CN111118190A - 一种基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品及其制备方法和应用，其通过构建包含疟原虫18s rRNA基因序列的质粒以制备疟原虫检测样品。应用该质粒可模拟疟原虫感染的生物样本，制备成相应的阳性对照品。本发明解决了疟原虫阳性样本需求大，但是疟原虫阳性滤纸血或全血样本数量有限且又不易定量的问题。本发明制备的基因阳性样本具有制作简单及成本低等优点，在实验室和临床的疟原虫核酸检测技术能力质量控制中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品及其制备方法。此外，本发明还涉及该基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品的应用。
背景技术
消除疟疾是我国“健康中国2020”战略计划的重要目标之一，随着2010年启动中国消除疟疾行动计划的实施，我国本地疟疾疫情已得到控制，但境外输入性疟疾病例近年来呈持续上升趋势，给疟疾消除工作带来巨大挑战。目前，准确的疟疾诊断依然是消除疟疾的核心工作之一。为此，我国已初步建成了基本覆盖所有疟疾流行省的疟疾诊断参比实验室网络，进一步完善了我国的疟疾诊断质量管理体系。这些疟疾病原学诊断标准化实验室作为消除疟疾阶段和消除后阶段开展疟疾病例复核和质量控制的主要力量，所采用的核酸检测技术已经纳入我国疟疾诊断标准，是显微镜检查外必须具备的检测技术。但对核酸检测技术进行质量控制需要大量的阳性样本，而疟原虫阳性滤纸血或全血样本数量有限，又不易定量，给质量控制的样本来源带来挑战。
可见，本领域亟需研发一种新的疟原虫阳性对照品，以解决考核盲样短缺的技术难题。18S rRNA基因普遍存在于真核细胞中，保守区与可变区在其上交替排列，是真核微生物多样性的最佳选择。基于该基因的疟原虫核酸检查已得到广泛认可。
中国专利申请CN201811366043公开了一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法，其中涉及“含有间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照，阴性对照”，仅涉及该基因的某个片段，无法对基于该基因的不同核酸检测技术进行有效评估，无法有效区分卵形疟原虫wallikeri亚种（W亚种）和curtisi亚种（C亚种）。
为此，本发明拟通过建立基于疟原虫18S rRNA基因全长序列的阳性模拟样本，获得适用于我国疟疾诊断参比实验室核酸检测能力质量控制过程中的疟原虫模拟样本，从而解决考核盲样短缺的难题，为消除疟疾阶段的疟疾诊断提供技术支持。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品的制备方法。
本发明要解决的技术问题之二是提供基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品，以疟原虫模拟样本作为阳性对照，可作为盲样进行基于疟原虫18S rRNA基因的核酸检测技术的检测能力评估，从而解决核酸检测技术中质量控制所需的大量考核盲样短缺的技术难题。
本发明要解决的技术问题之三是提供基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品在制备疟原虫诊断产品中的应用。目前还没有通用的疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品，本发明就填补了这一空缺，本发明的疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品可适用于基于疟原虫18s rRNA基因的疟原虫检测试剂盒，拓宽了适用范围。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
在本发明的第一方面，提供一种基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品的制备方法，包括以下步骤：
（1）基因序列信息的获取：从数据库中检索和比对人体疟原虫，获得人体疟原虫18srRNA基因全长序列信息；
（2）基因序列的获取及质粒构建：根据步骤（1）获得的序列信息，设计基因特异引物扩增出全长基因序列，或者应用全基因合成方法获取基因序列，将该序列与载体连接构建质粒，将该质粒导入感受态细胞中进行扩大培养以备后续大量质粒的提取；
（3）疟原虫感染模拟样本的制备：提取包含18s rRNA基因的质粒，将其与健康抗凝小鼠全血混合，做成模拟样本。
步骤（1）中，所述人体疟原虫包括但不限于恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫等。
步骤（2）中，所述得到的质粒包含疟原虫18s rRNA基因全长序列，能实现序列的大规模扩增。
步骤（3）中，提取包含18s rRNA基因的质粒，将其与健康抗凝小鼠全血以不同比例混合，所述得到的模拟样本包括全血模拟样本和滤纸血模拟样品，涵盖了现场样本采集的方式。
优选地，步骤（3）中，提取包含18s rRNA基因的质粒，将其与健康抗凝小鼠全血不同比例混合，使质粒终浓度为1pmol~1nmol，分别做成全血模拟样本和滤纸血模拟样本。
所述得到的疟原虫18s rRNA基因全长序列，包含疟原虫18s rRNA基因全长序列的质粒以及包含疟原虫18s rRNA基因全长序列质粒的模拟样本均可用于基于目的基因的疟原虫核酸检测。
在本发明的第二方面，提供一种采用上述方法制得的基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品。
在本发明的第三方面，提供一种该基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品在制备疟原虫诊断产品中的应用。所述疟原虫诊断产品包括疟原虫诊断试剂盒等。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明建立的基于疟原虫18S rRNA基因全长序列的阳性模拟样本，解决了核酸检测技术中质量控制所需的大量阳性样本短缺的问题，为疟原虫核酸检测提供检测阳性对照及为考核疟疾诊断参比实验室核酸检测能力提供盲样，从而提高疟原虫检测水平以及消除疟疾阶段的疟疾诊断提供技术支持。
与显微镜镜检血涂片计数原虫密度相比，本发明从全基因合成到质粒构建、质粒浓度稀释，更容易实现样本的定量。
本发明解决了疟原虫阳性样本需求大，但是疟原虫阳性滤纸血或全血样本数量有限且又不易定量的问题。本发明制备的基因阳性样本具有制作简单及成本低等优点，在实验室和临床的疟原虫核酸检测技术能力质量控制中具有重要意义。
目前现有的疟原虫核酸分型检测试剂盒中的阳性对照通常都是针对特定的试剂盒专门制备的，目前还没有通用的疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品，本发明就填补了这一空缺，本发明的疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品可适用于基于疟原虫18s rRNA基因的疟原虫检测试剂盒，拓宽了适用范围。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是本发明实施例1中人体疟原虫全长18s rRNA基因质粒限制性内切酶消化验证图谱；图1中，1：恶性疟原虫全长质粒；2：PvuI消化的恶性疟原虫全长质粒；3：DNAMarker；4：三日疟原虫全长质粒；5：BsrGI消化的三日疟原虫全长质粒；6：DNA Marker；7：间日疟原虫全长质粒；8：HindIII消化的间日疟原虫全长质粒；9：DNA Marker；10：卵形疟原虫C亚种全长质粒；11：KpnI/BamHI消化的卵形疟原虫C亚种全长质粒；12：DNA Marker；13：卵形疟原虫W亚种全长质粒；14：PvuI消化的卵形疟原虫W亚种全长质粒；15：DNA Marker。
图2是本发明实施例2中Real-time PCR扩增质粒的结果示意图。
图3是本发明实施例3中模拟全血和滤纸血中应用Real-time PCR扩增疟原虫属和虫种的结果示意图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：人体疟原虫18S rRNA基因全长序列合成与质粒构建
根据四种人体疟原虫18S rRNA基因全长序列（见表1），并进行全基因序列合成，使用具有Amp抗性的pUC57载体构建质粒。将上述质粒通过热激法转化至TOP10感受态细胞中进行扩增。感受态细胞的转化：
（1）超净工作台提前灭菌30min以上，从 -80℃冰箱中取一管TOP10感受态细胞（100μL/管）置于冰上融化；
（2）于超净台内向步骤4的连接反应液中加入2μL Solution III（TransformationEnhancer，提高转化率），吹打混匀取10μL混合液加入100μLDH5α感受态细胞中，用手指轻弹混匀，置于冰上放置30min；
（3）将装有步骤（2）反应液的离心管放入42℃的水中水浴处理90s，然后立即放到冰上3min，使细胞冷却；
（4）于超净台内向离心管中加入900μL不含抗性的无菌LB液体培养基，混匀后放到摇床内振荡培养约45min（37℃，150r/min），使质粒上的抗性基因表达，并使菌体复苏；
（5）将步骤（4）的溶液6000rpm离心3min，于超净台内小心倒掉上清，剩余约100μL上清，用移液器充分悬浮菌体沉淀，并转移至100μg/mL氨苄霉素抗性（Amp+）的LB固体培养基上，用无菌弯头玻璃棒轻轻将菌液均匀涂开；
（6）将平板置于室温直至液体被完全吸收，然后37℃倒置培养过夜（12-16h）；
（7）次日挑取5个单克隆进行菌落PCR验证，并取含目的片段的菌液进行测序。
使用序列验证正确的菌液提取质粒：
（1）首先向吸附柱（下面放一个干净的2mL收集管）加入500μL平衡液进行柱平衡处理，12000rpm离心1min，弃收集管内废液，然后将吸附柱放回收集管；
（2）取3mL过夜培养的菌液于一无菌离心管中，12000rpm离心1min，弃上清，用移液器小心将剩余上清除去；
（3）向带有菌体沉淀的离心管中加入250μL P1溶液（第一次使用前按说明书的要求加入RNase A），利用涡旋振荡器充分悬浮细菌沉淀；
（4）向步骤（3）的离心管中继续加入250μL P2溶液，温和上下颠倒混匀6-8次，使菌体裂解充分；
（5）向步骤（4）的离心管中继续加入350μL P3溶液，立即温和上下颠倒混匀6-8次，此时应出现白色絮状沉淀，12000rpm离心约15min；
（6）用移液器小心吸取步骤（5）中的上清转移至步骤（1）处理好的吸附柱内，12000rpm离心1min，弃废液并将吸附柱放回收集管；
（7）向吸附柱中加入600μL漂洗液（第一次使用前按说明书的要求加入相应量的无水乙醇），12000rpm离心1min，弃废液并将吸附柱放回收集管；
（8）重复步骤（7）一次；
（9）将吸附柱放入收集管中，12000rpm空转2min，尽量除尽漂洗液；
（10）将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，并向吸附膜中央小心滴加50μL灭菌去离子水，室温放置2min，12000rpm离心2min洗脱质粒溶液。
表1四种人体疟原虫18s rRNA基因信息
对提取的质粒进行双酶切验证，恶性疟原虫的酶切位点为Pvu，三日疟原虫的酶切位点为BsrGII，间日疟原虫的酶切位点为HindIII，卵形疟原虫C亚种的酶切位点为KpnI/BamHI，卵形疟原虫W亚种的酶切位点为PvuI。经酶切后，阳性克隆可消化为包含目的18s rRNA序列的片段和载体片段（如图1中的2，5，8，11，14所示），而空载体经酶切后的片段如图1中的1，4，7，10，11所示。
实施例2：Taqman探针法验证构建质粒
提取克隆质粒，根据文献（1. Rougemont M., et al. 2004. J. Clin. Microbiol.42:5636–5643; 2. Sandra E. Shokoples, et al. 2009. J. Clin. Microbiol. 47:975-980.）选择经典通用的Real-time PCR进行人体疟原虫核酸扩增，验证构建的18S rRNA基因全长质粒序列Real-time PCR 反应条件为95°C 15 s，60°C 1 min，扩增40个循环。25µl反应体系包括：5 µl 质粒DNA，12.5 µl TaqMan universal master mix，引物和探针。其中引物和探针的浓度和序列参照表2。如图2所示，应用该方法可以分别扩增出疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵型疟原虫C亚种和卵型疟原虫W亚种的特异片段，从而显示出特异信号。因此，用该质粒作为阳性参考不仅能够确定疟原虫属，还能区分不同的种。
表2 Real-time PCR法鉴定疟原虫种属的引物和探针
实施例3：模拟样本的制备与验证结果
将四种人体疟原虫18S rRNA基因全长质粒与健康小鼠抗凝全血混合，使质粒终浓度为50pmol，分别做成全血模拟样本和滤纸血模拟样本。使用Qiagen的DNeasy Blood & TissueKit提取DNA，具体步骤如下：
（1）加入20µl蛋白酶K，56℃水浴消化；
（2）加入200µl Buffer AL后56℃水浴15分钟；
（3）加入200µl无水乙醇；
（4）将上述溶液吸入带有2ml收集管的DNeasy Mini spin column中，以8000rpm离心1分钟后弃去收集管；
（5）将DNeasy Mini spin column中，加入500µl Buffer AW1，以8000rpm离心1分钟后弃去收集管；
（6）将DNeasy Mini spin column中，加入500µl Buffer AW2，以8000rpm离心3分钟后弃去收集管；
（7）将DNeasy Mini spin column放入新的离心管中；
（8）向DNeasy Mini spin column中心加入200µl Buffer AE洗脱DNA，室温放置1分钟后，以8000rpm离心1分钟。
然后使用实施例2中的Real-time PCR体系验证模拟样本，同样的，应用该方法可以分别扩增出疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵型疟原虫C亚种和卵型疟原虫W亚种的特异片段，从而显示出特异信号。因此，用该质粒制备全血模拟样本和滤纸血模拟样本，不仅能够确定疟原虫属，还能区分不同的种（见图3）。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）
<120>一种基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品及其制备方法和应用
<130> WH-NP-20-100597
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
gttaagggag tgaagacgat caga 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
aacccaaaga ctttgatttc tcataa 26
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
accgtcgtaa tcttaaccat aaactatgcc gactag 36
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
ccgactaggt gttggatgaa agtgttaa 28
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
agcaatctaa aagtcacctc gaaagatgac t 31
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
ccgactaggc tttggatgaa agatttta 28
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
agcaatctaa gaataaactc cgaagagaaa attct 35
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 8
ccgactaggt tttggatgaa agattttt 28
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 9
cgaaaggaat tttcttatt 19
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 10
ccgactaggt gttggatgat agagtaaa 28
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
ctatctaaaa gaaacactca t 21
Claims (8)
1.一种基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品的制备方法，包括以下步骤：
（1）基因序列信息的获取：从数据库中检索和比对人体疟原虫，获得人体疟原虫18srRNA基因全长序列信息；
（2）基因序列的获取及质粒构建：根据步骤（1）获得的序列信息，设计基因特异引物扩增出全长基因序列，或者应用全基因合成方法获取基因序列，将该序列与载体连接构建质粒，将该质粒导入感受态细胞中进行扩大培养以备后续大量质粒的提取；
（3）疟原虫感染模拟样本的制备：提取包含18s rRNA基因的质粒，将其与健康抗凝小鼠全血混合，做成模拟样本。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述人体疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述得到的质粒包含疟原虫18srRNA基因全长序列，能实现序列的大规模扩增。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，提取包含18s rRNA基因的质粒，将其与健康抗凝小鼠全血以不同比例混合，所述得到的模拟样本包括全血模拟样本和滤纸血模拟样品，涵盖了现场样本采集的方式。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，提取包含18s rRNA基因的质粒，将其与健康抗凝小鼠全血不同比例混合，使质粒终浓度为1pmol~1nmol，分别做成全血模拟样本和滤纸血模拟样本。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述得到的疟原虫18s rRNA基因全长序列，包含疟原虫18s rRNA基因全长序列的质粒以及包含疟原虫18s rRNA基因全长序列质粒的模拟样本均可用于基于目的基因的疟原虫核酸检测。
7. 采用如权利要求1-6任一项所述的方法制得的基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品。
8. 如权利要求7所述的基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品在制备疟原虫诊断产品中的应用。
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| US20100183679A1 (en) * | 2007-05-28 | 2010-07-22 | Takafumi Tsuboi | Primers for detecting plasmodium |
| CN109486962A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-03-19 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | 一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法 |
-
2020
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