg, a disease such as differentiation disorder) is a drug, agent, factor or means specific for the marker associated with the condition, or It can be realized by using a composition, kit or system containing them.
  • “gene product” refers to a protein or mRNA encoded by a gene. It has now been found that gene products that have not been shown to be associated with ocular cells (ie GPR49 / LGR5 etc.) can be used as indicators of ocular cell differentiation.
  • the “nerve cell” is used in a broad sense and means any cell contained in an organ of the nervous system, and particularly includes cells derived from neural crest cells (for example, corneal endothelial cells and the like). It is understood.
  • eye cell is used in a broad sense and means any cell present in the eye, and any cell present in the eyelid, sclera, cornea, uvea, lens, vitreous, retina, optic nerve. Cells are included.
  • cornea endothelial cell is used in the usual meaning used in the art.
  • the cornea is one of the layered tissues constituting the eye, is transparent, and is located in the portion closest to the outside world.
  • the cornea is said to be composed of five layers in order from the outside (body surface) in humans, and is composed of the corneal epithelium, Bowman's membrane (outer boundary line), eigenlayer, Desme's membrane (inner boundary line), and corneal endothelium from the outside Is done.
  • portions other than the epithelium and endothelium are sometimes collectively referred to as “corneal stroma” and are referred to as such in this specification.
  • corneal tissue is used in a normal sense and refers to the tissue itself constituting the cornea.
  • corneal tissue all of the corneal epithelium, Bowman's membrane (outer border), lamina basement, Descemet's membrane (inner border), and corneal endothelium that make up the cornea (in humans, in other animals, Depending on the corresponding category, all or part of the cornea may be missing, or other tissues (sclera) in addition to the cornea may be included. There is. Therefore, it can be said that the cornea or cornea piece is an embodiment of the corneal tissue.
  • proliferation ability refers to the ability of cells to proliferate.
  • state of growth refers to the possibility of growth at steady state.
  • steady state is a normal condition in a living body and a state in which the homeostasis of the living body is maintained. Such a state can be easily determined by those skilled in the art. For example, it can be confirmed by cell density analysis that the cell density is substantially constant and does not change, or that no expression of a cell proliferation marker is observed.
  • “highly proliferating ability” means having a proliferating ability in a steady state.
  • proliferation promotion means that the growth state of a certain cell is promoted. If the target cell has not grown, it can be considered to promote growth if it begins to grow as much as possible, and in the case of a cell that has already proliferated, if the growth level is maintained or higher, preferably it is increased. Corresponds to growth promotion.
  • differentiation ability refers to the ability of cells to differentiate. In that sense, a cell having a differentiation potential is “undifferentiated”. Stem cells (embryonic stem cells, germ cells, iPS cells, tissue stem cells, etc.) can be further differentiated and therefore can be referred to as having differentiation potential.
  • undifferentiated cell refers to any cell capable of differentiation.
  • undifferentiated cells include stem cells as well as cells that have differentiated to a certain extent but can still differentiate.
  • differentiation inhibition refers to inhibition of differentiation. If differentiation is not performed, it is understood that both differentiation levels that do not change and differentiation levels that progress in the direction of undifferentiation are encompassed by “inhibition of differentiation”.
  • differentiation inhibitor and / or growth promoter refers to a substance or factor that can suppress the differentiation and / or promote proliferation of a target cell.
  • differentiation suppressant and / or growth promoter refers to R-spondins, SHH, SHH agonists (for example, Frizzled family agonists such as purmorphamine), factors that suppress GPR49 / LGR5 (Antagonists) and at least one selected from the group consisting of their functional equivalents.
  • stem cell refers to a cell having both the ability to differentiate into cells of multiple lineages (multipotency) and the ability to maintain pluripotency even after cell division (self-renewal ability).
  • Stem cells include embryonic stem cells, germ cells, iPS cells, tissue stem cells and the like.
  • the “subject” refers to a subject (for example, a living organism such as a human or an organ (eye) or a cell taken out from a living organism) as a subject of diagnosis or detection of the present invention.
  • sample refers to any substance obtained from a subject or the like, and includes, for example, eye cells. Those skilled in the art can appropriately select a preferable sample based on the description of the present specification.
  • colony forming ability refers to the ability to form colonies when referring to cells.
  • the colony-forming ability can be determined using a colony-forming test of cells under culture conditions known in the art as a standard test method.
  • Ki-67 is a cell proliferation marker and is typically a cell cycle-related nucleoprotein represented by accession number P46013. In proliferating cells, it is expressed in the G 1 phase, S phase, G 2 phase, and M phase, but is not present in the G 0 phase where growth is paused, so it is used as a marker for cell proliferation and cell cycle. Further, since a positive correlation is seen between the expression level of Ki-67 and the malignancy of the tumor, it is also useful as a marker for detecting proliferating cells in the tumor tissue.
  • Ki-67 positive means that Ki-67, which is a cell marker, is expressed in target cells.
  • BrdU is an abbreviation of brominated deoxyuridine, and is incorporated as an analog of dTTP during DNA synthesis. Therefore, DNA (cell nucleus) incorporating BrdU is incorporated into BrdU incorporated into DNA. It can be detected with a specific antibody.
  • BrdU positive means that the cell marker BrdU is expressed in the target cell.
  • drug drug
  • drug may also be a substance or other element (eg energy such as light, radioactivity, heat, electricity).
  • Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, RNA such as mRNA), poly Saccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (for example, hormones, ligands, signaling substances, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (for example, small molecule ligands, etc.)) , These complex molecules are included, but not limited thereto.
  • a polynucleotide having a certain sequence homology to the sequence of the polynucleotide (for example, 70% or more sequence identity) and complementarity examples include, but are not limited to, a polypeptide such as a transcription factor that binds to the promoter region.
  • Factors specific for a polypeptide typically include an antibody specifically directed against the polypeptide or a derivative or analog thereof (eg, a single chain antibody), and the polypeptide is a receptor.
  • specific ligands or receptors in the case of ligands, and substrates thereof when the polypeptide is an enzyme include, but are not limited to.
  • detection agent refers to any drug that can detect a target object in a broad sense.
  • diagnostic agent refers to any drug capable of diagnosing a target condition (for example, a disease) in a broad sense.
  • therapeutic agent refers to any drug that can treat a target condition (for example, a disease) in a broad sense.
  • prophylactic agent refers to any drug that can prevent a target condition (for example, a disease) in a broad sense.
  • progression preventive agent refers to any drug capable of preventing the progression of the state of a disease or the like.
  • in vivo refers to the inside of a living body. In a particular context, “in vivo” refers to the location where a target substance is to be placed.
  • in vitro refers to a state in which a part of a living body is excised or released “outside the living body” (for example, in a test tube) for various research purposes. A term that contrasts with in vivo.
  • ex vivo refers to a series of operations ex vivo when a certain treatment is performed outside the body but is intended to be returned to the body afterwards. Also in the present invention, an embodiment in which cells in the living body are treated with the drug of the present invention and returned to the patient can be envisaged.
  • the present invention is a group consisting of R-spondins, SHH, an SHH agonist (for example, Frizzled family agonist such as purmorphamine), a factor that suppresses GPR49 / LGR5, and their functional equivalents
  • SHH SHH
  • SHH agonist for example, Frizzled family agonist such as purmorphamine
  • GPR49 / LGR5 a factor that suppresses GPR49 / LGR5
  • An agent for inhibiting cell differentiation and / or promoting proliferation comprising at least one selected from the above, is provided.
  • the cells targeted by the present invention are not particularly limited, but include eye cells, neural cells including neural crest cell-derived cells (including corneal endothelial cells), conjunctival epithelium, amniotic epithelium, oral mucosal epithelium, nasal Examples include epithelial cells such as mucosal epithelium and corneal epithelial cells.
  • the cells targeted by the present invention are ocular cells.
  • Eye cells targeted by the present invention may include, but are not limited to, retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, corneal endothelial cells, and the like.
  • R-spondins is, for example, a mutant or variant (eg, amino acid sequence variant) of R-spondins, and has an action of controlling differentiation and / or proliferation of eye cells and the like.
  • Those that can be converted to R-spondins themselves or variants or variants of these R-spondins at the time of action eg R-spondins themselves or variants or variants of R-spondins
  • a vector containing the nucleic acid, a cell, etc. includes a mutant or modified form of SHH (for example, an amino acid sequence modified form) that has an action of controlling differentiation and / or promoting proliferation of ocular cells, etc.
  • SHH agonists include variants or variants (eg, synthetic) of SHH agonists (eg, Frizzled family agonists such as purmorphamine).
  • Frizzled family agonists such as purmorphamine or those that can be changed to mutants or variants of this SHH agonist (for example, Frizzled family agonists such as purmorphamine) (for example, esters) Precursor of Other pro-drugs) are included.
  • Functional equivalents of factors that inhibit GPR49 / LGR5 include mutants or variants (eg, synthetic variants) of factors that inhibit GPR49 / LGR5, and differentiation of ocular cells and the like at the time of action.
  • Those that change so as to have a regulatory and / or growth-promoting action are included.
  • the R-spondins used in the present invention include at least one selected from R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, and R-spondin 4.
  • the R-spondins used in the present invention include R-spondin 1.
  • the eye cells targeted by the present invention are cells that are not proliferating in a steady state.
  • the present invention exhibits an unprecedented effect in that even cells that are not proliferating in a steady state can be proliferated by the present invention. .
  • the eye cell targeted by the present invention comprises at least one cell selected from retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, and corneal endothelial cells.
  • a corneal endothelial cell is a cell that hardly proliferates in a steady state, and the fact that it can be proliferated has an extremely important meaning in terms of treatment or prevention of ophthalmic diseases.
  • the ocular cells targeted by the present invention comprise corneal endothelial cells.
  • other cells such as corneal epithelial cells are proliferating only a small part of the basal cells, and most of them are not proliferating. Therefore, retinal cells other than corneal endothelial cells, vitreous bodies Even cells, corneal epithelial cells, and corneal parenchymal cells can be said to have extremely important meanings from the viewpoint of treatment or prevention of ophthalmic diseases.
  • the eye cells targeted by the present invention include primate corneal endothelial cells. In an even more preferred embodiment, the eye cells targeted by the present invention comprise human corneal endothelial cells.
  • cells targeted by the present invention are in a confluent state.
  • eye cells eg, eye cells
  • no technology has been reported so far that allows cells in such a confluent state to grow. Therefore, such a technique is extremely useful from the viewpoint of treatment or prevention of a disease or disorder, in that it is possible to grow cells of an unprecedented category.
  • the present invention can utilize corneal endothelial cells in a confluent state.
  • a confluent state it has been observed that in normal culture, the cell morphology becomes fibroblast-like.
  • One of the important features of the present invention is the ability to further suppress proliferation and differentiation even in confluent corneal endothelial cells, and important prognostic determinants after transplantation for clinical application of cultured corneal endothelial transplantation This means that cells with high corneal endothelial density can be transplanted.
  • the preferred concentration in this case is not limited to this, but when R-spondin 1 is used, it can be about 1 ng / ml to about 100 ng / ml, preferably about 10 ng / ml to about 100 ng / ml. And more preferably about 10 ng / ml.
  • the cell density is preferably about 570 cells / mm 2 or more, about 700 cells / mm 2 or more, about 800 cells / mm 2 or more, and can be about 1000 cells / mm 2 or more.
  • culture refers to a culture produced by culturing cells such as corneal endothelium. Therefore, the “corneal endothelium culture” refers to a culture of corneal endothelium, and usually refers to a culture that exists in a state different from that in vivo.
  • corneal endothelial culture obtained by the conventional culture method only a confluent culture of about 500 cells / mm 2 could be obtained at most as shown in Examples. Therefore, from the viewpoint of culture, it can be said that such a cell density could not be achieved especially for those cultured or passaged for a long period of time. That is, the density of corneal endothelial cells is easily reduced by culturing.
  • Corneal endothelial density is one of the most important indicators of health in clinical terms. Therefore, culturing at a high density is important from the viewpoint of regenerative medicine.
  • it can be administered to a living body and can be an extremely important therapeutic agent. In that sense, it is important that the density reduced by the usual culture method could be increased again.
  • the normal value of the human corneal endothelium in the living body is about 2500 to 3000 / mm 2 , and the present invention is also meaningful in that a technique for bringing the cell density of the culture close to or exceeding this can be provided. .
  • cells targeted by the present invention can be corneal tissue itself.
  • corneal tissue itself can be a cornea piece.
  • the present invention provides a culture of corneal endothelium, wherein the corneal endothelium is present at a density higher than the cell density in a confluent state.
  • the Ki67 positive cells are present at a rate of about 4% or more, more preferably at a rate of about 7% or more, and even more preferably at a rate of about 10% or more. Since the normal abundance ratio is about 1%, such a corneal tissue containing Ki67 positive cells, that is, proliferating cells, has not existed in the past, and the value as a novel therapeutic graft can also be found. it can.
  • the density of the corneal endothelial cells is about 4000 cells / mm 2 or more, more preferably about 4500 cells / mm 2 or more, and still more preferably about 5000 cells / mm 2 or more.
  • the normal value of human corneal endothelium in the living body is about 2500-3000 / mm 2.
  • the present invention provides a composition for cell storage or cell culture, comprising the differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent of the present invention.
  • the differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent used in the present invention may be any differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent described in the section (Suppression of differentiation and / or proliferation) and other sections.
  • the cells targeted by the present invention are intended for cell preservation or cell culture, and in any cell embodiment described in the (Suppression of differentiation and / or proliferation promotion) section and other sections. It is understood that it is good.
  • the cells targeted by the present invention are not particularly limited, but are intended for cell preservation or cell culture, and include cells derived from ocular cells and neural crest cells (including corneal endothelial cells). Examples thereof include neurons, epithelial cells such as conjunctival epithelium, amniotic epithelium, oral mucosal epithelium, nasal mucosal epithelium, corneal epithelial cells, and the like.
  • the cells targeted by the present invention are ocular cells.
  • the eye cells targeted by the present invention are intended for cell preservation or cell culture, and may include retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, corneal endothelial cells, and the like. It is not limited to.
  • the eye cell targeted by the present invention is a cell that is not proliferating in a steady state.
  • the present invention has been conventionally used in terms of cell preservation or cell culture in that even cells that are not proliferating in a steady state can be grown according to the present invention. It has no effect.
  • the ocular cells targeted by the present invention are selected from retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells and corneal endothelial cells. At least one type of cell.
  • corneal endothelial cells are cells that hardly proliferate in a steady state, and can be proliferated from the viewpoint of cell preservation or cell culture. This is extremely important from the viewpoint of treatment or prevention of ophthalmic diseases.
  • the ocular cells targeted by the present invention comprise corneal endothelial cells.
  • corneal epithelial cells are proliferating only a small part of the basal cells, and most of them are not proliferating. Therefore, retinal cells other than corneal endothelial cells, vitreous bodies Even cells, corneal epithelial cells, and corneal parenchymal cells are extremely important in terms of cell preservation or cell culture from the viewpoint of treatment or prevention of ophthalmic diseases by cell therapy used as a result. It can be said that there is.
  • the eye cells targeted by the present invention include primate corneal endothelial cells.
  • the eye cells targeted by the present invention comprise human corneal endothelial cells.
  • the cells targeted by the present invention are in a confluent state.
  • Such a technique capable of growing cells in a confluent state is very significant from the viewpoint of cell preservation or cell culture. Therefore, such a technique is capable of growing cells of an unprecedented category in that cell storage or cell culture is performed, and the resulting cells are used for treatment or prevention of diseases or disorders. From the viewpoint, it is extremely useful.
  • the present invention provides a composition for corneal preservation or corneal endothelial cell culture, comprising the differentiation inhibitor and / or proliferation promoter of the present invention.
  • a composition contains at least one R-spondin, SHH, or SHH agonist (for example, an agonist of the Frizzled family such as purmorphamine, etc.), which is an active ingredient of the differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent of the present invention. ),
  • a factor that suppresses GPR49 / LGR5 or a functional equivalent thereof may be used as it is, or may be prepared containing other components.
  • the present invention provides a method for preserving or culturing cells using the agent for suppressing differentiation and / or proliferation of the present invention.
  • the present invention provides a method of preserving the cornea or culturing corneal endothelial cells, comprising the step of using the differentiation inhibiting and / or proliferation promoting agent of the present invention.
  • the differentiation inhibiting and / or proliferation promoting agent contained in the composition for corneal preservation or corneal endothelial cell culture of the present invention may employ any embodiment described in (Differentiation inhibiting and / or proliferation promoting). It should be understood that it can be done.
  • corneal endothelial cells normally has at least characteristics such as a function inherent in corneal endothelial cells (also referred to as “normal function” in the present specification). One can be determined by checking whether it is maintained.
  • Such functions include ZO-1 and Na + / K + -ATPase, adaptability to corneal transplantation (Matsubara M, Tanishima T: Wound-healing of the endothermic in the Netherlands, the Morphology 1982, 26: 264-273; Matsubara M, Tanishima T: Wound-healing of corneal endothermic in monkey: an autoradiographic study, Jn J Othalmol 1983, 27: 44 in prime cornea, Exp Eye Res 1975, 21: 113-124 and VanHorn DL, Sendele DD, Seideman S, Buco PJ: Regenerative capacity of the concealed end of the end.
  • it is not limited to them.
  • normal function can be an index indicating that it is necessary or sufficient for realizing corneal transplantation.
  • normalization can be determined by observing changes in expression using functional proteins in corneal endothelial cells such as ZO-1 and Na + / K + -ATPase as indicators, or by transplanting to monkeys and the like. It can be done by checking if it wears and functions.
  • the determination method by transplantation can be performed as follows. That is, corneal endothelium is cultured on type I collagen to produce a cultured corneal endothelium sheet.
  • a corneal limbus of cynomolgus monkey is incised 1.5 mm, a surgical instrument made of silicon is inserted into the anterior chamber, and corneal endothelial cells are mechanically scraped to prepare a bullous keratopathy model. Subsequently, the corneal limbus is incised 5-6 mm, the cultured corneal endothelium sheet is inserted into the anterior chamber, and the anterior chamber is replaced with air to adhere the sheet to the corneal endothelium surface.
  • the therapeutic effect of bullous keratopathy by transplanting the cultured corneal endothelium sheet can be evaluated by evaluating the corneal transparency with a slit lamp microscope.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating a cell disorder or preventing the progression of the cell disorder, comprising the agent for suppressing differentiation and / or promoting proliferation of the present invention.
  • the differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent used in the present invention may be any differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent described in the section (Suppression of differentiation and / or proliferation) and other sections.
  • the cells targeted by the present invention are described in the (Suppression of differentiation and / or promotion of proliferation) section and other sections as long as they are intended for treatment of cell damage or prevention of progression of the damage of the cell. It is understood that any cell embodiment may be used.
  • the cells targeted by the present invention are not particularly limited, but may be derived from ocular cells or neural crest cells as long as the purpose is to treat cell damage or prevent progression of the cell damage.
  • nerve cells including cells (including corneal endothelial cells), epithelial cells such as conjunctival epithelium, amniotic epithelium, oral mucosal epithelium, nasal mucosal epithelium, corneal epithelial cells, and the like.
  • the cells targeted by the present invention are ocular cells.
  • Eye cells targeted by the present invention may include, but are not limited to, retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, corneal endothelial cells, and the like.
  • the eye cell targeted by the present invention is a cell that does not proliferate in a steady state.
  • the present invention is directed to the treatment of cellular disorders or the ability of cells to be propagated by the present invention even if the cells are not proliferating in a steady state. It has a significant effect in that it can prevent the progression of disability.
  • the eye cell targeted by the present invention is at least one cell selected from retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, and corneal endothelial cells.
  • a corneal endothelial cell is a cell that hardly proliferates in a steady state, and can be proliferated from the viewpoint of treating a cell disorder or preventing the progression of the cell disorder. It is extremely important from the viewpoint of treatment or prevention.
  • the ocular cells targeted by the present invention comprise corneal endothelial cells.
  • corneal epithelial cells are proliferating only a small part of the basal cells, and most of them are not proliferating. Therefore, retinal cells other than corneal endothelial cells, vitreous bodies Even cells, corneal epithelial cells, and corneal parenchymal cells are extremely important in terms of treatment or prevention of ophthalmic diseases in light of the treatment of cell disorders or the prevention of progression of such cell disorders. It can be said.
  • the eye cell targeted by the present invention comprises primate corneal endothelial cells.
  • the eye cells targeted by the present invention comprise human corneal endothelial cells.
  • the cells (for example, eye cells) targeted by the present invention are in a confluent state.
  • Such a technique capable of proliferating cells in a confluent state is also significant from the viewpoint of treating a cell disorder or preventing the progression of the cell disorder. Therefore, such a technique is extremely useful from the viewpoint of treating a cell disorder or preventing the progression of the disorder of a cell, in that it can grow a cell of an unprecedented category. It is.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating corneal endothelial cell disorder or preventing progression of corneal endothelial cell disorder, comprising the differentiation inhibitor and / or proliferation promoter of the present invention.
  • the differentiation inhibiting and / or proliferation promoting agent contained in the pharmaceutical composition of the present invention can adopt any embodiment described in (Differentiation inhibiting and / or proliferation promoting).
  • treatment refers to prevention of worsening of a disease or disorder when it becomes such a condition or disease (eg, corneal disease), preferably maintenance of the current situation. Preferably, it means reduction, and more preferably elimination.
  • a condition or disease eg, corneal disease
  • prevention means that a certain disease or disorder is prevented from becoming such a state before becoming such a state. Diagnosis can be performed using the drug of the present invention, and for example, a corneal disease or the like can be prevented using the drug of the present invention, or countermeasures for prevention can be taken.
  • the adaptability to corneal transplantation can be carried out by transplanting cultured cells by mechanically scraping the corneal endothelium as a bullous keratosis model even in laboratory animals such as rabbits.
  • a primate cynomolgus monkey for example, at least 1 month, preferably at least 2 months, more preferably at least 3 months, even more preferably at least 6 months, even more preferably Assess adaptability after at least 12 months. Confirmation of transplantation adaptability in primates such as monkeys is particularly important in human application.
  • various delivery systems are known, and such systems can be used to administer the therapeutic agents of the present invention, such systems include Encapsulation in, for example, liposomes, microparticles, and microcapsules: use of recombinant cells capable of expressing therapeutic agents (eg, polypeptides), use of receptor-mediated endocytosis; retroviral vectors or other vectors As part of this, there is the construction of therapeutic nucleic acids.
  • Introduction methods include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes.
  • an inhaler or nebulizer can be used with an aerosolizing agent and can be administered with other biologically active agents. Administration can be systemic or local.
  • the present invention when used in the ophthalmic area, it can be further administered by any suitable route, such as by direct injection into the eye.
  • the nucleic acid is administered in vivo by constructing the nucleic acid as part of a suitable nucleic acid expression vector and administering it to be present in a cell. It is also possible to facilitate the expression of the encoded protein, for example by the use of retroviral vectors or by direct injection or by the use of microparticle guns or the nucleic acids are lipids, cell surface receptors or This can be done by coating with a transfection agent or by administering a nucleic acid linked to a tag sequence known to enter the nucleus. Alternatively, nucleic acid therapeutics can be introduced into cells and incorporated by homologous recombination into host cell DNA for expression.
  • the medicament, therapeutic agent, prophylactic agent, etc. of the present invention comprises a therapeutically effective amount of the therapeutic agent or active ingredient, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a licensed or otherwise recognized pharmacopoeia of a government for use in animals, and more particularly in humans, by a government supervisory authority. It means that it is enumerated.
  • carrier refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic agent is administered.
  • Such carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including but not limited to those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, including but not limited to peanut oil, soybean oil, minerals Oil, sesame oil, etc. are included.
  • Water is a preferred carrier when the drug is administered orally.
  • Saline and aqueous dextrose are preferred carriers when the pharmaceutical composition is administered intravenously.
  • saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions are used as liquid carriers for injectable solutions.
  • Suitable excipients include light anhydrous silicic acid, crystalline cellulose, mannitol, starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, chloride Sodium, nonfat dry milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylacetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid triglyceride, polyoxyethylene hardening Castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts and the like are included.
  • compositions can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents, if desired.
  • These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. It is also possible to formulate the composition as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulations may also include standard carriers such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate. Examples of suitable carriers are E.I. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mark Publishing Company, Easton, USA).
  • compositions contain a therapeutically effective amount of the therapeutic agent, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient.
  • the formulation must be suitable for the mode of administration.
  • surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity Accelerators, flavoring agents and the like may be included.
  • the composition can be formulated as a pharmaceutical composition adapted for administration to humans according to known methods.
  • compositions for injection administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer.
  • the composition can also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lidocaine to ease pain at the site of the injection.
  • the ingredients are supplied separately or mixed together in a unit dosage form, for example in a sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent, lyophilized powder or water-free concentration Can be supplied as a product.
  • the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline.
  • an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration.
  • the pharmaceutical agent, therapeutic agent, or prophylactic agent of the present invention can be formulated as a neutral type, salt type, or other prodrug (for example, ester).
  • Pharmaceutically acceptable salts include those formed with free carboxyl groups derived from hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine And those formed with free amine groups such as those derived from, and those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxide, and the like.
  • the amount of the therapeutic agent of the invention effective for the treatment of a particular disorder or condition can vary depending on the nature of the disorder or condition, but can be determined by those skilled in the art by standard clinical techniques based on the description herein. Furthermore, in some cases, in vitro assays can be used to help identify optimal dosage ranges.
  • the exact dose to be used in the formulation can also vary depending on the route of administration and the severity of the disease or disorder and should be determined according to the judgment of the attending physician and the circumstances of each patient. However, suitable dosage ranges for direct administration to the cornea are generally about 1 to 500 micrograms of active ingredient per kilogram body weight, but are not limited thereto, and can be used below or above. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.
  • the “kit” refers to a unit provided with a portion to be provided (eg, therapeutic drug, antibody, label, instructions, etc.) usually divided into two or more compartments.
  • This kit form is preferred when it is intended to provide a composition that should not be provided in a mixed form but is preferably used in a mixed state immediately prior to use.
  • Such a kit preferably includes a provided part (eg, instructions or instructions describing how to use the therapeutic agent or how to treat the reagent).
  • the kit when the kit is used as a reagent kit, the kit usually includes instructions describing how to use the antibody.
  • the “instruction sheet” describes the method for using the present invention for a doctor or other user.
  • This instruction manual includes a word indicating that the detection method of the present invention, how to use a diagnostic agent, or administration of a medicine or the like is given.
  • the instruction sheet may include a word for instructing administration (for example, by injection) to skeletal muscle as an administration site.
  • This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national supervisory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc. in the United States) where the present invention is implemented, and is approved by the supervisory authority. It is clearly stated that it has been received.
  • the instruction sheet is a so-called package insert and is usually provided as a paper medium, but is not limited thereto, and is in the form of, for example, an electronic medium (for example, a home page or e-mail provided on the Internet). But it can be provided.
  • the present invention provides a drug pack or kit comprising one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • a drug pack or kit comprising one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • associated with such containers manufactured, used or sold for human administration by a government agency in a manner prescribed by the government agency that regulates the manufacture, use or sale of a pharmaceutical or biological product. It is also possible to indicate information indicating authorization.
  • the kit of the present invention can also contain an expression vector encoding a protein used as the therapeutic agent, prophylactic agent or pharmaceutical agent of the present invention, and the protein is biologically active after being expressed. It can also be reconstituted to form a complex.
  • a kit preferably also contains the necessary buffers and reagents.
  • such containers may be accompanied by instructions for use of the kit and / or by a government agency in a manner prescribed by the government agency that regulates the manufacture, use or sale of a pharmaceutical or biological product. It is also possible to provide information indicating the authorization of manufacture, use or sale for human administration.
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid of the invention can be administered via liposomes, microparticles, or microcapsules. In various embodiments of the present invention, it may be useful to achieve sustained release of nucleic acids using such compositions.
  • the treatment of the present invention can be performed using the corneal tissue itself prepared using the present invention, for example, a cornea piece.
  • the Ki67 positive cells are present at a rate of about 4% or more, more preferably at a rate of about 7% or more, and even more preferably at a rate of about 10% or more. Since the normal abundance ratio is about 1%, such a corneal tissue containing Ki67 positive cells, that is, proliferating cells, has not existed conventionally, and is directly transplanted from a living body as a new therapeutic graft. Expected to have therapeutic effects beyond corneal tissue.
  • the density of the corneal endothelial cells is about 4000 cells / mm 2 or more, more preferably about 4500 cells / mm 2 or more, and still more preferably about 5000 cells / mm 2 or more.
  • the normal value of human corneal endothelium in the living body is about 2500-3000 / mm 2.
  • the present invention includes a cell cultured using the differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent of the present invention, a therapeutic agent or progression prevention of the disorder of the cell or a disease or disorder caused by the cellular disorder.
  • the differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent used in the present invention may be any differentiation-suppressing and / or growth-promoting agent described in the section (Suppression of differentiation and / or proliferation) and other sections.
  • the cells targeted by the present invention may be any cell embodiment described in the (Suppression of differentiation and / or proliferation promotion) section and other sections.
  • the cells targeted by the present invention are not particularly limited, but include ocular cells, neural cells including neural crest cell-derived cells (including corneal endothelial cells), conjunctival epithelium, amniotic epithelium, oral mucosal epithelium. And epithelial cells such as nasal mucosal epithelium and corneal epithelial cells.
  • the cells targeted by the present invention are ocular cells.
  • Eye cells targeted by the present invention may include, but are not limited to, retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, corneal endothelial cells, and the like.
  • the eye cell targeted by the present invention is a cell that is not proliferating in a steady state.
  • the present invention exhibits an unprecedented effect in that even cells that are not proliferating in a steady state can be proliferated by the present invention. .
  • the eye cell targeted by the present invention is at least one selected from retinal cells, vitreous cells, corneal epithelial cells, corneal parenchymal cells, and corneal endothelial cells. Contains seed cells.
  • a corneal endothelial cell is a cell that hardly proliferates in a steady state, and the fact that it can be proliferated has an extremely important meaning in terms of treatment or prevention of ophthalmic diseases.
  • the ocular cells targeted by the present invention comprise corneal endothelial cells.
  • corneal epithelial cells are proliferating only a small part of the basal cells, and most of them are not proliferating. Therefore, retinal cells other than corneal endothelial cells, vitreous bodies Even cells, corneal epithelial cells, and corneal parenchymal cells can be said to have extremely important meanings from the viewpoint of treatment or prevention of ophthalmic diseases.
  • the eye cells targeted by the present invention include primate corneal endothelial cells.
  • the eye cells targeted by the present invention comprise human corneal endothelial cells.
  • cells targeted by the present invention are in a confluent state.
  • eye cells are in a confluent state.
  • no technology has been reported so far that allows cells in such a confluent state to grow. Therefore, such a technique is extremely useful from the viewpoint of treatment or prevention of a disease or disorder, in that it is possible to grow cells of an unprecedented category.
  • the present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for corneal endothelial cell injury comprising corneal endothelial cells cultured using the differentiation-suppressing and / or proliferation-promoting agent of the present invention.
  • the differentiation inhibitor and / or proliferation promoter contained in the therapeutic agent or progression preventive agent of the present invention is (differentiation suppression and / or proliferation promotion), (treatment or prevention of cell damage), (preservation or culture of cells), etc. It is to be understood that any described embodiment can be employed.
  • the cells contained in the therapeutic agent or progression preventive agent of the present invention have a higher cell density and / or undifferentiated than normal cells present in the natural state. Exist as a population containing more cells. Since a therapeutic agent or a prophylactic agent containing such a cell could not be produced conventionally, the present invention is able to treat a disease or disorder (for example, blistering) that could not be treated or prevented conventionally.
  • Corneal endothelial diseases such as, but not limited to, keratopathy and Fuchs corneal endothelial degeneration, etc. are highly clinically useful in that they can be treated.
  • the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention can be produced by culturing cells such as corneal endothelial cells using the differentiation inhibiting and / or proliferation promoting agent of the present invention.
  • factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, etc. described in another aspect of the present invention
  • factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin or the like
  • the proliferation ability or differentiation level can be determined using differentiation markers such as Ki-67 and BrdU as an index. Determination of proliferative capacity or differentiation level is described in detail elsewhere herein.
  • a method for producing a therapeutic agent or a prophylactic agent comprising the following steps: (A) a step of providing cells such as corneal endothelial cells; (B) differentiation inhibition and / or the present invention. A step of contacting the cell with a growth promoting agent; and a step of culturing the cell contacted in the steps (C) and (B).
  • factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 described in another aspect of the present invention
  • factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin or
  • a step of determining proliferation ability or differentiation level using a known differentiation marker such as Ki-67 or BrdU as an index and selecting a cell having high differentiation ability / proliferation ability may be included.
  • the step of administering the differentiation inhibiting and / or growth promoting agent of the present invention to a subject in need of treatment or the step of administering the therapeutic agent or progression preventing agent of the present invention to a subject in need of treatment.
  • a method of treating or preventing corneal endothelial disease, disorder, or condition is provided. Since the step of administering the therapeutic agent or the prophylactic agent of the present invention to a subject in need of treatment is an act of administering a drug containing cells, it may be referred to as transplantation.
  • a corneal endothelial disease, disorder, or condition can be prevented and / or treated by the administered or transplanted cells healing or repairing damage to the corneal endothelium.
  • cells that can contain corneal endothelial cells can be obtained from mammals including humans, preferably from individuals themselves undergoing transplantation or aborted fetuses.
  • the present invention relates to corneal endothelial cells comprising GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin.
  • GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin.
  • a marker for identifying a cell having a high proliferation ability and / or a differentiation ability is provided.
  • GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and other hedgehog pathway factors, and LRP6, ⁇ -catenin and other Wnt pathway factors are present in vivo, and have high proliferative cells and / or differentiation potential. It has been found in the present invention that it can be used as an indicator marker.
  • the cell having a high proliferation ability targeted by the present invention is an undifferentiated cell.
  • the high proliferative cell targeted by the present invention is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell targeted by the present invention is a human cell.
  • the proliferation ability of corneal endothelial cells targeted by the present invention is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the expression of factors of the hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH (gene), PTCH1, GLI1, and GLI2 is a highly proliferative cell and / or an index of differentiation ability among corneal endothelial cells. Therefore, according to the present invention, by detecting the expression of GPR49 / LGR5 and / or SHH, cells having high proliferation ability (undifferentiated cells, progenitor cells, stem cells, etc.) and / or differentiation ability among corneal endothelial cells can be obtained. Can be detected or selected.
  • Wnt pathway factors of the Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin are an indicator of corneal endothelial cells having low proliferation ability and / or differentiation ability. Therefore, according to the present invention, by detecting the expression of Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin, cells with low proliferative ability among corneal endothelial cells (relative to non-differentiated cells, progenitor cells or stem cells) Cells with advanced differentiation) and / or low differentiation ability can be detected or selected.
  • Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • cells having high proliferative ability undifferentiated cells, progenitor cells, stem cells, etc.
  • Differentiation potential can be detected or selected.
  • the present invention binds to GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin or
  • GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin
  • hedgehog pathway factors such as Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin
  • a detection agent or diagnostic agent for identifying cells having high proliferation ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells, which contain an interacting substance.
  • the substance binding is preferably specific.
  • Such a detection agent or diagnostic agent binds to a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin.
  • a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin.
  • any substance may be used.
  • antibodies of these factors or fragments or functional equivalents thereof, or encoding these factors may be used. Examples include, but are not limited to, nucleic acid primers or probes for the nucleic acid to be processed.
  • the detection agent or diagnostic agent of the present invention can be used as a detection kit or a diagnostic kit.
  • the highly proliferative cell targeted for detection or diagnosis by the present invention is an undifferentiated cell.
  • the highly proliferative cell targeted for detection or diagnosis by the present invention is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell targeted for detection or diagnosis by the present invention is a human cell.
  • the ability of the corneal endothelial cells to be detected or diagnosed by the present invention is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • the detection agent of the present invention may be a complex or a complex molecule in which another substance (for example, a label or the like) is bound to a detectable moiety (for example, an antibody or the like).
  • a detectable moiety for example, an antibody or the like.
  • complex or “complex molecule” means any construct comprising two or more moieties.
  • the other part may be a polypeptide or other substance (eg, sugar, lipid, nucleic acid, other hydrocarbon, etc.).
  • two or more parts constituting the complex may be bonded by a covalent bond, or bonded by other bonds (for example, hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic interaction, van der Waals force, etc.). May be.
  • the “complex” includes a molecule formed by linking a plurality of molecules such as a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a sugar, and a small molecule.
  • interaction refers to two substances, and forces (for example, intermolecular force (van der Waals force), hydrogen bond, hydrophobic interaction between one substance and the other substance. Etc.). Usually, two interacting substances are in an associated or bound state.
  • bond means a physical or chemical interaction between two substances or a combination thereof. Bonds include ionic bonds, non-ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, hydrophobic interactions, and the like.
  • a physical interaction (binding) can be direct or indirect, where indirect is through or due to the effect of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and does not involve other substantial chemical intermediates.
  • a “factor” (or drug, detection agent, etc.) that interacts (or binds) “specifically” to a biological agent such as a polynucleotide or a polypeptide is defined as that
  • the affinity for a biological agent such as a nucleotide or polypeptide thereof is typically equal or greater than the affinity for other unrelated (especially less than 30% identity) polynucleotides or polypeptides. Includes those that are high or preferably significantly (eg, statistically significant). Such affinity can be measured, for example, by hybridization assays, binding assays, and the like.
  • a first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to a second substance or factor means that the first substance or factor has a relationship to the second substance or factor. Interact (or bind) with a higher affinity than a substance or factor other than the second substance or factor (especially other substances or factors present in the sample containing the second substance or factor) That means. Specific interactions (or bindings) for a substance or factor involve both nucleic acids and proteins, for example, ligand-receptor reactions, hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, enzyme-substrate reactions, etc.
  • Examples include, but are not limited to, a protein-lipid interaction, a nucleic acid-lipid interaction, and the like, such as a reaction between a transcription factor and a binding site of the transcription factor.
  • a substance or factor is a nucleic acid
  • the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the first substance or factor has the second substance Or having at least a part of complementarity to the factor.
  • both substances or factors are proteins
  • the fact that the first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to the second substance or factor is, for example, by antigen-antibody reaction Examples include, but are not limited to, interactions by receptor-ligand reactions, enzyme-substrate interactions, and the like.
  • the first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to the second substance or factor by the transcription factor and its Interaction (or binding) between the transcription factor and the binding region of the nucleic acid molecule of interest is included.
  • detection or “quantification” of polynucleotide or polypeptide expression uses suitable methods, including, for example, mRNA measurement and immunoassay methods, including binding or interaction with marker detection agents. Can be achieved.
  • molecular biological measurement methods include Northern blotting, dot blotting, and PCR.
  • immunological measurement methods include ELISA using a microtiter plate, RIA, fluorescent antibody method, luminescence immunoassay (LIA), immunoprecipitation (IP), immunodiffusion method (SRID), immunization. Examples are turbidimetry (TIA), Western blotting, immunohistochemical staining, and the like.
  • the quantitative method include an ELISA method and an RIA method.
  • DNA array e.g, DNA array, protein array
  • DNA array has been widely outlined in (edited by Shujunsha, separate volume of cell engineering "DNA microarray and the latest PCR method”).
  • protein arrays see Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-532.
  • gene expression analysis methods include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, in vitro translation and the like.
  • expression level refers to the amount of polypeptide or mRNA expressed in a target cell, tissue or the like. Such expression level is evaluated by any appropriate method including immunoassay methods such as ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western blot method, and immunohistochemical staining method using the antibody of the present invention. The amount of expression of the polypeptide of the present invention at the protein level, or the polypeptide used in the present invention evaluated by any suitable method including molecular biological measurement methods such as Northern blotting, dot blotting, and PCR. The expression level of the peptide at the mRNA level can be mentioned.
  • “Change in expression level” means expression at the protein level or mRNA level of the polypeptide used in the present invention evaluated by any appropriate method including the above immunological measurement method or molecular biological measurement method. Means that the amount increases or decreases. By measuring the expression level of a certain marker, various detection or diagnosis based on the marker can be performed.
  • “decrease” or “suppression” or synonyms for activity, expression products (eg, proteins, transcripts (RNA, etc.)) or a synonym is a decrease in the quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein. Or activity to decrease.
  • an expression product eg, a protein, transcript (such as RNA)
  • a synonym thereof refers to a quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein.
  • a drug that regulates the differentiation of eye cells can be detected and screened using the regulatory ability such as reduction, inhibition, increase or activation of the marker of the present invention as an index.
  • antibody broadly refers to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, multispecific antibodies, chimeric antibodies, and anti-idiotype antibodies, and fragments thereof such as Fv fragments, Fab ′ fragments, F (ab ′). 2 and Fab fragments, as well as other recombinantly produced conjugates or functional equivalents (eg, chimeric, humanized, multifunctional, bispecific or oligospecific antibodies, single chain Antibody, scFV, diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ), scFv-Fc).
  • such antibodies may be covalently linked or recombinantly fused to enzymes such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, alpha galactosidase, and the like.
  • the anti-GPR49 / LGR5 antibody and Sonic hedgehog (SHH) antibody used in the present invention may be bound to GPR49 / LGR5 and Sonic hedgehog (SHH) proteins, respectively, and the origin, type, and shape thereof are not limited.
  • known antibodies such as non-human animal antibodies (eg, mouse antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies can be used.
  • monoclonal or polyclonal antibodies can be used as antibodies, but monoclonal antibodies are preferred. Binding of antibodies to specific proteins of GPR49 / LGR5, Sonic hedgehog (SHH), hedgehog pathway factors such as PTCH1, GLI1, and GLI2 and Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin is specific binding. It is preferable.
  • antigen refers to any substrate that can be specifically bound by an antibody molecule.
  • immunogen refers to an antigen capable of initiating lymphocyte activation that produces an antigen-specific immune response.
  • epitope or “antigenic determinant” refers to a site in an antigen molecule to which an antibody or lymphocyte receptor binds. Methods for determining epitopes are well known in the art, and such epitopes can be determined by those skilled in the art using such well known techniques once the primary sequence of the nucleic acid or amino acid is provided.
  • “means” refers to any tool that can achieve a certain purpose (for example, detection, diagnosis, treatment).
  • selective recognition means A means by which one object can be recognized differently from another.
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • ligand refers to a substance that specifically binds to a certain protein. Examples of the ligand include lectins, antigens, antibodies, hormones, neurotransmitters, and the like that specifically bind to various receptor protein molecules present on the cell membrane.
  • the detection agent, diagnostic agent or other medicine of the present invention can take the form of probes and primers.
  • Probes and primers of the present invention are specific to factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, Rspondins, Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin. Can be hybridized.
  • factors of the hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of the Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin It is an index of proliferation ability in endothelial cells, and is useful as an index of differentiation state.
  • the probe and primer according to the present invention can be used to identify cells having high proliferation ability and / or differentiation ability among corneal endothelial cells.
  • the probe and primer of the present invention are factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, GLI2, and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin. It may be a polymer comprising a plurality of bases or base pairs such as deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). Double stranded cDNA is also known to be available for tissue in situ hybridization, and probes and primers of the invention include such double stranded cDNA. As a particularly preferred probe and primer for detecting RNA in tissue, an RNA probe (riboprobe) can be mentioned.
  • nucleic acid primer refers to a substance necessary for the initiation of a reaction of a polymer compound to be synthesized in a polymer synthase reaction.
  • a nucleic acid molecule for example, DNA or RNA
  • the primer can be used as a marker detection means.
  • Nucleic acid sequences used as probes are nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Is included.
  • a sequence suitable as a primer may vary depending on the nature of the sequence intended for synthesis (amplification), but those skilled in the art can appropriately design a primer according to the intended sequence. Such primer design is well known in the art, and may be performed manually or using a computer program (eg, LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar).
  • the primer according to the present invention can also be used as a primer set composed of two or more kinds of the primers.
  • the primer and primer set according to the present invention are prepared by a conventional method in a known method for detecting a target gene using a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an in situ PCR method, or a LAMP method. It can be used as a primer and a primer set.
  • a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an in situ PCR method, or a LAMP method. It can be used as a primer and a primer set.
  • the primer set according to the present invention is used for GPR49 / LGR5, R-spondins, Sonic hedgehog (SHH), hedgehog pathway factors such as PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin.
  • the nucleotide sequence of the protein can be selected so that it can be amplified by a nucleic acid amplification method such as a PCR method. Nucleic acid amplification methods are well known, and selection of primer pairs in nucleic acid amplification methods is obvious to those skilled in the art.
  • one of two primers is a factor of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, R-spondins, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • Pairs with the plus strand of the double-stranded DNA of the protein of interest such as a factor of the Wnt pathway, the other primer pairs with the minus strand of the double-stranded DNA, and the other with the extended strand extended by one primer Primers can be selected such that these primers are paired.
  • the primer of the present invention can be chemically synthesized based on the nucleotide sequence disclosed herein. Preparation of the primer is well known, for example, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2 nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987-1997)) Can be implemented according to
  • the term “probe” refers to a substance that serves as a search means used in biological experiments such as screening in vitro and / or in vivo.
  • a nucleic acid molecule containing a specific base sequence or a specific Examples include, but are not limited to, peptides containing amino acid sequences, specific antibodies or fragments thereof.
  • the probe is used as a marker detection means.
  • Nucleic acid sequences used as probes are nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Is included.
  • the detection agent of the present invention may be labeled.
  • the detection agent of the present invention may have a tag bound thereto.
  • the “label” refers to a presence (for example, a substance, energy, electromagnetic wave, etc.) for distinguishing a target molecule or substance from others.
  • a labeling method include RI (radioisotope) method, fluorescence method, biotin method, chemiluminescence method and the like.
  • the labeling is performed with fluorescent substances having different fluorescence emission maximum wavelengths. The difference in the maximum fluorescence emission wavelength is preferably 10 nm or more.
  • Alexa TM Fluor is preferred as the fluorescent substance.
  • Alexa TM Fluor is a water-soluble fluorescent dye obtained by modifying coumarin, rhodamine, fluorescein, cyanine, etc., and is a series corresponding to a wide range of fluorescent wavelengths. Stable, bright and low pH sensitive. Examples of combinations of fluorescent dyes having a fluorescence maximum wavelength of 10 nm or more include a combination of Alexa TM 555 and Alexa TM 633, a combination of Alexa TM 488 and Alexa TM 555, and the like. Any nucleic acid can be used as long as it can bind to its base moiety.
  • cyanine dyes eg, CyDye TM series Cy3, Cy5, etc.
  • rhodamine 6G reagent 2-acetylaminofluorene ( AAF), AAIF (iodine derivative of AAF) and the like
  • the fluorescent substance having a fluorescence emission maximum wavelength difference of 10 nm or more include a combination of Cy5 and rhodamine 6G reagent, a combination of Cy3 and fluorescein, a combination of rhodamine 6G reagent and fluorescein, and the like.
  • the target object by using such a label, the target object can be modified so that it can be detected by the detection means used. Such modifications are known in the art, and those skilled in the art can appropriately carry out such methods depending on the label and the target object.
  • a “tag” is a substance for sorting molecules by a specific recognition mechanism such as a receptor-ligand, more specifically, a binding for binding a specific substance.
  • a substance that plays the role of a partner for example, having a relationship such as biotin-avidin, biotin-streptavidin
  • label can be included in the category of “label”.
  • a specific substance to which a tag is bound can be selected by bringing the substrate to which the binding partner of the tag sequence is bound into contact.
  • tags or labels are well known in the art.
  • Representative tag sequences include, but are not limited to, myc tag, His tag, HA, Avi tag and the like. Such a tag may be bound to the marker or marker detection agent of the present invention.
  • the present invention relates to a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin.
  • a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin.
  • a method for using as an index for identifying cells having high proliferation ability among endothelial cells / or differentiation ability or a method for detecting or diagnosing cells having high proliferation ability among corneal endothelial cells / or differentiation ability.
  • a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin is added to the proliferative ability of corneal endothelial cells.
  • GPR49 / LGR5 and / or factors of hedgehog pathway such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin It can be carried out by performing a step of detecting factors or genes of these factors in vivo.
  • factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, GLI2, and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin or genes of these factors
  • SHH Sonic hedgehog
  • PTCH1, GLI1, GLI2 and / or factors of Wnt pathway
  • LRP6, ⁇ -catenin or genes of these factors
  • a detection agent containing a substance that binds to can be used.
  • detection agents are described herein, and based on the description, it is understood that those skilled in the art can implement the method of the present invention.
  • the detection agent or diagnostic agent of the present invention is brought into contact with a target sample, and the target target GPR49 / LGR5 and / or Sonic hedgehog (SHH), PTCH1, GLI1, GLI2 Hedgehog pathway factors such as and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin or the presence or level or amount of genes for these factors are determined.
  • SHH Sonic hedgehog
  • contacting refers to a polypeptide that can function as a marker, a detection agent, a diagnostic agent, a ligand, and the like of the present invention either directly or indirectly. It means physical proximity to the polynucleotide.
  • the polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like. Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, microtiter plate, cell culture flask or microarray (eg, gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof.
  • the high proliferative cell targeted in the method of the present invention is an undifferentiated cell.
  • the highly proliferative cell targeted in the method of the present invention is a stem cell.
  • the corneal endothelial cell targeted in the method of the present invention is a human cell.
  • the proliferation ability of the corneal endothelial cells targeted in the method of the present invention is identified by a feature selected from the group consisting of colony forming ability, Ki-67 positive and BrdU positive.
  • a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin or genes of these factors Is a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin or a factor of these factors in a test sample (eg, a cell, etc.)
  • the method is not particularly limited as long as it can detect gene expression, and examples thereof include a hybridization method, a nucleic acid amplification method, and an antigen-antibody reaction method.
  • the “test sample” may be a sample considered to contain a corneal endothelial cell, a target cell, or a substance derived therefrom that enables gene expression. Isolated cells can be used.
  • the cells of the corneal endothelium can be obtained by a known method (Koizumi N, Okumura N, Kinoshita S., Experimental Eye Research. 2012; 95: 60-7.).
  • cells obtained from donors of corneal endothelium, corneal endothelial cells and the like can be used as test cell samples.
  • cultured cells containing corneal endothelial cells induced to differentiate in vitro can be used as samples.
  • Differentiation induction into corneal endothelial cells in vitro is carried out using known ES cells, iPS cells, bone marrow stromal cells and the like as starting materials, and differentiation using known methods, for example, AMED method ⁇ Ueno M, Matsumura M , Watanabe K, Nakamura T, Osakada F, Takahashi M, Kawasaki H, Kinoshita S, Sasai Y :, Proc Natl Acad Sci USA. 103 (25): 9554-9559, 2006. Etc.> can be performed.
  • the probe according to the invention is hybridized with a nucleic acid sample (mRNA or a transcript thereof) and the hybridization complex, ie the nucleotide duplex, is detected directly or indirectly.
  • the expression of GPR49 / LGR5 in the cell sample can be detected.
  • Detection of GPR49 / LGR5 and / or factors of hedgehog pathway such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin or gene expression of these factors using a hybridization method can be performed, for example, by: (a) contacting a polynucleotide derived from a test sample with a probe according to the present invention; and (b) detecting a hybridization complex.
  • mRNA prepared from the target test sample or complementary DNA (cDNA) transcribed from the mRNA can be brought into contact with the probe as a polynucleotide derived from the test cell sample.
  • the probe can be labeled and used.
  • the label for example, radioactive activity (for example, 32 P, 14 C, and 35 S), fluorescence (for example, FITC, europium), enzymatic reaction such as chemical color development (for example, peroxidase, alkaline phosphatase), etc. were utilized.
  • a label can be mentioned.
  • the detection of the hybridization product can be performed using a well-known method such as Northern hybridization, Southern hybridization, colony hybridization and the like.
  • Cells in which hybridization complexes are detected express GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin Since it is a cell, it can be determined that the cell has a high proliferation ability (such as an undifferentiated cell, a progenitor cell or a stem cell) and / or has a high differentiation ability.
  • GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin Since it is a cell, it can be determined that the cell has a high proliferation ability (such as an undifferentiated cell, a progenitor cell or a stem cell) and / or has a high differentiation ability.
  • a nucleic acid sample (mRNA or a transcription product thereof) is amplified by a nucleic acid amplification method using the primer or primer set according to the invention, and the amplification product is detected, whereby in the sample Expression of GPR49 / LGR5 and / or factors of hedgehog pathway such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin or genes of these factors can be detected.
  • hedgehog pathway such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2
  • Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin or genes of these factors
  • Detection of GPR49 / LGR5 and / or factors of hedgehog pathway such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin or gene expression of these factors using nucleic acid amplification method For example, (i) performing a nucleic acid amplification method using a polynucleotide derived from a test sample as a template and using a primer or primer set according to the present invention; and (ii) detecting a formed amplification product. can do.
  • step (i) mRNA prepared from the target test sample or complementary DNA (cDNA) transcribed from the mRNA can be used as a template.
  • Detection of the amplification product can be performed using a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, or a LAMP method. Since the cell in which the amplification product is detected is a cell expressing GPR49 / LGR5, it is determined that the cell has high proliferation ability (undifferentiated cell, progenitor cell, stem cell, etc.) and / or high differentiation ability. can do.
  • Expression of factors of the Hog pathway and / or factors of the Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin can be detected.
  • Detection of expression of factors of GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin using antigen-antibody reaction is performed by, for example, the following steps: And (I) a step of contacting a protein derived from a test cell sample with an antibody according to the present invention; and (II) a step of measuring an antigen-antibody complex. Methods for detecting antigen-antibody reactions are well known to those skilled in the art. For example, GPR49 / LGR5 protein and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, etc.
  • Immunological methods include cell tissue samples that have been appropriately treated, such as cell separation and extraction procedures, immunohistochemical staining, enzyme immunoassay, western blotting, agglutination, competition, etc. A known method such as a method or a sandwich method can be applied.
  • the immunohistochemical staining method can be performed by, for example, a direct method using a labeled antibody, an indirect method using a labeled antibody against the antibody, or the like.
  • labeling agent known labeling substances such as fluorescent substances, radioactive substances, enzymes, metals, and dyes can be used.
  • Cells in which antigen-antibody complexes are detected express GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin Since it is a cell, it can be determined that the cell has a high proliferation ability (such as an undifferentiated cell, a progenitor cell or a stem cell) and / or has a high differentiation ability.
  • GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin Since it is a cell, it can be determined that the cell has a high proliferation ability (such as an undifferentiated cell, a progenitor cell or a stem cell) and / or has a high differentiation ability.
  • corneal endothelium such as bullous keratopathy, corneal edema, corneal vitiligo, in particular corneal dystrophy, corneal endothelial disorders resulting from trauma or intraocular surgery, or other specific corneal endothelial diseases (Fuchs)
  • corneal endothelial degeneration posterior polymorphic corneal endothelial degeneration, etc.
  • cells with high proliferation ability desirably have high purity.
  • the detection steps described above can be performed not only once, but also by repeating or combining the steps, thereby improving the accuracy of detection or selection of cells with high proliferation / differentiation potential. Therefore, when such an embodiment is adopted, according to the detection method of the present invention, cells having high proliferation ability / differentiation ability can be detected or selected with higher accuracy by performing the above steps twice or more. Can do.
  • marker genes preferably GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • a marker gene for example, Ki-67 and BrdU
  • the accuracy of detection or selection of cells with high proliferation / differentiation potential can be increased.
  • diagnosis refers to identifying various parameters related to a disease, disorder, or condition in a subject and determining the current state or future of such a disease, disorder, or condition.
  • conditions within the body can be examined, and such information can be used to formulate a disease, disorder, condition, treatment to be administered or prevention in a subject.
  • various parameters such as methods can be selected.
  • diagnosis in a narrow sense means diagnosis of the current state, but in a broad sense includes “early diagnosis”, “predictive diagnosis”, “preliminary diagnosis”, and the like.
  • the diagnostic method of the present invention is industrially useful because, in principle, the diagnostic method of the present invention can be used from the body and can be performed away from the hands of medical personnel such as doctors.
  • diagnosis, prior diagnosis or diagnosis may be referred to as “support”.
  • the prescription procedure as a medicine such as the diagnostic agent of the present invention is known in the art, and is described in, for example, the Japanese Pharmacopoeia, the US Pharmacopoeia, the pharmacopoeia of other countries, and the like. Thus, one skilled in the art can determine the amount to be used without undue experimentation as described herein.
  • the antibody used in the present invention can be produced as follows.
  • Antibodies used in the present invention for example, anti-GPR49 / LGR5 antibodies, antibodies against hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and antibodies against Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • Monoclonal antibodies are prepared by hybridizing cell lines between antibody-producing cells obtained from animals immunized with antigen and myeloma cells, and GPR49 / LGR5, R-spondins, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, etc. are prepared from the resulting hybridomas.
  • GPR49 / LGR5, R-spondins, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, etc. are prepared from the resulting hybridomas.
  • GPR49 / LGR5, R-spondins, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and other hedgehog pathway factors used as antigens for animal immunization and / or mature forms such as LRP6, ⁇ -catenin and other Wnt pathway factors The entire amino acid sequence of a protein or a fragment having immunogenicity can be used as an immunogen.
  • a monoclonal antibody for specifically detecting a protein present on the cell surface it is preferable to use a peptide consisting of any 10 or more amino acids in the amino acid sequence of the marker protein of the present invention as an antigen.
  • Any other factor of the present invention eg, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, R-spondins, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • Antigens can be similarly designed for proteins corresponding to these.
  • Add adjuvant examples include Freund's complete adjuvant and Freund's incomplete adjuvant, and any of these may be mixed.
  • the antigen obtained as described above is administered to mammals such as mammals such as mice, rats, horses, monkeys, rabbits, goats and sheep. Any method can be used for immunization as long as it is an existing method, but it is mainly carried out by intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection or the like. Immunization intervals are not particularly limited, and immunization is performed at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 4 to 21 days.
  • antibody-producing cells 2-3 days after the last immunization.
  • antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells.
  • spleen cells are used.
  • 100 ⁇ g of antigen is used per mouse at a time.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be basically produced using known techniques as follows.
  • a target protein for example, a protein such as a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • a target protein for example, a protein such as a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • Immune cells obtained from an immunized animal are fused with a known parent cell by a conventional cell fusion method to obtain a hybridoma.
  • a hybridoma that produces the target antibody can be selected by screening cells that produce the target antibody by an ordinary screening method.
  • antibodies are obtained by expressing a target gene (such as GPR49 / LGR5 gene, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and other hedgehog pathway factors and / or WRP pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin).
  • a target gene such as GPR49 / LGR5 gene, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and other hedgehog pathway factors and / or WRP pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin.
  • WRP pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • the base sequence of the gene of interest is disclosed elsewhere in this specification (for example, NCBI registration number NM_003667.2 (SEQ ID NO: 1), NM_000193 (SEQ ID NO: 11), etc.)
  • a gene sequence encoding the target gene is inserted into a known expression vector to transform an appropriate host cell, and then the target protein can be purified from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • a purified natural protein can also be used in the same manner, and as used in the present invention, a fusion protein obtained by fusing a desired partial polypeptide of a target protein with a different polypeptide can be used as an immunogen.
  • an antibody Fc fragment or peptide tag can be used.
  • a vector that expresses a fusion protein is prepared by fusing genes encoding two or more desired polypeptide fragments in-frame and inserting the fusion gene into an expression vector.
  • a method for producing a fusion protein is described in Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). .
  • Proteins of interest purified in this way eg, proteins such as factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • It can be used as a sensitizing antigen used for immunization against mammals.
  • a partial peptide of the protein of interest can also be used as a sensitizing antigen.
  • a protein of interest a protein such as a factor of a hedgehog pathway such as human GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • genes of interest factors of hedgehog pathway such as human GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin
  • a target protein human GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, etc.
  • Protein protein
  • the Wnt pathway peptides obtained by decomposing by proteolytic enzymes can be sensitizing antigen.
  • the region and size of a protein used as a partial peptide are not limited.
  • the amino acid sequence constituting the extracellular domain of GPR49 / LGR5 (positions 1-556, 615-637, 704-722, and 792 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2) -800th) can be selected.
  • the number of amino acids constituting the peptide to be sensitized antigen is preferably at least 3 or more, for example, 5 or more, or 6 or more. More specifically, a peptide having 8 to 50, preferably 10 to 30 residues can be used as the sensitizing antigen.
  • hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin
  • sequences described herein for example, SEQ ID NOs: 12, 44, 46 , 48, 50, 52, etc.
  • an appropriate peptide can be similarly used as a sensitizing antigen.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited.
  • an immunized animal in consideration of compatibility with a parent cell used for cell fusion.
  • rodent animals are preferred as immunized animals. Specifically, mice, rats, hamsters, or rabbits can be used as immunized animals.
  • monkeys and the like can be used as immunized animals.
  • the above animals can be immunized with a sensitizing antigen.
  • mammals can be immunized by injecting a sensitizing antigen intraperitoneally or subcutaneously. Specifically, the sensitizing antigen is administered to mammals several times every 4 to 21 days.
  • the sensitizing antigen is diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline at an appropriate dilution ratio and used for immunization.
  • a sensitizing antigen can be administered with an adjuvant. For example, it can be mixed with Freund's complete adjuvant and emulsified to give a sensitizing antigen.
  • An appropriate carrier can be used for immunization with the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a small molecular weight is used as a sensitizing antigen, it is desirable to immunize the sensitizing antigen peptide by binding it to a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • DNA immunization refers to immunization by administering a vector DNA constructed in such a manner that a gene encoding an antigen protein can be expressed in the immunized animal, and expressing the immunizing antigen in the body of the immunized animal. It is a method of giving a stimulus.
  • a target protein for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt such as LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • DNA expressing a route factor or the like is administered to an immunized animal.
  • a DNA encoding a target protein for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • PCR DNA encoding a target protein (for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin) is known as PCR. It can be synthesized by the method.
  • the obtained DNA is inserted into an appropriate expression vector and administered to an immunized animal.
  • an expression vector for example, a commercially available expression vector such as pcDNA3.1 can be used.
  • a method of administering the vector to a living body a generally used method can be used.
  • DNA immunization can be performed by implanting gold particles adsorbed with an expression vector into a cell with a gene gun.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • spleen cells can be used.
  • Mammalian myeloma cells are used as cells to be fused with the above immune cells.
  • the myeloma cell is preferably provided with an appropriate selection marker for screening.
  • a selectable marker refers to a trait that can (or cannot) survive under certain culture conditions.
  • Known selection markers include hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency (hereinafter abbreviated as HGPRT deficiency) or thymidine kinase deficiency (hereinafter abbreviated as TK deficiency).
  • HGPRT deficiency hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency
  • TK deficiency thymidine kinase deficiency
  • Cells having HGPRT or TK deficiency have hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitivity (hereinafter abbreviated as HAT sensitivity).
  • HGPRT-deficient and TK-deficient cells can be selected in a medium containing 6-thioguanine, 8-azaguanine (hereinafter abbreviated as 8AG), or 5 'bromodeoxyuridine, respectively.
  • 8AG 8-azaguanine
  • 5 'bromodeoxyuridine normal cells die because they incorporate these pyrimidine analogs into the DNA, but cells deficient in these enzymes cannot survive these pyrimidine analogs and can survive in selective media.
  • a selectable marker called G418 resistance confers resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogs) with a neomycin resistance gene.
  • Various myeloma cells suitable for cell fusion are known. Basically, a known method such as Koehler G. and Milstein C. , Methods Enzymol.
  • cell fusion between immune cells and myeloma cells is performed. More specifically, for example, cell fusion can be carried out in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like can be used.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added as desired in order to increase the fusion efficiency.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily. For example, the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • RPMI1640 culture solution suitable for growth of myeloma cell lines for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of myeloma cell lines, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be added to the culture medium.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of immune cells and myeloma cells are mixed well in a culture solution, and a target PEG (hybridoma) is formed by mixing a PEG solution preheated to about 37 ° C.
  • PEG having an average molecular weight of about 1000 to 6000 can be usually added at a concentration of 30% (w / v) to 60% (w / v).
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of hybridomas are removed by sequentially adding the appropriate culture medium listed above, and then centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma obtained in this manner can be selected by using a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • cells having HGPRT or TK deficiency can be selected by culturing in a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). That is, when HAT-sensitive myeloma cells are used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion with normal cells can be selectively proliferated in the HAT culture solution.
  • the culture using the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die.
  • the target hybridoma can be selected by culturing for several days to several weeks. Subsequently, by carrying out the usual limiting dilution method, screening and single cloning of the hybridoma producing the target antibody can be performed.
  • an antibody that recognizes a target protein for example, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • a target protein for example, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • WO03 / 104453 can also be used for the production.
  • Screening and single cloning of the target antibody can be appropriately performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or the like, or a commercially available 96-well microtiter plate, and reacted with the culture supernatant of the hybridoma.
  • a secondary antibody labeled with an enzyme is reacted. If the culture supernatant contains an antibody of interest that reacts with the sensitizing antigen, the secondary antibody binds to the carrier via this antibody. By detecting the secondary antibody that finally binds to the carrier, it can be determined whether the antibody of interest is present in the culture supernatant.
  • the antigens used for immunization include substantially homogenous factors such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2, and / or Wnt pathways such as LRP6 and ⁇ -catenin. Proteins such as factors can be preferably used.
  • a cell line expressing a target protein for example, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • a target protein for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • a partial amino acid constituting the region An oligopeptide consisting of a sequence can be used as an antigen.
  • a target antibody can be obtained by sensitizing human lymphocytes with an antigen.
  • human lymphocytes are first sensitized in vitro with proteins such as factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin. .
  • the immunized lymphocytes are then fused with an appropriate fusion partner.
  • the fusion partner for example, a myeloma cell derived from a human and having a permanent division ability can be used (see Japanese Patent Publication No.
  • the anti-GPR49 / LGR5 antibody obtained by this method is a human antibody having binding activity to GPR49 / LGR5 protein.
  • factors of the hedgehog pathway such as SHH, Ptch1, Gli1, and Gli2 and / or factors of the Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin.
  • a target protein that serves as an antigen for a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes eg, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇
  • a protein of interest by immunizing with a DNA constructed to express the protein of interest (eg GPR49 / LGR5) in the animal Human antibodies against for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin
  • Antibody-producing cells of the immunized animal can be immortalized by treatment such as cell fusion with an appropriate fusion partner or Epstein-Barr virus infection.
  • a target protein for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin
  • WO94 / 25585, WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602 Further, by cloning the immortalized cells, it is possible to clone cells that produce an antibody having the desired reaction specificity.
  • a transgenic animal When a transgenic animal is used as an immunized animal, the animal's immune system recognizes the target human protein (for example, human GPR49 / LGR5) as a foreign substance. Therefore, a human antibody against a target human protein (for example, a factor of a hedgehog pathway such as human GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin) can be easily obtained. Obtainable.
  • a target human protein for example, human GPR49 / LGR5
  • a human antibody against a target human protein for example, a factor of a hedgehog pathway such as human GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution.
  • the hybridoma can also be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma can be cultured according to a usual method, and the target monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • a hybridoma can be administered to a mammal compatible therewith to proliferate and a monoclonal antibody can be obtained as its ascites.
  • the former method is suitable for obtaining a highly pure antibody.
  • an antibody encoded by an antibody gene cloned from an antibody-producing cell can also be used.
  • the cloned antibody gene can be expressed as an antibody by incorporating it into an appropriate vector and introducing it into a host. Methods for isolation of antibody genes, introduction into vectors, and transformation of host cells have already been established (eg, Vandamme, AM, et al., Eur. J. Biochem. (1990). 192, 767-775).
  • an antibody against a target protein for example, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin.
  • a protein of interest eg, a hedgehog pathway factor such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a Wnt pathway factor such as LRP6, ⁇ -catenin
  • a hedgehog pathway factor such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a Wnt pathway factor such as LRP6, ⁇ -catenin
  • An antibody that binds to a target protein is 1) An antibody comprising a V region encoded by the obtained cDNA is used as a target protein (for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin) (2) a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a factor of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • a target protein for example, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a factor of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • a method comprising a step of selecting an antibody that binds to a protein (eg, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin).
  • a protein eg, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin.
  • a method for detecting the binding between an antibody and a target protein for example, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • a target protein for example, a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, or GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 or ⁇ -catenin
  • a carrier eg, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • the test antibody is reacted with a labeled antibody that recognizes the antibody.
  • the target protein of the test antibody for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • an enzyme active protein such as peroxidase or ⁇ -galactosidase, or a fluorescent substance such as FITC can be used.
  • a target protein for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • a target protein for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • a panning method using a phage vector can also be used.
  • a screening method using a phage vector is advantageous.
  • a gene encoding the variable region of the heavy chain and the light chain can be converted into a single chain Fv (scFv) by linking with an appropriate linker sequence. If a gene encoding scFv is inserted into a phage vector, a phage expressing scFv on the surface can be obtained.
  • the DNA encoding scFv having the target binding activity can be recovered. By repeating this operation as necessary, scFv having the target binding activity can be concentrated.
  • the polynucleotide encoding the antibody may encode the full length of the antibody or may encode a part of the antibody.
  • a part of an antibody refers to any part of an antibody molecule.
  • antibody fragments may be used in the practice of the present invention.
  • a preferable antibody fragment in the present invention includes a complementary determination region (CDR) of an antibody. More preferably, the antibody fragment of the present invention comprises all three CDRs constituting the variable region.
  • an antibody of the invention comprises a protein of interest (eg, a hedgehog pathway factor such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin).
  • a protein of interest eg, a hedgehog pathway factor such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin.
  • a protein of interest eg, a hedgehog pathway factor such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or a Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin.
  • the multivalent antibodies of the present invention include multivalent antibodies that all have the same antigen-binding site, or multivalent antibodies that have some or all different antigen-binding sites.
  • the antibody of the present invention is not limited to the full-length molecule of the antibody, but is a target protein (for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin). As long as it binds to a factor, etc., it may be a low molecular weight antibody or a modified product thereof.
  • a target protein for example, factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5, SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin.
  • the antibody titer in the blood of the immunized animal or the antibody titer in the culture supernatant of the antibody producing cell Measure.
  • antibody detection methods include known techniques such as EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) and the like.
  • the concentration of the marker can be accurately measured even with a sample containing a lot of contaminants.
  • immunoassays include classical methods such as precipitation, agglutination, and hemolysis, which directly or indirectly measure antigen-antibody conjugates, and enzyme immunoassays (EIA) with increased detection sensitivity in combination with labeling methods. , Radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA) and the like.
  • the antibody specific for the marker used in these immunoassays may be monoclonal or polyclonal.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • ESI electrospray ionization
  • MALDI-TOF-MS combined with a time-of-flight mass spectrometer (TOF)
  • TOF time-of-flight mass spectrometer
  • the concentration of the marker can be measured more accurately.
  • MS / MS using two mass spectrometers the marker concentration can be measured more accurately.
  • the test material When measuring the marker concentration by electrophoresis, for example, the test material is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to separate the target marker, and the gel is stained with an appropriate dye or fluorescent substance. What is necessary is just to measure the darkness and fluorescence intensity of the band corresponding to the target marker. If the separation of the markers is insufficient by SDS-PAGE alone, two-dimensional electrophoresis combined with isoelectric focusing (IEF) can also be used. Furthermore, instead of detecting directly from the gel, Western blotting can be performed to measure the amount of marker on the membrane.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • IEF isoelectric focusing
  • a method by liquid high performance chromatography can be used. That is, the concentration of the marker in the sample can be measured by subjecting the sample to HPLC to separate the target marker and measuring the peak area of the chromatogram.
  • myeloma (myeloma) cell to be fused with the antibody-producing cell a cell line derived from various animals such as mouse, rat, human and generally available to those skilled in the art is used.
  • a cell line to be used a cell line having drug resistance and having the property that it cannot survive in a selective medium (for example, HAT medium) in an unfused state but can survive only in a fused state is used.
  • An 8-azaguanine resistant strain is generally used, and this cell line is deficient in hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase and cannot grow in hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) medium.
  • HAT hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase
  • Myeloma cells are known in various known cell lines such as P3 (P3 ⁇ 63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3 ⁇ 63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC- 11 (Margulies DH et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2 / 0 (Shulman M. et al., Nature (1978) 276: 269-270), FO (Lazekas de St. Groth, S.
  • P3 P3 ⁇ 63Ag8.653
  • P3 ⁇ 63Ag8U. 1 Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:
  • Antibody-producing cells can be obtained from spleen cells, lymph node cells, and the like. That is, spleen, lymph nodes, etc. are removed or collected from the various animals, and these tissues are crushed. The obtained crushed material is suspended in a medium or buffer solution such as PBS, DMEM, RPMI 1640, etc., filtered through a stainless mesh, etc., and then centrifuged to prepare the desired antibody-producing cells.
  • a medium or buffer solution such as PBS, DMEM, RPMI 1640, etc.
  • cell fusion is performed between the myeloma cells and antibody-producing cells.
  • Cell fusion is performed by mixing myeloma cells and antibody-producing cells at a mixing ratio of 1: 1 to 1:10 in an animal cell culture medium such as MEM, DMEM, and RPME-1640 medium in the presence of a fusion promoter. It is performed by contacting at 37 ° C. for 1 to 15 minutes.
  • a fusion promoter or fusion virus such as polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,000 to 6,000, polyvinyl alcohol, or Sendai virus can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
  • Select the desired hybridoma from the cells after cell fusion treatment examples include a method utilizing selective growth of cells in a selective medium. That is, after the cell suspension is diluted with an appropriate medium, it is spread on a microtiter plate, a selective medium (HAT medium or the like) is added to each well, and thereafter, the selective medium is appropriately replaced and cultured. As a result, growing cells can be obtained as hybridomas.
  • a selective medium HAT medium or the like
  • Hybridoma screening is performed by limiting dilution, fluorescence excitation cell sorter, or the like, and finally a monoclonal antibody-producing hybridoma is obtained.
  • Examples of a method for collecting a monoclonal antibody from the obtained hybridoma include a normal cell culture method and ascites formation method.
  • the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10 to 20% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium (for example, 37 ° C., 5% CO 2).
  • the antibody is obtained from the culture supernatant.
  • a hybridoma is administered into the abdominal cavity of an animal of the same kind as a mammal derived from myeloma cells, and the hybridoma is proliferated in large quantities. Ascites or serum is collected after 1 to 4 weeks.
  • purification is performed by appropriately selecting a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or a combination thereof. To do.
  • the substance contained as an antigen in the production of an antibody is preferably the full length of the target marker, but may be a partial sequence as long as it contains at least one epitope that can induce immunity.
  • Epitopes can be used even if their exact location and structure are not known, but if necessary, identification of epitopes in a given protein can be easily performed using techniques well known in the art. Achieved. See, for example, Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998; U.S. Pat. No. 4,708,871; and Geysen et al. (1986) Molecular Immunology 23: 709.
  • Antibodies that recognize the same epitope can be identified in a simple immunoassay.
  • methods for determining epitopes comprising peptides are well known in the art, and once such epitopes are provided with the primary sequence of a nucleic acid or amino acid, one skilled in the art will use such well known techniques. Can be determined.
  • a sequence of at least 3 amino acids in length is required, preferably this sequence is at least 4 amino acids, more preferably at least 5 amino acids, at least 6 amino acids, at least 7 A sequence of amino acids, at least 8 amino acids, at least 9 amino acids, at least 10 amino acids, at least 15 amino acids, at least 20 amino acids, at least 25 amino acids in length may be required.
  • the epitope may be linear or conformational.
  • a detection kit for carrying out the detection method according to the present invention is provided.
  • the detection kit according to the present invention includes a detection kit for performing the detection of the embodiment according to the present invention, specifically, GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2.
  • a kit for detecting the expression of a factor of the hedgehog pathway such as HRP and / or a factor of the Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin which comprises at least the probe according to the present invention. This probe may be labeled.
  • This detection kit detects the expression of factors of GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin by hybridization.
  • the detection method of the first aspect optionally further comprises various reagents for carrying out the hybridization method, such as substrate compounds, hybridization buffers, instructions, and / or instruments used for detection of the label. Can be included.
  • the detection kit of this embodiment according to the present invention provides GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • a probe, primer, primer set, or antibody that can detect the expression of a differentiation marker gene other than factors of the Wnt pathway may be further included.
  • These probes, primers, primer sets, or antibodies may be labeled.
  • This detection kit is obtained by any one of a hybridization method, a nucleic acid amplification method, and an antigen-antibody reaction method, such as GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇ -Further detecting the expression of differentiation marker genes other than factors of the Wnt pathway such as catenin.
  • an antigen-antibody reaction method such as GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇ -Further detecting the expression of differentiation marker genes other than factors of the Wnt pathway such as catenin.
  • the detection kit according to the present invention includes a detection kit for performing the detection of another embodiment according to the present invention, specifically, GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1,
  • a kit for detecting the expression of a factor of a hedgehog pathway such as GLI1 and GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin, comprising at least a primer according to the present invention or a primer set according to the present invention The kit which becomes is mentioned.
  • This detection kit detects the expression of factors of the hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, and GLI and / or factors of the Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin by a nucleic acid amplification method. Therefore, the detection method of the second aspect includes various reagents for carrying out the nucleic acid amplification method, for example, a buffer, an internal standard indicating that PCR can proceed normally, instructions, and / or instruments, if desired. Can further be included.
  • the detection kit of this embodiment according to the present invention provides GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇ -catenin, etc.
  • a probe, primer, primer set, or antibody that can detect expression of a differentiation marker gene other than a factor of the Wnt pathway may further be included. These probes, primers, primer sets, or antibodies may be labeled.
  • This detection kit is obtained by any one of a hybridization method, a nucleic acid amplification method, and an antigen-antibody reaction method, such as GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇ -Further detecting expression of differentiation markers other than factors of the Wnt pathway such as catenin.
  • an antigen-antibody reaction method such as GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, and / or LRP6, ⁇ -Further detecting expression of differentiation markers other than factors of the Wnt pathway such as catenin.
  • detection kits according to the present invention include detection kits for performing the detection of further embodiments according to the present invention, specifically GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2
  • This detection kit detects the antigen-antibody reaction, thereby expressing the factors of GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin. To detect.
  • the detection method of this embodiment further includes various reagents for carrying out the antigen-antibody reaction, for example, secondary antibodies used in the ELISA method, coloring reagents, buffers, instructions, and / or instruments, if desired. be able to.
  • the detection kit provides GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or LRP6, ⁇ -catenin, etc. It may further comprise a probe, primer, primer set, or antibody capable of detecting the expression of a differentiation marker other than the Wnt pathway factor. These probes, primers, primer sets, or antibodies may be labeled.
  • This detection kit can be obtained by any of hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods, such as GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, Ptch1, Gli1, Gli2, and / or LRP6, ⁇ -Further detecting expression of differentiation markers other than factors of the Wnt pathway such as catenin.
  • GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, Ptch1, Gli1, Gli2, and / or LRP6, ⁇ -Further detecting expression of differentiation markers other than factors of the Wnt pathway such as catenin.
  • kits, compositions or systems can be used for markers of the present invention (eg, GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or Wnt pathways such as LRP6, ⁇ -catenin).
  • markers of the present invention eg, GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or Wnt pathways such as LRP6, ⁇ -catenin.
  • the factor used in the present invention is selected from the group consisting of nucleic acid molecules, polypeptides, lipids, sugar chains, small organic molecules and complex molecules thereof, preferably the factor is a protein or complex.
  • a molecule eg, glycoprotein, lipid protein, etc.
  • the factor is an antibody (eg, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody).
  • Such factors are preferably labeled or labelable. This is because it is easy to diagnose.
  • the means used are mass spectrometer, nuclear magnetic resonance analyzer, X-ray analyzer, SPR, chromatography (eg, HPLC, thin layer chromatography, gas chromatography), immunology Means (eg Western blotting, EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)), biochemical means (eg pI electrophoresis, Southern blotting, two-dimensional electrophoresis), Electrophoresis equipment, chemical analysis equipment, fluorescence two-dimensional differential electrophoresis (2DE-DIGE), isotope labeling (ICAT), tandem affinity purification (TAP), physical means, laser microdissection and these Or a combination of It is selected from the group consisting of.
  • chromatography eg, HPLC, thin layer chromatography, gas chromatography
  • immunology Means eg Western blotting, EIA (enzyme immunoassay), RIA (radio
  • the system or kit of the invention further comprises a marker standard.
  • a marker standard may be used to confirm whether a marker detection means (such as a factor that specifically interacts with the marker or a means for selectively recognizing the marker) is functioning normally. preferable.
  • the present invention may further include a means for purifying a target sample.
  • a means for purifying a target sample include chromatography. Since purification can increase the accuracy of the diagnosis, it can be used in preferred embodiments, but this is not essential.
  • the factor or means used in the present invention has the ability to quantify the marker of the present invention.
  • Such quantification may be a means or factor that can draw a calibration curve properly when a standard curve is drawn.
  • Preferable examples include antibodies, mass spectrometry, and chromatographic analysis. Therefore, in one embodiment, the system of the present invention further comprises a quantification means for quantifying the marker.
  • the quantification unit includes a determination unit that compares the standard curve with a measurement result to determine whether the marker is within a normal value range.
  • determination means can be realized using a computer.
  • the kit or system of the invention comprises a composition comprising a marker or said agent that specifically interacts with the marker.
  • the present invention provides a level of proliferative ability or differentiation state of a marker in a sample from a subject, a factor that specifically interacts with the marker, or a means for selectively recognizing the marker, or Provided is the use in the manufacture of a medicament for predictive diagnosis, pre-diagnosis, prediction, detection or diagnosis of a disease, disorder or condition related thereto.
  • the sample may be acquired by any means. Usually, when a person in charge other than the doctor is engaged in the measurement, it may have been acquired by the doctor in some form.
  • the determination of the level of proliferative potential or the state of differentiation, or the associated disease, disorder or condition, or whether it is possible, is abnormal compared to the normal value, relative to each marker It can be implemented by determining. It will be appreciated that in the methods of the invention, the markers used, etc. may have any one or more of the features described elsewhere in this specification as long as they do not conflict.
  • a method for measuring the marker concentration a method generally used for protein quantification can be used as it is as long as the marker concentration can be specifically measured. For example, various immunoassays, mass spectrometry (MS), chromatography, electrophoresis and the like can be used.
  • One preferred embodiment in the detection or diagnosis of the present invention is to capture a marker on a carrier and measure the concentration of the captured marker. That is, a substance having affinity for the marker is immobilized on the carrier, and the marker is captured on the carrier via the substance having the affinity. According to this embodiment, the influence of the contaminant contained in the sample can be reduced, and the marker concentration can be measured with higher sensitivity and higher accuracy.
  • an immunoassay when used as a marker measurement method, it is preferable to use a carrier on which an antibody is immobilized.
  • an immunoassay system using the antibody immobilized on the carrier as the primary antibody can be easily constructed.
  • two types of antibodies specific to a marker and having different epitopes are prepared, one is immobilized on a carrier as a primary antibody, and the other is enzyme-labeled as a secondary antibody to construct a sandwich EIA system.
  • immunoassay systems based on binding inhibition methods and competitive methods can be constructed.
  • a substrate is used as a carrier, immunoassay using an antibody chip is possible. According to the antibody chip, the concentration of a plurality of markers can be measured simultaneously, and rapid measurement is possible.
  • the marker when mass spectrometry is used as a method for measuring a marker, the marker can be captured on a carrier by ion binding or hydrophobic interaction in addition to the antibody. Ion binding and hydrophobic interactions are not as specific as bioaffinity such as antigens and antibodies, and substances other than markers are captured, but according to mass spectrometry, they are quantified by a mass spectrometer spectrum that reflects molecular weight. No problem.
  • the concentration of the marker can be measured more accurately.
  • a substrate and a metal ion substrate are preferably used.
  • the ion exchanger When the marker is captured on the carrier by ionic bonding, the ion exchanger is immobilized on the carrier.
  • both an anion exchanger and a cation exchanger can be used as the ion exchanger, and further, a strong anion exchanger, a weak anion exchanger, a strong cation exchanger, and a weak cation exchanger. Any of these can be used.
  • weak anion exchangers include those having weak anion exchange groups such as dimethylaminoethyl (DE) and diethylaminoethyl (DEAE).
  • strong anion exchangers include quaternary ammonium (trimethylaminomethyl) (QA), quaternary aminoethyl (diethyl, mono-2-hydroxybutylaminoethyl) (QAE), and quaternary ammonium (trimethylammonium. And those having a strong anion exchange group such as (QMA).
  • weak cation exchangers include those having weak cation exchange groups such as carboxymethyl (CM).
  • strong cation exchanger include those having a strong cation exchange group such as sulfopropyl (SP).
  • the hydrophobic group examples include a C4 to C20 alkyl group and a phenyl group.
  • the marker can be captured on a carrier on which metal ions such as Cu 2+ , Zn 2+ , Ni 2+ , Ca 2+ , Co 2+ , and Mg 2+ are immobilized.
  • a carrier to be used a known carrier such as a bead, a microtiter plate, or a resin can be used.
  • beads and microtiter plates are conventionally used in immunoassays, and the measurement system can be easily constructed.
  • a carrier having a planar portion such as a substrate can also be used. In this case, it is preferable to immobilize a substance having affinity for the marker in a part of the flat surface portion.
  • An example is a carrier in which a chip is used as a substrate and an antibody specific for a marker is immobilized in spots on a plurality of spots on the surface.
  • a cell selected using a detection agent or a diagnostic agent such as a probe, primer, or antibody according to the present invention as an index is an undifferentiated cell or progenitor cell having proliferative ability (for example, an undifferentiated cell or progenitor cell present in corneal endothelial cells )
  • Corneal endothelial diseases such as bullous keratopathy or corneal endotheliitis in terms of safety, survival rate, and network formation ability, compared with conventional progenitor cells introduced with a heterogeneous cell population or foreign genes, Preferred for the treatment or prevention of disorders or conditions or other ophthalmic diseases.
  • Cells that can be selected are undifferentiated cells or progenitor cells that are proliferating before arrest, i.e., proliferating, may be differentiated and matured at optimal locations in the brain, and may be further undifferentiated cells or in vivo. Since progenitor cells may proliferate, a longer-term therapeutic effect can be expected. Therefore, it can be said that the present invention opens the way to the practical application of effective treatment or prevention of corneal endothelial diseases, disorders or conditions such as bullous keratopathy or corneal endotheliitis, or other ophthalmic diseases.
  • the detection method according to the present invention can be applied to screening for substances present in corneal endothelial cells that have a high proliferation ability and / or are effective in inducing differentiation into undifferentiated cells. That is, whether or not differentiation was induced by the addition of a test substance to cells having high proliferation ability and / or undifferentiated cells present in corneal endothelial cells, such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2, etc.
  • a screening method for a substance that is present in corneal endothelial cells and has a high proliferative ability and / or effective in inducing differentiation into undifferentiated cells comprises (i) corneal endothelial cells.
  • a step of contacting a test substance with a cell having high proliferative ability and / or capable of differentiating into an undifferentiated cell eg, ES cell, iPS cell, etc.
  • a cell having high proliferative ability and / or capable of differentiating into an undifferentiated cell eg, ES cell, iPS cell, etc.
  • the test substance Detecting the expression of GPR49 / LGR5 and / or hedgehog pathway factors such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin in the cells.
  • the cells present in corneal endothelial cells and capable of differentiating into undifferentiated cells having high proliferation ability are preferably iPS cells, ES cells, or neural progenitor cells induced to differentiate from these cells. Or it can extract
  • step (i) “contacting a test substance” means, for example, adding a test substance to cultured cells containing cells having high proliferation ability and / or capable of differentiating into undifferentiated cells existing in corneal endothelial cells. Can be done.
  • Test substances that can be used include synthetic low molecular weight compounds, proteins, synthetic peptides, purified or partially purified polypeptides, antibodies, bacterial release substances (including bacterial metabolites), nucleic acids (antisense, ribozymes, RNAi, etc.) Preferably, it is a compound or a salt thereof, or a solvate (for example, hydrate) thereof, but is not limited thereto.
  • the “test substance” may be a novel substance or a known substance.
  • step (ii) expression of a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin is performed according to the detection method of the present invention. Can be detected.
  • a factor of a hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or a factor of a Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin is performed according to the detection method of the present invention. Can be detected.
  • Specific embodiments include GPR49 / LGR5 and GPR49 / LGR5 by appropriately performing detection using a hybridization method described herein, detection using a nucleic acid amplification method, and detection using an antigen-antibody reaction.
  • Expression of factors of the hedgehog pathway such as SHH, PTCH1, GLI1, and GLI2 and / or factors of the Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin can be detected.
  • the substance is added to the corneal endothelium. It can be determined that the substance has a high proliferation ability and / or is effective in inducing differentiation into undifferentiated cells. When suppression or disappearance of expression of Wnt pathway factors such as LRP6 and ⁇ -catenin is detected, the substance is effective in inducing differentiation into corneal endothelial cells having high proliferative ability and / or undifferentiated cells. It can be determined that the substance is a new substance.
  • the substance specified by the screening method according to the present invention can be used as a substance effective in inducing differentiation into corneal endothelial cells having high proliferation ability and / or undifferentiated cells.
  • a method for screening a substance present in corneal endothelial cells having high proliferative ability and / or effective in inducing differentiation into undifferentiated cells comprising: (iii) contacting a test substance Thereafter, expression of differentiation marker genes other than factors of hedgehog pathway such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, and GLI and / or factors of Wnt pathway such as LRP6 and ⁇ -catenin is detected in the cells.
  • the step of performing may further include the following steps.
  • step (ii) expression of GPR49 / LGR5 and / or factors of hedgehog pathway such as SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or factors of Wnt pathway such as LRP6, ⁇ -catenin is detected, and step (ii) iii) differentiation marker genes other than hedgehog pathway factors such as GPR49 / LGR5 and / or SHH, PTCH1, GLI1, GLI2 and / or Wnt pathway factors such as LRP6, ⁇ -catenin (eg, Ki-67, When expression of BrdU or the like is detected, it can be determined with high accuracy that the substance is a substance having high proliferation ability existing in corneal endothelial cells and / or effective for induction into undifferentiated cells. .
  • Step (iii) may be performed after step (i), and may be performed before or after step (ii).
  • the oligonucleotide of the present invention can be synthesized by a standard method known in the art, for example, by using an automated DNA synthesizer (commercially available from Biosearch, Applied Biosystems, etc.). is there.
  • an automated DNA synthesizer commercially available from Biosearch, Applied Biosystems, etc.
  • it is possible to synthesize phosphorothioate oligonucleotides by the method of Stein et al. (Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209), and control pore glass polymer supports (Sarin et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451), etc. can also be used to prepare methylphosphonate oligonucleotides.
  • the animals used in the following examples were handled based on the Declaration of Helsinki in compliance with the standards prescribed at Kyoto Prefectural University of Medicine or Doshisha University. In addition, animals were raised and handled according to the ARVO Declaration on the Use of Animals in Visual and Ophthalmic Research (the ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research). Moreover, although the products specifically described in the examples were used as reagents, other manufacturers (Sigma, Wako Pure Chemicals, Nakarai, abcam, Santa Cruz Biotechnology, R & D Systems, Abnova, Assay Pro, Origin, Biobyte, Biorad, Cell Signaling Technology, GE Healthcare, IBL, etc.) can be substituted.
  • Cell culture In primary cultures of human corneal endothelial cells, the Descemet's membrane containing the endothelial cell layer is detached from the corneal tissue and placed in 2 mg / ml Collagenase A (catalog number: 70164923; Roche Applied Science, Penzberg, Germany) dissolved in OPTIMEM-I. Incubated at 37 ° C. 3 hours later, after centrifuging at 1000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, the culture medium was added to the precipitated corneal endothelial cell mass and mixed, and FNC Coating Mix (Catalog Number: 0407; Athena Enzyme Systems, Baltimore, The whole amount was seeded in a 12-well plate coated with MD, USA).
  • the culture medium was OPTIMEM-I (Catalog Number: 51985; Gibco-Invitrogen, Carlsbad, Calif.) With 5% fetal calf serum (Catalog Number: 10437-028; fetal bovine serum; FBS; BioWest, France), 50 ⁇ g / ml Gentamin (Gentamicin). Invitrogen) plus 10 ⁇ g / ml Y-27632 (Calbiochem, La Jolla, Calif.) was used.
  • the Descemet's membrane including the endothelial cell layer is peeled from the corneal tissue and dissolved in DMEM (Gibco-Invitrogen). And incubated at 37 ° C. After 1 hour, the corneal endothelial cells were peeled off from the Descemet's membrane by pipetting and collected. After centrifuging at 1000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, the culture medium was added to the precipitated corneal endothelial cells, mixed, and FNC Coating Mix. The whole amount was inoculated into a 6-well plate coated with.
  • the culture medium is 10% FBS, 50 ⁇ g / ml gentamicin (catalog number: 15710-064; Invitrogen), 10 ⁇ g / ml Y-27632 (catalog number: 6880005; Calbiochem, La Jolla) in DMEM (catalog number: 12320; Gibco-Invitrogen).
  • CA 2 ng / ml basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor; catalog number: 13256-029; bFGF; Invitrogen) was used.
  • the human cornea used had a period of less than 14 days until the primary culture.
  • CEC human and monkey corneal endothelial cells
  • the medium was changed every two days. Passaging was performed when the cells became 50-80% confluent.
  • cells were washed with Ca 2+ Mg 2+ free PBS (PBS-; Nissan Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo. Japan), and TrypLE TM Select (catalog number: 12563; Invitrogen) was added. , Incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Cells were detached from the plate and collected, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and then a culture medium was added to obtain a cell suspension. Cells were seeded at a density of 1: 2 onto plates coated with FNC Coating Mix.
  • the corneal tissue was embedded in OCT compound (catalog number: 4583; Sakura Finetek, Tokyo, Japan) and frozen in liquid nitrogen.
  • the frozen block was sliced into 8 ⁇ m, attached to a silane-coated slide, and air-dried.
  • the Descemet's membrane containing corneal endothelial cells was peeled from the corneal tissue, allowed to stand in ice-cooled 100% acetone for 30 seconds, then attached to a silane-coated slide and air-dried. Cultured corneal endothelial cells used were cultured in LabTek 8-well plastic chamber slides.
  • Ice-cooled 100% acetone was added to the corneal tissue and cultured cells and allowed to stand at 4 ° C. for 15 minutes to fix the cells. After shaking and washing with 0.15% Triton X / PBS-, 1% bovine serum albumin (catalog number: A4503BSA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) was added and left standing for 30 minutes at room temperature for blocking. . Primary antibody was diluted with 1% BSA and incubated for 1 hour at room temperature.
  • Primary antibodies used include anti-rabbit GPR49 / LGR5 (catalog number: GTX71143; 1: 200; GeneTex Inc., San Antonio, TX), anti-rabbit Nestin (catalog number: PRB-570C; 1: 200; COVANCE, Berkeley, CA), anti-mouse ABCG2 (catalog number: NC 236; 1: 2; Kamiya biomedical CO., Seattle, WA USA), anti-mouse Ki-67 (catalog number: 556003; 1: 200 BD Pharmingen TM NJ, USA), anti-rabbit Na + / K + ATPase (catalog number: A132; 1: 100; Zymed ), anti-rabbit ZO1 (Zymed Laboratories Inc., South San Franc sco, CA) was used. Washing was carried out by shaking twice with 0.15% Triton / PBS- and once with PBS-.
  • the secondary antibody was diluted with a mixed solution of 1% BSA and 0.15% TrironX / PBS- and incubated at room temperature for 30 minutes. Secondary antibodies used include Alexa TM Fluor 488 conjugated goat anti-rabbit IgG (catalog number: A11034; 1: 1500; Molecular Probe-Invitrogen) and Alexa TM Fluor 488 conjugated goat anti-mouse IgG (catalog) Number: A11029; 1: 1500; Molecular Probe-Invitrogen). After washing with 0.15% Triton / PBS- and shaking with PBS- once, nuclear staining was performed with propidium iodide (catalog number: SP29004-41; PI; Nacalai Tesque, Inc. Kyoto, Japan). And covered with a cover glass. The images were observed and photographed with a confocal laser microscope (Olympus Fluoview, Tokyo, Japan).
  • RNeasy Mini Kit (Catalog Number: 74106; QIAGEN, Valencia, CA) was used for RNA extraction from corneal tissue and cultured cells.
  • 1 ⁇ l of OligodTPrimer (catalog number: 18418-020; Invitrogen) was added per 1 ⁇ g of extracted RNA, and the mixture was incubated at 70 ° C. for 2 minutes and immediately cooled on ice.
  • 5 ⁇ First-Strand buffer 100 mM DTT (catalog number: 772590; Invitrogen), SuperScript TM II Reverse Transcriptase (catalog number: 18064-014; Invitrogen), 2.5 mM dNTP (01: Bio Bc.
  • GPR49 / LGR5-positive cells and GPR49 / LGR5-negative cells were separated using a flow cytometer (FACS Aria II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)), and each cell was seeded on an 8-well chamber slide and cultured. . Three days later, immunostaining was performed with anti-mouse Ki-67, and the number of Ki-67 positive cells was counted.
  • GPR49 / LGR5 MISSION® shRNA Plasmid DNA (Sigma-Aldrich) was purchased to make lentiviral particles containing the GPR49 / LGR5 shRNA viral vector (Table 2).
  • GPR49 / LGR5 expression vector used was transferred from Keigo Kawasaki, Kyoto Prefectural University of Medicine.
  • the method for producing this vector is as follows.
  • a lentiviral plasmid vector that expresses the target gene (here, GPR49 / LGR5) was used.
  • the present inventors used a commercially available lentiviral vector (pLenti6.3_V5-TOPO; Invitrogen) as a vector for inserting the target gene.
  • An amplification reaction was performed using cDNA as a template using a primer pair including the entire coding sequence of a specific gene, gel purified, and ligated to a lentiviral plasmid vector.
  • lentiviral plasmid DNA was used with 14 ⁇ l Fugene HD as a transfection reagent using ViraPower TM Lenticular Packaging Mix (Invitrogen), a packaging plasmid mixture containing pLP1, pLP2 and pLP / VSVG plasmids.
  • HEK293T cells were transfected. After 18 hours, the medium was removed by suction and replaced with complete medium (DMEM supplemented with 10% FBS; hereinafter also referred to as “culture medium”) to evaluate the quality of lentiviral particles.
  • HEK293T cells were seeded at a density of 9.0 ⁇ 10 5 cells / 25 cm 2 in a culture medium supplemented with 10% FBS in DMEM. After 24 h incubation, OPTIMEM-I, FuGENE was added (R) HDTransfection Reagent (Roche Applied Science) and Lentiviral Packaging Mix (Sigma-Aldrich ( MISSION Lentiviral Packaging Mix) or Invitrogen), a 5% CO 2 at 37 ° C. Incubated under conditions. After 18 hours, the culture medium was replaced, and the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 . After 24 hours, the culture medium containing lentiviral particles was collected.
  • HIV-1 p24 Antigen ELISA kit ZeptoMetrix Corporation, Buffalo, NY, USA was used for titer measurement of the collected lentivirus.
  • Non-Target shRNA Control Vector Sigma-Aldrich having a random sequence was used as a control.
  • Human and monkey cultured corneal endothelial cells were seeded in 6-well plates (5000 cells / well; 6-well plates treated with FNC Coating Mix®) or 8-well chamber slides (500 cells / well) and incubated at 37 ° C. for 5 Culturing was performed under the condition of% CO 2 .
  • the prepared lentiviral particles and 4 ⁇ g / ml hexadimethrine bromide (Sigma-Aldrich, also referred to as polybrene) were added, and the cells were transfected at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions.
  • the culture medium was replaced with 0.4 ⁇ g / ml puromycin (Calbiochem), and puromycin resistant cells were selected. Puromycin-resistant colonies were cultured in the presence of 0.4 ⁇ g / ml puromycin, and the medium was changed every two days.
  • lentiviral vector for gene expression
  • pLenti6.3_V5-TOPO Invitrogen
  • CDNA with a primer pair surrounding the entire coding sequence of a particular gene was amplified, gel purified and then ligated into a lentiviral plasmid vector.
  • lentiviral plasmid DNA was used in HEK293T cells with FuGENE® HD as a transfection reagent with plasmid packaging plasmid mixture ViraPower TM Lenticular Packaging Mix (Invitrogen) containing pLP1, pLP2 and pLP / VSVG plasmids. Transfected. After 18 hours, the medium was aspirated and replaced with complete medium, and the amount of lentiviral particles was evaluated.
  • the protein was separated by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane.
  • the membrane was then blocked with 1% ECL Advance Blocking Reagent (GE Healthcare) in TBS-T buffer and incubated overnight at 4 ° C. with the primary antibody. After washing three times in TBS-T buffer, the PVDF membrane was incubated with an appropriate HRP-labeled anti-rabbit or mouse IgG secondary antibody for 1 hour at room temperature. The membrane was exposed with an ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare) and observed with a LAS3000S imaging system (Fuji Film Co., Ltd., Tokyo).
  • Example 1 Expression of stem cell marker in full-thickness human corneal tissue
  • ABCG2 nestin and ATP-coupled set subfamily G member 2
  • GPR49 / LGR5 was minimally expressed in the corneal epithelium and corneal stroma (FIG. 2a).
  • Nestin was moderately expressed throughout the cornea, and ABCG2 was found to be expressed primarily in the basal cell layer of the corneal epithelium and weakly in the corneal stroma and endothelium (FIG. 2a).
  • Nestin was strongly expressed in all layers of the cornea. ABCG2 was strongly expressed in corneal epithelial basal cells, and was also expressed in corneal stroma and corneal endothelium. The mRNA expression levels of GPR49 / LGR5, Nestin, and ABCG2 were compared by real-time PCR (FIG. 2b). The expression levels of Nestin mRNA and ABCG2 mRNA were significantly increased in the corneal epithelium and corneal stroma compared to the corneal endothelium. On the other hand, it was confirmed that the expression level of GPR49 / LGR5 mRNA was significantly increased in the corneal endothelium.
  • GPR49 / LGR5 was determined to be one of the proteins expressed specifically in corneal endothelial cells.
  • the Descemet's membrane containing corneal endothelial cells was detached from the corneal tissue, and the expression level was compared by immunostaining and real-time PCR (Fig. 2c).
  • GPR49 / LGR5 was strongly expressed in the cell membrane and cytoplasm of the endothelial cells in the periphery of the cornea (FIG. 2d).
  • the expression level of GPR49 / LGR5 mRNA was also increased in the peripheral corneal endothelium compared to the central part (FIG. 2e).
  • Example 3 GPR49 / LGR5 expression in cultured human corneal endothelial cells
  • GPR49 / LGR5 expression in cultured human corneal endothelial cells was examined.
  • GPR49 / LGR5 could stably maintain the expression in the subcultured cultured corneal endothelial cells (FIG. 3c).
  • GPR49 / LGR5 mRNA tended to decrease in expression level by passage compared to monkey corneal tissue, the expression level could be maintained (FIG. 3d).
  • phase contrast micrographs of monkey CEC showed that both in vivo and in vitro (P0, P1) cells showed a confluent monolayer of smaller sized homogeneous hexagonal cells (FIG. 3c). Immunostaining of these cells showed that GPR49 / LGR5 was moderately expressed both in vivo and in vitro (FIG. 3c), but mean GPR49 / LGR5 mRNA expression in vitro was as the cells were passaged. It gradually decreased (* p ⁇ 0.05) (FIG. 3d). In view of these findings, it appears that GPR49 / LGR5 may be an important regulator for maintaining the undifferentiated state of CEC in vitro when using human and monkey cells.
  • GPR49 / LGR5 may have an important function in stable culture of corneal endothelial cells in vitro.
  • Example 5 Examination of cell biological characteristics of GPR49 / LGR5 positive cells
  • analysis was performed using FACS.
  • GPR49 / LGR5-positive cells GPR49 / LGR5 +
  • GPR49 / LGR5-negative cells GPR49 / LGR5-
  • GPR49 / LGR5 (+) and GPR49 / LGR5 ( ⁇ ) cells a subset of cells was isolated by flow cytometry.
  • expression at the protein level was confirmed in the purified fraction by immunofluorescence for GPR49 / LGR5 (FIG. 4a). Since the highest colony-forming ability is reported in the smallest keratinocytes, [Barrandon Y et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1985; 82: 5390-5394], and the size of the cells in each of the isolated fractions was measured using Scion Image software.
  • GPR49 / LGR5 + and GPR49 / LGR5- were photographed with a fluorescence microscope, and the size of 35 cells was randomly measured with Image J (Wayne Rasband (NIH) free software).
  • GPR49 / LGR5 + was found to be significantly smaller than GPR49 / LGR5- (FIGS. 4a and 4b).
  • the isolated cell fraction was then cultured on a cell chamber slide to assess the state of each cell cycle in the isolated cell fraction.
  • the percentage of Ki67 labeled cells in GPR49 / LGR5 (+) cells and GPR49 / LGR5 ( ⁇ ) cells is 14.2 ⁇ 3.87% and 0.58 ⁇ 0.5%, respectively, and the difference in Ki67 labeling index was statistically significant (* p ⁇ 0.05) (FIG. 4c).
  • FIG. 4c As a result, it was revealed that the Ki-67 positive cell rate was significantly higher in GPR49 / LGR5 + (FIG. 4c).
  • FACS was used for double staining of GPR49 / LGR5 and Ki67 to further clarify the relationship between GPR49 / LGR5 and cell proliferation.
  • cultured monkey corneal endothelial cells (passage number 3) were double-stained with anti-rabbit GPR49 / LGR5 and antibody mouse Ki-67, and analysis by FACS was attempted.
  • GPR49 / LGR5 + in all cells was 7.2%, of which GPR49 / LGR5 + / Ki-67 + was 3.4% (FIG. 4d). Further, GPR49 / LGR5- / Ki-67 + cells were not observed.
  • Example 6 GPR49 / LGR5 as a target gene of a hedgehog signal
  • GPR49 / LGR5 was examined for its function in hedgehog signals.
  • Hedgehog signal was identified as a signal related to morphogenesis in the embryonic period, and it has since been revealed that it is deeply involved in stem cells and canceration of adult tissues. HH signaling has also been reported to play an important role in various types of biological processes such as cell differentiation, proliferation and growth [Barker N et al, Nature, 2007; 449: 1003. -1007; Stanton BZ et al, MolBiosys. 2010; 6: 44-54; Tsuru T et al, Jpn J Ophthalmol. 1984; 28: 105-125]. Three types of proteins, SHH, Indian Hedgehog (Ihh), and Desert Hedgehog (Dhh), have been identified as human ligands.
  • Ihh Indian Hedgehog
  • Dhh Desert Hedgehog
  • Ptch1 12-transmembrane protein Patched1
  • Ptch1 a receptor that acts to suppress signals, suppresses cell membrane localization of the 7-transmembrane protein Smoothened (Smo), and downstream signals Transmission to the molecule is also inhibited.
  • no signal is transmitted to the transcription factor Gli family (Gli1, G1i2, Gli3) downstream of Smo, and transcription of the target gene does not occur.
  • Binding of the ligand to Ptch1 eliminates suppression of Ptch1 to Smo, activates a signal pathway from Smo to the transcription factor Gli family, and transcribes target genes such as Cyclin D / E and Myc.
  • Signal related molecules, Ptch1 and Gli1 are also target genes and serve as indicators of signal activation.
  • GPR49 / LGR5 has a high expression level in the periphery of the cornea (FIGS. 2c, 2d, and 2e). Therefore, the mRNA expression levels of hedgehog signal-related molecules (Shh, Smo, Ptch1, Gli1, Gli2) in human corneal central endothelial cells and peripheral endothelial cells are compared, and the characteristics of GPR49 / LGR5 in CEC are defined at the molecular level. In order to do this, first, the expression of HH signaling-related molecules in CEC was examined.
  • Human corneal tissue was treated with 100 ng / ml rhShh, 10 ⁇ M purmorphamine, 10 ⁇ M cyclopamine and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 days.
  • the Descemet's membrane was peeled from the cornea and applied to a silane-coated slide, and GPR49 / LGR5 and Ki-67 were immunostained. Further, RNA of corneal endothelial cells incubated under the same conditions was extracted, and the mRNA expression level was measured by real-time PCR.
  • GPR49 / LGR5 was able to confirm the expression cells only in the rhShh addition group (FIGS. 5d and 5e).
  • the expression level was increased in the rhShh addition group and the purmorphamine addition group as compared with the control (FIG. 5f).
  • the cyclopamine addition group abnormal cell morphology and suppression of cell proliferation were observed.
  • CEC has reportedly maintained the ability to grow in vitro [EngelmannK et al. , Invest Ophthalmol Vis Sci. 1988; 29: 1656-1662], therefore, as described above, we examined whether the HH pathway induces in vitro proliferation of CEC. Ki67 expression was found to be upregulated in response to SHH and purmorphamine stimulation, but this was not upregulated in response to cyclopropamine (FIG. 5g). These findings indicate that the HH pathway can induce CEC proliferation in an in vitro situation. The inventors determined that CEC treated with cyclopamine failed to maintain its normal hexagonal morphology (FIG. 5f). In view of these findings, the present inventors have found for the first time that GPR49 / LGR5 is a target molecule for HH signaling in CEC, and that the maintenance of CEC is partly regulated by the HH pathway.
  • Example 7 GPR49 / LGR5 gene expression suppression using shRNA
  • shRNA suppression of GPR49 / LGR5 expression by shRNA was attempted using cultured monkey corneal endothelial cells highly expressing GPR49 / LGR5.
  • Example 8A Forced expression of GPR49 / LGR5 gene
  • the cultured human corneal endothelial cells transfected with the GPR49 / LGR5 expression vector were found to have about 60-fold increased expression compared to the control (FIG. 6d).
  • cells into which GPR49 / LGR5 was introduced cell differentiation was suppressed, and expression of Na + / K + ATPase used for evaluation of the pump function of corneal endothelial cells was enhanced (FIG. 6c).
  • the mRNA expression level of hedgehog signal-related molecules ptch1, gli1, gli2
  • GPR49 / LGR5 is specifically expressed in stem cells / progenitor cells of corneal endothelial cells present in the peripheral part of corneal tissue.
  • the hedgehog signal has a function of promoting proliferation of corneal endothelial cells, but GPR49 / LGR5, which is a downstream gene of the hedgehog signal, is important for maintaining undifferentiated cells by suppressing the hedgehog signal. It has become clear that it plays an important role.
  • Hedgehog signal activation causes cell proliferation to be promoted by the proliferation of adult neural stem cells by addition of rhShh (Lai et al., Nature neuroscience 6: 21-27, 2003), mesenchymal stem cells by addition of purmorphamine Cell proliferation / differentiation promotion (Wu et al., Chem. Biol. 11, 1,229-1, 238, 2004). There was thought to be. Since no stable culture method for corneal endothelial cells has been established at present, it is understood that the method may be applied to the establishment of a new culture method using the effect of promoting cell proliferation by activation of hedgehog signal. . In this example, it is understood that proliferation is enhanced in cultured endothelial cells by the activation of SHH.
  • SHH can be used as a marker of the degree of differentiation.
  • the expression of GPR49 / LGR5 was enhanced by activation of hedgehog signal, but the effect of promoting cell proliferation was not obtained (FIG. 5b). It has been reported that the cells of human corneal endothelial cells are in very close contact with each other in vivo, and the cell cycle does not work unless cell-cell adhesion is relaxed using EDTA (Senooo et al., IOVS). 41 2930-2935, 2000).
  • GPR49 / LGR5 forced expression cells tend to contact cells at high density, and the functionality of corneal endothelial cells is high. It was speculated that GPR49 / LGR5 might contribute to maintenance of undifferentiation by controlling the progression to proliferation / differentiation by activation of hedgehog signal. There is a possibility that GPR49 / LGR5 is related to cell-cell adhesion, and it is considered that further research is necessary as a future study subject.
  • corneal endothelial cells may have a controlled cell growth in vivo by a hedgehog signal using Sonic hedgehog as a ligand.
  • GPR49 / LGR5 which is a target gene of hedgehog signal, is considered to be involved in the corneal endothelial cell undifferentiation maintenance mechanism.
  • GPR49 / LGR5 is an orphan receptor of the G protein-coupled receptor superfamily and its ligand is unknown.
  • RSPO functions as a ligand for GPR49 / LGR5 and regulates Wnt / ⁇ -catenin signaling [Carmon KS et al. Proc Natl Acad Sci USA. , 2011; 108: 11452-11457; de Lau W et al. , Nature, 2011; 476: 293-297; Glinka A et al. , EMBO Rep. 2011; 12: 1055-1061].
  • RSPO1, 2, 3 and 4 are expressed in corneal epithelial, parenchymal and endothelial cells, and RSPO1, 2 and 3 are only expressed in CEC in the peripheral region.
  • a in FIG. 6C we cultured primate CEC with or without human recombinant RSPO.
  • RSPO1 show compact smaller sized homogeneous hexagonal cells, while other RSPOs have an effect on CEC differentiation in vitro. There was not (B in FIG. 6C).
  • RSPO1 can play an important role in maintaining CEC, among the RSPO families.
  • keratinocyte stem cells can be distinguished from transiently amplified cells or differentiated cells depending on the cell size [Barrandon Y et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1985; 82: 5390-5394].
  • the response of minimal keratinocytes to phorbol esters is different from that of other cells.
  • These keratinocytes also showed the highest colony forming ability.
  • CEC is different from ectoderm-derived keratinocytes, the average diameter of our GPR49 / LGR5 (+) cells was actually smaller than that of GPR49 / LGR5 ( ⁇ ) cells. Based on these findings and the reported size of the peripheral CEC. Cell size appears to be a potential indicator of corneal endothelial stem / progenitor cells.
  • GPR49 / LGR5 is an important molecule for maintaining the undifferentiated state of CEC and regulating the normal cell phenotype in vitro.
  • isolated cells fractionated based on their GPR49 / LGR5 expression intensity can give rise to different cell populations with different properties. Only cells in the GPR49 / LGR5 (+) population showed exceptionally high proliferative capacity, a feature associated with the stem / progenitor cell population. Based on these findings, unique expression patterns and unavoidability in in vitro conditions, there may be some relationship between GPR49 / LGR5 and corneal endothelial stem / progenitor cell function.
  • HH signaling may control corneal endothelial morphogenesis.
  • RSPO is a family of 4 cysteine rich secreted proteins isolated as a potent enhancer of Wnt / ⁇ -catenin signaling.
  • a great deal of information regarding the cell biological function of RSPO has been revealed over the past few years, especially regarding its role as a ligand for the orphan receptor LGR4 / 5/6. From these updated important findings, we decided to further investigate whether RSPO could have an effect on the function of human CEC. Since human CEC is mitotically inactive and essentially incapable of regeneration in vivo, after loss of corneal endothelium due to disease or trauma, compensatory expansion of the remaining endothelial cells Occurs.
  • GPR49 / LGR5 is a positive or negative regulator of the Wnt pathway
  • Garcia MI et al. DevBiol. , 2009; 331: 58-67; Schuijers J et al. , EMBOJ. , 2012; Walker F et al. , PLoS One. 2011; 6: e22733 One possible explanation is that the molecular mechanism depends on the tissue, organ and species.
  • the cornea is a unique avascular tissue maintained by tears and aqueous humor.
  • RSPO1 dramatically accelerates CEC proliferation and inhibits corneal endothelial MT via the Wnt pathway.
  • GPR49 / LGR5 has proven to be a powerful tool in identifying large numbers of stem / progenitor cell populations. Regulation of GPR49 / LGR5 via the HH and Wnt pathways fully organized and maintained CEC integrity.
  • RSPO1 a GPR49 / LGR5 ligand, can pioneer new and sufficient protocols to provide effective augmentation of CEC, and RSPO1-based three-dimensional cultures and medical procedures can only be used to treat corneal dysfunction Rather, it is understood that it promises a promising regenerative therapy for the treatment of various serious systemic diseases.
  • Example 9 Cell growth promoting effect of R-spondins
  • an experiment was conducted for the purpose of examining the cell growth promoting effect of R-spondins, particularly R-spondin 1, in the culture of corneal endothelial cells.
  • EdU (5-ethyl-2'-deoxyuridine) is a modified nucleic acid that is incorporated into DNA in the DNA synthesis phase by a chemical reaction, and is widely used to identify cells in the DNA synthesis phase in place of conventional BrdU. By measuring the positive rate of EdU, the proliferating cell rate in cultured cells can be determined.
  • Example 10 Cell growth promoting effect of R-spondins in cultured human corneal endothelial cells
  • RSPO1 Use RSPO1 to investigate the association of R-spondin 1 (RSPO1), R-spondin 2 (RSPO2), R-spondin 3 (RSPO3), R-spondin 4 (RSPO4) with corneal endothelial cell differentiation Then, the relationship was examined.
  • the reagents used are as follows.
  • Human cultured corneal endothelial cells were cultured for 7 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 in RSPO1 added (50 ng / ml) and non-added groups.
  • RSPO1 added 50 ng / ml
  • the cells in the RSPO1-added group were maintained in a paving stone shape, whereas in the non-added group, the cells differentiated like fibroblasts. From the above results, it was confirmed that RSPO1 has an effect of suppressing differentiation of corneal endothelial cells.
  • RSPO1 to 4 were incubated on human corneal endothelial cells for 1 day under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . Thereafter, Ki-67, which is a cell proliferation marker, was immunostained. As a result, although growth tendency was observed in all of RSPO1 to 4, only RSPO1 significantly promoted the proliferation of human corneal endothelial cells.
  • Example 11 Effect of R-spondins on confluent cells
  • Method As a human corneal endothelial cell, the corneal endothelial cell was mechanically detached from the cornea for research purchased from Seattle Eye Bank together with the basement membrane, and collagenase (ROCHE catalog number: 10 103 586 001) was used. The primary culture was carried out after peeling off the basement membrane and collecting.
  • the medium is Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Liquid (INVITROGEN catalog number: 31985-070) + 8% fetal bovine serum (FBS) (BIOEST, catalog number: S1820-500) + 200 mg / ml CaCl 2 ⁇ 2H 2 O (SIGMA catalog number: C7902-500G) + 0.08% chondroitin sulfate (SIGMA catalog number: C9819-5G) +20 ⁇ g / ml ascorbic acid (SIGMA catalog number: A4544-25G) +50 ⁇ g / ml gentamicin (INVITROGEN catalog number: 15710-064 ) +5 ng / ml EGF (INVITROGEN catalog number: PHG0311) conditioned for 3T3 feeder cells was used.
  • FBS fetal bovine serum
  • R-spondin 1 is added to the medium at a concentration of 10 ng / ml. The culture was continued. The cell morphology was observed with a phase contrast microscope, and the cell density was calculated.
  • the results are shown in FIG.
  • the average corneal endothelial cell density when it reached confluence and no obvious change was observed in the corneal endothelial density was 566.8 cells / mm 2 , but the density increased over time, and on the 7th day About 695 pieces / mm 2 , about 875 pieces / mm 2 after 14 days, and 995.8 pieces / mm 2 after 21 days.
  • the number of cells was 535.4 / mm 2 .
  • Example 12 Production of tissue with increased corneal endothelial density by R-spondins
  • a tissue with increased corneal endothelium density can be prepared by treatment of corneal tissue with R-spondins.
  • the corneal endothelial cell density was significantly increased by R-spondin1. That is, the corneal endothelial cell density is 3673 cells / mm 2 in the case where R-spondin 1 is not added, 4314 cells / mm 2 when R-spondin 1 is added at 1 ng / ml, and 4626 cells / mm 2 when R-spondin 1 is added at 10 ng / ml. When mm 2 and 100 ng / ml were added, the number increased to 5037 / mm 2 .
  • Example 13 Proliferative effect in cells such as corneal stroma, epithelium, retinal pigment epithelium (RPE), vitreous
  • the proliferation effect of R-spondins in cells such as corneal stroma, epithelium, RPE and vitreous body is confirmed.
  • the culture methods are listed below. In each culture method, it can be confirmed that the effect on proliferation is promoted by culturing in the presence or absence of R-spondins according to the above examples.
  • Corneal parenchymal cells were obtained from Yamamoto M, Quantock AJ, Young RD, Okumura N, Ueno M, Sakamoto Y, Kinoshita S, Koizumi N. et al. Mol Vis. 2012; 18: 1727-39. Briefly, rabbit cornea is incubated with 1.2 U ⁇ ml dispase (Invitrogen) for 1 hour at 37 ° C. Thereafter, the corneal epithelium and corneal endothelium are removed by mechanical scraping. The corneal stroma is then cut into approximately 1 cm 2 pieces which are incubated overnight at 37 ° C.
  • DMEM / F12 containing 1 mg / ml collagenase A (Roche Diagnostics Japan) and 1% penicillin-streptomycin. After centrifuging at 1500 rpm (440 ⁇ g) for 3 minutes, the cells are continuously cultured in cell-free medium (DMEM / F12 containing 10 ⁇ g / ml, 1 mM ascorbic acid, and 1% penicillin-streptomycin) for 48 hours. Experiments can be performed using the cells thus obtained.
  • DMEM / F12 containing 10 ⁇ g / ml, 1 mM ascorbic acid, and 1% penicillin-streptomycin
  • RPE retinal pigment epithelium
  • MRPEC monkey retinal pigment epithelial cells
  • MRPEC and RPEC fragments were previously reported for human fetal RPE (Maminishkis A, Chen S, Jalkiesee S, et al. of native tissue.Invest Ophthalmol Vis Sci.2006; 47: 3612-3624).
  • MRPECs were then cultured in DMEM / F12 supplemented with 10% FBA, 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / mL streptomycin in FNC Coating Mix®-coated dishes at 37 ° C. in 5% CO 2 . Further expansion under humidified environment. The culture medium is then changed every two days.
  • the amniotic membrane was collected according to the method approved by the Kyoto Medical University Ethics Committee and used for the study. After obtaining written consent from a pregnant woman scheduled for cesarean section with no infection and no complications, the amnion was aseptically collected at the time of cesarean section, washed, immersed in 50% chrysolol DMEM solution, and stored frozen at -80 ° C. did. Next, corneal epithelial stem cells collected from human corneal tissue obtained permission from Northwest Lion Eye Bank (Seattle, WA, USA) for research purposes were cultured.
  • corneal epithelial cells were collected as a cell suspension by enzymatic treatment using 1.2 U dispase at 37 ° C. for 1 hour. The cell suspension was then seeded on amniotic membrane and cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for about 2 weeks.
  • Vitreous cell (hyalocyte) culture method Vitreous cells are described in Somer F, Pollonger K, et al. Culture is performed according to the method reported in Grafes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2008. First, the vitreous was collected from monkey eyes and washed 3 times with DMEM supplemented with 1% penicillin / streptomycin. Apply to 1 mg / ml collagenase and incubate overnight at 37 ° C. with rotation. After centrifugation, the supernatant is removed and washed with DMEM supplemented with 1% penicillin / streptomycin. Add DMEM + 10% FBS, 1% P / S and seed in culture dishes.
  • Example 14 Experiments with other cells
  • the proliferation effect of R-spondins is confirmed on nerve cells, conjunctival epithelium, amniotic epithelium, oral mucosal epithelium, and nasal mucosal epithelium.
  • the culture method can be performed according to a known method. In each culture method, it can be confirmed that the effect on proliferation is promoted by culturing in the presence or absence of R-spondins according to the above examples.
  • Example 15 Formulation Example: Corneal Preservation Solution Containing Growth Stimulation or Differentiation Control Agent
  • a corneal preservation solution containing the culture normalizing agent of the present invention is produced as follows.
  • R-spondin 1 10-500 ng / ml (adjust as appropriate)
  • Optisol-GS (Bausch-Lomb) adequate amount 100mL
  • Each component was purchased from R & D Systems Inc. (Minneapolis, MN).
  • R-spondin 1 10-500 ng / ml (adjust as appropriate) Sodium chloride 0.85g Sodium dihydrogen phosphate dihydrate 0.1g Benzalkonium chloride 0.005g Sodium hydroxide appropriate amount Purified water appropriate amount Total amount 100 mg (pH 7.0).
  • O Eye drops can be diluted with a base.
  • composition of the substrate is as follows.
  • O Differentiation markers for eye cells and differentiation control technology are provided, and technologies that can be used in industries related to the technology related to corneal transplantation (cell culture industry, pharmaceuticals, etc.) are provided.
  • SEQ ID NO: 1 Gene encoding human GPR49 / LGR5 (OMIM: 606667; NM_003667.2)
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of human GPR49 / LGR5 (OMIM: 606667; NP_003658.1)
  • SEQ ID NO: 3 R-spondin 1 (RSPO1) (OMIM: 609595; NM_001038633) (transscript variant 1)
  • SEQ ID NO: 4: R-spondin 1 (RSPO1) (OMIM: 6095595; NM_001038633) (transscript variant 1)
  • Gene sequence encoding R-spondin 2 (RSPO2) (OMIM: 610575; NM — 178565)
  • SEQ ID NO: 7: R-spondin 3 (RSPO3) OMIM: 610574; NM

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Abstract

本発明は、眼細胞の分化マーカーおよび分化制御技術に関する。より特定すると、本発明は、GPR49/LGR5を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカー、ならびにGPR49/LGR5に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤、あるいは検出方法を提供することによって、上記課題のうち眼細胞の分化マーカーを提供するという課題を解決した。また、本発明は、R-spondin類を含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供することによって、眼細胞の分化制御技術を提供するという課題を解決した。

Description

眼細胞の分化マーカーおよび分化制御
　本発明は、細胞、特に眼科領域の分化状態のマーカー、ならびに眼細胞（特に、分化制御の難しい角膜内皮細胞）の分化を抑制および／または増殖を刺激するための技術、方法、ならびにそのための薬剤および培地に関する。
　視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。
　角膜は眼球の前方に位置し、主に角膜上皮細胞層、角膜実質層、角膜内皮細胞層の３層構造を持った透明な組織である。角膜内皮細胞層は角膜深層部に存在する単層の細胞層であり、バリア機能とポンプ機能を持ち、角膜の水分量を一定に保つことで角膜の透明性を維持する役割を果たしている。また、障害を受けても生体内で増殖しないことが知られており、角膜内皮細胞が外傷や疾患等によって障害されて細胞数が減少することで、重篤な視覚障害が生じることが知られている。
　ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。角膜内皮変性症や種々の原因による角膜内皮の機能不全によって生じる水疱性角膜症では、角膜が浮腫と混濁を生じ、著しい視力低下をきたす。現在、水疱性角膜症に対しては、角膜の上皮、実質および内皮の３層構造のすべてを移植する全層角膜移植術が行われている。しかし、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内ドナー角膜を用いて行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
　近年、拒絶反応や術後合併症のリスクを軽減し、よりよい視機能を得る目的から、障害を受けた組織のみを移植する「パーツ移植」の考えが注目されている。角膜移植の中でも、実質組織の移植である深層表層角膜移植術、角膜内皮組織の移植であるデスメ膜角膜内皮移植術（Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ　Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ）などが行われるようになっている。また、生体外で培養した角膜上皮や口腔粘膜を角膜上皮の代わりに移植する培養粘膜上皮移植術は既に臨床応用されており、同様に生体外で培養した角膜内皮を移植する方法も検討されている。
　角膜内皮細胞は培養すると分化し、形態が線維芽細胞様に変化することが知られている。また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は小腸上皮幹細胞に限定的に発現し、重要な働きをしていることが知られている。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のリガンドとしてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎｓが報告されている（非特許文献１~４）。
　非特許文献５には、角膜輪部上皮細胞に幹細胞様の細胞が存在すること、およびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が、残存するヒト角膜輪部上皮幹細胞の表現型マーカーになり得ることが記載されている。
　非特許文献６には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は幹細胞マーカーとして挙げられている。マウス角膜上皮細胞の２つの細胞集団において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＡＢＣＧ２が高発現していることが記載されている。
　非特許文献７には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が幹細胞マーカーとして記載されている。
　非特許文献８には、腸管上皮幹細胞培養を確立したことが開示されている。
　非特許文献９には、腸および大腸を安定的かつ長期的に培養する方法が開示されている。培養の増殖は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１と免疫グロブリンＦｃの融合タンパク質（ＲＳｐｏ１−Ｆｃ）によって顕著に促進されたことが記載されている。
　従来角膜内皮細胞は生体内で増殖しないと考えられてきたが、近年の分子生物学的、細胞生物学的研究により、角膜内皮細胞層にも非常に増殖能に富む細胞群が存在していることが報告された。Ｓｃｈｉｍｍｅｌｐｆｅｎｎｉｎｇらはヒト角膜の周辺部の方が中心部と比較して内皮細胞密度が増加していることを明らかにし、角膜周辺部の細胞が増殖することにより、角膜中心部へと細胞を供給している可能性を提唱した（非特許文献１０）。
　また、Ｗｈｉｋｅｈａｒｔらは、ウサギ角膜を用いて、幹細胞や前駆細胞において高発現が見られるテロメラーゼが、角膜周辺部の内皮細胞において高発現していることを確認した。さらに細胞増殖マーカーであるＢｒｄＵを使用した評価法により、角膜周辺部の内皮細胞の方が障害を受けたときの応答が速いことを示した（非特許文献１１）。また、Ｙｏｋｏｏらは間葉系幹細胞の採取法であるスフェア法を用いて、成体ヒト角膜から角膜内皮細胞の前駆細胞の採取に成功した（非特許文献１２）。この細胞は未分化細胞マーカーを発現し、中心部と周辺部の角膜内皮細胞でスフェアの形成能を比較したところ、周辺部内皮細胞の方が高いことを確認した。（非特許文献１３）。さらに、ＭｃＧｏｗａｎらは、角膜周辺部に未分化細胞マーカーを発現している細胞が多く存在し、障害を受けることでそれらの細胞が活性化されることを報告した（非特許文献１４）。
　Ｇ　タンパク質共役レセプター４９（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４９；本明細書では「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５」ともいう。）は、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ）や濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ；ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ｌｅｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ；ＬＨ）と類似した７回膜貫通型受容体の一種であり、ロイシンリッチリピートを含む細胞外Ｎ末端ドメインが付随するユニークな構造をもつ（図１、非特許文献１５）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は発癌と関わりをもつＷｎｔシグナルならびにヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナルのターゲット遺伝子であることから、それらのシグナルの異常によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現亢進が起こることが報告されている（非特許文献１６、非特許文献１７および非特許文献１８）、さらにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が腸管上皮幹細胞に特異的に発現が見られることが確認されたことにより（非特許文献８）、新規の幹細胞特異的に発現するタンパク質として注目されるようになった。その後、毛包（非特許文献１９）や胃上皮（非特許文献２０）などの組織においても幹細胞特異的に発現の亢進が見られることが確認され、幹細胞ニッチの構築や組織形成に関与している可能性も報告されている。
Ｃａｒｍｏｎ　ＫＳ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０１１　Ｊｕｌｙ　１２；１０８（２８）：１１４５２−１１４５７ ｄｅ　Ｌａｕ　Ｗ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１　Ｊｕｌ　４；４７６（７３６０）：２９３−２９７ Ｇｌｉｎｋａ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｒｅｐ．２０１１　Ｓｅｐ　３０；１２（１０）：１０５５−１０６１． Ｊ．Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｌｅｅ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　２４（２０１２）３６９−３７７ Ｂｒｚｅｓｚｃｚｙｎｓｋａ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ．２０１２　Ｍａｙ；２９（５）：８７１−８７６ Ｋｒｕｌｏｖａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．２００８　Ｓｅｐ；４９（９）：３９０３−３９０８． ＨＯＬＡＮ　Ｖ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ　Ｖｏｌｕｍｅ　８８，Ｉｓｓｕｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ　２４６，ｐａｇｅ　０，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１０ Ｂａｒｋｅｒ　Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４４９：１００３−１００７，２００７ Ｏｏｔａｎｉ　Ａ．，Ｌｉ　Ｘ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｄ．２００９　Ｊｕｎ；１５（６）：７０１−７０６ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｐｆｅｎｎｉｇ　Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，ＩＯＶＳ，Ｖｏｌ．２５，，ｐｐ．２２３−２２９．１９８４ Ｗｈｉｋｅｈａｒｔ　ＤＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，１１，ｐｐ．８１６−８２４，２００５ Ｙｏｋｏｏ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ，ＩＯＶＳ．４６，１６２６−１６３１，２００５ Ｙａｍａｇａｍｉ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１４，４３３−４３９，２００７ ＭｃＧｏｗａｎ　ＳＬ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，１３：１９８４−２０００．２００７ Ｈｓｕ　ＳＹ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２，１８３０−１８４５，１９９８ Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３７，５２８−５３３，２００３ ＭｃＣｌａｎａｈａｎ　Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌ　Ｔｈｅｒ．５，４１９−４２６，２００６ Ｔａｎｅｓｅ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ．１７３，８３５−８４３，２００８ Ｊａｋｓ　Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．４０，１２９１−１２９９，２００８ Ｂａｒｋｅｒ　Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．７，６５６−６７０，２０１０
　本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を増殖・分化のマーカーとして使用する技術を提供する。本発明者らは、ヒト角膜組織においてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、角膜内皮細胞（特に周辺部）に強く発現していたことを見出し、ヒト角膜内皮細胞の培養細胞では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現量は有意に低下したことを見出し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞群は、細胞サイズが小さく、高い増殖能を有することも見出した。これらに基づきＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を増殖・分化のマーカーとして使用する技術へ応用した。
　また、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を分化抑制、増殖促進剤として使用することを提供する。
　本発明者らは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、特にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１において、ヒト培養角膜内皮細胞の分化を抑制し、増殖を促進する傾向を見出だした。これによって、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を、角膜保存液、角膜内皮細胞培養液、角膜内皮細胞障害の治療剤（点眼液、細胞注入）および角膜内皮細胞障害の進行予防剤などの用途として用いる技術へと応用した。
　これまでの研究では、未だ明確に角膜内皮幹細胞の存在を提示している報告はない。また、生体内における角膜内皮細胞の増殖能や未分化性を制御するメカニズムについても解明されていない。本発明者らは角膜内皮細胞の前駆細胞に特異的に発現するタンパク質としてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が存在することを見出し、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏの機能的役割について検証し、マーカーとして応用するに至った。
　１つの局面において、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　１つの実施形態において、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞等から選択される細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　別の実施形態において、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　別の実施形態において、本発明におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４から選択される少なくとも１つを含む。
　特定の実施形態において、前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を含む。
　別の実施形態において、前記眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞はコンフルエントの状態にある。
　１つの局面において、本発明は、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種含む、細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　１つの実施形態において、本発明は、ＳＨＨ、プルモルファミンおよびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種含む、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞等から選択される細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　別の実施形態において、本発明は、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　別の実施形態において、前記眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞はコンフルエントの状態にある。
　１つの局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子を含む、細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　１つの実施形態において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子を、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞等から選択される細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　別の実施形態において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子を含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。
　別の実施形態において、前記ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子は、核酸、抗体または抗体断片、あるいはそれらの機能的等価物である。
　別の実施形態において、前記眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
　特定の実施形態において、前記眼細胞はコンフルエントの状態にある。
　特定の実施形態において、前記眼細胞は、角膜組織の形態で提供される。
　さらなる局面において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜保存または角膜内皮細胞培養のための組成物を提供する。
　さらなる局面において、本発明は、本発明に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜内皮細胞障害の治療または角膜内皮細胞障害の進行予防のための医薬組成物を提供する。
　さらなる局面において、本発明は、本発明に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて培養された角膜内皮細胞を含む角膜内皮細胞障害の治療剤または進行予防剤を提供する。
　１つの実施形態において、前記細胞は、通常の角膜内皮細胞よりも細胞密度が高いかおよび／または未分化な細胞をより多く含む集団として存在する。
　さらに別の局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。
　本発明のマーカーの１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　別の局面において、本発明は、角膜内皮培養物であって、該角膜内皮は、コンフルエント状態の細胞密度よりも高い密度で存在する培養物を提供する。この場合の角膜内皮培養物は、通常、生体内に存在するものとは異なる状態で存在するものをさす。
　１つの実施形態において、前記細胞密度は、約５７０個／ｍｍ２以上である。
　別の実施形態において、前記細胞密度は、約７００個／ｍｍ２以上である。
　別の実施形態において、前記細胞密度は、約８００個／ｍｍ２以上である。
　別の実施形態において、前記細胞密度は、約１０００個／ｍｍ２以上である。
　別の局面において、本発明は、角膜内皮細胞を含む角膜組織であって、該組織中のＫｉ６７陽性細胞が、生体内中の割合よりも高い割合で存在するか、および／または該角膜内皮細胞の密度が生体内中の密度よりも高い角膜組織を提供する。
　１つの実施形態において、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約４％以上の割合で存在する。
　別の実施形態において、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約７％以上の割合で存在する。
　別の実施形態において、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約１０％以上の割合で存在する。
　別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の密度は、約４０００個／ｍｍ２以上である。
　別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の密度は、約４５００個／ｍｍ２以上である。
　別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の密度は、約５０００個／ｍｍ２以上である。
　別の局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法を提供する。
　本発明の指標とするための方法における１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　さらに別の局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤を提供する。
　本発明の検出剤の１つの実施形態において、前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記検出剤は、標識されたものである。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　さらに別の局面において、本発明は、ＳＨＨを含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。
　本発明のマーカーの１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　別の局面において、本発明は、ＳＨＨを、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法を提供する。
　本発明の指標とするための方法における１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　さらに別の局面において、本発明は、ＳＨＨに結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤を提供する。
　本発明の検出剤の１つの実施形態において、前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記検出剤は、標識されたものである。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　さらに別の局面において、本発明は、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。
　本発明のマーカーの１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子は、ＳＨＨ，ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２からなる群より選択される。
　さらに別の局面において、本発明は、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法を提供する。
　本発明の方法の１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　本発明の方法の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明の方法の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明の方法の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される。
　本発明の方法の別の実施形態において、前記ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子は、ＳＨＨ，ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２からなる群より選択される。
　別の局面において、本発明は、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤を提供する。
　本発明の検出剤の１つの実施形態において、前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記検出剤は、標識されたものである。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子は、ＳＨＨ，ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２からなる群より選択される。
　別の局面において本発明は、Ｗｎｔ経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。
　本発明のマーカーの１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される。
　本発明のマーカーの別の実施形態において、前記Ｗｎｔ経路の因子は、ＬＲＰ６およびβ−カテニンからなる群より選択される。
　別の局面において、本発明は、Ｗｎｔ経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法を提供する。
　本発明の方法の１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　本発明の方法の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明の方法の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明の方法の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　本発明の方法の別の実施形態において、前記Ｗｎｔ経路の因子は、ＬＲＰ６およびβ−カテニンからなる群より選択される。
　他の局面において、本発明は、Ｗｎｔ経路の因子に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤を提供する。
　本発明の検出剤の１つの実施形態において、前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記検出剤は、標識されたものである。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　本発明の検出剤の別の実施形態において、前記Ｗｎｔ経路の因子は、ＬＲＰ６およびβ−カテニンからなる群より選択される。
　さらに別の局面において、本発明は、本発明の検出剤、マーカー等を用いた診断剤、検出キット、診断キット、検出システム、診断システム等を提供する。
　さらに別の局面において、本発明は、本発明の医薬組成物、治療剤または進行予防剤を用いた治療方法、予防方法、使用等を提供する。
　上述の特徴は、１または複数をさらに組み合わせて用いることができることが理解される。
　本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本発明によれば、角膜内皮細胞に存在する細胞の分化能を識別することができ、増殖能が高い細胞を識別することができ、その結果、角膜内皮に少量存在する未分化細胞を効果的に識別し収集することができるようになった。また、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を使用することによって、角膜内皮の増殖を行うことができ、従来不可能または困難であった、角膜内皮の疾患や障害を治療または予防することができる。
図１は、ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５の構造を示す（Ｂａｒｋｅｒ　Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１０　Ｍａｙ；１３８（５）：１６８１−９６）を参照）。 図２は、ヒト角膜におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ａ．左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ネスチンおよびＡＢＣＧ２のヒト角膜切片における免疫染色を示す。スケールバーは１００μｍである各写真において、上から、上皮（Ｅｐｉ）、実質（Ｓｔｒ）、内皮（Ｅｎｄ）に該当する部分を示す。ｂ．左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ネスチンおよびＡＢＣＧ２のリアルタイムＰＣＲを示す、縦軸は角膜内皮を１としたｍＲＮＡの相対レベルを示す。Ｎ＝４．Ｅｐｉ：角膜上皮；Ｓｔｒ：角膜実質；Ｅｎｄ：角膜内皮。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。 図２は、ヒト角膜におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ｃ．ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の免疫染色のホールマウントである。Ｃｅｎｔｅｒは中心、Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙは周辺部を示す。ｄ．ヒト角膜の中央領域対周辺部領域の拡大図である。Ｃｅｎｔｅｒは中心、Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙは周辺部を示す。ｅ．ヒト角膜の中央（Ｃｅｎｔｅｒ）および周辺部（Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ）におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のリアルタイムＰＣＲを示す。縦軸は角膜内皮を１としたｍＲＮＡの相対レベルを示す。Ｎ＝３．エラーバーはＳ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。 図３は培養角膜内皮細胞のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ａ．培養ヒト角膜内皮細胞（ｃＨＣＥＣ）でのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびネスチンの免疫染色を示す。左から位相差像、ＧＰＲ４９　ＰＩ像およびネスチンＰＩ像を示す。上から生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）、初代培養（Ｐ０）、継代第１世代（Ｐ１）を示す。スケールバーは１００μｍを示す。 図３は培養角膜内皮細胞のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ｂ．左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびネスチンｍＲＮＡのｃＨＣＥＣでの発現を示す。縦軸は初代培養（Ｐ０）を１としたｍＲＮＡの相対レベルを示す。生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）、初代培養（Ｐ０）を示す。Ｎ＝４。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。ＮＤ＝検出せず。 図３は培養角膜内皮細胞のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ｃ．培養サル角膜内皮細胞（ｃＭＣＥＣ）におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の免疫染色を示す。左から位相差像、およびＧＰＲ４９　ＰＩ像を示す。上から生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）、初代培養（Ｐ０）、継代第１世代（Ｐ１）を示す。スケールバーは１００μｍを示す。 図３は培養角膜内皮細胞のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ｄ．ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡのｃＭＣＥＣでの発現を示す。縦軸は初代培養（Ｐ０）を１としたｍＲＮＡの相対レベルを示す。生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）、初代培養（Ｐ０）、継代第１世代（Ｐ１）および継代第２世代（Ｐ２）を示す。Ｎ＝３。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。 図４は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の特徴づけを示す。ａ．セルソーティング後のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞（ＧＰＲ４９＋）の位相差を左に示し、陰性細胞（ＧＰＲ４９−）の位相差を右に示す。スケールバーは１００μｍを示す。 図４は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の特徴づけを示す。ｂ．各細胞の表面積を示す。ＧＰＲ４９＋の平均細胞サイズは１８４．６±４５．８μｍ２であり、ＧＰＲ４９−の平均細胞サイズは３２６．７８±７８．８μｍ２である。Ｎ＝３５。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０１。ｃ．ＧＰＲ４９＋のおよびＧＰＲ４９−のＫｉ−６７陽性比率を示す。Ｎ＝４。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。 図４は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の特徴づけを示す。ｄ．二重染色でのＧＰＲ４９＋の細胞増殖のセルソーティングを示す（縦軸：Ｃｙ３−Ｋｉ６７および横軸：ＦＩＴＣ−ＧＰＲ４９）：ＧＰＲ４９＋／Ｋｉ−６７＋；３．４％，ＧＰＲ４９＋／Ｋｉ−６７−；３．８％，ＧＰＲ４９−／Ｋｉ−６７−；０％，ＧＰＲ４９−／Ｋｉ−６７−；９２．８％。 図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ａ．ヘッジホッグシグナル関連遺伝子（上段において左からＳｈｈ、ＳｍｏおよびＰｔｃｈ１、下段において左からＧｌｉ１およびＧｌｉ２）の発現を示す。中心を１としたｍＲＮＡ相対レベルを示す。 図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｂ．左から、コントロール、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＫｉ−６７の、１００ｎｇ／ｍｌ　ｒｈＳｈｈ（左から２番目）、１０μＭ　プルモルファミン（Ｐｕｒ）（左から３番目）および１０μＭ　シクロパミン（Ｃｙｃ）（一番右）で処理したＨＣＥＣにおける免疫染色を示す。上段はＧＰＲ４９染色、下段はＫｉ６７染色を示す。コントロールは、０．１％ＤＭＳＯ。スケールバーは１００μｍを示す。 図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｃ．上段左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＰｔｃｈ１、および下段左からＧｌｉ１およびＧｌｉ２のリアルタイムＰＣＲである。ｃｏｎｔｒｏｌはコントロールで、この結果を１とした相対ｍＲＮＡレベルを示す。ｒｈＳｈｈはｒｈＳｈｈで処理したものを示し、Ｐｕｒはプルモルファミン処理、Ｃｙｃはシクロパミドで処理したものを示す。Ｎ＝４。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。＊＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０１。 図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｄ．ｒｈＳＨＨで処理したｃＨＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現（相対ｍＲＮＡレベル）を示す。ｅ．ｒｈＳＨＨで処理したｃＨＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の免疫染色。スケールバーは１００μｍを示す。 図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｆ．左から、コントロール、１００ｎｇ／ｍｌ　ｒｈＳＨＨ、２μＭ　Ｐｕｒおよび２μＭ　Ｃｙｃで処理したｃＨＣＥＣにおけるＫｉ−６７の免疫染色を示す。上段はＧＲＰ４９染色を示し。下壇はＫｉ６７染色を示す。コントロールは、０．０１％ＤＭＳＯである。スケールバーは１００μｍを示す。 図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｇ．右からコントロール、１００ｎｇ／ｍｌ　ｒｈＳｈｈ，２μＭ　プルモルファミン（Ｐｕｒ）および２μＭ　シクロスファミド（Ｃｙｃ）で処理したｃＨＣＥＣのＫｉ−６７陽性比率を示す。Ｎ＝５。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定での＊ｐ＜０．０１。 図６は、角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を示す。ａ．ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｓｈＲＮＡのノックダウン効果を示す。コントロール（ＮＴ）を１とした相対ｍＲＮＡレベルを示す。左からＮＴ（コントロール）、ｓｈＧＰＲ４９−５８７、ｓｈＧＰＲ４９−５８８、およびｓｈＧＰＲ４９−５８９でのＧＰＲ４９に対する効果を示す。 図６は、角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を示す。ｂ．ｓｈＲＮＡ（５８９）で処理した（左から）Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２の発現を示す。ＮＴ：非標的。Ｎ＝５。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。ＮＤ＝検出せず。 図６は、角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を示す。ｃ．ｃＨＣＥＣに対するＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の過剰発現の効果を示す。左は位相差、右はＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ　ＰＩ染色を示す。上段はＧＰＲ４９発現を示し、下段はＮＴ（コントロール）を示す。 図６は、角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を示す。ｄ．上段左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＰｔｃｈ１、下段左からＧｌｉ１およびＧｌｉ２ｍＲＮＡの発現を示す。ＮＴはコントロール、ＥｘｐＧＰＲ４９はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現物を示す。Ｎ＝３。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定での＊ｐ＜０．０１。 図６Ａは、ヒト角膜内皮細胞（ＣＥＣ）におけるｓｈＬＧＲ５の作用を示す。（Ａ）左から、ＮＴおよびｓｈＬＧＲトランスフェクト細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２についてのリアルタイムＰＣＲを示す。平均±ＳＥＭ。＊＊Ｐ＜０．０５。Ｎ＝３。（Ａ）は図６−２のものを、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５とさらに並行して表示するものであり、一部重複する。（Ｂ）ＮＴ（上段）およびｓｈＬＧＲトランスフェクトヒトＣＥＣ（下段）におけるＫｉ６７の位相差顕微鏡像（左欄）およびＫｉ６７の免疫染色（右欄）を示す。矢印はＫｉ６７（＋）細胞を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ）右のグラフは、ＣＥＣ増殖に対するＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子ノックダウンの影響を実証するために、Ｋｉ６７細胞のパーセントについての免疫細胞化学研究を実施した結果を示す。左はコントロール（ＮＴ）を示し、右は、ｓｈＬＧＲ５処理細胞（ｓｈＬＧＲ５）を示す。。 図６Ｂは、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＲＳＰＯ１の機能を示す。（Ａ）ＮＴ（上段）およびｓｈＬＧＲトランスフェクトヒトＣＥＣ（下段）における、位相差顕微鏡像（一番左）、ならびにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（左から２番目）、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（右から２番目）およびＺＯ１（一番右）の免疫染色を示す。スケールバー＝１００μｍ。図６Ｂ（Ａ）は、図６−３と一部重複（位相差画像、ＮａＫＡＴＰ）するが、比較のためにいずれも並列して表示する。（Ｂ）このグラフは、ＲＳＰＯ１有または無でのＣＥＣの細胞密度を示す。平均±ＳＥＭ。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｎ＝５。（Ｃ）ＮＴおよびＬＧＲ５トランスフェクト細胞の細胞密度を示す。平均±ＳＥＭ。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｎ＝５。（Ｄ）ＮＴおよびＬＧＲ５トランスフェクト細胞におけるＥＭＴ関連遺伝子（Ｓｎａｉｌ（１番左）、Ｓｌｕｇ（左から２番目）、Ｔｗｉｓｔ（右から２番目）およびコラーゲン１（一番右））についてのリアルタイムＰＣＲ。平均±ＳＥＭ。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｎ＝３。（Ｅ）ＲＳＰＯ１（５０ｎｇ／ｍｌ）有（ＲＳＰＯ１（＋）、右）または無（ＲＳＰＯ１（−）、左）でのヒトＣＥＣの位相差顕微鏡像を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｆ）ＲＳＰＯ１（５０ｎｇ／ｍｌ）有または無でのＮＴおよびＬＧＲ５トランスフェクト細胞における活性化されたβ−カテニン（１番上の段）、ｐＬＲＰ６（上から２番目）、ｔＬＲＰ６（下から２番目）およびβ−アクチン（１番下の段）のウェスタンブロッティングを示す。 図６Ｃは、ヒト角膜内皮細胞（ＣＥＣ）におけるＲＳＰＯの発現および機能を示す。（Ａ）上パネルには、ヒト角膜上皮細胞（Ｅｐｉ）、実質細胞（Ｓｔｒｏｍａ）および内皮細胞（Ｅｎｄｏ）におけるＲＳＰＯ１（１番上の段）、ＲＳＰＯ２（上から２番目の段）、ＲＳＰＯ３（上から３番目の段）およびＲＳＰＯ４（上から４番目の段）についてのＰＣＲの結果を示す。下パネルには、内皮細胞（Ｅｎｄｏ）のうち、中心（Ｃｅｎｔｅｒ）および周辺（Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ）におけるＲＳＰＯ１（１番上の段）、ＲＳＰＯ２（上から２番目の段）、ＲＳＰＯ３（上から３番目の段）およびＲＳＰＯ４（上から４番目の段）についてのＰＣＲの結果を示す。（Ｂ）ＲＳＰＯ１（１番上の段）、ＲＳＰＯ２（上から２番目の段）、ＲＳＰＯ３（上から３番目の段）およびＲＳＰＯ４（上から４番目の段）（いずれも５０ｎｇ／ｍｌ）有または無での培養ヒトＣＥＣの位相差顕微鏡像を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ）ＲＳＰＯ１（１番上の段）、ＲＳＰＯ２（上から２番目の段）、ＲＳＰＯ３（上から３番目の段）およびＲＳＰＯ４（上から４番目の段）（いずれも５０ｎｇ／ｍｌ）有または無でのヒトＣＥＣにおけるＫｉ６７の免疫染色を示す。スケールバー＝１００μｍを示す。 図６Ｄは、ＣＥＣ維持の分子機構の模式図を示す。ヒトＣＥＣは、ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５発現に関して領域的な多様性を示す。ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５は、ＣＥＣの周辺部領域において特有に発現され、ここでは、ＨＨシグナル伝達が明らかに活性化されている。ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５は、ＨＨ経路の標的分子であり、インビトロ条件において、ＨＨ経路は、ＣＥＣ増殖を誘導することができた。しかしながら、インビボの状況では、ＨＨ経路のみの刺激では、ＣＥＣ増殖の誘導には不十分であった。永続的なＧＲＰ４９／ＬＧＲ５の発現は、Ｗｎｔ経路の阻害によって正常なＣＥＣ表現型を維持した。ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５リガンドであるＲＳＰＯ１は、インビボでＣＥＣ増殖を加速させ、Ｗｎｔ経路を介してＭＴを阻害した。 図７は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１~４の概説を示す。 図８は実施例９でのＣｌｉｃｋ−ｉＴ　ＥｄＵ　Ｉｍａｇｉｎｇ　ｋｉｔを用いた増殖細胞の検出（倍率ｘ２００）を示す。サル培養角膜内皮細胞を播種し、細胞がほぼコンフルエントな状態でＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（左から０、１０、５０ｎｇ／ｍｌ）入りの培地に交換し、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１添加から２４時間後、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ　ＥｄＵにてＥｄＵを染色し、ＥｄＵ陽性細胞率をカウントした。 図９は、図８におけるＥｄＵ陽性細胞率を示す。ＥｄＵ陽性細胞／ＤＡＰＩをカウントした結果、コントロールに比べてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を１０ｎｇ／ｍｌもしくは５０ｎｇ／ｍｌで添加したウェルでＥｄＵ陽性細胞が２倍増加していることが判明した。 図１０は、図８で示した方法で培養した角膜内皮細胞の内皮細胞密度を示す。位相差顕微鏡で写真撮影を行い、角膜内皮細胞密度計算ソフトＫｏｎａｎ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＫＳＳ−４００ＥＢを用いて細胞密度の計測を行った。左から培地添加なし、１０ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を示す。 図１１は、ヒト培養角膜内皮細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の作用を示す。ＲＳＰＯ１を添加した角膜内皮細胞（５０ｎｇ／ｍｌ（右上），５００ｎｇ／ｍｌ（左下））は、コントロールと比較してＫｉ６７陽性細胞率が上昇した。左上はコントロールを示し、右上は、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１で培養した例、左下は５００ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１で培養した例、右下は１０００ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１で培養した例を示す。Ｋｉ６７は緑色で染色され、コントロールではみえず、５０ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌでは顕著に染色され、１０００ｎｇ／ｍｌでも染色が観察される。ＰＩは赤く染色され、いずれの細胞でも染色される。 図１２は、ヒト培養角膜内皮細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２の作用を示す。ＲＳＰＯ２を添加した角膜内皮細胞は、コントロールと比較してＫｉ６７陽性細胞率がわずかに上昇した。左は、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２で培養した例、右は１００ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２で培養した例、上は角膜輪部を示し、下は中心部を示す。 図１３は、ヒト培養角膜内皮細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３の作用を示す。ＲＳＰＯ３を添加した角膜内皮細胞は、コントロールと比較してＫｉ６７陽性細胞率はわずかに上昇した。左は、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３で培養した例、右は２００ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３で培養した例、上は角膜輪部を示し、下は中心部を示す。 図１４は、ヒト培養角膜内皮細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４の作用を示す。ＲＳＰＯ４を添加した角膜内皮細胞は、コントロールと比較してＫｉ６７陽性細胞率はわずかに上昇した。左は、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４で培養した例、右は５００ｎｇ／ｍｌ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４で培養した例、上は角膜輪部を示し、下は中心部を示す。 図１５は、ヒト角膜内皮細胞の継代培養を行った後に、コンフルエントに到達して２週間以上培養し角膜内皮密度に明らかな変化を認めなくなった時点で、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を培地中に１０ｎｇ／ｍｌの濃度にて添加して培養を継続し、細胞形態の観察は位相差顕微鏡にて行い、細胞密度を計算した結果を示す。写真は、添加後の日数（左から０日目、７日目、１４日目および２１日目）を示す。下のグラフは、非添加群との比較での添加群Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１の細胞密度の０日目、７日目、１４日目および２１日目の推移を示すものである。 図１６は、ウサギ強角膜片を用いた器官培養について、ＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）にて１週間３７℃のインキュベーターにて、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１の存在（右から１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）または不存在下（最も左、コントロール）で、培養し、細胞増殖のマーカーとしてＫｉ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．、カタログ番号：Ｐ６８３４）を用いて角膜内皮細胞の免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った結果を示す。ＤＡＰＩにて核染色を行い、Ｋｉ６７陽性細胞率を計算した結果を左下パネルに示す。また、ＺＯ−１にて免疫染色を行い細胞密度の計算を行った結果を右下パネルに示す。
　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　本明細書において、「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５」とは、７回膜貫通型のＬＧＲファミリーメンバーであるタンパク質である。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、ある場合には糖タンパク質リガンドとの相互作用に重要であることが示されたロイシン・リッチ・リピートを含有する、巨大Ｎ末端細胞外ドメインによって特徴付けられる、異常なＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であるロイシン・リッチ・リピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５に基づく命名であり、近時このような名称の頻度が高まっており本明細書ではこれらを併記する。ＦＥＸ　ＨＧ３８、ＧＰＲ６７としても知られる。ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００３６５８．１（配列番号２）およびＮＭ＿００３６６７．２（配列番号１）に開示されている。当該分野では、ＧＰＲ４９またはＬＧＲ５と単独の名称でも呼称されている。本明細書では「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５」と表示するが、いずれの表示であっても同一の意味を示すことが理解される。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５としては、ＯＭＩＭ：６０６６６７とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
　なお、本発明で挙げる他のタンパク質すべてにも同じことがあてはまる。従って、既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。本明細書で使用される「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本発明では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５はヒトが主に論じられるが、チンパンジー（Ｐａｎ　ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（ＥＮＳＰＴＲＧ０００００００５２２３（ＸＲ＿０２１５８６．１））、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ）（ＥＮＳＭＭＵＧ００００００２０９４２）、マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２０１４０）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＥＮＳＲＮＯＧ０００００００４２２１（ＬＯＣ６８７８６８））、モルモット（Ｃａｖｉａ　ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）（ＥＮＳＣＰＯＧ０００００００９４９２）、イヌ（Ｃａｎｉｓ　ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（ＥＮＳＣＡＦＧ００００００００４５１）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ　ｃａｔｕｓ）（ＥＮＳＦＣＡＧ０００００００８０６４）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ）（ＥＮＳＧＡＬＧ００００００１０１６３）等、ヒト以外の多くの哺乳動物がＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質を発現していることが知られているため、これらの哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、アルツハイマー病において、ガンマーセクレターゼによるＡＰＰの異常なプロセシングに関与する、異なるタンパク質複合体の一部を形成することが発見されている。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がＡｐｈ１ａ複合体、Ｆｅ６５Ｌ２複合体、ＡＰＰ−Ｃ９９複合体およびＢＡＣＥ１複合体の一部であることが発見されているため、これらの複合体を検出することによっても、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を検出することができる。これらの複合体は、ＴＡＰ技術エントリーポイントとして用いられている、それぞれの重要なタンパク質化合物にちなんで命名されている。
　本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。
　本発明において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のフラグメントとは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の生物学的機能を有していなくてもよい。フラグメントの例として、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の細胞外領域を含むフラグメントが挙げられる。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の細胞外領域は配列番号２のアミノ酸配列において１−５５６番目、６１５−６３７番目、７０４−７２２番目、および７９２−８００番目が相当する。又、膜貫通領域は配列番号２のアミノ酸配列において５５７−５７９番目、５９２−６１４番目、６３８−６６０番目、６８１−７０３番目、７２３−７４５番目、７６９−７９１番目、および８０１−８２３番目が相当する。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の有する活性をいう。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の有する活性をいう。
　本発明の関連において、「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質」または「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５相互作用分子」は、少なくとも一時的にＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合し、そして好ましくは、結合したことを表示しうる（例えば標識されるか標識可能な状態である）、分子または物質である。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の阻害剤であってもよく、その例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）等を挙げることができ、例えばＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に対して向けられる、特にＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の活性部位に対して向けられる、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子に対して向けられる核酸も含まれる。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に対する核酸は、例えばＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子の発現またはＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の活性を阻害する、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そして限定なしに、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）およびリボザイムを含む。本明細書において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５について「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」とは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そしてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質骨格を含むがこれらに限定されない。
　本明細書において「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ（類）」とはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１等と同様の構造および機能を有する遺伝子群をいい、非特許文献４（Ｊ．Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｌｅｅ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　２４（２０１２）３６９−３７７）で説明されている。例えば、構造としては、Ｎ末端からＳＰ、ＣＲ，ＴＳＲ、ＢＲというドメインを有することが知られている。また、機能としては、ＧＰＲ４９に対するリガンドであることが知られている。従って、このような構造および機能を指標にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を確定することができる。例えば、ヒトでは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１　ＯＭＩＭ：６０９５９５；核酸配列（遺伝子配列）：配列番号３、３５、３７または３９；アミノ酸配列：配列番号４、３６、３８または４０）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２（ＲＳＰＯ２　ＯＭＩＭ：６１０５７５、配列番号５および６）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３（ＲＳＰＯ３　ＯＭＩＭ：６１０５７４、配列番号７および８）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４（ＲＳＰＯ４　ＯＭＩＭ：６１０５７３：核酸配列（遺伝子配列）：配列番号９または４１；アミノ酸配列：配列番号１０または４２）が知られている。非特許文献４の情報から、図７のように各Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎがまとめられる。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号３、３５、３７または３９に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号３、３５、３７または３９に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１の有する活性をいう。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号３、３５、３７または３９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１の有する活性をいう。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２の有する活性をいう。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２の有する活性をいう。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号７に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３の有する活性をいう。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３の有する活性をいう。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号９または４１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号９または４１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４の有する活性をいう。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号９または４１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４の有する活性をいう。
　本明細書において「ＳＯＮＩＣ　ＨＥＤＧＥＨＯＧ（ＳＨＨ）」とはヘッジホッグ（ＨＨ）ファミリーに属する５種類のタンパク質の内の１つであり、これをコードする遺伝子は、ｓｈｈで表記する。ＳＨＨは発生において最も重要なモルフォゲンとして、四肢や、脳脊髄正中線構造などの、多くの器官系のデザインを形成する役割がある。ヒト・ソニック・ヘッジホッグ遺伝子の変異では、腹側正中線の欠失が生じて全前脳胞症（ＨＰＥ）を引きおこすほか、シス調節エレメントの変化が原因で多指症になることなどが知られている。このファミリーの他のタンパク質には、哺乳類ではＤｅｓｅｒｔ　Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＤＨＨ）、Ｉｎｄｉａｎ　Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，（ＩＨＨ）がある。例えば、ヒトのものは、ＳＨＨ（ＳＨＨ　ＯＭＩＭ　６００７２５；ヒト：ＮＭ＿０００１９３（配列番号１１および１２）；マウス：ＮＭ＿００９１７０）が知られている。
　ｓｈｈの代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号１１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号１１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＳＨＨの有する活性をいう。
　ＳＨＨのアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号１１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＳＨＨの有する活性をいう。
　ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子としては、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２が挙げられる。
　本明細書において「ＰＴＣＨ１」とはヘッジホッグ経路の因子の一つであり、Ｐａｔｃｈｅｄ−１と呼ばれる受容体であり、ＳＨＨが結合する受容体である。この因子をコードする遺伝子は、ｐｔｃｈ１で表記する。ＳＨＨとＰＴＣＨ１の結合によって、やはりＳＨＨ受容体複合体のコンポーネントであるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）の抑制がはずれ、細胞内にシグナルが伝わり、最終的にＧｌｉ転写因子を介して様々な標的遺伝子の転写が活性化され生理機能を発揮するとされている。ＰＴＣＨ１の配偶子変異は、母斑基底細胞癌症候群（ＮＢＣＣＳ）（Ｇｏｒｌｉｎ症候群とも呼ばれる）という小奇形と高発がんを特徴とする遺伝病を引き起こすとされている。ＰＴＣＨ１は癌抑制遺伝子でもある。この遺伝子は、ＰＴＣ；ＢＣＮＳ；ＨＰＥ７；ＰＴＣ１；ＰＴＣＨ；ＮＢＣＣＳ；ＰＴＣＨ１１としても知られている。この因子には、例えば、ヒトのものは、ＮＣ＿０００００９．１１（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、ＮＣ＿０００００９（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）、ＮＭ＿００１０８３６０２．１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）（配列番号４３および４４）が知られている。
　ｐｔｃｈ１の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号４３＜ＮＭ＿００１０８３６０２．１＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号４３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＰＴＣＨ１の有する活性をいう。
　ＰＴＣＨ１のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号４３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＰＴＣＨ１の有する活性をいう。
　本明細書において「ＧＬＩ１」とはヘッジホッグ（ＨＨ）経路の因子であり、転写因子Ｇｌｉファミリー（ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３等）の一つである。ＧＬＩ１をコードする遺伝子はｇｌｉ１と示す。ＧＬＩ１はＰＴＣＨ１の下流にあり、ここから、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５にシグナルが伝わるとされる。ＳＨＨとＰＴＣＨ１の結合によって、やはりＳＨＨ受容体複合体のコンポーネントであるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）の抑制がはずれ、細胞内にシグナルが伝わり、最終的にＧＬＩ転写因子を介して様々な標的遺伝子の転写が活性化され生理機能を発揮するとされている。この因子には、例えば、ヒトのものは、バリアント１としてＮＭ＿００５２６９．２（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００５２６９（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）；バリアント２としてＮＭ＿００１１６００４５．１（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００１１６００４５（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ）；バリアント３としてＮＭ＿００１１６７６０９．１（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＮＭ＿００１１６７６０９（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）（配列番号４５および４６）が知られている。
　ｇｌｉ１の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号４５＜ＮＭ＿００１１６７６０９．１＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号４５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＬＩ１の有する活性をいう。
　ＧＬＩ１のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号４５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＬＩ１の有する活性をいう。
　本明細書において「ＧＬＩ２」とはヘッジホッグ（ＨＨ）経路の因子であり、転写因子ＧＬＩファミリー（ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３等）の一つである。このＧＬＩ２をコードする遺伝子はｇｌｉ１で表す。ＰＴＣＨ１の下流にあり、ここから、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５にシグナルが伝わるとされる。ＳｈｈとＰＴＣＨ１の結合によって、やはりＳｈｈ受容体複合体のコンポーネントであるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の抑制がはずれ、細胞内にシグナルが伝わり、最終的にＧｌｉ転写因子を介して様々な標的遺伝子の転写が活性化され生理機能を発揮するとされている。この因子には、例えば、ヒトのものは、ＮＭ＿００５２７０．４（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００５２７０（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）（配列番号４７および４８）が知られている。
　ｇｌｉ２の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号４７＜ＮＭ＿００５２７０．４＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号４７に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＬＩ２の有する活性をいう。
　ＧＬＩ２のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号４７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＬＩ２の有する活性をいう。
　Ｗｎｔ経路の因子としては、ＬＲＰ６およびβ−カテニンが挙げられる。
　本明細書において「ＬＲＰ６」とはＷｎｔ経路の因子の１つであり、Ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　６の略称であり、これをコードする遺伝子は、ｌｒｐ６で表記する。Ｇタンパク質であるＧβγはＧＳＫ３を活性化し、ＬＲＰ６を介するβ−カテニンの転写活性を促進する。この因子は、例えば、ヒトのものは、ＮＭ＿００２３３６．２（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００２３３６（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＬＲＰ６、ＮＭ＿００２３３６．２（配列番号４９および５０）が知られている。
　ｌｒｐ６の代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号４９＜ＮＭ＿００２３３６．２＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号４９に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＬＲＰ６の有する活性をいう。
　ＬＲＰ６のアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号４９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＬＲＰ６の有する活性をいう。
　本明細書において「β−カテニン」とはＷｎｔ経路の因子の１つであり、これをコードする遺伝子は、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／ＣＴＮＮＢ１で表記する。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、脊椎動物と無脊椎動物の発生における細胞の運命の決定を調節する。Ｗｎｔ−リガンドは分泌された糖タンパク質であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合する。この結合によって多機能キナーゼであるＧＳＫ−３βをＡＰＣ／Ａｘｉｎ／ＧＳＫ−３β複合体から離脱させるようなカスケードが開始する。Ｗｎｔ−シグナルが無い場合には、転写の共役因子であると同時に細胞膜に埋め込まれ、細胞と細胞の接着におけるアダプタータンパク質として存在するβ−カテニンが、ＡＰＣ／Ａｘｉｎ／ＧＳＫ−３β複合体による分解に向かうとされている。ＣＫ１とＧＳＫ−３βの協調的な作用によってβ−カテニンが適切なリン酸化を受けると、ユビキチン化と、β−ＴｒＣＰ／ＳＫＰ複合体を介したプロテアソームによる分解に至るとされている。Ｗｎｔが結合する場合には、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）がリン酸化とポリユビキチン化を受けて活性化され、今度はこれが分解複合体からＧＳＫ−３βを遠ざける。これが、β−カテニンの安定化のために、Ｒａｃ−１依存的な核移行をさせてＬＥＦ／ＴＣＦ　ＤＮＡ結合因子へと誘引するが、そこでは、Ｇｒｏｕｃｈｏ−ＨＤＡＣ補助抑制因子と置換することによって転写活性化因子として作用するとされている。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、多くの異なる型の細胞や組織において、レチノイン酸、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、及びＢＭＰなどの他の多くの経路からのシグナルを集約するとされている。この因子には、例えば、ヒトのものは、バリアント１としてＮＭ＿００１９０４．３（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００１９０４　ＸＭ＿９４２０４５　ＸＭ＿９４５６４８ＸＭ＿９４５６５０ＸＭ＿９４５６５１　ＸＭ＿９４５６５２　ＸＭ＿９４５６５３　ＸＭ＿９４５６５４　ＸＭ＿９４５６５５　ＸＭ＿９４５６５７（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ）；バリアント２としてＮＭ＿００１０９８２０９．１（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００１０９８２０９、ＸＭ＿００１１３３６６０、ＸＭ＿００１１３３６６４、ＸＭ＿００１１３３６７３　ＸＭ＿００１１３３６７５（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）；バリアント３としてＮＭ＿００１０９８２１０．１（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００１０９８２１０（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）、＿ＮＭ＿１３１０５９．２（ＣＴＮＮＢ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）（配列番号５１および５２）が知られている。
　β−カテニンの代表的なヌクレオチド配列は、
　（ａ）配列番号５１＜ＮＭ＿１３１０５９．２＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号５１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
　（ｅ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
　（ｆ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
　（ｇ）（ａ）~（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、β−カテニンの有する活性をいう。
　β−カテニンのアミノ酸配列としては、
　（ａ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
　（ｂ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
　（ｃ）配列番号５１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
　（ｄ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
　（ｅ）（ａ）~（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、β−カテニンの有する活性をいう。
　本明細書において「プルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）」とは、Ｎ−（４−モルホリノフェニル）−２−（１−ナフチルオキシ）−９−シクロヘキシル−９Ｈ−プリン−６−アミンの別称であり、ＣＡＳ番号は４８３３６７−１０−８として知られる化合物である。スムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）という７回膜貫通タンパク質のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリー（ヘッジホッグシグナル伝達経路を担う膜タンパク質）のアゴニストとして知られている。したがって、本発明では、ＳＨＨのアゴニストとして、例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニストとして使用され得る。
　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
　本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１−９８（１９９４））。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。ヒトおよび哺乳動物または他の種からオルソログ遺伝子対を検出するためのアルゴリズムは、これらの生物の全ゲノムを用いる。まず、予測されるタンパク質の完全Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ並列を用いて、対合ベストヒットを回収する。信頼性をさらに改善するため、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質を含む対合ベストヒットを用いて、これらの対のクラスターを形成してもよい。このような分析は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９：８６０−９２１に提供される。他の種の遺伝子に対する、本明細書に提供するタンパク質をコードする遺伝子の配列相同性に基づいて、慣用的技術を適用してそれぞれの遺伝子をクローニングし、そしてこのような遺伝子からタンパク質を発現させることによって、あるいは本明細書に提供する方法に従って、または当該分野で周知の他の適切な方法に従って、類似の複合体を単離することにより、他の種のタンパク質を単離することによって、本明細書に記載のタンパク質の相同体を単離することも可能である。
　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ　２．２．９（２００４．５．１２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
　本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７~１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１~２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１−３８，ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃ１ｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８~２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１~５時間洗浄し、そして２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、６０℃で１５時間洗浄することを含む。
　本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。
　本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ−Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
　本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、マウス、ラットのＲＰＧ４９、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類は、それぞれ、ヒトにおいて、対応するＲＰＧ４９、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＲＰＧ４９、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ｓｈｈ等）は、配列番号１、３、５、７、９、１１等の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
　本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１~ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
　本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
　本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５等がＲ−ｓｐｏｎｄｉｎを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
　本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のｍＲＮＡの量、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質の量、そしてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現レベルを知ることができる。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のｍＲＮＡやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
　本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類またはその機能的等価物」または「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群」という場合は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体のほか、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体またはこのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体またはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの機能的等価物は、格別に言及していなくても、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎと同様に用いられうることが理解される。
　また、「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５またはその機能的等価物」または「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５自体のほか、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５自体またはこのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５自体またはＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５と同様に用いられうることが理解される。
　また、「ＳＯＮＩＣ　ＨＥＤＧＥＨＯＧ（ＳＨＨ）またはその機能的等価物」または「ＳＯＮＩＣ　ＨＥＤＧＥＨＯＧ（ＳＨＨ）およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＳＨＨ自体のほか、ＳＨＨの変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＳＨＨ自体またはこのＳＨＨの変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＳＨＨ自体またはＳＨＨの変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、ＳＨＨの機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＳＨＨと同様に用いられうることが理解される。
　「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子またはその機能的等価物」または「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子自体のほか、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子の変異体または改変体（例えば、合成改変体等）であって、作用する時点において、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するように変化するもの（変化してＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子に変化することができるもの（例えば、エステル等の前駆体またはプロドラッグ））が包含されることが理解される。本発明において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子と同様に用いられうることが理解される。
　また、「ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）またはその機能的等価物」または「ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）自体のほか、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の変異体または改変体（例えば、合成改変体等）であって、作用する時点において、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するように変化するもの（変化してＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）自体またはこのＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、エステル等の前駆体またはプロドラッグ））が包含されることが理解される。本発明において、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）と同様に用いられうることが理解される。
　本明細書において「アゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用を発現させる物質をいう。天然のアゴニスト（リガンドとも称される）のほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。
　本明細書において「アンタゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用を阻害する物質をいう。アゴニスト（またはリガンド）と競合的に阻害するもののほか、非競合的に阻害するもの等がある。アゴニストを改変することによっても得られうる。生理現象を阻害することから、アンタゴニストは阻害剤または抑制（する）因子の概念に包含されうる。
　本明細書において「（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５等を）抑制する因子」は、対象となるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５等の機能を一時的または永久に低下または消失させることができる因子をいう。このような因子には、抗体、その抗原結合フラグメント、それらの誘導体、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ因子等の核酸の形態のもの等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　本発明で用いられるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５や、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
　本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等Ｗｎｔ経路の因子等の改変アミノ酸配列は、例えば１~３０個、好ましくは１~２０個、より好ましくは１~９個、さらに好ましくは１~５個、特に好ましくは１~２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　本明細書において「マーカー（物質または遺伝子）」とは、ある状態（例えば、疾患状態、障害状態、あるいは増殖能、分化状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、分化障害などの疾患）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。本明細書では、眼細胞への関連が示されていない遺伝子産物（すなわち、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５など）が眼細胞の分化の指標として使用可能であることが見出された。
　本明細書において「神経細胞」とは、広義に用いられ、神経系の器官に含まれる任意の細胞を意味し、特に、神経堤細胞由来の細胞（例えば、角膜内皮細胞等）も包含されることが理解される。
　本明細書において「眼細胞」とは、広義に用いられ、眼に存在する任意の細胞を意味し、眼瞼、強膜、角膜、ぶどう膜、水晶体、硝子体、網膜、視神経に存在する任意の細胞が包含される。
　本明細書において「角膜内皮細胞」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。
　本明細書において「角膜組織」とは、通常の意味で使用され、角膜を構成する組織自体をいう。角膜組織というときは、角膜を構成する角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮の全部（ヒトの場合。それ以外の動物の場合は、それに対応する区分に応じてその全部）を含んでいてもよく一部欠損していてもよく、あるいは、角膜のほか他の組織（強膜）を含んでいてもよく、その場合は特に強角膜ということがある。したがって、強角膜または強角膜片は角膜組織の一実施形態であるといえる。
　本明細書において「増殖能」とは、細胞の増殖する能力をいう。本明細書では格別に言及しない場合、増殖の状態は、定常状態での増殖の可能性を指す。ここで、「定常状態」とは、生体での通常の条件であって、生体の恒常性が維持されている状態をいう。そのような状態は、当業者であれば、容易に決定することができる。たとえば、細胞密度解析により、細胞密度がほぼ一定で変化しないこと、または細胞増殖マーカーの発現が認められないことなどによって確認することができる。
　本明細書において「増殖能の（が）高い」とは、定常状態で増殖能を有することをいう。
　本明細書において「増殖促進」とは、ある細胞の増殖状態が促進されることをいう。対象となる細胞が増殖していなかった場合は、少しでも増殖を始めれば増殖促進に該当し、すでに増殖をしている細胞の場合は、その増殖レベルが維持またはより高まれば、好ましくは高まれば増殖促進に該当する。
　本明細書において「分化能」とは、細胞が分化する能力をいう。分化能がある細胞は、その意味で「未分化」であるといえる。幹細胞（胚性幹細胞、生殖細胞、ｉＰＳ細胞、組織幹細胞等）は、さらに分化することができるため、分化能を有すると称することができる。
　本明細書において「未分化細胞」とは、分化能がある任意の細胞をいう。従って、未分化細胞には、幹細胞のほか、一定程度分化しているが、さらになお分化しうる細胞を包含する。
　本明細書において「分化抑制」とは、分化を抑制することをいう。分化がされなければ、分化レベルが変わらないものおよび分化レベルが未分化の方向に進んでいるものの両方が「分化抑制」に包含されることが理解される。
　本明細書において「分化抑制および／または増殖促進剤」とは、ある物質または因子についていうとき、対象となる細胞について、その細胞の分化を抑制するかおよび／または増殖を促進することができるものをいう。本明細書では、特に、「分化抑制および／または増殖促進剤」は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子（アンタゴニスト）およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む。
　本明細書において「幹細胞」とは、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を併せ持つ細胞をいう。幹細胞には、胚性幹細胞、生殖細胞、ｉＰＳ細胞、組織幹細胞などが包含される。
　本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した器官（眼）あるいは細胞等）をいう。
　本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、眼の細胞等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
　本明細書において「コロニー形成能」とは、細胞についていうとき、コロニーを形成することができる能力をいう。コロニー形成能は、本明細書では、標準試験法として当該分野において公知の培養条件下での細胞のコロニー形成試験等を用いて判断することができる。
　本明細書において「Ｋｉ−６７」とは、細胞増殖マーカーであって、代表的にアクセッション番号Ｐ４６０１３で示されるの細胞周期関連核タンパク質である。増殖中の細胞では，Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期において発現するが、増殖を休止しているＧ０期においては存在しないため、細胞増殖と細胞周期のマーカーとして用いられる。また、Ｋｉ−６７発現量と腫瘍の悪性度には正の相関が見られるため、腫瘍組織における増殖細胞を検出するマーカーとしても有用である。
　本明細書において「Ｋｉ−６７陽性」とは、細胞マーカーであるＫｉ−６７が標的細胞において発現していることをいう。
　本明細書において「ＢｒｄＵ」とは、臭素化デオキシウリジンの省略形であり、ＤＮＡ合成のときｄＴＴＰのアナログとして取り込まれることから、ＢｒｄＵを取り込んだＤＮＡ（細胞核）は、ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵに特異的な抗体で検出することができる。
　本明細書において「ＢｒｄＵ陽性」とは、細胞マーカーであるＢｒｄＵが標的細胞において発現していることをいう。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において「検出剤」とは、広義には、目的の対象を検出することができるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「診断剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「治療剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「予防剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。本明細書において「進行予防剤」とは、ある疾患等について、その状態の進行を予防することができるあらゆる薬剤を指す。
　本明細書において「インビボ」（ｉｎ　ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。
　本明細書において「インビトロ」（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
　本明細書において「エキソビボ」とは、ある処置について、体外で行われるがその後体内に戻されることが意図される場合、一連の動作をエキソビボという。本発明においても、生体内にある細胞を本発明の薬剤で処置して再度患者に戻すような実施形態を想定することができる。
　（好ましい実施形態）
　以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
　（分化抑制および／または増殖促進）
　１つの局面において、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。本発明が対象とする細胞は、特に限定されるものではないが、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮、角膜上皮細胞等の上皮細胞等を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は眼細胞である。本発明が対象とする眼細胞には、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞等が含まれうるが、これらに限定されない。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の機能的等価物は、例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、作用する時点において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体またはこのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体またはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含される。ＳＨＨの機能的等価物には、ＳＨＨの変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＳＨＨ自体またはこのＳＨＨの変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＳＨＨ自体またはＳＨＨの変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含される。ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の機能的等価物には、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の変異体または改変体（例えば、合成改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）自体またはこのＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、エステル等の前駆体またはプロドラッグ）が包含される。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子の機能的等価物には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子の変異体または改変体（例えば、合成改変体等）であって、作用する時点において、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するように変化するもの（変化してＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子に変化することができるもの（例えば、エステル等の前駆体またはプロドラッグ））が包含される。
　１つの実施形態において、本発明で使用されるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４から選択される少なくとも１つを含む。
　好ましい実施形態では、本発明で使用されるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を含む。
　１つの実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。理論に束縛されることを望まないが、定常状態で増殖していない細胞であっても、本発明によって、増殖させることができるという点で、本発明は従来にない効果を発揮するものである。
　別の実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。特に、角膜内皮細胞は、ほとんど定常状態では増殖しない細胞であって、これを、増殖させることができるという点は、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものである。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の対象とする眼細胞は角膜内皮細胞を含む。また、他の細胞、例えば、角膜上皮細胞でも、増殖しているのは基底細胞のごく一部であって、増殖していない細胞がほとんどであるため、角膜内皮細胞以外の網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞であっても、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものであるといえる。
　さらに好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
　別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）はコンフルエントの状態にある。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、発明者らの知る限りこれまで報告されていない。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、疾患または障害の治療または予防の観点から、きわめて有用性が高いものである。
　好ましい実施形態では、本発明は、コンフルエントの状態の角膜内皮細胞を利用することができる。コンフルエントの状態になると、通常の培養では、細胞の形態が、線維芽細胞様となることが観察されている。コンフルエント状態の角膜内皮細胞でもさらに増殖、分化抑制を行うことができることは、本発明の重要な特徴のひとつであり、培養角膜内皮移植の臨床応用化に向けて、移植後の重要な予後決定因子である角膜内皮密度の高い細胞を移植できることを意味する。その場合の好ましい濃度は、これに限定されるものではないが、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を用いる場合、約１ｎｇ／ｍｌ~約１００ｎｇ／ｍｌであり得、好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ~約１００ｎｇ／ｍｌであり得、さらに好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、発明者らの知る限りこれまで報告されていない。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、疾患または障害の治療または予防の観点から、きわめて有用性が高いものである。例えば、細胞密度は、好ましくは、約５７０個／ｍｍ２以上であり、約７００個／ｍｍ２以上であり、約８００個／ｍｍ２以上であり、約１０００個／ｍｍ２以上でありうる。
　本明細書において「培養物」は、角膜内皮等の細胞等を培養して生成されるものをいう。したがって、「角膜内皮培養物」は、角膜内皮の培養物をいい、通常、生体内に存在するものとは異なる状態で存在するものをさす。従来の培養法で得られる角膜内皮培養物は、せいぜい、実施例で示されるように、５００個／ｍｍ２程度のコンフルエント培養物しか得ることができなかった。したがって、培養物という観点からは、特に長期に培養したり、継代したものについていえば、このような細胞密度は達成することができなかったものといえる。すなわち、角膜内皮細胞は培養することで容易に密度が低下する。角膜内皮密度は臨床的には最も重要な健常度の指標の一つである。そのため、高い密度に培養することは再生医療の観点から重要である。また、内皮密度を事前に上昇させた後に、生体への投与することができ、極めて重要な治療薬となり得る。その意味で、通常の培養法で低下した密度を、再度上昇させることができたことが重要である。ヒト角膜内皮の生体における正常値は２５００−３０００個／ｍｍ２程度であり、これに培養物の細胞密度を近づけるかあるいはこれを超える技術を提供することができた点でも本発明は有意義である。
　別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）は角膜組織自体でありうる。そのような角膜組織自体は、強角膜片でありうる。
　したがって、別の局面において、本発明は、角膜内皮培養物であって、該角膜内皮は、コンフルエント状態の細胞密度よりも高い密度で存在する、培養物を提供する。
　好ましくは、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約４％以上の割合で、より好ましくは、約７％以上の割合で、さらに好ましくは約１０％以上の割合で存在する。通常の存在割合は１％程度であるため、このようなＫｉ６７陽性細胞、すなわち増殖性の細胞を含む角膜組織は従来存在したものではなく、新規な治療用の移植片としての価値も見出すことができる。
　好ましくは、前記角膜内皮細胞の密度は、約４０００個／ｍｍ２以上であり、より好ましくは、約４５００個／ｍｍ２以上であり、さらに好ましくは、約５０００個／ｍｍ２以上である。ヒト角膜内皮の生体における正常値は２５００−３０００個／ｍｍ２程度であり、直接組織に本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を適用することにより、従来にない程度に増殖性細胞または未分化細胞、あるいは角膜内皮細胞の割合が増えた新規の組織が提供されることが理解される。このような組織は、角膜の疾患、障害または状態を改善または治療ないし予防するために利用されることが理解される。
　（細胞の保存または培養）
　別の局面において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、細胞保存または細胞培養のための組成物を提供する。本発明で使用される分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の分化抑制および／または増殖促進剤であってよい。また、本発明が対象とする細胞は、細胞保存または細胞培養を目的とするものであり、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の細胞の実施形態でよいことが理解される。すなわち、本発明が対象とする細胞は、特に限定されるものではないが、細胞保存または細胞培養を目的とするものであり、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮、角膜上皮細胞等の上皮細胞等を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は眼細胞である。本発明が対象とする眼細胞には、細胞保存または細胞培養を目的とするものであり、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞等が含まれうるが、これらに限定されない。
　本発明の細胞保存または細胞培養のための組成物の１つの実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。理論に束縛されることを望まないが、定常状態で増殖していない細胞であっても、本発明によって、増殖させることができるという点で、本発明は細胞保存または細胞培養の観点で従来にない効果を発揮するものである。
　本発明の細胞保存または細胞培養のための組成物の別の実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。特に、角膜内皮細胞は、ほとんど定常状態では増殖しない細胞であって、これを、増殖させることができるという点は、細胞保存または細胞培養という観点でも、その結果使用されることになる細胞を用いた眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものである。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の対象とする眼細胞は角膜内皮細胞を含む。また、他の細胞、例えば、角膜上皮細胞でも、増殖しているのは基底細胞のごく一部であって、増殖していない細胞がほとんどであるため、角膜内皮細胞以外の網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞であっても、細胞保存または細胞培養という観点においても、その結果使用される細胞治療等による眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものであるといえる。
　本発明の細胞保存または細胞培養のための組成物のさらに好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
　本発明の細胞保存または細胞培養のための組成物の別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）はコンフルエントの状態にある。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、細胞保存または細胞培養という観点においてもきわめて有意義である。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、細胞保存または細胞培養を行い、その結果得られる細胞を用いた疾患または障害の治療または予防の観点からも、きわめて有用性が高いものである。
　従って、好ましい実施形態において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜保存または角膜内皮細胞培養のための組成物を提供する。このような組成物は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤の有効成分である、少なくとも１種のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子またはそれらの機能的等価物をそのままの形態で利用するものであってもよく、他の成分を含んで調製されることもできる。あるいは、本発明は、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いる、細胞を保存または培養する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いる工程を包含する、角膜を保存するか、または角膜内皮細胞を培養する方法を提供する。本発明の角膜保存または角膜内皮細胞培養のための組成物に含まれる分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）に記載される任意の実施形態を採用することができることが理解されるべきである。
　なお、本明細書において角膜内皮細胞が正常に培養されているかどうかは、角膜内皮細胞が本来有している機能（本明細書では「正常（な）機能」ともいう。）等の特徴を少なくとも１つは維持しているかを確認することによって判定することができる。そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ　Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｎｋｅｙ：ａ　ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ　ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８２，２６：２６４−２７３；Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ　Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｍｏｎｋｅｙ：ａｎ　ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ　Ｈｏｒｎ　ＤＬ，Ｈｙｎｄｉｕｋ　ＲＡ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｗｏｕｎｄ　ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｔｅ　ｃｏｒｎｅａ，Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ　１９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎＨｏｒｎ　ＤＬ，Ｓｅｎｄｅｌｅ　ＤＤ，Ｓｅｉｄｅｍａｎ　Ｓ，Ｂｕｃｏ　ＰＪ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｄ　ｃａｔ，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ　１９７７，１６：５９７−６１３）等が挙げられるがそれらに限定されない。すなわち、「正常な機能」は、角膜移植を実現するのに必要な機能または十分であることを示す指標でありうることが理解される。例えば、正常化の判断方法としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅのような角膜内皮細胞における機能タンパク質を指標としてその発現の変化を観察したり、あるいはサル等への移植によって生着し、機能するかどうかを調べることによって実行することができる。移植による判断方法は以下のとおりに行なうことができる。すなわち、Ｉ型コラーゲン上に角膜内皮培養して培養角膜内皮シートを作製する。全身麻酔下でカニクイザルの角膜輪部を１．５ｍｍ切開してシリコン製の手術器具を前房内に挿入して角膜内皮細胞を機械的に掻爬して水疱性角膜症モデルを作製する。続いて角膜輪部を５−６ｍｍ切開して培養角膜内皮シートを前房内に挿入し、前房を空気で置換することでシートを角膜内皮面に接着させる。培養角膜内皮シートの移植による水疱性角膜症の治療効果は細隙灯顕微鏡による角膜透明性の評価にて行うことができる。
　（細胞障害の治療または予防）
　別の局面において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防のための医薬組成物を提供する。本発明で使用される分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の分化抑制および／または増殖促進剤であってよい。また、本発明が対象とする細胞は、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防を目的とするものである限り、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の細胞の実施形態でよいことが理解される。すなわち、本発明が対象とする細胞は、特に限定されるものではないが、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防を目的とするものである限り、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮、角膜上皮細胞等の上皮細胞等を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は眼細胞である。本発明が対象とする眼細胞には、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞等が含まれうるが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物の１つの実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。理論に束縛されることを望まないが、定常状態で増殖していない細胞であっても、本発明によって、増殖させることができるという点で、本発明は、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防を行うことができるという点で、有意義な効果を発揮するものである。
　本発明の医薬組成物の別の実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。特に、角膜内皮細胞は、ほとんど定常状態では増殖しない細胞であって、これを、増殖させることができるという点は、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防という観点からも、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものである。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の対象とする眼細胞は角膜内皮細胞を含む。また、他の細胞、例えば、角膜上皮細胞でも、増殖しているのは基底細胞のごく一部であって、増殖していない細胞がほとんどであるため、角膜内皮細胞以外の網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞であっても、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防という観点に照らし、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものであるといえる。
　本発明の医薬組成物のさらに好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
　本発明の医薬組成物の別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）はコンフルエントの状態にある。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防という観点においても有意義である。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防という観点からも、きわめて有用性が高いものである。
　好ましい実施形態において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜内皮細胞障害の治療または角膜内皮細胞障害の進行予防のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に含まれる分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）に記載される任意の実施形態を採用することができることが理解されるべきである。
　本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、角膜疾患）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいう。
　本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、角膜疾患等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
　本発明の治療剤の効果を確認する場合は、角膜移植での適応能を観察することで判定することができる。角膜移植への適応能は、通常ウサギ等の実験動物においても水疱性角膜症モデルとして角膜内皮を機械的に掻爬して、培養細胞の移植試験を行うことができる。しかしながら、ウサギの角膜内皮細胞は生体内で増殖するため、ホストの角膜内皮細胞の増殖による自然治癒の可能性を否定できない（Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８２，２６：２６４−２７３；Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ　Ｈｏｒｎ　ＤＬ，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ１９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎ　Ｈｏｒｎ　ＤＬ，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ　１９７７，１６：５９７−６１３）。従って、より正確な移植適応能を評価するためには、霊長類への生着を評価することが好ましい。ヒトへの移植適応能を評価する場合は、霊長類であるカニクイザルなどにおいて、例えば、少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも２ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月、さらにより好ましくは少なくとも１２ヶ月経過させた後の適応性を評価する。サル等の霊長類での移植適応能を確認することは特にヒトへの適用において重要である。
　本発明を医薬として投与する場合、種々の送達（デリバリー）系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の療法剤を投与することも可能であり、このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：治療剤（例えば、ポリペプチド）を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。本発明が眼科領域で使用される場合、さらに、眼に直接注入する等、適切な経路いずれかによって投与されうる。
　角膜等の治療の場合、点眼、眼軟膏塗布、結膜下注射、硝子体注射等の慣用された技術が使用されうる。
　治療剤がタンパク質をコードする核酸である特定の態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、そして細胞内に存在するように投与することによって、核酸をｉｎ　ｖｉｖｏ投与して、コードされるタンパク質の発現を促進することも可能であり、これは、例えばレトロウイルスベクターの使用によって、または直接注射によって、または微小粒子銃の使用によって、または核酸を脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られるタグ配列に連結した核酸を投与することによって、実行可能である。あるいは、核酸治療剤を細胞内に導入し、そして発現のため、宿主細胞ＤＮＡ内に相同組換えによって取り込ませることも可能である。
　一般的に、本発明の医薬、治療剤、予防剤等は、治療有効量の治療剤または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアを含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。
　好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの注射投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
　本発明の医薬、治療剤、予防剤を中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ（例えば、エステル等）で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
　特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、角膜への直接投与に適した投薬量範囲は、一般的に、キログラム体重あたり、活性成分約１~５００マイクログラムであるがこれに限定されず、これ以下でもこれ以上でも使用されうる。有効用量は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
　本発明の医薬組成物または治療剤もしくは予防剤はキットとして提供することができる。
　本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、抗体の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
　本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、骨格筋に投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ　ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
　特定の実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の１以上の成分が充填された、１以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
　本発明のキットはまた、本発明の治療剤、予防剤または医薬として使用するタンパク質をコードする発現ベクターも含有することも可能であり、このタンパク質は、発現された後、生物学的に活性な複合体を形成するため、再構成されることも可能である。このようなキットは、好ましくはまた、必要な緩衝剤および試薬も含有する。場合によって、このような容器に付随して、キット使用のための説明書、並びに／あるいは医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
　特定の実施形態において、本発明の核酸を含む医薬組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与することができる。本発明の多様な態様において、このような組成物を用いて、核酸の持続放出を達成することが有用である可能性もある。
　別の局面では、本発明の治療は、本発明を用いて調製された角膜組織自体、例えば、強角膜片を用いて実施することができる。好ましくは、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約４％以上の割合で、より好ましくは、約７％以上の割合で、さらに好ましくは約１０％以上の割合で存在する。通常の存在割合は１％程度であるため、このようなＫｉ６７陽性細胞、すなわち増殖性の細胞を含む角膜組織は従来存在したものではなく、新規な治療用の移植片としての生体から直接移植する角膜組織を超える治療効果が期待される。
　好ましくは、前記角膜内皮細胞の密度は、約４０００個／ｍｍ２以上であり、より好ましくは、約４５００個／ｍｍ２以上であり、さらに好ましくは、約５０００個／ｍｍ２以上である。ヒト角膜内皮の生体における正常値は２５００−３０００個／ｍｍ２程度であり、直接組織に本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を適用することにより、従来にない程度に増殖性細胞または未分化細胞、あるいは角膜内皮細胞の割合が増えた新規の組織が提供されることが理解される。このような組織は、生体から直接移植する角膜組織を超える治療効果を伴うことを目的として、角膜の疾患、障害または状態を改善または治療ないし予防するために利用されることが理解される。
　（細胞治療）
　別の局面では、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて培養された細胞を含む、その細胞の障害またはその細胞障害に起因する疾患または障害の治療剤または進行予防剤を提供する。本発明で使用される分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の分化抑制および／または増殖促進剤であってよい。また、本発明が対象とする細胞は、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の細胞の実施形態でよいことが理解される。すなわち、本発明が対象とする細胞は、特に限定されるものではないが、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮、角膜上皮細胞等の上皮細胞等を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は眼細胞である。本発明が対象とする眼細胞には、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞等が含まれうるが、これらに限定されない。
　本発明の治療剤または進行予防剤の１つの実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。理論に束縛されることを望まないが、定常状態で増殖していない細胞であっても、本発明によって、増殖させることができるという点で、本発明は従来にない効果を発揮するものである。
　本発明の治療剤または進行予防剤の別の実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。特に、角膜内皮細胞は、ほとんど定常状態では増殖しない細胞であって、これを、増殖させることができるという点は、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものである。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の対象とする眼細胞は角膜内皮細胞を含む。また、他の細胞、例えば、角膜上皮細胞でも、増殖しているのは基底細胞のごく一部であって、増殖していない細胞がほとんどであるため、角膜内皮細胞以外の網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞であっても、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものであるといえる。
　本発明の治療剤または進行予防剤のさらに好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
　本発明の治療剤または進行予防剤の別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）はコンフルエントの状態にある。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、発明者らの知る限りこれまで報告されていない。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、疾患または障害の治療または予防の観点から、きわめて有用性が高いものである。
　１つの実施形態では、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて培養された角膜内皮細胞を含む角膜内皮細胞障害の治療剤または進行予防剤を提供する。本発明の治療剤または進行予防剤に含まれる分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）、（細胞障害の治療または予防）、（細胞の保存または培養）等に記載される任意の実施形態を採用することができることが理解されるべきである。
　１つの実施形態において、特に、角膜内皮細胞の場合、本発明の治療剤または進行予防剤において含まれる細胞は、天然の状態において存在する通常の細胞よりも細胞密度が高いかおよび／または未分化な細胞をより多く含む集団として存在する。このような細胞を含む治療剤または進行予防剤は、従来作製することができなかったため、本発明は、従来治療または予防することができなかったかあるいは困難であった疾患または障害（例えば、水疱性角膜症やＦｕｃｈｓ角膜内皮変性症などの角膜内皮疾患が挙げられるがこれらに限定されない。）を処置することができるということにおいて臨床上有用性が高い。
　本発明の治療剤または予防剤は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて角膜内皮細胞等の細胞を培養することによって製造することができる。その際には、本発明の別の局面で記載されるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子または公知のＫｉ−６７、ＢｒｄＵなどの分化マーカーを指標に増殖能または分化レベルを判定することができる。増殖能または分化レベルの判定は、本明細書において別途詳細に説明される。
　本発明によれば、下記工程を含む、治療剤または進行予防剤の製造方法が提供される：（Ａ）角膜内皮細胞等の細胞を提供する工程；（Ｂ）本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を該細胞に接触させる工程；および（Ｃ）（Ｂ）の工程で接触された細胞を培養する工程。さらに、必要に応じて、本発明の別の局面で記載されるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子または公知のＫｉ−６７、ＢｒｄＵなどの分化マーカーを指標に増殖能または分化レベルを判定し、分化能・増殖能が高い細胞を選択する工程を含んでいてもよい。
　本発明によれば、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を処置が必要な被験者に投与する工程、または、本発明の治療剤または進行予防剤を処置が必要な被験者に投与する工程を含む、角膜内皮疾患、障害、または状態等の治療または予防方法が提供される。本発明の治療剤または進行予防剤を処置が必要な被験者に投与する工程は、細胞を含む医薬を投与する行為であるから移植ということもある。
　本発明の治療または予防方法によれば、投与または移植された細胞が角膜内皮の損傷を治癒させるあるいは修復することによって、角膜内皮疾患、障害、または状態を予防および／または治療することができる。
　本発明による治療方法の実施に当たっては、ヒトを含む哺乳動物、好ましくは移植を受ける個体自身または中絶胎児等から角膜内皮細胞を含み得る細胞を取得することができる。
　（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の分化能・増殖の識別マーカー）
　１つの局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子およびＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子は生体内に存在するものであり、増殖能の高い細胞および／または分化能の指標マーカーとして用いることができることが本発明において見出された。
　１つの実施形態では、本発明が対象とする増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　別の実施形態では、本発明が対象とする増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　別の実施形態では、本発明が対象とする角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　さらに別の実施形態では、本発明が対象とする角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ（遺伝子）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子の発現は、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能の指標となる。従って、本発明によれば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨの発現を検出することにより、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能を検出または選択することができる。他方、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現は、角膜内皮細胞のうち増殖能の低い細胞および／または分化能の指標となる。従って、本発明によれば、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することにより、角膜内皮細胞のうち増殖能の低い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞ではない比較的分化の進んだ細胞等）および／または分化能が低いことを検出または選択することができる。あるいは、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現の抑制または消失が検出された場合に、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能を検出または選択することができる。
　別の局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子に結合または相互作用する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤または診断剤を提供する。このような検出または診断のためには、物質の結合は、特異的であることが好ましい。
　このような検出剤または診断剤は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子に結合または相互作用することができる限り、どのような物質を利用してもよいが、例えば、その代表的な例として、これらの因子の抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいはこれらの因子をコードする核酸についての核酸プライマーもしくはプローブを挙げることができるが、それらに限定されない。
　本発明の検出剤または診断剤は、検出キットまたは診断キットとして利用することができる。
　１つの実施形態では、本発明が検出または診断の対象とする増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　別の実施形態では、本発明が検出または診断の対象とする増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　別の実施形態では、本発明が検出または診断の対象とする角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　さらに別の実施形態では、本発明が検出または診断の対象とする角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　本発明の検出剤は、検出可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
　本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
　本明細書中で使用される用語「結合」は、２つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
　従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する（または結合する）「因子」（または、薬剤、検出剤等）とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
　本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用する（または結合する）ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用（または結合）としては、例えば、リガンド−レセプター反応、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用（または結合）が包含される。
　本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、マーカー検出剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡ　マイクロアレイと最新　ＰＣＲ　法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．２００２　Ｄｅｃ；３２　Ｓｕｐｐｌ：５２６−５３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
　本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。
　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。
　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
　従って、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、眼の細胞の分化調節を行う薬剤を検出、スクリーニングすることができることが理解される。
　本明細書において「抗体」は、広義にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらのフラグメント、例えばＦｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、ならびにその他の組換えにより生産された結合体または機能的等価物（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（ｏｌｉｇｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、単鎖抗体、ｓｃＦＶ、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ（Ｆｖ）２）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ）を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられる抗ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５抗体およびＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）抗体は、それぞれ、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）のタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子およびＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子のそれぞれのタンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。
　本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
　本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。
　本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。
　本発明の検出剤または診断剤あるいはその他医薬は、プローブおよびプライマーの形態を採ることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒｓｐｏｎｄｉｎ類、Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に記載されるように、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現は角膜内皮細胞における増殖能の指標であり、また、分化状態の指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するために用いることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、１つの実施形態では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。
　本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
　通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
　本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。
　本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を利用して目的
遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
　本発明によるプライマーセットはＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等目的のタンパク質のヌクレオチド配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方がＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等目的のタンパク質の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＬＡＭＰ法（ＷＯ００／２８０８２号公報）においては、標的遺伝子に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３という３つの領域を、それぞれ規定し、この６つの領域を用いて４種類のプライマーを設計することができる。本発明のプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．”（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））に従って実施することができる。
　本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。
　通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
　１つの実施形態において、本発明の検出剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤は、タグを結合させたものであってもよい。
　本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭ　Ｆｌｕｏｒが望ましい。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５の組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
　本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカー検出剤にはこのようなタグを結合させてもよい。
　１つの局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法、あるいは角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を検出または診断する方法を提供する。
　本発明の方法では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするために、例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子を生体内で検出する工程を行って実施することができる。例えば、その際に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子に結合する物質を含む検出剤を用いることができる。そのような検出剤は、本明細書において記載されており、その記載を元に、当業者が本発明の方法を実施することができることが理解される。
　本発明の方法は、本発明の検出剤または診断剤を目的とする試料に接触させ、その試料中に目的とする対象であるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子があるかどうか、あるいはそのレベルまたは量を測定する。
　本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、物質を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカー、検出剤、診断剤、リガンド等として機能しうるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
　１つの実施形態では、本発明の方法において対象とされる増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
　別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる増殖能の高い細胞は幹細胞である。
　別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる角膜内皮細胞はヒト細胞である。
　さらに別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
　本発明の１つの実施形態では、本発明の指標とする方法に基づいて、分化の状態に関する診断を行うこともできる。
　具体的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現を検出する方法については、被験試料（例えば、細胞等）におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
　ここで、「被験試料」とは、角膜内皮細胞または目的とする細胞またはそれに由来する物質であって遺伝子発現を可能にするものを含むと考えられる試料であればよく、例えば、角膜内皮から直接単離した細胞を用いることができる。角膜内皮の細胞は公知の方法により取得することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｎ，Ｏｋｕｍｕｒａ　Ｎ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　Ｓ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１２；９５：６０−７．）。好ましくは、角膜内皮のドナーから得られた細胞、角膜内皮細胞等を被験細胞試料として用いることができる。また、インビトロで分化誘導された角膜内皮細胞を含む培養細胞を試料として用いることができる。インビトロにおける角膜内皮細胞への分化誘導は、公知のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、骨髄間質細胞等の細胞を出発材料として、公知の方法、例えば、ＡＭＥＤ法等による分化させる処理＜Ｕｅｎｏ　Ｍ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ　Ｍ，Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ，Ｏｓａｋａｄａ　Ｆ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｍ，Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｈ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　Ｓ，Ｓａｓａｉ　Ｙ：，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１０３（２５）：９５５４−９５５９，２００６．等を参照＞を行うことにより実施することができる。
　本発明による検出の１つの実施形態によれば、本発明によるプローブを核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を直接または間接的に検出することにより細胞試料におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を検出することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．”（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特にＳｅｃｔｉｏｎ　９．４７−９．５８）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、特にＳｅｃｔｉｏｎ　６．３−６．４）、”ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　２ｎｄ　ｅｄ．”（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）、条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ　２．１０）を参照しうる。
　ハイブリダイゼーション法を利用したＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現の検出は、例えば、：（ａ）被験試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程により実施することができる。工程（ａ）において、目的の被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を発現している細胞であるので、該細胞について、増殖能が高い（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能が高いと判定することができる。
　本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、試料におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現を検出することができる。
　核酸増幅法を利用したＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現の検出は、例えば、（ｉ）被験試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および（ｉｉ）形成された増幅産物を検出する工程により実施することができる。
　工程（ｉ）において、目的の被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いることができる。増幅産物の検出は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を用いて実施できる。増幅産物が検出される細胞は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を発現している細胞であるので、該細胞について、増殖能が高い（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能が高いと判定することができる。
　本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明による抗体と試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより試料におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することができる。
　抗原抗体反応を利用したＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現の検出は、例えば、下記工程：（Ｉ）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程；および（ＩＩ）抗原抗体複合体を測定する工程により実施することができる。抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、角膜内皮細胞を含むと考えられる被験細胞試料中のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。
　抗原抗体複合体が検出される細胞は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を発現している細胞であるので、該細胞について、増殖能が高い（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能が高いと判定することができる。角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、特に、角膜ジストロフィー、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害などの、あるいは他の特定の角膜内皮疾患（Ｆｕｃｈｓ角膜内皮変性症、後部多形性角膜内皮変性症等）の治療に用いるためには、増殖能が高い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）は純度が高いことが望ましい。
　前記の各検出工程は１回のみならず、同工程を繰り返しあるいは組み合わせて行うことにより、増殖能／分化能が高い細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。従って、このような実施形態を採用した場合、本発明による検出方法によれば、前記の工程を２回以上行うことにより、増殖能／分化能が高い細胞をより高精度に検出または選択することができる。
　また、他のマーカー遺伝子、好ましくはＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子をコードする遺伝子以外の増殖マーカー遺伝子（例えば、Ｋｉ−６７およびＢｒｄＵ等）あるいはこれらの因子を併用することにより、増殖能／分化能が高い細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
　本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
　本発明の診断薬等の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
　本発明で使用される抗体は、以下のようにして生産することができる。
　本発明で使用される抗体（例えば、抗ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５抗体、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子に対する抗体およびＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子に対する抗体等）は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
　一例として、モノクローナル抗体の調製方法を以下に記載する。モノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等の活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
　動物の免疫に抗原として用いるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等の成熟型等のタンパク質のアミノ酸配列の全体または免疫原性を有するフラグメントを免疫原として使用することができる。また、細胞表面に存在するタンパク質を特異的に検出するためのモノクローナル抗体としては、本発明のマーカーのタンパク質のアミノ酸配列における任意の１０以上からなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。他の本発明の任意の因子（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等ならびにこれらに対応するタンパク質など）についても同様に抗原を設計することができる。
　得られた抗原用のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
　上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４~２１日間隔で免疫する。
　最終の免疫日から２~３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、例えば１００μｇ用いられる。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。まず、目的となるタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫する。免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。更にこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって目的の抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。
　具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、目的となる遺伝子（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用される目的のタンパク質が取得できる。目的の遺伝子の塩基配列は、本明細書の他の場所に記載されている（例えば、ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００３６６７．２（配列番号１）、ＮＭ＿０００１９３（配列番号１１）などに開示されている。すなわち、目的の遺伝子をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から、目的のタンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のタンパク質もまた同様に使用できる。また、本発明で用いられるように、目的のタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のＦｃフラグメントやペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類またはそれ以上のポリペプチドフラグメントをコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている。
　このようにして精製された目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。目的のタンパク質の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。例えば、次のようなペプチド：目的のタンパク質（ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）のアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド；目的の遺伝子（ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子をコードする遺伝子等）の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド；目的のタンパク質（ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチドを感作抗原とすることができる。
　部分ペプチドとして用いるタンパク質の領域および大きさは限定されない。例示的な領域としては、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の場合、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列において１−５５６番目、６１５−６３７番目、７０４−７２２番目、および７９２−８００番目）から選択することができる。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも３以上、例えば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８~５０、好ましくは１０~３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の場合も、本明細書に記載される配列、たとえば、配列番号１２、４４、４６、４８、５０、５２等の情報を元に、同様に適切なペプチドを感作抗原とすることができる。
　該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
　公知の方法に従って上記の動物が感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に４から２１日毎に数回投与される。感作抗原は、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。更に、感作抗原をアジュバントとともに投与することができる。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
　加えて、モノクローナル抗体は、ＤＮＡ免疫（ＤＮＡ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）によっても得ることができる。ＤＮＡ免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターＤＮＡを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。ＤＮＡ免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を発現するＤＮＡを免疫動物に投与する。目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）をコードするＤＮＡは、ＰＣＲなどの公知の方法によって合成することができる。得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、例えばｐｃＤＮＡ３．１などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。例えば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（ｇｅｎｅ　ｇｕｎ）で細胞内に打ち込むことによってＤＮＡ免疫を行うことができる。
　このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
　上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下ＨＧＰＲＴ欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下ＴＫ欠損と省略する）などが公知である。ＨＧＰＲＴやＴＫの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下ＨＡＴ感受性と省略する）を有する。ＨＡＴ感受性の細胞はＨＡＴ選択培地中でＤＮＡ合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してＤＮＡの合成を継続することができるためＨＡＴ選択培地中でも増殖するようになる。
　ＨＧＰＲＴ欠損やＴＫ欠損の細胞は、それぞれ６−チオグアニン、８−アザグアニン（以下８ＡＧと省略する）、あるいは５’ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをＤＮＡ中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、Ｇ４１８耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって２−デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。基本的には公知の方法、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ　Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１~１０倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を培養液に添加することができる。
　細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量１０００~６０００程度のＰＥＧを、通常３０％（ｗ／ｖ）~６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
　このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばＨＧＰＲＴまたはＴＫの欠損を有する細胞は、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、ＨＡＴ感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、ＨＡＴ培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記ＨＡＴ培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。あるいは、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を認識する抗体を国際公開ＷＯ０３／１０４４５３に記載された方法によって作製することもできる。
　目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって適宜実施することができる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実質的に同質なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質が好ましく使用できる。例えば目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を発現する細胞株、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）の細胞外ドメイン、あるいはその領域を構成する部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを、抗原として利用することができる。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、例えばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平１−５９８７８号公報参照）。この方法によって得られる抗ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５抗体は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。ＳＨＨ、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子についても同様である。
　さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となる目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）を投与するか、または目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５）を当該動物中において発現するように構築されたＤＮＡによって免疫することによって、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対するヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞から、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２参照）。更に不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、その動物の免疫システムは、目的のヒトタンパク質（例えば、ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５）を異物と認識する。従って、目的のヒトタンパク質（例えば、ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対するヒト抗体を容易に得ることができる。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。
　本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５参照）。
　例えば目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対する抗体の取得を目的とするとき、抗体の目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）への結合は、特異的であることがさらに好ましい。目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に結合する抗体は、例えば、１）得られたｃＤＮＡによってコードされるＶ領域を含む抗体を目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に接触させる工程；（２）目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）と抗体との結合を検出する工程、および（３）目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に結合する抗体を選択する工程を含む方法によりスクリーニングすることができる。
　抗体と目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）との結合を検出する方法は公知である。具体的には、担体に固定した目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対して被験抗体を反応させ、次に抗体を認識する標識抗体を反応させる。洗浄後に担体上の標識抗体が検出されたときには、当該被験抗体の目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）への結合を証明できる。標識には、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性蛋白質、あるいはＦＩＴＣ等の蛍光物質を利用することができる。抗体の結合活性を評価するために目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を発現する細胞の固定標本を利用することもできる。
　結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法を用いることもできる。上記のように抗体遺伝子を重鎖と軽鎖とのサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）とすることができる。ｓｃＦｖをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、ｓｃＦｖを表面に発現するファージを得ることができる。このファージを目的とする抗原と接触させて、抗原に結合したファージを回収すれば、目的の結合活性を有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを回収することができる。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、目的とする結合活性を有するｓｃＦｖを濃縮することができる。
　本発明において抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の全長をコードしていてもよいし、あるいは抗体の一部をコードしていてもよい。抗体の一部とは、抗体分子の任意の部分を言う。以下、本明細書では、本発明の実施の際に抗体フラグメントを用いる場合がある。本発明における好ましい抗体フラグメントは、抗体の相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）を含む。更に好ましくは、本発明の抗体フラグメントは、可変領域を構成する３つのＣＤＲの全てを含む。
　１つの実施形態では、本発明の抗体には、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に結合する限り、ＩｇＧに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはＩｇＭに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。
　免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、または抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。抗体検出の方法としては、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。
　イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカーの濃度を測定することが出来る。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的または間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカーに特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
　質量分析によってマーカーの濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。さらに、２台の質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。
　電気泳動によりマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカーを分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカーに相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカーの分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカーの量を測定することもできる。
　クロマトグラフィーによってマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカーを分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカーの濃度を測定することができる。
　抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。
　ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０）、Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ　Ｄ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８：４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−２７０）、ＦＯ（Ｌａｚｅｋａｓ　ｄｅ　Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．ａｎｄ　Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ　Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−１３３）等が好ましく使用される。
　抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出または採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地または緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
　次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＥ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１~１：１０で融合促進剤の存在下、３０~３７℃で１~１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００~６，０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０~２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で２~１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１~４週間後に腹水または血清を採取する。
　上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。
　従って、抗体作成の際に抗原として含まれる物質は、その対象となるマーカーの全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。エピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明していないとしても使用することができるが、必要な場合は、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８；米国特許第４，７０８，８７１号；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２３：７０９を参照することができる。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
　従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは直鎖状であってもコンフォメーション形態であってもよい。
　１つの局面において、本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出キットが提供される。
　１つの実施形態では、本発明による検出キットとしては、本発明による実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出する。従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
　本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｋｉ−６７、ＢｒｄＵ等）の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
　別の実施形態において、本発明による検出用キットとしては、本発明による別の実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出する。従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、ＰＣＲが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
　本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカーの発現を更に検出する。
　さらなる実施形態において、本発明による検出キットとしては、本発明によるさらなる実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子のタンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出する。この実施形態の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
　この実施形態では、本発明による検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカーの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカーの発現を更に検出する。
　これらのキット、組成物またはシステムは、本発明のマーカー（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を同定することができる限り、任意の被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。
　１つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子（例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）である。好ましくは、因子は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。
　本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ））、生化学的手段（例えば、ｐＩ電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（２ＤＥ−ＤＩＧＥ）、同位体標識法（ＩＣＡＴ）、タンデムアフィニティ精製法（ＴＡＰ法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
　本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムまたはキットは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段（該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。
　好ましい実施形態では、本発明では、対象となる試料を精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。
　１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマーカーの定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカーの定量を行うための定量手段をさらに備える。
　１つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカーが正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。
　１つの実施形態では、本発明のキットまたはシステムは、マーカーまたはマーカーに特異的に相互作用する前記因子を含む組成物を含む。
　１つの局面において、本発明は、被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段の、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態の予測診断、事前診断、予測、検出または診断するための医薬の製造における、使用を提供する。ここで、試料の取得は、どのような手段で行ってもよい。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態またはその可能性があるかどうかの決定は、正常値と比べて、各々のマーカーに比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。本発明の方法において、使用されるマーカーなどは、本明細書の他の場所において記載される任意の１または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。本発明の検出または診断において、マーカーの濃度を測定する方法は、そのマーカーの濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
　本発明の検出または診断における好ましい実施形態の一つは、マーカーを担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカーの濃度を測定することである。すなわち、マーカーに対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカーを担体上に捕捉する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカーの濃度を測定することができる。
　１つの実施形態においてマーカーの測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカーに特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカーの濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
　一方、１つの実施形態において、マーカーの測定方法に質量分析を用いる場合は、抗体の他、イオン結合や疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉することもできる。イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がなく、マーカー以外の物質も捕捉されるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間質量分析（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（本明細書中「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行えば、マーカーの濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、金属イオン基板が好ましく用いられる。
　イオン結合によってマーカーを担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陰イオン交換体、陽イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体のいずれも用いることができる。例えば、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。一方、疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４~Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。さらに、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋等の金属イオンを固定化した担体にマーカーを捕捉することもできる。
　１つの実施形態において、用いる担体の例としては、ビーズ、マイクロタイタープレート、樹脂等の公知のものを使用することができる。特に、ビーズとマイクロタイタープレートは、イムノアッセイにおいて従来から用いられており、測定系の構築が容易である。一方、基板のような、平面部分を有する担体を用いることもできる。この場合は、平面部分の一部にマーカーに対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基盤としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカーに特異的な抗体を固定化した担体が挙げられる。
　本発明によるプローブ、プライマー、または抗体等の検出剤または診断剤を指標として選択された細胞は、増殖能を有する未分化細胞または前駆細胞（例えば、角膜内皮細胞に存在する未分化細胞または前駆細胞）であることから、従来の雑多な細胞集団または外来遺伝子を導入した前駆細胞と比べて、安全性、生存率、ネットワーク形成能の面で水疱性角膜症または角膜内皮炎等の角膜内皮疾患、障害または状態あるいはその他の眼科疾患の治療または予防に好ましいものである。選択されうる細胞は、分裂停止前、すなわち増殖中の未分化細胞または前駆細胞であり、脳内の最適な場所で分化成熟していく可能性があり、また、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてさらに未分化細胞または前駆細胞が増殖する可能性があることから、より長期的な治療効果も期待できる。従って、本発明は、水疱性角膜症または角膜内皮炎等の角膜内皮疾患、障害または状態あるいはその他の眼科疾患の効果的な治療または予防の実用化に途を拓くものであるといえる。
　（スクリーニング）
　本発明による検出方法は、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、被験物質の添加により、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞に分化誘導されたか否かを、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を指標として判定することにより、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質をスクリーニングすることができる。
　従って、本発明によれば、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供され、この方法は、（ｉ）角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞に分化し得る細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）と、被験物質とを接触させる工程；および（ｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出する工程を包含する。工程（ｉ）において、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞に分化し得る細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、あるいはこれらの細胞より分化誘導した神経前駆細胞または神経堤細胞を含む培養細胞から採取することができる。
　工程（ｉ）において、「被験物質を接触させる」とは、例えば、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞に分化し得る細胞を含む培養細胞に被験物質を添加することにより行うことができる。
　使用されうる「被験物質」としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、核酸（アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等）等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定されるものではない。「被験物質」は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
　工程（ｉｉ）においては、本発明による検出法に従って、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することができる。
　具体的な実施形態としては、本明細書に記載されるハイブリダイゼーション法を利用した検出、核酸増幅法を利用した検出、抗原抗体反応を利用した検出を、適宜実施することにより、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することができる。
　工程（ｉｉ）において、被験物質を接触させて、細胞試料においてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子の発現が検出された場合に、該物質を角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質であると判定することができる。ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現の抑制または消失が検出された場合に、該物質を角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質であると判定することができる。
　本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質として用いることができる。本発明によれば、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供され、この方法は：（ｉｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞における、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子の発現を検出する工程を更に下記工程を含んでいてもよい。工程（ｉｉ）において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現が検出され、かつ、工程（ｉｉｉ）において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｋｉ−６７、ＢｒｄＵ等）の発現が検出された場合に、該物質を角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。なお、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉ）の後に行われればよく、工程（ｉｉ）の前でも後でもよい。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆＭｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
　例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されるものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Ｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：７４４８−７４５１）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、京都府立医科大学または同志社大学において規定される基準を遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。また、視覚および眼科研究における動物の使用についてのＡＲＶＯ宣言（ｔｈｅ　ＡＲＶＯ　Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌｓ　ｉｎ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ　ａｎｄ　Ｖｉｓｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って動物の飼育および取り扱いを行った。また、試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ，和光純薬、ナカライ、ａｂｃａｍ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｎｏｖａ，Ａｓｓａｙ　Ｐｒｏ，Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｂｉｏｂｙｔ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＩＢＬ等）の同等品でも代用可能である。
　（実験材料と方法）
　（材料）
　（角膜組織）
　本実験で使用した全てのヒト角膜組織はアメリカシアトルアイバンクのＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｌｉｏｎｓ　Ｆｏｕｄａｔｉｏｎ）より輸入されたものを使用した。また，全てのサル角膜組織は，他の研究目的により安楽死したカニクイザル（日精バイリス株式会社滋賀研究所（ＮｉｓｓｅｉＢｉｌｉｓ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）Ｏｈｔｓｕ，Ｊａｐａｎ、株式会社ケアリー（Ｋｅａｒｉ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）Ｗａｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）の角膜を使用した。全ての角膜を、保存培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ　Ｖｉｓｉｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中、４℃で保存した。全ての実験は、ヘルシンキ宣言の教義にしたがって実施した。
　（細胞培養）
　ヒト角膜内皮細胞初代培養では，角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し，ＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉに溶解した２ｍｇ／ｍｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ａ（カタログ番号：７０１６４９２３；Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れて３７℃でインキュベートした。３時間後，１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（カタログ番号：０４０７；Ａｔｈｅｎａ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ（カタログ番号：５１９８５；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に５％ウシ胎仔血清（カタログ番号：１０４３７−０２８；ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ；ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅ）、５０μｇ／ｍｌ　Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ）、１０μｇ／ｍｌ　Ｙ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を加えたものを使用した。
　サル角膜内皮細胞初代培養では，角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し，ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解した１．２Ｕ／ｍｌ　Ｄｉｓｐａｓｅ　Ｉ［（三光純薬）カタログ番号：ＧＤ８１０６０］に入れて、３７℃でインキュベートした。１時間後，ピペッティングでデスメ膜から角膜内皮細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ５分間遠心分離して上清を除去した沈殿している角膜内皮細胞に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘをコートした６ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＤＭＥＭ（カタログ番号：１２３２０；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０％　ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（カタログ番号：１５７１０−０６４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０μｇ／ｍｌ　Ｙ−２７６３２（カタログ番号：６８８０００５；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、２ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；カタログ番号：１３２５６−０２９；ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたものを使用した。
　ヒト角膜は、初代培養までの期間が１４日未満のものを用いた。ヒトおよびサルの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の培養には、以前に報告した系［Ｔａｎ　ＤＴ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．，２０１２；３７９：１７４９−１７６１；Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．，２０１２；９５：６０−６７；Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．．２００７；４８：４５１９−４５２６；Ｏｋｕｍｕｒａ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ．２０１２；１８１：２６８−２７７］を使用した。
　培地交換は２日ごとに行った。継代は５０~８０％コンフルエントになった時点で行った。継代方法は、Ｃａ２＋Ｍｇ２＋非含有（ｆｒｅｅ）ＰＢＳ（ＰＢＳ−；Ｎｉｓｓｕｉ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ．Ｊａｐａｎ）で細胞を洗浄し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ（カタログ番号：１２５６３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え，３７℃で５分間インキュベートした。プレートから細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、培養培地を加えて細胞懸濁液とした。ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘをコートしたプレートへ１：２の密度で細胞を播種した。
　（免疫染色）
　免疫組織化学研究は、本発明者らが以前に記載した方法［Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．，２００７；２５：６２８−６３８；Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．，２００８；２６：１２６５−１２７４］に従って行った。
　角膜組織凍結切片を作製するために、角膜組織をＯＣＴ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ（カタログ番号：４５８３；Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で包埋し、液体窒素にて凍結させた。凍結ブロックを８μｍに薄切してシランコーティングスライドに貼付し風乾した。全組織切片の作製では、角膜組織から角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、氷冷した１００％アセトンにて３０秒間静置後、シランコーティングスライドに貼付して風乾した。培養角膜内皮細胞はＬａｂＴｅｋ８ウェルプラスチックチャンバースライドで培養したものを使用した。角膜組織ならびに培養細胞に氷冷した１００％アセトンを加えて４℃で１５分間静置して細胞を固定させた。０．１５％ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳ−にて振盪洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；カタログ番号：Ａ４５０３ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、室温３０分間静置しブロッキングした。一次抗体は１％ＢＳＡで希釈し、室温１時間インキュベートした。使用する一次抗体には、抗ウサギＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（カタログ番号：ＧＴＸ７１１４３；１：２００；ＧｅｎｅＴｅｘＩｎｃ．，Ｓａｎ　Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）、抗ウサギＮｅｓｔｉｎ（カタログ番号：ＰＲＢ−５７０Ｃ；１：２００；ＣＯＶＡＮＣＥ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）、抗マウスＡＢＣＧ２（カタログ番号：ＮＣ　２３６；１：２；Ｋａｍｉｙａ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　ＣＯ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ　ＵＳＡ）、抗マウスＫｉ−６７（カタログ番号：５５６００３；１：２００　ＢＤ　ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ　ＮＪ，ＵＳＡ）、抗ウサギＮａ＋／Ｋ＋　ＡＴＰａｓｅ（カタログ番号：Ａ１３２；１：１００；Ｚｙｍｅｄ）、抗ウサギＺＯ１（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いた。０．１５％　Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ−にて２回、ＰＢＳ−にて１回振盪洗浄した。
　二次抗体は１％ＢＳＡと０．１５％　ＴｒｉｒｏｎＸ／ＰＢＳ−の混合溶液にて希釈し、室温３０分間インキュベートした。使用する二次抗体には、ＡｌｅｘａＴＭ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号：Ａ１１０３４；１：１５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｌｅｘａＴＭ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗マウスＩｇＧ（カタログ番号：Ａ１１０２９；１：１５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。０．１５％　Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ−にて２回、ＰＢＳ−にて１回振盪洗浄後、ヨウ化プロピジウム（カタログ番号：ＳＰ２９００４−４１；ＰＩ；Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）にて核染色を行い、カバーガラスをかけて包埋した。共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｆｌｕｏｖｉｅｗ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて観察し、写真撮影した。
　（リアルタイムＰＣＲ）
　リアルタイムＰＣＲ実験は、本発明者らが以前に記載した方法［Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．．２００７；２５：６２８−６３８］に従って行った。
　角膜組織や培養細胞からのＲＮＡ抽出にはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（カタログ番号：７４１０６；ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用した。抽出したＲＮＡ１μｇあたり１μｌ　ＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ（カタログ番号：１８４１８−０２０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、７０℃２分間インキュベート後、すぐに氷冷した。さらに、５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ，１００ｍＭ　ＤＴＴ（カタログ番号：７７２５９０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（カタログ番号：１８０６４−０１４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ（カタログ番号：ＢＧ７４０１Ａ；Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ．，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）、４０ｕｎｉｔ／μｌ　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（カタログ番号：ＳＩＮ−１０１；Ｔｏｙｏｂｏ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ　Ｊａｐａｎ）を含む反応液を加え、４２℃で４５分間、７０℃で１５分間インキュベートしてｃＤＮＡを合成した。プライマーの作製にはＢＬＡＳＴ　ｐｒｏｇｒａｍｓ（ＮＣＢＩ）を利用した（表１）。合成したｃＤＮＡ　２μｌにプライマーとＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（カタログ番号：４３６７６５９；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を加え、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクルで反応させた。得られたデータをＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍで解析した。なお、各遺伝子の発現量はβ−ａｃｔｉｎの遺伝子発現量で補正し、コントロールとの相対値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（フローサイトメトリー）
　培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘをコートした６−ウェルプレートへ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて１４日間培養した。ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔにて細胞を剥離して回収した。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の分取のために、回収した細胞に１％　ＢＳＡを加え、室温１５分間インキュベートしてブロッキングした。一次抗体は抗ウサギＧＰＲ４９／ＬＧＲ５とＡｌｅｘａＴＭ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ＜いずれも上記実施例参照＞を使用し、各々室温で２０分間インキュベートした。フローサイトメーター（ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））を使用してＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞とＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陰性細胞を分取し、各細胞を８ウェルチャンバースライドへ播種して培養した。３日間後、抗マウスＫｉ−６７にて免疫染色し、Ｋｉ−６７陽性細胞数を計測した。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞における細胞増殖率検討のために、回収した細胞に７０％エタノールを加えて−２０℃で２時間インキュベートし、細胞を固定した。ＰＢＳ−にて２回洗浄後、１％　ＢＳＡを加え、室温で１５分間インキュベートしてブロッキングした。一次抗体は、抗ウサギＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（１：１００）、抗マウスＫｉ−６７（１：１００）を使用し、室温で３０分間インキュベートした。二次抗体はＡｌｅｘａＴＭ　Ｆｌｕｏｒ　４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（１：１５００）とＡｌｅｘａＴＭ　Ｆｌｕｏｒ　５９４−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（１：１５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、室温で２０分間インキュベートした。細胞のソーティングにはＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用した。データの解析には付属のソフトウェアを使用した。
　（細胞面積の測定）
　各々の単離細胞画分を遠心分離して、培養培地中に再懸濁させた。細胞（約１００細胞／ｍｌ）を、６ウェルプレート内に入れ、倒立顕微鏡下で撮像した。細胞の面積を、Ｓｃｉｏｎ　Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて無作為に測定し（２００細胞／画分）、統計解析を行った［Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．，２００７；２５：６２８−６３８］。
　（遺伝子導入；ＲＮＡ干渉）
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｓｈＲＮＡウイルスベクターを含むレンチウイルスパーティクルを作製するために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を購入した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現ベクターは京都府立医科大学眼科学教室川崎諭より譲渡されたものを使用した。このベクターの作製方法は以下のとおりである。
　すなわち、このベクター構築のため、目的の遺伝子（ここでは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５）を発現するレンチウイルスプラスミドベクターを用いた。本発明者らは、目的の遺伝子を挿入するためのベクターとして市販のレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。特定の遺伝子のコード配列全体を包含するプライマー対を用いてｃＤＮＡを鋳型として用いて増幅反応を行い、これをゲル精製し、レンチウイルスプラスミドベクターにライゲートさせた。
　このレンチウイルスの発現の際、生成および感染は、以前本発明者らの一部が報告したｓｈＲＮＡについて用いてプロトコール（Ｎａｋａｔｓｕｋａｓａ　Ｍ，Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｓ，Ｙａｍａｓａｋｉ　Ｋ，Ｆｕｋｕｏｋａ　Ｈ，Ｍａｔｓｕｄａ　Ａ，Ｔｓｕｊｉｋａｗａ　Ｍ，Ｔａｎｉｏｋａ　Ｈ，Ｎａｇａｔａ−Ｔａｋａｏｋａ　Ｍ，Ｈａｍｕｒｏ　Ｊ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　Ｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ．２０１０　Ｓｅｐ；１７７（３）：１３４４−５５．）を改変して用いた。手短に述べれば、レンチウイルスプラスミドＤＮＡを、ｐＬＰ１、ｐＬＰ２およびｐＬＰ／ＶＳＶＧプラスミドを含むパッケージングプラスミド混合物であるＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１４μｌ　Ｆｕｇｅｎｅ　ＨＤをトランスフェクション試薬として用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。１８時間後、培地を吸引除去し、完全培地（ＤＭＥＭに１０％　ＦＢＳを補充したもの；以下「培養培地」とも称する）に置き換え、レンチウイルス粒子の品質を評価した。
　詳細には、ＤＭＥＭに１０％　ＦＢＳを添加した培養培地でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９．０×１０５個／２５ｃｍ２の密度で播種した。２４時間培養後、ＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）およびＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＩＳＳＩＯＮ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてインキュベートした。１８時間後培養培地に交換し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて培養した。２４時間後、レンチウイルスパーティクルを含む培養培地を回収した。回収したレンチウイルスの力価測定にはＨＩＶ−１　ｐ２４　Ａｎｔｉｇｅｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用した。なお、コントロールにはランダムな配列を有するＮｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ　ｓｈＲＮＡ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。ヒトおよびサル培養角膜内皮細胞を６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル；ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（登録商標）を施した６ウェルプレート）または８ウェルチャンバースライド（５００細胞／ウェル）へ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下で培養した。２４時間後、作製したレンチウイルスパーティクルおよび４μｇ／ｍｌヘキサジメトリンブロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ポリブレンともいう。）を添加し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下でトランスフェクションした。２４時間後、０．４μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む培養培地に交換し、ピューロマイシン耐性細胞を選択した。ピューロマイシン抵抗性コロニーは、０．４μｇ／ｍｌピューロマイシン存在下で培養し、２日おきに培地を交換した。
　（遺伝子発現のためのレンチウイルスプラスミドベクターの構築）
　目的の遺伝子を発現するレンチウイルスプラスミドベクターの構築のために、市販のレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。特定の遺伝子の全コード配列を包囲するプライマー対を用いたｃＤＮＡを増幅し、ゲル精製し、次いで、レンチウイルスプラスミドベクター内にライゲーションした。
　発現用レンチウイルスの生成および感染は、ｓｈＲＮＡについて使用した本発明者らのプロトコール［Ｎａｋａｔｓｕｋａｓａ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ．．２０１０；１７７：１３４４−１３５５］の改変バージョンで行った。簡単に述べると、レンチウイルスプラスミドＤＮＡを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤをトランスフェクション試薬として用い、ｐＬＰ１、ｐＬＰ２およびｐＬＰ／ＶＳＶＧプラスミドを含むプラスミドパッケージングプラスミドミクスチャＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。１８時間後、培地を吸引して、完全培地と交換し、レンチウイルス粒子の量を評価した。
　（遺伝子導入）
　感染能を持つウイルス粒子を含む培養上清を回収し、ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（登録商標）を含む６ウェルプレート中５０００細胞／ウェルのヒトＣＥＣへと移した。上清は、４μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で培養ＣＥＣ上に適用した。ピューロマイシン耐性コロニーを集める際、細胞は０．４μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下で培養し、そして、培地を２日おきに交換した。
　（ウェスタンブロッティング）
　ウェスタンブロッティングには、以下のウサギポリクローナル抗体：抗ＬＲＰ６、ｐ−ＬＲＰ６（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と、以下のマウスモノクローナル抗体：β−カテニン（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用した。二次抗体は、ＨＲＰ標識抗ウサギまたはマウスＩｇＧ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した。組換えヒトＳＨＨ、プルモルファミン、シクロパミンおよびＲＳｐｏｓは、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。
　培養ヒトＣＥＣをＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ、１％　ＴＲＩＴＯＮＴＭＸ−１００、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、ホスファターゼインヒビターカクテル２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびホスファターゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解バッファーでリンスした。活性化されたβ−カテニン（非膜結合型）の検出は、以前に報告されたプロトコール［Ａｇｈｉｂ　ＤＦ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．，１９９５；２１８：３５９−３６９］に従って実施した。簡単に述べると、Ｃｏｎ　Ａ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４Ｂ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理した細胞溶解物を、４℃で１時間インキュベートした。４℃で１０分間の遠心分離の後、上清を新しいチューブに移し、Ｃｏｎ　Ａ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭを各チューブに加え、４℃で１時間インキュベートした。最終的に、簡単な遠心分離の後、上清を新しいチューブに移し、そのタンパク質濃度を決定した。
　次いで、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移した。その後、メンブレンを、ＴＢＳ−Ｔバッファー中１％　ＥＣＬ　Ａｄｖａｎｃｅ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔバッファー中で３回洗浄した後、ＰＶＤＦメンブレンを、室温で１時間、適切なＨＲＰ標識抗ウサギまたはマウスＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートした。メンブレンを、ＥＣＬ　Ａｄｖａｎｃｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって感光させ、ＬＡＳ３０００Ｓ画像化システム（富士フィルム株式会社、東京都）で観察した。
　以下に各実施例および結果を示す。
　（実施例１：全層ヒト角膜組織における幹細胞マーカーの発現）
　ヒトＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のインビボ発現パターンを、間接的免疫蛍光法によって調べた。比較のために、未熟細胞および前駆細胞のマーカーであるネスチンおよびＡＴＰ結合化セットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）もまた調べた。
　角膜内皮細胞特異的に発現するタンパクを探索するために、既報の幹細胞マーカーを用いて網羅的に免疫染色を行った（図２ａ）。その結果、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜内皮細胞特異的に強い発現が認められた。比較対象として、未分化細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎ（Ｌｅｎｄａｈｌ　Ｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９０）と角膜輪部基底細胞に特異的に発現するＡＢＣＧ２（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２００４）を用いた。
　このように、これらの組織のＣＥＣを調べると、特に周辺部領域において強力なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が観察された。しかしながら、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、角膜上皮および角膜間質では最小限にしか発現していなかった（図２ａ）。ネスチンは、角膜の全体にわたって中程度に発現しており、ＡＢＣＧ２は、主に角膜上皮の基底細胞層で発現し、角膜の間質および内皮では弱く発現することが分かった（図２ａ）。
　Ｎｅｓｔｉｎは角膜全層で強い発現が見られた。ＡＢＣＧ２は角膜上皮基底細胞に強発現が見られ、角膜実質、角膜内皮にも発現が見られた。リアルタイムＰＣＲにてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｎｅｓｔｉｎ、ＡＢＣＧ２のｍＲＮＡ発現量を比較した（図２ｂ）。Ｎｅｓｔｉｎ　ｍＲＮＡおよびＡＢＣＧ２　ｍＲＮＡ発現量は、角膜内皮と比較して角膜上皮と角膜実質に有意に発現量が亢進していた。他方、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡ発現量は角膜内皮において有意に発現量が亢進していることが認められた。
　このように、リアルタイムＰＣＲは、平均ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡ発現が、角膜の実質細胞および上皮細胞と比較してＣＥＣにおいて有意にアップレギュレートされたことを示した（＊ｐ＜０．０５）（図２ｂ）。これに対し、角膜の実質細胞および上皮細胞におけるネスチンおよびＡＢＣＧ２の発現レベルは、ＣＥＣにおける発現レベルよりも高かった（図２ｂ）。したがって、角膜組織の中で、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は、ＣＥＣにおいて最も顕著であることが分かった。
　従って、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜内皮細胞特異的に発現するタンパク質の一つであると判断した。
　（実施例２：ヒト角膜全組織切片におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現局在）次に、本発明者らは、ホールマウント免疫蛍光法を用いて、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の局所パターンを検討した。
　本実施例では、角膜内皮組織におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現局在を調べるために、角膜組織から角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、免疫染色ならびにリアルタイムＰＣＲにて発現量を比較検討した（図２ｃ）。
　免疫染色を行った結果、図２ｄ−ｅに示すように、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜周辺部の内皮細胞の細胞膜や細胞質で強い発現が認められた（図２ｄ）。また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡ発現量も中心部と比較して周辺部角膜内皮の方が亢進していた（図２ｅ）。
　ＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は、ＣＥＣでは、周辺部領域において上昇しており、また、その発現レベルはＣＥＣの中心領域に向かって次第に減少することが分かった（図２ｃ、ｄ）。リアルタイムＰＣＲははっきりと、周辺部領域におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が、中心領域（直径７ｍｍ）と比べてアップレギュレートすることを示した（＊ｐ＜０．０５）（図２ｅ）。これらの知見は、角膜組織において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が周辺部ＣＥＣにおいて固有に発現されることを示す。
　（実施例３：培養ヒト角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現）
　本実施例では、培養ヒト角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現を調べた。
　ヒト角膜内皮細胞は生体内での増殖能に乏しく、生体外での細胞培養も極めて困難である。これまでにも様々な培養方法の検討が行われてきたが、六角形で敷石状の細胞形態を維持した状態で継代培養する方法は確立されていない。そこで、既存の方法にてヒト角膜内皮細胞を培養した際のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現量を検討した。比較対象としてＮｅｓｔｉｎを用いた。
　免疫染色を行った結果、角膜組織（ｉｎ　ｖｉｖｏ）ではＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｎｅｓｔｉｎともに非常に強い発現が見られた（図３ａ）。初代培養細胞では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は認められなかったが、Ｎｅｓｔｉｎの発現は確認された。継代細胞（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｐ０）では，ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は確認できなかったが、Ｎｅｓｔｉｎの発現は低下したものの発現が確認された。また、継代細胞（ｉｎ　ｖｉｔｒｏＰ１）では細胞分化を引き起こし、核の増大が認められた。同様の条件で培養した角膜内皮細胞の各ｍＲＮＡ量を解析したところ、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡ発現量は培養環境において有意に発現量が減少したが、Ｎｅｓｔｉｎ　ｍＲＮＡ発現量はほとんど減少が認められなかった（図３ｂ）。
　このように、インビボでのヒトＣＥＣの位相差顕微鏡写真は、これらが、より小さなサイズの均質な六角形の細胞のコンフルエントな単層を呈することが明らかになった（図３ａ）。これに対し、培養ＣＥＣ（Ｐ０、Ｐ１）は、拡大し、均質な六角形ではないことが分かった（図３ａ）。免疫染色は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がインビボの周辺部ＣＥＣにおいて十分に発現されることを示した（図３ａ）。特筆すべきことに、インビトロの培養ＣＥＣ（Ｐ０、Ｐ１）では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の最小限の発現しか認められなかった（図３ａ）。リアルタイムＰＣＲは、平均ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡ発現が、インビボＣＥＣにおける発現と比較して、インビトロＣＥＣにおいて有意にダウンレギュレートされることを示した（＊ｐ＜０．０５）（図３ｂ）。これに対し、インビボおよびインビトロの両方におけるネスチンの発現レベルは同様であった（図３ａ、ｂ）。
　（実施例４：培養サル角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現）
　サル角膜内皮細胞はヒトと同様に生体内での増殖能に乏しい性質をもつが、安定した継代培養方法の確立に成功している（Ｏｋｕｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，ＩＯＶＳ　２００９，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．８，３６８０−３６８７）。そこで、サル角膜内皮細胞を継代培養したときのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現量を評価した。
　免疫染色を行った結果、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は継代した培養角膜内皮細胞において安定的に発現維持できていることがわかった（図３ｃ）。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡはサル角膜組織と比較して継代することにより発現量が低下する傾向が認められたが、発現量が維持できていた（図３ｄ）。
　このように、サルＣＥＣの位相差顕微鏡写真は、インビボおよびインビトロ（Ｐ０、Ｐ１）の両方の細胞が、より小さなサイズの均質な六角形の細胞のコンフルエントな単層を示すことを示した（図３ｃ）。これらの細胞の免疫染色は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がインビボおよびインビトロの両方において中程度に発現されることを示した（図３ｃ）が、インビトロにおける平均ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡ発現は、細胞を継代するにつれ次第に減少した（＊ｐ＜０．０５）（図３ｄ）。これらの知見を考慮すると、ヒトおよびサルの細胞を用いた場合、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、インビトロでＣＥＣの未分化状態を維持するための重要な調節因子であり得るようである。
　以上の結果から、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜内皮細胞の生体外での安定的な培養において重要な働きを持つ可能性があることが理解される。
　（実施例５：ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の細胞生物学的特徴の検討）
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性角膜内皮細胞の細胞生物学的特徴を検討するため、ＦＡＣＳを用いて解析を行った。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を維持した状態で継代培養できることが確認された培養サル角膜内皮細胞を使用し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋）とＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陰性細胞（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−）の細胞サイズおよび増殖能を比較検討した。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）細胞およびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（−）細胞の特徴を調べるために、細胞のサブセットをフローサイトメトリーにより単離した。セルソーティングの手順を検証するために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に関する免疫蛍光法により、精製した画分においてタンパク質レベルでの発現を確認した（図４ａ）。最も高いコロニー形成能は報告によれば最小のケラチン生成細胞において見出されるので［Ｂａｒｒａｎｄｏｎ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．，１９８５；８２：５３９０−５３９４］、Ｓｃｉｏｎ　Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて単離した画分の各々における細胞の大きさを測定した。
　ＦＡＣＳでセルソーティング後、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋およびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−を蛍光顕微鏡で撮影し、無作為に各々３５個の細胞の大きさをＩｍａｇｅ　Ｊ（Ｗａｙｎｅ　Ｒａｓｂａｎｄ（ＮＩＨ）フリーソフト）にて測定したところ、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−に比べて有意に小さいことがわかった（図４ａ、図４ｂ）。そして、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）細胞の平均サイズは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（−）細胞の平均サイズよりも有意に小さい（１８４．６±４５．８μｍ２対３２６．７８±７８．８μｍ２，Ｎ＝３５，＊＊ｐ＜０．０１）ことが分かった。
　次に、単離した細胞画分の各々の細胞周期の状態を評価するために、単離した細胞画分を細胞チャンバスライド上で培養した。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）細胞およびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（−）細胞におけるＫｉ６７標識細胞の割合は、それぞれ、１４．２±３．８７％および０．５８±０．５％であり、Ｋｉ６７標識指数における差は統計的に有意であった（＊ｐ＜０．０５）（図４ｃ）。その結果、Ｋｉ−６７陽性細胞率はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋の方が有意に高いことが明らかになった（図４ｃ）。そこで単離した細胞画分の各々の増殖能をさらに詳細に調べるために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＫｉ６７の二重染色についてＦＡＣＳを使用し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５と細胞増殖との関係をより明確にするために、培養サル角膜内皮細胞（継代数３）を抗ウサギＧＰＲ４９／ＬＧＲ５と抗体マウスＫｉ−６７で二重染色し、ＦＡＣＳによる解析を試みた。その結果、全細胞の内ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋は７．２％であり、そのうち、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋／Ｋｉ−６７＋は３．４％であった（図４ｄ）。また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−／Ｋｉ−６７＋の細胞は認められなかった。ＦＡＣＳ分析は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｈｉｇｈ／Ｋｉ６７ｈｉｇｈ細胞画分が３．４％であったのに対し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｈｉｇｈ／Ｋｉ６７ｌｏｗ細胞画分が３．８％であったことを示した（図４ｄ）。最も興味深いことに、全てのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｌｏｗ細胞画分が、低いＫｉ６７レベルを示し（９２．８％）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現なしでは、ＣＥＣは増殖能を有さないことと理解される。
　（実施例６：ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナルのターゲット遺伝子としてのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５）
　本実施例ではＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がヘッジホッグシグナルにおける機能を調べた。
　ヘッジホッグシグナルは胎生期の形態形成に関わるシグナルとして同定され、その後、成体組織の幹細胞や癌化にも深くかかわっていることが明らかになってきた。また、ＨＨシグナル伝達は、細胞の分化、増殖および成長のような様々な種類の生物学的プロセスにおいて重要な役割を担うことも報告されている［Ｂａｒｋｅｒ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ，２００７；４４９：１００３−１００７；Ｓｔａｎｔｏｎ　ＢＺ　ｅｔ　ａｌ、ＭｏｌＢｉｏｓｙｓｔ．，２０１０；６：４４−５４；Ｔｓｕｒｕ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１９８４；２８：１０５−１２５］。ヒトのリガンドとしてＳＨＨ、Ｉｎｄｉａｎ　Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｉｈｈ）、Ｄｅｓｅｒｔ　Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｄｈｈ）の３種類のタンパク質が同定されている。リガンドが存在しない状態では、シグナルに対し抑制的に働くレセプターである１２回膜貫通型タンパクＰａｔｃｈｅｄ１（Ｐｔｃｈ１）が、７回膜貫通型タンパクＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の細胞膜局在を抑制し、下流のシグナル分子への伝達も阻害している。この状況下では、Ｓｍｏの下流にある転写因子Ｇｌｉファミリー（Ｇｌｉ１，Ｇ１ｉ２，Ｇｌｉ３）にシグナルが伝わらず、標的遺伝子の転写が起こらない。Ｐｔｃｈ１へのリガンドの結合により、Ｐｔｃｈ１のＳｍｏに対する抑制がなくなり、Ｓｍｏから転写因子Ｇｌｉファミリーに至るシグナル系路が活性化し、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ／Ｅ，Ｍｙｃなどの標的遺伝子が転写される。シグナルの関連分子であるＰｔｃｈ１、Ｇｌｉ１も標的遺伝子であり、シグナルの活性化の指標となっている。
　前述のとおり，ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜周辺部に高い発現量がある（図２ｃ、図２ｄ、図２ｅ）。そこで、ヒト角膜中心部内皮細胞と周辺部内皮細胞におけるヘッジホッグシグナル関連分子（Ｓｈｈ、Ｓｍｏ、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２）のｍＲＮＡ発現量を比較し、ＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の特性を分子レベルで定義するために、まず、ＣＥＣにおけるＨＨシグナル伝達関連分子の発現を調べた。
　その結果、リガンドであるＳｈｈと転写因子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２の発現量（ｍＲＮＡのレベル）は、中心領域におけるものと比較して、周辺部領域のＣＥＣにおいて上昇していることが観察され、周辺部内皮細胞の方が亢進しており、シグナルの活性化が認められた（図５ａ）、一方で、ＨＨ経路の受容体分子であるスムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）（Ｓｍｏ）およびｐｒｏｔｅｉｎ　ｐａｔｃｈｅｄ　ｈｏｍｏｌｏｇ　１（Ｐｔｃｈ１）の発現レベルは同様であり、これらのＰｔｃｈ１およびＳｍｏは差が見られなかった。したがって、ＨＨシグナル伝達は明らかに、周辺部領域のＣＥＣにおいて活性化されており、ＨＨシグナル伝達活性の場所による変動が存在することが示唆された。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５とヘッジホッグシグナルとの関連性を調べ、ＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現がＨＨシグナル伝達経路によって調節されるかどうかを決定するために、組換えヒトＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ｒｈＳｈｈ）、Ｓｍｏのアゴニストであるプルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）（Ｓｉｎｈａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：２９−３０，２００６）、アンタゴニストであるシクロパミン（Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ）（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１６（２１）：２７４３−２７４８，２００２）を使用して、ヘッジホッグシグナルの活性化、または抑制によるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現への影響と細胞増殖との関連性について検討した。ヒト角膜組織に１００ｎｇ／ｍｌ　ｒｈＳｈｈ、１０μＭプルモルファミン、１０μＭシクロパミンを処理し、３７℃５％ＣＯ２条件下で３日間インキュベートした。角膜からデスメ膜を剥離してシランコーティングスライドへ貼付し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＫｉ−６７の免疫染色を行った。また、同様の条件でインキュベートした角膜内皮細胞のＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにてｍＲＮＡ発現量を測定した。
　免疫染色の結果、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現はコントロールと比較してｒｈＳｈｈ添加群とプルモルファミン添加群で顕著な増加（アップレギュレート）が見られた（図５ｂ）。特に、ｒｈＳｈｈ添加群はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現細胞数が増加しており、プルモルファミン添加群はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞が強発現する傾向が認められた。このことから、ｒｈＳｈｈはＰｔｃｈ１への結合によりシグナルの活性化に働くのに対し、プルモルファミンはＳｍｏへの結合により活性化されるため、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現細胞のシグナルの活性化に働いたためと推測された。また、シクロパミンは明らかな発現抑制が確認された。同様の結果は、ｍＲＮＡ発現レベルでも確認できた（図５ｃ）。また、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２の発現パターンは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のものと同様であったが、ＨＨ活性化は、ＨＨ受容体（Ｐｔｃｈ１）に対して劇的な影響は有さなかった（図５ｃ）。
　また、ＨＨ経路がインビボでＣＥＣ増殖を誘導するかどうかを解明するために、Ｋｉ６７に対する免疫組織化学研究を実施した。ヒトＣＥＣは、有糸分裂的には不活性であり、インビボでは弱い増殖能を示すかまたは増殖能を示さないので［Ｊｏｙｃｅ　ＮＣ、Ｐｒｏｇ　Ｒｅｔｉｎ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．，２００３；２２：３５９−３８９］、全ての群でＫｉ−６７陽性細胞は検出できなかったため（図５ｂ）、ヒト角膜組織におけるヘッジホッグシグナルによる細胞増殖の促進は起こらないと考えられ、ＨＨ経路のみの刺激では、インビボでのＣＥＣ増殖を誘導するには不十分であると理解される。
　培養ヒト角膜内皮細胞でも同様の結果になるのか検証するために、初代ヒト角膜内皮細胞を８ウェルチャンバースライドへ播種し、培養培地に１００ｎｇ／ｍｌ　ｒｈＳｈｈ、２μＭプロモルファミン、２μＭシクロパミンを添加後、３７℃５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。３日後、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＫｉ−６７の免疫染色を行った。また、同様の条件でインキュベートした角膜内皮細胞のＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにてｍＲＮＡ発現量を測定した。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５はｒｈＳｈｈ添加群のみ発現細胞が確認できた（図５ｄ、図５ｅ）。角膜組織ではＫｉ−６７陽性細胞はなかったが、培養角膜内皮細胞ではｒｈＳｈｈ添加群とプルモルファミン添加群について、コントロールと比較して発現量が亢進していた（図５ｆ）。シクロパミン添加群では細胞形態の異常と細胞増殖の抑制が認められた。
　ＣＥＣは、報告によれば、インビトロで増殖する能力を維持しており［ＥｎｇｅｌｍａｎｎＫ　ｅｔ　ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．，１９８８；２９：１６５６−１６６２］、したがって、上述のように本発明者らは、ＨＨ経路がＣＥＣのインビトロ増殖を誘導するかどうかを検討した。Ｋｉ６７の発現は、ＳＨＨおよびプルモルファミン刺激に応答してアップレギュレートされることが分かったが、これは、シクロプロパミンに応答してアップレギュレートはされなかった（図５ｇ）。これらの知見は、インビトロの状況において、ＨＨ経路が、ＣＥＣ増殖を誘導できることを示す。本発明者らは、シクロパミン処理したＣＥＣが、その正常な六角形の形態を維持できなかったと断定した（図５ｆ）。これらの知見を考慮すると、本発明者らは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がＣＥＣにおけるＨＨシグナル伝達の標的分子であり、ＣＥＣの維持は、部分的にＨＨ経路によって調節されることを初めて見出した。
　（実施例７：ｓｈＲＮＡを用いたＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子の発現抑制）
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５とヘッジホッグシグナルの関連性を明らかにするために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を高発現している培養サル角膜内皮細胞を用いて、ｓｈＲＮＡによるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現抑制を試みた。
　初めに、リアルタイムＰＣＲにてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡの発現が有意に減少する条件を検討したところ、コントロールと比較してｓｈＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−５８９がＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡ発現量を約６０％抑制できることを確認した（図６ａ）。次に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現抑制によるヘッジホッグシグナルへの影響を検討するために、ｓｈＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−５８９をトランスフェクトしたサル角膜内皮細胞を用いて、ヘッジホッグシグナル関連分子（Ｐｔｃｈ１，Ｇｌｉ１，Ｇｌｉ２）のｍＲＮＡ発現量を解析した。その結果、ヘッジホッグシグナル関連分子の発現量の変化は確認できなかった（図６ｂ）。理論に束縛されることを望まないが、ＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子の発現抑制が増殖能には影響があった可能性がある。
　（実施例８Ａ：ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子の強制発現）
　角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を解析するために、通常の培養条件ではＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現が著しく低下する培養ヒト角膜内皮細胞を用いて、遺伝子導入法によるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の強制発現を試みた。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現ベクターをトランスフェクトした培養ヒト角膜内皮細胞は、コントロールと比較して約６０倍の発現亢進が認められた（図６ｄ）。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を遺伝子導入した細胞は、細胞分化が抑制されており、角膜内皮細胞のポンプ機能の評価として用いられるＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅの発現が亢進されていた（図６ｃ）。この条件の細胞を使用して、ヘッジホッグシグナル関連分子（ｐｔｃｈ１、ｇｌｉ１、ｇｌｉ２）のｍＲＮＡ発現量を調べた。その結果、全ての関連分子において発現量が抑制（Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｆｅｅｄｂａｃｋ）されていた（図６ｄ）。
　（考察）
　上記実施例により、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜組織周辺部に存在する角膜内皮細胞の幹細胞・前駆細胞に特異的に発現していることを明らかになった。また、ヘッジホッグシグナルは角膜内皮細胞の増殖を促進する働きがあるが、ヘッジホッグシグナルの下流遺伝子であるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、ヘッジホッグシグナルに対し抑制的働くことで細胞の未分化性維持に重要な役割を果たしていることが明らかになった。
　培養サル角膜内皮細胞を用いたフローサイトメトリーの結果より、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞にのみ細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７陽性細胞の発現が見られた（図４ｃ、ｄ）。培養ヒト角膜内皮細胞ではヘッジホッグシグナルの活性化によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が亢進し（図５ｄ、ｅ）、細胞増殖の促進を確認した（図５ｆ，ｇ）。ヘッジホッグシグナルの活性化により細胞増殖が引き起こされることはｒｈＳｈｈ添加による成体神経幹細胞の増殖促進や（Ｌａｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　６：２１−２７、２００３），プルモルファミン添加による間葉系幹細胞の増殖・分化促進（Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１，１，２２９−１，２３８、２００４）により報告されているため、角膜内皮細胞についても同様にシグナルの活性化による細胞増殖促進作用があると考えられた。現在、角膜内皮細胞の安定的な培養方法が確立されていないことから、ヘッジホッグシグナル活性化による細胞増殖促進効果を利用した新規の培養方法の確立に応用できる可能性があることが理解される。本実施例では、ＳＨＨの活性化により、培養内皮細胞では、増殖が亢進することが理解される。また、ＳＨＨは、分化の程度のマーカーとして使用されうることが理解される。対照的に、角膜内皮組織では、ヘッジホッグシグナルの活性化によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は亢進されたが細胞増殖促進の効果は得られなかった（図５ｂ）。生体内でのヒト角膜内皮細胞の細胞間は極めて密に接しており、ＥＤＴＡを用いて細胞間接着を緩和しなければ、細胞周期が働かないことが報告されている（Ｓｅｎｏｏ　ｅｔ　ａｌ．、ＩＯＶＳ　４１　２９３０−２９３５、２０００）。従って，ヘッジホッグシグナルの活性化によりターゲット遺伝子は発現亢進するが、生体内での細胞間接着は非常に緊密なために細胞増殖に繋がらなかったのではないかと推察された。また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の強制発現の実験より、ヘッジホッグシグナルの関連分子でありシグナル活性化の指標でもあるＰｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２の発現が低下していたことに注目した（図６ｄ）、つまり、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５はヘッジホッグシグナルのターゲット遺伝子として存在しているにもかかわらず，ヘッジホッグシグナルの関連分子の発現を抑制する、ネガティブ制御因子としての役割をもつ可能性がある。従って、ヘッジホッグシグナルの抑制により他のターゲット遺伝子であるＣｙｃｌｉｎＤ／ＥやＭｙｃなどの細胞増殖関連遺伝子の発現も抑制さていると推察される。さらに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５強制発現細胞は細胞間が高密度に接触する傾向にあり、角膜内皮細胞の機能性が高い。ヘッジホッグシグナル活性化による増殖・分化への進行をＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が制御することで未分化性の維持に貢献しているのではないかと推察した。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が細胞間接着に関連している可能性があり、今後の検討課題としてさらなる研究が必要であると考えられる。
　（まとめ）
　要約すると、角膜内皮細胞はＳｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇをリガンドとしたヘッジホッグシグナルにより、生体内での細胞増殖が制御されている可能性がある。また、ヘッジホッグシグナルのターゲット遺伝子であるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、角膜内皮細胞の未分化性維持機構に関与していると考えている。
　（実施例８Ｂ：ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のさらなる解析）
　（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のダウンレギュレーションは、ＣＥＣの増殖を減少させた）
　ＣＥＣに対するＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の直接作用は、ｓｈＲＮＡによるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のノックダウンによって解明した。培養ヒトＣＥＣがめったにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を発現しない（図３ａ、ｂ）という事実に起因して、この実験には、霊長類の培養ＣＥＣを使用した。ｓｈＲＮＡの９つのセットを設計し、そのノックダウン能の有効性を検討した。これらのうち、ｓｈＲＮＡ−５８９が、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５　ｍＲＮＡ発現をノックダウンするのに最も有効（約６０％のノックダウン）であることが分かった（図６ＡのＡ）。Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２についてのリアルタイムＰＣＲは、ｓｈＬＧＲ５群とコントロールとの間に有意差が見られないことを示した（図６ＡのＡ）。ＣＥＣ増殖に対するＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子ノックダウンの影響を実証するために、Ｋｉ６７についての免疫細胞化学研究を実施した。コントロールと比較すると、ｓｈＬＧＲ５処理細胞の細胞形態は、劇的に変化してはいなかったが、ｓｈＬＧＲ５処理細胞におけるＫｉ６７（＋）細胞の数は、大きく減少していた（図６ＡのＢ）。これらの知見は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のダウンレギュレーションは、ＨＨ経路に対して影響を有さないが、インビトロでのＣＥＣ増殖を減少させることを示した。
　（永続的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現は、Ｗｎｔ経路を介して間葉転換（ＭＴ）を阻害した）
　ＣＥＣに対する永続的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現の直接的な作用を調べるために、本発明者らは、ＣＭＶ−ＬＧＲ５−ｍＲＦＰを含むレンチウイルスを用いて、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を過剰発現させようと試みた。この実験では、ヒト培養ＣＥＣを使用した。なぜなら、これらが、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をめったに発現しない（図３ａ）からである。リアルタイムＰＣＲは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が、ＮＴベクターをトランスフェクトした細胞における発現の約６０倍高いことを示した（図６ＢのＢ）。免疫蛍光法を用いると、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が、ＮＴ細胞における発現と比較して上昇していることが確認された（図６ＢのＡ）。非常に興味深いことに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞におけるＨＨシグナル伝達分子の相対的ｍＲＮＡレベルは、ＮＴ細胞におけるものと比較してダウンレギュレートされており（図６ＢのＢ）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がＨＨ経路のネガティブフィードバック調節因子として機能すると理解される。
　ヒトＣＥＣは、報告によれば、通常の培養条件下では線維芽細胞様の形態変化を受けやすい［Ｐｅｈ　ＧＳ　ｅｔ　ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．，２０１１；９１：８１１−８１９］。レンチウイルスのトランスフェクションの後、ＮＴ細胞は、拡大した細長の形状（線維芽細胞様変化）を示し、均質な六角形の形状ではなかった（図６ＢのＡ）。非常に興味深いことに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞は、その形態を次第に変化させ、コンパクトなより小さなサイズの均質な六角形の細胞となり、再び正常な生理学的形態をとることが示された（図６ＢのＡ）。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞の細胞密度は、ＮＴ細胞のものと比較した場合、大きく上昇した（図６ＢのＣ）。ＮＴおよびＬＧＲ５ベクターをトランスフェクトした培養ＣＥＣの機能を調べるために、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ１について免疫組織化学法を実施した。これらの２つの機能的タンパク質の発現は、ＮＴ細胞よりも、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞においてかなりより高いことが分かった（図６ＢのＡ）。これらの知見を考慮すると、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、正常なＣＥＣ表現型の維持のための重要な分子であり得るようである。
　ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞において観察された興味深い知見から、本発明者らはさらに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の永続的な発現が、ＭＴプロセスをブロックし得るかどうかを検討することにした。上皮−ＭＴ（ＥＭＴ）関連分子（Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔおよびコラーゲン１）［Ｌｅｅ　ＪＭ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，２００６；１７２：９７３−９８１］の発現レベルをリアルタイムＰＣＲを用いて調べた。最も重要なことに、Ｓｌｕｇを除く全てのＥＭＴマーカーの相対的ｍＲＮＡレベルは、ＮＴ細胞よりも、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞において低く（図６ＢのＤ）、永続的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現がＭＴプロセスをブロックしたと理解される。本発明者らはさらに、どの経路がＣＥＣにおいて観察された内皮ＭＴを調節するかを調べた。最近の研究は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が、ＥＭＴにおいて重要な役割を果たすことを示唆している［Ｌｅｅ　ＪＭ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，２００６；１７２：９７３−９８１］。それゆえ、ウェスタンブロット分析を用いてＷｎｔ／β−カテニン関連分子の発現レベルを調べた。特筆すべきことに、サイトソル（非膜結合型）β−カテニンおよびリン酸化ＬＤＬ受容体関連タンパク質６（ｐ−ＬＲＰ６）のタンパク質レベルは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞において大きく減少した（図６ＢのＦ）。これらの知見は、永続的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を介して角膜内皮ＭＴを阻害することを示した。
　（ＲＳＰＯ１は、ＣＥＣ増殖を加速させ、Ｗｎｔ経路を介してＭＴを阻害した）
　これまでに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーのオーファン受容体であり、そのリガンドは未知であった。しかしながら、いくつかの近年の報告は、ＲＳＰＯがＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のリガンドとして機能して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を調節することを実証した［Ｃａｒｍｏｎ　ＫＳ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．，２０１１；１０８：１１４５２−１１４５７；ｄｅ　Ｌａｕ　Ｗ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ，２０１１；４７６：２９３−２９７；Ｇｌｉｎｋａ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．、ＥＭＢＯ　Ｒｅｐ．，２０１１；１２：１０５５−１０６１］。興味深いことに、本発明者らは、ＲＳＰＯ１、２、３および４が、角膜の上皮、実質および内皮の細胞において発現され、そして、ＲＳＰＯ１、２および３は、周辺部領域のＣＥＣにおいてのみ発現されることを発見した（図６ＣのＡ）。ＣＥＣ分化に対するＲＳＰＯの機能を決定するために、本発明者らは、霊長類ＣＥＣを、ヒト組換えＲＳＰＯとともに、または、ヒト組換えＲＳＰＯなしで培養した。特筆すべきことに、ＲＳＰＯ１で処理した培養ヒトＣＥＣのみが、コンパクトなより小さな大きさの均質な六角形の細胞を示し、他方で、他のＲＳＰＯは、インビトロでのＣＥＣ分化に対して影響を有さなかった（図６ＣのＢ）。ＣＥＣ増殖に対するＲＳＰＯの機能を決定するために、本発明者らは、Ｋｉ６７についての免疫組織化学研究を実施した。最も驚くべきかつ非常に興味深いことに、ＲＳＰＯ１とともにインキュベートしたＣＥＣは、他のＲＳＰＯと比較して劇的に増大したレベルのＫｉ６７（＋）細胞比を示した（図６ＣのＣ）。これらの知見を考慮し、本発明者らは、ＲＳＰＯファミリーの中でも、ＲＳＰＯ１が特に、ＣＥＣの維持において重要な役割を果たし得ると考えた。
　最後に、ＣＥＣに対するＲＳＰＯ１の影響をさらに決定するために、本発明者らは、ヒトＣＥＣの二次培養物を、ＲＳＰＯ１有または無で維持した。両方の条件でのＣＥＣの培養を通じて、本発明者らははっきりと、ＲＳＰＯ１とともに培養した細胞は、その六角形の形態を維持したのに対し、ＲＳＰＯ１無しで培養した細胞は、線維芽細胞様の表現型を示したことを観察した（図６ＢのＥ）。ＲＳＰＯ１処理細胞の細胞密度は、非処理細胞のものと比較して上昇した（図６ＢのＥ）。どの経路がこのタイプの角膜内皮ＭＴを調節するかを実証するために、本発明者らは、ウェスタンブロット分析を用いてＷｎｔ／β−カテニン関連分子の発現レベルを調べた。驚くべきことに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトし、ＲＳＰＯ１で処理した細胞におけるサイトソルβ−カテニンおよびｐ−ＬＲＰ６のタンパク質レベルは、明らかに、ＮＴ細胞と比較して減少していた。さらに、ＮＴおよびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトし、ＲＳＰＯ１で処理した細胞のタンパク質レベルは、ＲＳＰＯ１で処理していない細胞群と比較してより減少していた（図６ＢのＦ）。これらの結果は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を過剰発現する細胞のＲＳＰＯ１での刺激が、ｐＬＲＰの分解とβ−カテニンのターンオーバーを加速することを示唆した。
　（考察）
　大部分の哺乳動物は、角膜をとして外部情報の大部分を獲得するので、角膜組織は極めて重要である。近年、角膜移植手技が現在、角膜形成術から角膜内皮移植術へのパラダイムシフトを経ているという事実から、ＣＥＣが特に注目を集めている。それゆえ、科学的そして臨床的に、世界中の角膜関連の失明を処置するための次世代の新規治療を確立するためには、角膜内皮幹細胞／前駆細胞の分子機構を理解することがかなり重要である。しかしながら、これらの分子機構については現在、ごくわずかしか知られていない。
　ＣＥＣの特徴および増殖能は、角膜の中心領域に位置するものと、角膜の周辺部領域に位置するものとで異なることが報告されており［Ｂｅｄｎａｒｚ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ＣｅｌｌＤｅｖ　Ｂｉｏｌ　Ａｎｉｍ．，１９９８；３４：１４９−１５３］、また、角膜は、中心領域よりも周辺部領域においてより高い内皮細胞密度を有することが研究によって示されている［Ｓｃｈｉｍｍｅｌｐｆｅｎｎｉｇ　ＢＨ、Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．，１９８４；２５：２２３−２２９］。さらに、周辺部領域由来のＣＥＣは、報告によれば、中心領域由来のＣＥＣよりも高い複製能を維持しており［Ｍｉｍｕｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．，２００６；４７：１３８７−１３９６］、そして、周辺部領域のＣＥＣは、より多くの前駆体を含み、かつ、中心領域におけるＣＥＣよりも強力な自己再生能を有する［Ｍｉｍｕｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．，２００５；４６：３６４５−３６４８］。したがって、ヒト角膜内皮幹細胞／前駆細胞は主に周辺部領域に分布している可能性が高い。実際、ＣＥＣについての幹細胞／前駆細胞マーカーは、これまでのところ解明されていない。本研究の結果は、ＣＥＣが、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現に関して領域的な多様性を示すことを初めて実証した。これらの知見と、ＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の独特の発現パターンを考慮すると、これは、角膜内皮幹細胞を含む集団についての最初のマーカーとなる可能性がある。
　細胞の大きさにより、一過的に増幅する細胞または分化した細胞からケラチン生成細胞幹細胞を区別し得ることが報告されている［Ｂａｒｒａｎｄｏｎ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．，１９８５；８２：５３９０−５３９４］。表皮では、最小のケラチン生成細胞のフォルボールエステルに対する応答が、他の細胞のものと異なる。これらのケラチン生成細胞はまた、最も高いコロニー形成能を示した。ＣＥＣは外胚葉由来のケラチン生成細胞とは異なるが、本発明者らのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）細胞の平均直径は、現実に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（−）細胞のものよりも小さかった。これらの知見と、報告された周辺部ＣＥＣの大きさに基づくと。細胞の大きさは、角膜内皮幹細胞／前駆細胞の潜在的な指標となるようである。
　本発明者らは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が、ＣＥＣの未分化状態の維持と、インビトロにおける正常な細胞表現型の調節にとって重要な分子であることを見出した。本発明者らはまた、そのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現強度に基づいて分画した単離細胞が、異なる特性を持つ異なる細胞集団を生じ得ることを見出した。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）集団における細胞のみが、幹細胞／前駆細胞集団に関連する特徴である、並外れて高い増殖能を示した。これらの知見、特有の発現パターンおよびインビトロ条件における不可避性に基づくと、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５と角膜内皮幹細胞／前駆細胞の機能との間に何らかの関連性が存在する可能性がある。
　以前の研究が、高濃度のＳＨＨが網膜前駆細胞集団における顕著な増加と、分化した細胞の蓄積における全体的な増加を引き起こしたことを示している［Ｓｔａｎｔｏｎ　ＢＺ　ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２０１０；６：４４−５４］。本願の知見は、インビトロの状況において、ＨＨ経路が、以前の報告の知見と一致して、ＣＥＣの増殖を誘導し得ることを示す。ＨＨは、広範囲の組織型における発生の複数の局面の間にモルフォゲンとして機能する分泌型分子のファミリーである。ＨＨは、細胞の増殖や生存を調節することによって、四肢パターンの決定における左右非対称の決定や、前後軸決定に関与する。ＣＥＣでは、ＨＨシグナル活性に領域的なバリエーションが存在しており、本発明者らの知見に基づけば、ＨＨシグナル伝達が、角膜内皮形態形成を制御している可能性がある。
　ＲＳＰＯは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の強力な増強物質として単離された、４システインリッチ分泌型タンパク質のファミリーである。ＲＳＰＯの細胞生物学的機能に関する大量の情報が、特に、オーファン受容体ＬＧＲ４／５／６のリガンドとしてのその役割に関して、過去数年にわたって明らかになってきた。これらのアップデートされた重要な知見から、本発明者らは、ＲＳＰＯがヒトＣＥＣの機能に対して影響を有し得るかどうかをさらに検討することとした。ヒトＣＥＣは、有糸分裂的には不活性であり、インビボでは本質的に再生能を持たないため、疾患または外傷に起因した角膜内皮の喪失の後には、残りの内皮細胞の代償的な拡大が生じる。本発明者らが知る限り、ヒトＣＥＣの増殖およびＣＥＣ密度のレベルを増加させる有用な誘導性試薬または分子に関する報告は存在しない。本研究の知見は、ＲＳＰＯ１とともにインキュベートしたＣＥＣが、細胞増殖および細胞密度の劇的に増大したレベルを示すことを初めて示し、この分子が、局所投与または培養試薬によって損傷を受けた角膜を再構成するための最初の候補分子となる可能性があることが示唆される。
　いくつかの研究が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が、ＥＭＴにおいて重要な役割を果たすこと、そして、Ｗｎｔ／β−カテニン依存性シグナル伝達がＥＭＴ関連遺伝子の発現を調節することを示唆している［Ｌｅｅ　ＪＭ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，２００６；１７２：９７３−９８１］。しかしながら、これまでの報告は、ＲＳＰＯが、実際にＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のリガンドとして機能することによってＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を増強することを示している［Ｃａｒｍｏｎ　ＫＳ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．，２０１１；１０８：１１４５２−１１４５７；ｄｅ　Ｌａｕ　Ｗ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ，２０１１；４７６：２９３−２９７；Ｇｌｉｎｋａ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．、ＥＭＢＯ　Ｒｅｐ．，２０１１；１２：１０５５−１０６１］。この活性化に関与する実際の機構は未だ不明であり、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がＷｎｔ経路の正の調節因子であるか負の調節因子であるかについて、いくつかの相反する知見が存在している［Ｇａｒｃｉａ　ＭＩ　ｅｔ　ａｌ．、ＤｅｖＢｉｏｌ．，２００９；３３１：５８−６７；Ｓｃｈｕｉｊｅｒｓ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．，２０１２；Ｗａｌｋｅｒ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．，２０１１；６：ｅ２２７３３］。１つの可能な説明は、分子機構が組織、臓器およびその種に依存するというものである。角膜は、涙液および眼房水によって維持される独特の無血管組織である。これに対し、大部分の他の臓器は、血管構造の支持によって維持されており、角膜細胞の特徴および機構は、他の組織の上皮細胞とは根本的に異なることが示唆される。したがって、本研究の知見に基づけば、ＲＳＰＯ１は、ＣＥＣの増殖を劇的に加速させ、そして、Ｗｎｔ経路を介して角膜内皮ＭＴを阻害する。
　（結論）
　結論として、本研究の知見は、ヒトＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を初めて実証するものである（図６Ｄ）。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、多数の幹細胞／前駆細胞集団を同定する際の強力なツールとなることが証明された。ＨＨおよびＷｎｔ経路を介したＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の調節により、ＣＥＣの完全性は十分に体系化され、維持された。加えて、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５リガンドであるＲＳＰＯ１は、ＣＥＣの有効な増大を提供するための新規の十分なプロトコールを開拓し得、ＲＳＰＯ１ベースの三次元培養や医療処置が、角膜機能不全の処置だけでなく、様々な重篤な全身性の疾患の処置のための、再生治療の前途を約束するものであることが理解される。
　（実施例９：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の細胞増殖促進効果）
　本実施例では、角膜内皮細胞の培養におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、特にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１の細胞増殖促進効果を検討することを目的として実験を行った。
　（方法）
　サル培養角膜内皮細胞にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１タンパク質を添加して４８時間培養後、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ　Ｅｄｕ　ｉｍａｇｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて増殖中の細胞を検出し、コントロール細胞とＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１添加細胞のＥｄＵの陽性率および細胞密度を比較した。
　ＥｄＵ（５−ｅｔｈｙｎｙｌ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）は化学反応によりＤＮＡ合成期のＤＮＡに取り込まれる修飾された核酸であり、従来のＢｒｄＵに代わるＤＮＡ合成期細胞の同定に広く用いられている。ＥｄＵの陽性率を測ることで、培養細胞における増殖細胞率がわかる。
　（使用試薬）
Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ　ＥｄＵ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃａｔ．Ｃ１０３３７）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１（Ｒ＆Ｄ　Ｃａｔ．４６４５−ＲＳ）
　（使用細胞）
サル培養角膜内皮細胞（Ｌｏｔ．２０１１１２２２−４　Ｐ２）
　（実験：サル培養角膜内皮細胞培養におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の細胞増殖促進効果の検討）
　（手順）
　（１）サル培養角膜内皮細胞の播種とＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１の添加
　サル培養角膜内皮細胞（Ｌｏｔ．２０１１１２２２−４　Ｐ２）を０．０５％トリプシンで３７℃１０分間処理してＴ−２５フラスコから剥離し、培養培地（１０％ＦＢＳ＋ｂＦＧＦ／ＤＭＥＭ）に懸濁。細胞数をカウントし、３×１０４ｃｅｌｌｓ／３００μｌとなるように培養培地で調整。ＦＮＣコートしたＬａｂ−ＴｅｋＩＩ　ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅ（８ｗｅｌｌ）に３００ｕｌ／ｗｅｌｌで播種した。
　（２）Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ　ＥｄＵ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｋｉｔを用いた増殖細胞の検出
　細胞播種から７日後、細胞がほぼコンフルエントな状態でＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１（０、１０、５０ｎｇ／ｍｌ）入りの培地に交換し、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１添加から２４時間後、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ　ＥｄＵを最終濃度が１０μＭとなるように添加した。（Ｋｉｔの説明書には培地を半分変えることを推奨しているが、培地は交換しなかった。）さらに２４時間後（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１添加４８時間後）、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで固定し、Ｋｉｔの説明書に従いＥｄＵを検出し、ＥｄＵ陽性細胞率をカウントした（図８、９）。
　（３）細胞密度測定
　染色後のチャンバスライドを位相差顕微鏡で写真撮影を行い、角膜内皮細胞密度計算ソフトＫｏｎａｎ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＫＳＳ−４００ＥＢを用いて細胞密度の計測を行った（図１０）。
　（結果）
　ＥｄＵ陽性細胞／ＤＡＰＩをカウントした結果、コントロールに比べてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を１０ｎｇ／ｍｌもしくは５０ｎｇ／ｍｌで添加したウェルでＥｄＵ陽性細胞が２倍増加していることが判明した。また細胞密度を測定した結果、コントロールに比べてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を１０ｎｇ／ｍｌもしくは５０ｎｇ／ｍｌで添加ウェルで細胞密度が１．３倍高くなっていることが判明した。
　（考察）
　サル培養角膜内皮細胞においてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１の細胞増殖促進効果が認められた。またヒト培養角膜内皮細胞およびヒト角膜内皮組織でも同様の効果があることが期待される。
　（実施例１０：ヒト培養角膜内皮細胞でのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の細胞増殖促進効果）
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２（ＲＳＰＯ２）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３（ＲＳＰＯ３）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４（ＲＳＰＯ４）との角膜内皮細胞の分化との関連性を調べるために、ＲＳＰＯ１を使用して、その関連性について検討した。使用した試薬は以下のとおりであ　る。
　ＲＳＰＯ１　Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：４６４５−ＲＳ
　ＲＳＰＯ２　Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：３２６６−ＲＳ
　ＲＳＰＯ３　Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：３５００−ＲＳ
　ＲＳＰＯ４　Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：４５７５−ＲＳ
　ヒト培養角膜内皮細胞にＲＳＰＯ１添加（５０ｎｇ／ｍｌ）、非添加群に分けて３７℃５％ＣＯ２条件下で７日間培養した。その結果、ＲＳＰＯ１添加群の細胞は、細胞の形態が敷石状に維持されたのに対して、非添加群では、細胞が線維芽細胞様に分化した。以上の結果から、ＲＳＰＯ１は角膜内皮細胞の分化を抑制する効果が認められた。
　次に、ＲＳＰＯの細胞増殖に対する影響を調べる目的で、ＲＳＰＯ１~４をヒト角膜内皮細胞に３７℃５％ＣＯ２条件下で１日間インキュベートした。その後、細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７の免疫染色を行った。その結果、ＲＳＰＯ１~４のいずれにも増殖傾向は見られたが、ＲＳＰＯ１のみ、ヒトの角膜内皮細胞の増殖を統計学的に有意に促進させた。
　（実施例１１：コンフルエント細胞に対するＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の効果）
　本実施例では、コンフルエント状態に達した角膜内皮細胞に対してＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類が増殖効果を有するかどうかを確認した。
　（方法）
　（入手先および培養方法）：ヒト角膜内皮細胞として、シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼ（ＲＯＣＨＥカタログ番号：１０　１０３　５８６　００１）を用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はヒトはＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ　Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ　Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮカタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮカタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮカタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を３Ｔ３フィーダー細胞用に馴化させたものを用いた。
　継代培養を行った後に、コンフルエントに到達して２週間以上培養し角膜内皮密度に明らかな変化を認めなくなった時点で、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を培地中に１０ｎｇ／ｍｌの濃度にて添加して培養を継続した。細胞形態の観察は位相差顕微鏡にて行い、細胞密度を計算した。
　（結果）
　結果を図１５に示す。コンフルエントに到達して角膜内皮密度に明らかな変化を認めなくなった時点での平均角膜内皮細胞密度は５６６．８個／ｍｍ２であったが、経時的に密度は上昇し、７日目には約６９５個／ｍｍ２、１４日後には約８７５個／ｍｍ２、２１日後に９９５．８個／ｍｍ２に到達した。一方で、コントロールとして同ロットの細胞をＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を含まない培地で同期間である２１日間培養した場合は５３５．４個／ｍｍ２であった。
　（考察）
　これらの結果は、培養することで容易に密度が減少する角膜内皮細胞において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を用いて培養することで角膜内皮細胞密度を上昇させることができることを意味する。このことは、培養角膜内皮移植の臨床応用化に向けて、移植後の重要な予後決定因子である角膜内皮密度の高い細胞を移植できることを意味する。角膜内皮の再生医療への有用性に加えて、その他の細胞においてもＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を用いることで、より高い機能を持った細胞移植を可能にすることができると理解される。
　（実施例１２：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類によって角膜内皮密度を高くした組織の生産）
　本実施例では、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類による角膜組織の処理により、角膜内皮密度を高くした組織を調製することができることを実証する。
　（方法）
　別の目的で安楽死させた白色家兎の眼球（ナカライ）を購入して、強角膜片を作成した。強角膜片をＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）にて１週間３７℃のインキュベーターにて培養した。１週間後に強角膜片を４％パラホルムアルデヒドで１０分間室温で固定し、固定した後に細胞増殖のマーカーとしてＫｉ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．、カタログ番号：Ｐ６８３４）を用いて角膜内皮細胞の免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。ＤＡＰＩにて角膜内皮細胞の核染色を行い、Ｋｉ６７陽性細胞率を計算した。また、ＺＯ−１にて角膜内皮細胞の免疫染色を行い細胞密度の計算を行った。
　（結果）
　結果を図１６に示す。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を含む培地にて培養を行った場合は、強角膜片においてもＫｉ６７陽性細胞がコントロールと比べて高い割合で認められた。すなわち、Ｋｉ６７陽性細胞の比率は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を加えないコントロールでは約１．０％であったのに対して、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１　１ｎｇ／ｍｌ添加時には４．４９％、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１　１０ｎｇ／ｍｌ時には１０．５８％、そしてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１　１００ｎｇ／ｍｌ添加時には７．９４％になった。
　さらに、角膜内皮細胞密度はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１により有意に高値となった。すなわち、角膜内皮細胞密度は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を加えないコントロールでは３６７４個／ｍｍ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１　１ｎｇ／ｍｌ添加時には４３１４個／ｍｍ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１　１０ｎｇ／ｍｌ添加時には４６２６個／ｍｍ２、１００ｎｇ／ｍｌ添加時には５０３７個／ｍｍ２に増加していた。
　（考察）
　角膜移植医療において、角膜組織にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を作用させることで、移植後の需要な予後決定因子である角膜内皮密度を高くした組織を移植できることを意味する。角膜移植生医療への有用性に加えて、その他の組織においてもＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を用いることで、より高い機能を持った組織の移植を可能にすることができると理解される。
　（実施例１３：角膜実質、上皮、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、硝子体等細胞における増殖効果）
　本実施例では、角膜実質、上皮、ＲＰＥ、硝子体等細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の増殖効果をそれぞれ確認する。その培養法は以下に列挙する。各培養法において、上記実施例に準じてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の有無で培養することにより、増殖に対する効果が促進されることを確認することができる。
　（角膜実質細胞培養法）
　角膜実質細胞は、Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｍ，Ｑｕａｎｔｏｃｋ　ＡＪ，Ｙｏｕｎｇ　ＲＤ，Ｏｋｕｍｕｒａ　Ｎ，Ｕｅｎｏ　Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ　Ｙ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　Ｓ，Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｎ．Ｍｏｌ　Ｖｉｓ．２０１２；１８：１７２７−３９の手法に基づいて培養を行う。簡単に述べると、ウサギ角膜を１．２Ｕ・ｍｌディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で１時間インキュベートする。その後、角膜上皮および角膜内皮を機械的スクレープにより取り除く。次いで、角膜実質を約１ｃｍ２の小片に切断し、これを、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｊａｐａｎ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３７℃で一晩インキュベートする。１５００ｒｐｍ（４４０×ｇ）で３分間遠心分離した後、細胞を無細胞培地（１０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ　アスコルビン酸、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）で４８時間継続培養する。これによって得られる細胞を用いて実験を行うことができる。
　（網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞培養法）
　ＲＰＥ細胞は、Ｈａｔａｎａｋａ　Ｈ，Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２；５３（１１）：６９５５−６９６３の手法に基づいて培養を行う。簡単に述べると、サル網膜色素上皮細胞（ＭＲＰＥＣ）は、カニクイザル（年齢３−５歳、ヒトで５−２０歳に当たる；Ｎｉｓｓｅｉ　Ｂｉｌｉｓ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｏｔｓｕ　Ｊａｐａｎから入手）から取り出した眼球の後部領域から培養する。ついで、ＭＲＰＥＣをＲＰＥＣフラグメント（ＭＲＰＣＥの細胞集塊）をヒト胎児ＲＰＥについて以前に報告されている手法（Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓ　Ａ，Ｃｈｅｎ　Ｓ，ＪａｌｉｃｋｅｅＳ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｆｅｔａｌ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　ｅｘｈｉｂｉｔ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｎａｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ．Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．２００６；４７：３６１２−３６２４）に基づいて、分離して調製する。次いで、ＭＲＰＥＣをＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（登録商標）コーティングされたディッシュで、１０％ＦＢＡ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養し、３７℃で５％ＣＯ２中の加湿環境下でさらに拡大する。次いで、培養培地を２日おきに交換する。細胞が５−７日でコンフルエントに達すると、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトリプシン処理を３７℃で５分間行い、１：２~４の比率で継代培養する。培養したＭＲＰＥＣは、１~３継代のものを、すべての実験について用いる。
　（角膜上皮細胞培養法）
　羊膜は、京都府立医科大学倫理委員会で承認された方法に従って採取し、研究に使用した。感染症がなく合併症のない帝王切開予定の妊婦から文書による同意を得た後に、帝王切開時に羊膜を無菌的に採取し、洗浄した後に５０％クリセロールＤＭＥＭ溶液に浸漬し−８０℃で凍結保存した。次に、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｌｉｏｎ　Ｅｙｅ　Ｂａｎｋ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）から研究目的に使用する許可を得たヒト強角膜組織から採取した角膜上皮幹細胞の培養を行った。角膜上皮幹細胞を含む培養角膜上皮シートを作成するために、３７℃１時間１．２Ｕディスパーゼを用いて酵素処理により角膜上皮細胞を細胞懸濁液（ｃｅｌｌ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）として回収した。次に、細胞懸濁液を羊膜上に播種して３７℃５％ＣＯ２のインキュベーター中に約２週間培養した。
　（硝子体細胞（ヒアロサイト）培養法）
　硝子体細胞は、Ｓｏｍｍｅｒ　Ｆ，Ｐｏｌｌｏｎｇｅｒ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｒａｅｆｅｓ　Ａｒｃｈ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２００８で報告される方法に準じて培養を行う。まず、サル眼球より硝子体を採取、１％ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ３回洗浄した。１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼにつけ、３７℃でローテーションしながら一晩インキュベートする。遠心分離後、上清を除き、１％ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭで洗浄する。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ，１％Ｐ／Ｓを加え、培養ディッシュに播種する。
　（実施例１４：他の細胞での実験）
　本実施例では、神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮について、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の増殖効果をそれぞれ確認する。その培養法は公知の方法に準じて行うことができる。各培養法において、上記実施例に準じてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の有無で培養することにより、増殖に対する効果が促進されることを確認することができる。
　（実施例１５：製剤例：増殖刺激または分化制御剤を含有する角膜保存液）
　本実施例では、製剤例として、本発明の培養正常化剤を含有する角膜保存液を以下のように製造する。
　常法により下に示す保存液を調製する。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１　１０−５００ｎｇ／ｍｌ（適宜調節する）
　Ｏｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（Ｂａｕｓｃｈ−Ｌｏｍｂ）適量
全量　１００ｍＬ
　各成分は、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手することができる。
　（実施例１６：注入剤の調製例）
　点眼剤の調製例
　各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
　Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１　　　　　　　　１０−５００ｎｇ／ｍｌ（適宜調節する）
　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　０．８５ｇ
　リン酸二水素ナトリウム二水和物　　　　０．１ｇ
　ベンザルコニウム塩化物　　　　　　　　０．００５ｇ
　水酸化ナトリウム　　　　　　　　　　　適量
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。
　点眼剤は、基剤で希釈することも出来る。
　基材の組成は以下のとおり。
　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　０．８５ｇ
　リン酸二水素ナトリウム二水和物　　０．１ｇ
　ベンザルコニウム塩化物　　　　　　０．００５ｇ
　水酸化ナトリウム　　　　　　　　　適量
　精製水　　　　　　　　　　　　　　適量
　　　　　　　　　　　　　　　　　　全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。
　各成分は、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）．から入手することができる。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
　眼細胞の分化マーカーおよび分化制御技術が提供され、角膜移植に関連する技術に関与する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
配列番号１：ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（ＯＭＩＭ：６０６６６７；ＮＭ＿００３６６７．２）をコードする遺伝子配列
配列番号２：ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（ＯＭＩＭ：６０６６６７；ＮＰ＿００３６５８．１）のアミノ酸配列
配列番号３：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１０３８６３３）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１）をコードする遺伝子配列
配列番号４：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１０３８６３３）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１）のアミノ酸配列
配列番号５：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２（ＲＳＰＯ２）（ＯＭＩＭ：６１０５７５；ＮＭ＿１７８５６５）をコードする遺伝子配列
配列番号６：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２（ＲＳＰＯ２）（ＯＭＩＭ：６１０５７５；ＮＭ＿１７８５６５）のアミノ酸配列
配列番号７：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３（ＲＳＰＯ３）（ＯＭＩＭ：６１０５７４；ＮＭ＿０３２７８４）をコードする遺伝子配列
配列番号８：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３（ＲＳＰＯ３）（ＯＭＩＭ：６１０５７４；ＮＭ＿０３２７８４）のアミノ酸配列
配列番号９：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４（ＲＳＰＯ４）（ＯＭＩＭ：６１０５７３；ＮＭ＿００１０２９８７１）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１）をコードする遺伝子配列
配列番号１０：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４（ＲＳＰＯ４）（ＯＭＩＭ：６１０５７３；ＮＭ＿００１０２９８７１）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１）のアミノ酸配列
配列番号１１：ＳＨＨ（ＳＯＮＩＣ　ＨＥＤＧＥＨＯＧ）（ＯＭＩＭ：６００７２５；ＮＭ＿０００１９３）をコードする遺伝子配列
配列番号１２：ＳＨＨ（ＳＯＮＩＣ　ＨＥＤＧＥＨＯＧ）（ＯＭＩＭ：６００７２５；ＮＭ＿０００１９３）のアミノ酸配列
配列番号１３：ＨｕｍａｎＧＰＲ４９のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号１４：ＨｕｍａｎＧＰＲ４９のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号１５：ＨｕｍａｎＮｅｓｔｉｎのＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号１６：ＨｕｍａｎＮｅｓｔｉｎのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号１７：ＨｕｍａｎＡＢＣＧ２のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号１８：ＨｕｍａｎＡＢＣＧ２のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号１９：ＨｕｍａｎＳＨＨのＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２０：ＨｕｍａｎＳＨＨのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２１：ＨｕｍａｎＰｔｃｈ１のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２２：ＨｕｍａｎＰｔｃｈ１のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２３：ＨｕｍａｎＳｍｏのＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２４：ＨｕｍａｎＳｍｏのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２５：ＨｕｍａｎＧｌｉ１のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２６：ＨｕｍａｎＧｌｉ１のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２７：ＨｕｍａｎＧｌｉ２のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２８：ＨｕｍａｎＧｌｉ２のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２９：Ｈｕｍａｎｂｅｔａ−ａｃｔｉｎのＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号３０：Ｈｕｍａｎｂｅｔａ−ａｃｔｉｎのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号３１：ｓｈＲＮＡ　ｓｈＧＰＲ４０−５８７の挿入配列（表２）
配列番号３２：ｓｈＲＮＡ　ｓｈＧＰＲ４０−５８８の挿入配列（表２）
配列番号３３：ｓｈＲＮＡ　ｓｈＧＰＲ４０−５８９の挿入配列（表２）
配列番号３４：ｓｈＲＮＡ　ＢＮｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ（ＮＴ）の挿入配列（表２）
配列番号３５：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０８）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　２）をコードする遺伝子配列
配列番号３５：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０８）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　２）をコードする遺伝子配列
配列番号３６：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０８）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　２）のアミノ酸配列
配列番号３７：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０９）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　３）をコードする遺伝子配列
配列番号３８：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０９）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　３）のアミノ酸配列
配列番号３９：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９１０）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　４）をコードする遺伝子配列
配列番号４０：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９１０）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　４）のアミノ酸配列
配列番号４１：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４（ＲＳＰＯ４）（ＯＭＩＭ：６１０５７３；ＮＭ＿００１０４０００７）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　２）をコードする遺伝子配列
配列番号４２：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４（ＲＳＰＯ４）（ＯＭＩＭ：６１０５７３；ＮＭ＿００１０４０００７）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　２）のアミノ酸配列
配列番号４３：ｐｔｃｈ１＜ＮＭ＿００１０８３６０２．１＞の核酸配列
配列番号４４：ｐｔｃｈ１＜ＮＭ＿００１０８３６０２．１＞のアミノ酸配列
配列番号４５：ｇｌｉ１＜ＮＭ＿００１１６７６０９．１＞の核酸配列
配列番号４６：ｇｌｉ１＜ＮＭ＿００１１６７６０９．１＞のアミノ酸配列
配列番号４７：ｇｌｉ２＜ＮＭ＿００５２７０．４＞の核酸配列
配列番号４８：ｇｌｉ２＜ＮＭ＿００５２７０．４＞のアミノ酸配列
配列番号４９：ｌｒｐ６＜ＮＭ＿００２３３６．２＞の核酸配列
配列番号５０：ｌｒｐ６＜ＮＭ＿００２３３６．２＞のアミノ酸配列
配列番号５１：β−カテニン＜ＮＭ＿１３１０５９．２＞の核酸配列
配列番号５２：β−カテニン＜ＮＭ＿１３１０５９．２＞のアミノ酸配列

Claims (37)

  1. Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤。
  2. 前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ　３およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　４から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  3. 前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ　１を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  4. 前記眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  5. 前記眼細胞は網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  6. 前記眼細胞は角膜内皮細胞を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  7. 前記眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  8. 前記眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  9. 前記眼細胞はコンフルエントの状態にある、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  10. 前記眼細胞は、角膜組織の形態で提供される、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
  11. 請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜保存または角膜内皮細胞培養のための組成物。
  12. 請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜内皮細胞障害の治療または角膜内皮細胞障害の進行予防のための医薬組成物。
  13. 請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて培養された角膜内皮細胞を含む角膜内皮細胞障害の治療剤または進行予防剤。
  14. 前記細胞は、通常の角膜内皮細胞よりも細胞密度が高いかおよび／または未分化な細胞をより多く含む集団として存在する、請求項１２に記載の角膜内皮細胞障害の治療剤または進行予防剤。
  15. 角膜内皮細胞を含む角膜組織であって、該組織中のＫｉ６７陽性細胞が、生体内中の割合よりも高い割合で存在するか、および／または該角膜内皮細胞の密度が生体内中の密度よりも高い、角膜組織。
  16. ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカー。
  17. 前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である、請求項１６に記載のマーカー。
  18. 前記増殖能の高い細胞は幹細胞である、請求項１６に記載のマーカー。
  19. 前記角膜内皮細胞はヒト細胞である、請求項１６に記載のマーカー。
  20. 前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される、請求項１６に記載のマーカー。
  21. ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法。
  22. 前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記増殖能の高い細胞は幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記角膜内皮細胞はヒト細胞である、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される、請求項２１に記載の方法。
  26. ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤。
  27. 前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである、請求項２６に記載の検出剤。
  28. 前記検出剤は、標識されたものである、請求項２６に記載の検出剤。
  29. 前記増殖能の高い細胞は幹細胞である、請求項２６に記載の検出剤。
  30. 前記角膜内皮細胞はヒト細胞である、請求項２６に記載の検出剤。
  31. 前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される、請求項２６に記載の検出剤。
  32. ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカー。
  33. ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法。
  34. ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤。
  35. Ｗｎｔ経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカー。
  36. Ｗｎｔ経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法。
  37. Ｗｎｔ経路の因子に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016035874A1 (ja) * 2014-09-05 2016-03-10 国立研究開発法人理化学研究所 角膜内皮細胞マーカー
WO2016129654A1 (ja) * 2015-02-12 2016-08-18 国立大学法人 東京大学 角膜内皮前駆細胞の調製方法
WO2018235786A1 (ja) * 2017-06-19 2018-12-27 国立大学法人大阪大学 角膜内皮細胞マーカー及びその利用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7008337B2 (ja) * 2016-02-15 2022-02-10 京都府公立大学法人 ヒト機能性角膜内皮細胞およびその応用
CN113505699A (zh) * 2021-07-09 2021-10-15 兰州大学 一种基于RetinaNet算法的船舶检测方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
JPH0159878B2 (ja) 1982-05-21 1989-12-20 Yunibaashitei Obu Karifuorunia
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO2000028082A1 (fr) 1998-11-09 2000-05-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique
WO2003104453A1 (ja) 2002-06-05 2003-12-18 中外製薬株式会社 抗体作製方法
JP2006187281A (ja) * 2004-12-09 2006-07-20 Shiro Amano ヒト角膜内皮細胞由来の前駆細胞、細胞凝集体及びそれら作製方法、並びに前駆細胞および細胞凝集体の移植方法
WO2009028631A1 (ja) * 2007-08-29 2009-03-05 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. 角膜内皮細胞接着促進剤
JP2009268433A (ja) * 2008-05-09 2009-11-19 Tohoku Univ 組織幹細胞／組織前駆細胞からの角膜内皮細胞の生成方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006092894A1 (ja) * 2004-12-09 2006-09-08 Shiro Amano ヒト角膜内皮細胞由来の前駆細胞、細胞凝集体及びそれら作製方法、並びに前駆細胞および細胞凝集体の移植方法
WO2008103191A1 (en) * 2006-09-28 2008-08-28 Tissuetech, Inc. Rnai methods and compositions for stimulating proliferation of cells with adherent junctions
MX2011008044A (es) 2009-02-03 2012-01-12 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Medio de cultivo para celulas madre epiteliales y organoides que comprenden las celulas madre.
GB201111244D0 (en) * 2011-06-30 2011-08-17 Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw Culture media for stem cells
US9200252B2 (en) * 2009-10-06 2015-12-01 Snu R&Db Foundation Compositions for inducing differentiation into retinal cells from retinal progenitor cells or inducing proliferation of retinal cells comprising Wnt signaling pathway activators
US9752118B2 (en) * 2011-12-06 2017-09-05 Astellas Institute For Regenerative Medicine Method of directed differentiation producing corneal endothelial cells from neural crest stem cells by PDGFB and DKK2, compositions thereof, and uses thereof

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0159878B2 (ja) 1982-05-21 1989-12-20 Yunibaashitei Obu Karifuorunia
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO2000028082A1 (fr) 1998-11-09 2000-05-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique
WO2003104453A1 (ja) 2002-06-05 2003-12-18 中外製薬株式会社 抗体作製方法
JP2006187281A (ja) * 2004-12-09 2006-07-20 Shiro Amano ヒト角膜内皮細胞由来の前駆細胞、細胞凝集体及びそれら作製方法、並びに前駆細胞および細胞凝集体の移植方法
WO2009028631A1 (ja) * 2007-08-29 2009-03-05 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. 角膜内皮細胞接着促進剤
JP2009268433A (ja) * 2008-05-09 2009-11-19 Tohoku Univ 組織幹細胞／組織前駆細胞からの角膜内皮細胞の生成方法

Non-Patent Citations (130)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Cell Technology, separate", SHUJ UNSHA CO., LTD., article "DNA Microarray and Advanced PCR method"
"Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS
"DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach", 1995, OXFORD UNIVERSITY
"Experimental Medicine", 1997, YODOSHA CO., LTD., article "Gene Introduction & Expression Analysis Experimental Method"
"Genome Analysis Experimental Method, Nakamura Yusuke Lab. Manual", 2002, YODOSHA CO., LTD.
"Molecular Cloning", 1995, OXFORD UNIVERSITY PRESS, article "Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Pracltical Approach"
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR PRESS
"PCR Applications: Protocols for Functional Genomics", ACADEMIC PRESS
ADAMS, R. L. ET AL.: "The Biochemistry of the Nucleic Acids", 1992, CHAPMAN & HALL
AGHIB DF ET AL., EXP CELL RES., vol. 218, 1995, pages 359 - 369
AKIFUMI OOTANI ET AL.: "Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt- dependent stem cell niche", NATURE MEDICINE, vol. 15, no. 6, June 2009 (2009-06-01), pages 701 - 706, XP055180684 *
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
AUSUBEL, F. M.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, GREENE PUB. ASSOCIATES AND WILEY-INTERSCIENCE
AUSUBEL, F. M.: "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", 1989, GREENE PUB. ASSOCIATES AND WILEY-INTERSCIENCE
AUSUBEL, F. M.: "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", 1992, GREENE PUB. ASSOCIATES
AUSUBEL, F. M.: "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", 1995, GREENE PUB. ASSOCIATES
AUSUBEL, F. M.: "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", 1999, WILEY
BARKER N ET AL., NATURE, vol. 449, 2007, pages 1003 - 1007
BARKER N. ET AL., CELL STEM CELL, vol. 7, 2010, pages 656 - 670
BARKER N. ET AL., GASTROENTEROLOGY, vol. 138, no. 5, May 2010 (2010-05-01), pages 1681 - 96
BARKER N. ET AL., NATURE, vol. 449, 2007, pages 1003 - 1007
BARRANDON Y ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 82, 1985, pages 5390 - 5394
BATZER ET AL., NUCLEIC ACID RES., vol. 19, 1991, pages 5081
BEDNARZ J ET AL., IN VITRO CELL DEV BIOL ANIM., vol. 34, 1998, pages 149 - 153
BLACKBURN, G. M. ET AL.: "Nucleic Acids in Chemistry and Biology", 1996, OXFORD UNIVERSITY PRESS
BRZESZCZYNSKA J ET AL., INT J MOL MED., vol. 29, no. 5, May 2012 (2012-05-01), pages 871 - 876
CARMON KS ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 108, 2011, pages 11452 - 11457
CARMON KS. ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 108, no. 28, 12 July 2011 (2011-07-12), pages 11452 - 11457
CHEN ET AL., GENES DEV., vol. 16, no. 21, 2002, pages 2743 - 2748
CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, vol. 81, 1978, pages 1 - 7
DE LAU W ET AL., NATURE, vol. 476, 2011, pages 293 - 297
DE LAU W. ET AL., NATURE, vol. 476, no. 7360, 4 July 2011 (2011-07-04), pages 293 - 297
E. W. MARTIN: "Remington's Pharmaceutical Sciences", MARK PUBLISHING COMPANY
ECKSTEIN, F.: "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", 1991, IRL PRESS
ENGELMANN K ET AL., INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 29, 1988, pages 1656 - 1662
GAIT, M. J.: "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", 1985, IRL PRESS
GAIT, M. J.: "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", 1990, IRL PRESS
GALFRE G. ET AL., NATURE, vol. 277, 1979, pages 131 - 133
GARCIA MI ET AL., DEVBIOL., vol. 331, 2009, pages 58 - 67
GEYSEN ET AL., MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 23, 1986, pages 709
GEYSEN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 3998
GLINKA A ET AL., EMBO REP., vol. 12, 2011, pages 1055 - 1061
GLINKA A. ET AL., EMBO REP., vol. 12, no. 10, 30 September 2011 (2011-09-30), pages 1055 - 1061
HATANAKA H; KOIZUMI N ET AL., INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, vol. 53, no. 11, 2012, pages 6955 - 6963
HERMANSON, G. T.: "Bioconjugate Techniques", 1996, ACADEMIC PRESS
HOLAN V., OPHTHALMOLOGICA, vol. 88, no. 246, September 2010 (2010-09-01), pages 0
HSU SY. ET AL., J. MOL. ENDOCRINOL., vol. 12, 1998, pages 1830 - 1845
INNIS, M. A. ET AL.: "PCR Strategies", 1995, ACADEMIC PRESS
INNIS, M. A.: "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", 1990, ACADEMIC PRESS
J. IMMUNOL., vol. 123, 1979, pages 1548 - 1550
J. YOON; J. LEE, CELLULAR SIGNALLING, vol. 24, 2012, pages 369 - 377
JAKS V. ET AL., NATURE GENETICS, vol. 40, 2008, pages 1291 - 1299
JOANNA BRZESZCZYNSKA ET AL.: "Molecular profile of organ culture-stored corneal epithelium: Lgr5 is a potential new phenotypic marker of residual human corneal limbal epithelial stem cells", INTERNATIONAL JOURNALOF MOLECULAR MEDICINE, vol. 29, no. 5, 6 February 2012 (2012-02-06), pages 871 - 876, XP055180676 *
JOYCE NC, PROG RETIN EYE RES., vol. 22, 2003, pages 359 - 389
KANA HIRATA-TOMINAGA ET AL.: "Corneal endothelial cell fate is maintained by LGR5 through the regulation of hedgehog and Wnt pathway", STEM CELL, vol. 31, no. 7, July 2013 (2013-07-01), pages 1396 - 1407, XP055180707 *
KOEHLER G.; MILSTEIN C., METHODS ENZYMOL., vol. 73, 1981, pages 3 - 46
KOHLER, G.; MILSTEIN, C., EUR. J. IMMUNOL., vol. 6, 1976, pages 511 - 519
KOIZUMI N ET AL., EXP EYE RES., vol. 95, 2012, pages 60 - 67
KOIZUMI N ET AL., INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 48, 2007, pages 4519 - 4526
KOIZUMI N; OKUMURA N; KINOSHITA S., EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, vol. 95, 2012, pages 60 - 7
KRULOVA M ET AL., INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 49, no. 9, September 2008 (2008-09-01), pages 3903 - 3908
KRULOVA, MAGDALENA ET AL.: "A Rapid Separation of Two Distinct Populations of Mouse Corneal Epithelial Cells with Limbal Stem Cell Characteristics by Centrifugation on Percoll Gradient", INVEST. OPHTHALMOL. VIS. SCI., vol. 49, no. 9, 2008, pages 3903 - 3908, XP055180680 *
LAI ET AL., NATURE NEUROSCIENCE, vol. 6, 2003, pages 21 - 27
LAZEKAS DE ST. GROTH, S.; SCHEIDEGGER, D., J. IMMUNOL. METHODS, vol. 35, 1980, pages 1 - 21
LEE JM ET AL., J CELL BIOL., vol. 172, 2006, pages 973 - 981
LENDAHL U ET AL., CELL, 1990
MAMINISHKIS A; CHEN S; JALICKEES ET AL.: "Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue", INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 47, 2006, pages 3612 - 3624
MARGULIES D. H. ET AL., CELL, vol. 8, 1976, pages 405 - 415
MATSUBARA M ET AL., JPN J OPHTHALMOL, vol. 26, 1982, pages 264 - 273
MATSUBARA M ET AL., JPN J OPHTHALMOL, vol. 27, 1983, pages 444 - 450
MATSUBARA M; TANISHIMA T: "Wound-healing of corneal endothelium in monkey: an autoradiographic study", JPN J OPHTHALMOL, vol. 27, 1983, pages 444 - 450
MATSUBARA M; TANISHIMA T: "Wound-healing of the corneal endothelium in the monkey: a morphometric study", JPN J OPHTHALMOL, vol. 26, 1982, pages 264 - 273
MCCLANAHAN T. ET AL., CANCER BIOL THER., vol. 5, 2006, pages 419 - 426
MCGOWAN SL. ET AL., MOL. VIS., vol. 13, 2007, pages 1984 - 2000
MIMURA T ET AL., INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 46, 2005, pages 3645 - 3648
MIMURA T ET AL., INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 47, 2006, pages 1387 - 1396
NAKAMURA T ET AL., STEM CELLS, vol. 25, 2007, pages 628 - 638
NAKAMURA T ET AL., STEM CELLS, vol. 26, 2008, pages 1265 - 1274
NAKAMURA T ET AL., STEM CELLS., vol. 25, 2007, pages 628 - 638
NAKATSUKASA M ET AL., AM J PATHOL., vol. 177, 2010, pages 1344 - 1355
NAKATSUKASA M.; KAWASAKI S; YAMASAKI K; FUKUOKA H; MATSUDA A; TSUJIKAWA M; TANIOKA H; NAGATA-TAKAOKA M; HAMURO J; KINOSHITA S, AM J PATHOL., vol. 177, no. 3, September 2010 (2010-09-01), pages 1344 - 55
NAT GENET., vol. 32, December 2002 (2002-12-01), pages 526 - 532
NATURE, vol. 409, 2001, pages 860 - 921
NEEDLEMAN; WUNSCH, J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 443 - 453
NORIKO KOIZUMI ET AL.: "Development of new therapeutic modalities for corneal endothelial disease focused on the proliferation of corneal endothelial cells using animal models", EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, vol. 95, no. 1, February 2012 (2012-02-01), pages 60 - 67, XP055180703 *
NORIKO KOIZUMI ET AL.: "Progress in the Development of Tissue Engineering of the Cornea in Japan", JOURNAL OF JAPANESE OPHTHALMOLOGICAL SOCIETY, vol. 111, no. 7, 2007, pages 493 - 503, XP008175808 *
NORIKO KOIZUMI: "Development of new therapeutic modalities for corneal endothelial disease using somatic stem cells", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 241, no. 10, 9 June 2012 (2012-06-09), pages 765 - 770, XP055180705 *
OHTSUKA ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 260, 1985, pages 2605 - 2608
OKUMURA ET AL., IOVS, vol. 50, no. 8, 2009, pages 3680 - 3687
OKUMURA N ET AL., AM J PATHOL., vol. 181, 2012, pages 268 - 277
OOTANI A.; LI X. ET AL., NAT MED., vol. 15, no. 6, June 2009 (2009-06-01), pages 701 - 706
PEARSON; LIPMAN, PROC. NATL. ACAD. SCI., USA, vol. 85, 1988, pages 2444 - 2448
PEH GS ET AL., TRANSPLANTATION, vol. 91, 2011, pages 811 - 819
ROSSOLINI ET AL., MOL. CELL. PROBES, vol. 8, 1994, pages 91 - 98
SAMBROOK J. ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR
SAMBROOK, J ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS, pages: 9.47 - 9.58
SARIN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 7448 - 7451
SCHIMMELPFENNIG B. ET AL., IOVS, vol. 25, 1984, pages 223 - 229
SCHIMMELPFENNIG BH, INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 25, 1984, pages 223 - 229
SCHUIJERS J ET AL., EMBOJ., 2012
See also references of EP2876160A4
SENOO ET AL., IOVS, vol. 41, 2000, pages 2930 - 2935
SHABAROVA, Z. ET AL., ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY OF NUCLEIC ACIDS, 1994
SHIN HATO ET AL.: "Saisei Igaku Series [44] Kakumaku Saisei no Genjo to Kadai", ORGAN BIOLOGY, vol. 17, no. 1, pages 51 - 60, XP008175803 *
SHULMAN M. ET AL., NATURE, vol. 276, 1978, pages 269 - 270
SINHA ET AL., NAT. CHEM. BIOL., vol. 2, 2006, pages 29 - 30
SMITH; WATERMAN, J. MOL. BIOL., vol. 147, 1981, pages 195 - 197
SNINSKY, J. J. ET AL.: "short protocols in molecular biology a compendium of methods from current protocols in molecular biology", 1999
SOMMER F; POLLONGER K ET AL., GRAEFES ARCH CLIN EXP OPHTHALMOL, 2008
STANTON BZ ET AL., MOL BIOSYST., vol. 6, 2010, pages 44 - 54
STANTON BZ ET AL., MOLBIOSYST, vol. 6, 2010, pages 44 - 54
STEIN ET AL., NUCL. ACIDS RES., vol. 16, 1988, pages 3209
TAN DT ET AL., LANCET, vol. 379, 2012, pages 1749 - 1761
TANESE K. ET AL., AM J PATHOL., vol. 173, 2008, pages 835 - 843
TROWBRIDGE, I. S., J. EXP. MED., vol. 148, 1978, pages 313 - 323
TSURU T ET AL., JPN J OPHTHALMOL., vol. 28, 1984, pages 105 - 125
UENO M; MATSUMURA M; WATANABE K; NAKAMURA T; OSAKADA F; TAKAHASHI M; KAWASAKI H; KINOSHITA S; SASAI Y, PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 103, no. 25, 2006, pages 9554 - 9559
URIAN SCHUIJERS ET AL.: "Adult mammalian stem cells: the role of Wnt, Lgr5 and R-spondins", THE EMBO JOURNAL, vol. 31, 22 May 2012 (2012-05-22), pages 2685 - 2696, XP055180689 *
VAN HORN DL ET AL., EXP EYE RES, vol. 21, 1975, pages 113 - 124
VAN HORN DL ET AL., INVEST OPHTHALMOL VIS SCI, vol. 16, 1977, pages 597 - 613
VAN HORN DL; HYNDIUK RA: "Endothelial wound repair in primate cornea", EXP EYE RES, vol. 21, 1975, pages 113 - 124
VANDAMME, A. M. ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 192, 1990, pages 767 - 775
VANHORN DL; SENDELE DD; SEIDEMAN S; BUCO PJ: "Regenerative capacity of the corneal endothelium in rabbit and cat", INVEST OPHTHALMOL VIS SCI, vol. 16, 1977, pages 597 - 613
WALKER F ET AL., PLOSONE, vol. 6, 2011, pages E22733
WHIKEHART DR. ET AL., MOL. VIS., vol. 11, 2005, pages 816 - 824
WU ET AL., CHEM. BIOL., vol. 11, 2004, pages 1,229 - 1,238
YAMAGAMI S. ET AL., OPHTHALMOLOGY, vol. 114, 2007, pages 433 - 439
YAMAMOTO M; QUANTOCK AJ; YOUNG RD; OKUMURA N; UENO M; SAKAMOTO Y; KINOSHITA S; KOIZUMI N., MOL VIS., vol. 18, 2012, pages 1727 - 39
YAMAMOTO Y. ET AL., HEPATOLOGY, vol. 37, 2003, pages 528 - 533
YOKOO S. ET AL., IOVS, vol. 46, 2005, pages 1626 - 1631

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016035874A1 (ja) * 2014-09-05 2016-03-10 国立研究開発法人理化学研究所 角膜内皮細胞マーカー
JPWO2016035874A1 (ja) * 2014-09-05 2017-08-10 国立研究開発法人理化学研究所 角膜内皮細胞マーカー
US10968428B2 (en) 2014-09-05 2021-04-06 Osaka University Corneal endothelial cell marker
WO2016129654A1 (ja) * 2015-02-12 2016-08-18 国立大学法人 東京大学 角膜内皮前駆細胞の調製方法
WO2018235786A1 (ja) * 2017-06-19 2018-12-27 国立大学法人大阪大学 角膜内皮細胞マーカー及びその利用
JP2019000069A (ja) * 2017-06-19 2019-01-10 国立大学法人大阪大学 角膜内皮細胞マーカー及びその利用
US11839697B2 (en) 2017-06-19 2023-12-12 Osaka University Corneal endothelial cell marker and use thereof

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