TWI402348B - 用於偵測瘧原蟲之引子 - Google Patents

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Description

用於偵測瘧原蟲之引子 發明領域
本發明係有關一種可於瘧疾流行地區快速且準確地檢測/鑑別瘧原蟲屬之瘧疾寄生蟲之引子集合、一種檢測及鑑別方法、一種檢測套件組、一種抗瘧疾措施支援系統、及一種瘧疾感染預防/治療措施系統。
 發明背景
於許多瘧疾寄生蟲於地方上流行之國家，需要有瘧疾寄生蟲之快速準確的診斷。四種瘧原蟲中以可能致命之惡性瘧原蟲必須即刻鑑別且與可能造成人體發病之其它種瘧原蟲區別(Moody, A.，Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002): 66-78)。
此外，大部分瘧疾流行地區之感染特徵涉及其中兩種或多種瘧原蟲；大部分瘧疾流行地區具有涉及兩種或多種瘧原蟲之感染特徵；此等混合感染經常未經認知或被低估(Zimmerman, P.A.等人，瘧原蟲學趨勢20(2004): 440-447)。未能檢測混合型感染可能導致治療不當，結果引發嚴重疾病(Mayxay, M.等人，瘧原蟲學趨勢20 (2004): 233-240)。因此，迫切需要發展出可於流行地區操作、容易、快速、高度敏感性及有種-特異性之瘧疾診斷方法。
目前瘧疾之簡易診斷方法為顯微鏡檢血液抹片。若有高密度瘧原蟲，則此種顯微鏡檢有相對高敏感度及特異 性，且提供發育期及種屬測定。但於流行地區瘧原蟲密度通常低，此種方法為勞力密集法需要有技巧熟練之專業人士且可能導致治療的延遲。
於無法利用標準實驗室診斷之地區，為了改善瘧疾診斷之速度及精確度，開發基於免疫反應快速診斷瘧疾之試驗(RDT)(Moody, A. Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002): 66-78;Ndao, M.等人，J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 2694-2700)。但敏感度於各產品間互異(Murray, C. K.等人，Trop. Med. Int. Health. 8 (2003): 876-883)，且只有惡性瘧原蟲有種-特異性產品。於若干情況下藉顯微鏡檢術進行正確診斷需要極為長期的觀察時間及相當大的經驗：當血中瘧原蟲含量低時、混合感染期間、藥物治療後及感染慢性期期間。因此此種情況可能導致錯誤的負面結果或種屬診斷不可靠(Coleman，R.等人，泰國瘧疾期刊14 (2006): 121)。
隨後，開發用於瘧疾診斷之基於DNA擴增諸如巢套PCR及即時定量PCR等分子生物學方法。比較顯微鏡檢術，此等方法用於混合型感染驗證較高敏感度及較高特異性(Kimura, K.等人，Parasitol. Int. 46 (1997): 91-95;Perandin, F.等人，J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 1214-1219;Rougemont, M.等人，J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 5636-5643;Singh, B.等人，Am. J. Trop. Med. Hyg. 60 (1999): 687-692;Singh, B.等人，刺胳針363 (2004): 1017-1024;Snounou, G.等人，Mol. Biochem. Parasitol. 61 (1993): 315-320)。但唯有於設備完善的實驗室中經過長期周轉時間、高成本、及利用性促成此 種PCR技術不適合用於醫院檢驗室中之例行性診斷以及流行地區診所現場診斷(Hanscheid, T.及Grobusch, M.P.，瘧原蟲學趨勢18 (2002): 395-398)。
有關瘧疾檢測，專利文件1之實例8及10揭示由血樣中萃取核酸且執行巢套PCR來檢測四種瘧原蟲屬之方法。實例8揭示各正向引子序列及反向引子序列，該等序列係與本發明之引子序列不同(專利文件1)。
專利文件2及4等專利公開案揭示基於固相法或巢套PCR檢測一種或多種瘧原蟲感染之方法，其中多個類別引子中之一者或多者用於臨床上檢測惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲。但該等引子具有與本發明之引子序列不同的序列。
專利文件3之專利公開案揭示一種檢測惡性瘧原蟲及/或間日瘧原蟲之方法，其中惡性瘧原蟲及/或間日瘧原蟲之特異性引子係結合至標籤或固體撐體。但此等特異性引子序列係與本發明之引子集合之寡核苷酸序列不同。
晚近，發展新穎簡易的且高度敏感的稱作為回路媒介恆溫擴增(LAMP)技術(Notomi, T.等人，核酸研究28 (2000):e63;WO 2000/28082)。
LAMP是一種仰賴藉Bst DNA聚合酶執行自我循環股置換DNA合成之核酸擴增方法。擴增產物為幹-回路結構有數個重複標靶序列及多個回路。
本方法之主要優點為無需DNA樣板變性(Nagamine, K.等人，Clin. Chem. 47 (2001): 1742-1743)，如此LAPM反應 可於恆溫條件(由60℃至65℃之範圍)進行。LAMP只需要一種酶及可辨識六個分開標靶區之四類型引子。該方法製造大量已擴增產物，結果導致更容易檢測，諸如藉目測判定反應混合物之濁度或螢光來檢測(Mori, Y.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (2001): 150-154)。已知其中螢光物質諸如螢光素、異硫氰酸螢光素(FITC)、X-若丹明(ROX)等用於測量反應混合物之螢光偏極化值之LAMP，以及其中SYBR綠2一種綠色染料用作為插層劑之LAMP(日本專利公開案第2002-272475號及WO 2002/103053)。
若干研究學者曾經報告LAMP方法用於快速鑑別瘧原蟲屬、錐蟲屬(Trypanosoma)、巴貝蟲屬(Babesia)、鐮孢菌屬(Fusarium)、李氏菌屬(Listeria)及軍團菌屬(Legionella)，推薦LAMP檢定分析有用(Ikadai, H.等人，J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 2465-2469;Kuboki, N.等人，J. Clin. Microbiol. 41 (2003): 5517-5524;Thekisoe, O.等人，Mol. Biochem. Parasitol. 122 (2002): 223-236；日本專利公開案第2005-245257號，日本專利公開案第2007-61061號，日本專利公開案第2003-219878號，及Poon, L.等人，Clin. Chem. 52 (2006): 303-306)。
Poon等人估計執行LAMP檢定分析之成本約為惡性瘧原蟲檢測之正常PCR成本之十分之一(Poon, L.等人，Clin. Chem. 52 (2006): 303-306)。成本與時間的最大節省係來自於樣本準備上簡化而無需先前之DNA萃取(Iwasaki, M.等人，Genome Lett. 2 (2003): 119-126)。
用於樣本之製備，單純於99℃加熱受感染的血液10分鐘即足以製備用於LAMP之DNA樣板(Poon, L.等人，Clin. Chem. 52 (2006): 303-306)。但至今為止，只有於急性惡性瘧原蟲感染病人才證實LAMP用於臨床診斷中瘧原蟲的檢測的效果(Poon, L.等人，Clin. Chem. 52 (2006): 303-306)。雖然惡性瘧原蟲為重病的最主要起因，但其地理上之分布與間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲感染之地理分布重疊，因此需要有一種允許快速檢測與鑑別全部感染人類之四種瘧原蟲之方法。
近年來，於瘧疾流行地區，抗藥性種系的出現已經構成妥善瘧疾治療上的重大問題。醫界執業人士或醫院中的醫師期望有快速且高度敏感之鑑別診斷方法來獲得發燒病人是否感染特定瘧原蟲或感染多種屬瘧原蟲之資訊，因而可妥善治療發燒的瘧疾病人。
[專利文件1]WO2006/88895
[專利文件2]日本專利公開案第1994-261758號
[專利文件3]日本專利公開案第1993-227998號
[專利文件4]日本專利公開案第2003-250564號
[非專利文件1]Poon, L.等人，Clin. Chem. 52 (2006): 303-306
為了解決前述問題期望發展出檢測與鑑別四種瘧原蟲 屬之瘧原蟲(特別為存在有混合型感染)之簡易快速方法，該等方法係與已知方法諸如顯微鏡檢或PCR反應媒介方法不同。
本發明之一個目的係提供一種使用LAMP用於臨床上檢測及特異化惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之快速且高度敏感之檢測與鑑別方法。進一步，根據本發明之瘧原蟲之檢測及鑑別方法，使用於瘧疾流行地區診所所得之血樣，提供一種用於檢測瘧原蟲屬之四種瘧原蟲之引子集合，此處該引子集合已經經由顯微鏡檢術與LAMP之比較做評估；一種使用該引子集合用於瘧原蟲屬之四種瘧原蟲之檢測方法；一種鑑別方法及一種檢測套件組。
因此，本發明之一個目的係解決前述問題，以及提供一種用於檢測/鑑別人類簡體中是否存在有瘧原蟲屬或四種特定瘧原蟲中之任一者之容易且快速之檢測/鑑別方法，該方法有助於瘧疾流行地區之醫療照護以及進一步提供一種抗瘧疾措施支援系統以及一種瘧疾感染預防/治療措施系統。
針對解決此等問題發明人得知使用回路媒介恆溫擴增LAMP方法，該方法為恆溫基因擴增反應(WO 00/28082)。 但大致上，瘧原蟲基因之核酸序列與其它有機體富含AT含量之核酸序列不同。因此現有的引子設計軟體無法找出最理想的引子集合，需要重複嘗試錯誤過程且難以設計各類 型引子。最後，於合成引子集合之多項組合中，發現既具有高度敏感度又具有高度特異性之特別有用之引子集合。如此，發現使用可檢測四種感染人體之瘧原蟲之種-特異性引子集合，以及同時使用各自對四種瘧原蟲(惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲)具有特異性之引子集合允許容易且快速地檢測/鑑別是否存在有此等感染。
也發現此等結果可有效用於抗瘧疾措施支援系統，以及可有效使用該瘧疾感染-預防/治療措施系統。
換言之，本發明提供後文，如項目1至27說明如下。
項目1.一種檢測或鑑別於一檢體感染瘧原蟲屬(Plasmodium)及/或惡性瘧原蟲(P. falciparum)、間日瘧原蟲(P. vivax)、三日瘧原蟲(P. malariae)、及卵形瘧原蟲(P. ovale)中之一者或多者之方法；該方法包含下列步驟(a)至(c): a)該檢體萃取DNA; b)含有股置換DNA聚合酶及序列特異性引子集合之反應混合物中，讓於步驟(a)所萃取之DNA反應而擴增瘧原蟲屬18S rRNA基因序列之一個特定區；及c)測或鑑別是否存在有於步驟(b)所擴增之瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之一者或多者之已擴增產物；該序列特異性引子集合為含有用於擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之由序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列之寡核苷酸集合；及/或下列引子集合中之一者或多者：用於擴增惡性瘧原蟲 18S rRNA基因序列之一特定區之一引子集合，包含含有序列辨識編號：7至12所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合之一引子集合；用於擴增間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一引子集合，包含含有序列辨識編號：13至18、序列辨識編號：31至36、或序列辨識編號：37至42所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合之一引子集合；用於擴增惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一引子集合，包含含有序列辨識編號：7至12所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合之一引子集合；用於擴增三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一引子集合，包含含有序列辨識編號：19至24所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合之一引子集合；及用於擴增卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一引子集合，包含含有序列辨識編號：25至30所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合之一引子集合。
項目2.根據項目1之檢測或鑑別方法，其中由該檢體萃取DNA係藉沸騰含該DNA之檢體及執行離心而進行。
項目3.根據項目2之檢測或鑑別方法，其中該沸騰時間係由數分鐘至十幾分鐘。
項目4.根據項目1至3中之任一者之檢測或鑑別方法，其中於擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之步驟(b)中，使用恆溫水浴或特別設計供LAMP使用之擴增器，於約60℃執行DNA擴增反應歷約1小時。
項目5.根據項目1至4中之任一者之檢測或鑑別方法，其中於步驟(C)中，瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原 蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之一者或多者之擴增產物之存在與否係使用視覺觀察或即時濁度計檢測或鑑別。
項目6.根據項目1至5中之任一者之檢測或鑑別方法，其係於瘧疾流行地區進行。
項目7.根據項目1至6中之任一者之檢測或鑑別方法，其中瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之一者或多者之感染係同時或分開檢測或鑑別。
項目8.根據項目1至6中之任一者之檢測或鑑別方法，其中感染瘧原蟲屬係使用包含含有用於擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之由序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列之寡核苷酸集合之一引子集合作為序列特異性引子集合而檢測或鑑別。
項目9.根據項目1至6中之任一者之檢測或鑑別方法，其中感染間日瘧原蟲係使用包含含有序列辨識編號：13至18、序列辨識編號：31至36、或序列辨識編號：37至42所表示之一寡核苷酸集合且可擴增間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一用於檢測間日瘧原蟲之引子集合作為序列特異性引子集合而檢測或鑑別。
項目10.根據項目1至6中之任一者之檢測或鑑別方法，其中感染三日瘧原蟲係使用包含含有序列辨識編號：19至24所表示之一寡核苷酸集合且可擴增三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一用於檢測三日瘧原蟲之引子集合作為序列特異性引子集合而檢測或鑑別。
項目11.根據項目1至4中之任一者之檢測或鑑別方法，其中感染卵形瘧原蟲係使用包含含有序列辨識編號：25至30所表示之一寡核苷酸集合且可擴增卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一用於檢測卵形瘧原蟲之引子集合作為序列特異性引子集合而檢測或鑑別。
項目12.一種用於檢測瘧原蟲屬之引子集合，包含含有序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合，該引子集合可擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
項目13.一種用於檢測間日瘧原蟲之引子集合，包含含有序列辨識編號：13至18、序列辨識編號：31至36、或序列辨識編號：37至42所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合，該引子集合可擴增間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
項目14.一種用於檢測三日瘧原蟲之引子集合，包含含有序列辨識編號：19至24所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合，該引子集合可擴增三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
項目15.一種用於檢測卵形瘧原蟲之引子集合，包含含有序列辨識編號：25至30所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合，該引子集合可擴增卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
項目16.一種用於檢測瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之任一者之引子集合，包含含有選自於項目12至15所定義之該等核酸序列及 序列辨識編號：7至12所表示之核酸序列中之核酸序列之一寡核苷酸引子集合，該引子集合可擴增瘧原蟲屬及瘧原蟲之各種屬之18S rRNA基因序列之特定區包括惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
項目17.一種用於瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之任一者之檢測套件組，包含選自於如項目12至16所定義之引子集合中之至少一引子集合、一股置換DNA聚合酶、dNTP及一反應緩衝液。
項目18.根據項目17之檢測套件組，其中該檢測套件組係同時或分開檢測瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲。
項目19.一種抗瘧疾措施支援系統，包含：用於輸入及儲存瘧疾感染病人資訊之裝置，該資訊包括於瘧疾流行地區引發瘧疾之瘧原蟲屬陽性病人數目及該地區之攜帶者比率；瘧原蟲感染預防公共衛生措施指導資料庫，其基於該瘧疾感染病人資訊規定用於該瘧疾流行病地區之公共衛生措施，於該資料庫中已經輸入瘧原蟲感染區與此公共衛生措施選擇資訊連同指示哪一種公共衛生措施須選擇優先給予之措施優先順序；一公共衛生措施擷取區段，其係根據該個體之有關瘧原蟲之瘧疾感染病人資訊，從該瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫中擷取有關瘧疾感染流行地區之公共衛生措施及其優先順序；以及 一公共衛生措施顯示區段，其顯示於該公共衛生措施擷取區段所擷取之公共衛生措施連同其優先順序。
項目20.根據項目19之抗瘧疾措施支援系統，其中經由使用根據項目1之檢測或鑑別方法及/或根據項目12之引子集合或根據項目17之瘧原蟲檢測套件組，鑑別瘧原蟲屬感染之存在與否，來獲得於瘧疾流行地區之有關瘧原蟲之瘧疾感染病人資訊。
項目21.一種抗瘧疾措施支援系統，包含：用於輸入及儲存瘧原蟲治療劑資訊之裝置，該資訊規定作用於四種瘧原蟲中之一種或多種感染之瘧疾治療劑；病人資訊輸入裝置，用於輸入及儲存病人資訊，包括有關於瘧疾流行地區有發燒病人之有關瘧疾感染之病原之資訊；病人資訊輸入裝置，用於輸入及儲存病人資訊，包括有關於瘧疾非流行地區有發燒病人之有關瘧疾感染之病原之資訊；一種治療指南資料庫，根據於個體檢測得抗瘧原蟲之功效指標，於該資料庫中輸入瘧原蟲治療劑選擇資訊連同指示當選擇用於對抗瘧原蟲時，哪一種瘧疾治療劑須優先給予之優先順位；一瘧疾治療劑擷取區段，其係根據該個體之瘧疾感染病原之相關資訊，而由該治療指南資料庫中擷取欲投予之瘧疾治療劑及其優先順位；及一瘧疾治療劑顯示區段，其顯示於前述瘧疾治療劑擷 取區段所擷取之瘧疾治療劑連同其優先順位。
項目22.根據項目21之抗瘧疾措施支援系統，其中經由使用根據項目1至11中之任一項之檢測或鑑別方法及/或根據項目12至16中之任一項之引子集合或根據項目17或18之檢測套件組，鑑別感染四種瘧原蟲中之一種或多種而獲得有關發燒病人之瘧原蟲感染病原之相關資訊。
項目23.一種抗瘧疾措施支援系統，其中與抗瘧疾措施相關之公共衛生措施及與抗瘧疾措施相關之瘧原蟲治療措施係合併執行；該公共衛生措施包含：用於輸入及儲存瘧疾感染病人資訊之裝置，該資訊包括於瘧疾流行地區引發瘧疾之瘧原蟲屬陽性病人數目及該地區之攜帶者比率；瘧原蟲感染預防公共衛生措施指導資料庫，其基於該瘧疾感染病人資訊規定用於該瘧疾流行病地區之公共衛生措施，於該資料庫中已經輸入瘧原蟲感染區與此公共衛生措施選擇資訊連同指示哪一種公共衛生措施須選擇優先給予之措施優先順序；一公共衛生措施擷取區段，其係根據該個體之有關瘧原蟲之瘧疾感染病人資訊，從該瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫中擷取有關瘧疾感染流行地區之公共衛生措施及其優先順序；以及一公共衛生措施顯示區段，其顯示於該公共衛生措施擷取區段所擷取之公共衛生措施連同其優先順序；以及 該瘧原蟲治療措施包含：用於輸入及儲存瘧原蟲治療劑資訊之裝置，該資訊規定作用於四種瘧原蟲中之一種或多種感染之瘧疾治療劑；病人資訊輸入裝置，用於輸入及儲存病人資訊，包括有關於瘧疾流行地區有發燒病人之有關瘧疾感染之病原之資訊；病人資訊輸入裝置，用於輸入及儲存病人資訊，包括有關於瘧疾非流行地區有發燒病人之有關瘧疾感染之病原之資訊；一種治療指南資料庫，根據於個體檢測得抗瘧原蟲之功效指標，於該資料庫中輸入瘧原蟲治療劑選擇資訊連同指示當選擇用於對抗瘧原蟲時，哪一種瘧疾治療劑須優先給予之優先順位；一瘧疾治療劑擷取區段，其係根據該個體之瘧疾感染病原之相關資訊，而由該治療指南資料庫中擷取欲投予之瘧疾治療劑及其優先順位；及一瘧疾治療劑顯示區段，其顯示於前述瘧疾治療劑擷取區段所擷取之瘧疾治療劑連同其優先順位。
項目24.根據項目23之抗瘧疾措施支援系統，其中經由使用根據項目1之檢測或鑑別方法及/或根據項目12之引子集合或根據項目17之瘧原蟲檢測套件組，鑑別瘧原蟲屬感染之存在與否，來獲得於瘧疾流行地區之有關瘧原蟲之瘧疾感染病人資訊；及/或經由使用根據項目1至11中之任一項之檢測或鑑別方法及/或根據項目12至16中之任一項之 引子集合或根據項目17或18之檢測套件組，鑑別感染四種瘧原蟲中之一種或多種而獲得有關發燒病人之瘧原蟲感染病原之相關資訊。
項目25.一種用於計畫至瘧疾流行地區旅行者之瘧疾感染預防措施系統，該系統包含：從根據項目23之抗瘧疾措施支援系統，獲得於該瘧疾流行地區之公共衛生措施實際執行狀態、有關於該流行地區之瘧疾感染病原相關資訊、及感染病人之治療狀態之裝置；用於由瘧原蟲治療指南資料庫選擇瘧疾預防/治療劑之裝置；及於旅行前投予所選定之預防劑/治療劑之裝置。
項目26.一種用於從瘧疾流行地區返回者之瘧疾感染預防/治療措施系統，該系統包含：獲得於該瘧疾流行地區之公共衛生措施實際執行狀態、有關於該流行地區之瘧疾感染病原相關資訊、及感染病人之治療狀態之裝置；用於由瘧原蟲治療指南資料庫選擇瘧疾預防/治療劑之裝置；及根據項目23，於從瘧疾流行地區返回後投予選用之藥劑之裝置。
項目27.根據項目26之瘧疾感染預防/治療措施系統，其中當由瘧疾流行地區返回者有發燒時，執行惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之鑑別俾選擇且投 予選擇中應優先給予之瘧疾治療劑。
使用引子中之一者或前述項目(1)至(5)之用於LAMP之引子集合，允許瘧原蟲屬18S rRNA基因、惡性瘧原蟲18S rRNA基因、間日瘧原蟲18S rRNA基因、三日瘧原蟲18S rRNA基因或卵形瘧原蟲18S rRNA基因之一特定區之配對煉合。於LAMP方法之擴增條件下擴增之允許擴增特定基因區。此種擴增產物之存在與否係藉電泳或容易檢測方法分析。於此種方法中，受特定瘧原蟲屬及四種瘧原蟲中之各種感染可同時或分開檢測與區別。
當本發明之檢測方法用於特定檢體(例如人血)時，可由該等檢體分離DNA樣本，使用此等DNA樣本，項目(1)至項目(5)之引子集合中之任一者經反應用於擴增，藉此驗證任何已擴增DNA產物之存在與否。藉此方式，可同時或分開檢測瘧原蟲屬或四種瘧原蟲：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲中之任一者。
本發明允許引子集合之用於LAMP，其中該引子集合包含含有序列辨識編號：1至6、7至12、13至18(31至36或37至42)、19至24或25至30之核酸序列之寡核苷酸集合；以及允許同時或分開擴增瘧原蟲屬18S rRNA基因之一共通區，或四種人瘧疾寄生蟲：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲各自之18S rRNA基因之一特定區；藉此允許同時或分開檢測或區別任一種人瘧疾寄生蟲感染或四種人瘧疾寄生蟲中之一種之存在與否。
本發明之用於檢測或區別任一種人瘧疾寄生蟲感染或四種人瘧疾寄生蟲中之一種之存在與否之方法包含：使用包含含有序列辨識編號：1至6、7至12、13至18(31至36或37至42)、19至24或25至30之核酸序列之該寡核苷酸集合之一引子集合，藉LAMP(恆溫基因擴增)而擴增得自檢體之DNA樣本；以及分析任一種擴增產物之存在與否。此種檢測或區別方法允許同時或分開、容易地、快速地及可靠地檢測或區別任一種瘧疾寄生蟲感染或四種瘧疾寄生蟲：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲中之一種之存在與否。本發明也提供一種同時或分開檢測或鑑別此種人瘧原蟲或四種瘧原蟲之套件組。
抗藥性種系的發展構成妥善治療瘧疾的主要議題。本發明之用於同時區別四種瘧原蟲：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲之方法於瘧疾流行地區提供醫事從業人員或醫院醫生有關發燒病人是否感染特定瘧原蟲或多種瘧原蟲之快速且高度敏感的資訊，因而允許快速且妥善治療帶有發燒之瘧疾病人。
使用本發明之瘧原蟲屬或四種瘧原蟲之檢測/鑑別方法可監視投予瘧疾感染病人之瘧疾治療劑之療效。
根據本發明之抗瘧疾措施支援系統，臨床執業醫師及醫院醫師可於個人電腦或透過有習知作業軟體之行動電話由瘧疾治療劑指南資料庫中檢視有關發燒病人之瘧疾感染病原之相關資訊，藉此獲得選擇應優先給予之瘧疾治療劑或哪些瘧疾治療劑應組合使用之顯示。
使用本發明之瘧疾感染預防措施系統，計畫至瘧疾流行地區旅行者可事先了解該地區流行之瘧疾感染及抗藥性種系之出現狀態。如此，為了預防瘧疾感染，計畫旅行者可於旅行前較佳使用優先選用來對抗該地區流行之瘧疾感染之較佳瘧疾治療劑，因此即使該旅行者感染瘧疾，也可早期減輕因瘧疾感染所引發的症狀諸如發燒，且可預防重症病情，更容易由病人血液中早期消滅瘧原蟲。
圖式簡單說明
第1圖顯示瘧原蟲屬(A)及四種瘧原蟲(B)之LAMP標靶位置及打底位置，及18S rRNA基因核苷酸序列。(A)以箭頭指示於參考序列(基因存庫存取號碼M19173.1)中由瘧原蟲屬-特異性引子打底位置之所在。(B)四種人瘧原蟲惡性瘧原蟲(Pf；基因存庫存取號碼M19173.1)、間日瘧原蟲(Pv；基因存庫存取號碼U03079)、三日瘧原蟲(Pm；基因存庫存取號碼M54897)及卵形瘧原蟲(Po；基因存庫存取號碼L48986)之18S rRNA基因之部分序列對齊連同種-特異性引子配對煉合位置。
第2圖為使用LAMP之抗瘧疾措施支援系統之示意圖。
第3圖為基於本發明之原理之抗瘧疾措施支援系統之處理程序之流程圖。
 較佳實施例之詳細說明
將進一步說明本發明之較佳實施例之細節如下。
本發明為於醫院及實驗室，或於瘧疾流行地區之瘧疾 診所可容易且高度可靠地用於瘧原蟲篩檢之檢測系統。例如，當瘧原蟲屬或四種瘧原蟲：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲中之任一者存在於人類血液時，係使用對瘧原蟲屬及四種瘧原蟲各自之特異性寡核苷酸引子，採用LAMP藉恆溫基因擴增方法測定其存在。特定言之，本發明係基於一種方法包含下列步驟：靶定特定瘧原蟲屬18S rRNA基因序列、惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列、間日瘧原蟲18S rRNA基因序列、三日瘧原蟲18S rRNA基因序列或卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區；使用項目16之引子集合擴增該瘧原蟲屬18S rRNA基因序列、惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列、間日瘧原蟲18S rRNA基因序列、三日瘧原蟲18S rRNA基因序列或卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之特定區；及分析任何擴增產物之存在與否。
本發明之檢測/鑑別方法可應用至感染瘧原蟲之人類血液中存在的瘧原蟲。
如此處使用，「檢體」一詞可包括瘧原蟲屬或四種特定瘧原蟲：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲中之一者，表示人血樣係由本發明之檢測/鑑別方法所靶定。如此處使用，「檢測」一詞表示例如判定存在於血樣中之瘧原蟲是否為特定瘧原蟲種屬之瘧原蟲，檢測一詞偶爾用作為判定之同義詞。
如此處使用，「鑑別」一詞偶爾表示於存在有至少一種瘧原蟲種屬之檢體中，區別特定瘧原蟲種屬諸如惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲與其它瘧原蟲 種屬；及同時或分開檢測。但「鑑別」一詞通常係暗示鑑別於多種瘧原蟲中欲檢測之特定瘧原蟲。如此「鑑別」一詞包括單一瘧原蟲感染及多重瘧原蟲感染之檢測。
本發明所使用之LAMP方法為基因擴增法，不似PCR，於擴增步驟無需溫度調節(熱週期循環)，使用DNA聚合酶中之一者，基因於恆溫(恆溫溫度)擴增(WO 2000/28082及Notomi, T.等人，核酸研究28(2000): e63)。
前述DNA聚合酶可為任一種具有股置換活性之樣板相依性核酸合成酶。此種酶包括Bst DNA聚合酶(大型片段)、Bca (exo-)DNA聚合酶、大腸桿菌(Escherichia coli)克諾(Klenow)片段DNA聚合酶I、Vent (Exo-)DNA聚合酶(不具核酸外切酶活性之Vent DNA聚合酶)、DeepVent (Exo-)DNA聚合酶(不含核酸外切酶之DeepVent DNA聚合酶)、KOD DNA聚合酶。
較佳使用Bst DNA聚合酶(大型片段)。當使用此種酶時，反應較佳係於約65℃，亦即酶反應之最佳溫度進行。
LAMP之擴增產物可藉已知技術檢測。舉例言之可使用特異性辨識已擴增的基因序列之加標記的寡核苷酸檢測；或於反應完成後反應混合物直接接受瓊脂糖電泳來方便檢測。LAMP方法製造具不同鹼基長度之多帶梯階。
此外，經由擴增反應副產物之焦磷酸鎂積聚所造成之白色懸浮液可藉肉眼或使用濁度計檢測(Mori, Y.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (2001): 150-154)。
另外，使用SYBR綠色I(應用生物系統公司(Applied Biosystems)產品)其於已擴增的產物存在下變綠色，可單純以肉眼檢驗擴增。但SYBR綠色I結果係符合由即時濁度計所推定的結果(Parida, M.等人，J. Clin. Microbiol. 43 (2005): 2895-2903及日本專利公開案第2001-242169號)。因濁度檢定分析可於密閉系統進行，故污染風險低於瓊脂凝膠電泳之污染風險。此乃LAMP用於臨床用途之額外優點(Enosawa, M.等人，J. Clin. Microbiol. 41 (2003): 4359-4365;Seki, M.等人，J. Clin. Microbiol. 43 (2005): 1581-1586;Poon, L.等人，Clin. Chem. 52 (2006): 303-306)。
如此，原則上，LAMP診斷無需用於DNA萃取之昂貴試劑、濁度計、溫度週期循環器、或技巧熟練之技士。經由血樣之直接加熱處理可製備樣板而無需耗時且昂貴之使用商業套件組進行DNA萃取。(http://loopamp.eiken.co.jp)。
例如於瘧疾流行地區之現場，只需要沸騰血樣且由得自個體指尖分離極為小量血液，即允許製備足夠用於LAMP反應之期望之DNA樣本。
此外，LAMP只需要簡單型孵育器，諸如提供恆溫60℃之加熱塊或水浴，因而讓LAMP比巢套PCR或即時PCR更經濟實惠。
四種人瘧原蟲18S rRNA基因共通之屬-特異性引子集合及用於間日瘧原蟲18S rRNA基因、三日瘧原蟲18S rRNA基因、及卵形瘧原蟲18S rRNA基因之本發明之各特異性引子集合靶定各個18S rRNA基因之特定區。引子集合設計為共4種引子作為一個集合，其中兩個引子為形成兩種內部引 子：(FIP (F1c-F2)及BIP (B1-B2c))之回路，及另外兩種引子為兩種外部引子(F3, B3c)。各已擴增基因之特定區具有約70至500鹼基對長度。
內部引子擴增標靶區之核酸序列，且經特徵化包括：(a)作為第一節段，與標靶基因配對煉合且作為引子之一核酸序列；及(b)作為第二節段，與第一節段之3'核酸序列互補且係位於第一節段之5'端之一核酸序列。
進一步，使用具有與啞鈴形結構之5'端回路之單股部分之互補序列之回路引子(LPB、LPF)，此處該啞鈴形結構係作為擴增反應之起點，可增加DNA合成中之起點數目。因此使用回路引子可提高擴增功效，及縮短擴增所需時間至約三分之一至約二分之一。外部引子鑑別目標區之3'端核酸序列，具有可用作為合成起點之一核酸序列。
發明人嘗試使用LAMP設計軟體PrimerExplorer V3 ((http://primerexplorer.jp/e/)富士通有限公司(Fujitsu Limited)產品)，基於四種人瘧原蟲共通之18S rRNA基因及惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之18S rRNA基因之各個種-特異性核酸序列，設計內部引子((FIP (F1c-F2)、BIP (B1-B2c))、外部引子(F3、B3c)及回路引子(LPB、LPF)。但大致上，瘧原蟲基因之核酸序列與其它有機體之核酸序列有重大差異，富含AT含量。因此，現有的引子設計軟體無法找出最佳引子集合，需要重複嘗試錯誤過程，且於各類型引子之設計上造成困難。最後，於此種所合成之引子集合之多種組合中，找出敏感度及特異性皆 高的有用的引子集合。如此，發明人由各種18S rRNA基因成功地設計出可同時檢測四種人傳染性瘧原蟲之屬-特異性引子，及得自各種18S rRNA基因用於四種瘧原蟲(惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲)之各種特異性引子。
一旦判定引子寡核苷酸之核酸序列，寡核苷酸可藉已知手段例如藉伯金愛瑪公司(PerkinElmer，Inc.)製造之自動DNA合成儀合成。
根據本發明，四種人瘧原蟲共通之18S rRNA基因之核酸序列之特異性瘧原蟲屬-特異性引子集合及惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲各自之瘧原蟲18S rRNA基因之特異性引子集合之實例例如包括下列用於瘧原蟲屬及四種瘧原蟲之引子集合中之七個引子集合：用於瘧原蟲屬之引子集合[F3(序列辨識編號：1)、B3c(序列辨識編號：2)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：3)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：4)、LPF(序列辨識編號：5)、LPB(序列辨識編號：6)]；用於惡性瘧原蟲之引子集合[F3(序列辨識編號：7)、B3c(序列辨識編號：8)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：9)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：10)、LPF(序列辨識編號：11)、LPB(序列辨識編號：12)]；用於間日瘧原蟲之引子集合[F3(序列辨識編號：13)、B3c(序列辨識編號：14)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：15)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：16)、LPF(序列辨識編 號：17)、LPB(序列辨識編號：18)]；[PvFIP-9 (F1c+F2)(序列辨識編號：31)、PvBIP-9 (B1+B2c)(序列辨識編號：32)、PvF3-9(序列辨識編號：33)、PvB3c-9(序列辨識編號：34)、PvLPF-9(序列辨識編號：35)、PvLPB-9(序列辨識編號：36)]；或[PvFIP-7 (F1c+F2)(序列辨識編號：37)、PvBIP-7 (B1+B2c)(序列辨識編號：38)、PvF3-7(序列辨識編號：39)、PvB3c-7(序列辨識編號：40)、PvLPF-7(序列辨識編號：41)、PvLPB-7(序列辨識編號：42)]；用於三日瘧原蟲之引子集合[F3(序列辨識編號：19)、B3c(序列辨識編號：20)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：21)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：22)、LPF(序列辨識編號：23)、LPB(序列辨識編號：24)]；及用於卵形瘧原蟲之引子集合[F3(序列辨識編號：25)、B3c(序列辨識編號：26)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：27)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：28)、LPF(序列辨識編號：29)、LPB(序列辨識編號：30)]。
此處，瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲各自之特異性引子為可特異性擴增該等瘧原蟲種屬共通之18S rRNA基因之一特定區及惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲各自之18S rRNA基因之各個特定區。
使用本發明之LAMP接受檢測/鑑別特徵化之瘧原蟲屬及四種瘧原蟲之序列實例包括寄存於基因存庫之下列18S rRNA基因：惡性瘧原蟲(惡性瘧原蟲：基因存庫存取號碼 M19173.1、M19173.2、M19172)、間日瘧原蟲(間日瘧原蟲：基因存庫存取號碼U03079、U03080、X13926)、三日瘧原蟲(三日瘧原蟲：基因存庫存取號碼M54897)、及卵形瘧原蟲(卵形瘧原蟲：基因存庫存取號碼L48986、L48987)。
藉恆溫基因擴增，通常於60℃至65℃之溫度範圍歷15分鐘至1小時，使用前述五種引子集合中之至少一個集合遵照LAMP程序，進行存在於檢體中之瘧原蟲屬或四種瘧原蟲中之一者之檢測或鑑別。換言之，收集自檢體諸如血樣等之DNA係藉已知方法分離，此種DNA使用該引子集合擴增。已擴增之DNA產物的存在容易藉LAMP檢測，或藉一般電泳方法檢測。
前述容易檢測包括：1)目測檢驗擴增反應混合物是否有白色濁度(WO 2001/83817);2)使用螢光物質諸如螢光素、異硫氰酸螢光素(FITC)、X-若丹明(ROX)等測定反應混合物之螢光偏極化值之方法(日本專利公開案第2002-272475號)，該方法係使用連續螢光計諸如ABI稜鏡(Prism)7700(應用生物系統公司產品)等，允許擴增或動態分析之驗證；及3)使用SYBR綠色2之視覺檢驗，該方法使用螢光綠色染料作為插層劑(WO 2002/103053)。藉此等方法中之任一者，可藉肉眼檢驗任一種擴增產物之存在與否(標靶18S rRNA基因之存在與否)。
根據本發明，提供可同時或分開檢測瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲中之任一者之一種瘧原蟲檢測套件組。
前述瘧原蟲檢測套件組可與用於檢測使用本發明之引子集合所擴增之核酸所需之各類型試劑預先包裝。特定言之，用於本發明之引子或回路引子所需之各類型寡核苷酸、作為核酸合成之酶基質之四種dNTP、具有股置換活性之樣板相依性核酸合成酶、提供酶反應之較佳條件之緩衝劑或鹽、穩定化酶或樣板之保護劑，及當適用時，檢測反應產物所需之試劑係呈套件組提供。
提供套件組組件實例：(1)含有用於瘧原蟲屬[F3(序列辨識編號：1)、B3c(序列辨識編號：2)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：3)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：4)、LPF(序列辨識編號：5)、LPB(序列辨識編號：6)]之一引子集合之反應混合物；(2)目測檢測螢光之試劑；(3)酶混合溶液(包括Bst DNA聚合酶)；(4)陽性對照(用於瘧原蟲屬)；及(5)蒸餾水。
本發明進一步提供一種抗瘧疾措施支援系統及一種瘧疾感染預防/治療措施系統系統。
瘧疾感染病人資訊包括瘧疾流行地區引發瘧疾之瘧原蟲屬陽性病人數目及該地區之攜帶者比率；以及特定言之，該資訊包括駐在該地方病流行地區之個體之個體資訊諸如姓名、性別、年齡、體重、懷孕狀態或非懷孕狀鈦、家庭結構、住址、出生地、既有疾病名稱、用藥名稱、藥物副作用史等作為基本資訊，連同其對瘧原蟲屬係呈陽性 或陰性反應及對瘧疾治療劑是否已有抵抗力及該地區之瘧原蟲攜帶者比率。用於輸入及儲存瘧疾感染病人資訊之裝置例如為電腦輸入裝置及儲存裝置。
於瘧疾流行地區引發瘧疾之瘧原蟲攜帶者比率係以瘧原蟲屬陽性個體數目除以瘧原蟲屬檢測試驗個體數目，所得商乘以100獲得之百分比表示。於本發明之抗瘧疾措施支援系統中，例如使用LAMP之瘧原蟲屬檢測方法用於瘧疾流行地區為特佳。於駐在瘧疾流行地區長時間且已經對瘧疾獲得免疫力(抵抗力)之個體中，個體血液中之瘧原蟲數目低抵瘧疾發生病人體內之瘧原蟲數目之約百分之一至約千分之一。如此，少量瘧原蟲使用高度靈敏度之顯微鏡檢極為困難。此外，於瘧疾感染及潛伏期之後，於因血中出現瘧原蟲導致發燒之早期，瘧原蟲數目少，因此瘧原蟲之顯微鏡檢極為困難。當已經投予瘧疾治療劑，由於治療劑效果，個體血液中之瘧原蟲數目已經顯著減少時高度靈敏度的顯微鏡檢也極為困難。
於許多瘧疾流行地區，不存在有或無法提供滿意的DNA萃取器。於用於PCR之DNA製備中，當無法使用萃取套件組獲得高度純質之DNA時，由於血中存在有PCR之DNA擴增酶抑制劑，不會發生PCR故無法執行PCR。
於用於本發明之抗瘧疾措施支援系統中之瘧原蟲屬檢測方法中，例如藉由收集得自病人指尖之極小量血液，於沸水中沸騰血液10分鐘，其於10000 rpm離心血液1分鐘，獲得可用作為DNA之上清液，可極為容易地獲得DNA樣 本。因此，其中於檢體中之瘧原蟲屬係使用之擴增瘧原蟲屬18S rRNA基因序列之一特定區之本發明之瘧原蟲屬檢測引子套件組檢測之方法可優異地用於瘧疾流行地區。進一步，當不僅對瘧疾流行地區之個體進行研究，同時也對該地方病流行地區收集得之蚊子攜帶瘧原蟲之比例進行研究，基於攜帶瘧原蟲蚊子之研究來獲得瘧疾大流行預測之重要資料時，因本發明方法所使用之DNA比較PCR之DNA更容易從蚊子萃取獲得，故使用可擴增瘧原蟲屬18S rRNA基因序列之一特定區之本發明之瘧原蟲屬檢測引子集合所得檢體中之瘧原蟲屬檢測頻率可儲存於儲存裝置來作為瘧疾感染預防公共衛生措施資料庫中用於瘧疾大流行預測之一塊資訊。
比較顯微鏡檢術及PCR，根據本發明之瘧原蟲屬或四種瘧原蟲之檢測或鑑別方法較簡單、較廉價、更容易操作且具有較高敏感度及較高特異性，因此用於地方病流行地區為最佳。
基於瘧疾感染病人資訊而用於瘧疾感染流行地區之公共衛生措施包括下列(1)至(4):(1)由該流行地區消除蚊子最可能產卵的環境，及藉消滅不流動水中孵化的蚊子及蚊子幼蟲來清除蚊子的來源；(2)於房舍、棚庫等噴灑殺蟲劑，裝設有紗網的門窗且較佳若房舍住戶付得起於房舍安裝空調設備；(3)提供浸漬以殺蟲劑(以類除蟲菊酯為主的殺蟲劑：波美席靈(permethrin))之有捕蚊網之床鋪(有長期功效之捕蚊網：LLIN，住友化學公司(Sumitomo Chemical Co., Ltd.))，人體皮膚噴灑含昆蟲驅除劑(二乙基甲苯甲醯胺：DEET)之昆蟲驅除噴霧劑，及採行諸如日落後穿長袖、衣服上噴霧殺蟲劑等措施；以及(4)基於該地方病流行地區高頻率出現的瘧原蟲及抗藥性種系之相關資訊，預防性投予治療劑諸如美佛奎(mefloquine)與亞特蘇奈(artesunate)之混合物、氯奎(chloroquine)、亞特米希寧(artemisinin)、奎寧、朵希環素(doxycycline)等，因此瘧疾治療劑也可作為瘧疾預防劑。
用於感染陽性病人，使用瘧疾治療劑滅絕瘧原蟲(治療)列入考量。地方病流行地區高頻率出現的瘧原蟲及抗藥性種系之相關資訊可得自有地方病流行地區國家之衛生部網站；日本衛生科學基因會，策略新藥發展綜合研究計畫，熱帶病之化學治療研究小組(http://www.miyazaki-med.ac.jp/parasitology/orphan/HtML/page-DL.html)，寄生蟲病化學治療指南，修訂版本6.0(2007年)；及瘧疾化學預防專家會議指導方針，公告日期2005年3月(http://jsp.tm.nagasaki-u.ac.jp/modules/tinyd3/index.php?id=2)。基於化學治療劑已知之選擇標準，容易根據藉本發明方法所檢測或所示別之瘧原蟲種屬而選用瘧疾治療劑。
指示前述公共衛生措施(1)至(4)中之哪一者須優先給予之措施之優先順序係考慮該地區之瘧疾普及程度、該國家之經濟狀況、居民之環境條件及經濟條件等決定。容易由國家、當地政府、自體等採行之措施(1)須優先執行，然 後期望為容易由個體及其它居民容易採行之措施(2)及(3)。
措施(4)亦即預防性投予治療劑，考慮瘧疾流行地區居民之普遍經濟情況則為較低優先順序，且措施(4)可能受有特殊需求之居民諸如嬰兒、孕婦等所限。措施(4)於目前並不足。各向措施之優先順序係依據地方病流行地區而異，例如較佳為(1)>(2)=(3)>(4)，由實用觀點較佳為(2)=(3)>(4)>(1)。鑑於瘧疾普及程度、該國經濟情況、居民之環境及經濟條件等，此種措施優先順序擷取於公共衛生措施擷取區段(例如程式)，且顯示於公共衛生措施顯示區段(例如顯示器)。
於瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫中，其中已經輸入瘧原蟲感染區域之公共衛生措施選擇資訊，該資料庫所儲存之資訊如前文說明，可包括於該地區實際上地方流行之瘧疾類型及頻率、有關抗藥性種系之資訊、公共衛生措施(1)至(4)之相關資訊、有關該等措施、瘧疾大流行預測、瘧疾診斷方法之指示資訊及對各種感染的瘧原蟲個別選用藥物之相關資訊。
使用萃取自一個體之DNA，進行本發明之瘧原蟲檢測方法來獲得有關該個體之瘧疾感染存在與否之感染病原資訊；且此項資訊對得自公共衛生擷取區段之瘧疾感染流行地區之公共衛生措施及其優先順序做查證，該擷取區段係由瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫擷取公共衛生措施之優先順序，及公共衛生顯示區段做顯示於該公共衛生措施擷取區段所擷取之公共衛生措施及其優先順序。如 此，地方病流行地區之當地政府或個體需採行之公共衛生措施可循序執行或同時執行。此外，此等公共衛生措施之效果可儲存於瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫作為資訊。如此更新瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫。本發明之抗瘧疾措施支援系統如此提供予瘧疾流行地區。
本資訊包括個體是否感染瘧原蟲之資訊可藉習知技術使用PC(個人電腦)或行動電話、傳真等管理及獲得。欲儲存於瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫可使用個人電腦或行動電話得自網際網路之網站或得自小手冊。
於本發明之抗瘧疾措施支援系統中，載明對四種瘧原蟲中之一者或多者感染有作用之瘧疾治療劑之瘧疾治療劑輸入與儲存裝置表示考慮於各個瘧疾流行地區之抗藥性種系實際出現情況及其程度，或考慮各型瘧疾之臨床症狀、病人、年齡及是否懷孕狀態，用來將資訊儲存於「治療指南資料庫」之裝置，該等資訊包括藥效、藥物名稱、俗名、各藥物較佳施用區域、投藥期長短、劑量、副作用類別及頻率、副作用嚴重程度禁忌症、有關嬰兒及孕婦之資訊、有關合併使用其它藥物之資訊、藥物價格等資訊。
要緊地，患有因瘧疾感染所造成之發燒病人需與患有其它感染諸如流行性感冒病人做鑑別診斷，原因在於瘧疾感染及特別為惡性瘧原蟲感染一旦治療延誤可能導致嚴重後果。因此，期望有即刻、高度敏感且高度特異性之鑑別診斷。特別，如前文說明，並未存在有滿意的DNA萃取器，或於許多瘧疾流行地區並未提供DNA萃取器，且於發燒的 早期，瘧原蟲數目太少而不易做瘧原蟲之顯微鏡檢鑑別。
使用根據本發明之包含惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之特異性序列之一引子集合鑑別惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之方法或其鑑別/檢測套件組允許比較其它鑑別方法諸如PCR及顯微鏡檢術更容易、更快速且有更高敏感度及更高特異性來鑑別感染四種瘧原蟲中之一者或多者。
進一步，本發明之瘧原蟲檢測/鑑別方法允許監視瘧疾治療劑投予感染瘧疾病人之治療效果。
本發明之系統係基於瘧疾特異性檢測或鑑別技術。「用於輸入及儲存包括瘧疾流行地區之發生病人之瘧疾感染病原相關資訊之病人資訊輸入裝置」為用於輸入及記憶/儲存個體資訊於個人電腦之裝置，包括有關瘧疾流行地區之發燒病人之瘧疾感染病原及發燒病人之姓名、年齡、性別、體重、是否懷孕、家庭結構、住址、出生地、既有病名、服用藥名、藥物副作用史等資訊。輸入及記憶/儲存可基於得自地方病流行地區之資訊由電腦或行動電話或醫療機構及醫院傳真執行。
「用於輸入及儲存病人資訊包括於非瘧疾流行地區之發燒病人之瘧疾感染病原之相關資訊之病人資訊輸入裝置」係與「用於輸入及儲存病人資訊包括於瘧疾流行地區之發燒病人之瘧疾感染病原之相關資訊之病人資訊輸入裝置」相同，但發燒病人為「瘧疾流行地區之發燒病人」。
於前文說明中，「包含一治療指南資料庫，於其中，根 據於個體檢測得之抗瘧原蟲功效指標，輸入瘧疾治療劑選擇資㧁訊連同優先順序，其指示於選擇用來對抗瘧原蟲時須投予之瘧疾治療劑之優先順序；一瘧疾治療劑擷取區段，其係根據個體之瘧疾感染病原相關資訊，由該治療指南資料庫中擷取欲投予之瘧疾治療劑及其優先順序；以及一瘧疾治療劑顯示區段，其係顯示於前述瘧疾治療劑擷取區段所擷取之瘧疾治療劑連同其優先順序」係指下述程序，其中臨床職業醫師或醫院醫師已經獲得有關於瘧疾流行地區或非瘧疾流行地區之發燒病人之瘧疾感染病原相關資訊顯示，顯示於選擇抗瘧原蟲感染時因優先投予之瘧疾治療劑，考慮感染發燒病人之瘧原蟲種屬、病人症狀及其它條件，使用各種治療劑之功效指標，諸如用於惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之感染或用於此等瘧原蟲中之兩種或多種之複雜感染之功效特異性，以及進一步從儲存於「治療指南資料庫」中之瘧疾治療劑資訊，查出包括發燒病人之瘧疾感染病原及其它條件之病原資訊包括例如藥效、藥名、俗名、個別藥物之較佳施用區域、作用特異性、投藥期、劑量、副作用類型及頻率、副作用嚴重程度、禁忌症、嬰兒及孕婦之相關資訊、與其它藥物合併使用之相關資訊、藥物價格等。
根據本發明之抗瘧疾措施支援系統，臨床執業醫師及醫院醫師可於個人電腦或透過有習知作業軟體之行動電話從瘧疾治療劑指南資料庫中查出發燒病人之瘧疾感染病原之相關資訊，藉此獲得選用時須優先給予哪一種瘧疾治療 劑或哪些瘧疾治療劑應合併使用之顯示。
前述瘧疾治療劑資訊可儲存於「治療指南資料庫」，參考日本衛生科學基因會，策略新藥發展綜合研究計畫，熱帶病之化學治療研究小組(http://www.miyazaki-med.ac.jp/parasito1ogv/orphan/HtML/page-DL.html) ，寄生蟲病化學治療指南，修訂版本6.0(2007年)；及瘧疾化學預防專家會議指導方針，公告日期2005年3月(http://jsp.tm.nagasaki-u.ac.jp/modules/tinyd3/index.php?id=2)；及美國CDC(疾病防治中心)之瘧疾治療指導方針。
舉例言之，由於惡性瘧原蟲種系具有氯奎抗藥性之數目日增，故於泰國及已開發國家考慮合併投予美佛奎及亞特蘇奈作為優先給予之瘧疾治療。另一方面，於反映藥物價格方面，於某些情況下考慮優先給予第二代藥物凡賽德(fansidar)。對間日瘧原蟲及卵形瘧原蟲，於造成臨床症狀諸如發燒之紅血球期考慮優先選用氯奎，然後進行皮瑪奎(primaquine)投藥為期兩週用以完全治癒且預防瘧疾的復發。此外，對抗三日瘧原蟲考慮優先選用氯奎。
此等資訊也儲存於「瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫」。
有關使用本發明之抗瘧疾措施支援系統，以選用作用優先投予之瘧疾治療劑之藥物治療發燒病人之瘧疾結果之相關資訊回授至「瘧原蟲治療指南資料庫」及「瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫」且儲存為已更新的資訊。
如此，可提供一種抗瘧疾措施支援系統，經由將瘧疾流行地區發燒病人或非瘧疾流行地區發燒病人萃取得之檢體接受根據本發明之四種瘧原蟲中之一種或多種(複雜)感染鑑別方法處理，可容易地快速地且以高敏感度及高度特異性得知有關發燒病人之瘧疾感染病原之相關資訊；以及其中瘧疾流行地區或非瘧疾流行地區之臨床執業醫師或醫院醫師可從瘧原蟲治療指南資料庫中為該因瘧疾感染而已經發燒病人查出應優先給予之較佳治療劑及投藥方法，且可將此種藥物及方法應用於發燒之瘧疾感染病人的治療上。
綜觀於瘧疾流行地區之瘧疾感染預防公共衛生措施及於瘧疾流行地區或非流行地區之瘧疾感染發燒病人之治療，本發明也提供一種於流行地區清除瘧疾之抗瘧疾措施支援系統，該系統組合：使用根據本發明之瘧原蟲檢測方法，獲得瘧疾流行地區之瘧疾感染病人資訊；使用對瘧疾流行地區之當地政府、自體或居民使用該抗瘧疾措施支援系統來獲得瘧疾流行地區或非流行地區之發燒病人之瘧疾感染病原之相關資訊，其中使用瘧疾感染預防公共衛生措施資料庫及根據本發明用於鑑別四種瘧原蟲中之一種或多種感染之鑑別方法或套件組；以及提供一種抗瘧疾措施支援系統，其中於瘧疾流行地區或非流行地區之臨床執業醫師或醫院醫師使用該瘧原蟲治療指南資料庫，可選出對瘧疾感染發燒病人需優先投予之較佳治療劑及投藥方法，且將該藥物及方法應用於瘧疾感染發燒病人之治療上。
前述各片資料可使用個人電腦輸入與儲存，可於該地區透過個人電腦或行動電話或通過小冊子顯示。
本發明進一步提供由非瘧疾流行地區至瘧疾流行地區旅行者之瘧疾感染預防措施系統。本發明提供一種對計畫至瘧疾流行地區旅行者之瘧疾感染預防措施系統，該方法包含由前述抗瘧疾措施支援系統中，獲得於該瘧疾流行地區之公共衛生措施執行狀態、於該流行地區之瘧疾感染病原相關資訊及感染病人之治療狀態；從瘧原蟲治療指南資料庫中選出瘧疾預防/治療劑；以及於旅行前投予該選定藥劑之手段。
由瘧疾流行地區或國家政府使用個人電腦或行動電話容易從網際網路網站取得相關各片資訊，或以小冊子提供之資訊。對計畫至瘧疾流行地區旅行者使用該瘧疾感染預防措施系統，計畫至瘧疾流行地區旅行者可事先了解該地區流行之瘧疾感染及抗藥性種系出現狀態。如此，為了預防瘧疾感染，於旅行前，該旅行者可接受對抗該地區流行之瘧疾感染優先選用之較佳瘧疾治療劑，因而即使該旅行者感染瘧疾，也可早期減輕瘧疾感染症狀諸如發燒，且可預防嚴重病情，因而可早期消滅此等旅行者血液中之瘧原蟲。
本發明進一步提供一種用於從瘧疾流行地區返回者之瘧疾感染預防/治療措施系統，該系統包含：由該抗瘧疾措施支援系統，獲得瘧疾流行地區之公共衛生措施執行狀態、流行地區瘧疾感染病原相關資訊、及感染病人治療狀 態之手段；由瘧原蟲治療指南資料庫選擇瘧疾預防/治療劑之手段；以及從瘧疾流行地區返回後投予該選定藥劑之手段。根據本發明，由於依據感染瘧原蟲之種屬而定，出現臨床症狀諸如發燒前之潛伏期由1週至40天不等，故當返回者從瘧疾流行地區返回前感染瘧原蟲以及返回者知曉返回前曾經被蚊蟲叮咬，可參照得自抗瘧疾措施支援系統之資訊，選擇及投予對抗引發感染之瘧原蟲之較佳瘧疾治療劑，因此可早期減輕瘧疾感染症狀諸如發燒且即使返回者已經感染瘧疾也可預防重症病情，因而可早期消滅蟲瘧疾流行地區返回者血中之瘧原蟲。
本發明也提供用於從瘧疾流行地區返回者之瘧疾感染預防/治療措施系統，其中於前述用於從瘧疾流行地區返回者之瘧疾感染預防/治療措施系統中，當從瘧疾流行地區返回者發燒時，執行惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之鑑別，用以選擇及投予應優先投予之瘧疾治療劑。
進一步，使用本發明之瘧原蟲檢測/鑑別方法於本發明之瘧疾感染治療措施系統，可監視投予瘧疾感染病人之瘧疾治療劑之療效。
於前文說明中當返回者於投予瘧疾治療劑之前出現發燒時，得自發燒返回者之檢體接受根據本發明之四種瘧原蟲鑑別方法之處理來鑑別惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲或多種(複雜)感染，以及選定並投予選用於對抗該等瘧原蟲時應優先投予之瘧疾治療劑。如此本 發明之瘧疾感染治療措施系統提供瘧疾感染治療之適當方法及監視其療效之適當方法。
如第3圖所示，公共衛生措施結果相關資訊、發燒病人之瘧疾治療結果相關資訊及預防/治療劑投予結果之相關資訊回授至個別資料庫。
實例
下列實例舉例說明本發明之進一步細節，但非意圖限制本發明之範圍。
實例1 材料及方法：
從曾經於泰國西北梅索(Mae Sod)及梅卡薩(Mae Kasa)之瘧疾診所求診病人，收集68個樣本，樣本藉顯微鏡檢術確定為瘧原蟲陽性。此外於泰國西部崁恰納布里(Kanchanaburi)之瘧疾流行地區居民收集53個藉顯微鏡檢術呈現陰性之樣本。
血樣藉顯微鏡檢術及LAMP測試。各項測試係由對檢體來源以及檢驗結果無資訊之獨立研究學者進行(顯微鏡檢術係於泰國國防醫學研究所進行，LAMP係於日本伊喜米(Ehime)大學進行)，最終，比較及分析試驗結果。
顯微鏡檢術：
由有熟練經驗之顯微鏡檢師於1,000倍放大下檢查稠厚周邊血液抹片來鑑別瘧原蟲。計算每500顆白血球之瘧原蟲密度，然後假設白血球數目為每微升7,000個，算出每微升之瘧原蟲數目。於計算500顆白血球後若未找到瘧原蟲， 則該初始厚抹片被視為陰性。
DNA萃取：
用於LAMP之DNA樣板係如Plowe, C.等人所述製備(Am. J. Trop. Med. Hyg. (1995)Vol. 52:565-568)。25至50微升人血打墨點於濾紙上成為單點及乾燥。割下各個濾紙上的單一血點，於4℃於1毫升0.5%皂素於磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)中於室溫培養4小時及/或於4℃隔夜培養。濾紙於4℃ PBS中洗30分鐘，轉移至含200微升5%奇雷士(Chelex)-100(拜雷公司(Bio-Rad)，加州赫克利斯)之新試管內及渦旋30秒。混合物於56℃孵育15分鐘，渦旋30秒及於100℃加熱15分鐘來洗提DNA、渦旋及離心(10,000xg 5分鐘)。上清液係於反應後即刻使用或整份儲存於-20℃。
LAMP條件：
使用於Poon等人(非專利文件1)所述之用於惡性瘧原蟲之LAMP引子集合。嘗試使用LAMP引子設計軟體PrimerExplorer V3 (http://primerexplorer.jp/e/；富士通公司製造)設計其餘瘧原蟲屬-特異性及種-特異性LAMP引子集合。但瘧原蟲基因之核苷酸序列與其它種有機體之核苷酸序列通常有重大差異，含高量AT含量；因此無法使用前述引子設計軟體找出最佳引子集合。如此，需要多次嘗試錯誤，於引子設計上遭遇困難。但最後於有無數種組合之合成集合引子中可找出具有足夠供實際應用之敏感度及特異性之引子集合。如此，基於18S rRNA基因之屬-特異性及種特異性核苷酸序列，成功地設計可檢測一次感染病人之四 種瘧原蟲屬之基因特異性引子集合以及對四種瘧原蟲(惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲)個別特異性引子集合。
於如前文說明設計寡核苷酸之核苷酸序列後，藉已知方法例如使用自動化DNA合成器伯金愛瑪公司(Perkin-Elmer)製造，合成多個引子。
各引子之位置及核苷酸序列顯示於第1圖。
特定言之，使用瘧原蟲屬之引子集合及個別四種瘧原蟲之引子集合：用於瘧原蟲屬之引子集合[F3(序列辨識編號：1)、B3c(序列辨識編號：2)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：3)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：4)、LPF(序列辨識編號：5)、LPB(序列辨識編號：6)]；用於惡性瘧原蟲之引子集合[F3(序列辨識編號：7)、B3c(序列辨識編號：8)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：9)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：10)、LPF(序列辨識編號：11)、LPB(序列辨識編號：12)]；用於間日瘧原蟲之引子集合[F3(序列辨識編號：13)、B3c(序列辨識編號：14)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：15)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：16)、LPF(序列辨識編號：17)、LPB(序列辨識編號：18)]；用於三日瘧原蟲之引子集合[F3(序列辨識編號：19)、B3c(序列辨識編號：20)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：21)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：22)、LPF(序列辨識編 號：23)、LPB(序列辨識編號：24)]；用於卵形瘧原蟲之引子集合[F3(序列辨識編號：25)、B3c(序列辨識編號：26)、FIP (F1c-F2)(序列辨識編號：27)、BIP (B1-B2c)(序列辨識編號：28)、LPF(序列辨識編號：29)、LPB(序列辨識編號：30)]。
使用陸安普(Loopamp)DNA擴增套件組(日本東京榮研化學公司(Eiken Chemical Co., Ltd.))執行LAMP反應。
反應混合物(25微升)含有各1.6至2.4 μM之FIP及BIP，各0.2 μM之F3及B3c，各0.8 μM之LPF及LPB，2x反應混合物(12.5微升)，Bst DNA聚合酶(1微升)及1至2微升DNA樣本(相當於約0.125微升至0.5微升血液)。
LAMP反應於60℃執行100分鐘，然後酶於80℃鈍化2分鐘。
LAMP產物之分析：
LAMP反應造成試管之濁度係與已擴增的DNA數量成正比。因此，以肉眼觀察濁度。為了驗證LAMP的敏感度，藉陸安普即時濁度計(RT-160C，日本東京榮研化學公司)監視濁度。
為了進一步驗證，5微升LAMP產物於3%瓊脂糖凝膠於100伏特電泳，接著使用瑪斯尺規(MassRuler)DNA梯接標記器(佛曼特司公司(Fermentas Inc.)，馬里蘭州哈努維)以溴化乙鎓染色。藉已放大產物之限剪酶消化評估LAMP之特異性。
基於各LAMP產物之標靶序列之限剪酶拼圖，選定Ddel 用於瘧原蟲屬-特異性LAMP產物之限剪酶分析，HpyCH4V用於惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、及三日瘧原蟲及限剪酶AluI用於卵形瘧原蟲。於37℃消化隔夜後，已消化的產物藉瓊脂凝膠電泳分析。
LAMP結果之診斷臨界值：
使用陸安普即時濁度計監視LAMP反應產物之形成。大部分多次測試之陽性樣本於1小時內顯示陽性。因此，考慮藉濁度計於1小時內具有大於或等於臨界值之濁度之樣本視為陽性。
陽性對照質體DNA及定序：
用於敏感度評估，對各種屬組成用於LAMP反應之含18S rRNA基因標靶區之質體。標靶DNA序列藉PCR使用兩個LAMP引子(F3及B3c)擴增，然後轉殖入pCR 2.1-TOPO TA轉殖載體(英維仇貞公司(Invitrogen)，加州卡斯貝)。
使用自動化DNA定序器(ABI稜鏡310基因分析儀，應用生物系統公司)測定核苷酸序列。
LAMP之分析敏感度及特異性：
為了確立可藉LAMP檢測之標靶基因序列之最小套數(檢測低限)，使用陽性對照質體DNA作為樣板。使用質體DNA(106 至1套)稀釋於無菌水之10倍串列稀釋液，建立LAMP之標準曲線。對各標準，將套數相對於臨界時間作圖。所得作圖藉線性迴歸分析，藉ANOVA(自由統計與預測軟體v1.1.21:http://www.wessa.net/rwasp_kendall.wasp)分析γ2 值之統計顯著性。低於.05之概略視為統計上顯著。對 各對照質體DNA及純化自NF54種系之惡性瘧原蟲基因體DNA (gDNA)、純化自Sal-I種系之間日瘧原蟲gDNA、純化自鳥干達種系之三日瘧原蟲gDNA及純化自CDC種系之卵形瘧原蟲CDC型gDNA，評估種特異性及屬-特異性LAMP之敏感度。
瘧原蟲屬-及種-特異性LAMP之分析敏感度及特異性結果：用於瘧原蟲屬及四種瘧原蟲亦即惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之LAMP之敏感度為對三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲為10套，及對瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲及間日瘧原蟲為100套。
各LAMP反應之特異性進一步藉LAMP產物之限剪酶消化驗證。所得消化產物大小與預測大小吻合良好。
臨床敏感度及特異性：對121個全血樣本使用顯微鏡檢術做為參考標準方法，計算瘧原蟲LAMP之臨床敏感度及特異性。敏感度之計算式為(真陽性數目)/(真陽性數目+偽陰性數目)，及特異性之計算式為(真陰性數目)/(真陰性數目+偽陽性數目)。
臨床敏感度及特異性：顯微鏡檢與LAMP之比較：顯微鏡檢術及LAMP結果列舉於表2。
68位藉顯微鏡檢呈瘧原蟲陽性之病人中，12位病人診斷患有惡性瘧原蟲感染，34位有間日瘧原蟲感染，12位有三日瘧原蟲感染，5位有卵形瘧原蟲感染，及5位有惡性瘧原蟲與間日瘧原蟲之混合型感染。其餘53個樣本藉顯微鏡 檢呈陰性。
68個樣本中，使用屬-特異性引子集合之LAMP檢測得67個樣本中之瘧原蟲(98.5%敏感度)。53個顯微鏡檢呈陰性之樣本中，屬-特異性LAMP於3個樣本檢測得瘧原蟲(94.3%特異性)。
藉LAMP呈陽性但藉顯微鏡檢呈陰性之3個樣本再度藉LAMP測試。
3個樣本皆再度藉屬-特異性LAMP呈陽性；藉屬-特異性LAMP診斷一個樣本有惡性瘧原蟲而另外兩個有間日瘧原蟲。
如此，推定LAMP比顯微鏡檢更敏感，可減少臨床上可能造成疏忽出錯的偽陰性診斷至最低可能程度。
藉顯微鏡檢為惡性瘧原蟲陽性之12個樣本藉屬-特異性LAMP皆為惡性瘧原蟲陽性。於藉顯微鏡檢術對間日瘧原蟲呈陽性之34個樣本中，藉LAMP診斷兩個樣本帶有卵形瘧原蟲感染，及一個樣本帶有惡性瘧原蟲及間日瘧原蟲之混合型感染。於惡性瘧原蟲呈陽性的12個樣本中，一個樣本診斷帶有卵形瘧原蟲，及一個樣本有惡性瘧原蟲及間日瘧原蟲之混合型感染。
前述結果指示藉本發明人發展出之新穎LAMP瘧疾診斷方法具有比顯微鏡檢術更高的敏感度及更高的特異性，為檢測4種人瘧原蟲之優異方法。
藉LAMP之平均檢測時間如下。
屬-特異性LAMP:25.7±4.9分鐘(平均±標準差；19.4至 52.9分鐘)；惡性瘧原蟲特異性LAMP:31.7±4.8分鐘(25.8至44.9分鐘)；三日瘧原蟲特異性LAMP:30.6±5.2分鐘(25.4至46.9分鐘)；間日瘧原蟲特異性LAMP:34.8±4.8分鐘(30.5至46.6分鐘)；及卵形瘧原蟲特異性LAMP:36.1±6.8分鐘(29.9至49.8分鐘)。此等結果顯示LAMP可於比巢套PCR之擴增時間顯著更短之一段時間內做出診斷。
實例2
根據本發明之用於檢測瘧原蟲屬及瘧原蟲種屬之引子集合及使用該等引子集合分開或同時檢測或鑑別瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲之方法於泰國西北梅索該處為瘧疾地方病流行地區之瘧疾診所，接受與PCR及顯微鏡檢術之比較試驗。
也於使用特別設計用於LAMP之設備進行前述方法與可於瘧疾流行地區快速容易地執行之程序進行前述方法間做比較。
使用藉顯微鏡檢術對瘧原蟲呈陽性之18個樣本(寄生蟲血症百分比：0.04%至0.31%)；顯然為技術誤差之一個樣本由前述實例中排除。
根據本發明，使用沸騰方法來由病人血樣中萃取DNA 用於瘧疾流行地區快速且容易地檢測及鑑別瘧原蟲(可同時檢測瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲)。特定言之，50微升蒸餾水(D.W.)添加至50微升血樣，所得混合物於99℃沸騰5分鐘，接著離心(5415D，伊盆朵夫(Eppendorf)製造；16,000xg)來獲得上清液。
隨後，含DNA之2微升如上所得上清液添加至23微升反應混合物，該反應混合物含有1微升Bst DNA聚合酶(艾皮桑特生技公司(Epicentre Biotechnologies))，12.5微升2x反應混合物，1.6至2.4 μM實例1所得引子集合中之FIP及BIP，0.2 μM實例1所得引子集合中之F3及B3c，及0.8 μM實例1所得引子集合中之LPF及LPB，以及於可容納96x2(共192)根試管之恆溫水浴(社莫麥德(Thermominder)SM-05R，台泰克公司(TAITEC)製造)中於60℃反應約60分鐘。
目測觀察得反應產物之濁度存在與否，直接檢測瘧原蟲屬感染之存在與否且鑑別惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲中之哪一種引發感染。
另外，萃取自前述各試樣之含DNA反應混合物使用陸安普即時濁度計(LA-320C，榮研化學公司製造)於60℃反應約60分鐘來即時監視反應產物之生成。
進一步，為了就瘧疾種屬診斷上與PCR做比較，對相同樣本進行巢套PCR。因PCR反應要求嚴格條件，故當藉沸騰法而直接萃取自臨床樣本之DNA就此使用時，PCR反應可能受抑制。如此，於瘧疾診所所得試紙上的乾燥血樣帶 到泰國曼谷設備良好的檢驗院，使用DNA萃取套件組(快安普(QIAamp)DNA迷你套件組，快貞(QIAGEN)公司產品)萃取DNA及接受PCR。於巢套PCR中，各進行兩回合PCR歷2小時，共歷4小時。隨後，所得樣本接受瓊脂糖凝膠電泳且以螢光染色，檢測共進行5小時。
結果，使用瘧原蟲屬引子來檢測是否有瘧原蟲屬感染中，藉顯微鏡檢檢測18個樣本對瘧原蟲呈陽性，當使用特別設計用於LAMP之陸安普即時濁度計測試樣本時18個呈陽性，及當於恆溫水浴中反應接著視覺觀察測試樣本時，18個樣本也呈陽性。兩項試驗的吻合程度達100%。
表1比較使用瘧原蟲屬-特異性引子診斷瘧原蟲屬中，顯微鏡檢術、巢套PCR及LAMP之試驗結果；且比較使用特別設計用於LAMP擴增器之結果與於恆溫水浴中反應後目測觀察之結果。
如表1顯然易知，就惡性瘧原蟲而言，只有3個樣本接受PCR。於表中，Pf指示惡性瘧原蟲、Pv指示間日瘧原蟲 及Po指示卵形瘧原蟲。
結果，於一個藉顯微鏡檢術診斷為感染間日瘧原蟲及卵形瘧原蟲二者之樣本中，PCR及LAMP(使用特別設計用於LAMP之擴增儀之試驗，及於恆溫水浴反應後使用目測觀察之試驗二者)二者皆檢測得間日瘧原蟲但未檢查得卵形瘧原蟲，指示顯微鏡檢術診斷結果錯誤。
換言之，於比較試驗中，18個LAMP反應中有17個的結果匹配顯微鏡檢術結果(94%吻合度)。如此表示若排除前述一個不吻合顯微鏡檢術結果之反應結果，則LAMP反應結果100%吻合顯微鏡檢術結果。此等結果顯示根據本發明之用於檢測瘧原蟲屬及瘧原蟲種屬之引子集合以及使用此等引子分開或同時檢測或鑑別瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲之方法用於瘧原蟲感染之檢測及鑑別上與顯微鏡檢術診斷吻合度100%；以及使用特別設計用於LAMP之試驗結果100%吻合於恆溫水浴反應後目測觀察得的結果。於瘧原蟲種屬之診斷中，引子集合與方法之吻合度100%，達成相當於PCR之敏感度。
驗證對於根據本發明之用於檢測瘧原蟲屬及瘧原蟲種屬之引子集合以及使用此等引子集合分開或同時檢測或鑑別瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲之方法特別於瘧疾流行地區，DNA可藉沸騰法萃取，該方法快速簡單且價廉，以及DNA擴增反應可使用恆溫水浴進行，故可廉價處理大量樣本。
根據本發明之用於檢測瘧原蟲屬及瘧原蟲種屬之引子 集合以及使用此等引子集合分開或同時檢測或鑑別瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲之方法可比較顯微鏡檢術更快速且更容易地應用，具有相當於PCR之敏感度。因此，引子集合及方法可優異地現場應用特別為瘧疾流行地區應用於大量樣本同時快速簡單地檢測及鑑別診斷瘧原蟲屬及種。
實例3
根據本發明，由瘧疾流行地區短時間內現場(診所中)所得試驗結果，基於儲存於「治療指南資料庫」之瘧疾治療劑資訊中之治療劑及其優先順序相關資訊，美佛奎及亞特蘇奈可處方投予實例2中診斷且鑑別為感染惡性瘧原蟲之5位病人。同理，氯奎及皮瑪奎可處方用於診斷且鑑別為感染間日瘧原蟲之13位病人。如此，可操作抗瘧疾措施支援系統，可於瘧疾流行地區快速且可靠地檢測是否感染瘧原蟲及提供瘧疾治療。
實例4
如前文說明，於瘧疾流行地區簡單且容易地檢測瘧原蟲屬(特別為混合感染之存在與否)相當重要。
發明人對於可檢測瘧原蟲種屬之引子進行進一步研究。
結果，發明人發現兩類引子集合(Pv-7及Pv-9;Pv-7以序列辨識編號：37至42表示及Pv-9以序列辨識編號：31至36表示)可用於間日瘧原蟲之診斷，允許更快速之間日瘧原蟲的診斷。
當使用兩類引子集合時，驗證此等引子集合並未與惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲之任一種DNA反應。
使用可用於間日瘧原蟲診斷之兩類引子集合(Pv-7及Pv-9)比較先前發現之用於間日瘧原蟲診斷之引子集合(31分鐘)可達成更快速的診斷(Pv-7: 27分鐘；Pv-9: 24分鐘)。特別，使用引子集合Pv-9達成最快速診斷。
本發明進一步提供下列發明：
1A.一種用於檢測瘧原蟲屬之引子集合，包含含有序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合，該引子集合可擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
2A.一種用於檢測間日瘧原蟲之引子集合，包含含有序列辨識編號：13至18所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合，該引子集合可擴增間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
3A.一種用於檢測三日瘧原蟲之引子集合，包含含有序列辨識編號：19至24所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合，該引子集合可擴增三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
4A.一種用於檢測卵形瘧原蟲之引子集合，包含含有序列辨識編號：25至30所表示之核酸序列之一寡核苷酸集合，該引子集合可擴增卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
5A.一種用於檢測瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之引子集合，包含含有選自 於第1A至4A項所定義之該等核酸序列及序列辨識編號：7至12所表示之核酸序列中之核酸序列之一寡核苷酸引子集合，該引子集合可擴增瘧原蟲屬及瘧原蟲之各種屬之18S rRNA基因序列之特定區包括惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
6A.一種檢測存在於一檢體之瘧原蟲屬之方法，其中該方法係靶定瘧原蟲屬18S rRNA基因序列之一特定區，以及包含使用第1A項之一引子集合，藉LAMP選擇性擴增瘧原蟲屬18S rRNA基因序列之該特定區，以及證實已擴增產物之存在與否。
7A.一種檢測存在於一檢體之間日瘧原蟲之方法，其中該方法係靶定間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區，以及包含使用第2A項之一引子集合，藉LAMP選擇性擴增間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之該特定區，以及證實已擴增產物之存在與否。
8A.一種檢測存在於一檢體之三日瘧原蟲之方法，其中該方法係靶定三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區，以及包含使用第3A項之一引子集合，藉LAMP選擇性擴增三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之該特定區，以及證實已擴增產物之存在與否。
9A.一種檢測存在於一檢體之卵形瘧原蟲之方法，其中該方法係靶定卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區，以及包含使用第4A項之一引子集合，藉LAMP選擇性擴增卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之該特定區，以及證實已擴 增產物之存在與否。
10A.一種用於檢測存在於一檢體之瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之方法，其中該方法係靶定瘧原蟲屬18S rRNA基因序列、惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列、間日瘧原蟲18S rRNA基因序列、三日瘧原蟲18S rRNA基因序列或卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區； 以及其中該方法包含使用第5A項之一引子集合藉LAMP分別選擇性擴增瘧原蟲屬18S rRNA基因序列、惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列、間日瘧原蟲18S rRNA基因序列、三日瘧原蟲18S rRNA基因序列或卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之該特定區；以及證實一已擴增產物之存在與否。
11A.根據第10A項之檢測方法，其中該瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲係同時檢測或分開檢測。
12A.一種鑑別瘧原蟲屬之方法，包含由一檢體分離一DNA樣本，使用第1A項之一引子集合進行得自該DNA樣本之瘧原蟲屬18S rRNA基因序列之一特定區之LAMP擴增，以及證實一已擴增產物之存在與否。
13A.一種鑑別間日瘧原蟲之方法，包含由一檢體分離一DNA樣本，使用第2A項之一引子集合進行得自該DNA樣本之間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之LAMP擴增，以及證實一已擴增產物之存在與否。
14A.一種鑑別三日瘧原蟲之方法，包含由一檢體分離 一DNA樣本，使用第3A項之一引子集合進行得自該DNA樣本之三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之LAMP擴增，以及證實一已擴增產物之存在與否。
15A.一種鑑別卵形瘧原蟲之方法，包含由一檢體分離一DNA樣本，使用第4A項之一引子集合進行得自該DNA樣本之卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之LAMP擴增，以及證實一已擴增產物之存在與否。
16A.一種用於鑑別瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之方法，包含由一檢體分離一DNA樣本，使用第5A項之一引子集合對得自該DNA樣本之瘧原蟲屬18S rRNA基因序列、惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列、間日瘧原蟲18S rRNA基因序列、三日瘧原蟲18S rRNA基因序列或卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區執行LAMP擴增；以及證實一已擴增產物之存在與否。
17A.根據第16A項之鑑別方法，其中瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲中之任一者之鑑別係同時執行或分開執行。
18A.一種用於瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之檢測套件組，包含第1A至5A項中任一項之至少一引子集合、一股置換DNA聚合酶、dNTP及一反應緩衝液。
19A.根據第18A項之檢測套件組，其中該檢測套件組係同時或分開檢測瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲。
20A.一種抗瘧疾措施支援系統，包含：用於輸入及儲存瘧疾感染病人資訊之構件，該資訊包括於瘧疾流行地區引發瘧疾之瘧原蟲屬陽性病人數目及該地區之攜帶者比率；瘧原蟲感染預防公共衛生措施指導資料庫，其基於該瘧疾感染病人資訊規定用於該瘧疾流行病地區之公共衛生措施，於該資料庫中已經輸入瘧原蟲感染區與此公共衛生措施選擇資訊連同指示哪一種公共衛生措施須選擇優先給予之措施優先順序；一公共衛生措施擷取區段，其係根據該個體之有關瘧原蟲之瘧疾感染病人資訊，從該瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫中擷取有關瘧疾感染流行地區之公共衛生措施及其優先順序；以及一公共衛生措施顯示區段，其顯示於該公共衛生措施擷取區段所擷取之公共衛生措施連同其優先順序。
21A.根據第20A項之抗瘧疾措施支援系統，其中經由使用根據第1A項之檢測或鑑別方法及/或根據第6A項之引子集合或根據第19A項之瘧原蟲檢測套件組，鑑別瘧原蟲屬感染之存在與否，來獲得於瘧疾流行地區之有關瘧原蟲之瘧疾感染病人資訊。
22A.一種抗瘧疾措施支援系統，包含：用於輸入及儲存瘧原蟲治療劑資訊之構件，該資訊規定作用於四種瘧原蟲中之一種或多種感染之瘧疾治療劑；病人資訊輸入構件，用於輸入及儲存病人資訊，包括 有關於瘧疾流行地區有發燒病人之有關瘧疾感染之病原之資訊；病人資訊輸入構件，用於輸入及儲存病人資訊，包括有關於瘧疾非流行地區有發燒病人之有關瘧疾感染之病原之資訊；一種治療指南資料庫，根據於個體檢測得抗瘧原蟲之功效指標，於該資料庫中輸入瘧原蟲治療劑選擇資訊連同指示當選擇用於對抗瘧原蟲時，哪一種瘧疾治療劑須優先給予之優先順位；一瘧疾治療劑擷取區段，其係根據該個體之瘧疾感染病原之相關資訊，而由該治療指南資料庫中擷取欲投予之瘧疾治療劑及其優先順位；及一瘧疾治療劑顯示區段，其顯示於前述瘧疾治療劑擷取區段所擷取之瘧疾治療劑連同其優先順位。
23A.根據第22A項之抗瘧疾措施支援系統，其中經由使用根據第2A至5A項中任一項之一引子集合及/或根據第13A至17A項中任一項之鑑別瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之方法或根據第18A或19A項之檢測套件組，鑑別感染四種瘧原蟲中之一種或多種而獲得有關發燒病人之瘧原蟲感染病原之相關資訊。
24A一種抗瘧疾措施支援系統，其中與抗瘧疾措施相關之公共衛生措施及與抗瘧疾措施相關之瘧原蟲治療措施係合併執行；該公共衛生措施包含： 用於輸入及儲存瘧疾感染病人資訊之構件，該資訊包括於瘧疾流行地區引發瘧疾之瘧原蟲屬陽性病人數目及該地區之攜帶者比率；瘧原蟲感染預防公共衛生措施指導資料庫，其基於該瘧疾感染病人資訊規定用於該瘧疾流行病地區之公共衛生措施，於該資料庫中已經輸入瘧原蟲感染區與此公共衛生措施選擇資訊連同指示哪一種公共衛生措施須選擇優先給予之措施優先順序；一公共衛生措施擷取區段，其係根據該個體之有關瘧原蟲之瘧疾感染病人資訊，從該瘧疾感染預防公共衛生措施指南資料庫中擷取有關瘧疾感染流行地區之公共衛生措施及其優先順序；以及一公共衛生措施顯示區段，其顯示於該公共衛生措施擷取區段所擷取之公共衛生措施連同其優先順序；以及該瘧原蟲治療措施包含：用於輸入及儲存瘧原蟲治療劑資訊之構件，該資訊規定作用於四種瘧原蟲中之一種或多種感染之瘧疾治療劑；病人資訊輸入構件，用於輸入及儲存病人資訊，包括有關於瘧疾流行地區有發燒病人之有關瘧疾感染之病原之資訊；病人資訊輸入構件，用於輸入及儲存病人資訊，包括有關於瘧疾非流行地區有發燒病人之有關瘧疾感染之病原之資訊；一種治療指南資料庫，根據於個體檢測得抗瘧原蟲之 功效指標，於該資料庫中輸入瘧原蟲治療劑選擇資訊連同指示當選擇用於對抗瘧原蟲時，哪一種瘧疾治療劑須優先給予之優先順位；一瘧疾治療劑擷取區段，其係根據該個體之瘧疾感染病原之相關資訊，而由該治療指南資料庫中擷取欲投予之瘧疾治療劑及其優先順位；及一瘧疾治療劑顯示區段，其顯示於前述瘧疾治療劑擷取區段所擷取之瘧疾治療劑連同其優先順位。
25A.根據第24項之抗瘧疾措施支援系統，其中經由使用根據第1A項之一引子集合及/或根據第6A項之一檢測方法，或根據第19A項之瘧原蟲檢測套件組，鑑別瘧原蟲屬感染之存在與否，來獲得於瘧疾流行地區之有關瘧原蟲之瘧疾感染病人資訊；及/或經由使用根據第2A至5A項中任一項之引子集合及/或根據第13A至17A項中任一項之鑑別瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之方法或根據第18A或19A項之檢測套件組，鑑別感染四種瘧原蟲中之一種或多種而獲得有關發燒病人之瘧原蟲感染病原之相關資訊。
26A.一種用於計畫至瘧疾流行地區旅行者之瘧疾感染預防措施系統，該系統包含：從根據第24A項之抗瘧疾措施支援系統，獲得於該瘧疾流行地區之公共衛生措施實際執行狀態、有關於該流行地區之瘧疾感染病原相關資訊、及感染病人之治療狀態之構件；用於由瘧原蟲治療指南資料庫選擇瘧疾預防/治療劑 之構件；及於旅行前投予所選定之預防劑/治療劑之構件。
27A一種用於從瘧疾流行地區返回者之瘧疾感染預防/治療措施系統，該系統包含：獲得於該瘧疾流行地區之公共衛生措施實際執行狀態、有關於該流行地區之瘧疾感染病原相關資訊、及感染病人之治療狀態之構件；用於由瘧原蟲治療指南資料庫選擇瘧疾預防/治療劑之構件；及根據第24A項，於從瘧疾流行地區返回後投予選用之藥劑之構件。
28A.根據第27A項之瘧疾感染預防/治療措施系統，其中當由瘧疾流行地區返回者有發燒時，執行惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲之鑑別俾選擇且投予選擇中應優先給予之瘧疾治療劑。
工業應用
使用由本發明人所開發之檢測/鑑別瘧原蟲屬及四種瘧原蟲之方法具有比顯微鏡檢術更高之敏感度及更高之特異性，比較PCR可更容易且於更短時間內檢測/鑑別於檢體中之瘧原蟲。進一步，由於該方法價廉，故可用於具有不良設施之瘧疾流行地區之瘧疾臨床診斷與控制活動。也可使用該方法來組成一種新穎抗瘧疾措施支援系統(第3圖)。
序列表內文
四種瘧原蟲亦即惡性瘧原蟲(基因存庫存取號碼 M19172)、間日瘧原蟲(基因存庫存取號碼U03079或X13926)、三日瘧原蟲(基因存庫存取號碼M54897)、及卵形瘧原蟲(基因存庫存取號碼L48987)之18S rRNA序列對齊供比較用。
第1圖顯示瘧原蟲屬(A)及四種瘧原蟲(B)之LAMP標靶位置及打底位置，及18S rRNA基因核苷酸序列。(A)以箭頭指示於參考序列(基因存庫存取號碼M19173.1)中由瘧原蟲屬-特異性引子打底位置之所在。(B)四種人瘧原蟲惡性瘧原蟲(Pf；基因存庫存取號碼M19173.1)、間日瘧原蟲(Pv；基因存庫存取號碼U03079)、三日瘧原蟲(Pm；基因存庫存取號碼M54897)及卵形瘧原蟲(Po；基因存庫存取號碼L48986)之18S rRNA基因之部分序列對齊連同種-特異性引子配對煉合位置。
第2圖為使用LAMP之抗瘧疾措施支援系統之示意圖。
第3圖為基於本發明之原理之抗瘧疾措施支援系統之處理程序之流程圖。
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<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測卵形瘧原蟲之引子(LPF)
<400>29
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測卵形瘧原蟲之引子(LPB)
<400>30
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvFIP-9 (F1c+F2))
<400>31
<210>32
<211>39
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvBIP-9 (B1+B2c))
<400>32
<210>33
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<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvF3-9)
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<212>DNA
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<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvB3c-9)
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<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvLPF-9)
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<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvLPB-9)
<400>36
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvFIP-7 (F1c+F2))
<400>37
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<212>DNA
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<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvBIP-7 (B1+B2c))
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<211>16
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<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvF3-7)
<400>39
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvB3c-7)
<400>40
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<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvLPF-7)
<400>41
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>用於偵測間日瘧原蟲之引子(PvLPB-7)
<400>42

Claims (15)

  1. 一種檢測或鑑別一檢體中之感染的方法，該感染為瘧原蟲屬(Plasmodium)之感染及任擇地惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、及卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)中之一者或多者之感染；該方法包含下列步驟(a)至(c)：a)由該檢體萃取DNA；b)使用回路媒介恆溫擴增(LAMP)方法，於含有股置換DNA聚合酶(strand displacement DNA polymerase)及序列特異性引子組之反應混合物中，讓於步驟(a)所萃取之DNA反應而擴增一瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區；及c)檢測或鑑別是否存在有於步驟(b)所擴增之瘧原蟲屬之已擴增產物，其中該序列特異性引子組為含有由序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列以供用於擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區的寡核苷酸組；及任擇地檢測或鑑別是否存在有於步驟(b)所擴增之惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之一者或多者之已擴增產物，其中該序列特異性引子組為含有由序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列以供用於擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區的寡核苷酸組以及下列引子組中之一者或多者：包含含有序列辨識編號：7至12所表示之核酸序 列之一寡核苷酸組以供用於擴增惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區的一引子組；包含含有序列辨識編號：13至18、序列辨識編號：31至36、或序列辨識編號：37至42所表示之核酸序列之一寡核苷酸組以供用於擴增間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區的一引子組；包含含有序列辨識編號：19至24所表示之核酸序列之一寡核苷酸組以供用於擴增三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區的一引子組；及包含含有序列辨識編號：25至30所表示之核酸序列之一寡核苷酸組以供用於擴增卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區的一引子組。
  2. 如申請專利範圍第1項之檢測或鑑別方法，其中由該檢體萃取DNA係藉沸騰含該DNA之該檢體及執行離心而進行。
  3. 如申請專利範圍第2項之檢測或鑑別方法，其中該沸騰時間係由數分鐘至十幾分鐘。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之檢測或鑑別方法，其中於使用LAMP方法擴增一瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之步驟(b)中，使用恆溫水浴或特別設計供LAMP使用之擴增器，於約60℃執行DNA擴增反應歷約1小時。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之檢測或鑑別方法，其中於步驟(c)中，瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間 日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之一者或多者之擴增產物之存在與否係使用視覺觀察或即時濁度計檢測或鑑別。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之檢測或鑑別方法，其係於瘧疾流行地區進行。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之檢測或鑑別方法，其中瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之一者或多者之感染係同時或分開檢測或鑑別。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之檢測或鑑別方法，其中瘧原蟲屬之感染係使用包含含有由序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列之寡核苷酸組以供用於擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區的一引子組作為序列特異性引子組來檢測或鑑別。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之檢測或鑑別方法，其中間日瘧原蟲之感染係使用包含含有序列辨識編號：13至18、序列辨識編號：31至36、或序列辨識編號：37至42所表示之核酸序列之一寡核苷酸組且可擴增間日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一用於檢測間日瘧原蟲的引子組作為序列特異性引子組來檢測或鑑別。
  10. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之檢測或鑑別方法，其中三日瘧原蟲之感染係使用包含含有序列辨識編號：19至24所表示之核酸序列之一寡核苷酸組且可擴增 三日瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一用於檢測三日瘧原蟲的引子組作為序列特異性引子組來檢測或鑑別。
  11. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之檢測或鑑別方法，其中卵形瘧原蟲之感染係使用包含含有序列辨識編號：25至30所表示之核酸序列之一寡核苷酸組且可擴增卵形瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區之一用於卵形瘧原蟲的引子組作為序列特異性引子組來檢測或鑑別。
  12. 一種用於檢測瘧原蟲屬之引子組，包含含有序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列之一寡核苷酸組，該引子組可擴增瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
  13. 一種用於檢測瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之任一者之引子組，包含含有序列辨識編號：1至6所表示之核酸序列及挑選自序列辨識編號：7至12、序列辨識編號：13至18、序列辨識編號：31至36、或序列辨識編號：37至42、序列辨識編號：19至24、及序列辨識編號：25至30所表示之核酸序列中之核酸序列之一寡核苷酸引子組，該引子組可擴增瘧原蟲屬及瘧原蟲之各種物種之18S rRNA基因序列之特定區，包括惡性瘧原蟲18S rRNA基因序列之一特定區。
  14. 一種用於瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲中之任一者之檢測套件組，包含選自於如申請專利範圍第12及13項所定義之引子組中 之至少一引子組、一股置換DNA聚合酶、dNTPs及一反應緩衝液。
  15. 如申請專利範圍第14項之檢測套件組，其中該檢測套件組係同時或分開檢測瘧原蟲屬及/或惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲。
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