JP2022527085A - モノアミンオキシダーゼ亜型ａ（ｍａｏａ）の阻害による心血管石灰化の緩和 - Google Patents

モノアミンオキシダーゼ亜型ａ（ｍａｏａ）の阻害による心血管石灰化の緩和 Download PDF

Info

Publication number
JP2022527085A
JP2022527085A JP2021557385A JP2021557385A JP2022527085A JP 2022527085 A JP2022527085 A JP 2022527085A JP 2021557385 A JP2021557385 A JP 2021557385A JP 2021557385 A JP2021557385 A JP 2021557385A JP 2022527085 A JP2022527085 A JP 2022527085A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rna
nucleic acid
vic
cells
maoa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021557385A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020198613A5 (ja
Inventor
デカーノ，ユリウス
アイカワ，エレナ
眞範 相川
フランシスコ イワモト，ユキオ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Brigham and Womens Hospital Inc
Original Assignee
Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Brigham and Womens Hospital Inc filed Critical Brigham and Womens Hospital Inc
Publication of JP2022527085A publication Critical patent/JP2022527085A/ja
Publication of JPWO2020198613A5 publication Critical patent/JPWO2020198613A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/421—1,3-Oxazoles, e.g. pemoline, trimethadione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4985—Pyrazines or piperazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

大動脈弁石灰化と関連する障害の処置における使用のための組成物および方法。一部の実施形態では、障害は、石灰化大動脈弁狭窄症（ＣＡＳ）である。一般に、方法は、治療有効量の、本明細書で記載されるＭＡＯＡ阻害剤を、このような処置を必要とするか、またはこのような処置を必要とすることが決定された対象へと投与するステップを含む。

Description

優先権の主張
本出願は、２０１９年３月２７日に出願された、米国仮出願第６２／８２４，３８３号明細書の利益を主張する。前出の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本明細書では、大動脈弁石灰化と関連する障害の処置のための方法が記載される。一部の実施形態では、障害は、石灰化大動脈弁狭窄症（ＣＡＳ）である。一般に、方法は、治療有効量の、本明細書で記載されるＭＡＯＡ阻害剤を、このような処置を必要とするか、またはこのような処置を必要とすることが決定された対象へと投与するステップを含む。
関連する弁尖の肥厚を伴う、ヒト大動脈弁石灰化は、非リウマチ性大動脈弁狭窄症の、主要な原因である（１）。当初は、老齢におけるその有病率のために、変性病態と考えられ、大動脈硬化症（２）から、顕著な石灰化大動脈弁疾患（ＣＡＶＤ）（３）の範囲にわたるスペクトルを伴う、生物学的に活性の過程と見なされた。恒常的に拡大し続ける老齢人口は、２０５０年までに、１５０～３９０万人に増大すると予測される、欧州諸国および北米を組み合わせた有病率と共に、重度ＣＡＶＤ率の上昇をもたらす（４）。早期症状の欠如は、早期診断を不可能とする。非処置のまま放置されると、重度ＣＡＶＤは、心不全および死をもたらす。現在のところ、有効な薬物療法は、利用できず、手術または経カテーテル大動脈弁置換が、依然として唯一の処置選択肢であり続ける（５）。ＣＡＶＤの経済的負担および健康に対する負荷のために、非侵襲的治療戦略を探索することは、この満たされていない大きな臨床的必要を満たすのに必須である。
本開示は、ＣＡＶＤにおける、ヒト大動脈弁由来間質細胞（ＶＩＣ）のＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗ表現型を有する前駆体様亜集団であって、骨原性分化、脂肪生成性分化、および軟骨形成性分化を含む多能性の能力を伴う亜集団の同定に基づく。単一細胞マルチＯＭＩＣ法およびネットワーク医学を適用することにより、ＶＩＣ亜集団は、ＣＡＶＤ内の疾患ドライバー集団として同定された。ＤＤＰおよびＭＳＣについてのプロテオミクスおよび単一細胞トランスクリプトミクスの統合は、ＭＡＯＡおよびＣＴＨＲＣ１を、石灰化の潜在的な調節因子として明らかにした。ＭＡＯＡおよびＣＴＨＲＣ１のサイレンシングは、ヒトＶＩＣの石灰化を阻害した。こうして、本明細書では、ＣＡＶＤにおける、治療的介入のための方法であって、ＭＡＯＡ阻害剤を投与するステップを含む方法が提示される。
したがって、本明細書では、大動脈弁石灰化と関連する障害の処置のための方法が提示される。方法は、治療有効量のモノアミンオキシダーゼ亜型Ａ（ＭＡＯＡ）阻害剤を、このような処置を必要とするか、またはこのような処置を必要とすることが決定された対象へと投与するステップを含む。本明細書ではまた、このような処置を必要とするか、またはこのような処置を必要とすることが決定された対象における、大動脈弁石灰化と関連する障害の処置における使用のための、モノアミンオキシダーゼ亜型Ａ（ＭＡＯＡ）阻害剤を含む組成物も提示される。
一部の実施形態では、方法は、対象を、大動脈弁石灰化と関連する障害を有する対象として同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、石灰化大動脈弁狭窄症（ＣＡＳ）、冠動脈疾患、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、静脈グラフト不全、動静脈瘻、および強皮症を有する。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
一部の実施形態では、ＭＡＯＡ阻害剤は、低分子阻害剤である。
一部の実施形態では、低分子ＭＡＯＡ阻害剤は、ベフロキサトン（ＭＤ３７０５０３）；ビフェメラン（Ａｌｎｅｒｔ、Ｃｅｌｅｐｏｒｔ）；ブロファロミン（Ｃｏｎｓｏｎａｒ）；シモキサトン（ＭＤ ７８０５１５）；クロルギリン（Ｃｌｏｒｇｙｌｉｎｅ）（またはＣｌｏｒｇｉｌｉｎｅ）；メチレンブルー；ミナプリン（Ｃａｎｔｏｒ）；モクロベミド（Ａｕｒｏｒｉｘ、Ｍａｎｅｒｉｘ）；フェネルジン（Ｎａｒｄｉｌ）；ピルリンドール（Ｐｉｒａｚｉｄｏｌ）；トロキサトン（Ｈｕｍｏｒｙｌ）；チリマ（ＣＸ １５７）；トラニルシプロミン（非選択性および不可逆性、Ｐａｒｎａｔｅ）；イソカルボキサジド（１－ベンジル－２－（５－メチル－３－イソキサゾリルカルボニル）ヒドラジン－イソカルボキサジド、Ｍａｒｐｌａｎ、Ｍａｒｐｌｏｎ、Ｅｎｅｒｚｅｒ）；モリンドン；ラドスチギル；ＶＡＲ１０３０３；Ｍ３０；ヒドララジン；フェネルジン；キナクリン；ならびにこれらの塩および組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＭＡＯＡ阻害剤は、ＭＡＯＡをターゲティングする阻害性核酸である。一部の実施形態では、ＭＡＯＡをターゲティングする阻害性核酸は、アンチセンスＲＮＡ；アンチセンスＤＮＡ；キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド；修飾連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド；干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）；短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；低分子ＲＮＡ誘導性遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）；ギャップマー；ミックスマー；ロックト核酸（ＬＮＡ）；またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
一部の実施形態では、阻害性核酸は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡアプタマー、ＤＮＡデコイ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；低分子一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；低分子ＲＮＡ誘導性遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、ギャップマー、ミックスマー、モルホリノホスホルアミデート（ＭＦ）ＬＮＡ（ロックト核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、リボザイム、環状ＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ＲＮＡデコイ、長鎖非コードＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、低分子ガイドＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、ＲＮＡスポンジ、マイクロＲＮＡスポンジ、オリゴヌクレオチドタグ付け抗体、プラスミド複合体化マイクロバブル、ＤＮＡ複合体化マイクロバブル、もしくはＲＮＡ複合体化マイクロバブル、ＤＮＡコンジュゲート脂質ナノ粒子もしくはＲＮＡコンジュゲート脂質ナノ粒子、オリゴヌクレオチドコンジュゲートナノ材料／ナノ粒子、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、阻害性核酸は、修飾されており、例えば、好ましくは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間連結を含む、修飾骨格を含む。一部の実施形態では、阻害性核酸は、任意選択で、ヌクレオチドが糖の２’位において修飾された１つまたは複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書では、本発明における使用のための方法および材料が記載されるが、当技術分野で公知である、他の適切な方法および材料もまた、使用されうる。材料、方法、および例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース項目、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。齟齬が生じる場合は、定義を含む本明細書に従う。
本発明の、他の特徴および利点は、以下の「発明を実施するための形態」および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
ＣＡＶＤにおける、ＶＩＣの推定疾患ドライバー集団についての表面マーカーの同定を示す図である。Ａ．新規に分離したＶＩＣ（ＣＡＶＤ患者、プールのｎ＝８）および３つの異なる培地中：増殖培地もしくは通常培地（ＮＭ）中、骨原性培地（ＯＭ）中、または脂肪生成性培地（ＡＭ）中で、２週間にわたり培養されたＭＳＣについての、ハイスループットスクリーニングフローサイトメトリー（ＨＴＳ－ＦＣ）である。Ｂ．ＨＴＳ－ＦＣによる、ＶＩＣおよびＭＳＣについての発現ヒートマップ（陽性染色パーセント）、ならびにヒートマップ内に入れ子状に示された、対応する、一次近傍ＰＰＩネットワークである。青四角ノードは、シードされた標的遺伝子であり；黒丸の供給源ノードは、４つの細胞条件全てにおける発現が高度な表面マーカーであり；白丸は、シード遺伝子と、表面マーカー遺伝子とを接続する、一次近傍および二次近傍である。ノードサイズは、ハブ中心性（媒介中心性）の程度を反映する。Ｃ．エッジカウントの、媒介中心性と対比したプロットは、ＣＤ４４を、この「石灰化」ネットワーク内で、接続が最も高度なノードであって、最高のエッジカウント測定値および媒介中心性測定値の両方を有するノードとして示す。Ｄ．石灰化大動脈弁尖についての、代表的ＩＨＣ染色である。陽性マーカーＩＨＣ染色を擬似カラー表示して、マーカーの視覚化および定量を容易とする。Ｅ．層１つ当たりの陽性染色細胞パーセントは、１０例のドナー弁における平均に基づき定量した。（＊＊＊）ｐ＜０．００１である。Ｅ．全ての細胞条件における発現が高度である、選択された表面マーカーの陽性染色頻度の相対存在量スケールについてのヒストグラムである。それらのそれぞれのアイソタイプ対照（ＩＣ）（濃いグレーとして提示される）を伴う、２つの条件（ＶＩＣおよびＭＳＣ－ＯＭ）である。ＩＨＣ＝免疫組織化学；ＰＰＩ＝タンパク質間相互作用；ＭＳＣ＝間葉系幹細胞；ＶＩＣ＝大動脈弁由来間質細胞である。 （上記の通り。） （上記の通り。） ヒト石灰化大動脈弁尖内の、ＣＤ４４ｈｉｇｈＶＩＣの同定および特徴付けを示す図である。Ａ．石灰化小節（＊）と近接する弁尖領域についての概略図である。Ｂ．石灰化小節を含有する特異的領域へと適用された、組織細胞拡散法であり、目的の領域について描示する（弁ドナーのｎ＝４である）。Ｃ．処理（ｉｎ ｓｉｔｕにおける）前と、比較的同様の配向性を維持する細胞を示す、組織拡散調製の後における、Ｆｅｕｌｇｅｎによる核染色である。Ｄ．石灰化小節（＊）にｔ近接するＣＤ４４＋細胞（赤矢印および挿入図）を示す、組織拡散調製の後における、比較的良好に保存された組織マイクロアーキテクチャーについての、ＣＤ４４免疫染色である。Ｅ．石灰化近傍領域についての、６０倍における、免疫蛍光顕微鏡画像である。ＣＤ４４（赤）と、オステオカルシン（ＯＣＮ）（緑）との共局在（黄）を、非定型核形態を含有する細胞と共に示す。ＣＤ４４＋染色を伴う、石灰化近傍の、カップ状の核を伴う細胞（ＤＡＰＩ染色；黄矢印）である。Ｆ．「一連のビーズ」（左画像）または「釣り鐘型カップ状の積層」として現れる核についての、Ｆｅｕｌｇｅｎ染色である。Ｇ．ＣＤ４４＋染色、およびカップ状の積層構成にある、非定型の「メタカリオティック」核、または（Ｈ．～Ｉ．）共焦点免疫蛍光画像のｚスタックから３Ｄ化された、連鎖状構成（黄色矢印）である。Ｊ．非定型核化ＣＤ４４＋細胞を示す、２０倍の拡大図である。 推定ＤＤＰ（前駆体）ＶＩＣ核を、非前駆体と対比する、ハイコンテントイメージング解析を示す図である。組織切片を、ＰＥ－ＣＤ４４（赤）およびＡＦ４８８－ＣＤ２９（緑）で染色した。Ａ．石灰化領域近傍における、ＣＤ４４／ＣＤ２９染色細胞（スケール＝５０ｕｍ）である。大部分の染色が、ＣＤ４４およびＣＤ２９の両方で染色されることを示す、代表的画像である。Ｂ．石灰化から遠位にあるＣＤ４４陽性細胞である。ＣＤ２９による共染色は見られなかった。Ｃ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒを使用する、核形態測定を行うのに使用された、推定前駆体である、ＣＤ４４＋ＣＤ２９＋細胞、および（Ｄ．）推定非前駆細胞についての核遮蔽（緑色の境界）である。Ｅ．核面積の比較である。Ｆ．核の稠密度の比較である。Ｇ．核の偏心性の比較である。群１つ当たりのドナーのｎ＝４である。統計学的検定は、ウィルコクソンの非パラメトリックランクサムにより行った。 （上記の通り。） ＣＡＶＤ内の疾患ドライバー集団の同定を示す図である。Ａ．通常培地（ＮＭ）中、高リン酸培地（ＰＭ）中、または骨原性培地（ＯＭ）中で培養された大動脈ＶＩＣのＦＡＣＳ分取についての代表的画像である。２１日目におけるアリザリンレッドによる染色では、非分取ＶＩＣ、分取ＣＤ４４ｈｉｇｈ細胞、および分取ＣＤ４４＋細胞は、ＯＭ条件下およびＰＭ条件下では石灰化された（ＰＭ＞ＯＭ）が、ＮＭ条件下では石灰化されなかった（ｎ＝３）。Ｂ．多色フローサイトメトリーＣＤ４４ｈｉｇｈＶＩＣの、ＣＤ２９、ＣＤ５９、およびＣＤ７３の陽性染色との共局在を示すが、ＣＤ４５の染色は低度であった（ドナーのｎ＝３）。Ｃ．石灰化に対して近位の領域についての免疫組織化学は、マーカーである、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ５９、およびＣＤ７３について、石灰化に対して遠位の領域より高度の染色を示す（ｎ＝３）。Ｄ．分取ＶＩＣ集団である、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗ細胞は、ＯＭ中では、石灰化骨芽細胞様細胞へと（アリザリンレッドによる染色）、ＡＭ中では、脂肪細胞様細胞を含有する脂肪球へと（オイルレッドＯによる染色）たやすく分化し、これらの特化培地中のＭＳＣ分化と同様であった。アルシアンブルー染色は、ＣＭ中で、軟骨細胞様ＤＤＰ ＶＩＣを示すが、混合（ＭＩＸ）非分取大動脈ＶＩＣは、ＯＭ中、ＣＭ中、またはＡＭ中では、同等の分化を示さない。代表的画像であり、ドナーのｎ＝４である。Ｅ．マスサイトメトリーによる、弁の石灰化部分および非石灰化部分の間のＡＬＰＬ（早期石灰化についてのマーカー）、ＣＤ４４、ＣＤ２９、およびＫｉ６７の相対発現（発現強度：暖色／赤（高度）～寒色／青（低度）のスケール）についての比較である（ドナーのｎ＝３）。Ｆ．石灰化弁尖についてのＳＰＡＤＥは、寒色を伴う小型のノードと対比した、暖色を伴う大型のノード（挿入図を参照されたい）を介して示される通り、非石灰化ＳＰＡＤＥと比較した場合に発現強度が高度である、多くの細胞（ノード円のサイズが大きい）を含有した。 （上記の通り。） ＭＳＣ－ＮＭ細胞、ＭＳＣ－ＯＭ細胞、ＭＩＸ－ＮＭ細胞、ＭＩＸ－ＯＭ細胞、ＰＵＲ－ＮＭ細胞、およびＤＤＰ－ＯＭ細胞による、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける２週間の石灰化アッセイについての単一細胞ＲＮＡシーケンシングである、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを示す図である。Ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ石灰化アッセイについての、単一細胞ＩｎＤｒｏｐｓ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのスキームである。ＭＳＣおよびＶＩＣは、ＯＭ中またはＮＭ中で、２週間にわたり培養した。単一細胞ｃＤＮＡライブラリー合成／シーケンシング法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ）に従い、ＩｎＤｒｏｐｓを使用して、細胞を速やかに解離させ、速やかに分取した。Ｂ．ＭＳＣのｋ平均クラスター（ｋ ｃｌｕｓｔ）を示し、それらをどのようにして分離するのかを示す、ｔＳＮＥプロットである。Ｃ．ＭＳＣ－ＮＭおよびＭＳＣ－ＯＭの分離を示すｋ平均クラスター化情報により計算されたｔＳＮＥプロットである。Ｄ．ＶＩＣ：ＭＩＸ－ＮＭ、ＭＩＸ－ＯＭ、ＰＵＲ－ＮＭ、およびＰＵＲ－ＯＭの分離を示すｋ平均クラスター化情報により計算されたｔＳＮＥプロットである。Ｅ．ＶＩＣのｋ平均クラスター（ｋ ｃｌｕｓｔ）を示し、ＭＩＸ－ＮＭ、ＭＩＸ－ＯＭ、ＤＤＰ－ＮＭ、およびＤＤＰ－ＯＭをどのようにして分離するのかを示す、ｔＳＮＥプロットである。Ｆ．ＦＤＲのｑ値を≦０．０５として計算された、ｋ４の、ｋ２クラスターと対比した倍数変化≧２．０による、ＤＧＥの増大についての、ＭＳＣ ｋクラスターの発現ヒートマップである。Ｇ．ＦＤＲのｑ値を≦０．０５として計算された、ｋ４の、（ｋ１＋ｋ２）クラスターと対比した倍数変化≧１．５による、ＤＧＥの増大についての、ＶＩＣ ｋクラスターの発現ヒートマップである。ＤＧＥ＝差次的発現遺伝子、ＦＤＲ＝偽発見率、ＮＭ＝通常培地、ＯＭ＝骨原性培地、ＭＳＣ＝間葉系幹細胞、ＶＩＣ＝大動脈弁由来間質細胞、ＱＣ＝品質管理、ｔＳＮＥ＝ｔ分布型確率的近傍埋め込み法、ＭＩＸ＝混合非分取ＶＩＣ、ＤＤＰ＝分取ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗＶＩＣである。 （上記の通り。） ｉｎ ｖｉｔｒｏ時間経過プロテオームプロファイリングを示す図である。Ａ．増殖培地を使用する培養物中で増殖され、次いで、ＯＭ条件培地またはＮＭ条件培地へと移された、ＭＳＣ、ＶＩＣ ＭＩＸ、およびＤＤＰについての実験設定である。曝露からの時間経過、ＯＭまたはＮＭの切替えの０週間後～３週間後の、１週間ごとの間隔の異なる時点：０、７、１４、および２１日目における、タンパク質の回収である。Ｂ．ＯＭ処置の１４日後および２１日後において、ＭＳＣを、ＤＤＰおよびＭＩＸと比較する、アリザリンレッド石灰化アッセイ（ｎ＝４）である。ＤＤＰの表現型は、ＯＭ中の挙動が、ＭＳＣに酷似する。Ｃ．ＭＳＣ設定およびＶＩＣ設定において、プロテオミクスにより同定された全タンパク質であって、大部分の共通タンパク質を伴う全タンパク質である。Ｄ．０週間後または条件培地への切替えの直後における、ＭＳＣ－ＮＭとＭＳＣ－ＯＭとの近接を描示する、各試料条件についての主成分分析、ＰＣＡである。２ＤのＰＣＡ空間では、時間の経過につれて、一時的に対をなしたＯＭ条件とＮＭ条件とを隔てる距離が増大する。Ｅ．プロテオームによる存在量の、培地条件間差違が、１４日目～２１日目の時点間で、０日目～７日目の時点間より大きいことを示す、ＭＳＣデータセットについてのヒートマップである。Ｆ．ＭＳＣ－ＯＭおよびＭＳＣ－ＮＭのプロテオミクスデータについての解析ワークフローである。グローバルプロテオームにより、試料条件を、２つの方式：時点間のランク回帰、および培地条件間の２群比較により解析した。結果として得られる差次的発現タンパク質（ＤＥＰ）を、ＭＳＣについてのＤＥＰへと併合し、このように名付けた。Ｇ．経時的に増大する、ＭＳＣ－ＯＭ内のＤＥＰ（８６のタンパク質）である。Ｈ．ＶＩＣ－ＭＩＸおよびＶＩＣ－ＤＤＰのプロテオミクスデータについての解析ワークフローである。ＶＩＣ－ＤＤＰまたはＶＩＣ－ＭＩＸについてのグローバルプロテオームにより、試料条件を、２つの方式：時点間のランク回帰、および培地条件間の２群比較により解析した。結果として得られる差次的発現タンパク質（ＤＥＰ）を、ＶＩＣ ＤＤＰについてのＤＥＰ、またはＶＩＣ ＭＩＸについてのＤＥＰへと併合し、このように名付けた。これらの２つのＤＥＰリストについてのさらなる比較は、ＭＩＸ細胞内で同定されないＤＤＰに固有の、ＤＤＰ－ＤＥＰ特異的タンパク質を明らかにする。Ｉ．ＶＩＣ ＤＤＰ特異的タンパク質についてのＤＥＰの増大（７１タンパク質）である。Ｊ．ＭＳＣについてのＤＥＰ（８６）と、ＤＥＰ－ＤＤＰ特異的タンパク質についてのＤＥＰ（７１）との間の重複であって、２つの共通タンパク質を伴う重複である。 （上記の通り。） トランスクリプトミクスデータと、プロテオミクスデータとの交差を示す図である。Ａ．１３のタンパク質は、ＯＭ条件化ＭＳＣ細胞およびＯＭ条件化ＶＩＣ－ＤＤＰ細胞の間のプロテオミクス解析または単一細胞トランスクリプトミクス解析による、増大するＤＥＰまたはＤＥＧのリストにおいて、少なくとも２回現れる。ＣＴＨＲＣ１は、３つの差次的発現増大リストに存在する、唯一の遺伝子である。ＭＡＯＡは、大動脈弁石灰化と関連したことがない酵素である。Ｂ．ＭＡＯＡ ｍＲＮＡおよびＣＴＨＲＣ１ ｍＲＮＡのサイレンシングに続く、ＮＭ中またはＯＭ中におけるＶＩＣの培養は、培養の１０日後における、遺伝子の発現の、統計学的に有意な低減を示した。Ｃ．ＯＭ処理ＭＡＯＡ、またはＣＴＨＲＣ１サイレンシングＶＩＣ（ドナーのｎ＝３）では、ＶＩＣ細胞内の組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）活性（培養の１０日後における）が、これに応じて低下した。Ｄ．オステオカルシンｍＲＮＡ発現もまた、培養の１０日後における、ＭＡＯＡまたはＣＴＨＲＣ１のサイレンシング時に低下した。Ｅ．ＰＢＳ（対照）または１０μＭのモクロベミドまたは１０μＭのピルリンドールを伴うＯＭ中で増殖させた２１日後における、ＶＩＣについてのアリザリンレッド染色である（ｎ＝３）。Ｆ．石灰化領域に対する近接を示すが、石灰化に対して遠位の細胞には存在しない、ＭＡＯＡ陽性細胞についてのＩＨＣである。Ｇ．石灰化領域に対する近接を示すが、石灰化に対して遠位の細胞には存在しない、ＣＴＨＲＣ１陽性細胞についてのＩＨＣである。代表的画像であり、ドナーのｎ＝３である。図６Ａ～６Ｄについて：ｎｓ：ｐ＞０．０５、（＊）ｐ≦０．０５、（＊＊）ｐ≦０．０１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１である。図６Ｅ～６Ｆについて：（＊）＝石灰化領域である。 タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）ネットワークを示す図である。４つのＤＤＰマーカー（青；内側の円）およびそれらの一次近傍（青；外側の円）、ｓｃトランスクリプトミクスおよびプロテオミクスによりフィルターをかけた標的（黄；内側の円）およびそれらの一次近傍（黄；外側の円）、ならびに大動脈弁および血管の石灰化と関連するマーカー（赤；内側の円）およびそれらの一次近傍（赤；外側の円）のサブネットワークを接続するＰＰＩネットワークである。重複タンパク質は、それぞれのサブネットワークの間に存在する。
ＣＡＶＤにおける分子調節ネットワークは、層ベースおよび病期ベースのマルチＯＭＩＣ法により同定されている（６）。大動脈弁層の各々の、主要な細胞外マトリックス組成：コラーゲン（線維層）、プロテオグリカン（スポンジ層）、およびエラスチン（心室関連層）は、適正な弁機能に不可欠である（７）。内皮細胞が、内腔弁表面を覆うのに対し、大動脈弁由来間質細胞（ＶＩＣ）は、大動脈弁由来間質の大部分を含む。ＶＩＣは、通常の弁発生において、主に、マトリックスの組織化および区画化を統合することにより機能する（８）。最新の枠組みは、ＶＩＣが、可塑性の細胞集団である：疾患状態では、ＶＩＣは、マトリックスリモデリングおよび線維症に寄与する、コラーゲン産生活性化筋線維芽細胞へとへと分化することを示唆する（９）。しかし、ＶＩＣの亜集団もまた、石灰化過程を誘発するのかどうかは、不明である。弁細胞の異種性という新興概念（６、１０、１１）に触発され、本発明者らは、このような骨原性亜集団が、ヒトＣＡＶＤにおいて存在するのかどうかを決定しようと探索した。ヒト組織では、これらの探索が困難である：ツールが欠如し、組織病理学的研究に限定されている。本明細書では、ヒトＣＡＶＤにおいて存在する、大動脈ＶＩＣの、特異的疾患ドライバー集団（ＤＤＰ）が、石灰化を促進する骨原性分化が可能な前駆体として作用するという仮説を検証するのに、ハイスループットのプロファイリング技術の組合せを使用した研究（１２～１４）が記載される。
マルチオミクスおよび単一細胞法を、段階的ワークフローにおいて援用することにより、この問題が取り組まれた。本明細書で示される通り、多能性前駆体様ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗ ＶＩＣ集団が、包括的に特徴付けられ、疾患誘発の傾向がある線維層内に位置する、石灰化ノードへとマッピングされた。本明細書で示される通り、ＣＡＶＤ弁尖は、３Ｄ（組織拡散調製）（１５）および２Ｄ（免疫蛍光）において、ＭＳＣ様「メタカリオティック」核表現型を伴う細胞を含有した。ＨＴＳ－ＦＣおよびネットワーク解析は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて示される通り、ＣＤ４４が、ＤＤＰ－ＶＩＣによる石灰化の調節において、中心的役割を果たすことを裏付けた。これらの結果は、血管の石灰化およびＶＩＣの活性化において鍵となる分子としてのＣＤ４４についての、他の報告（１６、１７）を確証する。しかし、ＣＤ４４は、白血球、線維芽細胞、および内皮を含む、多くの組織内で遍在的に発現するので（１８）、ＣＤ４４の治療的ターゲティングは、意図されない全身作用をもたらしうる。ＣＤ２９は、近年、アテローム性動脈硬化において、石灰化促進性前駆細胞マーカーとして報告された（１９）が、ＣＤ５９は、間葉系間質細胞の脂肪生成性および骨原能と強く関連し（２０）；ＣＤ７３は、自然免疫に関与しているため（２１）、本発明者らは、近年報告されている（２２～２４）通り、弁の無機化における、ＣＤ７３の役割を認めはするが、これらを潜在的なＣＡＶＤ治療標的としての優先対象から外した。
ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗ表現型を、ＣＡＶＤにおけるＤＤＰ－ＶＩＣとして確立する中で、弁からＦＡＣＳにより単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて拡大されたＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗＤＤＰ－ＶＩＣを、その自家供給源である非分取ＭＩＸ－ＶＩＣに対して比較する、時間経過プロテオミクス解析および単一細胞トランスクリプトミクス（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）解析を介して、遺伝子発現について探索した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑでは、多様なコラーゲン（例えば、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ６Ａ１）、および石灰化関連遺伝子（例えば、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、ＳＰＯＣＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ／オステオプロテゲリン）を発現させる。ＭＳＣ－ＯＭ細胞のサブクラスターを見出し、これらの前駆体が、骨原性刺激に応答して、活性の線維芽細胞および骨芽細胞への分化を経る（２５）ことを確認した。この現象は、ＯＭで刺激されたＶＩＣ内では見られないので、これらの遺伝子が、ＣＡＶＤにおける治療的検討に適切であるのかどうかは不明である（２６）。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ ｋ４クラスターを含むＤＤＰ－ＶＩＣの大部分は、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗ石灰化促進表現型を有する。ＤＤＰ－ＶＩＣ ｋ４クラスター内で、他のＶＩＣ－ＯＭクラスター（ｋ３、ｋ５、およびｋ６）と対比して増大した増大は、幹細胞マーカー（とりわけ、ＣＤ３４、ＴＭＴＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＫＢＰ５、ＡＮＰＥＰ、ＴＧＦ－β受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、ＰＬＸＮＡ２、ＥＬＮ、ＣＴＨＲＣ１、およびＭＡＯＡ）を含む。ＭＡＯＡ、ＴＭＴＣ１、およびＣＯＬ８Ａ１がまた、時間経過ＭＳＣ－ＯＭプロテオミクスでも富化されたのに対し、ＣＴＨＲＣ１およびＡＮＰＥＰは、ＶＩＣ ＤＤＰ－ＯＭ時間経過プロテオミクスで富化されることは、これと符合する。初期ＨＴＳ－ＦＣデータおよびＶＩＣ時間経過プロテオミクス（ＤＤＰ－ＯＭ）と符合する、ＣＤ３４ ｍＲＮＡの富化は、ＤＤＰ－ＶＩＣの前駆細胞様の性質を反映した。ＴＧＦＢＲ２およびＰＬＸＮＡ２の発現の増大は、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗＤＤＰ－ＶＩＣのうちの、このサブセット（ｋ４）における、骨芽細胞化の可能性を示唆した。ＰＬＸＮＡ２は、ＴＧＦＢＲ２と同様に（２８）、ＲＵＮＸ２の調節を介して（２７）、骨間葉系前駆体における、骨芽細胞への分化を媒介する。遺伝子発現の他の重複は、ＭＳＣ－ＯＭ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびＭＳＣ－ＯＭプロテオミクスの両方において差次的に富化される、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＲＬＦ１、およびＤＣＮ、ならびにＶＩＣ ＤＤＰ－ＯＭプロテオミクスおよびＭＳＣ－ＯＭプロテオミクスの両方において富化される、ＡＣＡＤＳＢであった（図６Ａ）。最後に、ＶＩＣ ＤＤＰ－ＯＭプロテオミクス、ＤＤＰ－ＶＩＣｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ、およびＭＳＣ－ＯＭプロテオミクスにおいて存在するグルココルチコイド経路結合性タンパク質である、ＦＫＢＰ５は、石灰化過程における関与がいまだ不明である。
ＭＡＯＡおよびＣＴＨＲＣ１は、本発明者らによるｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータにおいて見られる通り、ＳＰＡＲＣ、ＥＬＮ、ＦＮ１、ＦＢＮ、およびＣＯＬ８Ａ１など、他の石灰化関連遺伝子と共調節性である、それらの誘導に基づき、潜在的な新規の治療的抗石灰化標的として用いられうるであろう。ＭＡＯＡはまた、幹細胞マーカーである、ＣＤ３４、ならびにＥＬＮ、ＣＯＬ８Ａ、ＡＣＴＡ２、およびＴＧＦＢＲ２を含む、多様な筋線維芽細胞マーカーおよび骨芽細胞分化マーカーと共に共富化されもする。経路の富化は、ＶＩＣデータセットとＭＳＣ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットとの間における、前駆体様細胞の、この骨芽細胞分化の共通機構をバリデーションすることから、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗＤＤＰ－ＶＩＣが、実際に、ヒトＣＡＶＤにおける、新規に同定された疾患ドライバーであることを確証する。
過去の研究は、高セロトニンレベルが、ヒト心弁において、酸化ストレスを引き起こしうることを示した（２９）。しかし、ＭＡＯＡは、石灰化過程における調節因子として報告されていない。本明細書では、ＶＩＣ骨原性分化時における、ＭＡＯＡサイレンシングが、石灰化関連遺伝子の発現および細胞内アルカリホスファターゼ活性を有効に低減したことから、新規のアミン酸化攪乱経路が、石灰化に干渉することを示唆する。ＣＴＨＲＣ１は、ヒト大動脈弁遺伝子発現データセットについてのバイオインフォマティクススクリーニング研究（３０）を介して、ＣＡＶＤに関与する。ＣＴＨＲＣ１もまた、ヒトＣＡＶＤにおける、非カノニカルのＷＮＴシグナル伝達のメンバーである、ＷＮＴ５ＡおよびＷＮＴ１１（３１）に結合し、これらを活性化させる（３２）。研究は、ＣＴＨＲＣ１が、石灰化ヒトアテローム動脈硬化性プラーク内に存在することを報告した（３３）。本研究は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＴＨＲＣ１の機能喪失が、ＯＭ培養条件下に置かれたＶＩＣにおいて、石灰化関連遺伝子の他に、アルカリホスファターゼ活性の低減をもたらすことを示し、これにより、潜在的な抗石灰化標的としてのＣＴＨＲＣ１を確認した。
結論として述べると、石灰化促進細胞亜集団の段階的富化を使用して、本発明者らは、骨形成促進性前駆体様表現型であるＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗを伴う、新規の疾患ドライバーであるＶＩＣ集団を分離した。単一細胞解析ツールである、トランスクリプトミクス法およびプロテオミクス法、ならびにネットワーク解析を援用することにより、ヒトＣＡＶＤについての、潜在的な治療用候補の一覧表を同定した。本明細書では、これらの疾患関連遺伝子をターゲティングする、ＣＡＶＤのための薬物療法が提示される。
処置法
本明細書で記載される方法は、大動脈弁石灰化と関連する障害の処置のための方法を含む。一部の実施形態では、障害は、石灰化大動脈弁狭窄症（ＣＡＳ）（３４）：Lindman et al., Nat Rev Dis Primers. 2016 Mar 3; 2:16006；冠動脈疾患、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、静脈グラフト不全、動静脈瘻、および強皮症である。一般に、方法は、治療有効量の、本明細書で記載されるＭＡＯＡ阻害剤を、このような処置を必要とするか、またはこのような処置を必要とすることが決定された対象へと投与するステップを含む。
この文脈で使用される、「～を処置する」とは、大動脈弁石灰化と関連する障害の、少なくとも１つの症状を改善することを意味する。しばしば、ＣＡＳは、心不全、狭心症、失神、およびめまいに起因する呼吸困難を含む症状を結果としてもたらすので、処置は、これらの症状のうちの１つまたは複数の軽減を結果としてもたらしうる。ＣＡＳに起因する心不全は、多くの症例において、死を結果としてもたらす。ＭＡＯＡの阻害は、心不全の発生を改善することが可能であり、したがって、ＣＡＳ患者の死亡率を低減しうる。大動脈弁石灰化と関連する状態の処置のための、治療有効量の、本明細書で記載される化合物の投与は、大動脈弁石灰化のレベルの低下を結果としてもたらすであろう。
石灰化は、冠動脈疾患、心発作、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、静脈グラフト不全、および動静脈瘻など、他の障害の発症機序および臨床的併発に参与する。ＭＡＯＡの阻害は、これらの問題を改善しうる。
一部の実施形態では、方法は、大動脈弁石灰化を有する対象を同定するステップを含む。当業者であれば、当技術分野で公知の方法を使用して、大動脈弁石灰化を有する対象を、たやすく同定または診断することができるであろう；例えば、ＡＳの診断は、心エコー検査（３４）を使用して確立されうる；例えば、Lindman et al., Nat Rev Dis Primers. 2016 Mar 3; 2:16006を参照されたい。
「有効量」とは、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。例えば、治療量とは、所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患の発生または疾患の症状を防止するのに必要な量である、予防有効量と同じ場合もあり、異なる場合もある。有効量は、１回または複数回の投与で投与される場合もあり、１回または複数回の適用で投与される場合もあり、１回または複数回の投与量で投与される場合もある。治療用化合物の治療有効量（すなわち、有効投与量）は、選択される治療用化合物に依存する。組成物は、隔日１回を含む、１日当たり１回または複数回～１週間当たり１回または複数回投与されうる。当業者は、疾患または障害の重症度、既往の処置、対象の一般的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子が、対象を、有効に処置するのに要求される、投与量およびタイミングに影響を及ぼしうることを察知するであろう。さらに、治療有効量の、本明細書で記載される治療用化合物による対象の処置は、単回の処置を含む場合もあり、一連の処置を含む場合もある。
投与量、毒性、および治療効能は、細胞培養物中または実験動物における、標準的な薬学的手順であって、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％に対する治療有効用量）を決定するための手順により決定されうる。毒性作用と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表されうる。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物も、使用されうるが、非感染細胞に対する、潜在的な損傷を最小化し、これにより、副作用を軽減するために、このような化合物を、罹患組織の部位へとターゲティングする送達系をデザインするように配慮されるべきである。
細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲の策定において使用されうる。このような化合物の投与量は、毒性をほとんどまたは全く伴わずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、援用される剤形および活用される投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量はまず、細胞培養物アッセイから推定されうる。用量は、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の５０％阻害を達成する被験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルで策定されうる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を、より正確に決定するのに使用されうる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定されうる。
ＭＡＯＡ阻害剤
本方法は、ＭＡＯＡ阻害剤の投与を含む。当技術分野では、低分子および阻害性核酸を含む、多数のＭＡＯＡ阻害剤が公知である。
低分子ＭＡＯＡ阻害剤
低分子ＭＡＯＡ阻害剤は、ベフロキサトン（ＭＤ３７０５０３）；ビフェメラン（Ａｌｎｅｒｔ、Ｃｅｌｅｐｏｒｔ）；ブロファロミン（Ｃｏｎｓｏｎａｒ）；シモキサトン（ＭＤ ７８０５１５）；クロルギリン（Ｃｌｏｒｇｙｌｉｎｅ）（またはＣｌｏｒｇｉｌｉｎｅ）；メチレンブルー；ミナプリン（Ｃａｎｔｏｒ）；モクロベミド（Ａｕｒｏｒｉｘ、Ｍａｎｅｒｉｘ）；フェネルジン（Ｎａｒｄｉｌ）；ピルリンドール（Ｐｉｒａｚｉｄｏｌ）；トロキサトン（Ｈｕｍｏｒｙｌ）；チリマ（ＣＸ １５７）；トラニルシプロミン（非選択性および不可逆性、Ｐａｒｎａｔｅ）；イソカルボキサジド（１－ベンジル－２－（５－メチル－３－イソキサゾリルカルボニル）ヒドラジン－イソカルボキサジド、Ｍａｒｐｌａｎ、Ｍａｒｐｌｏｎ、Ｅｎｅｒｚｅｒ）；モリンドン；ラドスチギル；ＶＡＲ１０３０３；Ｍ３０；ヒドララジン；フェネルジン；キナクリン；ならびにこれらの塩および組合せを含む。例えば、Dhiman et al., Molecules 2019, 24(3), 418を参照されたい。
阻害性核酸
本方法において有用である阻害性核酸および組成物は、標的ＭＡＯＡ核酸の、少なくとも一部にハイブリダイズし、その機能をモジュレートする、ｓｉＲＮＡ化合物、修飾塩基／ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボザイム、および他のオリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチド模倣体など、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、一本鎖ＲＮＡｉ化合物または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物を含む。ヒトＭＡＯＡの例示的な配列は、以下の通りである：
Figure 2022527085000002
一部の実施形態では、阻害性核酸は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡアプタマー、ＤＮＡデコイ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；低分子一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；低分子ＲＮＡ誘導性遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、ギャップマー、ミックスマー、モルホリノホスホルアミデート（ＭＦ）ＬＮＡ（ロックト核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、リボザイム、環状ＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ＲＮＡデコイ、長鎖非コードＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、低分子ガイドＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、ＲＮＡスポンジ、マイクロＲＮＡスポンジ、オリゴヌクレオチドタグ付け抗体、プラスミド複合体化マイクロバブル、ＤＮＡ複合体化マイクロバブル、もしくはＲＮＡ複合体化マイクロバブル、ＤＮＡコンジュゲート脂質ナノ粒子もしくはＲＮＡコンジュゲート脂質ナノ粒子、オリゴヌクレオチドコンジュゲートナノ材料／ナノ粒子、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、阻害性核酸は、１０～５０、１０～２０、１０～２５、１３～５０、または１３～３０ヌクレオチドの長さである。当業者は、これが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ヌクレオチドの長さ、またはこの中の任意の範囲の相補性部分を有する阻害性核酸を実現することを察知するであろう。一部の実施形態では、阻害性核酸は、１５ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、阻害性核酸は、１２もしくは１３～２０、２５、または３０ヌクレオチドの長さである。当業者は、これが、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０ヌクレオチドの長さ、またはこの中の任意の範囲の相補性部分（相補性部分とは、標的配列と相補性である、阻害性核酸の部分を指す）を有する阻害性核酸を実現することを察知するであろう。
本方法において有用である阻害性核酸は、標的ＲＮＡに対して、十分に相補性である、すなわち、所望の効果をもたらすのに、十分に良好に、かつ、十分な特異性でハイブリダイズする。「相補性」とは、自然発生の塩基もしくは非自然発生の塩基、またはこれらの類似体を含む、２つ配列の間の水素結合を介して対合する能力を指す。例えば、阻害性核酸の１つ位置における塩基が、ＲＮＡの対応する位置における塩基と水素結合することが可能である場合、塩基は、この位置において、互いと相補性であると考えられる。１００％の相補性は、要求されない。
規定の方法は、標的配列に、十分な特異性で結合する阻害性核酸をデザインするのに使用されうる。一部の実施形態では、方法は、当技術分野で公知のバイオインフォマティクス法を使用して、二次構造、例えば、１つ、２つ、もしくはこれを超えるステム－ループ構造、またはシュードノットの領域を同定するステップと、阻害性核酸でターゲティングするための領域を選択するステップとを含む。例えば、「遺伝子ウォーク」法は、核酸の阻害活性を最適化するのに使用される場合があり；例えば、標的ＲＮＡの全長にわたる、１０～３０ヌクレオチドの、一連のオリゴヌクレオチドが調製された後、活性について調べることができる。任意選択で、合成され、調べられるオリゴヌクレオチドの数を低減するように、標的配列の間に、例えば、５～１０ヌクレオチドまたはこれを超えるギャップが残されうる。ＧＣ含量は、好ましくは、約３０～６０％の間である。可能な場合、３つまたはこれを超えるＧまたはＣの連続は、回避されるべきである（例えば、極めて短い（例えば、約９～１０ヌクレオチド）オリゴヌクレオチドを伴うことは、可能でない場合がある）。
一部の実施形態では、阻害性核酸分子は、ＭＡＯＡ配列の特異的領域をターゲティングするようにデザインされうる。例えば、特異的機能的な領域、例えば、公知のモチーフを含む領域（すなわち、プロモーターと相補性である領域）がターゲティングされうる。代替的に、または加えて、高度に保存的な領域、例えば、霊長動物（例えば、ヒト）および齧歯動物（例えば、マウス）など、完全に異なる種に由来する配列をアライメントし、高度の同一性を伴う領域を探索することにより同定される領域がターゲティングされうる。同一性パーセントは、基本的な局所的アライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴプログラム）（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410；Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）を、規定通りに使用して、例えば、デフォルトのパラメータを使用して決定されうる。
１つまたは複数の標的領域、セグメント、または部位が、例えば、当技術分野で公知であるか、または本明細書で提示される標的配列内で同定されたら、標的に対して、十分に相補性である、すなわち、所望の効果をもたらすのに、十分に良好に、かつ、十分な特異性でハイブリダイズする（すなわち、他の非標的ＲＮＡに、実質的に結合しない）、阻害性核酸化合物が選び出される。
本開示の文脈では、ハイブリダイゼーションとは、相補性のヌクレオシド塩基またはヌクレオチド塩基の間の、ワトソン－クリック水素結合の場合もあり、フーグスティーン水素結合の場合もあり、逆フーグスティーン水素結合の場合もある水素結合を意味する。例えば、アデニンと、チミンとは、水素結合の形成を介して対合する、相補性ヌクレオ塩基である。本明細書で使用される相補性とは、２つのヌクレオチドの間の、正確な対合のための能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドのある特定の位置におけるヌクレオチドが、ＲＮＡ分子の同じ位置におけるヌクレオチドと水素結合することが可能である場合、阻害性核酸と、ＲＮＡとは、この位置において、互いと相補性であると考えられる。阻害性核酸と、ＲＮＡとは、各分子内の、十分な数の対応する位置が、互いと水素結合しうるヌクレオチドにより占有される場合、互いと相補性である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補性」とは、阻害性核酸と、ＲＮＡ標的との間で、安定的で特異的な結合が生じるように、十分な程度の相補性または正確な対合を指し示すのに使用される用語である。例えば、阻害性核酸の１つの位置における塩基が、ＲＮＡの対応する位置における塩基と水素結合することが可能である場合、塩基は、この位置において、互いと相補性であると考えられる。１００％の相補性は、要求されない。
当技術分野では、相補性核酸配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるのに、その標的核酸の核酸配列に、１００％相補性である必要はないことが理解される。本方法を目的とする相補性核酸配列は、特異的結合が所望される条件下、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合には、生理学的条件下であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合には、アッセイが、適切な厳密性条件下で実施される条件下で、配列の、標的ＲＮＡ分子への結合が、標的ＲＮＡの通常の機能に干渉して、活性の喪失を引き起こし、配列の、非標的ＲＮＡ配列への非特異的結合を回避する十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。例えば、厳密な塩濃度は通例、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは、約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、より好ましくは、約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであろう。低厳密性のハイブリダイゼーションが、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得られうるのに対し、高厳密性のハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミドの存在下で得ることができ、より好ましくは、少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得られうる。厳密な温度条件は通例、少なくとも約３０℃、より好ましくは、少なくとも約３７℃の温度を含み、最も好ましくは、少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。当業者には、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの組入れまたは除外など、さらなるパラメータを変動させることも周知である。必要に応じて、これらの多様な条件を組み合わせることにより、多様なレベルの厳密性が達せられる。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および１％のＳＤＳ中、３０℃で生じるであろう。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で生じるであろう。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中、４２℃で生じるであろう。当業者には、これらの条件に対する、有用な変動がたやすく明らかであろう。
大半の適用では、ハイブリダイゼーションに後続する洗浄ステップもまた、厳密性において変動する。洗浄の厳密性条件は、塩濃度および温度により規定されうる。上記の通り、洗浄の厳密性は、塩濃度を減少させることにより増大される場合もあり、温度を上昇させることにより増大される場合もある。例えば、洗浄ステップのための厳密な塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは、約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであろう。洗浄ステップのための厳密な温度条件は通例、少なくとも約２５℃、より好ましくは、少なくとも約４２℃の温度を含み、なおより好ましくは、少なくとも約６８℃の温度を含むであろう。好ましい実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中、２５℃で生じるであろう。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中、４２℃で生じるであろう。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中、６８℃で生じるであろう。当業者には、これらの条件における、さらなる変動がたやすく明らかであろう。当業者には、ハイブリダイゼーション法が周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977)；Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)；Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；ならびにSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkにおいて記載されている。
一般に、本明細書で記載される方法において有用な阻害性核酸は、標的核酸内の標的領域に対する、少なくとも８０％の配列相補性、例えば、ＲＮＡ内の標的領域に対する、９０％、９５％、または１００％の配列相補性を有する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、２０個中１８個のヌクレオ塩基が、標的領域と相補性であり、したがって、標的領域に、特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物であれば、９０パーセントの相補性を表すであろう。阻害性核酸の、標的核酸の領域との相補性パーセントは、基本的な局所的アライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴプログラム）（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410；Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）を、規定通りに使用して決定されうる。ＲＮＡとハイブリダイズする阻害性核酸は、規定の実験を介して同定されうる。一般に、阻害性核酸は、それらの標的に対する特異性を保持しなければならない、すなわち、意図される標的以外に直接結合したり、意図される標的以外の転写物の発現レベルに、直接、著明に影響したりしてはならない。
阻害性核酸に関する、さらなる開示については、米国特許出願公開第２０１０／０３１７７１８号明細書（アンチセンスオリゴ）；米国特許出願公開第２０１０／０２４９０５２号明細書（二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ））；米国特許出願公開第２００９／０１８１９１４号明細書および米国特許出願公開第２０１０／０２３４４５１号明細書（ＬＮＡ）；米国特許出願公開第２００７／０１９１２９４号明細書（ｓｉＲＮＡ類似体）；米国特許出願公開第２００８／０２４９０３９号明細書（修飾ｓｉＲＮＡ）；国際公開第２０１０／１２９７４６号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０４０１１２号パンフレット（阻害性核酸）を参照されたい。
加えて、ＭＡＯＡをターゲティングする阻害性核酸は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；ｏｒｉＧｅｎｅ；ｄｈａｒｍａｃｏｎ；およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている。
ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ
一部の実施形態では、標的ＲＮＡと相補性である核酸配列は、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）または低分子ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）を含むがこれらに限定されない干渉ＲＮＡでありうる。干渉ＲＮＡを構築するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、干渉ＲＮＡは、１つの鎖がセンス鎖であり、他の鎖がアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖とセンス鎖とが自己相補性（すなわち、各鎖は、アンチセンス鎖と、センス鎖とが、二重鎖構造または二本鎖構造を形成する場合など、他の鎖内のヌクレオチド配列と相補性であるヌクレオチド配列を含む）であり、アンチセンス鎖が標的核酸分子またはその部分（すなわち、所望されない遺伝子）におけるヌクレオチド配列と相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖が標的核酸配列またはその部分に対応するヌクレオチド配列を含む、２つの個別のオリゴヌクレオチドからアセンブルされうる。代替的に、干渉ＲＮＡは、自己相補性センス領域とアンチセンス領域とが、核酸ベースのリンカー（複数可）または非核酸ベースのリンカー（複数可）により連結された、単一のオリゴヌクレオチドからアセンブルされる。干渉ＲＮＡは、自己相補性センス領域とアンチセンス領域とを有し、アンチセンス領域が、個別の標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列と相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス領域が、個別の標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列と相補性であるヌクレオチド配列ヌクレオチド配列を有する、二重鎖構造、非対称性二重鎖構造、ヘアピン構造、または非対称性ヘアピン二次構造を伴うポリヌクレオチドでありうる。干渉ＲＮＡは、自己相補性センス領域とアンチセンス領域とを含み、アンチセンス領域が、標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列と相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス領域が、標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列と相補性であるヌクレオチド配列ヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉を媒介することが可能な活性ｓｉＲＮＡ分子を作出するように、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてプロセシングされうる、２つまたはこれを超えるループ構造およびステムを有する、環状一本鎖ポリヌクレオチドでありうる。
一部の実施形態では、干渉ＲＮＡコード領域は、センス領域、アンチセンス領域、およびループ領域を有する、自己相補性ＲＮＡ分子をコードする。このようなＲＮＡ分子は、発現されると、「ヘアピン」構造を形成することが所望され、本明細書では、「ｓｈＲＮＡ」と称される。ループ領域は、一般に、約２～約１０ヌクレオチドの間の長さである。一部の実施形態では、ループ領域は、約６～約９ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、センス領域およびアンチセンス領域は、約１５～約２０ヌクレオチドの間の長さである。転写後プロセシングの後、低分子ヘアピンＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩＩファミリーのメンバーの酵素である、Ｄｉｃｅｒにより媒介される切断イベントにより、ｓｉＲＮＡへと転換される。次いで、ｓｉＲＮＡは、それが相同性を共有する遺伝子の発現を阻害することが可能である。詳細については、Brummelkamp et al., Science 296:550-553, (2002)；Lee et al, Nature Biotechnol., 20, 500-505, (2002)；Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol 20:497-500, (2002)；Paddison et al. Genes & Dev. 16:948-958, (2002)；Paul, Nature Biotechnol, 20, 505-508, (2002)；Sui, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 99(6), 5515-5520, (2002)；Yu et al. Proc NatlAcadSci USA 99:6047-6052, (2002)を参照されたい。
ｓｉＲＮＡにより導かれる標的ＲＮＡの切断反応は、高度に配列特異的である。一般に、標的核酸の部分と同一なヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡは、阻害に好ましい。しかし、本発明を実施するのに、ｓｉＲＮＡと、標的遺伝子との間の１００％の配列同一性は要求されない。したがって、本発明は、遺伝子突然変異、株による多型、または進化的分岐に起因することが予測されうる、配列の変動を許容することか可能である利点を有する。例えば、標的配列と比べて、挿入、欠失、および単一の点突然変異を伴うｓｉＲＮＡ配列もまた、阻害に有効であることが見出されている。代替的に、ヌクレオチド類似体の置換または挿入を伴うｓｉＲＮＡ配列も、阻害に有効でありうる。一般に、ｓｉＲＮＡは、それらの標的に対する特異性を保持しなければならない、すなわち、意図される標的以外に直接結合したり、意図される標的以外の転写物の発現レベルに、直接、著明に影響したりしてはならない。
修飾阻害性核酸
一部の実施形態では、本明細書で記載される方法において使用される阻害性核酸は、修飾されている、例えば、１つまたは複数の、修飾結合または修飾塩基を含む。多数の修飾塩基は、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、ペプチド核酸分子、またはロックト核酸（ＬＮＡ）分子を含む。一部の阻害性核酸が、完全に修飾されているのに対し、他の阻害性核酸は、キメラ核酸であり、各々が、少なくとも１つのヌクレオチドから構成された、２つまたはこれを超える、化学的に顕著に異なる領域を含有する。これらの阻害性核酸は、典型的に、１つまたは複数の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の増大、細胞への取込みの増大、標的に対する結合アフィニティーの増大など）を付与する、修飾ヌクレオチドの、少なくとも１つの領域、およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド体、またはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド体を切断することが可能な酵素に対する基質である領域を含有する。本発明のキメラ阻害性核酸は、２つまたはこれを超える、上記で記載した、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成されうる。当技術分野では、このような化合物はまた、ハイブリッド体またはギャップマーとも言及されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ギャップマー（ＬＮＡ修飾ヌクレオチドのブロックで挟まれた、ＲＮアーゼＨによる切断を誘導するのに十分に長い、中央部におけるＤＮＡ単量体の連なり（ギャップ）を含有する；例えば、Stanton et al., Nucleic Acid Ther. 2012. 22: 344-359；Nowotny et al., Cell, 121:1005-1016, 2005；Kurreck, European Journal of Biochemistry 270:1628-1644, 2003；FLuiter et al., Mol Biosyst. 5(8):838-43, 2009を参照されたい）である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ミックスマー（ＬＮＡとＤＮＡとの、交代する短い連なりを含む；Naguibneva et al., Biomed Pharmacother. 2006 Nov; 60(9):633-8；Orom et al., Gene. 2006 May 10; 372:137-41）である。このようなハイブリッド構造の調製について教示する、代表的な米国特許は、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０１３，８３０号明細書；同第５，１４９，７９７号明細書；同第５，２２０，００７号明細書；同第５，２５６，７７５号明細書；同第５，３６６，８７８号明細書；同第５，４０３，７１１号明細書；同第５，４９１，１３３号明細書；同第５，５６５，３５０号明細書；同第５，６２３，０６５号明細書；同第５，６５２，３５５号明細書；同第５，６５２，３５６号明細書；および同第５，７００，９２２号明細書を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、阻害性核酸は、糖の２’位において修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、または２’－フルオロで修飾されたヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース、非塩基性残基、またはＲＮＡの３’末端における反転塩基における、２’－フルオロ修飾、２’－アミノ修飾、または２’－Ｏ－メチル修飾を含む。このような修飾は、規定の方式で、オリゴヌクレオチドへと組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’－デオキシオリゴヌクレオチドよりＴｍが大きい（すなわち、標的への結合アフィニティーが大きい）ことが示されている。
多数のヌクレオチド修飾およびヌクレオシド修飾は、ヌクレオチド修飾およびヌクレオシド修飾が組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ消化に対して、天然のオリゴデオキシヌクレオチドより抵抗性とすることが示されており；これらの修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間にわたり、無傷で存続する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例は、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間連結を含む、修飾オリゴヌクレオチドを含む。ホスホロチオエート骨格を伴うオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２骨格、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２骨格（メチレン（メチルイミノ）骨格またはＭＭＩ骨格として公知である）、ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２骨格、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２骨格、およびＯ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２骨格［式中、天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨとして表される］、アミド骨格（De Mesmaeker et al. Ace. Chem. Res. 1995, 28:366-374を参照されたい）；モルホリノ骨格構造（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照されたい）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（この場合、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置きかえられ、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子へと、直接的にまたは間接的に結合される；Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497を参照されたい）を伴うオリゴヌクレオチドが、最も好ましい。リン含有連結は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、ならびに３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む、他のホスホン酸アルキル、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミダイトおよびアミノアルキルホスホルアミダイトを含むホスホルアミダイト、通常の３’－５’連結およびその類似体の２’－５’連結、ならびに極性が反転され、ヌクレオシド単位の隣接対が、３’－５’連結から、５’－３’連結へと反転されるか、または２’－５’連結から、５’－２’連結へと反転された、チオノホスホルアミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むがこれらに限定されない；米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９６号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３０６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；および同第５，６２５，０５０号明細書を参照されたい。
モルホリノベースのオリゴマー性化合物については、Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510；Genesis, volume 30, issue 3, 2001；Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214；Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220；Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596；および１９９１年７月２３日に公布された、米国特許第５，０３４，５０６号明細書において記載されている。
シクロヘキセニル核酸によるオリゴヌクレオチド模倣体については、Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602において記載されている。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによるヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルとの混合によるヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環によるヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結を有する骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格、およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成部分の混合を有する他の骨格を含む；それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，２６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；および同第５，６７７，４３９号明細書を参照されたい。
１つまたは複数の置換糖部分はまた、例えば、２’位における以下：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３［式中、ｎは、１～約１０である］；Ｃ１～Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、またはＮ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、またはＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つも含みうる。好ましい修飾は、２’－メトキシエトキシ［２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）としてもまた公知の、２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３］修飾（Martin et al, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486）を含む。他の好ましい修飾は、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）修飾、２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）修飾、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾を含む。また、同様の修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても施されうる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりに、シクロブチル基などの糖模倣体も有しうる。
阻害性核酸はまた、加えて、または代替的に、ヌクレオ塩基（当技術分野では単に、「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換も含みうる。本明細書で使用される、「非修飾」ヌクレオ塩基または「天然」ヌクレオ塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、天然の核酸内で、低頻度で、または一過性に見出されるに過ぎないヌクレオ塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に、５－メチルシトシン（また、５－メチル－２’デオキシシトシンとも称され、当技術分野では、５－Ｍｅ－Ｃとして言及されることが多い）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビシルＨＭＣ、ならびに合成のヌクレオ塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾイルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、および２，６－ジアミノプリンを含む（Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77；Gebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res. 1987, 15:4513）。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンもまた、組み入れられうる。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６～１．２℃上昇させることが示されており（Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、本明細書で好ましい塩基置換である。
所与のオリゴヌクレオチド内の全ての位置が、一様に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾のうちの１つを超える修飾は、単一のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合もあり、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内に組み込まれる場合もある。
一部の実施形態では、糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規の基で置きかえられうる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合物であるオリゴヌクレオチド模倣体であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置きかえられうる。ヌクレオ塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子へと、直接的に、または間接的に結合されうる。ＰＮＡ化合物の調製について教示する、代表的な米国特許は、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；および同第５，７１９，２６２号明細書を含むがこれらに限定されない。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Nielsen et al, Science, 1991, 254, 1497-1500において見出すことができる。
阻害性核酸はまた、１つまたは複数のヌクレオ塩基（当技術分野では単に、「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換も含みうる。本明細書で使用される、「非修飾」ヌクレオ塩基または「天然」ヌクレオ塩基は、プリン塩基である、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基である、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、および２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、および６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロアデニンおよび８－ハログアニン、８－アミノアデニンおよび８－アミノグアニン、８－チオールアデニンおよび８－チオールグアニン、８－チオアルキルアデニンおよび８－チオアルキルグアニン、８－ヒドロキシルアデニンおよび８－ヒドロキシルグアニン、ならびに他の８－置換アデニンおよび８－置換グアニン、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、特に、５－ブロモウラシルおよび５－ブロモシトシン、５－トリフルオロメチルウラシルおよび５－トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の５－置換ウラシルおよび５－置換シトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなど、他の合成ヌクレオ塩基および天然ヌクレオ塩基を含む。
さらに、ヌクレオ塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号において開示されているヌクレオ塩基；’The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering’, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990において開示されているヌクレオ塩基；Englisch et al., Angewandle Chemie, International Edition’, 1991, 30, page 613により開示されているヌクレオ塩基；およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications’, pages 289- 302、Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993により開示されているヌクレオ塩基を含む。これらのヌクレオ塩基のうちのある特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合アフィニティーを増大させるために、特に有用である。これらは、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、およびＯ－６置換プリンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６～１．２℃上昇させることが示されており（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, ‘Antisense Research and Applications’, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、なおより特に、本明細書で好ましい塩基置換である。修飾ヌクレオ塩基については、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号明細書の他に、同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０２号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；および同第５，６８１，９４１号明細書において記載されている。
一部の実施形態では、阻害性核酸は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、または細胞への取込みを増強する、１つまたは複数の部分またはコンジュゲートへと化学的に連結される。このような部分は、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309； Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基（Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49- 54）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム，１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖（Mancharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）などの脂質部分、または酢酸アダマンタン（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノカルボニル－ｔ－オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）を含むがこれらに限定されない。また、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書；同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書；同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書；および同第５，６８８，９４１号明細書も参照されたい。
阻害性核酸の作製および使用
本明細書で記載される方法を実施するのに使用される核酸配列は、ＲＮＡであれ、ｃＤＮＡであれ、ゲノムＤＮＡであれ、ベクターであれ、ウイルスであれ、これらのハイブリッド体であれ、様々な供給源から単離される場合もあり、遺伝子操作される場合もあり、増幅される場合もあり、かつ／または組換えにより発現される／作出される場合もある。組換え核酸配列は、個別に単離またはクローニングされ、所望の活性について調べられうる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系、細菌発現系、真菌発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系、昆虫発現系、または植物細胞発現系を含む、任意の組換え発現系が使用されうる。
本発明の核酸配列は、送達ベクターへと挿入され、ベクター内の転写単位から発現されうる。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドの場合もあり、ウイルスベクターの場合もある。ベクター構築物の作出は、当技術分野で周知である、任意の適切な遺伝子操作法であって、限定なしに述べると、例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989)、Coffin et al. (Retroviruses. (1997))、および“RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000))において記載されている、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡシーケンシングの標準的技法を含む遺伝子操作法を使用して達せられうる。当業者に明らかとなる通り、様々な適切なベクターが、本発明の核酸を、細胞へと導入するために利用可能である。核酸を送達するのに適切なベクターの選択、および選択された発現ベクターの、細胞への挿入のための条件の最適化は、不要な実験を必要とせずに、当業者の技術の範囲内にある。ウイルスベクターは、パッケージング細胞内の組換えウイルスの産生のめの配列を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸を発現させるウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、またはアルファウイルスを含むがこれらに限定されない、ウイルス骨格に基づき構築されうる。本発明の核酸を発現させることが可能な組換えベクターは、本明細書で記載される通りに送達される場合があり、標的細胞（例えば、安定的な形質転換細胞）内に存続しうる。
本発明を実施するのに使用される核酸配列は、例えば、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661；Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444；Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380；Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896；Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90；Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859；米国特許第４，４５８，０６６号明細書において記載されている通りに、周知の化学的合成法により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成されうる。
本発明の核酸配列は、修飾、例えば、ヌクレオチド修飾の組込みによる核酸分解などの核酸分解に対して安定化されうる。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端において、ホスホロチオエートによる、少なくとも第１のヌクレオチド間連結、第２のヌクレオチド間連結、または第３のヌクレオチド間連結を含む。別の例として述べると、核酸配列は、２’－修飾ヌクレオチド、例えば、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含みうる。別の例として述べると、核酸配列は、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル－修飾ヌクレオチドを含むことが可能であり、一部の実施形態では、ヌクレオチドの全ては、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。一部の実施形態では、核酸は、「ロックト」核酸である、すなわち、リボース環が、２’－Ｏ原子と、４’－Ｃ原子とを接続するメチレン架橋により「閉止された」核酸類似体（例えば、Kaupinnen et al., Drug Disc. Today 2(3):287-290 (2005)；Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc., 120(50):13252-13253 (1998)を参照されたい）を含む。さらなる修飾については、米国特許出願公開第２０１００００４３２０号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９８９１６号明細書、および米国特許出願公開第２００９０１４３３２６号明細書を参照されたい。
例えば、サブクローニング、標識付けプローブ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ、ニック翻訳、増幅を使用する、ランダムプライマーによる標識付け）、シーケンシング、ハイブリダイゼーションなど、本発明を実施するのに使用される核酸の操作のための技法について、学術文献および特許文献において十分に記載されている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual 3d ed. (2001)；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (John Wiley & Sons, Inc., New York 2010)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照されたい）。
医薬組成物および投与法
本明細書で記載される方法は、１つまたは複数のＭＡＯＡ阻害剤を、有効成分として含む医薬組成物の使用を含む。
医薬組成物は、典型的に、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される、「薬学的に許容される担体」という表現は、医薬の投与と適合性の、生理食塩液、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。使用されうる担体は、ウイルス粒子；不活化ウイルス粒子；ウイルス粒子の部分；特異的ウイルスタンパク質；超音波マイクロバブル；ガス充填型超音波マイクロバブル；脂質ナノ粒子；脂質マイクロ粒子；鉄化合物ナノ粒子；磁性ナノ粒子；他のナノ材料；ならびにナノチューブおよび他のナノ粒子を含む。補助的活性化合物もまた、組成物へと組み込まれうる。
医薬組成物は、典型的に、意図されるその投与経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例は、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、舌下投与、結膜内投与、および直腸内投与、または薬物溶出ステントもしくは心臓に対する他の手術手順による局在化投与を含む。局所投与は、冠動脈、頸動脈、末梢動脈、静脈グラフト、および動静脈瘻を含むがこれらに限定されない、アテローム性動脈硬化性の動脈または静脈において使用されうる。
当技術分野では、適切な医薬組成物を処方する方法が公知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005;およびDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)シリーズの書籍を参照されたい。例えば、非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩液溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌薬剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはリン酸緩衝液などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど、張性を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基により調整されうる。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製の、アンプル内に封入される場合もあり、ディスポーザブルのシリンジ内に封入される場合もあり、多数回投与用のバイアル内に封入される場合もある。
注射における使用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液（水に可溶性である場合）または滅菌水性分散液、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液の即席調製のための滅菌粉末を含みうる。静脈内投与に適する担体は、生理学的生理食塩液、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を含む。全ての場合に、組成物は、滅菌であり、容易な注射針通過可能性が存在する程度に流体であるものとする。組成物は、製造条件下および保管条件下において安定であるものとし、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防護される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物を含有する、溶媒の場合もあり、分散媒の場合もある。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合には要求される粒子サイズを維持することにより、かつ、界面活性剤を使用することにより維持されうる。微生物作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の遅延吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組み入れることによりもたらされうる。
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、活性化合物を、要求に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に、要求量で組み込んだ後、濾過滅菌を施すことにより調製されうる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒と、上記で列挙した成分に由来する、要求される他の成分とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、有効成分に、任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を、既に滅菌濾過されたその溶液からもたらす、真空乾燥法および凍結乾燥法である。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。経口治療用投与の目的で、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用されうる。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のための流体担体を使用しても調製されうる。薬学的に適合性の結合性化合物および／またはアジュバント材料も、組成物の一部として組み入れられうる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または同様の性質の化合物のうちのいずれか：結晶セルロース、トラガントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ芳香剤などの芳香剤を含有しうる。
本明細書で記載される治療用化合物の全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によってもなされうる。経粘膜投与または経皮投与のために、製剤中では、透過されるべき障壁に適切な透過促進剤が使用される。当技術分野では一般に、このような透過促進剤が公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーの使用を介して達せられる場合もあり、坐剤の使用を介して達せられる場合もある。経皮投与のためには、活性化合物は、当技術分野で一般に公知の、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ、ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームへと製剤化される。
医薬組成物はまた、直腸内送達のための、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなど、従来の坐剤のための基剤）または貯留型浣腸剤の形態でも調製されうる。
核酸であるか、またはこれを含む治療用化合物は、ＤＮＡワクチンなど、核酸剤の投与に適する、任意の方法により投与されうる。これらの方法は、遺伝子銃、バイオインジェクター、および皮膚パッチの他に、米国特許第６，１９４，３８９号明細書において開示されている、マイクロ粒子によるＤＮＡワクチン技術などの無針法、および米国特許第６，１６８，５８７号明細書において開示されている、粉末形態ワクチンによる、哺乳動物における経皮無針ワクチン接種を含む。加えて、とりわけ、Hamajima et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10 (1998)において記載されている通り鼻腔内送達も可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号明細書において記載されている）およびマイクロカプセル化もまた、使用されうる。生体分解性の、ターゲティング可能なマイクロ粒子送達系もまた、使用されうる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号明細書において記載されている）。
一部の実施形態では、治療用化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤など、治療用化合物を、体内からの急速な消失に対して保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーが使用されうる。当業者には、このような製剤は、標準的技法を使用して調製される場合もあり、例えば、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている場合もある。リポソーム懸濁液（細胞内抗原に対するモノクローナル抗体により、選択された細胞へとターゲティングされるリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用されうる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書において記載されている、当業者に公知の方法に従い調製されうる。
薬物溶出ステントを使用して、化合物の、より局在化された送達が達成されうる。ステントは、好ましくは、半径方向の拡大が可能であり、本明細書で記載される化合物の持続放出を封入するコーティング層を含む、冠動脈における使用のために構成されたインプラントである。ステントは、ポリマーコーティング層を含む場合もあり、非ポリマーコーティング層を含む場合もある。例えば、とりわけ、国際公開第９９／０７３０８号パンフレット；米国特許第９，０１２，５０６号明細書；同第６，２５８，１２１号明細書；同第６，１７１，６０９号明細書；同第６，１５９，４８８号明細書；同第６，０９９，５６２号明細書；同第５，８７３，９０４号明細書；同第５，３４２，３４８号明細書；同第５，８７３，９０４号明細書；同第５，７０７，３８５号明細書；同第５，８２４，０４８号明細書；同第５，５２７，３３７号明細書；同第５，３０６，２８６号明細書；同第５，２８８，７１１号明細書；同第６，１５３，２５２号明細書；および同第６，０１３，８５３号明細書；ならびに米国特許出願公開第２０１９０３８８２１０号明細書を参照されたい。
医薬組成物は、投与のための指示書と併せて、容器、パック、または分注器に組み入れられうる。
本発明は、特許請求の範囲において記載される、本発明の範囲を限定するものではない、以下の例において、さらに記載されうる。
方法
下記の実施例では、以下の方法を使用した。
研究プロトコールの承認
大動脈弁由来間質細胞（ＶＩＣ）の亜集団、およびヒト石灰化大動脈弁疾患（ＣＡＶＤ）の起源におけるそれらの関与を同定するために、本発明者らは、ＣＡＶＤを伴う患者に対する大動脈弁置換術手順において得られた大動脈弁尖について解析した。全ての患者は、説明同意文書を提出し、ヒト試料の回収についての研究プロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにより承認された。臨床概要についての詳細な精査は、冠動脈疾患または他の状態など、ＣＡＶＤに対する素因となる危険性因子について、患者間に有意差が見られないことを明らかにした。この研究は、平均値年齢を６７±１０歳とする、２３名の男性患者および１０名の女性患者から構成される、合計３３例のヒト大動脈弁を使用した。
細胞培養物の維持
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に使用される培養物培地は、以下である：（１）無血清培地は、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を伴う、ダルベッコ改変イーグル培地である、ＤＭＥＭ（１１９６５－０９２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。（２）通常の培地（ＮＭ）は、５％の胎仔ウシ血清、ＦＢＳ（１００８２１４７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴うＤＭＥＭである。（３）増殖培地（ＧＭ）は、１０％のＦＢＳを伴うＤＭＥＭである。骨原性培地（ＯＭ）は、１０ｍＭのβ－グリセロリン酸（３５６７５－５０ＧＭ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、０．０１ｍＭのデキサメタゾン（ＩＣＮ１９４５６１２５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および０．０５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Ａ４５４４－２５Ｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＮＭ中で使用して調製した。軟骨形成性培地は、０．１μＭデキサメタゾン、１倍濃度のインスリン－トランスフェリン－セレニウム－エタノールアミン（ＩＴＳ＋）（５１５０００５６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｍＭの２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸（４９７５２－１０Ｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭのＬ－プロリン（Ｐ５６０７－２５Ｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．１％のＴＧＦ－β１（１００－Ｂ－００１／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）を、無血清ＮＭ中で使用して調製した。脂肪生成性培地は、１μＭのデキサメタゾン、０．１２５％のヒトインスリン溶液（Ｉ－９２７８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン、ＩＢＭＸ（Ｉ５８７９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有し、６０μＭのインドメタシンを、ＮＭへと添加した。脂肪組織由来ヒトＭＳＣ細胞株（ＡＴＣＣ）の初期増殖のために、ＰｅｐｒｏＧｒｏｗ（商標）ｈＭＳＣ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を使用した。そうでないことが指し示されない限りにおいて、全ての洗浄ステップには、オートクレーブ処理されたリン酸緩衝液生理食塩液（ＰＢＳ）を使用した。
大動脈ＶＩＣの単離
石灰化小節を含む、弁尖塩基から先端部にわたる連続部分を含有する、１～５ｍｍの厚さの弁尖組織は、酵素的消化のための処理の前に、組織学のために、各ドナーの弁尖から得た。大動脈弁組織の処理は、ピンセットを使用して、大型の石灰化小節（直径約≧２ｍｍ）を、組織から、手作業で除去し、組織を、≦１ｍｍ３の小片へと切り刻むことを要求した。検体が、下流において、マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）または単一細胞ＲＮＡシーケンシングのために処理される場合、本発明者らは、ミンチにする前に、弁を、片方が全ての目視可能な石灰化小節を含有し、弁の「石灰化」試料と名付けられ、片方が目視可能な石灰化を伴わず、「非石灰化」試料と名付けられる半分へと切断した。ＦＡＣＳ、ハイスループット表面マーカーフローサイトメトリースクリーニング、および多色フローサイトメトリーを含む、さらなる実験のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける培養を経る検体については、本発明者らは、石灰化部分と、非石灰化部分とを分離せずに、弁を切り刻んだ。ＶＩＣは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液と、１％のペニシリン／ストレプトマイシンとを補充したＤＭＥＭ中で、２０分間ごとに混合を反転させて、１時間にわたり調製した、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＡ－Ｓ（Ｓｉｇｍａ）の滅菌濾過溶液約６ｍＬを使用する、３７℃における酵素的消化により、切り刻まれた組織から放出された。次いで、内容物をボルテックスし、小片を沈降させた後で、培地を吸引した。基礎培地であるＤＭＥＭによる、さらなる洗浄ステップの後、本発明者らは、濾過された、未使用のコラゲナーゼ溶液を、組織へと添加し、これを、さらなる３時間にわたりインキュベートした。１０％のＦＢＳ約６００μｌを使用して、酵素的消化を停止させた。次いで、１００μｍの細胞ストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を介して、細胞懸濁液を、濾過し、洗浄し、下流におけるフローサイトメトリーまたはＣｙＴＯＦ実験のために直径６ｃｍもしくは１０ｃｍのペトリディッシュへと培養するか、または１．０ｍＭのＨＥＰＥＳを伴うＤＭＥＭ中に３％のＦＢＳ中に再懸濁させた。
大動脈弁についての免疫組織化学（ＩＨＣ）
本発明者らは、大動脈弁尖の全体にわたり、低温切片についての定量的免疫組織化学を行った（ｎ＝１０）。ＯＣＴ化合物（Ａｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で凍結させた試料を、６μｍの組織学切片へと、連続的に切断した。固定（４％パラホルムアルデヒド）、ペルオキシダーゼブロッキング（０．３％過酸化水素）、および血清ブロッキング（４％胎仔ウシ血清）の後、切片を、石灰化特性、ＶＩＣ特性、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）特性と関連する一次抗体（抗体についての付表）と共にインキュベートした。１．５時間にわたるインキュベーション、およびさらなる洗浄ステップの後、本発明者らは、切片を、１：１００の濃度のビオチン標識付け二次抗体中でインキュベートするのに続き、発色を達成するように、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼ処理およびＡＥＣ液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によるインキュベーションを行った。Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）による速やかな対比染色の後、本発明者らは、Ｏｍｎｙｘ ＶＬ４スキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、スライドを検討し、次いで、それらを、Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ ３．２０で処理した。
ｐｙｔｈｏｎ ｓｃｉ－ｋｉｔを使用する、ＩＨＣによる、３つの層にわたる、陽性性についての染色の測定
画像処理のためのｓｃｉ－ｋｉｔ－ｉｍａｇｅ（Ｐｙｔｈｏｎ）を使用して、１０例の大動脈弁尖について、図１に列挙された、以下のマーカーについて、細胞１個当たりの陽性免疫染色シグナルの、バイアスのない細胞計数および定量を行った。Ｏｍｎｙｘ ＶＬ４スキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により走査された画像を、最大分解能（最高の分解能を、４０倍、またはピクセル１つ当たり０．０１９マイクロメートルとする）でエクスポートし、次いで、全弁についての大型走査（１１５０８×３２７３ピクセル）としてエクスポートした。大型の走査画像を、操作可能なサイズ（約２３００×１６００ピクセル）へと分割した。青色のヘマトキシリン染色を、褐色のＤＡＢ染色に対して、明瞭に識別するように、分割された各画像を、色彩デコンボリューションのために処理した。次いで、シグナル染色（核およびＩＨＣマーカー）が、暗色のバックグラウンド（間質の陰性染色）に対して、明色として現れるように、画像の色を反転させた。石灰化領域および結晶がヘマトキシリンで核を染色するのと同様に染色されるために、ブロッブサンプリングによる対象物の最大直径を使用するアルゴリズムにより、同定された各対象物／粒子に閾値設定することにより、石灰化小節を、解析から除外した。例えば、ブロッブを染色するヘマトキシリンが、互いと近接して並置されて（隣接して）検出される場合、直径は、累積的に合計され、マイクロメートル単位の閾値直径を超えるであろう。各々が、他の隣接する細胞核から、細胞質を染色するヘマトキシリン以外の染料により隔てられた、真の細胞核のいずれも、約２０マイクロメートルを超えず、ヘマトキシリンによる石灰化小節の染色は、５０マイクロメートルより小さくない。よって、ブロッブ直径に閾値設定することにより、石灰化領域を除外することができる。石灰化除外の後、本発明者らは、ラプラシアンガウシアン（Ｌａｐｌａｃｉａｎ ｏｆ Ｇａｕｓｓｉａｎ）法（scikit-image.org/docs/dev/api/skimage.feature.html#id55）を使用して、各細胞の核を同定するように、ブロッブ検出を再度使用した。細胞を、自動的にカウントおよび記録して、切片全体についての全細胞カウントを求めた。次いで、同定された核ブロッブについて、それらが、重複するか、または極めて近接する（≦５ｕｍ）ことを基準として、ＩＨＣシグナル（ＤＡＢ褐色）によるブロッブ検出を行って、陽性染色細胞と名付けた。陽性である、ＤＡＢにおける褐色は、色彩デコンボリューションステップにおいて、アルゴリズムにより決定される走査画像内で見出される、０を白色相強度とし、１．０を、最も暗い褐色相強度とする、０～１．０の範囲内で、０．４以上（ＤＡＢ閾値≧０．４）の色相強度として規定した。その後、分割された画像の各々、およびそれらの画像により列挙されたサイトメトリーデータを、連結および併合した。各層についての迅速画像解析用領域（ＦＲＩＡ）を同定し、試料を、ＦＲＩＡ当たり、全細胞当たりの、陽性染色パーセントについて定量した。陽性染色細胞総数を、細胞総数で除して、陽性細胞パーセントの測定値を得た。
ＶＩＣについての免疫細胞化学
混合および単離された集団に由来するＶＩＣを、個別の４ｃｍ２チャンバー内で、セミコンフルエンシーまで培養した。細胞を、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）１．０ｍＬによる、１０分間にわたる固定の前に、３回にわたり洗浄した。ＰＦＡを廃棄し、ＰＢＳで洗浄した後で、本発明者らは、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ（商標）ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ型番：Ａ１８９６７０１）中に混合された、２倍濃度の透過化緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＦｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｍセット；型番：８８－８８２４－００）を、１０分間にわたり添加して、透過化を確認した。再度の洗浄の後、本発明者らは、静かな振盪を確保しながら、暗所内、室温で、３０分間にわたり、１倍濃度の透過化緩衝液、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ ＤＭＥＭ溶液中に１％のＰｅｒｍＷａｓｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および細胞に対して１：１００の一次抗体を添加した。ＰＢＳ中で２回にわたる静かな洗浄の後、抗体の濃度を１：５００として、特異性が一次抗体カクテルとマッチする、二次抗体カクテルを調製した。暗所で、３０分間にわたるインキュベーションの後、スライドを、ＰＢＳで、３回にわたり、静かに洗浄した。次いで、スライドを、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ ＤＭＥＭ中に１：１００のＨｏｅｃｈｓｔ ３３５４３（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で、１０分間にわたり染色した。純粋なＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ（商標） ＤＭＥＭによる、２回にわたる洗浄の後、２０倍および６０倍の水浸倍率のＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ Ａ１共焦点顕微鏡により、イメージングを行った。
大動脈ＶＩＣおよびＭＳＣにおける２４２の細胞表面マーカーについてのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）
ＮＭ、ＯＭ、およびＡＭの培地条件下における、２週間にわたる分化の後、石灰化大動脈弁のＶＩＣ、および細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－５００－０１１（商標）、ロット番号：８０６２２１７５）に由来する、脂肪間質由来ＭＳＣは、ハイスループットスクリーニングフローサイトメトリー（ＨＴＳ－ＦＣ）を受けた。単一弁細胞を放出するために、本発明者らは、上記で記載した通りに、弁組織消化を行った。集塊物、破砕物、およびカルシウム結晶は、洗浄および細胞ストレーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ；型番：４３１７５２）を介して除去した。各ドナー弁（ｎ＝８）について、細胞をプールし、個別にカウントした。ウェル１つ当たりの細胞２５０，０００個を、ウェル１つ当たり２４２の固有の単一抗体表面マーカーキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｙｏｐｌａｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐａｎｅｌ）へと分注するために、各細胞懸濁液を、容量２２ｍＬ中に、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個の濃度へと調整した。ＭＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に継代し、培地条件１つ当たりのフラスコを６本として、１５０ｃｍ２のフラスコ１８本へと拡大した。次いで、培養物に由来する細胞、および弁に直接由来する細胞を、抗体による染色を伴う、標準的ＦＡＣＳプロトコールにかけるのに続き、間に、厳密な細胞洗浄を伴う、ＡＰＣコンジュゲート抗体による染色を行った。次いで、フローサイトメトリーによる読み取りの前に、４％のＰＦＡにより固定した。９６ウェルプレートハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）を伴う、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅにおいて使用し、ＣｙｔｏｂａｎｋおよびＦｌｏｗＪｏ １０．７ソフトウェアを使用して、データを解析した。試料条件ごとの相対表面マーカー発現を比較するために、本発明者らは、陽性染色パーセントの測定値から、百分位数ランクを計算した。次いで、本発明者らは、試料条件（ＶＩＣ、ＭＳＣ－ＮＭ、ＭＳＣ－ＯＭ、ＭＳＣ－ＡＭ）の各々において高度に発現される特異的ＣＤ（ｎ）マーカーを明確に標識付けするためのカットオフとして、第８５百分位数を採用した。
ＰＰＩネットワークと併合されたＦＡＣＳ ＨＴＳデータについてのネットワーク解析
１３のマーカーを、供給源ノードとして使用して、ＭｅｔａＣｏｒｅ（商標）（Ｃｌａｒｉｖａｔｅ）による指向性インタラクトームネットワークを構築した。マーカーを、最短の経路および経路内の、２つのリンクノードのうちの大きい方のノードと接続した。オステオカルシン、組織非特異性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）、およびオステオポンチンを、最終標的ノードとしての、石灰化についてのマーカーとしてシードすることにより、ネットワークは、石灰化と関連する文脈を指示した。加えて、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．６およびＧｅｐｈｉ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．９．１を使用して、ハブ中心性および次数中心性を測定した。
三次元組織細胞拡散免疫組織化学（ＩＨＣ）
本発明者らは、過度に乾燥させたり、室温を下回って冷却されたりしていない、採取したての大動脈弁組織（ｎ＝２）を使用した。カルノア固定液ベースの方法のために、本発明者らは、４分の３であるエタノールを、４℃（または氷上で）で調製し、４分の１である氷酢酸を、室温で調製した。本発明者らは、弁尖（石灰化弁）を、４５ｍＬのカルノア固定液中に、３０分間にわたり浸漬した。３～４時間にわたる固定の後、５回にわたる新鮮なエタノール溶液への交換を使用して、固定液を、７０％のエタノールで洗い流した。７０％のエタノール中で固定された弁は、ＩＨＣ品質または免疫蛍光（ＩＦ）染色の品質を失わずに、１年間にわたり、４℃で保管することができた。
組織の断片を、３７℃の溶液へとあらかじめ加熱し、次いで、６０℃で、８分間にわたり加熱された、１ＮのＨＣｌを含有するコプリンジャーに入れて、酸による組織の消化を可能とした。次いで、本発明者らは、ＭｉｌｌｉＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、組織をすすぎ、ＭｉｌｌｉＱ水中に４５％の酢酸を含有する、未使用のペトリディッシュに入れた。１５分間にわたるインキュベーションの後、細胞を、顕微鏡スライド状で、単一の細胞層へと分散させた（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）。細胞を分散させる（ｄｉｓｐｅｒｓｅ）ために、０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×０．５ｍｍの組織消化物を、＋／＋ Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔガラススライドの中央部の、４５％の酢酸溶液（容量を約５．０マイクロリットルとする）によるドーム状の液滴の上に置いた。組織の上に、本発明者らは、２２ｍｍ×２２ｍｍのガラスカバースリップ（＃１．５）を置き、細胞を分散させる（ｓｐｒｅａｄ ｏｕｔ）ように、ピンセットを使用して、カバースリップへと、静かに圧力加えた。分散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）は、細胞が、平板化していないことを確認するように、顕微鏡によりモニタリングした。細胞を単一の層へと分散させた（ｓｐｒｅａｄ）ら、ガラススライドを、ドライアイス上で速やかに凍結させ、剃刀の刃で、カバースリップを静かに除去した。こうして、ガラススライドは、既に記載されている通りに、免疫組織化学処理の準備ができた。
ＦＡＣＳ分取されたＣＤ４４＋ ＶＩＣについての石灰化アッセイ
早期継代ＶＩＣ（初代～４代目）を、それらのＣＤ４４陽性性に基づくフローサイトメトリーにより、細胞培養物から分取し、３つの群：ＣＤ４４－、ＣＤ４４＋、およびＣＤ４４ｈｉｇｈへと分けた。次いで、３つの群を播種し、コンフルエントとなるまで増殖させた。ＯＭ処理またはＮＭ処理の後３週間にわたり、骨原性分化アッセイを行った。本発明者らは、骨形成アッセイに、２％のアリザリンレッド（ＡＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。４８ウェルプレートまたは９６ウェルプレートに播種した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１０％のホルマリンにより、室温で、１５分間にわたり固定した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水による洗浄の後、本発明者らは、染料を添加し、２０分間にわたりインキュベートした。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水による３回にわたる洗浄の後、ｉＰｈｏｎｅ７（Ａｐｐｌｅ）で写真を撮影し、放出された色素の量を、５５０ｎｍにおける分光光度法により定量した。
マスサイトメトリー飛行時間（ＣｙＴＯＦ）ベースの、大動脈ＶＩＣについてのタンパク質プロファイリング
ＣｙＴＯＦは、希土類金属同位体コンジュゲート抗体を使用して、標的タンパク質を検出し、定量する。大動脈ＶＩＣは、組織のコラゲナーゼ消化から調製し、１０％のＦＢＳを伴うＤＭＥＭ、１倍濃度の抗生剤／抗有糸分裂剤、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを使用して、培養物（３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター）中で、一晩にわたり回収した。一晩にわたる培養の後、細胞は、大部分の非接着性細胞と、５％未満の、弱く接着性である細胞とから構成された。本発明者らは、細胞を採取し、バリウム非含有ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、次いで、遠心分離機内、３００ｇで、１０分間にわたりペレット化させた。本発明者らは、細胞密度を、反応容量２５０μＬ中、１ｍＬ当たりの細胞＜１×１０７個とし、Ｃｅｌｌ－ＩＤＴＭ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎを、バリウム非含有ＰＢＳ中に、５．０μＭの濃度で使用して、室温で、５分間にわたり、細胞を、生存について染色した。細胞懸濁液容量の５倍容量として、ＭａｘＰａｒ（登録商標）細胞染色緩衝液（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して、生存染色反応を停止させた。全ての進行ステップは、バリウム非含有緩衝液、試薬、および容器を使用して行った。本発明者らは、細胞を、再度ペレット化させ、それらを、１００μＬの反応容量中に、１ｍＬ当たりの細胞１．５～３．０×１０６個の濃度で再懸濁させてから、２００μＬのＦｉｘ Ｉ緩衝液（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）により、４℃で、１０分間にわたり固定した。固定は、細胞を、８００μＬの細胞染色緩衝液（ＣＳＢ）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で洗浄することにより停止させた。本発明者らは、サポニン含有ＣＳＢ－Ｓ緩衝液（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を、１分間にわたり使用して、細胞を透過化させ、それらをペレット化させた。次に、本発明者らは、細胞を、５００μＬの核抗原染色緩衝液（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）と共に、３０分間にわたりインキュベートしてから、核抗原染色透過化緩衝液（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で洗浄した。次いで、結果として得られる細胞を、８００ｇで、５分間にわたりペレット化させ、１０μＬの残留容量中に再懸濁させた。非特異的抗体結合は、ＣＳＢ－Ｓ緩衝液による、Ｈｕｍａｎ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、１：１００希釈液１０μＬを、室温で、１０分間にわたり使用して停止させた。ブロッキング手順の後、本発明者らは、細胞を、２０μＬの抗体カクテルと共に、室温で、３０分間にわたり（細胞懸濁液の間欠的な攪拌を伴い）インキュベートした。上記で記載した通りに、ＦＡＣＳに使用した抗体に加えて、本発明者らは、８つのさらなる表面抗体と、１４の細胞内マーカー抗体を組み入れた。カクテルは、細胞内に浸透するように、ＣＳＢ－Ｓ緩衝液中で調製した。８００μＬのＣＳＢ－Ｓを伴う洗浄細胞懸濁液で、抗体結合反応を停止させ、８００ｇで、５分間にわたり、細胞をペレット化させた。大半の上清を廃棄したの後、ペレット化させた細胞を、５０μＬの残留容量中に、再度再懸濁させた。細胞は全て、８００μＬ中で、２回にわたり洗浄し、８００ｇで、５分間にわたりペレット化させた。核内容物相互作用およびビーズスパイキングを、あらゆる試料に使用した。調製された細胞は、Ｃｙｔｏｂａｎｋにおいて、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｈｅｌｉｏｓ ＣｙＴＯＦ ＭＳ装置にかけ、解析した。
大動脈ＶＩＣについての多色ＦＡＣＳ
ＦＡＣＳ解析で同定された、１３のマーカーを、多色ＦＡＣＳにより、前駆体マーカーおよび石灰化マーカーの共発現について調べた。推定前駆細胞集団と関連する表面マーカーを決定するために、１８のマーカーの各々を、他のマーカーとの共発現、ならびに石灰化についてのマーカー（オステオカルシン）、および増殖についてのマーカー（Ｋｉ－６７）との共発現について調べた。ＦＡＣＳプロトコールを実行した。本発明者らは、弁消化から得られた細胞を、洗浄し、裏ごしし、次いで、表面抗体（蛍光色素コンジュゲート抗体）の染色（３つの抗体カクテルの組合せ）の前に、Ｆｃブロッキング剤でブロッキングした。表面抗体による染色の後、本発明者らは、細胞内マーカーの染色に備えるために、細胞を、洗浄し、固定し、１％のサポニン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する透過化緩衝液で透過化した。オステオカルシン抗体と、Ｋｉ－６７抗体とのカクテルによる染色に続き、ＦＡＣＳによる読み取りの前に、細胞の厳密な洗浄および最終的な細胞固定を行った。ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＦＡＣＳデータを収集し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用して、解析した。
蛍光活性化細胞分取（ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗ集団についてのＦＡＣＳ）
フローサイトメトリーにより、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋Ｋｉ６７＋ＯＣ＋Ｄ４５low疾患ドライバー細胞を分離するために、コンフルエントの早期継代（初代～４代目）異種ＶＩＣを、少なくとも１つの１５０ｃｍ２フラスコから解離させ、ＤＭＥＭ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、３％のＦＢＳ、および１ｍＭのＨＥＰＥＳからなるＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。３００ｇで、１０分間にわたる遠心分離の後、細胞ペレットを、４μＬのＡＰＣコンジュゲートＣＤ４４、３μＬのＡＦ４８８コンジュゲートＣＤ２９、ＡＰＣコンジュゲートＣＤ５９、およびＰＥコンジュゲートＣＤ７３、ならびに１μＬのＰＥコンジュゲートＣＤ４５を、マイクロチューブ内の２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に伴う抗体カクテル溶液中に再懸濁させた。全ての抗体原液は、０．５μｇ／μＬであった。本発明者らは、試料（複数可）を、暗所で保持し、かき回し、混合しながら、室温で、４０分間にわたりインキュベートした。本発明者らは、５００ｇで、５分間にわたりスピンダウンする前に、別のＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬを添加した。上清を廃棄した後で、本発明者らは、ＦＡＣＳ緩衝液による洗浄ステップを繰り返した。本発明者らは、最終ペレットを、４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。各々が、ＤＭＥＭ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、５％のＦＢＳ、および５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＦＡＣＳ分取液４ｍＬずつを伴う、１５ｍＬずつを受容するチューブ２本を準備した。ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗにマッチする細胞を、一方のチューブ内に分取し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａを使用して、残りの細胞を、他のチューブに分取した。分取効率は、純度最頻値が、９６～９９％の間であった。
ＩＨＣによるクロスバリデーションを伴う、石灰化大動脈弁組織のレーザー顕微解剖
２つの戦略：顕微鏡下における、外科用メスを伴う、手作業による解剖（ドナー弁尖１例）、およびＭＭＩ ＣｅｌｌＣｕｔ（商標）デバイスによるレーザー顕微解剖（ＬＭＤ）（ドナー弁尖２例）を使用して、本発明者らは、石灰化領域および非石灰化領域を解剖した。切片を、ヘマトキシリン－エオシンカクテル（ＭＭＩ）（細胞核を示す）でフラッシュ染色して、ＬＭＤ試料内に含有されるＶＩＣが、細胞を、弁内の指定された領域から抽出することを検証することにより、ＬＭＤ精度を増強した。次いで、分離細胞（ＬＭＤ試料を介する）を、質量分析（下記で、さらに記載する）のために処理した。
プロテオーム解析のための試料の調製
石灰化大動脈弁組織からのタンパク質の単離およびペプチドの消化
Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｒｅ ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ）を使用して、回収された細胞ペレットを、氷上、４℃（低温室）で、１５秒間ずつ、一定のデューティーサイクルで、４回にわたり超音波処理し、３０秒間隔で、２回のアウトプットを得た。さらなるペプチド調製は、製造元のプロトコールに厳密に従い、ｉＳＴ ９６ｘキット（ＰｒｅＯｍｉｃｓ ＧｍｂＨ）を使用して、１５μｇのタンパク質インプットに照らして正規化された試料について行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する、ＢＣＡタンパク質定量アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。
分化したＭＳＣおよびＶＩＣについての時間経過プロファイリングのための、タンパク質の単離およびペプチド消化
ＲＩＰＡ緩衝液中の細胞溶解物（大動脈弁石灰化についてのｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングを参照されたい）を融解させ、１ｍＬのシリンジを使用して、氷上で２０回にわたり、あらかじめ冷却されたゲージ２７注射針に、ゆっくりと通過させて、細胞の溶解を容易とし、完了させた。結果として得られるホモジネート溶解物の各々を、まず、上記で記載した通り、氷上で超音波処理することにより処理した。３０秒間にわたる激しいボルテックス混合に続く、４℃、１８，０００ｇで、３０分間にわたり高速度遠心分離を介して、２：１のクロロホルム：メタノール溶液を使用して、タンパク質ディスク沈殿物を、超音波処理されたホモジネートから抽出した。上下の液相を廃棄し、５０μｇのタンパク質インプットを使用して、各タンパク質ディスクを、ｉＳＴ ９６ｘキットの溶解緩衝液中で可溶化させた。
質量分析
データ依存型収集（ＤＤＡ；バイアスのないペプチドサンプリング）のために、本発明者らは、Ｅａｓｙ－Ｓｐｒａｙイオン源を前置し、Ｅａｓｙ－ｎＬＣ１０００ ＨＰＬＣポンプ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へとカップリングさせた、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ペプチドについて解析した。ペプチドは、二重カラム配置：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８ ｔｒａｐカラム、７５μｍ×２０ｍｍ；およびＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ ＬＣ加熱型（４５℃）カラム、７５μｍ×２５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分離した。勾配流量は、３００ｎＬ／分で、１２０分間にわたる、５～２１％の溶媒Ｂ（アセトニトリル／０．１％ギ酸）、１０分間にわたる、２１～３０％の溶媒Ｂに続く、５分間にわたる、９５％の溶媒Ｂであった。溶媒Ａは、０．１％のギ酸である。計器は、１２０Ｋの分解能に設定し、３秒間のサイクル時間内（３７５～１５００ｍ／ｚの走査範囲内）における、上位Ｎ個の前駆体イオンを、ペプチドシーケンシング（またはＭＳ／ＭＳ）のための衝突誘導型解離（ＣＩＤ、衝突エネルギー３０％）にかけた。
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ＰＤ）Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して、ＨＴ－ＳＥＱＵＥＳＴ検索アルゴリズムを使用して、ヒトＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２０１４年８月１日にダウンロードされた；配列の数は、８８，９４４に等しい）に対して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。前駆体質量の公差は、２０ｐｐｍに設定し、フラグメント質量の公差は、０．５Ｄａに設定した。メチオニン酸化およびＮ末端のアセチル化を、可変修飾として設定し、システインのカルバミドメチル化を、固定修飾として設定した。逆データベース（デコイ）結果に基づく、１％のＦＤＲに基づき、ペプチドにフィルターをかけた（Elias JE & Gygi SP (2007) Nature Methods 4(3):207-214；Kall et al., (2008) Journal of Proteome Research 7(1):29-34）。ＭＳ１では検出されたが、試料間でシーケンシングされなかったペプチド前駆体を定量するために、本発明者らは、「特徴マッピング」ノードを有効化した。クロマトグラフィーアライメントは、最大保持時間（ＲＴ）シフトを、１０分間とし、質量公差を、１０ｐｐｍとして行った。特徴のリンキングおよびマッピングの設定は、ＲＴ公差の最小値を０分間とし、質量公差を１０ｐｐｍとし、シグナル対ノイズの最小値を５とした。所与のタンパク質群に割り当てられるが、他の任意のタンパク質群内には存在しないペプチドを、固有と考えた。結果として、各タンパク質群は、単一のマスタータンパク質（ＰＤ群分け特徴）により表される。前駆体ペプチド存在量は、それらのクロマトグラフィー強度に基づき、全ペプチド量を、正規化のために使用した。本発明者らは、定量のために、タンパク質ごとに、固有ペプチドおよびレザーペプチドを使用した（Tyanova et al. (2016) Nature Protocols 11:2301）。２つまたはこれを超える固有のペプチドを伴うタンパク質は、さらなる解析のために検討した。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒからエクスポートされた各データセットに由来するタンパク質を、タンパク質中央値強度により正規化した。Ｑｌｕｃｏｒｅ Ｏｍｉｃｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ３．４（Ｑｌｕｃｏｒｅ ＡＢ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、タンパク質存在量傾向（ヒートマップおよび主成分分析）を解析した。Ｑｌｕｃｏｒｅを使用して、本発明者らはまた、弁のうちの、差次的に調節されたタンパク質の間の異なる領域も探索した。
ＭＳＣおよびＶＩＣについての時間経過プロテオミクスの解析ワークフロー
本発明者らによる既往の研究（Schlotter et al., Circulation. 2018 Jul 24;138(4):377-393）に基づき、本発明者らは、ＶＩＣについて、時間および培地条件に加えて、変動の第３の供給源は、ベースラインにおけるドナー間のばらつきであろうと予測した。ＶＩＣデータについての、初期ＰＣＡ解析は、ＰＣＡプロット軸上に、試料によりプロットされた距離が、ドナー効果により主に駆動されたものであり、このため、分化時間経過と関連する、基礎的生物学的過程を遮蔽することを示した。このドナー間のばらつきおよび効果は、一般線形化モデルを、Ｑｌｕｃｏｒｅ ＯＭＩＣｓ ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Wichura, In The Coordinate-Free Approach to Linear Models. Cambridge University Press (Chapter 6):110-136 (2006)）において使用する、因子消去により除去した。ＭＳＣ内およびＶＩＣ内で、同様に発現されたタンパク質を、ＯＭ誘導性分化の関数として同定するために、本発明者らは、一連のフィルタリングステップを実施した（図５Ｆ）。具体的に述べると、ＭＳＣでは、本発明者らは、ＯＭ中で、ＮＭと対比して差次的に発現されたタンパク質についてフィルターをかけ、並行して、本発明者らは、ＯＭ内で、その存在量が、経時的に増大したタンパク質についてフィルターをかけた。第１のステップとして、経時的な反復にわたるランク回帰（ｑ値≦０．００５）を使用して、タンパク質の存在量にフィルターをかけた。解析は、ＯＭ中およびＮＭ中の試料について、個別に行った。その存在量の変化が、細胞培養物により駆動されるタンパク質を除外するために、本発明者らは、ＯＭ条件およびＮＭ条件の両方について、フィルタリングステップにとどまるタンパク質を省き、ＭＳＣグローバルプロテオームのタンパク質を、３９９８から、３２８へと狭めた（ｑ値＜０．００５）。並行して、本発明者らは、それぞれ、７、１４、および２１日後における、ＯＭと対比したＮＭについての２群比較（カットオフ：ｑ値＜０．００５）により、元のＭＳＣグローバルプロテオームの差次的発現タンパク質（ＤＥＰ）についての統計学的フィルタリングを実施した。時点の交絡ではなく、培地条件に基づくフィルタリングを優先するために、本発明者らは、既に記載されている、時間についての因子消去を追加する結果として、ＯＭおよびＮＭの間のＤＥＰ（増加および減少を含む）を、３９９８から９５６へと軽減した（図５Ｆ）。
グローバルプロテオームにより、試料条件（ＭＳＣ－ＯＭ、ＭＳＣ－ＮＭ、ＤＤＰ－ＯＭ、ＤＤＰ－ＮＭ、ＭＩＸ－ＯＭ、およびＭＩＸ－ＮＭ）を、まず、２つの主要な比較：（１）ＭＳＣ－ＯＭの、ＭＳＣ－ＮＭと対比した比較（Krishnamurthy et al. (2017) Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology 62:40-57）、ならびに（２）ＤＤＰ－ＯＭ、ＤＤＰ－ＮＭ、ＭＩＸ－ＯＭ、およびＭＩＸ－ＮＭの比較として、個別に解析した。ＭＳＣ－ＯＭを、ＭＳＣ－ＮＭと対比する、差次的発現タンパク質の比較では、解析は、２つの方式：時点（ＯＭまたはＮＭの培養の、０週間後、１週間後、２週間後、および３週間後）間のランク回帰、および培地条件間の２群比較（ＮＭと対比したＯＭ）により行った。０週間後から、３週間後への時間経過につれて、ランク回帰を介してフィルタリングされる結果として得られる差次的発現タンパク質（ＤＥＰ）を併合し、「ＤＥＰ ＭＳＣ－ＯＭ」と名付けた。経時的に増大するＤＥＰ ＭＳＣ－ＯＭは、８６のタンパク質から構成される。
グローバルプロテオームによるＤＤＰおよびＭＩＸのプロテオミクスデータについての解析ワークフローでは、試料条件を、上記の通りに、２つの方式：時点間のランク回帰、および培地条件間の２群比較により解析した。したがって、これらのＶＩＣ試料についてのプロテオームの差違（図５Ｈ）を同定するために、本発明者らは、ＤＤＰおよびＭＩＸについて、全てのフィルタリングステップを、帰結としてのデータの収束が得られるまで、並行して実施した。第１のランク回帰フィルタリングステップが、ＶＩＣ－ＭＩＸについて、４５３８のタンパク質から、１００２のタンパク質への軽減を結果としてもたらした（ｑ値＜０．０５）のに対し、ＶＩＣ－ＤＤＰの軽減は、４４４４から、７４７であった。ＮＭ条件とＯＭ条件との２群比較は、ＭＩＸ ＶＩＣについてのフィルタリングにより、６７９のＤＥＰを除外し、ＤＤＰ ＶＩＣについてのフィルタリングにより、６２９のＤＥＰを除外した（ｑ値＜０．００５）。２つの統計学的フィルタリングスキームによるＤＥＰリストの間の重複は、各ＶＩＣ条件について、ＭＩＸ ＶＩＣについて３３０のＤＥＰを結果としてもたらし、ＤＤＰ ＶＩＣについて２８９のＤＥＰを結果としてもたらした。煩雑にならない、簡素な解析のために、本発明者らは、ＭＳＣのＤＥＰと同様に、時間経過にわたる増大傾向を伴うタンパク質のセット（１９７のタンパク質および１６９のタンパク質）に焦点を絞ることにより、３３０のＭＩＸ ＤＥＰのリストおよび２８９のＤＤＰ ＤＥＰのリストをさらに限定した。
これらのＮＭ由来ＤＥＰリストと対比したＯＭ由来ＤＥＰリスト、および時間経過由来ＤＥＰリストについての探索は、ＤＤＰとＭＩＸとの間の表現型の差違を説明しうるタンパク質をさらに明らかにしうる。ＭＩＸ－ＤＥＰ（１９７）と、ＤＤＰ－ＤＥＰ（１６９）との重複を除外することにより、非弁別的タンパク質（共通タンパク質）を、下流における解析から消去した（図５Ｆ）。ＭＩＸ（１９７）と、ＤＤＰ（１６９）との間には、９７の共通タンパク質が存在する一方、７１のタンパク質は、ＤＤＰに照らして除外的である（図５Ｉ）。これらの７１のタンパク質は、経時的に差次的に発現される一方、ＤＤＰの中では、ＮＭ条件とＯＭ条件との間で差次的に発現される。
大動脈弁石灰化についてのｉｎ ｖｉｔｒｏモデリング
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のために、時間経過設定において、プロテオミクスの他、単一細胞トランスクリプトミクスを行うように、異種ＶＩＣ、またはフローサイトメトリーにより単離されたＶＩＣを、細胞培養物中で拡大した。ＶＩＣに加えて、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－５００－０１１（商標））を、骨原性培地（ＯＭ）中では、陽性対照として使用し、増殖培地（ＧＭ）中では、陰性対照として使用した。０、７、１４、および２１日後の時点で、ポリエチレン製の細胞スクレーパーで、細胞を掻爬して回収することにより、細胞を、１％のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有する、ＨＰＬＣ用Ｈ２Ｏ中に１０％のＲＩＰＡ緩衝液（ＣＳＴ）中の、ＯＭ中およびＧＭ中に溶解させるか、または速やかに凍結させ、さらなる処理まで、－８０℃で保管した。加えて、将来の酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のために、培地を、時点を一致させて回収した。
機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（ＭＳＣおよびＶＩＣ）
骨原性分化、軟骨形成性分化、および脂肪生成性分化についてのアッセイを、培地を、増殖培地から、特化培地へと交換した、０、１、２、および３週間後において回収された、タンパク質、ＲＮＡ、および培地の試料について行った。２％のアリザリンレッド：アリザリンレッド（ＡＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％のアルシアンブルー（ＡＢ）、およびオイルレッドＯ（ＯＲＯ）（Ａｂｃａｍ）を、それぞれ、骨形成アッセイ、軟骨形成アッセイ、および脂肪生成アッセイに使用した。４８ウェルプレートまたは９６ウェルプレートに播種した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＡＲおよびＡＢについては、１０％のホルマリンにより、ＯＲＯについては、４％のＰＦＡにより、室温で、１５分間にわたり固定した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水による洗浄の後で、染料を添加した。ＯＲＯについては、２分間にわたるインキュベーションを伴う、プロピレングリコール（８５％）による別の洗浄ステップを行った。インキュベーション時間は、室温で、２０分間（ＡＲ）、１時間（ＡＢ）、および１５分間（ＯＲＯ）であった。ＡＲ（３回）およびＡＢ（４回）については、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水による洗浄が、染色に後続した。ＯＲＯについては、洗浄ステップは、以下：５分間にわたるプロピレングリコールに続く、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水による５回にわたる洗浄、ヘマトキシリンによる、２分間にわたるインキュベーションの通りであり、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水による、５回にわたる最終洗浄を行って、染色工程を終えた。ｉＰｈｏｎｅ７（Ａｐｐｌｅ）を使用して、写真を撮影し、放出された色素は、５５０ｎｍにおける分光光度法により定量した。
コンピュータによるプロテオームデータの解析およびネットワーク解析
ＦＤＲを＜０．５とする、多群比較を使用して、本発明者らは、異なる群にわたるプロテオームデータに、統計学的にフィルターをかけた。Ｑｌｕｃｏｒｅを使用して、本発明者らは、ＭｅｔａＣｏｒｅ（商標）（Ｃｌａｒｉｖａｔｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ／Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒｅｕｔｅｒｓ）のアルゴリズムを使用して、「ハブ」ノードの中に、重要な疾患関連および潜在的な治療標的を見出すように、経路富化を含む、ネットワークベースの解析を行った。加えて、本発明者らは、ヒトタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）についてのグローバルマップを使用して、フィルターをかけられたプロテオミクスデータおよび石灰化およびＤＤＰ表面マーカーによるサブネットワークを構築した。ヒトＰＰＩネットワークは、実験による実証を伴う、精選された物理的ＰＰＩであって、二元的相互作用、タンパク質複合体、酵素カップリング反応、シグナル伝達相互作用、キナーゼ－基質対、調節的相互作用、およびその詳細について既に記載されている（Menche J, et al. (2015) Science 347(6224):1257601）、文献から手作業で精選された相互作用を含むＰＰＩからなる。図７に描示されるサブネットワークは、Ｎｅｔｗｏｒｘ ｌｉｂｒａｒｙ ｖ１．９ ｉｎ Ｐｙｔｈｏｎ ｖ２．７．１０を使用して、フィルターをかけられたプロテオミクスデータおよび石灰化およびＤＤＰ表面マーカーを、それらの直接的な相互作用因子（一次近傍）と共に、ＰＰＩネットワークへとマッピングすることにより構築した。サブネットワーク間で共通のタンパク質を同定して、サブネットワーク間の重複を決定した。サブネットワーク間の重複の統計学的有意性は、フィッシャーの両側正確検定を使用して計算した。ネットワークは、Ｇｅｐｈｉ ｖ ０．９．２を使用して視覚化した。
単一細胞トランスクリプトミクス法
単一細胞の分離およびＩｎＤｒｏｐｓによるｃＤＮＡライブラリーの調製：面積１０ｃｍ２当たり１．０ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、室温で、３分間にわたりインキュベートすることにより、細胞を、培養物から解離させた。ＶＩＣ通常培地（５％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ）を添加して、酵素的消化を停止させた。単一細胞の分散および調製は、２０回にわたり、上下に、静かにピペッティングし、７０ｕｍの細胞ストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を介して、細胞を継代培養することにより達成した。次いで、既往の報告（Klein AM, et al. (2015) Cell 161(5):1187-1201）に従い、液滴内バーコードを使用して、細胞を、速やかに分取し、処理した。
ｃＤＮＡライブラリーの調製およびシーケンシング：ｃＤＮＡライブラリーは、品質管理解析を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより行う、ＣＥＬ－Ｓｅｑ／ ＭＡＲＳプロトコールを使用して調製した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｍｉｘを、プライマービーズと併せて、ハイドロゲル液滴内に、あらかじめ封入した。本発明者らは、マルチリード法を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑシーケンサーによりシーケンシングした。第１のリードが、試料のバーコード、およびユニバーサル分子識別子（ＵＭＩ）配列を収集する一方で、第２のリードは、結果を、参照トランスクリプトームへとマッピングした。シーケンシングは、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（ＭＢＣＦ）において行った。
単一細胞解析法
ＵＭＩでフィルターをかけた正規化カウントに照らした、生データの処理：シーケンシングの後、生ＦＡＳＴＱデータファイルに、ｂｃｂｉｏ／ｂｃｂｉｏ ｎｅｘｔｇｅｎ－ｓｅｑ、ｐｙｔｈｏｎツールキット（github.com/bcbio/bcbio-nextgen）、およびアルゴリズムパイプラインを介して、バイオインフォマティクス処理を施した。略述すると、細胞バーコードをマッチさせることにより、Ｎｅｘｔｓｅｑリードを、各細胞へと割り当てるのに続き、各リードについての、ＵＭＩの抽出を行った（Svensson et al. (2016) Power Analysis of Single Cell RNA-Sequencing Experiments. bioRxiv. dx.doi.org/10.1101/073692 and Nature Methods volume 14, pages381-387(2017)）。次いで、ＲａｐＭａｐ（Ciceri et al. (2016) Calcified Tissue International 99(5):472-480）（doi.org/10.1093/bioinformatics/btw277）を使用して、リードを、ｈｇ３８についてのトランスクリプトーム（トランス遺伝子により拡張された）に照らしてアライメントし、固有のＵＭＩ １つ当たり、転写物１つ当たりのリードカウントを、各細胞について生成した。フィルターをかけて、生データ中の任意のノイズを除去することを目的とする、マルチステップの品質管理を実施した。第１のステップとして、ｂｃｂｉｏフィルタリングパイプラインを使用して、１，０００リードを超える細胞だけを保持した。細胞１個当たりのリード、細胞１個当たりのＵＭＩ、細胞１個当たりの遺伝子、および細胞１個当たりのミトコンドリア比の分布を、カットオフをさらに規定し、これにより、高品質ＲＮＡを伴う細胞を同定するのに使用した。適用された、さらなるＱＣ計量は、検出遺伝子と対比したＵＭＩ、リードカウントと対比したＵＭＩ、および新規性スコアを含む。新規性スコア法は、ＵＭＩ １つ当たりの遺伝子を注視することにより、カウント１つ当たりの検出遺伝子が、他の細胞より少ない細胞にフィルターをかける一助となる。最終データは、各試料についての、細胞×遺伝子行列の形態でエクスポートした。データの作成は、Ｈａｒｖａｒｄ Ｔ．Ｃｈａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて行った。
ＳｅｑＧｅｑ解析：ＳｅｑＧｅｑソフトウェアを、ＦｌｏｗＪｏ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（exchange.flowjo.com）からインストールされた、ＳｅｑＧｅｑプラグインと共に使用して、ＱＣを経たデータについて解析した。第１のステップとして、解析に必要な、各試料条件細胞の集団を、１つのファイルとして連結した。この連結ファイルによる細胞分散プロットを使用して、ｂｃｂｉｏ ＱＣダブレット除外アルゴリズムから漏出する、任意のダブレットを除外した。本発明者らによるｂｃｂｉｏ後解析では、ダブレットがほとんど見出されなかった。遺伝子分散プロットを使用して、グローバルにゲートをかけて、高発現遺伝子および極低発現遺伝子（細胞１個当たりの遺伝子≦１０）を除外した。全ての細胞の中で、極高発現遺伝子が、ハウスキーピング特徴、またはミトコンドリア遺伝子を示しうる一方で、極低発現遺伝子（発現細胞が、≦１０個である）は、下流におけるクラスター化に対して、ノイズをもたらし、低品質リードとなる可能性が最も高いので、フィルターをかけて、これらの「異常値」遺伝子を除外することが必要であった。１０～１，５００×１０～１，５００のゲート域内に収まる遺伝子データ点は、異常値遺伝子（細胞１個当たりのカウントが≧１，５００である高発現遺伝子、または細胞１個当たりのカウントが≦１０である低発現遺伝子）を含まない、「異常値フィルターをかけた遺伝子」と表示した。異常値フィルターをかけた遺伝子セットだけを使用する遺伝子ビューへと切り替えることにより、本発明者らは、遺伝子を、「遺伝子分散特徴」軸と対比した、「細胞発現特徴」軸により結合した散布図にプロットし、細胞の間で大幅に発現を変動させる、高分散遺伝子（ＨＤＧ）についてゲートをかけた。このゲートは、「対照」をスパイクされたＲＮＡ分子種と一致するプロット座標を含有する領域を除外した。これらの外部ＲＮＡ対照コンソーシアム（ＥＲＣＣ）ＲＮＡを、ＩｎＤｒｏｐｓによりスパイクされた配列は、本発明者らによる試料内の、非変動対照ＲＮＡ分子種として用いられ、ＨＤＧゲーティング戦略の適切な境界の他に、試料間のバッチによるばらつきについての検査も確認した。ＨＤＧ遺伝子セットを、主成分分析（ＰＣＡ）による、単一細胞の視覚化のための計算のベースとして使用した。
高次元性の軽減はまず、ＨＤＧ遺伝子セットの、分散／変動が高度な遺伝子発現を使用するＰＣＡによって行った。結果として得られる上位２５のＰＣＡ成分は、細胞間における遺伝子発現のばらつきの大部分を説明する遺伝子パラメータについて記載する。これらは、試料条件、試料の細胞型、または各試料条件内における、細胞集団の内因性の異種性に起因しうる。その後、上位１５のＰＣＡ成分を使用して、ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）を介して、非線形次元軽減を行った。結果として得られるｔ－ＳＮＥプロットは、グローバルな遺伝子のばらつきに基づき、細胞をクラスター化した。マルチグラフのカラーマッピングと共に、ｔ－ＳＮＥ空間内の細胞「アイランド」の表現型は明らかとなる。高度に変動性の遺伝子に対する、ＱＣ～ＰＣＡ～ｔ－ＳＮＥマッピングによる段階的なフィルタリングの使用は、細胞クラスターの「判定」の明確化において、特に、有効であった。
単一細胞トランスクリプトミクスの差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）解析：まず、全ての試料６例（ＭＳＣ－ＯＭ、ＭＳＣ－ＮＭ、ＰＵＲ－ＯＭ、ＰＵＲ－ＮＭ、ＭＩＸ－ＯＭ、およびＭＩＸ－ＮＭ）を、１つの連結データフレームとして解析した後で、本発明者らは、ＭＳＣ試料が、ＶＩＣ試料とは顕著に異なる形でクラスタリングする傾向があることは、骨原性培地（ＯＭ）または通常培地（ＮＭ）の分極化効果にもかかわらず、少数の遺伝子発現パターンは、ＶＩＣとＭＳＣとの間で共通であることを示唆することを見出した。ＯＭモデル化ＶＩＣと、原型的血管石灰化モデル（ＯＭ）におけるＭＳＣとの間で、潜在的に共通の生物学的過程を導出するために、本発明者らは、ＭＳＣおよびＶＩＣを、個別の連結ファイルとして解析した。次いで、結果として得られる、差次的に発現される２つの個別の遺伝子セット（ＭＳＣ特異的およびＶＩＣ特異的）を、２つの個別のＯＭＩＣサマリーとして解析した。したがって、本発明者らはまず、ＭＳＣデータセットを、個別に解析した。本発明者らは、上記のＳｅｑＧｅｑを使用して、ＭＳＣデータセットを処理した。今回は、本発明者らは、ＭＳＣデータセットから、ＨＤＧだけを使用した。結果として得られるＰＣＡ処理は、上位６つのＰＣが、ＭＳＣデータセットのばらつきの大半を説明するため、上位６つの主成分（ＰＣ）だけが、ｔＳＮＥプロットを創出するのに必要とされることを明らかにした。次いで、細胞を、ｋ平均法による６つのクラスターへと分離することを意図して、これらの上位６つのＰＣ成分を使用して、ｋ平均によるクラスター化を行った。ＭＳＣのばらつきの大半を説明するのに６つのＰＣＡ成分だけを要するため、本発明者らは、本発明者らの対象を、６つのクラスターに限定することに決定した。直感的に、本発明者らは、これを、ばらつきの大半を説明するのに、６つのＰＣＡ成分だけを要する場合に、ＭＳＣデータセットは、最低限、６つの「コミュニティー」へと分離されうるように解釈した。一層よく分離されたｔＳＮＥプロットを再創出するために、本発明者らは、今回は、６つのＰＣＡ成分＋ｋ平均成分（ｋ平均クラスター化に基づく、クラス／クラスターの割当て）を使用する、冗長なｔＳＮＥプロッティングを単純に実施し、結果として二次的な最終ｔＳＮＥプロットをもたらした（図４Ａ～４Ｂ）。
本発明者らは、ＶＩＣデータセットの類似性を処理し、ここでもまた、ＶＩＣデータセットにおけるばらつきの大半を説明しうる、上位６つだけのＰＣＡ成分が存在することを見出した。このために、本発明者らは、データを、ＭＳＣ同様に処理し、ＶＩＣ ｋ平均クラスターの良好な分離を示す、最終的なｔＳＮＥプロットを得た（図４Ｅ～４Ｆ）。
本発明者らはまず、－ｌｏｇ（１０）ｑ値（偽発見率：ＦＤＲ）と対比した倍数変化についてのボルカノプロットにより、ＭＳＣ－ＯＭ試料の間における、差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）の増大についてフィルターをかけた。ＭＳＣ－ＯＭ中には、ｑ値≦０．０５において、倍数変化が、ＭＳＣ－ＮＭと比べて、≧１．５に増大するＤＥＧが、４３存在した（図４Ｄ）。しかし、各ＭＳＣ－ＯＭクラスターの間で比較したところ、本発明者らは、１つのＭＳＣ－ＯＭ ｋ平均クラスターを、別のＭＳＣ－ＯＭ ｋ平均クラスターに対して、固有にマーキングするＤＥＧのセットが存在しないことを見出したことは、細胞系であるＭＳＣは、当初予測したよりも、異種性がはるかに小さいことを示唆する。しかし、ｔＳＮＥ、およびｋクラスターの差別化の後でプロットされる、みかけの異種性は、ＭＳＣ－ＯＭ細胞のクラスター化が、主に、同じｋ平均クラスターに属するＭＳＣ－ＯＭ細胞内の、これらの４３のＯＭ－ＤＥＧの各々についての、転写物カウント（発現強度）の類似性に依存したという事実により説明される。さらに、公知の骨芽細胞関連するマーカーである、ＳＰＡＲＣ（１１）を精査すること（図４Ｃおよび４Ｄ）により、本発明者らは、ＭＳＣ ｋ４クラスターを、ＭＳＣ細胞の中で、最も「石灰化促進性の」クラスターとして同定した。ＦＣ≧１．５、ｑ≦０．０５で、ｋ４ ＭＳＣにおいて、ｋ１ ＭＳＣ（ＭＳＣ－ＮＭ）を上回るＤＥＧだけにフィルターをかけることにより本発明者らは、これらもまた、ＶＩＣについての石灰化標的として適用可能でありうる、５０のＤＥＧを同定した。
本発明者らは、ＶＩＣデータセットの類似性について解析し、ｋ平均法によるｋ４クラスターが、探索するのに、最も興味深いクラスターであることを同定した（下記の実施例を参照されたい）。したがって、本発明者らは、ボルカノプロットをプロットし、倍数変化が≧１．５であり、ｑ≦０．０５である遺伝子についてゲートをかけることにより、ＤＥＧの富化を同定するように、ｋ４クラスターを、ＶＩＣ－ＮＭ細胞（ＤＤＰおよびＭＩＸ）の大半を含有する、ｋ１クラスターおよびｋ２クラスターの組合せに対して比較した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるサイレンシング
ヒトＡＯＶ（ｎ＝３）に由来するＶＩＣ細胞において、サイレンシング実験を実施した。細胞を、４８ウェルプレートに播種し、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＭＡＯＡ、およびｓｉＣＴＨＲＣ１で処理した。この実験のために、製造元のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した。トランスフェクションの前に、細胞を、通常培地および骨原性培地で処理した。各ｓｉＲＮＡを、各培地条件で使用して、サイレンシング実験を実施した。細胞は、ＲＮＡ抽出のための、２つの異なる時点（３日後および１０日後）において採取した。ＴＮＡＰ活性のためには、細胞を、１０日後に採取した。トランスフェクションは、３日ごとに繰り返した。
ＲＮＡの精製およびｃＤＮＡの合成
ＲＮＡの単離は、Ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＲＮＡｓｐｉｎ ｍｉｎｉキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、型番：２５－０５００－７２）を使用して達した。１％の２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）と混合された、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＲＮＡｓｐｉｎ Ｍｉｎｉキット（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によるＲＮＡ溶解液を、接着細胞へと添加した。各溶解物は、さらに精製まで、－３０℃で凍結させた。製造元のプロトコールに従い、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＩｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＲＮＡｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ単離キット（ロット番号：１７１１／００１）により、ＲＮＡ精製を行った。高濃度のＲＮＡのためには、最終的な精製ＲＮＡを、１６μＬのＲＮアーゼ非含有Ｈ２Ｏ中で溶離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ２００９（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、各試料の濃度を測定した。使用されるＲＮＡの量を、試料間で正規化するために、本発明者らは、各試料が、５００ｎｇのＲＮＡを有するのに必要とされる容量を計算した。ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。前記容量のＲＮＡを、ストリップチューブへと添加し、ヌクレアーゼ非含有水で、１５μＬの全容量へと希釈した。本発明者らは、ストリップチューブ１本当たり、４μＬの反応ミックス、および１μＬの逆転写酵素（ＲＴ）を添加した。遠心分離の後、調製されたストリップチューブプレートを、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２７２０ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒにおけるｃＤＮＡ合成のために処理した。最終的な試料を、４℃で保管した。
前増幅
Ｐｅｒｆｅｃｔａ ＰｒｅＡｍｐ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（５×）キット（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して、ｃＤＮＡ試料の前増幅を実施した。２００μｌの全容量に到達するように、各プライマー２μｌずつと、さらなるＴ１０Ｅ０，１緩衝液（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍｌのＥＤＴＡ）とを使用するアッセイプライマープールを作製した。４μｌのＰｅｒｆｅＣＴａ ＰｒｅＡｍｐｌ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（５×）、２．５μｌのＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ Ｐｏｏｌ、５μｌのｃＤＮＡ、および８．５μｌのヌクレアーゼ非含有水を使用して、全容量を２０ｕｌとする、ＴａｑＭａｎアッセイのための前増幅反応混合物を混合した。これらのステップ：初期変性ステップ（９５℃で、２分間にわたる）、前増幅サイクリングステップ（９５℃で、１０秒間；６０℃で、３分間にわたる１４サイクル）、および保持ステップ（４℃）に従い、各試料を、熱サイクル内でインキュベートした。次いで、共時的試料を、ｑＰＣＲのために使用した。
ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）
ｑＰＣＲ解析のために、本発明者らは、ウェル１つ当たり、２μｌのＰｒｅＡｍｐ ｃＤＮＡ、および８μｌのプライマーカクテルを伴う、３８４ウェルプレートを使用した。５μｌのＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２Ｘ）、２．７５μｌのヌクレアーゼ非含有水（ＱｕａｎｔａＢｉｏ）、および０．２５μｌずつの、それぞれのプライマーにより、プライマーカクテルを作製した。ＰＣＲは、７９０２０ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを使用して実施した。データ解析は、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ ８を使用して行った。
組織非特異的アルカリホスファターゼ活性（ＴＮＡＰ）アッセイ
ＴＮＡＰアッセイは、製造元により推奨されるプロトコールに従い、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ、型番：Ｋ４１２－５００）を使用して行った。試料溶解物の各々は、４８ウェルプレートのウェルから、三連で採取した。測定値は、検量線に対して較正し、タンパク質量により正規化した。
石灰化弁についての免疫組織化学
明白な３層構造を伴う、ＣＡＶＤ患者の大動脈弁尖（ｎ＝１０）の組織切片を、推定の線維芽細胞および前駆体マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４６、ＮＡＮＯＧ、Ｃ－Ｋｉｔ、オステオカルシン、およびビメンチンについて免疫染色した。ＭＡＯＡおよびＣＴＨＲＣを染色するために、ＣＡＶＤ患者から供給された弁尖の個別のセット（ｎ＝３）を使用した。本明細書で記載される、標準的な免疫染色プロトコールを、９０分間にわたりなされる、一次抗体を伴うインキュベーションに続く、従来の二次抗体－ビオチン－ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼベースの検出により実施した。画像走査（Ｏｍｎｙｘ ＶＬ４スキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、および画像処理（ｓｃｉ－ｋｉｔ ｐｙｔｈｏｎパッケージ、またはＮｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ ３．２０による）の前に、全ての切片を、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により対比染色した。
細胞の分離および培養
大動脈弁由来間質細胞（ＶＩＣ）は、ＣＡＶＤ患者における、大動脈弁置換術時に得られた大動脈弁尖（ｎ＝１２）に由来した。組織学的解析およびＶＩＣの分離のために、各弁尖を解剖した。ＶＩＣを、コラゲナーゼＩＡ－Ｓ消化（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）により分離した。フローサイトメトリーもしくは分取のために、細胞を、速やかに処理するか、または１０％のＦＢＳを伴うＤＭＥＭ中で培養し、次いで、下流におけるアッセイのために、さらに拡大した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＡＴＣＣ（ＰＣＳ－５００－０１１）から得、拡大した。第４継代において、細胞は、未分化細胞（通常培地、ＮＭ）、または分化細胞（骨原性培地、ＯＭ；脂肪生成性培地、ＡＭ；または軟骨形成性培地、ＣＭ）として、後続の実験のための参照試料条件としての使用への準備が整った。
ハイスループットスクリーニングフローサイトメトリー（ＨＴＳ－ＦＣ）およびＦＡＣＳ分取
製造元の指示書に従い、石灰化大動脈弁のＶＩＣおよびＭＳＣ（２週間にわたる、ＮＭ条件下、ＯＭ条件下、およびＡＭ条件下における分化の後の）に、ハイスループットスクリーニングフローサイトメトリー（ＨＴＳ－ＦＣ）を施した。組織を消化した直後に、十分な弁（ｎ＝８）を回収するまで、各弁ドナーについて、細胞を低温保存し、次いで、ＨＴＳ－ＦＣを実施するためにプールした。同様に、表面マーカーの発現についてプロファイリングするように、ウェル１つ当たり２４２の固有の単一抗体表面マーカーキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｙｏｐｌａｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐａｎｅｌ）を使用して、培養されたＭＳＣ（２週間にわたる、ＮＭ条件下、ＯＭ条件下、およびＡＭ条件の後における）も、ＨＴＳ－ＦＣのために処理した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを使用して、ＨＴＳ－ＦＣを読み取り、ＣｙｔｏｂａｎｋおよびＦｌｏｗＪｏ １０．７ソフトウェアを使用して、データを解析した。ＭｅｔａＣｏｒｅ（Ｃｌａｒｉｖａｔｅ）を使用して、ネットワーク解析を行い、ＣｙｔｏｓｃａｐｅおよびＧｅｐｈｉを使用して査定した。ＶＩＣについて、表面マーカー疾患ドライバー集団（ＤＤＰ）を同定したら、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける拡大、およびさらなる機能的評価のために、細胞を、ＦＡＣＳにより分取した。
単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング
ＦＡＣＳにより分取されたＤＤＰ－ＶＩＣ、および非分取ＭＩＸ－ＶＩＣを、酵素的に分散された石灰化大動脈弁尖から得、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、第４の継代まで繁殖させ、ここで、両方のＶＩＣ型を、ＮＭまたはＯＭ（刺激培養物）中で培養した。骨原性分化を、アリザリンレッド染色により評価した。同様に、ＭＳＣの第４の継代を、比較のために組み入れた。細胞は、刺激培養の１４日目に採取し、単一細胞（ｓｃ）捕捉、およびＩｎＤｒｏｐｓを使用するｓｃ－ｍＲＮＡシーケンシングのために処理した。試料条件１つ当たりの細胞２０００個の限界、および細胞１個当たりの遺伝子リード少なくとも１０００を設定した。ｂｃｂｉｏソフトウェアおよびＳｅｑＧｅｑソフトウェアを使用して、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを解析した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏプロテオミクスプロファイリング
ＭＳＣ（反復のｎ＝３）、ＤＤＰ－ＶＩＣ、およびＭＩＸ－ＶＩＣ（ドナーのｎ＝３）を、ＮＭ中およびＯＭ中で、最大で、２１日間にわたり培養した。いくつかの時点：０、７、１４、および２１日目に試料を採取し、次いで、既に示されている通りに、処理し、プロテオミクスについて解析した（Krishnamurthy VK, et al. (2017) Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology 62:40-57）。データの解析は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ＰＤ）Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＱｌｕｃｏｒｅ Ｏｍｉｃｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ３．４（Ｑｌｕｃｏｒｅ ＡＢ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）使用して行った。
機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＣＡＶＤ弁から分離されたＶＩＣ細胞を、機能的アッセイの前に、第３継代まで培養して、同定された潜在的石灰化標的である、ＭＡＯＡおよびＣＴＨＲＣをバリデーションした。細胞を、１０日目まで、非特異的ｓｉＲＮＡ、およびＭＡＯＡ ｓｉＲＮＡまたはＣＴＨＲＣ ｓｉＲＮＡで処理した。細胞内アルカリホスファターゼアッセイ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＣＡ）、およびｑＰＣＲ（ＭＡＯＡ、ＣＴＨＲＣ、オステオカルシン、およびビメンチン）を、試料条件反復ウェル上で実施した。ＭＡＯＡの阻害の機能的効果をさらに実証するために、低分子阻害剤である、モクロベミドおよびビフェメランを使用した。
[実施例１]
ＣＤ４４および上位の発現細胞表面マーカーは、ＭＳＣとＶＩＣとの間で共通である
本発明者らは、前駆体様亜集団の中の異種ＶＩＣが、ヒトＣＡＶＤにおける石灰化を駆動しうることを仮定した。この考えについて探索するために、本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（ＡＴＣＣから、市販品として購入される細胞系）を、実験における参照基準としての対照として拡大した。８例のさらなるドナーから採取されたＶＩＣをプールし、２４２の表面マーカーを含むライブラリーの、ハイスループットスクリーニング－フローサイトメトリー（ＨＴＳ－ＦＣ）によるプロファイリングのために、速やかに処理した（図１Ａ）。この比較は、罹患ＶＩＣ、ならびに未分化ＭＳＣ（ＭＳＣ－ＮＭ）、骨原性（ＭＳＣ－ＯＭ）表現型、および脂肪生成性（ＭＳＣ－ＡＭ）表現型へと分化したＭＳＣによる、マーカーの共通の発現を決定する（図１Ａ）。
プールされたＶＩＣ内の各表面マーカーについての陽性染色パーセント、およびＭＳＣの分化条件を、百分位数によりランク付けした。次いで、本発明者らは、公知のＭＳＣ表面マーカーの組入れ／除外についての既往の報告（３５、３６）に基づき、陽性カットオフパーセントを判定した。本発明者らは、８５％のカットオフでは、１６の表面マーカー、すなわち：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６４、ベータ２－マイクロチューブリン、ＨＬＡ Ａ－Ｂ－Ｃ、およびＨＬＡ－Ｂ２が、３つのＭＳＣ条件（ＮＭ、ＯＭ、およびＡＭ）全て、およびＶＩＣにおいて、一貫して、＞８５％パーセントの陽性であると評定されることを見出した。これに対し、原型的造血マーカーである、ＣＤ３８およびＣＤ４５ｂの陽性画分の百分率は、４例の試料にわたり可変的であった。
これらの１６の表面マーカーに、さらにフィルターをかけ、優先順位をつけるために、本発明者らは、ネットワーク法を採用して、これらのタンパク質が、どの程度、石灰化関連分子と関連するのかを決定した。全ての核化細胞内で発現されることが公知である（３７）ので、解析では、ベータ２－マイクロチューブリン、ＨＬＡ Ａ－Ｂ－Ｃ、およびＨＬＡ－Ｂ２を除外した。フローサイトメトリー（ＦＣ）プロファイルは、円形ヒートマップとした（図１Ｂ）。残る１３の表面タンパク質を、精選されたタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）ネットワークへとマッピングすることにより、本発明者らは、指向性インタラクトームネットワーク（図１Ｂ、内側パネル）を構築した。ネットワークを、石灰化へとアンカリングするために、本発明者らは、４つの公知の石灰化マーカー（オステオカルシン、組織非特異性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）、ＲＵＮＸ２、およびオステオポンチン）を、「標的」ノード（青ノード、図１Ｂ）としてシードした（３８～４０）。各ＣＤマーカーは、「供給源」ノード（赤ノード、図１Ｂ）である。本発明者らは、最大で１つの「リンキング」ノードを介して、供給源ノードと、標的ノードとを接続する、ネットワークアルゴリズム（ＭｅｔａＣｏｒｅ）を使用した。生成されたリンキングタンパク質は、幹細胞増殖マーカーである、ＮＡＮＯＧを含んだ（４１）。これらのリンクにより、本発明者らは、１３の供給源ノードを、媒介中心性およびエッジカウントに基づきランク付けし、ＣＤ４４を、中心ハブノードとして明らかにした（図１Ｃ）。
[実施例２]
ＣＤ４４の発現は、大動脈弁尖内の石灰化領域と近接する
ＶＩＣ亜集団の潜在的な細胞起源を画定するために、ＣＡＶＤ患者に由来する大動脈弁尖を、大動脈弁置換術から得、免疫組織化学（ＩＨＣ；ｎ＝１０）のために切片化した。本発明者らは、弁尖の長手方向の断面内で、前駆体マーカー（１２、３５、４２）および骨原性マーカー（４３）：ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４６、ＮＡＮＯＧ、Ｃ－Ｋｉｔ、オステオカルシン、およびビメンチンについて評価した。層特異的なマーカー分布を特徴付けるために、本発明者らは、ｓｃｉ－ｋｉｔリポジトリーによる、Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、染色された弁尖断面の全体についての組織学走査を、３つの解剖学層（線維層、スポンジ層、および心室関連層）へと分割した。線維層は、心室関連層より石灰化誘発の傾向がある（６）。次いで、上記で言及されたマーカーについての陽性染色細胞パーセントを検討する層間比較を行った（代表的弁；図１Ｄ）。ＣＤ４４は、石灰化部位と典型的に関連する、線維層内の全ての細胞の中で、最高の陽性染色パーセントを示した。これに対し、心室関連層内では、その相対発現は低下した（図１Ｅ；ｐ＜０．０００１）。この非石灰化領域へと向かう発現低下のパターンは、他の被験マーカーのうちのいずれについても見られなかった（図１Ｅ）。
[実施例３]
ＣＤ４４ｈｉｇｈＶＩＣは、石灰化領域と機能的かつ空間的に関連する
次いで、本発明者らは、規定の組織学的切片化ベースの方法（図１Ａ）と異なり、３Ｄ組織アーキテクチャーを保存する、免疫組織化学ベースの組織拡散法（図２Ａ～２Ｄ；ドナーのｎ＝４）を実施することにより、ＣＤ４４が、石灰化と共局在化する領域について、緊密に検討した。石灰化を取り巻く領域を解剖し（図２Ａ～２Ｂ）、組織細胞拡散解析（図２Ｃ）およびＣＤ４４免疫染色（図２Ｄ）のために処理した。ＣＤ４４発現細胞のクラスターは、微小石灰化に近似する外見を呈した（代表的画像：図２Ｄ）。
Ｚスタック共焦点蛍光顕微鏡法は、微小石灰化の周囲領域内のＣＤ４４染色と重複するオステオカルシンシグナルを裏付けた（図２Ｅ）。被験大動脈弁尖では、本発明者らは、ＣＤ４４シグナルおよびオステオカルシンシグナルの両方を有する細胞の亜群がまた、非定型の核形態も擁することを観察した（図２Ｅ～２Ｊ）。これらの非定型核は、ヒト器官形成時に見出されるメタカリオティック前駆細胞（１５）（図２Ｆ；右）を想起させる、釣り鐘型カップ状の積層（図２Ｆ；左）として現れうる。したがって、カップ状の核を伴う、これらのＣＤ４４陽性ＶＩＣ（図２Ｇ～２Ｊ；黄色矢印）は、前駆細胞のプールの一部でありうる。本発明者らは、石灰化領域（非定型の核形態を伴う細胞を含有するニッチ）近傍で、ＣＤ４４／ＣＤ２９二重陽性細胞の間の核形態を、石灰化から隔たった、ＣＤ４４だけについて陽性であり、ＣＤ２９については陰性である細胞と対比して測定した。面積、稠密性、および偏心性などの核形態測定の測定値は、ＶＩＣ群間の統計学的有意差を示す（図３Ａ～３Ｈ）。共焦点画像は、倍率４０倍で撮像し、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒを使用して解析した（図３Ｆ～３Ｇ）。統計学的検定は、ウィルコクソンの非パラメトリックランクサムにより行った。
ＣＤ４４陽性ＶＩＣの石灰化可能性について検討するために、本発明者らは、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、それらを、酵素的に消化された弁組織から直接分取した。本発明者らは、一般的なＣＤ４４陽性細胞集団内で、ＣＤ４４ｈｉｇｈＶＩＣを分取した（図４Ａ）。本発明者らは、ＣＤ４４＋ゲーティングＶＩＣ（アロフィコシアニン（ＡＰＣ）平均値強度蛍光（ＭＩＦ）≧１０３）およびＣＤ４４ｈｉｇｈＶＩＣ（ＡＰＣ ＭＩＦ≧１０４）の両方を分取した。ＣＤ４４ｈｉｇｈ集団、ＣＤ４４陽性集団、非分取混合集団である。ＶＩＣを、通常培地（ＮＭ）条件下、および２つの石灰化促進培地条件（骨原性培地（ＯＭ）および高リン酸培地（ＰＭ））下で培養した。ＯＭが、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）依存性無機化条件（４４）であるのに対し、ＰＭは、アルカリホスファターゼ非依存性無機化条件（４５）である。石灰化のための、２１日間にわたる培養の後における細胞（アリザリンレッド染色）である。ＣＤ４４ｈｉｇｈＶＩＣおよびＣＤ４４陽性ＶＩＣは、ＯＭ条件およびＰＭ条件のいずれの下でも石灰化したが、ＮＭ条件下では石灰化しなかった。ＣＤ４４ｈｉｇｈＶＩＣは、ＣＤ４４陽性ＶＩＣよりたやすく石灰化した（図４Ａ）。非分取混合（ＭＩＸ）ＶＩＣ集団は、ＰＭ条件下だけで石灰化した。さらに、ＰＭ培地中で培養された、ＣＤ４４ ｓｉＲＮＡ処理ＶＩＣは、石灰化を、３週間後におけるＮＭ培地中と同等なレベルまで軽減した（図３Ａ）。
[実施例４]
骨原性ＣＤ４４ｈｉｇｈ細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ５９、およびＣＤ７３を共発現させる
ここまでのところ、本発明者らの知見は、高石灰化可能性が、ＶＩＣ内のＣＤ４４の発現と関連することを裏付ける。高石灰化可能性を伴う、この前駆体様ＶＩＣ集団のフィンガープリントをさらに同定するために、本発明者らは、文献引用抄録検索を使用して、「間葉系幹細胞」、「間葉系前駆細胞」、および「石灰化」という用語との関連について、１３の（供給源ノード）マーカー全て（図１Ｂ）を検索した。「間葉系幹細胞」または「間葉系前駆細胞」を引用する抄録について、引用度が最も高度な８つのマーカーは、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ１３、ＣＤ５５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１４７、およびＣＤ５９（引用度が高度～低度の順）であった。「石灰化」という用語と重複するマーカーについて、ランクは、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ５９、ＣＤ５５、およびＣＤ４９ｅであった。２つのリストの重複は、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１３、ＣＤ７３、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＣＤ４９ｅ（ＣＤ２９の結合パートナー）をもたらした。したがって、本発明者らは、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４４ｈｉｇｈＶＩＣ内の、これらの７つのマーカーの共発現についてアッセイした（ドナーのｎ＝３）。非間葉系由来細胞型についての対照として、本発明者らは、造血マーカーである、ＣＤ４５についてモニタリングした（３２）。本発明者らは、ＣＤ４４ｈｉｇｈ集団が、ＣＤ２９、ＣＤ５９、およびＣＤ７３について陽性であり（図４Ｂ）、ＣＤ１３およびＣＤ５５について陰性であることを見出した。全ての被験ＶＩＣ集団は、ＣＤ４５について、低度の染色を呈した（図４Ｂ）。ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ５９、およびオステオカルシンについて陽性の細胞についての、ＩＨＣベースの、定量的な、石灰化からの距離のマッピングは、石灰化小節の近傍における、これらのマーカーの高度の発現を示した。したがって、本発明者らは、石灰化可能性が高い、本発明者らによる新規の前駆体様ＶＩＣ集団を、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗとして規定した。
次いで、３例のドナーに由来する大動脈弁尖の低温切片を、オステオカルシン、α－ＳＭＡ（筋線維芽細胞についてのマーカー）およびＫｉ６７（細胞増殖についての核マーカー（４６））に加えた、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ５９、およびＣＤ７３について免疫染色した。石灰化と近接するＶＩＣは、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ２９、ＣＤ７３（図３Ｃ）、オステオカルシン、およびＫｉ６７と免疫反応性であり、ビメンチンと局在化した。全体として、これらの結果は、ＣＡＶＤにおけるＶＩＣが、石灰化可能性が高いＣＤ４４陽性細胞の亜集団を含有し、このＶＩＣ亜集団が、前駆体関連表現型である、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗを発現させるＶＩＣのサブセットを含むことを裏付けた。
[実施例５]
ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗＶＩＣ表現型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＳＣ様特性を模倣する
次いで、本発明者らは、混合集団（ＭＩＸ－ＶＩＣ）と名付けられる非分取異種ＶＩＣと対称的な、疾患ドライバー集団（ＤＤＰ－ＶＩＣ）と名付けられる、このＶＩＣ亜集団の多能性能力について調べた。本発明者らは、さらなるＣＡＶＤ弁尖（ドナーのｎ＝９）から、ＤＤＰ ＶＩＣおよびＭＩＸ ＶＩＣを、単離、分取、培養し、ＭＳＣを、対照として使用した。全てのＭＳＣを、ＯＭ中、脂肪生成性培地（ＡＭ）中、軟骨形成性培地（ＣＭ）中、またはＮＭ中で、３週間にわたり培養し（図４Ｄ）、それらの骨原可能性、脂肪生成可能性、および軟骨形成可能性について評価した。アリザリンレッド染色、オイルレッドＯ染色、およびアルシアンブルー染色は、ＤＤＰ集団およびＭＳＣ集団の両方について、それぞれ、骨原性分化および脂肪生成性分化を検出したが、ＭＩＸ集団については、これらを検出しなかった。軟骨形成性培地中のＤＤＰは、陽性アルシアンブルー染色を示したが、軟骨形成性培地中のＭＳＣは、これを示さなかった（画像は示さない）。これらの知見は、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２９＋ＣＤ５９＋ＣＤ７３＋ＣＤ４５ｌｏｗＤＤＰ ＶＩＣが、骨原可能性が高い、多能性の前駆細胞様特性を有することを示唆する。
[実施例６]
マスサイトメトリーは、ＤＤＰ－ＶＩＣ前駆体様表現型を検証する
本発明者らは、大動脈弁尖の石灰化領域を、非石灰化領域と対比して比較することにより、ＤＤＰ－ＶＩＣの表現型特徴を査定するのに、マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）を使用した。ＣｙＴＯＦは、多色フローサイトメトリーと比較して、スペクトルの重複を最小限として、より多くの表面マーカーについてのスクリーニングと、細胞内マーカーについてのスクリーニングとを、同時にもたらす（４７）。本発明者らは、ＶＩＣを、ＣＡＶＤ弁尖（ｎ＝４）の石灰化部分および非石灰化部分から分離し、後続のＣｙＴＯＦのために、細胞を、近年、本発明者ら（６）により記載された、ＣＡＶＤの１１の細胞内マーカー（ＡＬＰＬ、α－ＳＭＡ、ＧＦＡＰ、Ｋｉ－６７、ＮＡＮＯＧ、オステオカルシン、ｐＳ６、ソルチリン、ＴＧＦ－β、ＶＥ－カドヘリン、ビメンチン）、および８つの表面抗体（ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ１０５）と共にインキュベートした。
ＳＰＡＤＥ（ｓｐａｎｎｉｎｇ－ｔｒｅｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｅｎｓｉｔｙ－ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｅｖｅｎｔｓ）による視覚化（４８）は、ノードとして表された、測定されたマーカーについての、それらの発現プロファイルに基づき、いくつかの細胞クラスターを裏付ける（図４Ｅ）。各ノード色は、免疫染色レベル（発現強度：暖色／赤（高度）～寒色／青（低度）のスケール）を表す。本発明者らはまず、弁尖の石灰化領域内および非石灰化領域内の、ＣＤ２９、ＣＤ４４（図４Ｅ）、ＣＤ５９、およびＣＤ７３の発現を比較することにより、ＤＤＰ ＶＩＣを含有する、特異的細胞クラスターを同定した。図４Ｅ内の台形型枠囲いにより強調され、図４Ｆで拡大して示された、ＶＩＣのクラスターは、石灰化ＳＰＡＤＥが、非石灰化ＳＰＡＤＥ（発現レベルが低度である、小型ノード）と比較した場合に、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＡＬＰＬ、およびＫｉ６７（図４Ｅ）の他、ＣＤ５９およびＣＤ７３の発現強度が高度（暖色を伴う、大型のノード）である、より多くのＶＩＣを含有したことを裏付ける。ＮＡＮＯＧ、オステオカルシン、ｐＳ６、ソルチリン、ＴＧＦ－β、およびＣＤ３４はまた、石灰化試料中でも、高度の相対発現を示したが、α－ＳＭＡ、ＧＦＡＰ、ＶＥ－カドヘリン、ビメンチン、ＣＤ４５、ＣＤ６３、およびＣＤ１０５は、石灰化ＳＰＡＤＥにおける染色が、非石灰化ＳＰＡＤＥにおける染色と対比して異ならなかった。これらの結果は、石灰化弁尖部分における、骨原性が高度な（例えば、オステオカルシン、ソルチリン、ＴＧＦ－β）細胞集団、増殖性の（例えば、ＮＡＮＯＧ、ｐＳ６）細胞集団、および前駆体様の（例えば、ＣＤ３４）細胞集団の優越性を示唆する。
[実施例７]
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは、ＤＤＰ ＶＩＣの、骨原性移行時における発現が高度な遺伝子を同定する
本発明者らは次に、ＤＤＰ－ＶＩＣ、ＭＩＸ－ＶＩＣ、およびＭＳＣを、骨原性分化時に培養することにより、単一細胞レベルにおけるトランスクリプトームについて検討した。ＮＭ中およびＯＭ（ＭＩＸ－ＮＭ、ＭＩＸ－ＯＭ、ＤＤＰ－ＮＭ、ＤＤＰ－ＯＭ、ＭＳＣ－ＮＭ、およびＭＳＣ－ＯＭ）中で、２週間（２１日目における、ピーク表現型の出現の前における、早期のｍＲＮＡ変化を捕捉するために）にわたり培養された６つの条件から、単一の細胞を分離した（図５Ａ）。ＩｎＤｒｏｐｓ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ法を使用した（４９）。以下：ＭＩＸ－ＮＭ（ｎ＝１８１３）、ＭＩＸ－ＯＭ（ｎ＝２０００）、ＤＤＰ－ＮＭ（ｎ＝１８１４）、ＤＤＰ－ＯＭ（ｎ＝２０００）、ＭＳＣ－ＮＭ（ｎ＝８７３）、およびＭＳＣ－ＯＭ（ｎ＝２０００）は、条件ごとの細胞数である。細胞１個当たりの遺伝子リードの範囲は、１０００～８１９２であった。トランスクリプトミクスデータの組合せについての、主成分分析（ＰＣＡ）およびｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）によるプロットは、分化の２週間後に、ＭＳＣ－ＮＭとＭＳＣ－ＯＭとが、他のＶＩＣクラスター（ＭＩＸ－ＮＭ、ＭＩＸ－ＯＭ、ＤＤＰ－ＮＭ、ＤＤＰ－ＯＭ）と重複しない、顕著に異なるクラスターを形成することを明らかにした。ＭＳＣ試料とＶＩＣ試料との間の、この顕著に異なる分離（ＰＣＡおよびｔＳＮＥによる）は、それらのグローバルトランスクリプトームが、実質的に異なり、下流において、共クラスター化アルゴリズム（例えば、ｋ平均）にかけることができないことを示唆する。このため、本発明者らは、ＶＩＣ亜集団をさらに特徴付けるように、ＭＳＣデータセットとＶＩＣデータセットとを、個別に解析した（図５Ｂ～５Ｇ）。ＭＳＣ／ＶＩＣクラスター間の重複の欠如は、グローバルトランスクリプトームデータの分岐を駆動する、実質的な細胞型の差違を含意しうる。しかし、これは、本発明者らが、共通経路の一部である、ＯＭで刺激されたＤＤＰ ＶＩＣまたはＤＥＧ ＶＩＣと共通の、一部の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を捕捉することを可能としうるので、ＯＭ刺激時におけるＭＳＣ挙動の探索において、ある程度の価値がある。
ｔＳＮＥプロットにより視覚化された、ＭＳＣ－ＮＭおよびＭＳＣ－ＯＭによる単一細胞発現（強度）についての連結データの、ｋ平均によるクラスター化（６クラスター）は、ＭＳＣ－ＯＭ集団が、ＭＳＣ－ＮＭ集団の全体について描示する単一クラスター（ｋ２）と比較して、５つのサブクラスター（ｋ１、ｋ３、ｋ４、ｋ５、ｋ６）へと分離されるので、ＭＳＣ－ＮＭよりも変動があることを示した（図５Ｂ、５Ｃ）。他方、４つのＶＩＣ試料条件の全てにわたり分布した変動は、同様であった（図５Ｄ、５Ｅ）。本発明者らは、まず、ｋクラスターによる群分けを考慮せずに、ＭＳＣ－ＮＭ条件とＭＳＣ－ＯＭ条件との間で、ＤＥＧを計算することにより、相対遺伝子発現プロファイルを検討した。ｑ値≦０．０５において、倍数変化の増大が、ＭＳＣ－ＮＭと比べて≧１．５であるＤＥＧについてフィルターをかける、後続の階層的なクラスター化のために、ＤＥＧを、ｋクラスターにより組織化した（図５Ｆ）。ＭＳＣ－ＯＭ条件を規定する５つのｋクラスターのうちで、ｋ４は、公知の骨芽細胞関連マーカーである、ＳＰＡＲＣ（４６）を含む、これらの多数のＤＥＧについて、最高の発現を呈する（図５Ｄ；矢印）。ｋ４クラスターを、他のＭＳＣ－ＯＭ ｋクラスターから差別化する、さらなる遺伝子について探索するための、さらなる精緻化として、本発明者らは、ボルカノプロット（ＦＣ≧１．５、ｑ≦０．０５）を使用して、ｋ４とｋ２と（ＭＳＣ－ＮＭ）の間で、ＤＥＧを計算し、４９のＤＥＧを生成した。
次に、本発明者らは、ＤＤＰ－ＶＩＣとＭＩＸ－ＶＩＣとの連結試料について、ＶＩＣ－ＯＭを、ＶＩＣ－ＮＭと対比して精査した。ＶＩＣ－ＯＭが、ＯＭ培地中のＤＤＰ－ＶＩＣ試料およびＭＩＸ－ＶＩＣ試料（ＤＤＰ－ＯＭおよびＭＩＸ－ＯＭ）から構成されるのに対し、ＶＩＣ－ＮＭは、ＮＭ培地中の、ＤＤＰ－ＶＩＣとＭＩＸ－ＶＩＣとの組合せである。同様に、本発明者らは、ＰＣＡ、ｔＳＮＥ、およびｋ平均によるクラスター化を使用して、試料を解析した。ＶＩＣ－ＯＭクラスターは、ＤＤＰ－ＯＭ細胞およびＭＩＸ－ＯＭ細胞の両方を、数を変動させて含有するが、全体的な遺伝子発現の類似性に基づき、併せてクラスター化された。ＶＩＣ－ＯＭのクラスター（ｋ４、ｋ５、およびｋ６）を、ＶＩＣ－ＮＭのクラスター（ｋ１およびｋ２）と対比して比較する（倍数変化＞１．５、ｑ値＜０．０５）ことにより、本発明者らは、１８のＤＥＧの増大を同定した（表１）。
Figure 2022527085000003
この解析において、ＶＩＣ－ＯＭの中では、骨芽細胞分化マーカーである、ＴＧＦ－β受容体２（ＴＧＦＢＲ２）（２８）が増大した。その後、本発明者らは、ＶＩＣ－ＯＭ細胞を含有するクラスター（ｋ３～ｋ６）に由来するＤＥＧについて、ＶＩＣ－ＮＭ細胞だけを含有するクラスター（ｋ１、ｋ２）と比較してフィルターをかけた。本発明者らは、ｋ３クラスターではＯＭ中で培養された細胞がＮＭ中で培養された細胞に対して優越するため、ＮＭ刺激に由来する細胞を含有するにもかかわらず、ｋ３クラスターを、ＶＩＣ－ＯＭクラスターの中に組み入れた（図５Ｅ）。しかし、ｋ４クラスターが、主に、ＤＤＰ－ＯＭであることに注目することは有意義である（図５Ｄ～５Ｅ）。ＤＤＰ－ＯＭは、ＭＩＸ－ＯＭより骨原可能性高い（図４Ｄ）。ｋ４クラスターはまた、主にＭＩＸ－ＯＭであるｋ５クラスターおよびｋ６クラスターと比較して、ＡＬＰＬ、および大動脈弁石灰化（３２）において重要な、非カノニカルのＷＮＴシグナル伝達と関連する遺伝子発現がより高度な、より多くの細胞も有する（図５Ｄ～５Ｅ）。経路富化を使用して、本発明者らは、ｋ４クラスターを、幹細胞分化およびＴＧＦ－βシグナル伝達と関連する、大半の経路を有するクラスターとして同定した。したがって、本発明者らは、ほぼ全体が、ＭＩＸ－ＮＭおよびＤＤＰ－ＮＭから構成される、ｋ１とｋ２との組合せクラスターに対する倍数変化が≧１．５であるｋ４ ＤＥＧを目的として、３４のＤＥＧを得た（図５Ｇ、表２）。ＭＳＣ－ＯＭ ｋ４クラスターおよびＤＤＰ－ＯＭ ｋ４クラスターに特異的な遺伝子リストを、石灰化過程の駆動の一因となる遺伝子についての、コンピュータ上のバリデーションとして、生物学的過程および経路について富化した。
Figure 2022527085000004
倍数変化＞１．５；ｑ値＜０．０５；遺伝子のｎ＝３４である。
[実施例８]
大動脈弁石灰化のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングについてのプロテオーム解析
本発明者らは次に、骨原性分化時における、ＤＰＰ－ＶＩＣおよびＭＩＸ－ＶＩＣの細胞プロテオームに対する変化について検討した。大スケールの単一細胞プロテオミクスは、実現不可能にとどまるので、本発明者らは、ＤＤＰ－ＶＩＣに対して、亜集団ターゲティングプロテオミクスを実施し、同じドナーから分離されたＭＩＸ－ＶＩＣに対して比較した（ｎ＝４）。ＭＳＣの培養と並行して、これらの設定の細胞培養物を、ＯＭ条件下またはＮＭ条件下で、０、７、１４、および２１日間にわたり増殖させた（図６Ａ）。アリザリンレッド石灰化アッセイは、ＤＤＰ ＶＩＣ集団が、１４日目までに石灰化する（ＭＳＣの石灰化可能性に相似する）のに対し、４例のＭＩＸ ＶＩＣドナーは全て、これより遅く、２１日目に、石灰化を呈することを裏付けた（図６Ｂ）。さらに、アリザリンレッドによる染色は、ＤＤＰ－ＶＩＣでは、後の時点における、それらのＭＩＸ－ＶＩＣ対応物と比較して強力であった。
本発明者らは、各細胞集団（ＭＳＣ、ＭＩＸ－ＶＩＣ、およびＤＤＰ－ＶＩＣ）内の石灰化の候補ドライバー（タンパク質）を同定し、これらの候補が、これらの細胞集団内に存在するのかどうかを決定するように、骨原性分化時におけるプロテオームについてモニタリングした。プロテオーム解析は、ＭＳＣ－ＯＭおよびＭＳＣ－ＮＭの組合せについて、３，９９８のタンパク質をシーケンシングし、ＭＩＸ－ＶＩＣおよびＤＤＰ－ＶＩＣの組合せについて、４，５３８のタンパク質をシーケンシングしたところ、３６０７（７３％）のタンパク質が、２つ細胞型の間で共通であった（図６Ｃ）。
三連の細胞培養実験（０日目について、組合せのｎ＝６）を使用して、本発明者らはまず、ＭＳＣ－ＮＭおよびＭＳＣ－ＯＭのベースライン（ｔ０＝０日目）プロテオームについて比較した。これらの反復は、有意な供給源の変動は、培地条件および時点の間の変動であり、試料反復間の変動ではないことを裏付ける。条件を組み合わせて、プロテオームを検討したところ、ＰＣＡは、３つの重要な知見：１）培養の反復は、各細胞集団内で、他の試料条件と対比して、高度の近接を示すこと；２）時間進行成分が存在し、３）この時間進行成分はまた、ＭＳＣ－ＮＭ試料とＭＳＣ－ＯＭ試料との間の分岐も駆動すること（図６Ｄ）を描示した。階層的クラスター解析は、時点間および培地間におけるプロテオームの変化についての概観をもたらす（図６Ｅ）。
次いで、本発明者らは、１）ドナー間のばらつきを低減し、２）培養における時間の影響をモデル化し、３）ＭＳＣ集団およびＤＤＰ－ＶＩＣ集団の両方において、経時的な差次的発現タンパク質を同定し、４）石灰化培地処理の、これらの差次的発現タンパク質に対する効果をモデル化する、複数の統計学的フィルタリングステップを実施した。本明細書では、本発明者らによるフィルタリング法についての、完全な方法的詳細について記載し、図６Ｆ、６Ｈのグラフに描示する。
２つの並行するフィルタリング法（図６Ｆ、６Ｈ）の交差は、１２８の共通タンパク質を結果としてもたらした。最終段階として、本発明者らは、ＯＭ中で、ＮＭ中を上回って富化されたタンパク質についてフィルターをかけ、結果として８６の最終タンパク質をもたらした（図６Ｇ）。ＤＤＰ－ＯＭ中で富化されたタンパク質を同定するために、本発明者らは、ＤＤＰ－ＶＩＣデータセットおよびＭＩＸデータセットについて、個別に、かつ、ＭＳＣデータセットの場合と同様に解析し；ＭＩＸ－ＯＭタンパク質を、ＤＤＰ－ＯＭタンパク質から控除するステップ（図６Ｈ）を組み込む結果として、７１のタンパク質をもたらした（図６Ｉ）。
[実施例９]
ＣＴＨＲＣ１およびＭＡＯＡは、ＤＤＰ－ＶＩＣについてのトランスクリプトームおよびプロテオームにより同定され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＶＩＣの石灰化を促進する
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ法と、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロテオーム法とを組み合わせ、本発明者らは、本発明者らによるＯＭ媒介差次的発現を、ＤＤＰ－ＶＩＣおよびＭＳＣにおける、骨原可能性のドライバーでありうる、それぞれ、８３および１５７の候補分子へと狭めた。次いで、本発明者らは、これらのタンパク質が、オミクスデータセットの間、およびこれらの細胞型の間で共通であるのかどうかを決定することを目的とした。この戦略は、共通のタンパク質リスト（図７Ａ）をもたらしたが、タンパク質のうちのいずれも、全てのデータセットには含まれなかった。複数のデータセットまたは細胞型の間で共通のタンパク質は、ＡＮＰＥＰ、ＮＩＤ２、ＣＴＨＲＣ１、ＡＣＳＳ２、ＤＥＲＡ、ＭＡＯＡ、ＦＫＢＰ５、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＥＬＮ、ＴＭＴＣ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＲＦＬ１、およびＤＣＮであった。本発明者らはとりわけ、２つのタンパク質：（１）ＣＴＨＲＣ１（コラーゲン三重リピート含有タンパク質）（ＶＩＣオミクスデータ（ＤＥＰおよびＤＥＧについてのリスト）およびＭＳＣ－ＯＭ ＤＥＰリストにおいて共通の唯一の分子）、および（２）ＭＡＯＡ（モノアミンオキシダーゼＡ）（ＤＤＰリスト、ＤＥＧリスト、およびＭＳＣ－ＯＭ ＤＥＰリストに存在する）に焦点を当てた。カテコールアミン分解について公知のＭＡＯＡについての報告は、高セロトニンレベルが、ヒト心弁において、酸化ストレスを引き起こしうることを示す（２９）。これらの遺伝子が、ＶＩＣの石灰化可能性を促進するのかどうかを決定するために、本発明者らは、ＯＭ中またはＮＭ中で１０日間にわたり培養されたＶＩＣにおける、ｓｉＲＮＡ媒介機能喪失を実施した。ＭＡＯＡまたはＣＴＨＲＣ１の機能喪失（サイレンシング効率は、各遺伝子について、＞９０％であった；ｐ＜０．０００１；図７Ｂ）は、ＯＭ中で培養されたＶＩＣ内の、ＡＬＰＬ活性、およびオステオカルシンのｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）の低下を結果としてもたらした（図７Ｃ、７Ｄ）。ＭＡＯＡ阻害剤である、モクロベミドおよびピルリンドールは、石灰化の軽減を裏付け（図７Ｅ）、上記の知見を、さらに裏書きした。現在のところ、並行的なＣＴＨＲＣ１試験に利用可能な、ＣＴＨＲＣ１低分子阻害剤は存在しない。ＣＡＶＤ組織（ドナーのｎ＝３）の免疫染色は、石灰化近傍領域内の、ＣＴＨＲＣ１およびＭＡＯＡの発現の富化を確認した（図７Ｅ、７Ｆ）。
[実施例１０]
石灰化関連疾患ネットワークは、共通の遺伝子および経路を、前駆体マーカーと共有し、ＤＤＰ－ＶＩＣおよびＯＭＩＣにより同定される、新規の標的について描示する
ＭＳＣ－ＯＭおよびＶＩＣ ＤＤＰ－ＯＭによるマルチオミクス標的を、石灰化およびＤＤＰ－ＶＩＣ表面マーカーと連関させる、共通の分子構成要素を決定するために、本発明者らは、それらのそれぞれの遺伝子セットを、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）ネットワークへとマッピングした。増大する証拠は、ＰＰＩネットワーク内で重複するサブネットワークは、同様の機能を有する可能性があり、共発現されるか、または併存疾患を示すことを示唆する（５０）。こうして、本発明者らは、ＤＤＰ－ＶＩＣについて描示する前駆細胞マーカーと、プロテオームプロファイリング研究により検出される新規の標的と、石灰化ＰＰＩネットワークと関連するｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ研究によるＤＥＧとの間で共通のタンパク質相互作用の存在を同定するように、これらの３つのデータセット内の、ネットワークの接続を裏付けようとした（図８）。全体として、サブネットワークは、ＭＳＣ－ＯＭおよびＶＩＣ ＤＤＰ－ＯＭオミクスデータ内で富化される遺伝子から構成され、ＤＤＰ－ＶＩＣ表面マーカーは、大動脈弁および血管の石灰化と関連することが、既に見出されている石灰化因子を含む、石灰化ＰＰＩネットワーク内の重要な重複を有した。この新たなネットワークは、共通の石灰化関連マーカーを伴う２７の遺伝子（フィッシャーの正確検定、両側ｐ値＝８．４５×１０－１２）、およびＤＤＰ表面マーカーを伴う、７つの遺伝子（フィッシャーの正確検定、両側ｐ値＝１．８０×１０－４）を共有したことから、３つのデータセットを接続する、共通の経路を示唆する。ＶＩＣのプロファイリングに由来するデータセットから立ち現れた、これらの共通経路は、ＣＡＶＤの大きな基礎機構の一部である可能性があり、最新の概念と符合する（６）。
Figure 2022527085000005
参考文献
Figure 2022527085000006
Figure 2022527085000007
Figure 2022527085000008
Figure 2022527085000009
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前出の説明は、付属の特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、これを限定することを意図するものではないことが理解されるものとする。他の態様、利点、および改変も、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (22)

  1. 大動脈弁石灰化と関連する障害の処置のための方法であって、治療有効量のモノアミンオキシダーゼ亜型Ａ（ＭＡＯＡ）阻害剤を、このような処置を必要とするか、またはこのような処置を必要とすることが決定された対象へと投与するステップを含む、前記方法。
  2. 前記対象を、大動脈弁石灰化と関連する障害を有する対象として同定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記対象が、石灰化大動脈弁狭窄症（ＣＡＳ）、冠動脈疾患、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、静脈グラフト不全、動静脈瘻、および強皮症を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記対象が、哺乳動物、好ましくは、ヒトである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＭＡＯＡ阻害剤が、低分子阻害剤である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記低分子ＭＡＯＡ阻害剤が、ベフロキサトン（ＭＤ３７０５０３）；ビフェメラン（Ａｌｎｅｒｔ、Ｃｅｌｅｐｏｒｔ）；ブロファロミン（Ｃｏｎｓｏｎａｒ）；シモキサトン（ＭＤ ７８０５１５）；クロルギリン（Ｃｌｏｒｇｙｌｉｎｅ）（またはＣｌｏｒｇｉｌｉｎｅ）；メチレンブルー；ミナプリン（Ｃａｎｔｏｒ）；モクロベミド（Ａｕｒｏｒｉｘ、Ｍａｎｅｒｉｘ）；フェネルジン（Ｎａｒｄｉｌ）；ピルリンドール（Ｐｉｒａｚｉｄｏｌ）；トロキサトン（Ｈｕｍｏｒｙｌ）；チリマ（ＣＸ １５７）；トラニルシプロミン（非選択性および不可逆性、Ｐａｒｎａｔｅ）；イソカルボキサジド（１－ベンジル－２－（５－メチル－３－イソキサゾリルカルボニル）ヒドラジン－イソカルボキサジド、Ｍａｒｐｌａｎ、Ｍａｒｐｌｏｎ、Ｅｎｅｒｚｅｒ）；モリンドン；ラドスチギル；ＶＡＲ１０３０３；Ｍ３０；ヒドララジン；フェネルジン；キナクリン；ならびにこれらの塩および組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＭＡＯＡ阻害剤が、ＭＡＯＡをターゲティングする阻害性核酸である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ＭＡＯＡをターゲティングする阻害性核酸が、アンチセンスＲＮＡ；アンチセンスＤＮＡ；キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド；修飾連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド；干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）；短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；低分子ＲＮＡ誘導性遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）；ギャップマー；ミックスマー；ロックト核酸（ＬＮＡ）；またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記阻害性核酸が、修飾されている、請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記阻害性核酸が、好ましくは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間連結を含む、修飾骨格を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記阻害性核酸が、任意選択で、ヌクレオチドが前記糖の２’位において修飾された１つまたは複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
  12. このような処置を必要とするか、またはこのような処置を必要とすることが決定された対象における、大動脈弁石灰化と関連する障害の処置における使用のための、モノアミンオキシダーゼ亜型Ａ（ＭＡＯＡ）阻害剤を含む組成物。
  13. 前記対象を、大動脈弁石灰化と関連する障害を有する対象として同定するステップをさらに含む、請求項１２に記載の使用のための組成物。
  14. 前記対象が、石灰化大動脈弁狭窄症（ＣＡＳ）を有する、請求項１２または１３に記載の使用のための組成物。
  15. 前記対象が、哺乳動物、好ましくは、ヒトである、請求項１４に記載の使用のための組成物。
  16. 前記ＭＡＯＡ阻害剤が、低分子阻害剤である、請求項１２に記載の使用のための組成物。
  17. 前記低分子ＭＡＯＡ阻害剤が、ベフロキサトン（ＭＤ３７０５０３）；ビフェメラン（Ａｌｎｅｒｔ、Ｃｅｌｅｐｏｒｔ）；ブロファロミン（Ｃｏｎｓｏｎａｒ）；シモキサトン（ＭＤ ７８０５１５）；クロルギリン（Ｃｌｏｒｇｙｌｉｎｅ）（またはＣｌｏｒｇｉｌｉｎｅ）；メチレンブルー；ミナプリン（Ｃａｎｔｏｒ）；モクロベミド（Ａｕｒｏｒｉｘ、Ｍａｎｅｒｉｘ）；フェネルジン（Ｎａｒｄｉｌ）；ピルリンドール（Ｐｉｒａｚｉｄｏｌ）；トロキサトン（Ｈｕｍｏｒｙｌ）；チリマ（ＣＸ １５７）；トラニルシプロミン（非選択性および不可逆性、Ｐａｒｎａｔｅ）；イソカルボキサジド（１－ベンジル－２－（５－メチル－３－イソキサゾリルカルボニル）ヒドラジン－イソカルボキサジド、Ｍａｒｐｌａｎ、Ｍａｒｐｌｏｎ、Ｅｎｅｒｚｅｒ）；モリンドン；ラドスチギル；ＶＡＲ１０３０３；Ｍ３０；ヒドララジン；フェネルジン；キナクリン；ならびにこれらの塩および組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の使用のための組成物。
  18. 前記ＭＡＯＡ阻害剤が、ＭＡＯＡをターゲティングする阻害性核酸である、請求項１２に記載の使用のための組成物。
  19. 前記ＭＡＯＡをターゲティングする阻害性核酸が、アンチセンスＲＮＡ；アンチセンスＤＮＡ；キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド；修飾連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド；干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）；短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；低分子ＲＮＡ誘導性遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）；ギャップマー；ミックスマー；ロックト核酸（ＬＮＡ）；またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項１８に記載の使用のための組成物。
  20. 前記阻害性核酸が、修飾されている、請求項１８または１９に記載の使用のための組成物。
  21. 前記阻害性核酸が、好ましくは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間連結を含む、修飾骨格を含む、請求項２０に記載の使用のための組成物。
  22. 前記阻害性核酸が、任意選択で、ヌクレオチドが前記糖の２’位において修飾された１つまたは複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の使用のための組成物。
JP2021557385A 2019-03-27 2020-03-27 モノアミンオキシダーゼ亜型ａ（ｍａｏａ）の阻害による心血管石灰化の緩和 Pending JP2022527085A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962824383P 2019-03-27 2019-03-27
US62/824,383 2019-03-27
PCT/US2020/025295 WO2020198613A1 (en) 2019-03-27 2020-03-27 Inhibition of monoamine oxidase subtype a (maoa) mitigates cardiovascular calcification

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022527085A true JP2022527085A (ja) 2022-05-30
JPWO2020198613A5 JPWO2020198613A5 (ja) 2023-03-28

Family

ID=72609128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021557385A Pending JP2022527085A (ja) 2019-03-27 2020-03-27 モノアミンオキシダーゼ亜型ａ（ｍａｏａ）の阻害による心血管石灰化の緩和

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220175818A1 (ja)
JP (1) JP2022527085A (ja)
WO (1) WO2020198613A1 (ja)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4868179A (en) * 1987-04-22 1989-09-19 Cohn Jay N Method of reducing mortality associated with congestive heart failure using hydralazine and isosorbide dinitrate
US9913832B2 (en) * 2009-10-12 2018-03-13 Rajabrata Sarkar Accelerating thrombus resolution through augmentation of p53 activity
AU2013217176B2 (en) * 2012-02-12 2017-10-19 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Ladostigil therapy for immunomodulation
WO2015120206A1 (en) * 2014-02-07 2015-08-13 University Of Southern California Mao inhibitors and their conjugates as therapeutics for the treatment of brain cancer
WO2019036174A1 (en) * 2017-08-16 2019-02-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO ANTI-CALCIFICATION

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020198613A1 (en) 2020-10-01
US20220175818A1 (en) 2022-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fang et al. MicroRNA‐29b suppresses tumor angiogenesis, invasion, and metastasis by regulating matrix metalloproteinase 2 expression
Liu et al. MicroRNA-122 influences the development of sperm abnormalities from human induced pluripotent stem cells by regulating TNP2 expression
JP2015531594A (ja) 神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞の作製方法
US9260755B2 (en) Compositions and methods for characterizing and treating muscular dystrophy
Yan et al. Growth factors-based beneficial effects of platelet lysate on umbilical cord-derived stem cells and their synergistic use in osteoarthritis treatment
WO2016164463A1 (en) Methods for reactivating genes on the inactive x chromosome
US20170202910A1 (en) Differentiation marker and differentiation control of eye cell
Iannolo et al. MiR34 inhibition induces human heart progenitor proliferation
JPWO2017043370A1 (ja) エクソソーム分泌阻害剤
Osana et al. Puromycin‐sensitive aminopeptidase is required for C2C12 myoblast proliferation and differentiation
US10626397B2 (en) Therapeutic compositions for breast cancer containing protein kinase D1 inhibitor
EP2810655A1 (en) Novel antitumor agent and method for screening same
JP2022527085A (ja) モノアミンオキシダーゼ亜型ａ（ｍａｏａ）の阻害による心血管石灰化の緩和
JP5567555B2 (ja) 頭頸部腫瘍増殖抑制剤
KR102181813B1 (ko) 단백질 카이네이즈 d1 저해제를 포함하는 유방암 치료제 조성물
JP7033072B2 (ja) Ｓｍｏｃ２を標的化する線維症のための治療方法
Aung et al. MicroRNAomic transcriptomic analysis reveal deregulation of clustered cellular functions in human mesenchymal stem cells during in vitro passaging
WO2021062202A1 (en) Methods for depletion of deleterious mitochondrial genomes
JP2006508666A (ja) カスパーゼ３活性調節による幹細胞分化の調節
CA3036233A1 (en) Primed cardiac progenitors and methods for making and using same
Rong et al. Decreased CRISPLD2 expression impairs osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells during in vitro expansion
US20230374508A1 (en) Compositions and Methods Targeting circ2082 for the Treatment of Cancer
US11679126B2 (en) Methods to enhance microvascular engraftment of bioengineered and primary tissues
WO2016149187A1 (en) Methods to accelerate wound healing in diabetic subjects
KR20220088294A (ko) Oligodendrocyte transcription factor 2 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 치료 효과 증진용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220520

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230317

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230317

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240604