CN108588247A - 一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108588247A
CN108588247A CN201810411005.1A CN201810411005A CN108588247A CN 108588247 A CN108588247 A CN 108588247A CN 201810411005 A CN201810411005 A CN 201810411005A CN 108588247 A CN108588247 A CN 108588247A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
nucleic acid
brucella
dna
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810411005.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李晓非
尤其敏
胡林
刘红伟
杜映荣
刘贵明
白劲松
普冬
余婷婷
黄山
吴磊
黄红丽
杨永锐
李国忠
李松鹏
张瑜书
梁桂亮
王霖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
YOUSIDA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd HANGZHOU
Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd
Original Assignee
YOUSIDA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd HANGZHOU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by YOUSIDA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd HANGZHOU filed Critical YOUSIDA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd HANGZHOU
Priority to CN201810411005.1A priority Critical patent/CN108588247A/zh
Publication of CN108588247A publication Critical patent/CN108588247A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，检测试剂包括：0.05μm‑0.7μm SEQ ID NO.1，0.15μm‑2.4μm SEQ ID NO.2，0.1μm‑1.5μm SEQ ID NO.3，0.15μm‑2.4μm SEQ ID NO.4，0.05μm‑0.7μm SEQ ID NO.5，2U‑8U Bst DNA聚合酶，10％10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1mM‑5mM MgSO4，0.2mM‑0.6mM dNTP混合物，0.5μL‑5μL DNA样品，补充水至总体积20μL‑40μL；本发明实现了布鲁氏菌感染的早期诊断，检测过程快速简便；检测试剂的检测下限在100copies/测试～1000copies/测试之间，灵敏度高；检测试剂与布鲁氏菌病误诊的常见病原体没有交叉反应，特异性好。

Description

一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，特别是一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法。
背景技术
布鲁氏菌是一种细胞内寄生的革兰氏阴性菌，可感染人、羊、猪、狗、骆驼等多种哺乳动物。目前已经发现的布鲁氏杆菌可分为6种，分别为：羊种布氏杆菌、牛种布氏杆菌、猪种布氏杆菌、犬种布氏杆菌、沙漠森林野鼠种布氏杆菌和绵羊附睾种布氏杆菌。其中的羊、牛、猪、犬四种布氏杆菌对人具有传染性。感染者一般因为接触过患病动物、使用过布鲁氏菌污染的动物制品、肉制品、奶制品等原因感染发病。布鲁氏菌的急性感染多表现为反复发热、多汗、四肢乏力、肝脾肿大等症状，这些症状容易被误诊为肺炎、风湿病、肝炎等其他疾病，从而延误患者的最佳治疗时机。布鲁氏菌的慢性感染则进一步引起关节炎症、严重时可导致人劳动力丧失。因此，准确的早期诊断和及时的药物治疗是控制布鲁氏菌病疫情的重要策略。
根据《布鲁氏菌诊断标准》(WS268-2007)的规定，布鲁氏菌病的诊断结果以血清学检查结果或病原学检查结果为标准。血清学检查方法包括试管凝集试验、补体结合试验、抗人免疫球蛋白试验三类。这三类方法的原理都是通过检测血清样本中的布鲁氏菌抗体来判断患者近期是否感染布鲁氏菌。血清学检查的优点在于设备要求低，操作简便，但人体从发生感染到抗体合成需要至少2周～4周的窗口期。在窗口期内的血清学检查易出现漏检的情况，难以在感染发生后的第一时间发现患者。细菌学检查方法的原理是从患者的血液、骨髓、关节液、脑脊液、淋巴组织、尿液等组织样本中，分离并培养出布鲁氏菌，进而诊断患者是否发生感染。与前者相比，细菌学检查虽然没有了窗口期的限制，但布氏杆菌的生长对营养要求较高，体外生长的速度缓慢，需要大约4周时间才能形成肉眼可见的菌落。因此，耗时太长的缺点也限制了细菌学检查在早期诊断领域的应用价值。
核酸检测技术的出现，实现了布鲁氏菌的早期诊断。核酸检测的原理是通过高效的核酸扩增技术，在短时间内使临床样本中微量的布鲁氏菌核酸达到能被仪器检测到的丰度。代表性的核酸检测技术如聚合酶链式反应(PCR)、荧光PCR技术、以及环介导等温扩增技术在2-3小时内就能得到准确的检测结果。然而，核酸检测技术大多需要昂贵的核酸扩增设备或核酸检测设备，并对实验室分区有严格的要求。昂贵的硬件设施和仪器投入成本，限制了布鲁氏菌核酸检测技术在基层医疗单位的普及；本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法，本发明实现了布鲁氏菌感染的早期诊断，检测过程快速简便，灵敏度高，特异性好，不依赖昂贵的仪器和硬件设施，具备向基层医疗单位推广的可行性和良好的临床应用前景。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，检测试剂包括：0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.1，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.2，0.1μm-1.5μm SEQ ID NO.3，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.4，0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.5，2U-8U Bst DNA聚合酶，10％10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1mM-5mMMgSO4，0.2mM-0.6mM dNTP混合物，0.5μL-5μL DNA样品，补充水至总体积20μL-40μL；
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG。
前述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，检测试剂包括：0.3μL浓度为20μmol/L的SEQID NO.1，1μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.2，0.7μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.3，1μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.4，0.3μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.5，1μL浓度为6U/μl的Bst DNA聚合酶，2μL 10×的BstDNA聚合酶缓冲液，0.6μL浓度为3mM的MgSO4溶液，0.8μL浓度为0.4mM的dNTP混合物，10.3μL水，2μL DNA样品；
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG。
前述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3是带有抗原标记的探针，抗原标记的种类包括：Biotin或6-FAM。
前述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的抗原标记在核酸序列的5’端或中间位置。
前述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，Bst DNA聚合酶缓冲液的组分包括：200mMTris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，100mM dNTP，质量百分比为1％的Triton X-100。
前述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，Bst DNA聚合酶缓冲液在25℃环境下的pH值为8.8。
一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤一，采集布鲁氏菌疑似感染者的全血样本；
步骤二，使用试剂盒纯化全血样本中的DNA核酸；
步骤三，设计如下5条引物和探针，并合成：
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG；
步骤四，配制布鲁氏菌核酸检测试剂；
检测试剂包括：0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.1，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.2，0.1μm-1.5μm SEQ ID NO.3，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.4，0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.5，2U-8U BstDNA聚合酶，10％10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1mM-5mM MgSO4，0.2mM-0.6mM dNTP混合物，0.5μL-5μL DNA样品，补充水至总体积20μL-40μL。
步骤五，取全血样本的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；
步骤六，恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果；
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线C位置和检测线T位置；
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线C位置；
无效结果：检测装置无指示线出现。
前述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，步骤二，使用试剂盒纯化全血样本中的DNA核酸；所述试剂盒使用QIAGEN公司QIAamp DNA blood mini kit试剂盒。
前述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，步骤三，设计如下5条引物和探针，并交由生工生物工程上海股份有限公司合成：
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG。
前述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，步骤五，取全血样本的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；
恒温扩增的具体过程为：
步骤a，向PCR反应管中加入布鲁氏菌核酸检测试剂，再向PCR反应管中滴加一滴石蜡油，将布鲁氏菌核酸检测试剂与空气隔离；
步骤b，用微量移液器吸取全血DNA样本，将微量移液器吸头的尖端深入到石蜡油层下方的布鲁氏菌核酸检测试剂，吹打混匀全血DNA样本；
步骤c，短暂离心PRC反应管，将管壁上的小液滴离心到管底；
步骤d，将PCR反应管放入恒温金属浴的加热孔中，设置恒温扩增程序为：63℃，60分钟，温度偏差应在±2℃以内。
本发明的有益之处在于：
本发明实现了布鲁氏菌感染的早期诊断，检测过程快速简便；
本发明不依赖昂贵的仪器和硬件设施，具备向基层医疗单位推广的可行性和良好的临床应用前景；
本发明的布鲁氏菌核酸检测试剂的检测下限在100copies/测试～1000copies/测试之间，灵敏度高；
本发明的布鲁氏菌核酸检测试剂，与布鲁氏菌病误诊的常见病原体没有交叉反应，特异性好。
附图说明
图1是本发明的5条引物探针扩增布鲁氏菌bp26基因片段的示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，检测试剂包括：0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.1，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.2，0.1μm-1.5μm SEQ ID NO.3，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.4，0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.5，2U-8U Bst DNA聚合酶，10％10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1mM-5mMMgSO4，0.2mM-0.6mM dNTP混合物，0.5μL-5μL DNA样品，补充水至总体积20μL-40μL；
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG。
需要说明的是：
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3是带有抗原标记的探针，作为一种实施例，抗原标记的种类包括但不限于Biotin或6-FAM。SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的抗原标记在核酸序列的5’端或中间位置。因为SEQ ID NO.4的5’端序列与SEQ ID NO.2相同，所以其延伸链的3’端可以与5’端形成发卡结构。SEQ ID NO.3可以与发卡结构的单链部分结合，启动新一轮的核酸扩增，从而实现在恒定温度下扩增目标核酸的过程。
作为一种实施例，Bst DNA聚合酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；BstDNA聚合酶缓冲液的组分包括：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，100mM dNTP，质量百分比为1％的Triton X-100。Bst DNA聚合酶缓冲液在25℃环境下的pH值为8.8。
一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤一，采集布鲁氏菌疑似感染者的全血样本；
步骤二，使用试剂盒纯化全血样本中的DNA核酸；试剂盒使用QIAGEN公司QIAampDNA blood mini kit试剂盒；
步骤三，设计如下5条引物和探针，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成：
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG。
步骤四，配制布鲁氏菌核酸检测试剂；
检测试剂包括：0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.1，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.2，0.1μm-1.5μm SEQ ID NO.3，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.4，0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.5，2U-8U BstDNA聚合酶，10％10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1mM-5mM MgSO4，0.2mM-0.6mM dNTP混合物，0.5μL-5μL DNA样品，补充水至总体积20μL-40μL。
步骤五，取全血样本的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；
恒温扩增的具体过程为：
步骤a，向PCR反应管中加入布鲁氏菌核酸检测试剂，再向PCR反应管中滴加一滴石蜡油，将布鲁氏菌核酸检测试剂与空气隔离；
步骤b，用微量移液器吸取全血DNA样本，将微量移液器吸头的尖端深入到石蜡油层下方的布鲁氏菌核酸检测试剂，吹打混匀全血DNA样本；
步骤c，短暂离心PRC反应管，将管壁上的小液滴离心到管底；
步骤d，将PCR反应管放入恒温金属浴的加热孔中，设置恒温扩增程序为：63℃，60分钟，温度偏差应在±2℃以内。
步骤六，恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果；
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线C位置和检测线T位置；
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线C位置；
无效结果：检测装置无指示线出现。
作为一种优选，检测试剂的成分包括：0.3μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.1，1μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.2，0.7μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.3，1μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.4，0.3μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.5，1μL浓度为6U/μl的Bst DNA聚合酶，2μL 10×的BstDNA聚合酶缓冲液，0.6μL浓度为3mM的MgSO4溶液，0.8μL浓度为0.4mM的dNTP混合物，10.3μL水，2μL DNA样品。
检测试剂各组分的优化流程如下：
1.SEQ ID NO.4的浓度优化
SEQ ID NO.4设置5组浓度梯度0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM，每组重复测试5次。其他组分浓度如下：0.1μM SEQ ID NO.1，0.8μM SEQ ID NO.2，0.5μM SEQ ID NO.3，0.1μM SEQ ID NO.5，3U/测试Bst DNA聚合酶，10％10×BstDNA聚合酶缓冲液，2mM MgSO4溶液，0.3mM dNTP混合物，2000copies/测试质粒DNA，补充水至总体积20μL。
恒温扩增后，经一次性核酸检测装置测试结果如下：SEQ ID NO.4 0.6μM组检出率为4/5，显色较弱；SEQ ID NO.4 0.8μM组检出率为3/5，显色正常；SEQ ID NO.4 1.0μM组检出率为5/5，显色较强；SEQ ID NO.4 1.2μM组检出率为5/5，显色正常；SEQ ID NO.4 1.4μM组检出率为4/5，显色正常。选择SEQ ID NO.4 1.0μM组作为浓度最优组。
2.SEQ ID NO.2的浓度优化
SEQ ID NO.2设置5组浓度梯度0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM，每组重复测试5次。其他组分浓度如下：0.1μM SEQ ID NO.1，0.5μM SEQ ID NO.3，1μM SEQ ID NO.4，0.1μMSEQ ID NO.5，3U/测试Bst DNA聚合酶，10％10×BstDNA聚合酶缓冲液，2mM MgSO4溶液，0.3mM dNTP混合物，2000copies/测试质粒DNA，补充水至总体积20μL。
恒温扩增后，经一次性核酸检测装置测试结果如下：SEQ ID NO.2 0.6μM组检出率为5/5，显色较弱；SEQ ID NO.2 0.8μM组检出率为5/5，显色正常；SEQ ID NO.2 1.0μM组检出率为5/5，显色较强；SEQ ID NO.2 1.2μM组检出率为5/5，显色正常；SEQ ID NO.2 1.4μM组检出率为5/5，显色正常。选择SEQ ID NO.2 1.0μM组作为浓度最优组。
3.SEQ ID NO.3的浓度优化
SEQ ID NO.3设置5组浓度梯度0.1μM、0.3μM、0.5μM、0.7μM、0.9μM，每组重复测试5次。其他组分浓度如下：0.1μM SEQ ID NO.1，1μM SEQ ID NO.2，1μM SEQ ID NO.4，0.1μMSEQ ID NO.5，3U/测试Bst DNA聚合酶，10％10×BstDNA聚合酶缓冲液，2mM MgSO4溶液，0.3mM dNTP混合物，2000copies/测试质粒DNA，补充水至总体积20μL。
恒温扩增后，经一次性核酸检测装置测试结果如下：SEQ ID NO.3 0.1μM组检出率为1/5，显色较弱；SEQ ID NO.3 0.3μM组检出率为4/5，显色正常；SEQ ID NO.3 0.5μM组检出率为5/5，显色正常；SEQ ID NO.3 0.7μM组检出率为5/5，显色较强；SEQ ID NO.3 0.9μM组检出率为5/5，显色正常。选择SEQ ID NO.3 0.7μM组作为浓度最优组。
4.SEQ ID NO.1的浓度优化
SEQ ID NO.1设置3组浓度梯度0.1μM、0.3μM、0.5μM，每组重复测试5次。其他组分浓度如下：1μM SEQ ID NO.2，0.7μM SEQ ID NO.3，1μM SEQ ID NO.4，0.1μM SEQ ID NO.5，3U/测试Bst DNA聚合酶，10％10×BstDNA聚合酶缓冲液，2mM MgSO4溶液，0.3mM dNTP混合物，2000copies/测试质粒DNA，补充水至总体积20μL。
恒温扩增后，经一次性核酸检测装置测试结果如下：SEQ ID NO.1 0.1μM组检出率为5/5，显色正常；SEQ ID NO.1 0.3μM组检出率为5/5，显色较强；SEQ ID NO.1 0.5μM组检出率为5/5，显色正常。选择SEQ ID NO.1 0.3μM组作为浓度最优组。
5.SEQ ID NO.5的浓度优化
SEQ ID NO.5设置3组浓度梯度0.1μM、0.3μM、0.5μM，每组重复测试5次。其他组分浓度如下：0.3μM SEQ ID NO.1，1μM SEQ ID NO.2，0.7μM SEQ ID NO.3，1μM SEQ ID NO.4，3U/测试Bst DNA聚合酶，10％10×BstDNA聚合酶缓冲液，2mM MgSO4溶液，0.3mM dNTP混合物，2000copies/测试质粒DNA，补充水至总体积20μL。
恒温扩增后，经一次性核酸检测装置测试结果如下：SEQ ID NO.5 0.1μM组检出率为5/5，显色正常；SEQ ID NO.5 0.3μM组检出率为5/5，显色较强；SEQ ID NO.5 0.5μM组检出率为5/5，显色正常。选择SEQ ID NO.5 0.3μM组作为浓度最优组。
6.Bst DNA聚合酶用量优化
Bst DNA聚合酶用量设置4组浓度梯度：1U/测试，3U/测试，6U/测试，9U/测试，每组重复测试5次。其他组分浓度如下：0.3μM SEQ ID NO.1，1μM SEQ ID NO.2，0.7μM SEQ IDNO.3，1μM SEQ ID NO.4，0.3μM SEQ ID NO.5，10％10×BstDNA聚合酶缓冲液，2mM MgSO4溶液，0.3mM dNTP混合物，2000copies/测试质粒DNA，补充水至总体积20μL。
恒温扩增后，经一次性核酸检测装置测试结果如下：Bst DNA聚合酶1U/测试组检出率为2/5，显色较弱；Bst DNA聚合酶3U/测试组检出率为5/5，显色正常；Bst DNA聚合酶6U/测试组检出率为5/5，显色较强，Bst DNA聚合酶9U/测试组检出率为5/5，显色较强。结果提示，Bst DNA聚合酶在6U/测试以上浓度已经趋于饱和，因此选择Bst DNA聚合酶6U/测试组作为浓度最优组。
7.MgSO4和dNTP混合物的用量优化
Mg2+与dNTP可发生螯合反应，降低甚至抑制反应效率，因此该两种组分需联合优化浓度。MgSO4设置浓度梯度为1mM，2mM，3mM，4mM；dNTP混合物设置浓度梯度为0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，两两正交形成16个实验组，每组重复5次测试。其他组分浓度如下：0.3μM SEQID NO.1，1μM SEQ ID NO.2，0.7μM SEQ ID NO.3，1μM SEQ ID NO.4，0.3μM SEQ ID NO.5，6U/测试Bst DNA聚合酶，10％10×BstDNA聚合酶缓冲液，2000copies/测试质粒DNA，补充水至总体积20μL。
恒温扩增后，经一次性核酸检测装置测试结果如下表：
选择3mM MgSO4和0.4mM dNTP混合物组作为浓度最优组。
为了证明本发明具有高灵敏度，做实验一，验证本发明的布鲁氏菌核酸检测试剂的检测下限；
实验一，最低检测限测试
本发明采用的试剂和仪器如下所示：
质粒DNA用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒(DP103)提取；
质粒浓度用NanoDrop 2000微量分光光度计测定；
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst DNA聚合酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
最低检测限测试的过程如下所示：
步骤一，布鲁氏菌质粒的制备
从头合成布鲁氏菌bp26基因片段，并连接进pUC57载体，转化感受态大肠杆菌。大肠杆菌培养至对数生长期(OD600 0.8～1.0)后，抽提质粒并测定浓度。
将布鲁氏菌质粒溶液10倍梯度稀释至5000copies/μL，500copies/μL，50copies/μL，5copies/μL的质粒稀释液。
步骤二，引物设计与合成
根据单交叉引物恒温扩增原理设计以下5条引物和探针，扩增布鲁氏菌bp26基因片段(图1)。
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG；
步骤三，试剂配制
根据如下表格，配制布鲁氏菌核酸检测试剂；
其中，Bst DNA聚合酶缓冲液的成分为200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mMKCl、20mM MgSO4、100mM dNTP、质量百分比1％Triton X-100。25℃环境下，Bst DNA聚合酶缓冲液pH值为8.8。
步骤四，核酸扩增
选择5000copies/μL，500copies/μL，50copies/μL，5copies/μL四种不同浓度的质粒稀释液作扩增模板，每种浓度梯度的质粒稀释液重复进行3次测试。
恒温扩增程序为：63℃ 60分钟，温度偏差应在±2℃以内。
步骤五，结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置；
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置；
无效结果：检测装置无指示线出现。
实验结果如下所示：
5000copies/μL和500copies/μL质粒稀释液的检出率均为3/3；50copies/μL质粒稀释液的检出率为2/3；5copies/μL质粒稀释液未检出阳性信号。
由实验结果得出如下实验结论：
本专利中公开的布鲁氏菌核酸检测试剂，其检测下限在100copies/测试～1000copies/测试之间，具有高灵敏度。
为了证明本发明具有优秀的特异性，做实验二，验证本发明的布鲁氏菌核酸检测试剂，与布鲁氏菌病误诊的常见病原体没有交叉反应，做特异性测试；
实验二，特异性测试
布鲁氏菌病易误诊为溶血性链球菌、伤寒沙门菌、结核分枝杆菌等病原体感染。用高温灭活的溶血性链球菌菌落、伤寒沙门菌菌落、结核分枝杆菌菌落、布鲁氏菌菌落作扩增模板，经恒温扩增后，测试试剂对其他病原体的交叉反应。
测试采用的试剂和仪器如下所示：
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst DNA聚合酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
特异性测试的具体过程如下所示：
步骤一，菌落DNA的制备；
菌落样本由昆明市第三人民医院检验科从日常工作中收集。
向1.5ml离心管中加入30μl生理盐水，挑取单菌落样本，加入到生理盐水中。将离心管95℃加热10分钟裂解，再插入冰水混合物3分钟。将离心管10,000rpm离心2分钟，上清液即为菌落DNA溶液，可作为核酸扩增的模板。
步骤二，引物设计与合成
根据单交叉引物恒温扩增原理设计以下5条引物和探针，扩增布鲁氏菌bp26基因片段(图1)。
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG；
步骤三，试剂配制
根据如下表格，配制布鲁氏菌核酸检测试剂；
其中，Bst DNA聚合酶缓冲液的成分为200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mMKCl、20mM MgSO4、100mM dNTP、质量百分比1％Triton X-100。25℃环境下，Bst DNA聚合酶缓冲液pH值为8.8。
步骤四，核酸扩增
将四种菌落DNA溶液作扩增模板，每种菌落DNA重复进行2次测试。
恒温扩增程序为：63℃60分钟，温度偏差应在±2℃以内。
步骤五，结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置；
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置；
无效结果：检测装置无指示线出现。
实验结果如下所示：
布鲁氏菌菌落样本检测结果为阳性，而溶血性链球菌菌落样本、伤寒沙门菌菌落样本、结核分枝杆菌菌落样本检测结果均为阴性。
实验结果得出实验结论：
本专利中公开的布鲁氏菌核酸检测试剂，与布鲁氏菌病误诊的常见病原体没有交叉反应。
为了进一步验证本发明的布鲁氏菌核酸检测试剂，具备临床应用的可行性，做临床样本测试；
实验三，临床样本测试；
测试采用的试剂和仪器如下所示：
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst DNA聚合酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
QIAamp DNA blood mini kit试剂盒购自QIAGEN公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
临床样本测试具体包括如下步骤：
步骤一，临床样本DNA的制备
5例确认感染布氏杆菌的全血样本由昆明市第三人民医院检验科从日常工作中收集，临床样本DNA用QIAGEN公司QIAamp DNA blood mini kit试剂盒提取。
布鲁氏菌菌落由布鲁氏菌阳性的临床样本经固体培养得到；
布鲁氏菌菌落DNA用煮沸法制备，操作流程为：向1.5ml离心管中加入30μl生理盐水，挑取临床样本DNA，加入到生理盐水中，将离心管95℃加热10分钟裂解，再插入冰水混合物3分钟，将离心管10,000rpm离心2分钟，上清液即为菌落DNA溶液，可作为核酸扩增的模板。
步骤二，引物设计与合成
根据单交叉引物恒温扩增原理设计以下5条引物和探针，扩增布鲁氏菌bp26基因片段(图1)。
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCTTTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG；
步骤三，试剂配制
根据如下表格，配制布鲁氏菌核酸检测试剂；
其中，Bst DNA聚合酶缓冲液的成分为200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mMKCl、20mM MgSO4、100mM dNTP、质量百分比1％Triton X-100。25℃环境下，Bst DNA聚合酶缓冲液pH值为8.8。
步骤四，核酸扩增
将临床样本DNA作扩增模板，每例样本DNA测试1次，将布鲁氏菌菌落DNA作为阳性对照的扩增模板，将去离子水作为阴性对照的扩增模板。
恒温扩增程序为：63℃60分钟，温度偏差应在±2℃以内。
步骤五，结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置；
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置；
无效结果：检测装置无指示线出现。
实验结果如下所示：
5例感染布鲁氏菌的临床样本均检测出阳性结果；阴性对照与阳性对照检测结果均正确。
实验结果得出如下实验结论：
本专利中公开的布鲁氏菌核酸检测试剂，具备临床应用的可行性。
本发明提供一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法，本发明实现了布鲁氏菌感染的早期诊断，检测过程快速简便，灵敏度高，特异性好，不依赖昂贵的仪器和硬件设施，具备向基层医疗单位推广的可行性和良好的临床应用前景。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，其特征在于，检测试剂包括：0.05μm-0.7μm SEQ IDNO.1，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.2，0.1μm-1.5μm SEQ ID NO.3，0.15μm-2.4μm SEQ IDNO.4，0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.5，2U-8U Bst DNA聚合酶，10％10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1mM-5mM MgSO4，0.2mM-0.6mM dNTP混合物，0.5μL-5μL DNA样品，补充水至总体积20μL-40μL；
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCT TTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG。
2.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，其特征在于，检测试剂包括：0.3μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.1，1μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.2，0.7μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.3，1μL浓度为20μmol/L的SEQ ID NO.4，0.3μL浓度为20μmol/L的SEQ IDNO.5，1μL浓度为6U/μl的Bst DNA聚合酶，2μL 10×的BstDNA聚合酶缓冲液，0.6μL浓度为3mM的MgSO4溶液，0.8μL浓度为0.4mM的dNTP混合物，10.3μL水，2μL DNA样品；
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCT TTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG。
3.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3是带有抗原标记的探针，所述抗原标记的种类包括：Biotin或6-FAM。
4.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的抗原标记在核酸序列的5’端或中间位置。
5.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶缓冲液的组分包括：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，100mMdNTP，质量百分比为1％的Triton X-100。
6.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶缓冲液在25℃环境下的pH值为8.8。
7.一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，采集布鲁氏菌疑似感染者的全血样本；
步骤二，使用试剂盒纯化全血样本中的DNA核酸；
步骤三，设计如下5条引物和探针，并合成：
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCT TTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG；
步骤四，配制布鲁氏菌核酸检测试剂；
检测试剂包括：0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.1，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.2，0.1μm-1.5μm SEQ ID NO.3，0.15μm-2.4μm SEQ ID NO.4，0.05μm-0.7μm SEQ ID NO.5，2U-8U Bst DNA聚合酶，10％10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1mM-5mM MgSO4，0.2mM-0.6mM dNTP混合物，0.5μL-5μL DNA样品，补充水至总体积20μL-40μL；
步骤五，取全血样本的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；
步骤六，恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果；
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线C位置和检测线T位置；
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线C位置；
无效结果：检测装置无指示线出现。
8.根据权利要求7所述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤一，使用试剂盒纯化全血样本中的DNA核酸；所述试剂盒使用QIAGEN公司QIAamp DNA bloodmini kit试剂盒。
9.根据权利要求7所述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤三，设计如下5条引物和探针，并交由生工生物工程上海股份有限公司合成：
SEQ ID NO.1：5’-AAA GTG CTC GAT GCC ATG AAG；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-TAT CCT GAC GAC AAG AAC AAC；
SEQ ID NO.4：5’-CAA TAT CCA GCC GAT TTA TGT CCG GTG ATG GTA GGC TCT TTC；
SEQ ID NO.5：5’-ACG CGA ACC GTG AGA CTG GTG。
10.根据权利要求7所述的一种布鲁氏菌核酸的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤五，取全血样本的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；
恒温扩增的具体过程为：
步骤a，向PCR反应管中加入布鲁氏菌核酸检测试剂，再向PCR反应管中滴加一滴石蜡油，将布鲁氏菌核酸检测试剂与空气隔离；
步骤b，用微量移液器吸取全血DNA样本，将微量移液器吸头的尖端深入到石蜡油层下方的布鲁氏菌核酸检测试剂，吹打混匀全血DNA样本；
步骤c，短暂离心PRC反应管，将管壁上的小液滴离心到管底；
步骤d，将PCR反应管放入恒温金属浴的加热孔中，设置恒温扩增程序为：63℃，60分钟，温度偏差应在±2℃以内。
CN201810411005.1A 2018-05-02 2018-05-02 一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法 Pending CN108588247A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810411005.1A CN108588247A (zh) 2018-05-02 2018-05-02 一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810411005.1A CN108588247A (zh) 2018-05-02 2018-05-02 一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108588247A true CN108588247A (zh) 2018-09-28

Family

ID=63620505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810411005.1A Pending CN108588247A (zh) 2018-05-02 2018-05-02 一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108588247A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628924A (zh) * 2019-10-10 2019-12-31 中国检验检疫科学研究院 一种用于检测布鲁氏菌的引物组合、试剂盒和psr方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006097347A2 (en) * 2005-03-17 2006-09-21 Instituto Científico Y Tecnológico De Navarra, S.A. Methods for detecting, identifying and differentiating species and vaccine strains of the brucella genus
CN103276061A (zh) * 2013-04-28 2013-09-04 华南农业大学 一种检测布鲁菌的lamp核酸试纸条试剂盒及其应用
CN104263839A (zh) * 2014-10-13 2015-01-07 天津市动物疫病预防控制中心 布鲁氏杆菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
CN106771208A (zh) * 2016-11-10 2017-05-31 中国兽医药品监察所 布鲁氏菌抗体检测试纸条

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006097347A2 (en) * 2005-03-17 2006-09-21 Instituto Científico Y Tecnológico De Navarra, S.A. Methods for detecting, identifying and differentiating species and vaccine strains of the brucella genus
CN103276061A (zh) * 2013-04-28 2013-09-04 华南农业大学 一种检测布鲁菌的lamp核酸试纸条试剂盒及其应用
CN104263839A (zh) * 2014-10-13 2015-01-07 天津市动物疫病预防控制中心 布鲁氏杆菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
CN106771208A (zh) * 2016-11-10 2017-05-31 中国兽医药品监察所 布鲁氏菌抗体检测试纸条

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VIVEK KUMAR GUPTA等: "markers for the molecular diagnosis of brucellosis in animals", 《ADVANCES IN ANIMAL AND VETERINARY SCIENCE》 *
吴彤等: "动物布鲁氏菌病快速诊断方法研究进展", 《中国人兽共患病学报》 *
夏邦顺等: "《临床分子诊断学》", 31 July 2012, 中山大学出版社 *
张明露等: "《饮用水微生物检验技术》", 31 August 2015, 中国环境出版社 *
李秀梅等: "环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测布鲁氏杆菌", 《食品与生物技术学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628924A (zh) * 2019-10-10 2019-12-31 中国检验检疫科学研究院 一种用于检测布鲁氏菌的引物组合、试剂盒和psr方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103074450B (zh) 一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法
JP2798499B2 (ja) 感染症診断用プローブ
CN102747165B (zh) 一种应用环介导等温扩增技术快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒
CN109913564B (zh) 一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN110964857A (zh) 排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用
CN103074449A (zh) 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法
CN103911365A (zh) 提取结核杆菌dna的方法及检测其多重耐药性的试剂盒
CN111518877B (zh) 用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量pcr检测试剂盒
CN107365869B (zh) 利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物
CN106282375A (zh) 一种鼠伤寒沙门氏菌的lamp引物组及试剂盒与使用方法
Gou et al. The colorimetric isothermal multiple-self-matching-initiated amplification using cresol red for rapid and sensitive detection of porcine circovirus 3
CN105779644B (zh) 人巨细胞病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN108588247A (zh) 一种布鲁氏菌核酸的试剂盒及其检测方法
CN115820818B (zh) 一种一步法核酸检测方法及其应用
CN113755618A (zh) 一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法
CN115992273A (zh) 用于检测肺炎链球菌的核酸分子、试剂盒及检测方法
CN104313185A (zh) 检测牛白血病的荧光定量pcr的试剂盒及其检测方法
CN100582240C (zh) 实时荧光定量检测肺炎衣原体的方法及试剂盒
CN111172306A (zh) 一种用于检测结核分枝杆菌和/或布鲁氏菌的组合物、试剂盒及其应用
CN115948588B (zh) 布鲁氏菌属四个种的多重荧光定量pcr分种检测试剂
RU2744665C1 (ru) Способ выявления рнк вируса луйо методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени
RU2814556C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2785381C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
CN112501329B (zh) 用于滑液支原体鉴定的特有功能基因、核酸染料qPCR引物、试剂盒及其应用
CN108753999B (zh) 用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸、试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Li Xiaofei

Inventor after: You Qimin

Inventor after: Hu Lin

Inventor after: Liu Hongwei

Inventor after: Yang Yongrui

Inventor after: Huang Shan

Inventor after: Liang Guiliang

Inventor before: Li Xiaofei

Inventor before: Huang Shan

Inventor before: Wu Lei

Inventor before: Huang Hongli

Inventor before: Yang Yongrui

Inventor before: Li Guozhong

Inventor before: Li Songpeng

Inventor before: Zhang Yushu

Inventor before: Liang Guiliang

Inventor before: Wang Lin

Inventor before: You Qimin

Inventor before: Hu Lin

Inventor before: Liu Hongwei

Inventor before: Du Yingrong

Inventor before: Liu Guiming

Inventor before: Bai Jinsong

Inventor before: Pudong

Inventor before: Yu Tingting

CB03 Change of inventor or designer information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180928

RJ01 Rejection of invention patent application after publication