RU2583001C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii - Google Patents

Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii Download PDF

Info

Publication number
RU2583001C1
RU2583001C1 RU2015113098/10A RU2015113098A RU2583001C1 RU 2583001 C1 RU2583001 C1 RU 2583001C1 RU 2015113098/10 A RU2015113098/10 A RU 2015113098/10A RU 2015113098 A RU2015113098 A RU 2015113098A RU 2583001 C1 RU2583001 C1 RU 2583001C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
coccidioidomycosis
immitis
posadasii
fluorescent
probe
Prior art date
Application number
RU2015113098/10A
Other languages
English (en)
Inventor
Маргарита Леонтьевна Леденева
Галина Александровна Ткаченко
Сергей Сергеевич Савченко
Валерий Алексеевич Антонов
Original Assignee
Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека filed Critical Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority to RU2015113098/10A priority Critical patent/RU2583001C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2583001C1 publication Critical patent/RU2583001C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологиии. Представлен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза С. immitis и С. posadasii методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов, содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», имеющих следующую структуру:
Figure 00000004
Использование разработанного набора олигонуклеотидных праймеров CimMBP3s/CimMBP4as и флуоресцентно-меченого зонда Pf-MBP-1 позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью проводить идентификацию ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза С. immitis и С. posadasii в пробах чистых культур, биологическом материале и объектах окружающей среды. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологиии и может быть использовано для выявления ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii в биологическом материале и объектах окружающей среды специалистами учреждений как практического здравоохранения, службы Роспотребнадзора, так и в научных исследованиях.
Необходимость исследований, направленных на выявление этих патогенных микромицетов, определяется отсутствием средств специфической профилактики кокцидиоидомикоза, а также выраженной резистентностью Coccidioides spp. ко многим химиотерапевтическим препаратам.
Трудности диагностики кокцидиоидомикоза обусловлены диморфным характером этих микроскопических грибов - способностью существования в мицелиальной (сапробиотической) форме во внешней среде и тканевой (паразитической) в организме человека и животных. Существующие методы идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза оказываются недостаточно эффективными для их ускоренной диагностики. Традиционная схема лабораторного анализа с выделением культуры и использованием биопробных животных занимает до 30 и более суток. Общим для всех иммуносерологических методов, направленных на выявление антигенов грибов, является их недостаточная чувствительность составляющая 1×104-1×107 артроспор/мл.
В качестве альтернативного способа выявления данных патогенов наиболее перспективным является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которую отличает универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения. ПЦР позволяет исследовать любой материал как биологический (мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, плевральную жидкость, мазки из ротоглотки, кровь, микро- и макроаутоптаты), так и пробы из объектов окружающей среды (воду, почву, смывы), которые инфицированы возбудителями кокцидиоидомикоза, а также чистые культуры.
Известны способы идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза, согласно которым ДНК-мишенями для амплификации служат нуклеотидные последовательности рибосомальных генов (18S рРНК, 5,8S рРНК, а также спейсерные области рибосомальных генов) [Greene D.R., Koenig G., Fisher M.C. et al. Soil isolation and molecular identification of Coccidioides immitis. Mycologia. 2000; 92:406-10; Lindsley M.D., Hurst S.F., Iqbal N.J. et al. Rapid identification of dimorphic and yeast-like fungal pathogens using specific DNA probes. J. Clin. Microbiol. 2001; 39:3505-11]. Однако, учитывая высокую консервативность этих регионов у различных видов грибов, существует вероятность получения ложноположительных результатов, в первую очередь при исследовании материала из объектов внешней среды. Это указывает на необходимость проведения секвенирования всех продуктов амплификации, если в ПЦР-тест-системе используются праймеры, разработанные на основе фрагментов рибосомальных генов возбудителей кокцидиоидомикоза [Millar B.C., Jim X., Walker M.J. … et al. False identification of Coccidioides immitis: do molecular methods always get it right? J. Clin. Microbiol. 2003; 41(12):5778-80]. Такой подход является достаточно трудоемким и приводит к значительному увеличению времени и стоимости анализа.
Наряду с рибосомальными генами, в качестве мишени амплификации использовались гены, кодирующие видоспецифические белки: 19 кДа специфичный белок (CS-Ag) [Pan. S., Cole G.T. Molecular and biochemical characterization of a Coccidioides immitis-specific antigen. Infect. Immun. 1995; 63(10):3994-4002], пролин-богатый иммунодоминантный белок клеточной стенки (Ag2/PRA) [Bialek R., Kern J., Herrmann Т. et al. PCR assays for identification of Coccidioides posadasii based on the nucleotide sequence of the antigen 2/Proline-Rich Antigen. J. Clin. Microbiol. 2004; 42:778-83], иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул данных микромицетов (SOWgp82) [Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Антонов В.А. и др. Идентификация возбудителей кокцидиоидомикоза методом полимеразной цепной реакции. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2007; 4:25-31]. Однако детекция продуктов амплификации в этих случаях осуществляется с помощью электрофореза, что создает риск контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, увеличивает риск возникновения ложноположительных результатов.
Использование в качестве специфической мишени фрагмента гена МВР-1 позволило разработать олигонуклеотидные праймеры, позволяющие выявлять С.immitis и С.posadasii методом ПЦР в биологическом материале и объектах окружающей среды [патент РФ №2346046, МПК C12N 15/30, C12Q 1/68, опубл. 10.02.2009]. Однако существенным недостатком этого набора олигонуклеотидов, так же как и вышеупомянутых аналогов, является электрофорезная детекция продуктов амплификации.
Детекция продуктов 1ТДР с помощью специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что не только приводит к снижению риска контаминиции, т.к. учет результатов реакции происходит без открывания пробирок, но и сокращает время проведения анализа. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм.
Существует множество флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. Для обнаружения возбудителей кокцидиоидомикоза известна методика, основанная на использовании зондов с резонансным переносом энергии флуоресценции (LightCycler assay) [Binnicker M.J., Buckwalter S.P., Eisberner J.J. et al. Detection of Coccidioides species in clinical specimen by real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 2007; 45:173-78]. Применение данного подхода сопряжено с необходимостью использования двух олигонуклеотидных зондов, меченных разными флуорофорами, что повышает стоимость проведения анализа и предъявляет высокие требования к выбору пары флуоресцентных красителей, между которыми возможен резонансный перенос энергии.
K.W. Sheff с соавт. для дифференциации С. immitis и С. posadasii предложена технология TaqMan-ПЦР в формате реального времени [Sheff K.W., York E.R., Driebe Е.М. et al. Development of a rapid, cost-effective TaqMan Real-Time PCR Assay for identification and differentiation of Coccidioides immitis and Coccidioides posadasii. Med. Mycol. 2010; 48(3):466-9]. Используемый в данной работе нефлуоресцентный гаситель MGB (Minor Groove Binder) повышает температуру плавления зонда и стабильность его взаимодействия с ампликоном. Однако подобная модификация зонда значительно увеличивает стоимость синтеза олигонуклеотида, а также на данный момент сложно осуществима на территории Российской Федерации.
Из флуоресцентных методов детекции известен гибридизационный олигонуклеотидный зонд PR-SOW для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза С. posadasii (патент РФ 2539108, МПК C12Q 1/68, опубл. 10.01.2015 г.). Однако с помощью этого зонда нельзя выявлять С. immitis.
Наиболее близким аналогом является работа S. Gago с соавт., в которой приведены праймеры и зонд, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности внутреннего транскрибирующегося спейсерного региона ITS1 генов рРНК [Gago S., Buitrago M.J., Clemons K.V. Development and validation of a quantitative real-time PCR assay for the early diagnosis of coccidioidomycosis. Diagn Microbiol Infect Dis. 2014; 79(2):214-21]. Однако праймеры и зонд, рассмотренные в данной работе, были апробированы только при исследовании клинических образцов. Высокая степень гомологии возбудителей кокцидиоидомикоза с близкородственными сапрофитными грибами и консервативность рибосомальных генов грибов определяют возможность получения ложноположительных результатов при исследовании объектов окружающей среды с помощью этих олигонуклеотидов.
Недостатки описанных подходов устраняются в настоящем изобретении. Вышеупомянутые зонды отличаются по структуре от зонда, предлагаемого в заявляемом техническом решении. В отличие от S. Gago с соавт. разработанный гибридизационный зонд сконструирован таким образом, что взаимно-комплементарные концевые последовательности, образующие «шпильку» по принципу «молекулярного маяка» (molecular beacon), полностью комплементарны целевой последовательности амплификации, что существенно повышает специфичность гибридизации. Кроме того, предлагаемые олигонуклеотидные праймеры, входящие в состав набора, имеют оригинальные места посадки, а также больше по размеру, тем самым увеличивая специфичность разработанного набора олигонуклеотидов.
Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза С. immitis и С. posadasii методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.
Цель достигается созданием набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза С. immitis и С. posadasii методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов, содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», имеющих следующую структуру:
Figure 00000001
где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм. RTQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.
Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и ДНК-мишени для гибридизации
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные CimMBPSs/CimMBP4as, комплементарные фрагменту гена МВР-1 (macrophage binding protein) и обеспечивающие амплификацию специфического фрагмента размером 373 п.н.
Для детекции продуктов 1ТДР в режиме реального времени был сконструирован зонд формата «молекулярный маяк», обозначенный Р/-МВР-1, на разных концах которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. Подобная структура зонда обеспечивает максимальный эффект тушения и низкую фоновую флуоресценцию, поскольку молекулы флуорофора и гасителя сближены в пространстве.
Апробация разработанного набора олигонуклеотидов была осуществлена на наборе штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза коллекционного центра ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребназора. В качестве положительного контроля в экспериментах использовали референтные штаммы С. immitis 158 и С. posadasii 36-S. Выделение ДНК проводили из обеззараженных суспензий микромицетов в концентрациях от 1×109 до 1×10 артроспор/мл.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого гибридизационного зонда для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза методом ПЦР в режиме реального времени
На основе изучения in silico секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей кокцидиоидомикоза, присутствующих в генетических базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования прямого CimMBP3s и обратного CimMBP4as праймеров была выбрана последовательность гена С. immitis МВР-1 (macrophage binding protein), размер которой составляет 1534 п.н. (GenBank NCBI, AF326276). Наиболее перспективной для подбора праймеров при разработке ПНР была выявлена последовательность гена, фланкируемая с 453 по 825 нуклеотид. Расчетная длина специфического фрагмента составила 373 п.н. (табл. 1).
При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранной пары праймеров CimMBP3s/CimMBP4as (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.
Для флуоресцентной детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени сконструирован зонд Pf-MBP-1 в формате «молекулярный маяк» размером 27 п.н., который полностью гибридизовался на участке гена МВР-1 с 601 по 627 нуклеотид, фланкируемого праймерами CimMBP3s/CimMBP4as.
Вторичную структуру и термодинамические параметры разработанного зонда оценивали в онлайн-режиме с использованием программы Mfold на интернет-сайте http://mfold.rna. albany. edu.
Специфичность разработанных олигонуклеотидов оценивали методом множественного сравнения последовательностей с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере (bttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) для установления гомологии между сконструированными праймерами и зондом и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов. На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.
Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанного набора олигонуклеотидов для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза С. immitisi и С. posadasii с детекцией результатов ПЦР в режиме реального времени.
Инактивацию образцов и выделение ДНК проводили согласно требованиям СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Обеззараживание исследуемых проб проиводили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и последующим прогреванием в течение 40 мин при температуре температуре 56°С и инкубировании при комнатной температуре до 24 ч. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом [Sandhu G.S. et al., 1995].
Для проведения ПЦР в режиме реального времени с разработанными праймерами CimMBP3s/CimMBP4as и олигонуклеотидным зондом Pf-MBP-1 готовили смесь компонентов следующего состава (из расчета на одну пробу в 25 мкл смеси): 200 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 2 мМ MgCl2, 5 мкл 5х ПЦР-буфер 0mM Mg2+ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), по 0,48 мкМ специфических олигонуклеотидных праймеров, 0,24 мкМ флуоресцентно-меченого зонда, 2 ед. TaqF ДНК-полимеразы (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), 4,96 мкл Н2О для ПЦР и 5 мкл исследуемой ДНК.
В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли ТЕ-буфер.
Амплификацию в режиме реального времени проводили на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research)), Австралия), в микроцентрифужных пробирках объемом 0,2 мл, с использованием «горячего старта» по следующей программе: предварительный прогрев 95°С - 15 мин, 45 циклов (95°С - 20 с, 55°С - 60 с), из них первые 5 циклов без флуоресцентной детекции, затем 40 циклов с флуоресцентной детекцией сигнала на этапе отжига праймеров.
Анализ продуктов ПЦР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) по каналу Green. Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью программного обеспечения прибора. Результаты анализировали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию. При этом значение Ct для исследуемых образцов было не более 33.
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров CimMBP3s/CimMBP4as и флуоресцентно-меченого зонда Pf-МВР-1 для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii.
Исследования проводили на штаммах микромицетов из коллекционного центра ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. При подготовке проб для ПЦР исследуемые культуры грибов в мицелиальной фазе роста культивировали на агаре Сабуро при 28°С в течение 30 суток. Дрожжевые формы H. capsulatum и P. brasiliensis выращивали на FT-агаре с добавлением цельной крови и L-цистеина при 37°С в течение 10-14 суток, в зависимости от штамма. Из выросших культур готовили суспензии в 0,15 М растворе хлорида натрия, рН 7,1±1.
После обеззараживания мертиолятом натрия (1:1000) и фильтрования суспензий грибов проводили подсчет клеток исходных взвесей артроспор и дрожжевой фазы микромицетов в камере Горяева. Затем взвеси микромицетов разводили 0,15 М раствором хлорида натрия таким образом, чтобы концентрации для Coccidioides spp. составляли 1×103-1×105 артроспор/мл, а для гетерологичных микроорганизмов до 1×107 м.к./мл.
Выделение ДНК, постановку и учет результатов реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли, как описано в примере 2.
Чувствительность реакции амплификации с разработанным набором специфичных праймеров CimMBP3s/CimMBP4as и флуоресцентно-меченого зонда Pf-MBP-1 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведении артроспор чистых культур возбудителей кокцидиоидомикоза. При тестировании коллекции грибных культур С. immitis и C. posadasii продукт амплификации синтезировался с ДНК всех штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1×104 клеток/мл (рис. 1).
Рисунок 1 отображает график нарастания флуоресцентных кривых, полученных при амплификации ДНК штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза с праймерами CimMBP3s/CimMBP4as и зондом Pf-МВР-1 (изображены кривые 1 - С.posadasii 36-S в концентрации 105 м.к./мл; 2 - С. immitis 158 концентрации 105 м.к./мл; 3 - С. posadasii 36-S в концентрации 104 м.к./мл; 4 - С. immitis 158 в концентрации 104 м.к./мл; 5 - отрицательный контроль и кривые накопления флуоресценции проб С. immitis 158 и C. posadasii 36-S в концентрации меньше 10 м.к./мл, не пересекающие пороговую линию).
Специфичность разработанного набора праймеров
CimMBP3s/CimMBP4as и флуоресцентно-меченого зонда Pf-MBP-1 оценена на коллекции из 8 штаммов С. immitis, 14 штаммов C. posadasi и 15 штаммов гетерологичных микроорганизмов (3 штамма Н. capsulatum, 3 штамма H. duboisii, 3 штамма В. dermatitidis, 2 штамма P. brasiliensis, 1 штамм Cryptococcus neoformans, 1 штамм Aspergillus fumigates, 1 штамм Candida glabrata, 1 штамм Scopulariopsis brevicaulis). Оценка специфичности показала отсутствие перекрестных реакций с близкородственными гетерологичными штаммами и наличие специфической амплификации со всеми штаммами С. immitis и С. posadasi.
Таким образом, из вышеизложенного следует, что достигнута поставленная цель, а именно: разработан набор праймеров CimMBP3s/CimMBP4as и флуоресцентно-меченого зонда Pf-MBP-1 для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii. Подтверждена специфичность и определена аналитическая чувствительность сконструированного набора олигонуклеотидов для детекции данных микромицетов, которая составила 1×104 артроспор/мл, что позволяет использовать сконструированный набор олигонуклеотидов для детекции возбудителей кокцидиоидомикоза в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью.
Figure 00000002

Claims (1)

  1. Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза immitis и Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов, содержащий пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонд, сконструированный по типу «молекулярного маяка», имеющих следующую структуру:
    Figure 00000003

    где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 490 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм; RTQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.
RU2015113098/10A 2015-04-09 2015-04-09 Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii RU2583001C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015113098/10A RU2583001C1 (ru) 2015-04-09 2015-04-09 Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015113098/10A RU2583001C1 (ru) 2015-04-09 2015-04-09 Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2583001C1 true RU2583001C1 (ru) 2016-04-27

Family

ID=55794800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015113098/10A RU2583001C1 (ru) 2015-04-09 2015-04-09 Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2583001C1 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAGO S. ET AL., Development and validation of a quantitative real-time PCR assay for the early diagnosis of coccidioidomycosis, Diagn Microbiol Infect Dis., 2014, v.79, no.2, p. 214-221;RU 2346045 C1, 10.02.2009. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9523131B2 (en) PCR diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi
Jiang et al. Rapid detection of Candida albicans by polymerase spiral reaction assay in clinical blood samples
RU2625006C1 (ru) Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров
Karakkat et al. Detection of root-infecting fungi on cool-season turfgrasses using loop-mediated isothermal amplification and recombinase polymerase amplification
CN108588250B (zh) 一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的lamp引物及其检测方法
Karakuş et al. Evaluation of conjunctival swab sampling in the diagnosis of canine leishmaniasis: A two-year follow-up study in Çukurova Plain, Turkey
Kobylak et al. Real-time PCR approach in dermatophyte detection and Trichophyton rubrum identification
Uda-Shimoda et al. Simplified protocol for DNA extraction and amplification of 2 molecular markers to detect and type Giardia duodenalis
RU2612137C1 (ru) Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica
RU2435860C1 (ru) ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА B.pseudomallei И B.mallei
WO2010031888A1 (es) Método para la detección simultanea de histoplasma capsulatum y paracoccidioides brasiliensis
CN103276099A (zh) 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒
RU2551208C1 (ru) НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei
RU2583001C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii
RU2639498C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации возбудителя бластомикоза blastomyces dermatitidis
US11560602B2 (en) Primer set for detecting trichophyton gene by lamp method, kit including same, and method for detecting trichophyton using same
RU2532845C1 (ru) ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД MS8 Flip-R ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА Histoplasma capsulatum
RU2346045C1 (ru) ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii
RU2539108C1 (ru) ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii
RU2738358C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени
RU2706570C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 40 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты)
RU2486252C1 (ru) СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pseudotuberculosis ОТ Yersinia pestis И Yersinia enterocolitica
Naeimipour et al. Subtilisin Gene Activity in Dermatophytes: A study on the Presence of the Subtilisin Gene in Trichophyton verrucosum and Microsporum gypseum in Clinical and Nonclinical Samples in Tehran, Iran
RU2737396C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 4 генотипа (west nile virus lineage 4)
RU2439159C1 (ru) ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА B. pseudomallei И B. mallei

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170410