CN101688242A

CN101688242A - 用于检测疟原虫的引物

Info

Publication number: CN101688242A
Application number: CN200880018077A
Authority: CN
Inventors: 坪井敬文; 韩银泽
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; Ehime University NUC
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; Ehime University NUC
Priority date: 2007-05-28
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2028-05-27
Also published as: HK1139186A1; TW200907069A; CN101688242B; US20150176083A1; JP5631006B2; TW201319259A; US8309702B2; WO2008146938A1; US9222140B2; US8936920B2; EP2152899B1; US20130017221A1; US20100183679A1; US20150322534A1; JP2010527583A; EP2152899A1; TWI521064B; HK1139185A1; EP2527475A1; US9200332B1

Abstract

本发明提供用于检测/鉴定人样品中是否存在特定疟原虫属寄生虫和疟疾寄生虫的四个种的容易且快速的方法、抗疟疾措施支持系统和疟疾感染－预防/治疗系统，它们可有助于疟疾流行区的实际诊断。根据本发明，使用能够同时检测四种感染人体的疟原虫属寄生虫的属特异性引物组，和分别对疟原虫属寄生虫的四个种(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫)特异性的引物组，可以容易且快速地检测/鉴定是否存在这些寄生虫的感染。

Description

用于检测疟原虫的引物

技术领域

本发明涉及能够快速和准确地检测/鉴定疟疾流行区的疟原虫属疟疾寄生虫的引物组、其检测和鉴定方法、其检测试剂盒、抗疟疾措施支持系统，和疟疾感染-预防/治疗措施系统。

背景技术

在许多疟疾寄生虫流行的国家，快速和准确地诊断疟疾寄生虫是一项挑战。在疟原虫属的四个种中，恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)可能是致命的，必须迅速鉴定且从其他对人类致病的疟原虫种中区分出来(Moody，A.，Clin.Microbiol.Rev.15(2002)：66-78)。

另外，大多数疟疾流行区典型的感染涉及两种或多种上述的种；这些混合感染经常认识不到或被低估(Zimmerman，P.A.等人，TrendsParasitol.20(2004)：440-447)。混合感染检测的失败会导致治疗不充分，以及可能会导致严重的疾病(Mayxay，M.等人，Trends Parasitol.20(2004)：233-240)。因此，亟需发展一种在疟疾流行区可行的、简便、快速、高灵敏度和种特异性的疟疾诊断方法。

目前疟疾的简便诊断方法是血涂片的显微镜检。如果寄生虫密度很高，这种显微镜检具有相对较高的灵敏度和特异性并且能够确定发展阶段和种。然而，在寄生虫密度通常较低的流行区，该方法比较繁琐，需要训练良好的专家，并且可能导致治疗上的延误。

在一些标准实验室诊断无法开展的地区，为提高疟疾诊断的速度和精确性，研究者们开发了基于免疫反应的疟疾快速诊断试验(RDT)(Moody，A.Clin.Microbiol.Rev.15(2002)：66-78；Ndao，M.等人，J.Clin.Microbiol.42(2004)：2694-2700)。然而，产品间的灵敏度有波动(Murray，C.K.等人，Trop.Med.Int.Health.8(2003)：876-883)，并且只有对恶性疟原虫的种特异性的产品。在以下几种情形下需要极长的观察时间和较多的技巧来通过显微镜检校正诊断：当寄生虫血症呈低度时、在混合感染期间、在药物治疗之后、和在感染慢性期过程中。因此，这种状况可导致假阴性结果或不可靠的种诊断(Coleman，R.等人，Thailand.Malar.J.14(2006)：121)。

后来，开发出了用于疟疾诊断的基于DNA扩增的分子生物学方法，如套式PCR和实时定量PCR。与显微镜检相比，这些方法被证明对于混合感染具有较高的灵敏度和较好的特异性(Kimura，K.等人，Parasitol.Int.46(1997)：91-95；Perandin，F.等人，J.Clin.Microbiol.42(2004)：1214-1219；Rougemont，M.等人，J.Clin.Microbiol.42(2004)：5636-5643；Singh，B.等人，Am.J.Trop.Med.Hyg.60(1999)：687-692；Singh，B.等人，Lancet.363(2004)：1017-1024；Snounou，G.等人，Mol.Biochem.Parasitol.58(1993)：283-292；Snounou，G.等人，Mol.Biochem.Parasitol.61(1993)：315-320)。然而，较长的运转时间、高成本、和仅能在装备良好的实验室进行使得该PCR技术无法胜任医院实验室和流行区的现场诊所的常规诊断(Hanscheid，T.和Grobusch，M.P.，Trends Parasitol.18(2002)：395-398)。

关于疟疾检测，专利文件1的实施例8和10公开了一种从血液样品中提取核酸和进行套式PCR来检测疟原虫属的四个种的方法。实施例8公开了每个正向引物和反向引物序列，它们与本发明的引物序列不同(专利文件1)。

专利文件2和4的专利公开文本公开了基于固相方法或套式PCR检测一种或多种疟疾感染的方法，其中使用多种类型引物中的一个或多个进行恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的临床检测。然而，这些引物与本发明的引物具有不同的引物序列。

专利文件3的专利公开文本公开了一种检测恶性疟原虫和/或间日疟原虫的方法，其中恶性疟原虫和/或间日疟原虫特异性引物结合于标记物或固相支持物上。然而，这些特异性引物序列不同于本发明引物组的寡核苷酸序列。

最近，开发出了一种新型、简便和高灵敏度的技术，称为环介导的等温扩增(LAMP)(Notomi，T.等人，Nucleic Acids Res.28(2000)：e63；WO 2000/28082)。

LAMP是一种核酸扩增方法，它依赖于由Bst DNA聚合酶运行的自动循环链置换DNA合成。扩增产物为具有靶标的几个重复序列的茎环结构，并且具有多个环。

该法的主要优点是不需要DNA模板的变性(Nagamine，K.等人，Clin.Chem.47(2001)：1742-1743)，并且因此LAMP反应可以在等温条件下运行(范围从60℃至65℃)。LAMP仅需一种酶和四种类型的能够识别六个不同靶区域的引物。该方法产生大量的扩增产物，使得检测十分容易，如通过目视判断反应混合物的浊度或荧光进行检测(Mori，Y.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.289(2001)：150-154)。使用荧光物质如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、X-罗丹明(ROX)或类似物来测量反应混合物的荧光极性值的LAMP，以及使用SYBR Green 2(一种绿色染料)作为嵌入剂的LAMP是已知的(日本未审查的专利公开No.2002-272475，和WO2002/103053)。

几名研究人员已经报道了LAMP方法在快速鉴定疟原虫、锥虫(Trypanosoma)、巴贝虫(Babesia)、镰孢霉(Fusarium)、李斯特氏菌(Listeria)和军团菌(Legionella)中的应用，并且推荐了LAMP试验的有效性(Ikadai，H.等人，J.Clin.Microbiol.42(2004)：2465-2469；Kuboki，N.等人，J.Clin.Microbiol.41(2003)：5517-5524；Thekisoe，O.等人，Mol.Biochem.Parasitol.122(2002)：223-236；日本未审查的专利公开No.2005-245257，日本未审查的专利公开No.2007-61061，日本未审查的专利公开No.2003-219878和Poon，L.等人，Clin.Chem.52(2006)：303-306)。

对于恶性疟原虫检测，Poon等人估计运行LAMP试验的成本大约是标准PCR的十分之一(Poon，L.等人，Clin.Chem.52(2006)：303-306)。成本和时间的大幅缩减是由于无需前期DNA提取的简单样品制备(Iwasaki，M.等人，Genome Lett.2(2003)：119-126)。

对于样品制备，在99℃下简单加热感染的血液10分钟就能够制备可用于LAMP的DNA模板(Poon，L.等人，Clin.Chem.52(2006)：303-306)。但是，至今为止，临床诊断中用于疟疾寄生虫检测的LAMP仅在急性恶性疟原虫患者中得到确证(Poon，L.等人，Clin.Chem.52(2006)：303-306)。尽管恶性疟原虫是重症疾病的最重要的病因，但是它的地理分布与间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫感染的地理分布有重叠，因此希望有一种能够快速检测和鉴定感染人类的所有四个种的方法。

近些年来，在疟疾流行区，抗药株的发展已成为适当的疟疾治疗的主要问题。医务工作者或医院医生亟需快速和高灵敏度的区分方法，以获得关于发热患者是感染了一种特定疟疾寄生虫还是多种疟疾寄生虫的信息，从而适当地治疗该发热疟疾患者。

[专利文件1]WO2006/88895

[专利文件2]日本未审查的专利公开No.1994-261758

[专利文件3]日本未审查的专利公开No.1993-227998

[专利文件4]日本未审查的专利公开No.2003-250564

[非专利文件1]Poon，L.等人，Clin.Chem.52(2006)：303-306

发明内容

本发明将要解决的问题

为解决上述问题，亟需开发简便和快速的方法用于检测和鉴定疟原虫属的四种疟疾寄生虫(特别是，混合感染的存在)，这些方法应当不同于已知的方法如显微镜检或PCR反应介导的方法。

本发明的目的是提供快速和高灵敏度的检测和鉴定方法，用于使用LAMP临床检测和确定恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫。而且，根据本发明的疟疾寄生虫检测和鉴定方法，使用疟疾流行区诊所获得的血样，提供用于检测疟原虫属和四种疟疾寄生虫的引物组，其中该引物组已经通过显微镜检和LAMP的比较得到了评估；提供应用该引物组检测疟原虫属的四种疟疾寄生虫的检测方法；提供鉴定方法；以及提供检测试剂盒。

因此，本发明的目的是解决上述问题，以及提供简便和快速的检测/鉴定方法，用来确定人标本中疟原虫属寄生虫或疟疾寄生虫的四个具体种中任一种的存在与否，其能够对疟疾流行区的医疗处理有帮助，并且进一步提供抗疟疾措施支持系统和疟疾感染-预防/治疗措施系统。

解决问题的方法

为解决这些问题，本发明的发明人想到使用环介导的等温扩增(LAMP)方法，其为一种等温基因扩增反应(WO 00/28082)。但是，一般来讲，疟疾寄生虫基因的核酸序列与其他生物体大大不同，富含AT成分。因此，现有的引物设计软件无法获得最优的引物组，在设计每种类型的引物时就需要困难的反复的试错过程。最终，在合成引物组的许多组合中，发现同时具有高灵敏度和高特异性的特别有用的引物组。因此，人们发现使用能够同时检测疟原虫属寄生虫的四个感染人类的种的属特异性引物组，以及各自特异性针对四种寄生虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫)的引物组，允许容易且快速地检测/鉴定此类感染的存在与否。

也发现这些结果可有效地用于抗疟疾措施支持系统，并且可以有效地使用疟疾感染-预防/治疗措施系统。

即，本发明可提供下述第1至27项描述的内容。

第1项.一种检测或鉴定标本中疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染的方法；该方法包括以下步骤(a)至(c)：

a)从标本中提取DNA；

b)通过使步骤(a)中提取的DNA在含有链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物中进行反应，来扩增疟原虫属18SrRNA基因序列的特定区域；和

c)检测或鉴定在步骤(b)中扩增的疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的扩增产物的存在与否；

所述序列特异性引物组是含有SEQ ID NO：1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域；和/或以下引物组中的一个或多个：包含含有SEQ ID NO：7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增恶性疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域；包含含有SEQ ID NO：13至18、SEQ IDNO：31至36或SEQ ID NO：37至42表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域；包含含有SEQ ID NO：19至42表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域；和包含含有SEQ ID NO：25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

第2项.根据第1项所述的检测或鉴定方法，其中从标本中提取DNA是通过煮沸含有该DNA的标本并进行离心来完成的。

第3项.根据第2项所述的检测或鉴定方法，其中煮沸时间是从数分钟至十数分钟。

第4项.根据第1至3项中任一项所述的检测或鉴定方法，其中，在扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域的步骤(b)中，使用恒温水浴或特别为LAMP设计的扩增仪，在大约60℃下进行所述DNA扩增反应大约1小时。

第5项.根据第1至4项中任一项所述的检测或鉴定方法，其中，在步骤(c)中，利用目视观察或实时浊度计检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的扩增产物的存在与否。

第6项.根据第1至5项中任一项所述的检测或鉴定方法，其在疟疾流行区进行。

第7项.根据第1至6项中任一项所述的检测或鉴定方法，其中同时或分别检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染。

第8项.根据第1至6项中任一项所述的检测或鉴定方法，其中使用一个引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定疟原虫属的感染，该引物组包含含有SEQ ID NO：1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域。

第9项.根据第1至6项中任一项所述的检测或鉴定方法，其中使用用于检测间日疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定间日疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ ID NO：13至18、SEQ ID NO：31至36或SEQ ID NO：37至42表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

第10项.根据第1至6项中任一项所述的检测或鉴定方法，其中使用用于检测三日疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定三日疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ ID NO：19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

第11项.根据第1至6项中任一项所述的检测或鉴定方法，其中使用用于检测卵形疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定卵形疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ ID NO：25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

第12项.一种用于检测疟原虫属的引物组，其包含含有SEQ IDNO：1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域。

第13项.一种用于检测间日疟原虫的引物组，其包含含有SEQID NO：13至18、SEQ ID NO：31至36或SEQ ID NO：37至42表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

第14项.一种用于检测三日疟原虫的引物组，其包含含有SEQID NO：19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

第15项.一种用于检测卵形疟原虫的引物组，其包含含有SEQID NO：25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

第16项.一种用于检测疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的任一种的引物组，其包含含有选自第12至15项中所述的核酸序列和SEQ ID NO：7至12表示的核酸序列的寡核苷酸引物组，该引物组能够扩增疟原虫属以及疟原虫属的各个种的18S rRNA基因序列的特定区域，包括恶性疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

第17项.一种用于疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的任一种的检测试剂盒，其包含选自第12至16项所述的引物组的至少一个引物组、链置换DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。

第18项.根据第17项所述的检测试剂盒，其中该试剂盒同时或分别检测疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫。

第19项.一种抗疟疾措施支持系统，包括：

用于输入和存储疟疾感染患者信息的装置，该信息包括疟疾流行区导致疟疾的疟原虫属寄生虫阳性的数字，以及该地区的携带率；

疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库，该数据库基于疟疾感染患者信息为疟疾流行区指定公共卫生措施，该数据库中已经输入了关于疟原虫感染区的公共卫生措施选择信息，后者与指示应当优先选择哪种公共卫生措施的措施优先级一起被输入；

公共卫生措施提取部分，该部分根据关于受试者中疟原虫的疟疾感染患者信息，从疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库中提取用于疟疾感染流行区的公共卫生措施及其优先级；和

公共卫生措施显示部分，该部分显示在公共卫生措施提取部分提取的公共卫生措施及其优先级。

第20项.根据第19项所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据第1项所述的检测或鉴定方法和/或根据第12项所述的引物组，或根据第17项所述的疟原虫属检测试剂盒，通过鉴定疟原虫属感染的存在与否，获得关于疟疾流行区的疟原虫的疟疾感染患者信息。

第21项.一种抗疟疾措施支持系统，包括：

用于输入或存储疟原虫治疗剂信息的装置，用于指定对疟原虫四个种中的一种或多种的感染起作用的疟疾治疗剂；

患者信息输入装置，用于输入和存储患者信息，包括关于疟疾流行区发热患者的疟疾感染病原体的信息；

患者信息输入装置，用于输入和存储患者信息，包括关于疟疾非流行区发热患者的疟疾感染病原体的信息；

治疗指导数据库，根据针对在受试者中检测出的疟原虫的有效性指数，疟原虫治疗剂选择信息与指示应当优先选择哪种疟疾治疗剂来对抗疟原虫的优先级一起输入到该数据库中；

疟疾治疗剂提取部分，该部分根据关于受试者的疟疾感染病原体的信息，从治疗指导数据库中提取将要施用的疟疾治疗剂及其优先级；和

疟疾治疗剂显示部分，该部分显示在上述疟疾治疗剂提取部分中提取的疟疾治疗剂及其优先级。

第22项.根据第21项所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据第1至11项中任一项所述的检测或鉴定方法，和/或根据第12至16项中任一项所述的引物组，或根据第17或18项所述的检测试剂盒，通过鉴定疟原虫四个种中的一种或多种的感染，获得关于发热患者的疟疾感染病原体的信息。

第23项.一种抗疟疾措施支持系统，其中涉及抗疟疾措施的公共卫生措施和涉及抗疟疾措施的疟原虫治疗措施组合进行；

公共卫生措施包括：

用于输入和存储疟疾感染患者信息的装置，该信息包括疟疾流行区导致疟疾的疟原虫属阳性的数字，以及该地区的携带率；

公共卫生措施显示部分，该部分显示在公共卫生措施提取部分提取的公共卫生措施及其优先级；且

疟原虫治疗措施包括：

用于输入或存储疟原虫治疗剂信息的装置，用于指定对四种疟原虫中的一种或多种的感染起作用的疟疾治疗剂；

第24项.根据第23项所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据第1项所述的检测或鉴定方法，和/或根据第12项所述的引物组，或根据第17或18项所述的疟原虫属检测试剂盒，通过鉴定疟原虫属感染的存在与否，获得关于疟疾流行区的疟原虫的疟疾感染患者信息；和/或使用根据第1至11项中任一项所述的检测或鉴定方法，和/或根据第16项所述的引物组，或根据第17或18项所述的疟原虫种检测试剂盒，通过鉴定四种疟原虫中的一种或多种的感染，获得关于发热患者的疟疾感染病原体的信息。

第25项.一种用于计划到疟疾流行区旅行的个人的疟疾感染-预防措施系统，该系统包括：

用于从根据第23项所述的抗疟疾措施支持系统中获得疟疾流行区公共卫生措施的实施状态、关于该疟疾流行区的疟疾感染病原体的信息和感染患者的治疗状态的装置；

用于从疟原虫治疗指导数据库中选择疟疾预防/治疗剂的装置；和

用于在旅行前施用选择的药物的装置。

第26项.一种用于疟疾流行区返回者的疟疾感染-预防/治疗措施系统，该系统包括：

用于获得疟疾流行区的公共卫生措施实施状态、关于该疟疾流行区的疟疾感染病原体的信息和感染患者的治疗状态的装置；

用于在从疟疾流行区返回后根据第23项施用选择的药物的装置。

第27项.根据第26项所述的疟疾感染-预防/治疗措施系统，其中，当疟疾流行区返回者发热时，进行恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的鉴定，以选择和施用应当优先选择的疟疾治疗剂。

使用用于LAMP的上述第(1)至(5)项的引物或引物组中的一个，允许与疟原虫属18S rRNA基因、恶性疟原虫18S rRNA基因、间日疟原虫18S rRNA基因、三日疟原虫18S rRNA基因或卵形疟原虫18SrRNA基因的退火。在LAMP方法的扩增条件下扩增该基因允许特异基因区域的扩增。这种扩增产物的有无可通过电泳或简便的检测方法来分析。在此类方法中，特定疟原虫属的感染和四种疟疾寄生虫的每一种的感染可被同时或分别检测和区分出来。

当本发明的检测方法用于特定的标本(例如，人血)时，可从标本中分离DNA样品，使用这些DNA样品，第(1)至(5)项的引物组中的任何一个发生反应而扩增，由此确认任何扩增的DNA产物的有无。以这种方式，疟原虫属或四种疟疾寄生虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)中的任何一种可被同时或分别检测出来。

本发明的效果

本发明允许使用LAMP引物组，其中该引物组包含含有SEQ IDNO：1至6、7至12、13至18(31至36或37至42)、19至24或25至30的核酸序列的寡核苷酸组；并且允许同时或分别扩增疟原虫属18S rRNA基因的共同区域，或四种人疟疾寄生虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)中每一种的18S rRNA基因的特定区域；从而允许同时或分别检测或区分任何人疟疾寄生虫感染或四种人疟疾寄生虫之一的有无。

本发明用于检测或区分疟疾寄生虫感染或四种人疟疾寄生虫之一的有无的方法包括：使用包含含有SEQ ID NO：1至6、7至12、13至18(31至36或37至42)、19至24或25至30的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，通过LAMP(等温基因扩增)扩增从标本中获得的DNA样品；并且分析任何扩增产物的有无。这种检测或区分方法能够简便、快速和可靠地同时或分别检测或区分任何疟疾寄生虫感染或四种疟疾寄生虫之一(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)的有无。本发明还提供一种用于同时或分别检测或鉴定这种人疟疾寄生虫或四种疟疾寄生虫的试剂盒。

抗药株的发展已成为适当治疗疟疾的主要问题。本发明用于同时区分四种疟疾寄生虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)的方法可为疟疾流行区的医务工作者或医院医生提供关于发热患者是感染了特定疟疾寄生虫还是感染了多种疟疾寄生虫的快速和高灵敏度的信息，从而允许对发热疟疾患者进行快速和适当的治疗。

使用本发明的疟原虫属或四种疟疾寄生虫的检测/鉴定方法，能够监测给疟疾感染患者施用疟疾治疗剂的治疗效果。

根据本发明的抗疟疾措施支持系统，通过个人电脑中的疟疾治疗剂指导数据库或经由具有常规操作软件的手机，临床从业者和医院医生可检查关于发热患者中疟疾感染病原体的信息，由此获得关于哪种疟疾治疗剂应当给予选择优先级或者哪些疟疾治疗剂应当联合使用的显示。

使用本发明的疟疾感染-预防措施系统，计划去疟疾流行区旅行的个人可提前获知该地区流行的疟疾感染，以及抗药株出现的状态。因此，为预防疟疾感染，该个人可在旅行前施用给予选择优先级的优选的疟疾治疗剂，用于抵抗该地区流行的疟疾感染，使得即便该个人感染疟疾，由疟疾感染引起的症状(如发热)可在早期降低且可以预防严重的状况，能够在早期消除该人血液中的疟疾寄生虫。

附图说明

图1显示了LAMP靶标的位置和疟原虫属(A)和疟原虫属四个种(B)的引发位点，以及18S rRNA基因核苷酸序列。(A)参考序列(GenBank登记号M19173.1)中疟原虫属特异性引物组引发位点的位置用箭头表示。(B)四种人疟疾寄生虫-恶性疟原虫(Pf；GenBank登记号M19173.1)、间日疟原虫(Pv；GenBank登记号U03079)、三日疟原虫(Pm；GenBank登记号M54897)和卵形疟原虫(Po；GenBank登记号L48986)-的18S rRNA基因的部分序列比对，以及种特异性引物退火位点。

图2是使用LAMP的抗疟疾措施支持系统的示意图。

图3是基于本发明原理的抗疟疾措施支持系统过程的流程图。

实施本发明的最佳方式

下面将详述本发明优选的实施方式。

本发明是一种简便和高可靠性的检测系统，用于在医院和实验室或在流行区的疟疾诊所的常规疟疾寄生虫筛选。例如，通过采用LAMP的等温基因扩增方法，使用特异性针对疟原虫属和四种疟疾寄生虫中每一种的寡核苷酸引物，当人血样中存在疟原虫属或四种疟疾寄生虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)中的任一种时，就可被确定。特别地，本发明是基于包括以下步骤的方法：靶向属特异性疟原虫18S rRNA基因序列、恶性疟原虫18SrRNA基因序列、间日疟原虫18S rRNA基因序列、三日疟原虫18SrRNA基因序列、或卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域；使用第16项的引物组扩增疟原虫属18S rRNA基因序列、恶性疟原虫18S rRNA基因序列、间日疟原虫18S rRNA基因序列、三日疟原虫18S rRNA基因序列或卵形疟原虫18S rRNA基因序列的该特定区域；且分析任何扩增产物的有无。

本发明的检测/鉴定方法可应用于感染了疟疾寄生虫的人血中存在的疟疾寄生虫。

本文使用的术语“标本”可包括疟原虫属或疟疾寄生虫的四个具体种之一：恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫，意指本发明的检测/鉴定方法针对的人血样。本文使用的术语“检测”意指，例如，确定血液样品中存在的疟疾寄生虫是否为具体疟原虫种的疟疾寄生虫，有时又与“确定”同义。

本文使用的术语“鉴定”有时是指在至少存在疟原虫属的一个种的标本中，在疟原虫属的具体种如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫和疟原虫属其他种之间进行辨别；以及同时或分别检测。但是，术语“鉴定”通常意指在多个疟原虫寄生虫中鉴定出一种特定的待检疟疾寄生虫。因此，术语“鉴定”包括单个疟疾寄生虫感染和多个疟疾寄生虫感染的检测。

本发明使用的LAMP方法是一种基因扩增方法，其不同于PCR，在扩增步骤中不需要温度调节(热循环)，使用一种DNA聚合酶，并且在恒定温度(等温)下扩增基因(WO 2000/28082和Notomi，T.等人，Nucleic Acids Res.28(2000)：e63)。

上述DNA聚合酶可为任何具有链置换活性的模板依赖性核酸合成酶。此类酶包括Bst DNA聚合酶(大片断)、Bca(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片断、Vent(Exo-)DNA聚合酶(不具有外切核酸酶活性的Vent DNA聚合酶)、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶(不具有外切核酸酶活性的DeepVent DNA聚合酶)、KOD DNA聚合酶等等。

优选地使用Bst DNA聚合酶(大片断)。当使用该酶时，优选地在大约65℃进行反应，这是该酶反应的最适温度。

LAMP方法的扩增产物可用已知技术来检测。例如，可使用标记的特异性识别扩增基因序列的寡核苷酸来检测；或在反应结束后将反应混合物直接进行琼脂糖电泳进行方便的检测。LAMP方法产生具有不同碱基长度的多条带的梯形带(ladder)。

此外，作为扩增副产物，由焦磷酸镁累积产生的白色悬浮液可通过肉眼或浊度计来检测(Mori，Y.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.289(2001)：150-154)。

可选择地，可以使用SYBR Green I(Applied Biosystems公司产品)用肉眼简单检查扩增，当存在扩增的DNA时变绿。然而，SYBRGreen I的结果与从实时浊度计推导出的结果一致(Parida，M.等人，J.Clin.Microbiol.43(2005)：2895-2903和日本未审查的专利公开No.2001-242169)。因为浊度试验可以在封闭系统中进行，所以污染的风险小于琼脂糖凝胶电泳。这是LAMP在临床使用中的一个额外的优点(Enosawa，M.等人J.Clin.Microbiol.41(2003)：4359-4365；Seki，M.等人，J.Clin.Microbiol.43(2005)：1581-1586；Poon，L.等人，Clin.Chem.52(2006)：303-306)。

因此，LAMP诊断原则上不需要昂贵的DNA提取试剂、浊度计、热循环仪、或熟练技术人员。模板可通过直接热处理血样来制备，无需使用商业试剂盒的耗时和昂贵的DNA提取(http://loopamp.eiken.co.jp)。

例如，在疟疾流行区现场，仅仅煮沸和分离非常小量的受试者指尖血就能确保制备足以用于LAMP反应的DNA样品。

此外，LAMP仅需要能够提供60℃恒温的简单孵箱，如加热块或水浴，这比套式PCR或实时PCR更加经济和可行。

四种人疟疾寄生虫18S rRNA基因共同的属特异性引物组，和本发明的每一个针对间日疟原虫18S rRNA基因、三日疟原虫18S rRNA基因和卵形疟原虫18S rRNA基因的特异性引物组，均针对每个18SrRNA基因的特定区域。引物组被设计成具有总共4种引物为一组，其中两个是成环的2种内引物：(FIP(F1c-F2)和BIP(B1-B2c))，其他两个是2种外引物(F3，B3c)。每个扩增基因的特定区域范围在大约70至500个碱基对长度之间。

内引物扩增靶区域的核酸序列，并且其特征在于包括：(a)作为第一区段，与靶基因退火且行使引物功能的核酸序列；和(b)作为第二区段，与第一区段的3’核酸序列互补的核酸序列，和位于第一区段的5’侧的位置。

此外，使用具有与哑铃结构5’末端环的单链部分互补的序列的环引物(LPB，LPF)可增加DNA合成起点的数目，其中该哑铃结构行使扩增反应起点的功能。因此，使用环引物可增加扩增效率，并且缩短大约三分之一至二分之一的扩增时间。外引物识别靶区域的3’端核酸序列，并且具有起合成起点作用的核酸序列。

发明人试图基于四种人疟疾寄生虫共同的18S rRNA基因的属特异性核酸序列，和恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫18S rRNA基因的每个种特异性核酸序列，使用LAMP设计软件PrimerExplorer V3((http://primerexplorer.jp/e/)，Fujitsu Limited的产品)，设计每个内引物((FIP(F1c-F2)，BIP(B1-B2c))、外引物(F3，B3c)和环引物(LPB，LPF)。然而，通常来讲，疟疾寄生虫基因的核酸序列与其他生物体的序列大不相同，富含AT含量。因此，现有的引物设计软件无法获得最优的引物组，需要重复性的试错过程，并且导致设计每种类型的引物十分困难。最终，在这些合成的引物组的许多组合中，找到高灵敏度和高特异性的可用引物组。由此，发明人已成功设计了能够同时检测四种人感染性疟疾寄生虫的属特异性引物，和针对四种疟疾寄生虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫)中每一种的各18S rRNA基因的特异性引物。

一旦确定了引物寡核苷酸的核酸序列，寡核苷酸就可用已知方法合成，例如，通过PerkinElmer，Inc公司生产的自动DNA合成仪来合成。

根据本发明，特异性针对四种人疟疾寄生虫共同的18S rRNA基因核酸序列的疟原虫属特异性引物组，和特异性针对恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的各疟疾寄生虫18S rRNA基因的特异性引物组的实例包括，例如，如下七个用于疟原虫属和四种疟疾寄生虫的引物组：

用于疟原虫属的引物组[F3(SEQ ID NO：1)，B3c(SEQ ID NO：2)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：3)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：4)，LPF(SEQID NO：5)，LPB(SEQ ID NO：6)]；

用于恶性疟原虫的引物组[F3(SEQ ID NO：7)，B3c(SEQ ID NO：8)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：9)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：10)，LPF(SEQ ID NO：11)，LPB(SEQ ID NO：12)]；

用于间日疟原虫的引物组[F3(SEQ ID NO：13)，B3c(SEQ ID NO：14)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：15)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：16)，LPF(SEQ ID NO：17)，LPB(SEQ ID NO：18)]；[PvFIP-9(F1c+F2)(SEQID NO：31)，PvBIP-9(B1+B2c)(SEQ ID NO：32)，PvF3-9(SEQ ID NO：33)，PvB3c-9(SEQ ID NO：34)，PvLPF-9(SEQ ID NO：35)，PvLPB-9(SEQ ID NO：36)]；或[PvFIP-7(F1c+F2)(SEQ ID NO：37)，PvBIP-7(B1+B2c)(SEQ ID NO：38)，PvF3-7(SEQ ID NO：39)，PvB3c-7(SEQ ID NO：40)，PvLPF-7(SEQ ID NO：41)，PvLPB-7(SEQ ID NO：42)]；

用于三日疟原虫的引物组[F3(SEQ ID NO：19)，B3c(SEQ ID NO：20)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：21)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：22)，LPF(SEQ ID NO：23)，LPB(SEQ ID NO：24)]；和

用于卵形疟原虫的引物组[F3(SEQ ID NO：25)，B3c(SEQ ID NO：26)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：27)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：28)，LPF(SEQ ID NO：29)，LPB(SEQ ID NO：30)]。

在这里，各自特异性针对疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的引物都是能够特异性扩增所述疟原虫属的种共同的18S rRNA基因的特定区域以及恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的各18S rRNA基因的各特定区域的引物。

本发明的使用LAMP进行检测/鉴定的疟原虫属和四种疟疾寄生虫特征性的序列实例包括，在GenBank中登记的恶性疟原虫(P.falciparum：GenBank登记号M19173.1，M19173.2，M19172)、间日疟原虫(P.vivax：GenBank登记号U03079，U03080，X13926)、三日疟原虫(P.malariae：GenBank登记号M54897)和卵形疟原虫(P.ovale：GenBank登记号L48986，L48987)的18S rRNA基因序列。

通过通常在60至65℃范围内进行15分钟至1小时的等温基因扩增，使用前述五个引物组中的至少一组，对标本中存在的疟原虫属或四种疟疾寄生虫中的一种进行检测或鉴定。也就是说，从标本如血样等中收集的DNA用已知的方法分离，并且用所述引物组扩增该DNA。扩增的DNA产物的存在可通过LAMP或通过常用的电泳方法容易地检测。

前述容易的检测包括：1)对扩增反应混合物的白色浊度的目视检查(WO 2001/83817)；2)使用荧光物质如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、X-罗丹明(ROX)等测量反应混合物的荧光极性值的方法(日本未审查的专利公开No.2002-272475)，其使用连续荧光计如ABIPrism 7700(Applied Biosystems公司的产品)等，可证实扩增或动力学分析；和3)使用SYBR Green 2的目视检查，其使用荧光绿色染料作为嵌入剂(WO 2002/103053)。通过这些方法中的任一个，可通过肉眼检查任何扩增产物的有无(靶18S rRNA基因的有无)。

根据本发明，可提供一种疟疾寄生虫检测试剂盒，该试剂盒能够同时或分别检测疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫中的任一个。

上述疟疾寄生虫检测试剂盒可预装有多种类型的检测使用本发明引物组扩增的核酸所必需的试剂。具体地，作为试剂盒提供本发明引物或环引物所必需的多种寡核苷酸，作为核酸合成底物的四种dNTP，具有链置换活性的模板依赖性核酸合成酶，能够提供优选的酶反应条件的缓冲液或盐，用于稳定酶或模板的保护剂，和，当标示出时，用于检测反应产物所必需的试剂。

试剂盒组分的实例：提供

(1)一种反应混合物，其含有用于疟原虫属的引物组[F3(SEQ IDNO：1)，B3c(SEQ ID NO：2)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：3)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：4)，LPF(SEQ ID NO：5)，LPB(SEQ ID NO：6)]；

(2)用于荧光目视检测的试剂；

(3)酶混合溶液(包括Bst DNA聚合酶)；

(4)阳性对照(对于疟原虫属)；和

(5)蒸馏水。

本发明进一步提供一种抗疟疾措施支持系统和一种疟疾感染-预防/治疗措施系统。

疟疾感染患者信息疟疾流行区引发疟疾的疟原虫属阳性的数字，和该地区的携带率；具体地，作为基本信息，该信息包括，居住在流行区的个体受试者的受试者信息，如姓名、性别、年龄、体重、怀孕或非怀孕状态、家庭结构、家庭住址、出生地、原有疾病的名称、施用药物名称、药物副作用史等，以及他们对于疟原虫属的阳性或阴性和对疟疾治疗剂的抗性的获得或未获得，和该地区的疟疾寄生虫携带率等。输入和储存疟疾感染患者信息的装置是，例如，计算机输入装置和存储装置。

在疟疾流行区引起疟疾的疟原虫属的携带率表示为百分比，通过将疟原虫属阳性受试者数目除以接受疟原虫属检测试验的受试者数目并且将得到的商乘以100就得到该百分比。在本发明的抗疟疾措施支持系统中，例如，在疟疾流行区特别优选地使用应用LAMP的疟原虫属检测方法。在长期居住在疟疾流行区并获得针对疟疾的免疫(抗性)的受试者中，该受试者血液中寄生虫的数目大约是发热疟疾患者的百分之一至约千分之一。对这种小数目寄生虫的高灵敏度显微镜检是十分困难的。另外，在疟疾感染和潜伏期后，在由于血液中出现疟疾寄生虫而开始发热的阶段的早期，寄生虫的数目较少，因此寄生虫的显微镜检非常困难。当已经施用了疟疾治疗剂且由于治疗剂的作用而使受试者血液中寄生虫数目明显降低时，高灵敏度的显微镜检同样十分困难。

在许多疟疾流行区，不存在或没有提供令人满意的DNA提取设备。在制备用于PCR的DNA时，当使用提取试剂盒无法得到高纯度DNA时，PCR无法进行，因为由于血液中存在抑制用于PCR的DNA扩增酶的抑制剂，PCR无法发生。

在本发明抗疟疾措施支持系统中使用的疟原虫属检测方法中，DNA样品可非常容易地获得，例如，通过从受试者指尖收集非常少量的血液，在沸水中煮沸该血液10分钟，并且在10000rmp离心血液1分钟以获得上清液，其可以作为DNA使用。因此，疟疾流行区可以有利地应用其中使用本发明的疟原虫属检测引物组检测标本中疟原虫属的方法，其可扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域。进一步地，当开展的研究不仅仅针对疟疾流行区的受试者，而且针对流行区采集的携带疟疾寄生虫的蚊虫率，以基于对携带疟疾寄生虫的蚊子的研究获得疟疾流行预测的重要数据时，因为本发明方法使用的DNA与用于PCR的DNA相比，可更容易地从蚊子中提取，使用本发明的疟原虫属检测引物组(其可扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域)获得的标本中疟原虫属的检出频率，可以存储于存储装置中，作为疟疾感染-预防公共卫生措施数据库中关于疟疾流行预测的一条信息。

根据本发明检测或鉴定疟原虫属或四种疟疾寄生虫的方法比显微镜检和PCR更加简便、成本更低、更容易操作、且具有更高的灵敏度和更高的特异性，并且因此可在流行区最优选地使用。

基于疟疾感染患者信息的疟疾感染流行区公共卫生措施包括下面第(1)至(4)项：(1)从该地区消除蚊子可能孳生的环境，和通过杀灭蚊子和死水中的蚊子幼虫来消除蚊子的源头；(2)在屋内、场所内等喷杀虫剂，给门窗配备纱网，和优选地，如果户主有条件的话可在屋内安装空调；(3)在床上加装浸泡了杀虫剂(基于拟除虫菊酯的杀虫剂：苄氯菊脂(permethrin))的蚊帐(具有长期效果的蚊帐：LLIN，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)，在人体皮肤上施用含有驱虫剂的驱虫剂喷雾剂(二乙基甲苯酰胺：DEET)，采取诸如日落后穿长袖衣物的措施，用杀虫剂喷洒衣物等；和(4)基于关于疟疾流行区高频发生的疟疾寄生虫和抗药株的信息，预防性地施用治疗剂，如甲氟喹和青蒿琥酯的混合物、氯喹、青蒿素、奎宁、多西环素等，使得疟疾治疗剂也作为疟疾预防剂。

对于阳性感染患者，考虑用疟疾治疗剂消灭(治疗)疟疾寄生虫。关于流行区高发疟疾寄生虫和抗药株的信息可获自：流行区所属国家的卫生部网站；日本卫生科学基金会，政策创新药物发展总体研究计划，热带病化学治疗研究组(http://www.miyazaki-med.ac.jp/parasitology/orphan/HTML/page-DL.html)，寄生虫疾病化学治疗指南(Guidance for Parasitic Disease Chemotherapy)，修订版6.0(2007)；和出版于2005年3月的疟疾化学预防专家会议指南(the guidelines ofthe Expert Meeting on Malaria Chemoprophylaxis)(http://jsp.tm.nagasaki-u.ac.jp/modules/tinyd3/index.php？id＝2)。根据本发明方法所检测或鉴定的疟疾寄生虫种类，基于选择治疗剂的已知标准，可容易地选择疟疾治疗剂。

指示上述公共卫生措施(1)至(4)种哪一种应当给予选择优先级的措施优先级应当在考虑该地区疟疾流行的程度、该国的经济状况、居民的环境和经济状况等后确定。可由国家、当地政府、自治体等采取的措施(1)应当给予优先级，然后是可由个体受试者和其他居民容易地采取的措施(2)和(3)。

考虑到疟疾流行区居民的总体经济状况，措施(4)-预防性施用治疗剂-具有较低的优先级，并且可能局限于具有特殊需要的居民，如婴儿、孕妇等。目前措施(4)还不充分。取决于流行区，措施优先级可发生变化，并且可能为，例如优选地(1)＞(2)＝(3)＞(4)，并且从实践的角度出发，(2)＝(3)＞(4)＞(1)。考虑疟疾流行程度、该国的经济状况、居民的环境和经济状况等，这种措施优先级从公共卫生措施提取部分(例如，程序)中提取出来，并且显示在公共卫生措施显示部分(例如，显示器)上。

如上所述，已经输入了被输入疟疾寄生虫感染地区的公共卫生措施选择信息的疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库中存储的信息可包括：该地区实际流行的疟疾的类型和频率、关于抗药株的信息、关于公共卫生措施(1)至(4)的信息、有关措施的指导性信息、疟疾流行预测、疟疾诊断方法、和关于选择用于感染性疟疾寄生虫各自种类的药物的信息。

使用从受试者中提取的DNA，进行本发明的疟疾寄生虫检测方法，以获得关于受试者中是否存在疟疾感染的感染患者信息；并且将该信息与疟疾感染流行区的公共卫生措施和它们的优先级进行核对，后者来自于能够从疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库中提取公共卫生措施优先级的公共卫生措施提取部分和能够显示在公共卫生措施提取部分提取的公共卫生措施及其优先级的公共卫生措施显示部分。由此，由流行区当地政府或受试个体采取的公共卫生措施可顺序进行或同时进行。进一步地，这种公共卫生措施的效果可以作为信息存储在疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库中。这样就可更新疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库。本发明的抗疟疾措施支持系统就可因此提供给疟疾流行区。

包括关于受试者中是否存在疟疾寄生虫感染的受试者信息可通过常规技术使用PC(个人电脑)或手机、传真机等来进行管理和获得。使用PC或手机从Internet网站上、或从手册中可获得存储于疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库中的信息。

在本发明的抗疟疾措施支持系统中，用于输入和存储指定作用于四种疟疾寄生虫中的一种或多种感染的疟疾治疗剂的疟疾治疗信息的装置是指，考虑每个疟疾流行区的抗药株的实际出现，和其严重程度，或考虑每种类型疟疾的临床症状、患者年龄和怀孕或非怀孕状态，将包括以下的信息存储于“治疗指导数据库”中的装置：药效、药物名称、通用名称、各药物优选应用的地区、施用周期、剂量、副作用的类型和频率、副作用的严重程度、禁忌症、关于婴儿和孕妇的信息、关于与其他药物共用、药物价格等的信息。

从其他感染如流感患者中区别诊断出由疟疾感染引起的发热患者是十分重要的，因为如果治疗延误，疟疾感染，尤其是恶性疟原虫感染会导致严重后果。因此，快速、高灵敏度和高特异性的区别诊断是非常需要的。尤其地，如上所述，许多疟疾流行区都缺乏或没有提供令人满意的DNA提取设备，并且在发热的早期阶段，疟疾寄生虫的数目太少以至于疟疾寄生虫的显微镜检鉴定并不容易。

根据本发明使用包含恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫特异性序列的引物组来鉴定恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的方法，或其鉴定/检测试剂盒，能够比其他鉴定方法如PCR和显微镜检更容易、更快速、更高灵敏度和更高特异性地鉴定四种疟疾寄生虫中的一种或多种的感染。

进一步地，本发明的疟疾寄生虫检测/鉴定方法使得能够监测疟疾感染患者施用疟疾治疗剂的疗效。

本发明的系统是基于疟疾寄生虫特异性的检测或鉴定技术。“用于输入和储存患者信息包括关于疟疾流行区发热患者的疟疾感染病原体信息的患者信息输入装置”，是用于向PC(个人电脑)中输入和记忆/存储受试者信息的装置，这些信息包括关于疟疾流行区发热患者的疟疾感染病原体的信息，以及发热患者的姓名、年龄、性别、体重、怀孕或非怀孕状态、家庭结构、家庭地址、出生地、原有疾病名称、施用药物的名称、药物副作用史等信息。基于从流行区获得的信息，可从PC或手机、或作为传真信息从医疗设施和医院实现输入和记忆/存储。

“用于输入和储存患者信息包括关于疟疾非流行区发热患者的疟疾感染病原体信息的患者信息输入装置”，除发热患者是疟疾非流行区的发热患者外，与“用于输入和储存患者信息包括关于疟疾流行区发热患者的疟疾感染病原体信息的患者信息输入装置”相同。

在上文中，“包括治疗指导数据库，根据针对在受试者中检测出的疟疾寄生虫的有效性指数，疟疾寄生虫治疗剂选择信息与指示应当优先选择哪种疟疾治疗剂来对抗疟疾寄生虫的优先级一起被输入到该数据库中；疟疾治疗剂提取部分，该部分根据关于受试者的疟疾感染病原体的信息，从治疗指导数据库中提取将要施用的疟疾治疗剂及其优先级；和疟疾治疗剂显示部分，该部分显示在上述疟疾治疗剂提取部分中提取的疟疾治疗剂及其优先级”表示这样一个过程：其中当获得了关于疟疾流行或非流行区发热患者的疟疾感染寄生虫的信息后，考虑发热患者感染的疟疾寄生虫种类、患者症状、和其他状况，使用每种治疗剂的有效性指数，如对恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫或两种或多种这些疟疾寄生虫的复合感染的效果特异性，以及进一步将包括疟疾感染的来源和发热患者的其它状况的病原体信息与存储于“治疗指导数据库”中的疟疾治疗剂信息(例如包括，药物效果、药物名称、通用名称、各药物优选应用的地区、作用特异性、施用周期、剂量、副作用的类型和频率、副作用的严重程度、禁忌症、关于婴儿和孕妇的信息、关于与其他药物共用的信息、药物价格等)进行对照，临床从业者或医院医生就可以排列出哪种疟疾治疗剂应当给予选择优先级用于对抗感染性疟疾寄生虫。

根据本发明的抗疟疾措施支持系统，临床从业者和医院医生可以将关于发热患者中疟疾感染病原体的信息在个人电脑中或经由具有常规操作软件的手机与疟疾治疗剂指导数据库进行对照，由此获得关于哪种疟疾治疗剂应当给予选择优先级或者哪些疟疾治疗剂可联合使用的显示。

上述疟疾治疗剂信息可存储于“治疗指导数据库”中，参见日本卫生科学基金会，政策创新药物发展总体研究计划，热带病化学治疗研究组(http://www.miyazaki-med.ac.jp/parasitology/orphan/HTML/page-DL.html)，寄生虫疾病化学治疗指南，修订版6.0(2007)；出版于2005年3月的疟疾化学预防专家会议指南(http://jsp.tm.nagasaki-u.ac.jp/modules/tinyd3/index.php？id＝2)；和美国CDC(疾病预防和控制中心(Centers for Disease Control and Prevention))的疟疾治疗指南。

例如，由于越来越多的恶性疟原虫株变为氯喹抗性，在泰国和发达国家共同施用甲氟喹和青蒿琥酯被认为是具有选择优先级的疟疾治疗。另一方面，在反映药物价格的地区，在一些情况下二代药物法西达(fansidar)具有选择优先级。对于间日疟原虫和卵形疟原虫，在能引起临床症状如发热的红细胞内期，氯喹具有选择优先级，并且随后选择施用两周疗程的伯氨喹来达到完全的治愈和复发预防。此外，对于三日疟原虫选择氯喹具有优先级。

这些信息也存储于“疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库”中。

使用本发明的抗疟疾措施支持系统选出作为给予选择优先级的疟疾治疗剂的药物，将关于用该药物治疗发热患者的疟疾治疗结果的信息反馈到“疟疾寄生虫治疗指导数据库”和“疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库”中，并且作为更新的信息存储。

由此，可以提供抗疟疾措施支持系统，其中通过对从疟疾流行区发热患者或非流行区发热患者中提取的标本实施根据本发明的鉴定四种疟疾寄生虫中一种或多种(复合)感染的方法，可以容易、快速、以及高灵敏度和高特异性地获得关于发热患者中的疟疾感染病原体的信息；以及其中疟疾流行区或非流行区的临床从业者或医院医生可以将这些信息针对疟疾寄生虫治疗指导数据库进行检查，以选择应当给予选择优先级的优选的治疗剂和施用方法，用于由于疟疾感染而发热的患者，以及能够应用此药物和方法来治疗疟疾感染的发热患者。

从疟疾流行区的感染-预防公共卫生措施和疟疾流行区或非流行区的疟疾感染发热患者的治疗总体来看，本发明也可以通过组合以下几个方面提供用于从流行区根除疟疾的抗疟疾措施支持系统：使用根据本发明的检测疟疾寄生虫的方法获得疟疾流行区的疟疾感染患者信息；使用疟疾流行区当地政府、自治体或居民的抗疟疾措施支持系统(其中使用疟疾感染-预防公共卫生措施数据库)以及使用根据本发明的用于鉴定四种疟疾寄生虫中的一种或多种感染的方法或试剂盒，获得关于疟疾流行区或非流行区发热患者的疟疾感染病原体的信息；和抗疟疾措施支持系统，其中疟疾流行区或非流行区的临床从业者或医院医生使用疟疾寄生虫治疗指导数据库可以为疟疾感染的发热患者选择应当给予选择优先级的优选的治疗剂和施用方法，并应用该药物和方法来治疗疟疾感染的发热患者。

上述各个信息可使用PC来输入和存储，并且可在该地区通过PC部手机、或通过纸质手册来显示。

本发明可进一步提供用于从疟疾非流行区前往疟疾流行区的旅行者的疟疾感染-预防措施系统。本发明可提供用于计划前往疟疾流行区旅行的个人的疟疾感染-预防措施系统，该系统包括，从上述抗疟疾措施支持系统中获得疟疾流行区的公共卫生措施实施状态、关于该疟疾流行区的疟疾感染病原体的信息、和感染患者的治疗状态的装置；从疟疾寄生虫治疗指导数据库中选择疟疾预防/治疗剂的装置；和在旅行前施用选择的药物的装置。

上述各条信息可使用PC或手机容易地从Internet网站获得，或者作为疟疾流行区或国家政府组织的手册中提供的信息获得。使用用于计划去疟疾流行区旅行的个人的疟疾感染-预防措施系统，计划去疟疾流行区旅行的个人可以提前知道该地区流行的疟疾感染和抗药株出现的状态。由此，为预防疟疾感染，个人可在旅行前施用给予选择优先级的优选疟疾治疗剂来对抗该地区流行的疟疾感染，因此即使个人应感染疟疾，但由疟疾感染导致的症状，如发热，可在早期阶段减小并，且严重状况可以得到预防，使得可以在早期阶段消除该人血液中的疟疾寄生虫。

本发明可进一步提供用于从疟疾流行区返回者的疟疾感染-预防/治疗措施系统，该系统包括：用于从抗疟疾措施支持系统中获得疟疾流行区的公共卫生措施实施状态、关于该疟疾流行区的疟疾感染病原体的信息和感染患者的治疗状态的装置；用于从疟疾寄生虫治疗指导数据库中选择疟疾预防/治疗剂的装置；和用于从疟疾流行区返回后施用选择的药物的装置。根据本发明，由于出现临床症状如发热之前的潜伏期根据感染性疟疾寄生虫的种类不同从1周至40天变化，当已经感染了疟疾寄生虫的返回者从疟疾流行区返回之前，以及在返回者担心在归来之前不久已经被蚊子叮咬的情况下，可以参考来自抗疟疾措施支持系统的信息，选择并施用优选的对抗可能引起感染的疟疾寄生虫的疟疾治疗剂，因此即使返回者已经感染了疟疾，由疟疾感染导致的症状，如发热，可在早期阶段减小，并且严重状况可以得到预防，由此能够在早期阶段消除来自于疟疾流行区的返回者血液中的疟疾寄生虫。

本发明还提供用于从疟疾流行区返回者的疟疾感染-预防/治疗措施系统，其中，在上述的用于从疟疾流行区返回者的疟疾感染-预防/治疗措施系统中，当从疟疾流行区返回者发热时，进行恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的鉴定，以选择和施用应当给予选择优先级的疟疾治疗剂。

此外，在本发明的疟疾感染治疗措施系统中使用本发明的疟疾寄生虫检测/鉴定方法使得能够监测疟疾感染患者施用疟疾治疗剂的治疗效果。

在上文中，当返回者在施用疟疾治疗剂之前出现发热时，对来自发热的返回者的标本实施根据本发明的鉴定四种疟疾寄生虫的方法，以鉴定恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫或其中的多种(复合)，并且选择和施用应当给予选择优先级的疟疾治疗剂来对抗疟疾疾寄生虫。本发明的疟疾感染治疗措施系统因此可提供适当的疟疾感染治疗方法，以及监测其治疗效果的方法。

如图3所示，关于公共卫生措施结果的信息、关于发热患者的疟疾治疗结果的信息、和关于预防/治疗剂施用结果的信息均被反馈到各自的数据库中。

实施例

下面的实施例进一步详细地阐明了本发明，但并不是意图限制本发明的范围。

实施例1

材料和方法：

从曾经到泰国西北部Mae Sod和Mae Kasa疟疾诊所看病的患者中收集到68个通过显微镜检确定为疟疾寄生虫阳性的样品。此外，从泰国西部Kanchanaburi疟疾流行区居民中收集到通过显微镜检确定为阴性的53个样品。

血样均经过显微镜检和LAMP检验。每个试验都由独立的研究者来进行(显微镜检在泰国武装力量医学科学研究所(Armed ForcesResearch Institute of Medical Sciences)进行，LAMP在日本EhimeUniversity进行)，均不知道标本的来源和实验室结果，并且最终对检验结果进行比较和分析。

显微镜检：

由在鉴定疟疾寄生虫方面具有丰富经验的显微操作员在1,000倍放大倍数下检查粘稠外周血涂片。计数每500个白细胞的寄生虫密度，随后假设白细胞计数为7,000/μl，计算每微升的寄生虫数。在计数500个白细胞后如果没有发现寄生虫就视初始厚膜为阴性。

DNA提取：

按照Plowe，C.等人(Am.J.Trop.Med.Hyg.(1995)Vol.52：565-568)描述的方法制备用于LAMP的DNA模板。将25至50微升人血作为单斑点点样在滤纸上并干燥。从每个滤纸上切下单血点，然后在1ml含0.5％皂角苷的磷酸盐缓冲液中室温孵育4小时和/或4℃过夜孵育。在4℃下用PBS漂洗滤纸30分钟并转移至含200μl 5％Chelex-100(Bio-Rad，Hercules，CA)的新试管中，并且振荡30秒。混合液在56℃下孵育15分钟，振荡30秒，并且在100℃加热15分钟，以洗脱DNA，振荡，并且离心(10,000g离心5分钟)。上清液可在反应后立即使用，或分成小份存储于-20℃。

LAMP条件：

使用Poon等人(非专利文件1)描述的用于恶性疟原虫的LAMP引物组。其他的疟原虫属特异性和种特异性LAMP引物组尝试用LAMP引物设计软件PrimerExplore V3(http://primerexplorer.jp/e/；Fujitsu Ltd.出品)来设计。然而，疟疾寄生虫基因的核苷酸序列通常与其他物种的生物体的序列大大不同并且具有高AT含量；因此，用上述引物设计软件无法获得最优的引物组。因此，需要很多的尝试和失败，在设计引物时会遇到困难。然而最后，在合成的引物组经过很多组合后得以发现具有足以实际使用的灵敏度和特异性的引物组。因此，基于18S rRNA基因的属和种特异性核苷酸序列，成功设计了能够同时检测感染人的疟原虫属中四个种的属特异性引物组，和各自针对四种疟疾寄生虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫)中每一种特异性的引物组。

在如上所述设计完寡核苷酸的核苷酸序列后，通过已知方法合成引物，例如，使用由Perkin-Elmer公司制造的自动DNA合成仪。

每个引物的位置和核苷酸序列显示在图1中。

更具体地，使用了用于疟原虫属的引物组和用于四种疟原虫各自的引物组：

用于疟原虫属的引物组[(F3(SEQ ID NO：1)，B3c(SEQ ID NO：2)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：3)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：4)，LPF(SEQ ID NO：5)，LPB(SEQ ID NO：6)]；

用于间日疟原虫的引物组[F3(SEQ ID NO：13)，B3c(SEQ ID NO：14)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：15)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：16)，LPF(SEQ ID NO：17)，和LPB(SEQ ID NO：18)]；

用于三日疟原虫的引物组[F3(SEQ ID NO：19)，B3c(SEQ IDNO：20)，FIP(F1c-F2)(SEQ ID NO：21)，BIP(B1-B2c)(SEQ ID NO：22)，LPF(SEQ ID NO：23)，LPB(SEQ ID NO：24)]；

使用Loopamp DNA扩增试剂盒(Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)进行LAMP反应。

反应混合物(25μl)含有各1.6至2.4μM的FIP和BIP，各0.2μM的F3和B3c，各0.8μM的LPF和LPB，2x反应混合物(12.5μl)，Bst DNA聚合酶(1μl)，和1至2μl的DNA样品(对应于大约0.125至0.5μl血液).

LAMP反应在60℃下进行100分钟，随后在80℃下灭活该酶2分钟。

LAMP产物分析：

LAMP反应在反应管中引起混浊，与扩增DNA量成正比。因此，用肉眼观察浊度。为确保LAMP的灵敏度，也应用Loopamp实时浊度计(RT-160C，Eiken Chemical Co.，Tokyo，Japan)来监测浊度。

为进一步确认，使用MassRulerTM DNA阶梯分子量标准(Fermentas Inc.，Hanover，MD)，5μl的LAMP产物在3％琼脂糖凝胶中在100V下电泳，然后用溴化乙啶染色。LAMP的特异性通过扩增产物的限制性酶切来评估。

基于每个LAMP产物的靶序列的限制性酶切图谱，选择限制性酶DdeI用于疟原虫属特异性LAMP产物的限制酶分析，HpyCH4V用于恶性疟原虫、间日疟原虫和三日疟原虫，限制酶AluI用于卵形疟原虫。经过37℃过夜消化后，消化的产物通过琼脂糖凝胶电泳来分析。

LAMP结果的诊断阈值：

LAMP反应产物的形成通过使用Loopamp实时浊度计来监测。大多数经多次检测的阳性样品在1小时内显示阳性结果。因此，通过浊度计测量在1小时内浊度大于或等于阈值的样品被视为阳性。

阳性对照质粒DNA和测序：

对于灵敏度评估，针对每个种构建了用于LAMP反应的含有18SrRNA基因靶区域的质粒。靶DNA序列用两个LAMP引物(F3和B3c)通过PCR扩增，随后克隆至2.1-TOPO TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。

使用自动DNA测序仪(ABI

310 Genetic Analyzer，Applied Biosystems)来确定核苷酸序列。

LAMP的分析灵敏度和特异性：

为了建立能够通过LAMP检测的靶基因序列的最小拷贝数(检测下限)，使用阳性对照质粒DNA作为模板。使用在无菌水中10倍系列稀释的质粒DNA(10⁶至1个拷贝)构建LAMP标准曲线。对于每个标准，拷贝数对阈值时间作图。产生的图通过线性回归分析，γ²值的统计显著性通过ANOVA(Free Statistics and ForecastingSoftware v1.1.21：http://www.wessa.net/rwasp_kendall.wasp)进行分析。小于0.05的概率被视为统计性显著的。针对每种对照质粒DNA和自NF54株纯化的恶性疟原虫基因组DNA(gDNA)、来自Sal-I株的间日疟原虫gDNA、来自乌干达株的三日疟原虫gDNA、和来自CDC株的卵形疟原虫CDC型gDNA，评估属特异性和种特异性LAMP的特异性。

疟原虫属特异性和种特异性LAMP的分析灵敏度和特异性的结果：

对于疟原虫属和四种疟疾寄生虫：恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，LAMP的灵敏度分别为，三日疟原虫和卵形疟原虫为10个拷贝，疟原虫属、恶性疟原虫和间日疟原虫为100个拷贝。

通过LAMP产物的限制酶切进一步确证每个LAMP反应的特异性。产生的消化产物的大小与预期大小非常一致。

临床灵敏度和特异性：

对121个全血样品使用作为参照标准方法的显微镜检来计算疟原虫LAMP的临床灵敏度和特异性。灵敏度计算为(真阳性数目)/(真阳性数目+假阴性数目)，特异性计算为(真阴性数目)/(真阴性数目+假阳性数目)。

临床灵敏度和特异性：显微镜检与LAMP的比较：

表2给出了显微镜检和LAMP的结果。

在68名经显微镜检为疟疾寄生虫阳性的患者中，12名患者被诊断为恶性疟原虫感染，34名为间日疟原虫感染，12名为三日疟原虫感染，5名为卵形疟原虫感染，以及5名为恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染。其余53份样品显微镜检为阴性。

使用属特异性引物组的LAMP在显微镜检为阳性的68份样品中的67个中检出疟疾寄生虫(灵敏度为98.5％)。在53个显微镜检阴性样品中，属特异性LAMP在3个样品中检出疟疾寄生虫(特异性为94.3％)。

LAMP检测为阳性而显微镜检为阴性的3份样品通过LAMP重新检测。

通过属特异性LAMP，所有3份样品再次呈阳性；一个诊断为恶性疟原虫，另两个被种特异性LAMP诊断为间日疟原虫。

由此推断LAMP比显微镜检更灵敏且能使假阴性诊断减至最小可能的程度，假阴性诊断可在临床上导致忽略。

所有12份经显微镜检为恶性疟原虫阳性的样品通过种特异性LAMP检测同样呈恶性疟原虫阳性。在34份显微镜检为间日疟原虫阳性的样品中，经过LAMP检测，有2份样品诊断为卵形疟原虫感染，1份为恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染。在12份三日疟原虫阳性的样品中，有1个样品诊断为卵形疟原虫，1份样品为三日疟原虫和间日疟原虫混合感染。

上述结果表明，本发明的发明人开发的新LAMP疟疾诊断方法比显微镜检具有更高的灵敏度和更好的特异性，并且是一个有利的检测四种人疟疾寄生虫的方法。

LAMP平均检测时间如下。

属特异性LAMP：25.7±4.9分钟(平均值±SD；19.4-52.9分钟)；

恶性疟原虫特异性LAMP：31.7±4.8分钟(25.8-44.9分钟)；

三日疟原虫特异性LAMP：30.6±5.2分钟(25.4-46.9分钟)；

间日疟原虫特异性LAMP：34.8±4.8分钟(30.5-46.6分钟)；和

卵形疟原虫特异性LAMP：36.1±6.8分钟(29.9-49.8分钟)。

这些结果显示LAMP可在显著短于套式PCR扩增时间的时间段内作出诊断。

实施例2

根据本发明用于检测疟原虫属和疟原虫属的种的引物组，和使用该引物组同时或分别检测或鉴定疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的方法，在疟疾流行的泰国西北部Mae Sod的疟疾诊所中，与PCR和显微镜检法进行比较测试。

在使用专为LAMP设计的设备进行的上述方法与通过可在疟疾流行区快速和便于运行的程序进行的上述方法之间也进行了比较。

使用了18份经显微镜检为疟疾寄生虫阳性的样品(寄生虫血症的百分比：0.04％-0.31％)；一份样品由于技术失误而从样品中提前排除。

根据本发明，使用煮沸方法来从患者样品中提取DNA用于疟疾流行区疟疾寄生虫的快速和简便检测和鉴定(可同时检测疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫)。具体地，将50μl蒸馏水(D.W.)加入50μl血样中，并且产生的混合物在90℃煮沸5分钟，随后进行离心(5415D，Eppendorf生产；16,000g)，以得到上清液。

然后，将2μl的上述获得的含DNA的上清液加入到23μl的反应混合物中，该反应混合物中含有1μl Bst DNA聚合酶(EpicentreBiotechnologies)、12.5μl 2x反应混合物、实施例1中得到的引物组中的1.6至2.4μM的FIP和BIP、实施例1中得到的引物组中的0.2μM的F3和B3c，和实施例1中得到的引物组中的0.8μM的LPF和LPB，并且在能够容纳96x 2(总共192)个试管的60℃恒温水浴(Thermominder SM-05R，TAITEC生产)中反应大约60分钟。

直接目视观察反应产物中是否产生混浊，以检测是否存在疟原虫属感染和鉴定恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫中的哪一种引起感染。

分别地，含有上述每个样品中提取的DNA的反应混合物在60℃下反应大约60分钟，使用Loopamp实时浊度计(LA-320C，EikenChemical Co.，Ltd.生产)实时监测反应产物的形成。

进一步地，为了与PCR比较疟疾种类的诊断，对相同样品进行套式PCR。由于PCR反应需要严格的条件，在使用通过煮沸方法从临床样品中获得的DNA时，可能会抑制PCR反应。因此，将疟疾诊所获得的滤纸上的干燥血液送至曼谷一个装备良好的实验室，使用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit，QIAGEN生产)来提取DNA并进行PCR。在套式PCR中，两轮PCR各进行2小时，总共4个小时。然后，获得的样品进行琼脂糖凝胶电泳并且用荧光染色，检测总共进行5小时。

作为结果，在18份经显微镜检为疟疾寄生虫阳性的样品中，在使用疟原虫属引物检测是否存在疟原虫属感染时，当使用特别为LAMP设计的Loopamp实时浊度计检测时，18份为阳性，并且当在恒温水浴中反应随后进行目视观察时，这18份同样为阳性。两个试验的结果100％吻合。

表1比较了显微镜检、套式PCR和使用疟原虫种特异性引物诊断疟疾种的LAMP的试验结果；以及使用特别为LAMP设计的扩增仪的结果，以及在恒温水浴中反应后目视观察的结果。

表1

如表1中所示，对于恶性疟原虫，只有3个样品进行PCR。在该表中，Pf表示恶性疟原虫，Pv表示间日疟原虫，Po表示卵形疟原虫。

结果，在一份经显微镜检诊断为间日疟原虫和卵形疟原虫双重感染的样品中，PCR和LAMP(两个试验都使用特别为LAMP设计的扩增仪，该试验在恒温水浴中反应后采用目视观察)均检测到间日疟原虫，但没有检测到卵形疟原虫，表明显微镜检诊断是错误的。

也就是说，在比较试验中，18份LAMP反应结果中有17份与显微镜检结果一致(一致性为94％)。这意味着如果上述这一个与显微镜检结果不一致的反应结果被排除的话，LAMP反应结果与显微镜检结果100％一致。这些结果揭示，根据本发明的用于检测疟原虫属和疟原虫种的引物组，和使用这些引物分别或同时检测或鉴定疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的方法，在检测和鉴定疟原虫寄生虫感染方面与显微镜检诊断100％一致；以及使用特别为LAMP设计的扩增仪的检测结果与在恒温水浴中反应后目视观察的结果100％一致。在疟疾种的诊断中，引物组和方法100％一致，并且达到与PCR相等的灵敏度。

这证明了，对于根据本发明的用于检测疟原虫属和疟原虫种的引物组，和使用该引物组分别或同时检测或鉴定疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的方法，特别是在疟疾流行区，可通过快速、简便和便宜的煮沸法来提取DNA，并且可使用恒温水浴来进行DNA扩增反应，使得能以低廉的价格处理大量样品。

根据本发明的用于检测疟原虫属和疟原虫种的引物组，和使用该引物组分别或同时检测或鉴定疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的方法，与显微镜检相比可更快速和容易地应用，且具有与PCR相等的灵敏度。因此，该引物组和方法可有利地现场应用，尤其是在疟疾流行区，用于大量样品中疟原虫属和种的快速和简便的同时检测和鉴定诊断。

实施例3

根据本发明，基于短期内从疟疾流行区现场(在诊所内)获得的试验结果，基于存储于“治疗指导数据库”中的疟疾治疗剂信息中关于疟疾治疗剂和其优先级的信息，可以给实施例2中被诊断和鉴定为恶性疟原虫感染的五名患者开具甲氟喹和青蒿琥酯进行给药。同样，给13名被诊断和鉴定为间日疟原虫感染的患者开具氯喹和伯氨喹进行给药。因此，在疟疾流行区，可以运行抗疟疾措施支持系统，该系统能够快速和可靠地检测是否存在疟原虫属寄生虫感染且提供疟疾治疗。

实施例4

如上所述，疟原虫属的简便和容易的检测(尤其是，是否存在混合感染)在疟疾流行区是十分重要的。

本发明的发明人对能够检测疟原虫属的种的引物进行了进一步的研究。

结果，发明人发现两种对间日疟原虫诊断有用的引物组(Pv-7和Pv-9；Pv-7由SEQ ID NO：37至42表示，Pv-9由SEQ ID NO：31至36表示)能够更快速地诊断间日疟原虫。

当使用这两个引物组时，已经证明这些引物组与恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的DNA都不发生反应。

与先前发现的用于间日疟原虫诊断的引物组(31分钟)相比，使用对间日疟原虫诊断有用的这两个引物组(Pv-7和Pv-9)获得了更快的诊断(Pv-7：27分钟；Pv-9：24分钟)。尤其是，使用Pv-9引物组获得了最快的诊断。

本发明进一步提供下述发明：

1A.一种用于检测疟原虫属的引物组，其包含含有SEQ ID NO：1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域。

2A.一种用于检测间日疟原虫的引物组，其包含含有SEQ IDNO：13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

3A.一种用于检测三日疟原虫的引物组，其包含含有SEQ IDNO：19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

4A.一种用于检测卵形疟原虫的引物组，其包含含有SEQ IDNO：25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

5A.一种用于检测疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的引物组，其包含含有权利要求1A至4A中所述的核酸序列和SEQ ID NO：7至12表示的核酸序列中的任一核酸序列的寡核苷酸引物组，该引物组能够扩增疟原虫属以及疟原虫属的各个种的18S rRNA基因序列的特定区域，包括恶性疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域。

6A.一种用于检测标本中存在的疟原虫属的方法，其中该方法针对疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域，且包括通过LAMP使用权利要求1A的引物组选择性地扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域，和确定扩增产物的有无。

7A.一种用于检测标本中存在的间日疟原虫的方法，其中该方法针对间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域，且包括通过LAMP使用权利要求2A的引物组选择性地扩增间日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域，和确定扩增产物的有无。

8A.一种用于检测标本中存在的三日疟原虫的方法，其中该方法针对三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域，且包括通过LAMP使用权利要求3A的引物组扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域，和确定扩增产物的有无。

9A.一种用于检测标本中存在的卵形疟原虫的方法，其中该方法针对卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域，且包括通过LAMP使用权利要求4A的引物组选择性地扩增卵形疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域，和确定扩增产物的有无。

10A.一种用于检测标本中存在的疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的方法，其中该方法针对疟原虫属18S rRNA基因序列、恶性疟原虫18S rRNA基因序列、间日疟原虫18S rRNA基因序列、三日疟原虫18S rRNA基因序列、或卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域；并且其中该方法包括通过LAMP使用权利要求5A的引物组选择性地分别扩增疟原虫属18SrRNA基因序列、恶性疟原虫18S rRNA基因序列、间日疟原虫18SrRNA基因序列、三日疟原虫18S rRNA基因序列、或卵形疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域；和确定扩增产物的有无。

11A.一种根据权利要求10A的检测方法，其中同时或分别检测疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫。

12A.一种用于鉴定疟原虫属的方法，其包括从标本中分离DNA样品，使用权利要求1A的引物组进行从DNA样品中LAMP扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域，及确定扩增产物的有无。

13A.一种用于鉴定间日疟原虫的方法，其包括从标本中分离DNA样品，使用权利要求2A的引物组进行从DNA样品中LAMP扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域，及确定扩增产物的有无。

14A.一种用于鉴定三日疟原虫的方法，其包括从标本中分离DNA样品，使用权利要求3A的引物组进行从DNA样品中LAMP扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域，及确定扩增产物的有无。

15A.一种用于鉴定卵形疟原虫的方法，其包括从标本中分离DNA样品，使用权利要求4A的引物组进行从DNA样品中LAMP扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域，及确定扩增产物的有无。

16A.一种用于鉴定疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的方法，其包括从标本中分离DNA样品，使用权利要求5A的引物组进行从DNA样品中LAMP扩增原虫属18SrRNA基因序列、恶性疟原虫18S rRNA基因序列、间日疟原虫18SrRNA基因序列、三日疟原虫18S rRNA基因序列、或卵形疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域，及确定扩增产物的有无。

17A.根据权利要求16A的鉴定方法，其中同时或分别进行疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫中的任一种的鉴定。

18A.一种用于检测疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的检测试剂盒；其包含至少一种权利要求1A至5A中任一个的引物组、链置换DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。

19A.根据权利要求18A的检测试剂盒，其中该检测试剂盒同时或分别检测疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫。

20A.一种抗疟疾措施支持系统，包括：

公共卫生措施提取部分，该部分根据关于受试者中疟疾寄生虫的疟疾感染患者信息，从疟疾感染-预防公共卫生措施指导数据库中提取用于疟疾感染流行区的公共卫生措施及其优先级；和

21A.根据权利要求20A所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据权利要求1A所述的引物组和/或根据权利要求6A所述的检测方法，或根据权利要求19A所述的疟原虫属检测试剂盒，通过鉴定疟原虫属感染的存在与否，获得关于疟疾流行区的疟疾寄生虫的疟疾感染患者信息。

22A.一种抗疟疾措施支持系统，包括：

用于输入或存储疟疾治疗剂信息的装置，用于指定对疟原虫的四个种中的一种或多种的感染起作用的疟疾治疗剂；

23A.根据权利要求22A所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据权利要求2A至5A中任一项所述的引物组，和/或根据权利要求13A至17A中任一项所述的用于鉴定疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的方法，或根据权利要求18A或19A所述的检测试剂盒，通过鉴定疟原虫四个种中的一种或多种的感染，获得关于发热患者的疟疾感染病原体的信息。

24A.一种抗疟疾措施支持系统，其中涉及抗疟疾措施的公共卫生措施和涉及抗疟疾措施的疟原虫治疗措施组合进行；

公共卫生措施包括：

疟原虫治疗措施包括：

用于输入或存储疟原虫治疗剂信息的装置，用于指定对疟原虫四个种中的一种或几种的感染起作用的疟疾治疗剂；

治疗指导数据库，根据针对在标本中检测出的疟原虫的有效性指数，疟原虫治疗剂选择信息与指示应当优先选择哪种疟疾治疗剂来对抗疟原虫的优先级一起输入到该数据库中；

25A.根据权利要求24A所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据权利要求1A所述的引物组，和/或根据权利要求6A所述的检测方法，或根据权利要求19A所述的疟原虫属检测试剂盒，通过鉴定疟原虫属感染的存在与否，获得关于疟疾流行区的疟原虫的疟疾感染患者信息；和/或使用根据权利要求2A至5A中任一项所述的引物组，和/或根据权利要求13A至17A中任一项所述的用于鉴定疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的方法，或根据权利要求18A或19A所述的检测试剂盒，通过鉴定疟原虫四个种中的一种或多种的感染，获得关于发热患者的疟疾感染病原体的信息。

26A.一种用于计划到疟疾流行区旅行的个人的疟疾感染-预防措施系统，该系统包括：

用于从根据权利要求24A所述的抗疟疾措施支持系统中获得疟疾流行区公共卫生措施的实施状态、关于该流行区的疟疾感染病原体的信息和感染患者的治疗状态的装置；

用于在旅行前施用选择的药物的装置。

27A.一种用于疟疾流行区返回者的疟疾感染-预防/治疗措施系统，该系统包括：

用于获得疟疾流行区的公共卫生措施实施状态、关于该流行区的疟疾感染病原体的信息和感染患者的治疗状态的装置；

用于在从疟疾流行区返回后根据第24项施用选择的药物的装置。

28A.根据权利要求27A所述的疟疾感染-预防/治疗措施系统，其中，当疟疾流行区返回者发热时，进行恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的鉴定，以选择和施用应当优先选择的疟疾治疗剂。

工业实用性

本发明的发明人研发的使用LAMP检测/鉴定疟原虫属和疟原虫属的四个种的方法比显微镜检具有更高的灵敏度和更高的特异性，且与PCR相比能够在较短时间内更容易地检测/鉴定标本中的疟原虫属寄生虫。进一步地，因为该方法价格低廉，其对于设施较差的疟疾流行区的疟疾临床诊断和防治活动是十分有益的。也可以使用该方法构建一个新的抗疟疾措施支持系统(图3)。

序列表自由文本

比较了疟原虫属的四个种的18S rRNA序列：恶性疟原虫(GenBank登记号M19172)、间日疟原虫(GenBank登记号U03079或X13926)、三日疟原虫(GenBank登记号M54897)和卵形疟原虫(GenBank登记号L48987)。

序列表

<110>EHIME UNIVERSITY，OTSUKA PHARMACEUTICAL CO.，LTD.

<120>用于检测疟原虫的引物

<130>P08-38

<150>丂JP2007-140525

<151>丂2007-05-28

<160>42

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测疟原虫属的引物(F3)

<400>1

gtatcaatcg agtttctgac c 21

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测疟原虫属的引物(B3c)

<400>2

cttgtcacta cctctcttct 20

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测疟原虫属的引物(FIP(F1c-F2))

<400>3

tcgaactcta attccccgtt acctatcagc ttttgatgtt agggt 45

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测疟原虫属的引物(BIP(B1-B2c))

<400>4

cggagaggga gcctgagaaa tagaattggg taatttacgc g 41

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测疟原虫属的引物(LPF)

<400>5

cgtcatagcc atgttaggcc 20

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测疟原虫属的引物(LPB)

<400>6

agctaccaca tctaaggaag gcag 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测恶性疟原虫的引物(F3)

<400>7

tgtaattgga atgataggaa ttta 24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测恶性疟原虫的引物(B3c)

<400>8

gaaaacctta ttttgaacaa agc 23

<210>9

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测恶性疟原虫的引物(FIP(F1c-F2))

<400>9

agctggaatt accgcggctg ggttcctaga gaaacaattg g 41

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测恶性疟原虫的引物(BIP(B1-B2c))

<400>10

tgttgcagtt aaaacgttcg tagcccaaac cagtttaaat gaaac 45

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测恶性疟原虫的引物(LPF)

<400>11

gcaccagact tgccct 16

<210>12

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测恶性疟原虫的引物(LPB)

<400>12

ttgaatatta aagaa 15

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(F3)

<400>13

ggaatgatgg gaatttaaaa cct 23

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(B3c)

<400>14

acgaagtatc agttatgtgg at 22

<210>15

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(FIP(F1c-F2))

<400>15

ctattggagc tggaattacc gctcccaaaa ctcaattgga gg 42

<210>16

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(BIP(B1-B2c))

<400>16

aattgttgca gttaaaacgc tcgtaagcta gaagcgttgc t 41

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(LPF)

<400>17

gctgctggca ccagactt 18

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(LPB)

<400>18

agttgaattt caaagaatcg 20

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测三日疟原虫的引物(F3)

<400>19

caaggccaaa ttttggtt 18

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测三日疟原虫的引物(B3c)

<400>20

cggttattct taacgtaca 19

<210>21

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测三日疟原虫的引物(FIP(F1c-F2))

<400>21

tattggagct ggaattaccg cgatgatggg aatttaaaac ct 42

<210>22

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测三日疟原虫的引物(BIP(B1-B2c))

<400>22

aattgttgca gttaaaacgc ctatgttata aatatacaaa gcatt 45

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测三日疟原虫的引物(LPF)

<400>23

gccctccaat tgccttctg 19

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测三日疟原虫的引物(LPB)

<400>24

tcgtagttga atttcaagga atca 24

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测卵形疟原虫的引物(F3)

<400>25

ggaatgatgg gaatttaaaa cc 22

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测卵形疟原虫的引物(B3c)

<400>26

gaatgcaaag aacagatacg t 21

<210>27

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测卵形疟原虫的引物(FIP(F1c-F2))

<400>27

tattggagct ggaattaccg cgttcccaaa attcaattgg agg 43

<210>28

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测卵形疟原虫的引物(BIP(B1-B2c))

<400>28

gttgcagtta aaacgctcgt agtgtattgt ctaagcatct tatagca 47

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测卵形疟原虫的引物(LPF)

<400>29

tgctggcacc agacttgc 18

<210>30

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测卵形疟原虫的引物(LPB)

<400>30

tgaatttcaa agaatcaa 18

<210>31

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvFIP-9(F1c+F2))

<400>31

cgctattgga gctggaatac tcaattggag ggc 33

<210>32

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvBIP-9(B1+B2c))

<400>32

aattgttgca gttaaaacga ttaagctaga agcgttgct 39

<210>33

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvF3-9)

<400>33

tttaaaacct tcccaa 16

<210>34

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvB3c-9)

<400>34

aagtatcagt tatgtgg 17

<210>35

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvLPF-9)

<400>35

gctggcacca gactt 15

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvLPB-9)

<400>36

ctcgtagttg aatttcaaag 20

<210>37

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvFIP-7(F1c+F2))

<400>37

ctggaattac cgcggctcct tcccaaaact ca 32

<210>38

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvBIP-7(B1+B2c))

<400>38

ccaatagcgt atattaaaat tgttgctaga agcgttgct 39

<210>39

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvF3-7)

<400>39

tggaatgatg ggaatt 16

<210>40

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvB3c-7)

<400>40

gtatcagtta tgtggatt 18

<210>41

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvLPF-7)

<400>41

accagacttg ccctccaat 19

<210>42

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测间日疟原虫的引物(PvLPB-7)

<400>42

gcagttaaaa cgctcgtagt tga 23

Claims

1.一种检测或鉴定标本中疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染的方法；该方法包括以下步骤(a)至(c)：

a)从标本中提取DNA；

2.根据权利要求1所述的检测或鉴定方法，其中从标本中提取DNA是通过煮沸含有该DNA的标本并进行离心来完成的。

3.根据权利要求2所述的检测或鉴定方法，其中煮沸时间是从数分钟至十数分钟。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测或鉴定方法，其中，在扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域的步骤(b)中，使用恒温水浴或特别为LAMP设计的扩增仪，在大约60℃下进行所述DNA扩增反应大约1小时。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测或鉴定方法，其中，在步骤(C)中，利用目视观察或实时浊度计检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的扩增产物的存在与否。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测或鉴定方法，其在疟疾流行区进行。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中同时或分别检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中使用一个引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定疟原虫属的感染，该引物组包含含有SEQ ID NO：1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中使用用于检测间日疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定间日疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ ID NO：13至18、SEQ ID NO：31至36或SEQ ID NO：37至42表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中使用用于检测三日疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定三日疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ ID NO：19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中使用用于检测卵形疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定卵形疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ ID NO：25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

12.一种用于检测疟原虫属的引物组，其包含含有SEQ ID NO：1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增疟原虫属18SrRNA基因序列的特定区域。

13.一种用于检测间日疟原虫的引物组，其包含含有SEQ ID NO：13至18、SEQ ID NO：31至36或SEQ ID NO：37至42表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

14.一种用于检测三日疟原虫的引物组，其包含含有SEQ ID NO：19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

15.一种用于检测卵形疟原虫的引物组，其包含含有SEQ ID NO：25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

16.一种用于检测疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的任一种的引物组，其包含含有选自权利要求12至15中所述的核酸序列和SEQ ID NO：7至12表示的核酸序列的核酸序列的寡核苷酸引物组，该引物组能够扩增疟原虫属以及疟原虫属的各个种的18S rRNA基因序列的特定区域，包括恶性疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。

17.一种用于疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的任一种的检测试剂盒，其包含选自权利要求12至16所述的引物组的至少一个引物组、链置换DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。

18.根据权利要求17所述的检测试剂盒，其中该试剂盒同时或分别检测疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫。

19.一种抗疟疾措施支持系统，包括：

20.根据权利要求19所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据权利要求1所述的检测或鉴定方法和/或根据权利要求12所述的引物组，或根据权利要求17所述的疟原虫属检测试剂盒，通过鉴定疟原虫属感染的存在与否，获得关于疟疾流行区的疟原虫的疟疾感染患者信息。

21.一种抗疟疾措施支持系统，包括：

22.根据权利要求21所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据权利要求1至11中任一项所述的检测或鉴定方法，和/或根据权利要求12至16中任一项所述的引物组，或根据权利要求17或18所述的检测试剂盒，通过鉴定四种疟原虫中的一种或多种的感染，获得关于发热患者的疟疾感染病原体的信息。

23.一种抗疟疾措施支持系统，其中涉及抗疟疾措施的公共卫生措施和涉及抗疟疾措施的疟原虫治疗措施组合进行；

公共卫生措施包括：

疟原虫治疗措施包括：

24.根据权利要求23所述的抗疟疾措施支持系统，其中使用根据权利要求1所述的检测或鉴定方法，和/或根据权利要求12所述的引物组，或根据权利要求17或18所述的疟原虫属检测试剂盒，通过鉴定疟原虫属感染的存在与否，获得关于疟疾流行区的疟疾寄生虫的疟疾感染患者信息；和/或使用根据权利要求1至11中任一项所述的检测或鉴定方法，和/或根据权利要求16所述的引物组，或根据权利要求17或18所述的疟原虫属种检测试剂盒，通过鉴定四种疟原虫中的一种或多种的感染，获得关于发热患者的疟疾感染病原体的信息。

25.一种用于计划到疟疾流行区旅行的个人的疟疾感染-预防措施系统，该系统包括：

用于从根据权利要求23所述的抗疟疾措施支持系统中获得疟疾流行区公共卫生措施的实施状态、关于该疟疾流行区的疟疾感染病原体的信息和感染患者的治疗状态的装置；

用于在旅行前施用选择的药物的装置。

26.一种用于疟疾流行区返回者的疟疾感染-预防/治疗措施系统，该系统包括：

27.根据权利要求26所述的疟疾感染-预防/治疗措施系统，其中，当疟疾流行区返回者发热时，进行恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的鉴定，以选择和施用应当优先选择的疟疾治疗剂。