CN114574607B

CN114574607B - 一种试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114574607B
Application number: CN202210478240.7A
Authority: CN
Inventors: 杨国威; 吴云
Original assignee: Beijing Friendship Hospital
Current assignee: Beijing Friendship Hospital
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114574607A

Abstract

本发明提供了一种试剂盒及其应用，具体提供了一种特异性引物和/或探针，以及包含引物和/或探针的试剂盒或芯片。通过将包含利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和/或荚膜组织胞浆菌的引物和/或探针组合在一起，能够在一个检测反应体系中同时检测三种病原体，缩短了单独检测三种病原体的时间，提高了检测效率。

Description

一种试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及病原体诊断技术领域，具体涉及利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌的检测。

背景技术

利什曼病、马尔尼菲青霉病和荚膜组织胞浆菌病常见于移植患者、肿瘤患者以及艾滋病患者等免疫功能低下的人群。这些病例临床表现均为不明原因的发热且持续时间、发热程度不一；肝脾肿大，淋巴结肿大；中至重度贫血，白细胞减少等，临床症状非常相似，骨髓涂片的镜下病原体形态、大小较接近，且都常位于吞噬细胞内，容易混淆，在临床上这三种病原体感染的诊断具有一定的迷惑性，容易误诊。

三种病原体的现有检测方法如下：对于利什曼原虫，马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌，临床使用镜检、培养以及免疫学方法进行诊断。镜检和培养方法具有敏感度低和检测周期长的缺点；免疫学方法容易发生交叉反应，特异性不高，容易误诊。

本发明应用利什曼原虫，马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌的保守基因的序列设计了引物探针组合构建了利什曼原虫，马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌同步检测的三重荧光定量PCR检测方法，该方法具有敏感度高，特异性好，无需开盖有效避免了产物气溶胶污染，检测结果更准确的优势。三种病原体同步检测与单独检测每一种病原体比较更高效，大大缩短了检测时间，同时三种病原体同步检测具有鉴别诊断的优势。

发明内容

基于临床鉴别诊断的需求，本申请应用内脏利什曼病感染原虫动基体DNA（mkDNA），马尔尼菲青霉菌的ITS（internal transcribed spacer，转录间隔区）片段和荚膜组织胞浆菌的（internal transcribed spacer，转录间隔区）ITS片段的保守区域设计了若干特异性引物、探针，并将其形成不同的组合，进行检测，特异性的筛选出9条短序列在同一体系中不出现交叉反应，也没有形成二级结构的引物探针组合，成功构建了三重荧光定量PCR的鉴别诊断检测体系。本申请使用的三种病原体的检测靶标具有拷贝数多，种内较保守，可有效提高检测敏感度和特异性。该方法的建立使得临床具有可应用的准确、便捷的利什曼原虫，马尔尼菲青霉菌以及荚膜组织胞浆菌感染的鉴别诊断方法。

第一方面，本发明提供了一种引物，所述的引物包含利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和/或荚膜组织胞浆菌的引物。

所述的利什曼原虫的引物扩增mkDNA。优选的，所述的利什曼原虫的上游引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：1经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：1具有相同或相似功能的核苷酸序列，下游引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：2经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：2具有相同或相似功能的核苷酸序列。进一步优选的，所述的利什曼原虫的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示。

所述的马尔尼菲青霉菌的引物扩增ITS（SEQ ID NO:12）片段。优选的，所述的马尔尼菲青霉菌的上游引物包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：4经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：4具有相同或相似功能的核苷酸序列，下游引物包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：5经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：5具有相同或相似功能的核苷酸序列。进一步优选的，所述的马尔尼菲青霉菌的上游引物如SEQ ID NO：4所示，下游引物如SEQ ID NO：5所示。

所述的荚膜组织胞浆菌的引物扩增ITS（SEQ ID NO:13）片段。优选的，所述的荚膜组织胞浆菌的上游引物包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：7经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：7具有相同或相似功能的核苷酸序列；下游引物包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：8经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：8具有相同或相似功能的核苷酸序列。进一步优选的，所述的荚膜组织胞浆菌的上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引物如SEQ ID NO：8所示。

第二方面，公开了一种探针，所述的探针包含利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和/或荚膜组织胞浆菌的探针。

所述的利什曼原虫的探针靶向mkDNA。优选的，所述的利什曼原虫的探针包含SEQID NO：3所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：3经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：3具有相同或相似功能的核苷酸序列。进一步优选的，所述的利什曼原虫的探针如SEQ ID NO：3所示。

所述的马尔尼菲青霉菌的探针靶向ITS（SEQ ID NO:12）片段。优选的，所述的马尔尼菲青霉菌的探针包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：6经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：6具有相同或相似功能的核苷酸序列。进一步优选的，所述的马尔尼菲青霉菌的探针如SEQ ID NO：6所示。

所述的荚膜组织胞浆菌的探针靶向ITS（SEQ ID NO:13）片段。优选的，荚膜组织胞浆菌的探针SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：9经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID NO：9具有相同或相似功能的核苷酸序列。进一步优选的，所述的荚膜组织胞浆菌的探针如SEQ ID NO：9所示。

优选的，所述的探针中SEQ ID NO：3、6或9的5’端包含荧光报告基团的修饰，3’端包含荧光淬灭基团的修饰。

所述的荧光报告基团可以为常规使用的荧光报告基团，优选包括但不限于VIC(绿色荧光蛋白)、FAM（carboxy-fluorescein，羧基荧光素）、Texas Red（德克萨斯红）、HEX（hexachlorofluorescein，六氯-6-甲基荧光素）、TAMRA（tetramethyl-6-carboxyrhodamine，6-羟基四甲基罗丹明）、TET（Tetrachlorofluorescein，四氯-6-羧基荧光素）、JOE（2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素）、Cy3（三氢-吲哚菁型染料）、Cy5（三氢-吲哚菁型染料）、ROX（6-羧基-X-罗丹明）、LC RED640（红色染料640）或LC RED705（红色染料705）中的任意一种。所述的荧光淬灭基团可以为常规使用的，优选包括但不限于TAMRA（tetramethyl-6-carboxyrhodamine，6-羟基四甲基罗丹明）、DABCYL（4-（4-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）、BHQ1（Black Hole Quencher 1）、BHQ2（Black Hole Quencher 2）或BHQ3（Black Hole Quencher 3）中的任意一种。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的，利什曼原虫的探针为FAM-SEQ ID NO：3-BHQ1，马尔尼菲青霉菌的探针为TAMRA-SEQ ID NO：6-BHQ2，荚膜组织胞浆菌的探针为Cy5-SEQ ID NO：9-BHQ2。

第三方面，提供了一种上述的引物、上述的探针在制备检测利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和/或荚膜组织胞浆菌的试剂盒或芯片中的应用。

第四方面，提供了一种检测利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和/或荚膜组织胞浆菌的试剂盒或芯片，所述的试剂盒或芯片中包含上述的引物和/或上述的探针。

优选的，所述试剂盒或芯片还包括PCR反应的试剂。进一步优选的，所述的PCR反应的试剂选自Taq DNA聚合酶、dNTPs、酶稳定剂、Taq DNA聚合酶反应缓冲液、溴酚蓝染料或水中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的试剂盒或芯片还包含DNA提取所需试剂。

优选的，所述的试剂盒或芯片检测的样本可以为受试者的外周血、骨髓、痰液或组织。

第五方面，提供了一种检测利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和/或荚膜组织胞浆菌的方法，使用上述的引物、上述的探针或上述的试剂盒或芯片进行检测。

在本发明的一个具体实施方式中，包括以下步骤：

提取利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和/或荚膜组织胞浆菌的DNA样品，进行PCR，其中，PCR的反应条件为：94~96℃ 2~3 min；94~96℃ 15~30 s，55-60℃（优选59℃）15~30s，35~40个循环。

优选的，检测的样本可以为受试者的外周血、骨髓、痰液或组织。

优选的，所述的方法不是疾病的诊断和治疗方法。

本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。

本发明所述的“受试者”可以为人或非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠（例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠）或猴等等。

本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1为实施例1中利什曼原虫样品的荧光定量PCR检测的扩增曲线；

图2为实施例1中马尔尼菲青霉菌样品的荧光定量PCR检测的扩增曲线；

图3为实施例1中荚膜组织胞浆菌样品的荧光定量PCR检测的扩增曲线；

图4为实施例1中混合样品（利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌及荚膜组织胞浆菌各1μL）的荧光定量PCR检测的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。如无特殊说明，均为常规方法。除非另行定义，文中所用的专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。

实施例1 利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌检测体系的建立

1、引物和探针的设计

为了满足在同一个体系中同时检测三种病原体，本实施例依据利什曼原虫动基体DNA（mkDNA）或ITS2、马尔尼菲青霉菌ITS和荚膜组织胞浆菌ITS，设计引物和探针，结果见表1。

表1. 设计的引物探针序列

2、构建标准质粒

2.1目的片段的制备及纯化：

（1）利什曼病原虫动基体DNA样品从实验室保存的利什曼病原虫感染的临床样本中提取，使用引物SEQ ID NO:10-11扩增，PCR扩增反应体系：2×GoTaq Green Master Mix10μL，上游引物200nM，下游引物200nM，DNA样品20ng，无菌双蒸水补充至20μL。

P-lei-F（SEQ ID NO:10）：AAACGACGGCCAGTGAATTCCCGGCCCTATTTTACACCAAC

P-lei-R（SEQ ID NO:11）：ACCATGATTACGCCAAGCTTCAAACTTTCTGGTCCTCCGGGTA

PCR扩增反应条件：95℃，5min；95℃ 15s，63℃ 15s，72℃ 30s，共35个循环；72℃5min，4℃ 保存。

扩增产物回收：采用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用天根生物的通用性DNA纯化回收试剂盒切胶回收目的片段。

（2）马尔尼菲青霉菌的ITS序列、荚膜组织胞浆菌的ITS序列均由上海生工生物有限公司合成并构建标准质粒，经测序确认合成基因正确。

马尔尼菲青霉菌的ITS片段序列：

CCGAGTGCGGGCCCTCGCGGCCCAACCTCCCACCCTTGTCTCTATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACCCGGTCGCCGGGGGACGTTTGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCCCTGTGAACCCTGATGAAGATGGACTGTCTGAGTACCATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCTCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCACCATATTTACCACGG（SEQ ID NO:12）

荚膜组织胞浆菌ITS片段序列：CACGCCGTGGGGGGCTGGGAGCCTCTGACCGGGACCCCCCCGCCCCCCTACCCGGCCACCCTTGTCTACCGGACCTGTTGCCTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGAGCTTCTCCTCCCCGGGCCCGTGTCCGCCGGGGACACCGCAAGAACCGTCGGTGAACGATTGGCGTCTGAGCATGAGAGCGATAATAATCCAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGACATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCAACCCTCAAGCGCGGCTTGTGTGTTGGGCCATCGTCCCCCCTCGACCGGCGGGACGTGCCCGAAATGCAGTGGCGGTGTCGAGTTCCGGTGCCCGAGCGTATGGGGCTTTGCCACCCGCTCTGGAGGCCCGGCCGGCTCCGGCCCACCATCTCAACCCCCCTCTCACACCAGG（SEQ ID NO:13）

2.2质粒载体的酶切及纯化：

（1）EcoRⅠ和HindⅢ酶切质粒载体pUC19线性化的酶切反应体系：HindⅢ 1μL，EcoRⅠ 1μL，10×M buffer 2μL，pUC19 1μg，dH₂O 14 uL。

（2）酶切的反应条件：37℃ 1 h。

（3）线性化pUC19质粒的回收：采用1%琼脂糖凝胶电泳检测步骤（2）酶切后的产物，使用天根生物的通用性DNA纯化回收试剂盒（货号：DP214-02）切胶回收线性化的pUC19质粒。

2.3目的片段与线性化质粒载体pUC19的重组及转化：

（1）重组反应体系：线性化载体pUC19 50 ng，目的片段8 ng，2×EasyGenoAssembly Mix 5μL，无菌双蒸水补充反应体系至10μL；

（2）反应条件：50℃水浴，15min；

（3）取100μL感受态细胞DH5α置于冰浴中解冻；

（4）在步骤（3）的感受态细胞DH5α悬液中加入步骤（2）的10μL重组产物，轻弹混匀，在冰浴中静置30min；

（5）将步骤（4）的样品置于42℃水浴中放置90s，然后快速转移到冰浴中，使细胞冷却3min，该过程不要摇动离心管；

（6）在步骤（5）的样品中加入350μL无菌的不含抗生素的37℃预热的SOC培养基，混匀后置于37℃摇床震荡培养45min；

（7）吸取步骤（6）的已转化的感受态细胞100μL，加到含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的平板涂布棒轻轻的将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16h。

2.4单克隆菌株的鉴定：

（1）随机挑取步骤2.3（7）中的单克隆菌株放入含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，并送测序；

（2）目的序列测序结果均含有插入的目的序列，质粒构建成功。

2.5质粒DNA的提取（快速质粒小提试剂盒，货号DP105-02）：

（1）将测序鉴定含有目的序列的菌株在含有氨苄青霉素的LB培养基中扩大培养；

（2）将步骤（1）的培养菌株12000rpm离心1min，收集菌体；

（3）在步骤（2）的样品中加入150μL溶液P1，涡旋振荡混匀；

（4）在步骤（3）的样品中加入150μL溶液P2，温和的上下翻转6-8次，使菌体充分裂解；

（5）在步骤（4）的样品中加入350μL溶液P5，立即快速上下颠倒数次，充分混匀；

（6）将步骤（5）的样品12000 rpm离心2min，将上清液转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心30s，倒掉废液；

（7）将步骤（6）的吸附柱CP3放入收集管中，并加入300μL漂洗液PWT，12000rpm离心30s，倒掉废液；

（8）将步骤（7）的吸附柱CP3放回收集管，12000rpm离心1min；

（9）将步骤（8）的吸附柱CP3置于一个新的离心管中，向膜的中间位置加50μL洗脱缓冲液TB，12000rpm离心30s，收集溶液，即为质粒DNA，并用NanoDrop定量。

3、使用构建的标准质粒测试利什曼原虫，马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌检测系统

（1）制备检测样品。将构建好的质粒DNA稀释为浓度为10⁵copies/μL。

（2）荧光定量PCR扩增的反应体系：

第一引物探针组合：HC-n-F 600nM、HC-n-R 600nM、探针HC-n-probe 250nm；PM-n-F 900nM、PM-n-R 900nM、探针PM-n-probe 250nm；PF3 300nM、PF4 300 nM、探针Probe2250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

第二引物探针组合：HC-n-F 600 nM、HC-n-R 600nM、探针HC-n-probe 250nm；PM-n-F 900nM、PM-n-R 900nM、探针PM-n-probe 250nm；Lei-n-F 300nM、Lei-n-R 300 nM、探针Lei-n-probe 250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

第三引物探针组合：HC-n-F 600 nM、HC-n-R 600nM、探针HC-n-probe 250nm；PM-n-F 900nM、PM-n-R 900nM、探针PM-n-probe 250nm；Lei-n-1-F 300nM、Lei-n-1-R 300 nM、探针Lei-n-probe 250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

第四引物探针组合：HC-n-F 600 nM、HC-n-R 600nM、探针HC-n-probe 250nm；PM-n-F 900nM、PM-n-R 900nM、探针PM-n-probe 250nm；Lei-n-1-F 300nM、Lei-n-2-R 300 nM、探针Lei-n-probe 250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

第五引物探针组合：hc-ITS2-F1 600 nM、hc-ITS2-R1 600nM、探针hc-ITS2-Probe1250nm；PM-n-F 900nM、PM-n-R 900nM、探针PM-n-probe 250nm；PF3 300nM、PF4 300nM、探针Probe2 250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

第六引物探针组合：Hc-n-1-F 600 nM、Hc-n-1-R 600nM、探针HC-n-probe 250nm；PM-n-F 900nM、PM-n-R 900nM、探针PM-n-probe 250nm；PF3 300nM、PF4 300 nM、探针Probe2 250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

第七引物探针组合：HC-n-F 600 nM、HC-n-R 600nM、探针HC-n-probe 250nm；pm-F1 900nM、pm-R1 900nM、探针pm-Probe1 250nm；PF3 300nM、PF4 300 nM、探针Probe2250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

第八引物探针组合：HC-n-F 600 nM、HC-n-R 600nM、探针HC-n-probe 250nm；pm-F2 900nM、pm-R2 900nM、探针pm-Probe2 250nm；PF3 300nM、PF4 300 nM、探针Probe2250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

第九引物探针组合：HC-n-F 600 nM、HC-n-R 600nM、探针HC-n-probe 250nm；pm-F3 900nM、pm-R3900nM、探针pm-Probe3 250nm；PF3 300nM、PF4 300 nM、探针Probe2250nm、三种质粒DNA各1μL、10μL的GoTaq® Probe qPCR Master Mix、无菌双蒸水补齐至20μL。各引物和探针浓度为反应体系中的终浓度。荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。

（3）结果：

将表1设计的引物探针进行组合得到的九组引物探针组合进行试验验证，在相同加入量及扩增条件时，结果显示只有优选出的引物探针组合（表2）在同一个检测体系中能同时检测三种病原体。

表2：扩增目标基因的引物序列

表2设计的引物探针组合结果见图1-4，图1~图4的荧光定量PCR检测结果表明，使用利什曼原虫，马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌三种病原体三重检测体系进行检测，在利什曼原虫标记的FAM荧光通道中，只看到利什曼原虫的一条扩增曲线，马尔尼菲青霉菌标记的TAMRA荧光通道中，只看到马尔尼菲青霉菌的一条扩增曲线，荚膜组织胞浆菌标记的Cy5荧光通道中，只看到荚膜组织胞浆菌的一条扩增曲线，表明三个病原体的引物探针之间未发生交叉反应，因此，本申请设计的引物及探针可以对利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌进行准确鉴定。

实施例2单独检测和混合检测比较

采用实施例1表2引物探针组合制备的检测体系对利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌分别进行单独检测和混合检测。

（1）三种病原体的质粒DNA稀释浓度为10⁵copies/μL。

（2）荧光定量PCR扩增的反应体系和条件见表3。

表3：反应体系和条件

（3）检测结果见表4。

表4：单独检测与混合检测结果对比

该实施例中，三种病原体混合检测和单独检测对比有如下优势：

（1）每种病原体检测用时2.5h，三种单独检测总计需要7.5h，使用本实施例发明的三种病原体混合检测，总计用时2.5h，有效的缩短了检测结果的报告时间。

（2）三种病原体单独检测，检验人员需要操作三次，上机三次，混合检测仅需一次便可完成，简化了操作流程，易于临床推广。

（3）三种病原体混合检测可对三种病原体进行鉴别诊断，可有效区分显微镜下形态相似的三种病原体，使得检测结果更准确，更好的指导后续的临床治疗。

实施例3：临床样本的检测

采用实施例1表2引物探针组合制备的检测体系对利什曼病、马尔尼菲青霉菌病和荚膜组织胞浆菌病的患者进行检测，具体过程如下：

1、选择临床样本：从确诊的患者中选取5例利什曼原虫感染的患者骨髓样本、1例马尔尼菲青霉菌感染的患者痰液样本和2例荚膜组织胞浆菌感染患者的痰液临床样本。利什曼原虫感染患者的病原学诊断依据为患者骨髓样本镜检看到利杜小体；马尔尼菲青霉菌的痰液样本中镜检找到菌丝或孢子；荚膜组织胞浆菌痰液样本镜下可见病原体。

2、按照试剂盒说明书提取患者临床样本总DNA：使用Qiagen Dneasy Blood&tissue kit（货号：69506）提取利什曼原虫感染的骨髓样本的总DNA；使用天根的植物基因组DNA提取试剂盒（货号DP305）提取马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌感染的痰液临床样本的总DNA。

3、临床样本总DNA的荧光定量PCR反应

（1）检测利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌的PCR反应体系(20μL)：

Master mix(Promega，A6001) 10 μL

HC-n-F(10μM) 1.2 μL

HC-n-R(10μM) 1.2 μl

HC-n-probe(10μM) 0.5 μL

PM-n-F(10μM) 1.8 μL

PM-n-R(10μM) 1.8 μl

PM-n-probe(10μM) 0.5 μL

PF3(10μM) 0.6 μL

PF4(10μM) 0.6 μl

Probe2(10μM) 0.5 μL

Template 1 μL

dH₂O 0.3 μL

（2）荧光定量PCR反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40cycles。

（3）荧光定量PCR的反应结果见表5。

表5：临床样本检测结果

表5结果表明，各个临床样本的检测符合率为100%，特异性好。说明本发明制备的检测体系能够同时准确鉴定三种病原体，对三种疾病进行准确诊断。

本发明所述的检测方法与现有临床使用的检测方法（镜检和培养）相比较具有如下优势：

（1）本发明（荧光定量PCR方法）的敏感度要优于镜检及培养方法，可提高检测敏感度，防治漏诊。

（2）本发明可以定量病原体，监测患者治疗过程中的病原体含量，进而判断药物的有效性及确定治疗终点，较传统的镜检及培养方法能更好的指导临床治疗。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京友谊医院

<120> 一种试剂盒及其应用

<130> P0102022030222Y

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggccctat tttacaccaa c 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaactttct ggtcctccgg gta 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtttcccg ccccggagcc gatt 24

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatggactgt ctgagtac 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctgcaattc acattactta tc 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcaacaatg gatctcttgg ttccg 25

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcgataata atccagtca 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgatgattca cggaattc 18

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcaacaacg gatctcttgg ttcc 24

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacgacggc cagtgaattc ccggccctat tttacaccaa c 41

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accatgatta cgccaagctt caaactttct ggtcctccgg gta 43

<210> 12

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgagtgcgg gccctcgcgg cccaacctcc cacccttgtc tctatacacc tgttgctttg 60

gcgggcccac cggggccacc cggtcgccgg gggacgtttg tccccgggcc cgcgcccgcc 120

gaagcgccct gtgaaccctg atgaagatgg actgtctgag taccatgaaa attgtcaaaa 180

ctttcaacaa tggatctctt ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag 240

taatgtgaat tgcagaattc cgtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccctg 300

gcattccggg gggcatgcct gtccgagcgt catttctgcc ctcaagcacg gcttgtgtgt 360

tgggtgtggt ccctccgggg acctgcccga aaggcagcgg cgacgtccgt ctggtcctcg 420

agcgtatggg gctctgtcac tcgctcggga aggacctgcg ggggttggtc accaccatat 480

ttaccacgg 489

<210> 13

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cacgccgtgg ggggctggga gcctctgacc gggacccccc cgccccccta cccggccacc 60

cttgtctacc ggacctgttg cctcggcggg cctgcagcga tgctgccggg ggagcttctc 120

ctccccgggc ccgtgtccgc cggggacacc gcaagaaccg tcggtgaacg attggcgtct 180

gagcatgaga gcgataataa tccagtcaaa actttcaaca acggatctct tggttccgac 240

atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt ccgtgaatca 300

tcgaatcttt gaacgcacat tgcgccccct ggtattccgg ggggcatgcc tgtccgagcg 360

tcattgcaac cctcaagcgc ggcttgtgtg ttgggccatc gtcccccctc gaccggcggg 420

acgtgcccga aatgcagtgg cggtgtcgag ttccggtgcc cgagcgtatg gggctttgcc 480

acccgctctg gaggcccggc cggctccggc ccaccatctc aacccccctc tcacaccagg 540

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tctccattct ctcctctc 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caacgcgaag ttgaattc 18

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttaataatcc tggtcacagc ctctc 25

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttttcatcaa aaagggggga 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aagttgaatt ctcgttttgg ttt 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aagcaaaaaa tggccaacg 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgtccgagcg tcattgca 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gacgatggcc caacacaca 19

<210> 22

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccctcaagcg cggc 14

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcatgagagc gataataatc 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctgcaattca cattacttat c 21

<210> 25

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcgcggccca acct 14

<210> 26

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cccgccaaag caacag 16

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccacccttgt ctctatac 18

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcaaaacttt caacaatgga tctc 24

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gcatttcgct gcgttcttc 19

<210> 30

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tggttccggc atcg 14

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gcgtcatttc tgccctcaag cac 23

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aggtccttcc cgagcgagt 19

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tccgtctggt cctcgagcgt at 22

Claims

1.一种检测利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌的试剂盒或芯片，其特征在于，所述的试剂盒或芯片中包含引物和探针，所述的引物为利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌的引物，所述的探针为利什曼原虫、马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌的探针，其中，

利什曼原虫的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示；

马尔尼菲青霉菌的上游引物如SEQ ID NO：4所示，下游引物如SEQ ID NO：5所示；

荚膜组织胞浆菌的上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引物如SEQ ID NO：8所示；

利什曼原虫的探针如SEQ ID NO：3所示，马尔尼菲青霉菌的探针如SEQ ID NO：6所示，荚膜组织胞浆菌的探针如SEQ ID NO：9所示；

所述的探针的5’端包含荧光报告基团的修饰，3’端包含荧光淬灭基团的修饰。

2.根据权利要求1所述的试剂盒或芯片，其特征在于，所述的荧光报告基团选自VIC、FAM、Texas Red、TAMRA、TET、JOE、HEX、ROX、LC RED640、LC RED705、CY3或CY5，所述的荧光淬灭基团选自TAMRA、DABCYL、BHQ1、BHQ2或BHQ3。

3.根据权利要求1所述的试剂盒或芯片，其特征在于，所述试剂盒或芯片还包括PCR反应的试剂，所述的PCR反应的试剂选自Taq DNA聚合酶、dNTPs、酶稳定剂、Taq DNA聚合酶反应缓冲液、溴酚蓝染料或水中的一种或两种以上的组合。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒或芯片，其特征在于，所述的试剂盒或芯片还包含DNA提取所需试剂。