KR102589646B1 - 말라리아 5종 검출용 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 말라리아 5종(삼일열, Plasmodium vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)을 검출할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용한 조성물 또는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 기존 검사법의 문제점을 보완한 다중 실시간 유전자 증폭(multiplex Real-time PCR) 방법의 확립함으로써 신속 정확한 말라리아 종 감별 또는 말라리아 감염증 진단이 가능하다.
Description
본 발명은 말라리아 5종(삼일열, Plasmodium vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)을 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물 또는 검출방법에 관한 것이다.
말라리아는 열원충(Plasmodium) 속 원충(삼일열, P. vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)에 속하는 기생충이 척추동물의 적혈구에 기생하여 발생하는 급성 열성질환이다. 우리나라에서는 1984년 이후 사라졌던 삼일열 말라리아가 1993년 이후 주로 휴전선 인근 경기 북부 지역에 근무하는 장병들을 중심으로 급속히 확산되어 1998~2000년에는 연간 약 4천 명의 환자가 발생하였다. 재출현 이후 민간인의 비율이 점차 증가하여 2002년 부터는 민간인의 비율이 전체 환자의 절반 이상을 차지하고 있다.
말라리아는 얼룩날개모기속에 속하는 암컷 모기에 의해 전파되며 국내는 총 6종의 얼룩날개모기종에서 말리리아 전파능력이 확인되었다.
WHO에 따르면 2019년 전 세계적으로 약 2억 2천 9백만 명의 환자와 40만 9천 명의 사망자가 보고되었다. 매년 3-5억 명의 환자가 발생하며 연간 200만 명 이상이 말라리아로 인해 사망하고 있다. 여행자에서는 전 세계적으로 매년 만 명 이상이 해외여행 도중 말라리아에 감염되고 있으며, 최근 우리나라 사람들도 점차 아프라키 등 말라리아 위험 지역으로의 방문이 증가하고 있어 해외에서 감염되는 사례가 증가하고 있다.
국내 삼일열 말라리아의 경우, 적절한 치료를 받으면 완치되며 사망사례는 거의 없으나 중증 말라리아(대부분 열대열 말라리아)의 경우 성인 20%, 소아 10% 치사율이 확인되었다. 국내 말라리아 발생 현황을 보면 2017년에 436명이 보고되어 전년대비 27.6% 감소하였다. 그러나 해외여행이 늘어남에 따라 최근 5년간 연도별 유입 국가별 발생 현황을 보면 2017년(79명) 국외 유입 사례가 2013년(60명) 대비 31% 이상 증가하였다. 국외 유입 사례에서는 사망율이 높은 열대열이 가장 많은 부분을 차지하기 때문에 지속적인 감시가 필요하며, 이를 위해서는 정확성과 신속성을 겸비한 검사 시스템의 확립이 필수적이다.
말라리아의 신속한 치료를 위해 신속진단키트검사(Rapid Diagnostic Test, RDT Kit)를 먼저 실시한다. 말라리아 신속진단키트검사에서 양성이 나오면 반드시 확진을 위해 현미경 검사(혈액도말법) 또는 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 등의 유전자 검출검사를 실시하여 원충 또는 특이 유전자를 확인한다. 신속진단검사(RDT Kit)의 경우 결과는 15~20분 내 감염 여부를 확인할 수 있으나 말라리아 열원충 종 감별을 할 수는 없고, 반응 후 장시간 방치 시 위 양성으로 나타날 수 있다는 단점이 있다. 현미경 도말 검사는 민감도가 낮다는 단점이 있다. 현재 구축된 유전자 검출 검사는 이중 중합효소 연쇄반응법(Nested PCR)을 통해 표적 유전자를 확인하는 것이다. 1차 PCR은 말라리아 원충 존재 확인을 위한 시험이며, 종 감별을 위해 2차 PCR을 수행하기 때문에 신속성이 결여되는 문제점이 있다. 따라서, 기존 검사법의 문제점을 보완한 다중 실시간 유전자 증폭(multiplex Real-time PCR) 방법의 확립과 표준화된 시약의 공급을 통해서 말라리아 질환의 신속한 검사체계 구축에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간을 측정하는 원리이다. 검출을 위하여 형광이 표지된 probe를 이용하는데 프로브의 5' 말단에는 서로 다른 파장을 나타내는 FAM, VIC, TET, HEX 등의 reporter dye를 부착하며 3' 말단에는 quencher dye를 표지한다. TaqManTMprobe는 annealing step에서 주형 DNA에 특이적으로 결합하지만, 프로브의 quencher에 의해 형광 발색이 억제되며 Extension 반응 시에 Taq. DNA polymerase가 갖는 5'->3' exonuclease 활성으로 주형 DNA에 결합한 프로브가 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되면서 quencer에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 실시간 중합효소연쇄반응은 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다.
한국등록특허 제2039178호는 말라리아 원충의 감염진단을 위한 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 말라리아 원충의 검사 방법에 관한 것으로, 말라리아 원인인 삼일열, 열대열, 사일열 또는 난형성 원충의 존재 여부를 탐지할 수 있는 증폭용 프라이머에 관해 개시하고 있고, 한국공개특허 제2010-0135128호는 말라리아 원충 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 시료 내에 열대열, 삼일열, 사일열, 난형열이 혼재되어 있을지라도 한번에 실시간으로 검출할 수 있는 프라이머에 관해 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2011-0118179호는 말라리아 검출을 위한 프로브 및 프라이머에 관한 것으로, 열대열 또는 삼일열 말라리아 검출을 위한 실시간 PCR 방법이 개시되어 있다.
하지만, 본 발명의 특정 서열을 갖는 열대열, 삼일열, 사일열, 난형열, 원숭이열 감별용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 말라리아 5종(삼일열, Plasmodium vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)을 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 감별 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)에 대한 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브와 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax)에 대한 서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
다른 예로서, 사일열 말라리아(Plasmodium malariae)에 대한 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 9를 포함하는 프로브, 난형열 말라리아(Plasmodium ovale)에 대한 서열번호 10을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 11을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 12를 포함하는 프로브와 원숭이열 말라리아(Plasmodium knowlesi)에 대한 서열번호 13을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 14를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 15를 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또 다른 예로서, 상기 프라이머 세트를 모두 포함하는 말라리아 검출용 다중 실시간 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR) 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 내부 대조군(internal control)으로 서열번호 16을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 17을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 18을 포함하는 프로브를 포함할 수 있다.
다른 예로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 말라리아 종 감별용 조성물을 제공한다.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 말라리아 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 말라리아 감염증은 두통, 열, 몸서림, 관절 통증, 구토, 용혈성 빈혈, 황달, 망막 손상 및 경련으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 말라리아 종 감별방법을 제공한다.
본 발명의 말라리아 5종(삼일열, Plasmodium vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)을 검출할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용한 조성물 또는 방법은 기존 검사법의 문제점을 보완한 다중 실시간 유전자 증폭(multiplex Real-time PCR) 방법의 확립과 표준화된 시약의 공급을 통해서 말라리아 질환의 신속한 검사체계 구축에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. vivax 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. malariae 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. knowlesi 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 설정된 프로브 형광 종류를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 및 프로브 성능 확인 결과를 나타낸 것이다. (a) P. falciparum 프라이머/프로브 세트, (b) P. vivax 프라이머/프로브 세트, (c) P. ovale 프라이머/프로브 세트, (d) P. malariae 프라이머/프로브 세트, (e) P. knowlesi 프라이머/프로브 세트.
도 8은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 내부양성대조군 첨가 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 구현 예에 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 세트에서 P. falciparum 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과 결과를 나타낸 것이다(빨간색 곡선 : P. falciparum, 검정색* 곡선 : IC).
도 17은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 세트에서 P. vivax 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(파란색 곡선 : P. vivax, 검정색 곡선 : IC).
도 18은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. ovale 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(빨간색 곡선 : P. ovale, 검정색 곡선 : IC).
도 19는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. malariae 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(파란색 곡선 : P. malariae, 검정색 곡선 : IC).
도 20은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. knowlesi 올리고를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(초록색 곡선 : P. malariae, 검정색 곡선 : IC).
도 21은 본 발명의 일 구현 예에 따른 플라스미드 DNA 확인 결과를 나타낸 것이다. (a) P. falciparum (b) P. vivax (c) P. ovale (d) P. malariae (e) P. knowlesi (f) IC.
도 22는 본 발명의 일 구현 예에 따른 양성 대조군 제작 결과를 나타낸 것이다. (a) Malaria multiplex Ⅰ kit (b) Malaria multiplex Ⅱ kit
도 23은 본 발명의 일 구현 예에 따른 교차반응 시험 결과(Malaria multiplex Ⅰ kit)를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 구현 예에 따른 교차반응 시험 결과(Malaria multiplex Ⅱ kit)를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 구현 예에 따른 Malaria multiplex Ⅰ kit 검출한계 Ct 측정값 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. vivax 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 일 구현 예에 따른 IC 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 일 구현 예에 따른 Malaria multiplex Ⅱ kit 검출한계 Ct 측정값 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. malariae 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. knowlesi 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 일 구현 예에 따른 IC 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험 결과(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험 결과(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험의 Ct 측정값(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험의 Ct 측정값(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 일 구현 예에 따른 말라리아 기존진단법과의 성능 비교 테스트(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 구현 예에 따른 말라리아 기존진단법과의 성능 비교 테스트(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. vivax 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. malariae 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. knowlesi 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 설정된 프로브 형광 종류를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 및 프로브 성능 확인 결과를 나타낸 것이다. (a) P. falciparum 프라이머/프로브 세트, (b) P. vivax 프라이머/프로브 세트, (c) P. ovale 프라이머/프로브 세트, (d) P. malariae 프라이머/프로브 세트, (e) P. knowlesi 프라이머/프로브 세트.
도 8은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 내부양성대조군 첨가 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 구현 예에 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 세트에서 P. falciparum 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과 결과를 나타낸 것이다(빨간색 곡선 : P. falciparum, 검정색* 곡선 : IC).
도 17은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 세트에서 P. vivax 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(파란색 곡선 : P. vivax, 검정색 곡선 : IC).
도 18은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. ovale 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(빨간색 곡선 : P. ovale, 검정색 곡선 : IC).
도 19는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. malariae 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(파란색 곡선 : P. malariae, 검정색 곡선 : IC).
도 20은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. knowlesi 올리고를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(초록색 곡선 : P. malariae, 검정색 곡선 : IC).
도 21은 본 발명의 일 구현 예에 따른 플라스미드 DNA 확인 결과를 나타낸 것이다. (a) P. falciparum (b) P. vivax (c) P. ovale (d) P. malariae (e) P. knowlesi (f) IC.
도 22는 본 발명의 일 구현 예에 따른 양성 대조군 제작 결과를 나타낸 것이다. (a) Malaria multiplex Ⅰ kit (b) Malaria multiplex Ⅱ kit
도 23은 본 발명의 일 구현 예에 따른 교차반응 시험 결과(Malaria multiplex Ⅰ kit)를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 구현 예에 따른 교차반응 시험 결과(Malaria multiplex Ⅱ kit)를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 구현 예에 따른 Malaria multiplex Ⅰ kit 검출한계 Ct 측정값 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. vivax 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 일 구현 예에 따른 IC 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 일 구현 예에 따른 Malaria multiplex Ⅱ kit 검출한계 Ct 측정값 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. malariae 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. knowlesi 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 일 구현 예에 따른 IC 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험 결과(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험 결과(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험의 Ct 측정값(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험의 Ct 측정값(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 일 구현 예에 따른 말라리아 기존진단법과의 성능 비교 테스트(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 구현 예에 따른 말라리아 기존진단법과의 성능 비교 테스트(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)에 대한 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브와 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax)에 대한 서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
다른 예로서, 사일열 말라리아(Plasmodium malariae)에 대한 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 9를 포함하는 프로브, 난형열 말라리아(Plasmodium ovale)에 대한 서열번호 10을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 11을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 12를 포함하는 프로브와 원숭이열 말라리아(Plasmodium knowlesi)에 대한 서열번호 13을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 14를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 15를 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또 다른 예로서, 상기 프라이머 세트를 모두 포함하는 말라리아 검출용 다중 실시간 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR) 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 내부 대조군(internal control)으로 서열번호 16을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 17을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 18을 포함하는 프로브를 포함할 수 있다.
다른 예로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 말라리아 종 감별용 조성물을 제공한다.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 말라리아 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하는 원리이다. 이는 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다.
프로브는 이 분야에 알려진 실시간 중합효소연쇄반응용 모든 프로브를 포함하고, 바람직하게는 5' 및 3' 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 및 소광자가 결합되어 있는 프로프를 사용한다. 일반적으로 5' 및 3' 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 (Reporter) 및 소광자 (Quencher)가 결합되어 있으므로, 사용가능한 모든 형광 표지인자 및 소광자를 사용할 수 있다. 형광 표지 인자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있으며 종류에 따라 emission 및 exitation 파장이 다르므로 각각의 파장 간 중첩을 최소로 하는 형광표지자를 선택하여 한 번의 반응에서 다양한 병원체의 특이 유전자 검출을 가능케 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
형광검출법으로는 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자비콘(Molecular becon) 방법 등이 있다. 이들은 각각 다른 원리를 이용하여 형광의 증가를 검출하는데, 바람직하게는 TaqMan™ 프로브법을 사용할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5' 말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3' 말단을 quencher 물질(TAMRA, Blacke hole chencher 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM probe가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 100 내지 500 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. PCR 종료시, 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 피크를 구현한다. 이때, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다. 분석된 결과는 Ct (Threshold cycle)로 나타나 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 말라리아 감염증은 두통, 열, 몸서림, 관절 통증, 구토, 용혈성 빈혈, 황달, 망막 손상 및 경련으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 말라리아 종 감별방법을 제공한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다
<실시예 1> 프라이머 및 프로브 설계
1-1. Plasmodium falciparum 검출용 프라이머/프로브 설계
말라리아 5종의 PCR 분석 기술에 관한 선행 연구들을 조사한 결과 임상 시료에서 말라리아 검출에서는 18S rRNA 혹은 COX1 부위를 일반적으로 표적 유전자로 사용하고 있으며 AMA1 (apical membrane antigen 1) 유전자도 확인되었다.
18S rRNA 유전자는 특이성을 갖는 부위가 있었으나 3군데 모두 선행 연구들의 프라이머/프로브 부위였고, Tm값을 고려하여 선행 연구들의 프라이머/프로브 서열을 피해 디자인하기가 용이하지 않았다.
이 때문에 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 COX1, AMA1을 타겟 유전자 후보로 하였다. 그 중 AMA1의 경우 다른 말라리아 4종과 구분이 가능한 부위가 한정적이며 AT가 많아서 최적의 Tm값을 확보할 수 있는 프로브 설계가 용이하지 않기 때문에 타겟 유전자에서 제외되었고, in silico 상 특이성이 확인된 COX1을 타겟 유전자로 선정하였다.
COX1 유전자는 특이성을 갖는 부위가 존재하고 해당 지역 내의 선행연구들의 프라이머 및 프로브가 위치하지 않아 목표 유전자로 설정하고 프라이머 및 프로브 설계를 위한 염기서열 분석을 수행하였다.
Plasmodium falciparum을 특이적으로 검출하기 위해서 NCBI에 등록된 참조서열을 선정한 뒤, 이들의 다중서열 정렬 결과의 공통서열을 BLAST 하여 데이터베이스를 확장하였다.
COX1 부위의 공통서열을 BLAST한 결과로 유전적 상동성이 높은 말라리아 5종을 다중서열 정렬 결과 특이적 검출이 가능하며, 최적의 Tm 값이 확보도리 수 있는 부위가 발견되었으므로 이 구간에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.
TaqMan 프로브 제작 시 일반적으로 고려해야 할 사항으로 염기서열 길이, GC 비율 및 이합체의 형성 여부를 확인하였으며 5’ 말단에 G 염기가 있는 것은 프로브 선정에서 제외하였다.
프라이머의 Tm (melting temperature)값은 55~60℃, 길이는 18~29 mers, 프로브의 Tm은 68~70℃, 길이는 34 mers 이하의 범위로 디자인하였으며 Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 1).
| Target | Primer/Probe | Sequence (5' to 3') | Amplicon size (bp) |
| COX1 | Forward Primer (서열 1) | ATGTAATTTCTACTAATTATTGCAGAAATC | 136 bp |
| Reverse Primer (서열 2) | CTAGTATCAACTTCTAAACCAGTAGTG | ||
| Probe (서열 3) | TTGCTATGGGATGTATAGCTGTTTTAGGAAGC |
1-2. Plasmodium vivax 검출용 프라이머/프로브 설계
P. falciparum과 동일한 방식으로 말라리아 5종 간의 18S rRNA 유전자를 검토한 결과, 최적의 성능을 위한 TaqMan 프로브의 위치를 확보할 수가 없었으므로 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 AMA1에 프로브 및 프라이머 세트를 설계하였다. COX1 유전자에 디자인할 경우, P. falciparum와 유사한 부위를 공유하므로 프라이머에서 서로 교차반응이 일어날 시, 멀티플렉스 효율이 감소할 수 있기 때문에 타겟 유전자에서 제외 되었고, in silico 상 특이성이 확인된 AMA1을 타겟 유전자로 선정하였다.
P. vivax의 AMA1 부위의 유전적으로 상동성이 높은 말라리아 5종의 서열을 다중 서열 정렬한 결과, P. vivax 특이적 검출이 가능하고 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.
프라이머 및 TaqMan 프로브 제작 시 P. fapclparum과 동일한 방식으로 디자인하였으며, Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 2).
| Target | Primer/Probe | Sequence (5' to 3') | Amplicon size (bp) |
| AMA1 | Forward Primer(서열 4) | ATTATCCGAGTTGAATGCACCC | 130 bp |
| Reverse Primer(서열 5) | CTCAGATCAACCAACTCAGTATGAAGA | ||
| Probe(서열 6) | CTCTCGGTTGTTTTGTCTAAACCCTTGTTGT |
1-3. Plasmodium ovale 검출용 프라이머/프로브 설계
P. falciparum과 동일한 방식으로 말라리아 5종 간의 18S rRNA 유전자에 프라이머 프로브 설계가 용이하지 않았기 때문에 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 COX1, AMA1을 타겟 유전자 후보로 하였다. 이 중 AMA1은 다른 말라리아 4종과 구분이 가능한 부위가 한정적이며 AT가 많아서 최적의 Tm값을 확보할 수 있는 프로브 설계가 용이하지 않았다. 이 때문에 in silico 상 특이성이 확인된 COX1을 타겟 유전자로 선정하였다.
P. ovale의 COX1 부위의 유전적으로 상동성이 높은 다른 말라리아 4종의 서열을 다중 서열 정렬한 결과, P. ovale 특이적 검출이 가능하고 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.
프라이머 및 TaqMan 프로브 제작 시 P. fapclparum과 동일한 방식으로 디자인하였으며, Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 3).
| Target | Primer/Probe | Sequence (5' to 3') | Amplicon size (bp) |
| AMA1 | Forward Primer(서열 7) | TTTTGGTATTACTCATAGTTCATCTT | 121 bp |
| Reverse Primer(서열 8) | TGTATCATGTAATGCTATATCAATAGC | ||
| Probe(서열 9) | CTTTCGGAGGAACTACAGGTGTTATTTTAGGT |
1-4. Plasmodium malariae 검출용 프라이머/프로브 설계
P. falciparum과 동일한 방식으로 18S rRNA 유전자에서 프라이머 프로브 설계가 용이하지 않기 때문에 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 COX1, AMA1을 타겟 유전자 후보로 하였다. 그 중 COX1 유전자에 디자인할 경우 P. malariae와 서로 교차반응이 일어날 시, 멀티플렉스 효율이 감소할 수 있기 때문에 타겟 유전자에서 제외 되었고, in silico 상 특이성이 확인된 AMA1을 타겟 유전자로 선정하였다.
P. malariae의 AMA1 부위의 유전적으로 상동성이 높은 말라리아 5종의 서열을 다중 서열 정렬한 결과, P. malariae 특이적 검출이 가능하고 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.
프라이머 및 TaqMan 프로브 제작 시 P. fapclparum과 동일한 방식으로 디자인하였으며 Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 4).
| Target | Primer/Probe | Sequence (5' to 3') | Amplicon size (bp) |
| AMA1 | Forward Primer(서열 10) | GAAAACGGACAATTTTAAGCATTATG | 112 bp |
| Reverse Primer(서열 11) | GACCCATAAACCAAATTTAGCAACA | ||
| Probe(서열 12) | AGTGATTGGGATGTTAAGTGCCCTCGTAAAAG |
1-5. Plasmodium knowlesi 검출용 프라이머/프로브 설계
P. falciparum과 동일한 방식으로 18S rRNA 유전자에서 프라이머 프로브 설계가 용이하지 않기 때문에 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 COX1, AMA1을 타겟 유전자 후보로 하였다. 그 중 COX1의 경우 다른 말라리아 4종과 구분이 가능한 부위가 한정적이며 AT가 많아서 최적의 Tm값을 확보할 수 있는 프로브 설계의 한계가 있어 타겟 유전자에서 제외 되었고, in silico 상 특이성이 확인된 AMA1을 타겟 유전자로 선정하였다.
P. knowlesi의 AMA1 부위의 유전적으로 상동성이 높은 말라리아 5종의 서열을 다중 서열 정렬한 결과, P. knowlesi 특이적 검출이 가능하고 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.
프라이머 및 TaqMan 프로브 제작 시 P. fapclparum과 동일한 방식으로 디자인하였으며 Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 5).
| Target | Primer/Probe | Sequence (5' to 3') | Amplicon size (bp) |
| AMA1 | Forward Primer(서열 13) | AACAACAGCGTTATCTCACCCTC | 116 bp |
| Reverse Primer(서열 14) | CACTGTACAGATTCATATTTCTCGACTG | ||
| Probe(서열 15) | CAATGAATTTCCATGCAGCATATACAAAGATG |
1-6. 프라이머 및 프로브의 in silico 분석
말라리아 5종과 유사 증상의 원인이 될 수 있는 감염 원충 및 바이러스들과 교차 반응성을 확인하기 위하여 말라리아 5종 특이적 검출을 목적으로 설계한 프라이머 및 프로브들과의 서열 일치도를 분석하였다.
선정한 원충 및 바이러스들과 프라이머 및 프로브 염기서열의 일치율이 낮아 다른 종과의 비특이적 증폭 시그널이 발생하지 않을 것으로 예측되었다(표 7-11).
서열 일치도는 80% 기준으로 이하일 경우, 결합 가능성이 낮아 증폭이 발생되지 않을 것으로 예상되고, 프라이머의 서열 일치도가 80~90%이고 프로브의 서열 일치도가 80% 미만이면 증폭산물이 생길 가능성은 있지만 프로브 결합이 생기지 않아 형광이 발생되지 않을 것으로 예상되었다.
<실시예 2> Multiplex Real-time RT-PCR 조건 최적화
2-1. 제작된 프라이머 및 프로브 세트 성능확인
P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi 및 내부 양성 대조군(Internal control; GAPDH) 검출용 프라이머 및 프로브의 올리고를 합성하였다(서열 16-Forward primer: aataaatcat aacctcccgc ttcgctctct; 서열번호 17-Reverse primer: aataaatcat aagctggcga cgcaaaaga; 서열번호 18-Probe: cctcctgttc gacagtcagc cgc). 이 때 프로브의 형광 종류는 다음과 같다(도 6).
합성된 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트를 이용해 각 양성 시료(질병관리청으로부터 말라리아 5종에 대한 각 1개씩의 핵산을 제공 받았음)에 대한 Real-time PCR 증폭곡선을 확인한 결과, 각각 검출 타겟인 유전체 DNA에서만 정상적인 증폭곡선을 나타냈다(도 7).
Real-time PCR 반응액은 5 pmol/㎕로 희석한 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 ㎕ 와 2 pmol/㎕로 희석한 TaqMan 프로브 1 ㎕, 2X Real-time PCR MasterMix (Kogenebiotech) 10 ㎕에 주형 DNA 5 ㎕ 및 TE 버퍼를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 제조하였다. 이때 사용한 주형 DNA은 질병관리청으로부터 제공받은 말라리아 5종(P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi)의 DNA로 각 1개씩 제공받았다. PCR 조건은 50℃에서 2분간 교차오염 방지를 위한 UDG 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 중합효소를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 반복으로 하여 총 40 반복을 수행하였다. 사용한 Real-time PCR 장비는 QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument (Thermo Fisher Scientific, USA)이고 설정은 base line 3 to 15, threshold 25,000였다.
2-2. 프라이머/프로브 농도조건 확립
Multplex 조건 최적화 시 고려할 사항으로 각 타겟 별 증폭 곡선의 △Rn 값 및 linear phase의 기울기를 유사하게 조절하고, 각 TaqMan 프로브의 형광물질들의 교차반응 현상을 최소화하기 위해서 프로브의 농도를 조절할 것, 단일 프라이머/프로브 조건에서와 증폭 효율을 유사하게 맞출 것 등이 있다.
최적화된 프라이머/프로브 농도 조건 및 PCR 저해 확인 시험 데이터는 도8 내지 11과 같으며, 실험 결과 단일 프라이머/프로브 반응액과 다중 프라이머/프로브 반응액에서의 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이점이 없었다.
P. falciparum 및 P. vivax 의 단일 프라이머 프로브 세트 반응액과 두 가지의 프라이머/프로브 세트가 혼합된 멀티플렉스 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해 비교한 결과, 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이가 없음을 확인하였음(도 8, 9).
P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 의 단일 프라이머 프로브 세트 반응액과 세 가지의 프라이머/프로브 세트가 혼합된 멀티플렉스 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해서 비교한 결과, 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이가 없음을 확인하였음(도 10, 11).
2-3. 내부 양성 대조군 첨가
내부 양성 대조군이 첨가된 최종 프라이머/프로브 농도 조건 및 PCR 저해 확인 시험 데이터는 도 12-15와 같으며 내부 양성 대조군 첨가 여부에 따른 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이점이 없었음.
P. falciparum 및 P. vivax 의 두 가지의 프라이머/프로브 세트가 혼합된 멀티플렉스 반응액과 내부 양성 대조군 프라이머/프로브 세트가 첨가된 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해서 비교한 결과, 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이가 없음을 확인하였음(도 12, 13).
P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 의 세 가지의 프라이머/프로브 세트가 혼합된 멀티플렉스 반응액과 내부 양성 대조군 프라이머/프로브 세트가 첨가된 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해서 비교한 결과, 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이가 없음을 확인하였다(도 14, 15).
2-4. 마스터믹스 선정
최적의 성능을 확보할 수 있는 마스터믹스를 선정하기 위해서 동일한 프라이머/프로브 혼합 조건을 이용해 3종류 마스터믹스 간의 성능 비교 테스트를 수행하였다.
3종류 마스터믹스 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 5 ㎕, ２X Real-time MasterMix 10 ㎕와 단계적으로 Human genomic DNA로 희석한 DNA 5 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 제조하였다(표 6, 7). PCR 조건은 50℃에서 2분간 교차오염 방지를 위한 UDG 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 중합효소를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 반복으로 하여 총 40 반복을 수행하였다. 사용한 Real-time PCR 장비는 QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument (Thermo Fisher Scientific, USA)이고 설정은 base line 3 to 15, threshold 25,000였다.
| Component parts | Volume (㎕) |
| Primer/Probe mix (P. falciparum, P. vivax, IC) | 5 |
| 2X Real-time PCR Mastermix (3 types) | 10 |
| Total | 15 |
| Component parts | Volume (㎕) |
| Primer/Probe mix (P. ovale/ P. malariae/ P. knowlesi, IC) | 5 |
| 2X Real-time PCR Mastermix (3 types) | 10 |
| Total | 15 |
P. falciparum 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 성능 비교 시험에서 2번이 1, 3 번과 비교 시 Ct 값이 밀리고, 성능이 떨어지는 것이 확인되었다. P. vivax 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 성능 비교 시험에서도 2번이 1, 3 번과 비교 시 민감도가 10배 이상 차이나는 것이 확인되었다(도 16, 17).
P. ovale 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 2, 3번이 1번과 비교 시 민감도가 10배 이상 차이나는 것이 확인되었다. P. malariae 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서 2번이 1, 3 번과 비교 시 Ct 값이 밀리는 것이 확인되었다. P. knowlesi 올리고를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 Mastermix에 따른 Ct값과 Rn값 차이가 없었다(도 18-20).
마스터믹스 별 성능 비교 결과를 종합하였을 때, 2번 시약과 비교해 1,3번의 성능이 우수한 것으로 판단되었다. 1, 3번 마스터믹스 사용 조건에서의 Ct 값이 유사하게 검출이 되었으나 3번 시약에 UDG가 포함되지 않기 때문에 UDG까지 포함된 1번 마스터믹스를 본 발명의 주성분으로 최종 결정하였다.
최정 선정된 마스터믹스 조성과 확립된 프라이머 및 프로브 농도는 다음과 같다(표 8-10).
| Name | Component parts |
| Mastermix No. 1 |
Hot-start Taq DNA Polymerase |
| Potassium Chloride | |
| Glycerin | |
| dNTP mixture with dUTP | |
| Magnesium Chloride | |
| TRIS(HYDROXYMETHYL)AMINOMETHANE HYDROCHLORIDE) | |
| Uracil DNA Glycosylase | |
| Water |
| Target | Fluorophore | Primer/Probe | Concentration (nM) |
| P. falciparum | FAM | Forward primer | 250 |
| Reverse primer | 250 | ||
| Probe | 100 | ||
| P. vivax | JOE | Forward primer | 250 |
| Reverse primer | 250 | ||
| Probe | 150 | ||
| IC | Cy5 | Forward primer | 150 |
| Reverse primer | 150 | ||
| Probe | 100 |
| Target | Fluorophore | Primer/Probe | Concentration (nM) |
| P. ovale | FAM | Forward primer | 250 |
| Reverse primer | 250 | ||
| Probe | 100 | ||
| P. malariae | JOE | Forward primer | 250 |
| Reverse primer | 250 | ||
| Probe | 100 | ||
| P. knowlesi | ROX | Forward primer | 250 |
| Reverse primer | 250 | ||
| Probe | 100 | ||
| IC | Cy5 | Forward primer | 150 |
| Reverse primer | 150 | ||
| Probe | 75 |
<실시예 3> 양성표준물질 제작
확립된 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi 동시 검출용 multiplex Real-time PCR 시스템의 양성표준물질을 제작하였으며 사용 목적은 검출한계 및 정밀도 시험에 표준물질로 사용하고, 키트 제작 시 프라이머와 프로브 염기서열 및 효소 등의 시약 구성물들이 정상적으로 작동하는지 여부를 확인하는 양성 대조군으로써 활용하였다.
양성표준물질의 성상은 각 프라이머의 증폭 서열을 포함한 플라스미드 DNA이며 이의 제조 방법은 다음과 같다.
제공받은 양성시료를 본 키트의 프라이머로 증폭한 후 pGEM T-Easy Vector System (Promega, Madison, USA)의 사용법에 따라 벡터 내에 삽입하였다(표 11). 재조합된 DNA를 DH5a (Intron, Korea) 세포에 도입하고 배양한 후 플라스미드 DNA를 추출하였다.
| Manufacturer | Product Name | Cat No. |
| Promega | pGEMⓡ-T Easy Vector SystemsⅠ | A1360 |
재조합된 플라스미드 DNA를 시퀀싱 전문 업체에 의뢰하여 M13 프라이머로 양방향 시퀀스 분석을 진행한 후 NCBI (National center for Biotechnology information)의 Global Align tool을 또는 Geneious 프로그램을 이용하여 삽입된 프라이머 및 프로브의 매치 여부를 확인하였다(data not shown).
염기서열 분석이 완료된 플라스미드는 제한효소를 처리하여 linearization 시켰고, NanoDrop Spectrophotometer를 이용하여 플라스미드의 농도를 측정하였다. 사용하는 제한 효소 제품 및 조성은 표 12, 13과 같다. 37℃에서 1시간 반응한 뒤, 65℃에서 20분간 방치하여 효소를 불활성시켰다.
| Menufacturer | Product Name | Cat No. |
| Enzynomics | SacI | R005M |
| Component | Volume (㎕) |
| 10x Enzyme buffer | 5 |
| SacI | 1 |
| 플라스미드 DNA | x (10 ㎍) |
| Nuclease-free water | x (up to 50) |
| 최종 볼륨 | 50 |
효소 처리한 DNA를 Qiaquick PCR purification Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 DNA purification을 제품 매뉴얼에 따라서 수행하였다. DNA 정량은 정제가 완료된 DNA를 NanoDrop Spectrophotometer를 이용하여 플라스미드의 농도를 측정하였고, 측정된 DNA 농도와 염기서열 길이를 이용하여 카피 수를 계산하였다.
DNA 카피 수 = (DNA 농도 x 6.022 x 1023) / {플라스미드 사이즈 (벡터 사이즈 + 증폭산물 사이즈) x 1 x 109 x 650}
합성된 양성표준 플라스미드 DNA를 Real-time PCR로 확인, 증폭 곡선을 확인하였다.
키트 제작 시 양성대조군을 제작하였다(도 22). 제작된 양성대조군은 Ct 값 23±3 범주가 되도록 제작 완료하였다.
<실시예 4> 성능평가
4-1. 분석적 특이도(Analytical specificity)
개발한 multiplex Real-time PCR 시스템의 특이성을 교차반응시험을 통해 평가하였다. 유사한 증상의 원인이 될 수 있는 감염 원충과 바이러스 및 Human genomic DNA를 포함한 다양한 생물 종의 핵산을 이용하여 Real-time PCR을 수행한 후 각각의 시료에 대한 검출 결과를 분석하였다. 시험에 사용한 물질은 질병관리청, NCCP 국가병원체자원은행, ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받거나 Vircell S.L (Santafe, Spain)에서 핵산을 구입하였다.
교차반응 시험 결과 타겟인 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi 에서만 각각의 형광 채널에서 검출 반응이 일어났고 다른 종의 핵산에서는 검출반응이 일어나지 않았다(도 23, 24). 또한 IC는 질병관리청에서 제공한 핵산과 Human genomic DNA에서만 증폭됨을 확인하였다.
4-2. 검출한계(limit of detection) 측정
검출한계 확인 시험 시 제작한 양성표준물질을 음성검체를 이용해 10배씩(105~100 copies/㎕) 순차적으로 희석하여 사용하였다. 직선성이란 검체 중에 함유되어 있는 분석 대상물질(target analyte)의 양에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 말하며 시험 기준은 최소 5농도 이상 단계 희석한 시험물질을 이용하며 표준곡선을 작성하여 R2값이 0.99 이상일 경우 유효하다고 판단한다.
측정 Ct 값과 농도를 이용해 표준곡선을 작성한 결과 모두 R2값이 0.99 이상이었고, slope로부터 계산된 PCR 효율도 90%~100%에 근접한 것으로 나타나 시스템의 직선성과 효율성을 확인하였다(도 25-33).
[계산식] PCR Efficiency = 10(-1/slope)-1
Malaria multiplex Ⅰ kit에서 타겟 별 검출한계는 P. falciparum, P. vivax, IC 가 모두 1.0 x 101 copies/㎕ 으로 확인 되었고, Malaria multiplex Ⅱ kit에서 타겟 별 검출한계는 P. ovale, P. knowlesi, IC 가 1.0 x 101 copies/㎕ 이고, P. malariale 가 1.0 x 100 copy/㎕으로 확인 되었음(도 25-33).
4-3. 정밀도(Precision)
정밀도는 규정된 조건 하에서 얻어진 독립적인 검사 결과들 가운데 일치도의 근접성을 측정하는 것으로써 시험법의 정밀성은 표준편차(Standard deviation, SD) 또는 변동계수(Coefficient of variation, CV)로 표시하며 CV 5% 미만일 경우 정밀성이 확보된다고 판단할 수 있다. 본 발명 시약의 정밀도는 날짜 간(between day), 시험 간(between run) 반복성으로 평가하였다.
각 타겟 별 3가지 농도의 양성표준물질을 시험하였으며 분석적 민감도 시험 결과를 바탕으로 저농도(low positive), 중간 농도(middle positive) 및 고농도(high positive)를 각각 설정하였다. 타겟 별 시료를 5일 동안 1일 1회, 시료의 농도 당 2반복 시험하였다.
정밀도 시험 결과 산출된 검사 날짜 간(between-day), 검사 간(between-run) CV (%)는 5% 미만으로 산출되어 본 시약 시스템의 정밀성을 입증하였다(도 37 및 38 참조).
4-4. 판정기준치 설정
본 발명 시약의 판정기준치 설정은 양성으로 확인된 검체(질병관리청에서 제공한 5종의 양성검체를 사용, IC의 경우 copy수를 알고 있는 양성 대조군을 사용하였음)를 이용해 시험하였으며, 1차 단계적 10배씩 단계적 희석 테스트를 수행하고, 불검출 나오는 단계 바로 전 단계를 2차 실험에 사용하였다.
2차 실험에서는 선정된 단계를 포함해서 4/5, 2/5 단계로 추가 희석하여 총 3단계 이상에서 각각 40회 반복 실험을 수행하였다. 선정된 최종 단계 구간에서 50%는 양성, 50%는 음성 결과를 보이는 농도에서의 Ct값을 판정 기준치로 선정하였다(결과 생략).
4-5. 기존 진단법과의 성능 비교 평가
기존 진단법과의 성능 비교 평가는 질병관리청에서 제공받은 양성시료 5개 핵산을 이용해 시험하였으며, 기존 진단법의 PCR 조성 및 온도 조건은 질병관리청에서 제공한 조건으로 진행하였다. 기존 진단법은 Nested PCR로 1차 PCR의 산물 1 ㎕를 주형으로 이용하여 2차 PCR을 수행하였다(표 14는 말라리아 기존진단법 프라이머; 표 15는 말라리아 기존진단법 1차 PCR 조성; 표 16은 말라리아 기존진단법 1차 PCR 조건; 표 17은 말라리아 기존진단법 2차 PCR 조성; 표 18(rVIV1/2, rFAL1/2, rMAL1/2), 19(rOVA1/2)는 말라리아 기존진단법 2차 PCR 조건).
| Target | Primer | Sequence (5' to 3') | Amplicon (bp) |
| Plasmodium sp. | rPLU5 | CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC | 1100 |
| rPLU6 | TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG | ||
| P. vivax | rVIV1 | CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC | 120 |
| rVIV2 | ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA | ||
| P. malariae | rMAL1 | ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC | 144 |
| rMAL2 | AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA | ||
| P. falciparum | rFAL1 | TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT | 205 |
| rFAL2 | ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC | ||
| P. ovale | rOVA1 | ATCTCTTTTGCTATTTTTTAGTATTGGAGA | 800 |
| rOVA2 | GGAAAAGGACACATTAATTGTATCCTAGTG | ||
| P. knowlesi | PK18SF | GAGTTTTTCTTTTCTCTCCGGAG | 424 |
| PK18SR | GGGAAAGGAATCACATTTAACGT |
| Component | Volume (㎕) |
| gDNA | 3 |
| rPLU6 | 1 |
| rPLU5 | 1 |
| SDW | 15 |
| Total | 20 |
| Temperature | Time | Cycle |
| 95℃ | 5 min | 1 |
| 95℃ | 1 min | 30 |
| 60℃ | 1 min | |
| 72℃ | 1 min | |
| 72℃ | 5 min | 1 |
| Component | Volume (㎕) |
| 1st PCR product | 1 |
| rVIV1 or rFAL1 or rOVA1 or rMAL1 | 2 |
| rVIV2 or rFAL2 or rOVA2 or rMAL2 | 3 |
| SDW | 15 |
| Total | 20 |
| Temperature | Time | Cycle |
| 95℃ | 5 min | 1 |
| 95℃ | 1 min | 30 |
| 60℃ | 30 sec | |
| 72℃ | 30 sec | |
| 72℃ | 5 min | 1 |
| Temperature | Time | Cycle |
| 95℃ | 5 min | 1 |
| 95℃ | 1 min | 30 |
| 55℃ | 30 sec | |
| 72℃ | 1 min | |
| 72℃ | 5 min | 1 |
P. falciparum, P. ovale, P. malariae 성능평가 결과, 기존 진단법 보다 본 과제 개발품의 성능이 우수하고(도 38), P. vivax, P. knowlesi 의 경우는 성능이 동등한 것으로 확인되었다(도 39). 종합적으로 본 과제 개발품이 기존진단법과 비교 시 성능이 동등 이상을 최종 확인하였다.
<110> KCDC
<120> Primer set for the detection of 5 species of malaria
<130> M21-0000
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum forward primer
<400> 1
atgtaatttc tactaattat tgcagaaatc 30
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum reverse primer
<400> 2
ctagtatcaa cttctaaacc agtagtg 27
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum probe
<400> 3
ttgctatggg atgtatagct gttttaggaa gc 32
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. vivax forward primer
<400> 4
attatccgag ttgaatgcac cc 22
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. vivax reverse primer
<400> 5
ctcagatcaa ccaactcagt atgaaga 27
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. vivax probe
<400> 6
ctctcggttg ttttgtctaa acccttgttg t 31
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. ovale forward primer
<400> 7
ttttggtatt actcatagtt catctt 26
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. ovale reverse primer
<400> 8
tgtatcatgt aatgctatat caatagc 27
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. ovale probe
<400> 9
ctttcggagg aactacaggt gttattttag gt 32
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. malariae forward primer
<400> 10
gaaaacggac aattttaagc attatg 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. malariae reverse primer
<400> 11
gacccataaa ccaaatttag caaca 25
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. malariae probe
<400> 12
agtgattggg atgttaagtg ccctcgtaaa ag 32
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. knowlesi forward primer
<400> 13
aacaacagcg ttatctcacc ctc 23
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. knowlesi reverse primer
<400> 14
cactgtacag attcatattt ctcgactg 28
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. knowlesi probe
<400> 15
caatgaattt ccatgcagca tatacaaaga tg 32
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal control(IC) forward primer
<400> 16
aataaatcat aacctcccgc ttcgctctct 30
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal control(IC) reverse primer
<400> 17
aataaatcat aagctggcga cgcaaaaga 29
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal control(IC) probe
<400> 18
cctcctgttc gacagtcagc cgc 23
Claims (11)
- 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)에 대한 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브, 및
삼일열 말라리아(Plasmodium vivax)에 대한 서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트 및 프로브 조성물 - 삭제
- 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)에 대한 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브,
삼일열 말라리아(Plasmodium vivax)에 대한 서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브,
사일열 말라리아(Plasmodium malariae)에 대한 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 9를 포함하는 프로브,
난형열 말라리아(Plasmodium ovale)에 대한 서열번호 10을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 11을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 12를 포함하는 프로브, 및
원숭이열 말라리아(Plasmodium knowlesi)에 대한 서열번호 13을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 14를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 15를 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 다중 실시간 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR) 프라이머 세트 및 프로브 조성물 - 제3항에 있어서, 내부 대조군(internal control)으로 서열번호 16을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 17을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 18을 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 다중 실시간 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR) 프라이머 세트 및 프로브 조성물
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트 및 프로브 조성물을 포함하는 말라리아 종 감별용 조성물
- 제5항에 있어서, 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 말라리아 종 감별용 조성물
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트 및 프로브 조성물을 포함하는 말라리아 감염증 진단용 조성물
- 제7항에 있어서, 상기 말라리아 감염증은 두통, 열, 몸서림, 관절 통증, 구토, 용혈성 빈혈, 황달, 망막 손상 및 경련으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 말라리아 감염증 진단용 조성물
- 제7항에 있어서, 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 말라리아 감염증 진단용 조성물
- 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트 및 프로브 조성물을 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 말라리아 종 감별방법 - 제10항에 있어서, 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 말라리아 종 감별방법
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