KR102039178B1 - 말라리아 원충의 감염진단을 위한 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 말라리아 원충의 검사 방법 - Google Patents

말라리아 원충의 감염진단을 위한 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 말라리아 원충의 검사 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 말라리아 원충의 탐지를 위한 유전자 증폭용 프라이머, 및 이를 이용한 말라리아 원충의 탐지 방법 또는 탐지용 키트에 관한 것으로서, 본 발명의 증폭용 프라이머를 이용하여 말라리아 원인인 삼일열 원충, 열대열 원충, 사일열 원충 또는 난형성 원충의 존부를 탐지할 수 있을 뿐만 아니라, 종(species)까지 구별할 수 있다.

Description

말라리아 원충의 감염진단을 위한 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 말라리아 원충의 검사 방법{Primer for amplifying the gene of malaria protozoa for the diagnosis of infections of malaria protozoa and detection method of malaria protozoa using the same}
본 발명은 말라리아 원충의 탐지를 위한 유전자 증폭용 프라이머, 및 이를 이용한 말라리아 원충의 탐지 방법 또는 탐지용 키트에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명에 따른 증폭용 프라이머를 이용하여 말라리아 원인인 삼일열 원충, 열대열 원충, 사일열 원충 또는 난형성 원충의 존부를 탐지할 수 있을 뿐만 아니라, 구체적인 종(species)까지 구별할 수 있는 유전자 증폭용 프라이머 세트, 이를 이용한 탐지방법 및 탐지 키트에 관한 것이다.
말라리아(Malaria)는 암컷 아노펠레스 모기(Anopheles mosquito)가 옮기는 전염병으로, 매년 2~3억 명의 사람이 감염되고 수백만 명이 사망하는 주로 열대 지방에서 발병되는 질병이다. 현재까지 인체에 말라리아 감염을 일으킨다고 알려진 플라스모디움(Plasmodium) 속에는 Plasmodium vivax(삼일열 원충), Plasmodium falciparum(열대열 원충), Plasmodium malariae(사일열 원충), 및 Plasmodium ovale(난형성 원충) 등이 있다. 이중 열대열 원충이 감염의 가장 큰 원인이며 증상도 가장 심각하다. 합병증으로는 빈혈, 황달, 뇌성 말라리아, 신부전, 흑수열(용혈성 빈혈과 혈색소뇨증)등이 있으며, 전세계적으로 열대열 원충 감염이 주요 사망 원인이 되고 있다. 환자 중 일부는 수혈이나 수직 감염 등의 감염원인에 의해 감염되기도 하며 최근 국내 말라리아 감염 실태는 대부분 휴전선 인근에서 주로 발생되었으나, 서울 강북 지역까지 남하한 상태여서 국민 보건에 위협이 되고 있다.
기존의 말라리아 검사는 말초혈액 도말검사, 항원검사, 항체검사, 유전자 검사 등이 있다. 말초혈액 도말검사는 박층 또는 후층도말법, 김사(Giemsa) 염색법 등이 보편적으로 사용되고 있다. 이 중 김사(Giemsa)법이 라이트(Wright)염색법보다 우수하고, 박층보다 후층도말법이 더 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나 원충 확인 시, 이물이나 혈소판을 말라리아 원충으로 오인하는 실수를 범할 수 있는 광학현미경을 사용하므로, 숙련된 검사자를 필요로 하는 단점이 있다. 형광현미경을 사용하는 아크리딘 오렌지 등 형광 염색법이 경제적이고 타염색법보다 빠른 시간 내에 검사할 수 있는 장점이 있다. 그러나 검사자의 주관적 판단이 개입될 수 있는 문제점이 있고 형광염색법을 이용하여 유세포 측정기로 검사하는 방법도 현재 기생출혈증(parasitemia) 검사 목적 이외에는 사용되지 않고 있다. 원충 항원검사는 단클론 항체를 이용하여 항원 캡쳐(Antigen capture) ELISA법으로 일부 사용되고 있는데, 예민도가 낮은 문제점이 있으며, 이뮤노캡쳐(Immunocapture) Dipstick 방법은 여러 제품이 개발되어 있으나, 서로 다른 표적 항원을 사용하며 예민도가 기존 방법보다 낮고 방법상 위양성이 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한 원충 항체검사는 역학 조사와 혈액 제제의 선별 검사용으로 사용되거나, 일부 항체의 경우 진단용으로 사용되는데, 항체가 존재한다고 해서 말라리아 항원이 혈중에 존재하는 것이 아니므로 치료 목적의 검사는 부적절한 점이 있다.
원충 유전자 검사방법으로는, 원충의 CS(Circumsporozoite protein), MSP-1(Merozoite surface protein 1), EBP(Erythrocyte binding protein) 등의 말라리아 감염 여부를 검사하는 방법이 있다. 상기 방법들은 검사 방법 중 예민도가 가장 높으며, 유전자 증폭 후 PCR 도트 블랏팅, SSCP, 뉴클레오타이드 서열 분석을 이용하여 종을 분류할 수 있으나, 비용과 검사시간이 많이 들고 정량화가 불가능하다는 단점이 있다.
최근 많이 사용되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하는 말라리아 원충 유전자 검사 방법은, 대게 증폭산물이 100bp 내외로 유사하여 일반 중합효소 연쇄반응(Conventional PCR)방법을 이용한 Multiplex PCR 방법에 적용하기에는 어려움이 있다. 말라리아 같은 전염성 질병은 모기를 매개로 발병하기에 선진국보다 후진국에서 많이 발생하는 질병으로, 후진국에서는 아직까지 장비나 진단키트의 비용적 문제로 Real-time PCR을 기반으로 하는 분자진단 시장이 크지 않은 것이 현실이며, 일반 중합효소 연쇄반응을 이용하는 것이 일반적이다.
따라서 본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 후진국에서도 용이하게 사용할 수 있는 Conventional PCR 방법을 기반으로 한 Multiplex PCR로 단 한번만으로 4종의 말라리아 원충의 존부를 탐지할 수 있을 뿐만 아니라, 구체적인 종까지 구별할 수 있는 유전자 증폭용 프라이머 세트, 이를 이용한 탐지방법, 및 탐지키트를 제공한다.
본 발명은 말라리아 원충의 18S rRNA 유전자를 증폭할 수 있는, 프라이머쌍을 1종 이상 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 얻어진 증폭산물이며, 증폭산물의 크기가 100 내지 800 bp 크기인 것을 특징으로 하는, 말라리아 원충 탐지용 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계, 상기 프라이머 세트를 이용하여, 중합효소연쇄반응으로 상기 추출된 DNA의 18S rRNA를 증폭하는 단계, 및 상기 유전자 증폭산물의 뉴클레오타이드 서열 또는 증폭산물의 크기를 이용하여 말라리아 원충을 탐지하는 단계를 포함하는 말라리아 원충 탐지 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, DNA 추출 시약, 및 중합효소연쇄반응 시약을 포함하는 말라리아 원충 탐지용 키트를 제공한다.
본 발명은, 한 번의 검사만으로 4종의 말라리아 원충의 존부를 탐지할 수 있을 뿐만 아니라, 구체적인 종(species)까지 구별할 수 있는 Multiplex PCR 에 사용가능한 프라이머 세트를 고안하였고, 이를 이용한 말라리아 원충의 탐지 방법 및 탐지 키트를 개발하였다.
본 발명의 프라이머는 4종의 말라리아 원충의 18S rRNA(ribosomal RNA), Plasmodium ovale small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence(GenBank: AF145337.1), Plasmodium malariae small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence (GenBank: AF145336.1), Plasmodium vivax small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence (GenBank: AF145335.1), Plasmodium falciparum small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence (GenBank: AF145334.1)의 일부 또는 상보적 뉴클레오타이드 서열의 일부를 포함하는 것으로서, 말라리아 원충 18S rRNA의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 상기 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 30 bp, 바람직하게는 19 내지 24 bp 크기를 가지는 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있으며, 프라이머의 Tm 값이 50℃ 내지 70℃, 바람직하게는 57℃ 내지 60℃일 수 있다. 상기 크기 범위 또는/및 Tm 값을 가지는 프라이머를 사용해 멀티플렉스 PCR 반응을 수행했을 때, 가장 특이도(Specificity)가 높으며, PCR 증폭효율이 높다.
본 발명의 일 예는, 말라리아 원충의 18SrRNA 유전자를 증폭하며, 바람직하게는 서열번호 1, 3, 5 및 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머와; 서열번호 2, 4, 6, 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 1종 이상 포함하는, 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍을 모두 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST를 이용해 확인한 결과 각각의 프라이머가 서로 중복되지 않았으며, 다른 말라리아 종에 비특이적으로 반응하지 않는다. 또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 말라리아 원충의 18s rRNA에 대한 PCR 반응을 수행 후 증폭산물의 크기가 Plasmodium vivax 729bp, Plasmodium falciparum 213bp, Plasmodium malariae 142bp, Plasmodium ovale 383bp로 명확히 상이하였으므로 본 발명의 프라이머 세트는 멀티플렉스 PCR에 사용하기 적절하며, 높은 결과 정확도로 4종의 말라리아 원충을 반복 없이 신속 정확하게 탐지가능하고, 구체적인 원충 종까지 구별할 수 있다(표 3).
증폭대상
18s rRNA		 명명 뉴클레오타이드 서열
(5' > 3')		 서열번호
Plasmodium Vivax
PV-F GGACTTTCTTTGCTTCGGCTT 1
PV-R TCATCCAGATCCAATCCGACAT 2
Plasmodium falciparum
PF-F TGTTTCATTTAAACTGGTTTGGGAA 3
PF-R CACAATGAACTCAATCATGACTACC 4
Plasmodium malariae
PM-F ACGTTAAGAATAAACGCCAAGC 5
PM_R TCAAAGTAACAAAATTCCCATGC 6
Plasmodium ovale
PO-F AAGAAAATTCCTTTCGGGGAAAT 7
PO-R ATTCTTCAAAATAAGCAAATTCAGC 8
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 시점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 기존 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 4종의 말라리아 원충의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 방해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형(예를 들어 부가, 결실, 치환)이 될 수 있으며, 주형과 완전하게 상보적이지 않더라도 주형과 혼성화할 수 있을 정도로 충분히 상보적일 수 있다. 상기 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형 등이 있다. 또한, 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들어 단백질(예; 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 말라리아 원충의 18S rRNA 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 얻어진 증폭산물이며, 증폭산물의 크기가 100 내지 800 bp, 바람직하게는 142 내지 729 bp인, 말라리아 원충 탐지용 프로브를 제공한다.
상기 프로브는 중합효소연쇄반응을 통해 각 원충의 18sRNA 유전자의 일부를 증폭산물로서 얻을 수 있는 것으로, 그 크기가 100bp 내지 800bp 이고, 바람직하게는 142 내지 729 bp 이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행했을 때 증폭산물의 크기는 말라리아 원충 종에 따라 각각 상이하며, 구체적으로 Plasmodium vivax(삼일열 원충)은 729bp, Plasmodium malariae(사일열 원충)은 142bp, Plasmodium falciparum(열대열 원충)은 213bp, Plasmodium ovale(난형성 원충)은 383bp 크기를 가질 수 있다. 따라서, 상기 4개의 프로브를 말라리아 원충 탐지용으로 사용할 경우, 종래의 어떤 방법보다 말라리아 4종류 원충을 간단하고, 정확하게 구별할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일예로 상기 프로브는 서열번호 9 내지 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
구분 프로브(증폭산물)의 뉴클레오타이드 서열
(5'>3')		 서열번호
Plasmodium vivax 18S rRNA GGACTTTCTTTGCTTCGGCTTGGAAGTCCTTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGCGTTCAAAGCAAACAGATATAGCATTGCGCGTTTGAATACTACAGCATGGAATAACAAAATTGAACAAGTCAGAATTTTGTTCTTTTTTCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGCTTGGGGGACATTTGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACAAACAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGCTTTGGATGAAAGATTTTAAAATAAGAATTTTCTTCGGAGTTTATTCTTAGATTGCTTCCTCAGTGCCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTTCTTGGATGGTGATGCATGGCCGCTTTTAGTTCGTGAATATGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGATCTTAACCTGCTAATTAGCGGTAAGTACGACATATTTTTATGTCGGATTGGATCTGGATGA 9
Plasmodium falciparum 18S rRNA TGTTTCATTTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATTATATATTTTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTAATAAATTATGTTTTTATCAGATATGACAGAATCTTTTTTAAAATCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAAATTAAGTGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCATTGTG 10
Plasmodium malariae
18S rRNA		 ACGTTAAGAATAAACGCCAAGCGTTATATTTTTTCTGTTACATTTTGTTTTATTAATATATATATGCGTTCTTATTATAAAAATGATTCTTTTTAAAATTCTTTTGTATAATTTTTTATGCATGGGAATTTTGTTACTTTGA 11
Plasmodium ovale
18S rRNA		 AAGAAAATTCCTTTCGGGGAAATTTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTTCTTGGATGGTGATGCATGGCCGTTTTTAGTTCGTGAATATGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGATCTTAACTTGCTAATTAGCGGCGAATACGTCATATTCTTATGCGAAATTGAATATAGCTGAATTTGCTTATTTTGAAGAAT 12
본 발명의 일 예는, 대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계, 상기 추출된 DNA의 18S rRNA를, 상기 말라리아 원충의 18S rRNA 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭하는 단계, 및 상기 유전자 증폭산물의 뉴클레오타이드 서열 또는 증폭산물의 크기를 이용하여 말라리아 원충을 탐지하는 단계를 포함하는 말라이아 원충 탐지 방법을 제공한다.
상기 대상 시료로부터 DNA를 추출은 다양한 방법으로 추출가능하며, 예를 들어 혈액 또는 채혈지 검체에서 추출할 수 있다.
상기 말라리아 원충의 18S rRNA 유전자 증폭용 프라이머 세트의 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 길이가 10 내지 30 bp, 바람직하게는 19 내지 24 bp이고, Tm 값이 50℃ 내지 70℃, 바람직하게는 57℃ 내지 60℃일 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 3, 5 및 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 프라이머와 서열번호 2, 4, 6, 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 1종 이상 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍 모두를 포함할 수 있다.
상기 중합효소 연쇄반응법은 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 일반 중합효소 연쇄반응(Conventional PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR), 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응법(Multiplex PCR) 등일 수 있고, 바람직하게는 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응이다.
상기 멀티플렉스 PCR은 복수의 프라이머쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법으로 동일한 검체에서 검출 가능한 다수의 유전자가 있을 경우 유용하게 사용되고, 한 번의 검사로 다수의 유전자형을 판별할 수 있어 시간과 비용을 줄일 수 있다. 멀티플렉스 PCR에 사용하는 프라이머는 다수의 프라이머간에 dimer를 형성하거나 상호 간에 간섭하지 않도록 프라이머의 상호작용을 계산하여 제작해야 하며, 증폭 산물의 크기가 각각 상이하여 아가로스 겔(agarose gel)상에서 구분될 수 있어야 한다.
본 발명의 프라이머 세트는 상기 조건을 모두 만족하여 멀티플렉스 PCR 용으로 바람직하며, 한 번의 검사로 4종의 말라리아 원충의 감염여부 및 감염된 원충의 구별이 가능하고, 단시간에 우수한 민감도로 검출이 가능하므로 기존 말라리아 검출방법보다 우수한 활용도를 가진다.
상기 유전자 증폭산물을 말라리아 원충 탐지용 프로브(probe)로 사용할 수 있다. 구체적으로, 유전자 증폭산물의 뉴클레오타이드 서열 또는 증폭산물의 크기를 이용하여 말라리아 원충을 탐지하며, 예를 들어, 증폭산물의 크기가 729bp인 경우 Plasmodium vivax(삼일열 원충), 142bp 인 경우 Plasmodium malariae(사일열 원충)은, 213bp인 경우 Plasmodium falciparum(열대열 원충), 383bp인 경우 Plasmodium ovale(난형성 원충)인 것으로 말라리아 원충의 존부와 4가지 종을 구분할 수 있다.
한편, 상기 중합효소연쇄반응을 수행함에 있어서, 어닐링 온도는 55℃ 내지 60℃, 바람직하게는 55℃ 내지 57℃, 예를 들어 57℃일 수 있다.
구체적으로, 다양한 어닐링(Annealing) 온도 조건에서 PCR 증폭을 수행한 결과, 각 원충에 따른 최적 어닐링 온도 조건이 있는 것으로 확인되었으며, 어닐링 온도가 55℃ 내지 57℃, 특히 57℃에서 4종의 말라리아 원충 각각의 밴드가 가장 뚜렷이 나타났으며, 비특이적 반응을 하지 않고 각각의 밴드가 검출되었다(도 1). 따라서, 상기 어닐링 온도에서 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 멀티PCR을 수행하였을 때 4종의 말라리아 원충을 가장 뚜렷이 구분할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 4종의 말라리아 검체를 검출하기위해서는, 멀티플렉스 PCR을 40cycle 미만, 바람직하게는 25 내지 39 cycle 예를 들어, 30 cycle 수행하는 것이 바람직하며, 말리리아 검출에 소요되는 총 소요시간은 120분 미만, 바람직하게는 30분 내지 80분, 예를 들어, 70분이 소요될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 프라이머 세트, DNA 추출시약, 및 중합효소연쇄반응 시약을 포함하는 말라리아 원충 탐지용 키트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 3, 5 및 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머와 서열번호 2, 4, 6, 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 1종 이상 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 키트는 추가적으로 증폭용 완충용액, dNTP, 대조군, 검출 시약 등을 추가적으로 포함할 수 있으며, 액상 또는 건조 타입으로 제공될 수 있고, 반응에 영향이 없는 경우에 한하여 목적에 따라 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
상기 DNA 추출시약은 단백질 분해효소(proteinase K)와 추출용액(10mM Tris-Cl, 7% chelex)을 포함할 수 있고, 상기 중합효소연쇄반응 시약은 Taq DNA 중합효소, 프리믹스(Premix) 1용액 [2X PCR (100 mM-KCl, 20mM Tris-HCl(pH8.0), 2.0 mM MgCl2), 2.5 mM dNTP, 20 pmol 5' 3' 프라이머, 0.001% Sybergreen 또 Evagreen]를 포함할 수 있으며, 상기 대조군은 본 발명을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행시 음성 판정이 나왔을 때, 즉 시료에 말라리아 원충이 존재하지 않는 것으로 나왔을 때 그 결과가 실험상의 실수인지 또는 실제 말라리아 원충이 존재하지 않는 것인지 검증하기 위해 필요하며, 본 발명의 말라리아 프라이머 세트와 함께 증폭할 때 말라리아 검출을 방해하지 않아야 한다. 상기 대조군이 양성으로 나타날 경우 중합효소 연쇄반응 자체는 문제가 없음을 나타낸다.
본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 유전자 검사 키트를 사용할 경우, 검체의 삼일열 원충, 사일열 원충, 열대열 원충 또는 난형 원충의 존재 여부 및 이들 종류를 구별할 수 있으며, 특히 4가지 원충을 혼합물에 대해서 한번의 멀티플렉스 PCR로 원충의 존재 유무 및 종류를 구별하여 탐지할 수 있으며, 따라서, 말라리아의 감염 여부를 단시간에 우수한 민감도로 간편하고 정확하게 4종의 말라리아 원충을 검출할 수 있다.
도 1은 실시예 2 내지 5에 따라 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 말라리아 원충의 18s rRNA에 대한 멀티플렉스 PCR 수행 시 최적 PCR 반응 온도를 결정하기 위한 실험결과이다.
도 2는 실시예 2 내지 13에 따라 본 발명의 4종의 프라이머 세트를 이용하여 말라리아 원충의 18s rRNA에 대해 멀티플렉스 PCR 수행 시 교차반응 발생 유무를 확인한 실험결과이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트 사용시 최적 Multiplex PCR Cycle 횟수를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명 프라이머 세트의 최소검출한계 농도와 S사 kit(솔젠트 제품)의 최소검출한계 농도 측정 결과를 나타낸다.
이하에서는, 본 발명의 구성을 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예로만 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 프라이머 설계 및 합성
말라리아 원충의 18s rRNA 뉴클레오타이드 서열를 증폭하기 위한 프라이머를설계하고 합성하고자, 본 발명자들은 4종의 말라리아 원충 각각의 18s rRNA를 서로 교차 반응이 일어나지 않고, 한 번에 탐지할 수 있도록 표 3의 PCR 프라이머를 설계 및 합성하였다.
구체적으로, 4종의 말라리아 18s rRNA (1) Plasmodium ovale small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence(GeneBank: AF145337.1), (2) Plasmodium malariae small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence(GenBank: AF145336.1), (3) Plasmodium vivax small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence(GenBank: AF145335.1) (4) Plasmodium falciparum small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence (GenBank: AF145334.1) 각각의 뉴클레오타이드 서열에서 길이는 19 내지 24 bp, Tm 값은 55 내지 65℃가 되도록 임의의 뉴클레오타이드 서열을 선택하여 정방향 및 역방향 프라이머를 선발하였다. Tm 값은 Primer3Plus 프로그램을 사용하여 체크하였다.
증폭대상 18s rRNA 명명 뉴클레오타이드 서열(5'>3') 서열번호 Tm
(℃)		 증폭산물
크기(bp)
Plasmodium Vivax
PV-F GGACTTTCTTTGCTTCGGCTT 1 59.4 729
PV-R TCATCCAGATCCAATCCGACAT 2 59
Plasmodium falciparum
PF-F TGTTTCATTTAAACTGGTTTGGGAA 3 58 213
PF-R CACAATGAACTCAATCATGACTACC 4 58
Plasmodium malariae
PM-F ACGTTAAGAATAAACGCCAAGC 5 57.9 142
PM_R TCAAAGTAACAAAATTCCCATGCA 6 57.8
Plasmodium ovale
PO-F AAGAAAATTCCTTTCGGGGAAAT 7 57.5 383
PO-R ATTCTTCAAAATAAGCAAATTCAGC 8 57.6
다음으로, 4종의 말라리아 원충(Plasmodium Vivax , Plasmodium falciparum , Plasmodium malariae , Plasmodium ovale)에 대한 각각의 프라이머가 서로 중복되지 않음을 NCBI blast를 이용하여 확인하였으며, 이후 PCR을 통해 검사하였다.
< 실시예 2 내지 5> 말라리아 원충과 프라이머 세트를 이용한 PCR 반응
(1) 주형 DNA 제조
중합효소 연쇄반응을 실시하기 위해, 먼저 네 종류의 주형 DNA를 제조하였다. 우선, Plasmodium ovale small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence(GenBank: AF145337.1), Plasmodium malariae small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence (GenBank: AF145336.1), Plasmodium vivax small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence (GenBank: AF145335.1), Plasmodium falciparum small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence (GenBank: AF145334.1)서열을 유전자 합성방법(NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203)을 사용하여 4종 말라리아 원충의 각 18s rRNA를 암호화하는 cDNA를 각각 합성하고 이를 pMD20-T Vector에 클로닝하였다.
구체적으로, 증류수 3㎕, pMD20-T vector 1㎕, DNA ligase 5㎕, 유전자 합성물질 1㎕를 동일한 튜브에 넣어 혼합하여 반응액을 제조하였다. 그 후 E. coli JM109 competent cell 100㎕에 상기 반응액을 넣고, 엠피실린, IPTG, X-Gal이 포함된 LB 플레이트에 상기 반응액을 접종한 후 37℃ 조건에서 배양하였다. 다음으로 색이 흰 콜로니를 취하여 배지에서 37℃ 조건에서 배양한 후 원심분리하여 상층액은 버리고 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA는 제한효소를 이용하여 말라리아 주형 DNA만을 잘라내 실험에 사용하였다.
(2) PCR 최적 반응 온도 조건 확인
PCR 수행에 있어 최적 반응 온도 조건을 확인하기 위하여, 상기 (1)에서 합성한 말라리아 주형 DNA와 표 3의 프라이머 쌍을 사용하고 simply Amp(Thermo, USA)를 이용해 어닐링(Annealing) 온도를 변화시키면서 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
구체적으로, PCR buffer(with 3mM MgCl2), TopTaq DNA polymerase 5U/ul, dNTP 400uM, coralload concentrate가 포함된 TopTaq master Mix(Qiagen, USA)를 PCR tube에 넣고 상기 (1)에서 합성한 4가지 주형 각각과, 하기 표 4의 실시예 2의 주형과 프라이머 쌍을 증류수를 넣고 총 용량이 50㎕가 되도록 혼합하였다.
상기 혼합액을 반응조건 94℃ 에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초씩 30 cycle을 반응시키고, 증폭된 PCR 산물을 아가로스겔 전기영동법으로 전기영동한 후, 자외선 조사하여 확인하였다. 추가적으로, 어닐링(Annealing) 온도 조건을 변화시킨 것(55℃, 57℃, 60℃, 62℃ 및 65℃) 외에는 상기 PCR 방법과 동일한 조건에서 PCR을 수행한 후, 아가로스겔 전기영동를 수행하였으며, 그 결과를 도 1에 나타냈다.
추가로 3종의 말라리아 원충의 18s rRNA를 하기 표 4의 실시예 3 내지 5의 주형과 프라이머쌍을 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 PCR 증폭반응을 수행하였으며, 전기영동 결과를 도 1에 나타냈다.
실시예 주형(template) 사용 프라이머쌍
2 Plasmodium vivax (V) PV-F & PV-R
3 Plasmodium falciparum (F) PF-F & PF-R
4 Plasmodium malariae (M) PM-F & PM-R
5 Plasmodium ovale (O) PO-F & PO-R
다양한 어닐링(Annealing) 온도 조건(55℃, 57℃, 60℃, 62℃ 및 65℃) 에서 PCR 증폭을 수행한 결과, 4종의 말라리아 원충이 모두 증폭이 되기는 하였으나, 각 원충에 따른 최적 어닐링 온도 조건이 있음을 도 1로부터 확인할 수 있었다.
구체적으로, 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 Plasmodium Vivax의 18s rRNA는 55℃, 57℃, 60℃, 62℃ 및 65℃ 온도 조건에서 모두 증폭산물이 뚜렷이 확인되었으며, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 Plasmodium falciparum 의 18s rRNA는 55℃, 57℃, 60℃ 및 62℃ 온도 조건에서 모두 증폭산물이 뚜렷이 확인되었으나 65℃ 온도 조건에서 다소 밴드 강도가 줄어들었다. 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 Plasmodium malariae 의 18s rRNA는 55℃, 57℃ 및 60℃ 온도 조건에서 모두 증폭산물이 뚜렷이 확인되었으나, 62℃ 및 65℃ 온도 조건에서 다소 밴드 강도가 줄어들었다. 서열번호 7 및 8의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 Plasmodium ovale 의 18s rRNA는 55℃ 및 57℃온도 조건에서 모두 증폭산물이 뚜렷이 확인되었으나, 60℃, 62℃ 및 65℃ 온도 조건에서 다소 밴드 강도가 줄어들었다.
즉, 어닐링 온도가 57℃인 경우, 4종의 말라리아 원충 각각에서 밴드가 가장 뚜렷이 나타났으며, 비특이적 반응을 하지 않고 각각의 밴드가 검출되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 6 내지 13> 멀티플렉스 PCR 반응의 교차 반응성 평가
상기에서 합성한 말라리아 원충 4종의 18s rRNA 주형과 표 3의 4종 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 진행하였을 때 교차반응이 일어나는지를 확인하기 위하여, PCR 반응물 주형과 프라이머를 다양하게 조합하여 멀티플렉스 PCR 을 수행하였다.
PCR 수행 조건은 어닐링 온도를 57℃로 유지한 것 외에는 상기 실시예 2-5의 PCR 방법과 동일하게 수행하였으며, 사용한 주형과 프라이머 세트의 조합은 표 4 및 표 5에 나타냈다.
실시예 주형(Template) 사용 프라이머 세트
6 Plasmodium vivax (V) PV-F & PV-R
PF-F & PF-R
PM-F & PM-R
PO-F & PO-R
7 Plasmodium falciparum (F) PV-F & PV-R
PF-F & PF-R
PM-F & PM-R
PO-F & PO-R
8 Plasmodium malariae (M)
 PV-F & PV-R
PF-F & PF-R
PM-F & PM-R
PO-F & PO-R
9 Plasmodium ovale (O) PV-F & PV-R
PF-F & PF-R
PM-F & PM-R
PO-F & PO-R
10 Plasmodium vivax (V)
Plasmodium falciparum (F)
Plasmodium malariae (M)
Plasmodium ovale (O)　		 PV-F & PV-R
11 Plasmodium vivax (V)
Plasmodium falciparum (F)
Plasmodium malariae (M)
Plasmodium ovale (O)　		 PF-F & PF-R
12 Plasmodium vivax (V)
Plasmodium falciparum (F)
Plasmodium malariae (M)
Plasmodium ovale (O)　		 PM-F & PM-R
13 Plasmodium vivax (V)
Plasmodium falciparum (F)
Plasmodium malariae (M)
Plasmodium ovale (O)　		 PO-F & PO-R
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머는 4종의 말라리아 원충의 종(species)에 따라 증폭산물의 크기가 각각 Plasmodium vivax 729bp, Plasmodium falciparum 213bp, Plasmodium malariae 142bp, Plasmodium ovale 383bp로 명확히 상이하였고, 원충 4종이 비특이적 반응없이 각각 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 4종의 프라이머 세트를 사용할 경우, Real time PCR 뿐만 아니라, 일반적인 Multiplex PCR 방법을 사용하였을 때에도 다른 말라리아 원충종에 비특이적으로 반응하지 않아 4종의 말라리아 원충을 한 번에 우수한 정확도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
< 실험예 1> Multiplex PCR 검사 시간 평가
1-1. 본 발명의 프라이머 세트사용 시 최적 Multiplex PCR Cycle 및 검사시간 측정
본 발명의 4종의 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 세트를 사용하였을 때, 4종의 말라리아 검체의 검출에 소요되는 시간을 확인하기 위해, Multiplex PCR 검사에 걸리는 시간을 평가하였다.
구체적으로, 주형으로 말라리아 4종의 Control template 혼합액을 사용하였고, 말라리아 4종의 프라이머 쌍을(표 4) 혼합하였으며, 57℃ 반응온도에서 PCR cycle의 수만 20, 30, 40으로 변경하면서 멀티플렉스 PCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3에 나타낸 바와 같이, PCR 30cycle 만으로 4종의 말라리아 검체 모두에서 밴드가 분명하게 나타났으며, 검사시간은 총 70분이 소요되었다.
1-2. 시판제품을 사용 시 최적 Multiplex PCR Cycle 및 검사시간 측정
시중에서 판매되고 있는 솔젠트 제품(제품명 DiaPlexC Malaria Detection kit)을 사용해 말라리아 검체의 검출에 소요되는 시간을 확인하였다.
구체적으로 솔젠트 사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 PCR을 수행하였으며, 시약 내 UDG의 활성화를 위해 50℃에서 3분 간 반응 후, 95℃에서 15분간 효소를 활성화 하였으며, 그 후 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 40초의 PCR 과정을 40cycle 반복하였다. 마지막으로 PCR 산물의 안정화를 위해 72℃에서 5분간 반응 후 PCR을 종료하였다.
그 결과, 말라리아 검체를 검출하는데 40cycle 의 PCR을 반복해야 했으며, 총 검사시간에 120분이 소요되었다.
즉, 4종의 말라리아 검체의 검출에 있어, 본 발명의 프라이머 세트를 사용할 경우 30 cycle, 총 70분 만에 말라리아 원충의 검출 및 종구분이 가능하였으며, 이는 기존 제품이 40 cycle, 총 소요시간 120분이 걸리는 것과 비교해 말라리아 검출시간을 현저히 단축시킨 것이며, 기존방법보다 간단히 말라리아 검출 및 종 확인이 가능함을 보여준다.
< 실험예 2> 최소검출한계 확인
2-1. 본 발명 프라이머 세트의 최소검출한계 확인
본 발명의 4종의 프라이머 세트를 사용해 Multiplex PCR 반응을 수행시 최소검출한계를 확인하기 위해, 표 3의 4종의 말라리아 원충의 18s rRNA를 모두 포함하는 Control template를 4ng, 400pg, 40pg, 4pg, 400fg, 40fg 을 각각 주형으로 하여, 상기 표 3의 4종의 말라리아 프라이머를 처리한 후, 실시예 2-6과 동일한 PCR 조건으로 반응 시켰으며, 2% Agarose gel을 이용해 4종의 말라리아 원충 18s rRNA 밴드가 모두 나타나는 최소 농도를 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타난 바와 같이, 4pg 까지 4개의 밴드가 모두 뚜렷이 나타났으며, 400fg에서는 3개 밴드가 나타났는바, 4pg이 검출이 가능한 최소 반응농도 한계임을 확인하였다.
2-2. 솔젠트 제품의 최소검출한계 확인
솔젠트사에서 제공하는 Control template 4ng, 400pg, 40pg, 4pg, 400fg, 40fg 을 각각 주형으로 사용하여, 솔젠트 사에서 제공하는 메뉴얼에 따라 PCR를 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타난 바와 같이, 솔젠트 제품을 사용했을 때 4pg까지 4개의 밴드가 모두 뚜렷이 나타난 반면, 400fg에서는 3개 밴드가 나타났다. 즉, 솔젠트 제품의 최소검출한계 농도가 4pg임을 확인하였다.
이로써 본 발명의 4종의 프라이머 세트의 최소검출한계를 시판중인 솔젠트 제품과 비교했을 때 동등한 정도를 가져 유사한 민감도를 가짐을 확인하였다.
<110> Chang Healthcare <120> Primer for amplifying the gene of malaria protozoa for the diagnosis of infections of malaria protozoa and detection method of malaria protozoa using the same <130> DPP20173097KR <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV-F <400> 1 ggactttctt tgcttcggct t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV-R <400> 2 tcatccagat ccaatccgac at 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PF-F <400> 3 tgtttcattt aaactggttt gggaa 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PF-R <400> 4 cacaatgaac tcaatcatga ctacc 25 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PM-F <400> 5 acgttaagaa taaacgccaa gc 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PM_R <400> 6 tcaaagtaac aaaattccca tgca 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PO-F <400> 7 aagaaaattc ctttcgggga aat 23 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PO-R <400> 8 attcttcaaa ataagcaaat tcagc 25 <210> 9 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmodium vivax 18S rRNA <400> 9 ggactttctt tgcttcggct tggaagtcct tgttactttg agtaaattag agcgttcaaa 60 gcaaacagat atagcattgc gcgtttgaat actacagcat ggaataacaa aattgaacaa 120 gtcagaattt tgttcttttt tcttattttg gcttagttac gattaatagg agtagcttgg 180 gggacatttg tattcagatg tcagaggtga aattcttaga ttttctggag acaaacaact 240 gcgaaagcat ttgcctaaaa tacttccatt aatcaagaac gaaagttaag ggagtgaaga 300 cgatcagata ccgtcgtaat cttaaccata aactatgccg actaggcttt ggatgaaaga 360 ttttaaaata agaattttct tcggagttta ttcttagatt gcttcctcag tgccttatga 420 gaaatcaaag tctttgggtt ctggggcgag tattcgcgca agcgagaaag ttaaaagaat 480 tgacggaagg gcaccaccag gcgtggagct tgcggcttaa tttgactcaa cacgggaaaa 540 ctcactagtt taagacaaga gtaggattga cagattaata gctctttctt gatttcttgg 600 atggtgatgc atggccgctt ttagttcgtg aatatgattt gtctggttaa ttccgataac 660 gaacgagatc ttaacctgct aattagcggt aagtacgaca tatttttatg tcggattgga 720 tctggatga 729 <210> 10 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmodium falciparum 18S rRNA <400> 10 tgtttcattt aaactggttt gggaaaacca aatatattat atattttgct ttgttcaaaa 60 taaggttttc taataaatta tgtttttatc agatatgaca gaatcttttt taaaatctct 120 tcaatatgct tttattgctt ttgagaggtt ttgttacttt gagtaaaatt aagtgttcat 180 aacagacggg tagtcatgat tgagttcatt gtg 213 <210> 11 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmodium malariae 18S rRNA <400> 11 acgttaagaa taaacgccaa gcgttatatt ttttctgtta cattttgttt tattaatata 60 tatatgcgtt cttattataa aaatgattct ttttaaaatt cttttgtata attttttatg 120 catgggaatt ttgttacttt ga 142 <210> 12 <211> 383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmodium ovale 18S rRNA <400> 12 aagaaaattc ctttcgggga aatttcttag attgcttcct tcagtacctt atgagaaatc 60 aaagtctttg ggttctgggg cgagtattcg cgcaagcgag aaagttaaaa gaattgacgg 120 aagggcacca ccaggcgtgg agcttgcggc ttaatttgac tcaacacggg gaaactcact 180 agtttaagac aagagtagga ttgacagatt aatagctctt tcttgatttc ttggatggtg 240 atgcatggcc gtttttagtt cgtgaatatg atttgtctgg ttaattccga taacgaacga 300 gatcttaact tgctaattag cggcgaatac gtcatattct tatgcgaaat tgaatatagc 360 tgaatttgct tattttgaag aat 383

Claims (9)

  1. 삼일열 원충(Plasmodium vivax), 사일열 원충(Plasmodium malariae), 열대열 원충(Plasmodium falciparum) 또는 난형 원충(Plasmodium ovale)의 18S rRNA(ribosomal RNA) 유전자를 증폭하며,
    서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 프라이머쌍;
    서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 프라이머쌍;
    서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 프라이머쌍; 및
    서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 프라이머쌍을 포함하고,
    상기 프라이머는 Tm 값이 50℃ 내지 70℃인 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 얻어진 증폭산물이며, 증폭산물의 크기가 100 내지 800 bp인, 말라리아 원충 탐지용 프로브로서,
    상기 프로브는 서열번호 9, 10, 11 또는 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것인 말라리아 원충 탐지용 프로브.
  6. 대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    제1항에 따른 삼일열 원충(Plasmodium vivax), 사일열 원충(Plasmodium malariae), 열대열 원충(Plasmodium falciparum) 또는 난형 원충(Plasmodium ovale)의 18S rRNA(ribosomal RNA) 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 중합효소연쇄반응으로 상기 추출된 DNA의 18S rRNA 유전자를 증폭하는 단계; 및
    상기 유전자 증폭산물의 뉴클레오타이드 서열 또는 증폭산물의 크기를 이용하여 말라리아 원충을 탐지하는 단계를 포함하는 말라리아 원충 탐지 방법으로서,
    상기 중합효소연쇄반응의 어닐링(annealing)온도는 55 내지 57℃인 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 말라리아 원충을 탐지하는 단계는, 말라리아 원충의 존부 또는 종(species)을 구별하는 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응법은 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응법(Multiplex PCR)인 것인, 방법.
  9. 삭제
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