RU2539108C1 - ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii - Google Patents
ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii Download PDFInfo
- Publication number
- RU2539108C1 RU2539108C1 RU2013135391/10A RU2013135391A RU2539108C1 RU 2539108 C1 RU2539108 C1 RU 2539108C1 RU 2013135391/10 A RU2013135391/10 A RU 2013135391/10A RU 2013135391 A RU2013135391 A RU 2013135391A RU 2539108 C1 RU2539108 C1 RU 2539108C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- coccidioidomycosis
- probe
- causative agent
- posadasii
- sow
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии. Предложен олигонуклеотидный зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу "молекулярного маяка", обеспечивающий флуоресцентную детекцию при идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза Coccidioides posadasii методом ПЦР с олигонуклеотидными праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as, комплементарными фрагменту гена SOWgp82 С. posadasii. Зонд имеет структуру 5'(ROX)-CGCGGAGATGACTGTCGAGTGGCGCG-(BHQ2)3', где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции. Изобретение позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК С. posadasii в чистой культуре и биологическом материале. 1 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя кокцидиоидомикоза Coccidioides posadasii как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.
Кокцидиоидомикоз относят к особо опасным микозам, возбудителями которого являются диморфные грибы рода Coccidioides spp. С. posadasii имеет значительно более широкое географическое распространение, включая юго-западную часть США, Центральную и Южную Америку, по сравнению С.immitis, который эндемичен для Калифорнии (США). Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя кокцидиоидомикоза.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена при помощи фермента ДНК-полимеразы. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.
Использование специальных флуоресцентных меток при детекции результатов позволяет отказаться от стадии электрофореза, что снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Существует несколько флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данной заявке используются зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков» (molecular beacons).
Наиболее близким аналогом являются олигонуклеотидные зонды, разработанные для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени R. Bialek с соавторами в 2004 году. Авторы используют 2 зонда с резонансным переносом энергии (LightCycler assay). Принцип метода основан на переносе энергии с одного флуорофора, находящегося на 3'-конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5'-конце второго зонда. Излучение детектируется при одновременном связывании обоих зондов с ДНК-матрицей. В качестве ДНК-мишеней для выявления возбудителя кокцидиоидомикоза был выбран участок гена, кодирующего антиген, обогащенный пролином (Ag2/PPvA) [PCR Assays for Identification of Coccidioides posadasii Based on the Nucleotide Sequence of the Antigen 2/Proline-Rich Antigen/Bialek R., Kern J., Herrmannetall T. et al. // J. Clinical. Microdiol. - 2004. - Vol.42, №2. - Р.778-783.].
Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидного зонда для флуоресцентной детекции результатов анализа методом полимеразной цепной реакции при идентификации С.posadasii в режиме реального времени.
Цель достигается конструированием специфичного олигонуклеотида, имеющего структуру «шпильки» с флуорофором и гасителем флуоресценции на концах и обладающего комплементарностью к продукту реакции амплификации с праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as (патент №2346045):
PR-SOW 5'(ROX)-CGCGGAGATGACTGTCGAGTGGCGCG-(BHQ2)3',
где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.
Характеристика олигонуклеотидного зонда и ДНК-мишени для его гибридизации.
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), был подобран олигонуклеотид, обладающий активностью гибридизационного зонда по типу «молекулярного маяка» к фрагменту генома возбудителя кокцидиоидомикоза, фланкированному праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as. Данный зонд обеспечивает флуоресцентную детекцию продукта амплификации фрагмента гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) С. posadasii.
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме С. posadasii 36 Silveira, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×106 артроспор/мл до 1×101 артроспор/мл. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Апробация гибридизационного зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя кокцидиоидомикоза коллекционного центра МЖК ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентно-меченым зондом PR-SOW оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя кокцидиоидомикоза, и составила - 1×102-1×104 клеток/мл.
Для обнаружения возбудителя кокцидиоидомикоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированного олигонуклеотидного зонда для анализа биологического материала (кровь, искусственно контаминированная клетками С. posadasii). Показано, что использование разработанного зонда при постановке реакции амплификации позволяет выявлять ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1×104 клеток/мл.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда PR-SOW для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза С. posadasü методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.
На основе теоретического изучения нуклеотидной последовательности фрагмента гена SOWgp82 возбудителя кокцидиоидомикоза, фланкированной праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as и имеющей длину 300 п.н., сконструирован гибридизационный зонд размером 26 п.н. (таблица 1).
Полученный олигонуклеотид был проанализирован с помощью компьютерной программы Vector NTI Express v. 1.1.2 (Life Technologies, США) на предмет образования вторичных структур с праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as, а также с использованием ресурса BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ним и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.
Пример 2. Детекция специфических фрагментов ДНК с помощью разработанного зонда PR-SOW для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза методом ПЦР в режиме реального времени.
В состав реакционных смесей, помимо анализируемой ДНК, входили комплементарные специфическому фрагменту олигонуклеотидные зонды, меченые флуорофором ROX и гасителем флуоресценции (BHQ2), а также праймеры CpSOW82s/CpSOWS2as, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Год-полимераза. Праймеры и зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.
Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».
Анализ продуктов ПЦР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью компьютерных программ. Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов (рис.1).
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации в режиме реального времени с помощью разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда PR-SOW для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза.
Чувствительность реакции амплификации с разработанным гибридизационным зондом оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений клеток чистых культур возбудителя кокцидиоидомикоза.
Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С и инкубированием при комнатной температуре 24 ч. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов выполняли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляли как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур С. posadasii ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора с использованием разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда PR-SOW продукт амплификации детектировался с ДНК всех штаммов возбудителя кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1×102-1×104 клеток/мл. С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат (рис.1).
В качестве примера на рисунке 1 показана диаграмма результатов реакции амплификации в режиме реального времени при определении чувствительности сконструированных праймеров с ДНК штаммов возбудителя кокцидиоидомикоза С. posadasii 36 Silveira (графики представлены в порядке убывания концентрации слева направо: 1х105 клеток/мл, 1х104 клеток/мл, 1х103 клеток/мл).
Таким образом, разработанный гибридизационный зонд может быть использован для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК С.posadasii в чистой культуре и биологическом материале.
| Таблица 1 | |||
| Характеристика сконструированного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза С. posadasii | |||
| Название зонда | Последовательность праймеров | Локализация | Флуоресцентный краситель/гаситель флуоресценции |
| PR-SOW | CGCGGAGATGACTGTCGAGTGGCGCG | ген SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) | ROX/BHQ2 |
Олигонуклеотидный зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», обеспечивающий флуоресцентную детекцию при идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as (патент №2346045), комплементарными фрагменту гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) С. posadasii имеет следующую структуру:
PR-SOW 5'(ROX)-CGCGGAGATGACTGTCGAGTGGCGCG-(BHQ2)3',
где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.
Claims (1)
- Олигонуклеотидный зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу "молекулярного маяка", обеспечивающий флуоресцентную детекцию при идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as, комплементарными фрагменту гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) С. posadasii имеет следующую структуру:
PR-SOW 5'(ROX)-CGCGGAGATGACTGTCGAGTGGCGCG-(BHQ2) 3',
где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм, BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013135391/10A RU2539108C1 (ru) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013135391/10A RU2539108C1 (ru) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2539108C1 true RU2539108C1 (ru) | 2015-01-10 |
| RU2013135391A RU2013135391A (ru) | 2015-02-10 |
Family
ID=53281462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013135391/10A RU2539108C1 (ru) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2539108C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2346045C1 (ru) * | 2007-06-09 | 2009-02-10 | ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii |
| US20120252015A1 (en) * | 2011-02-18 | 2012-10-04 | Bio-Rad Laboratories | Methods and compositions for detecting genetic material |
-
2013
- 2013-07-26 RU RU2013135391/10A patent/RU2539108C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2346045C1 (ru) * | 2007-06-09 | 2009-02-10 | ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii |
| US20120252015A1 (en) * | 2011-02-18 | 2012-10-04 | Bio-Rad Laboratories | Methods and compositions for detecting genetic material |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIALEK R. et al., PCR Assays for Identification of Coccidioides posadasii Based on the Nucleotide Sequence of the Antigen 2/Proline-Rich Antigen, J. Clin. Microbiol., 2004, Vol. 42, No. 2, pp. 778-783 * |
| GenBank Acc. no. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013135391A (ru) | 2015-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jiang et al. | Rapid detection of Candida albicans by polymerase spiral reaction assay in clinical blood samples | |
| Karakkat et al. | Detection of root-infecting fungi on cool-season turfgrasses using loop-mediated isothermal amplification and recombinase polymerase amplification | |
| Vitale et al. | TaqMan‐based detection of Leishmania infantum DNA using canine samples | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| Vuran et al. | Identification of Malassezia species from pityriasis versicolor lesions with a new multiplex PCR method | |
| RU2612137C1 (ru) | Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica | |
| RU2435860C1 (ru) | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА B.pseudomallei И B.mallei | |
| Yera et al. | Evaluation of five automated and one manual method for Toxoplasma and human DNA extraction from artificially spiked amniotic fluid | |
| KR20090100950A (ko) | 실시간 ｐｃｒ을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법 | |
| Zhou et al. | Development of a Loop‐Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Trichosporon asahii in Experimental and Clinical Samples | |
| Hockman et al. | Comparison of multiplex PCR hybridization-based and singleplex real-time PCR-based assays for detection of low prevalence pathogens in spiked samples | |
| RU2551208C1 (ru) | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei | |
| RU2532845C1 (ru) | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД MS8 Flip-R ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА Histoplasma capsulatum | |
| RU2539108C1 (ru) | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii | |
| RU2346045C1 (ru) | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii | |
| US11560602B2 (en) | Primer set for detecting trichophyton gene by lamp method, kit including same, and method for detecting trichophyton using same | |
| Khosravi et al. | Severe dermatophytosis due to Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale in flocks of green iguanas (Iguana iguana) | |
| US20150292039A1 (en) | Method to amplify nucleic acids of fungi to generate fluorescence labeled fragments of conserved and arbitrary products | |
| RU2639498C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации возбудителя бластомикоза blastomyces dermatitidis | |
| RU2486252C1 (ru) | СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pseudotuberculosis ОТ Yersinia pestis И Yersinia enterocolitica | |
| Ijaz et al. | Molecular phytopathometry | |
| RU2583001C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii | |
| KR20160075943A (ko) | 장수풍뎅이 병원성 바이러스 AdV(Allomyrina dichotoma Virus)의 감염 진단용 프라이머 세트 및 그 진단방법 | |
| RU2737396C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 4 генотипа (west nile virus lineage 4) | |
| RU2738358C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150727 |