KR20030032081A

KR20030032081A - 열대열말라리아와 삼일열말라리아의 동시 검출방법

Info

Publication number: KR20030032081A
Application number: KR1020010062247A
Authority: KR
Inventors: 고원규; 정준용
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2001-10-09
Publication date: 2003-04-26
Also published as: KR100451398B1

Abstract

본 발명은 열대열말라리아(Plasmodium falciparum)와 삼일열말라리아(Plasmodium vivax)의 18s rRNA 유전자에 동시에 특이적이고 민감하게 반응하는 프라이머를 찾아내고, 이들 프라이머를 이용하여 1 회의 멀티플렉스(One-shot multiplex) 중합효소연쇄반응(PCR)으로 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 빠르고 정확하게 검출하는 방법과 키트에 관한 것이다.

본 발명에 의해, 말라리아의 종별 검출을 위한 단계가 생략되고, 검사자의 숙련도에 관계없이 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 신속하고 정확하게 검출하는 방법과 키트가 제공된다.

Description

열대열말라리아와 삼일열말라리아의 동시 검출방법{THE SIMULTANEOUS DETECTING METHOD OF PLASMODIUM FALCIPARUM AND PLASMODIUM VIVAX}

여기서, 멀티플렉스는 한 반응 튜브내에 1쌍 이상의 프라이머를 사용한다는 의미이다.

말라리아는 포자충강(Sporozoa)의 플라스모디움(Plasmodium) 속에 속하는 원충이 적혈구나 간 세포 내에 일으키는 질병으로, 세계적으로 매년 2 ∼ 3억 명의 환자가 발생하여 그 중 약 2백만 명이 사망하는 보건상 매우 중요한 질병이다.

현재까지 인체에 말라리아를 발병시키는 것으로 알려져 있는 것은 열대열말라리아, 삼일열말라리아, 사일열말라리아(Plasmodium malariae), 난형말라리아(Plasmodium ovale) 4 종으로, 이들은 임상 증상도 매우 다양하며, 각각의 종에 따라 치료제를 달리 사용하여야 한다(참조 ; Snounou et al., Mol Biochem Parasitol 58:283-292, 1993).

이들 중에 열대열말라리아와 삼일열말라리아가 말라리아 환자의 대부분을 차지하여 임상적으로 매우 중요하므로, 말라리아 환자 치료시 열대열말라리아와 삼일열말라리아의 빠르고 정확한 검출이 요구되고 있다.

말라리아 검출에 사용되고 있는 전통적인 방법인 말초혈액도말법은 혈액도말을 짐사(Giemsa)나 와이트(Wight) 염색한 후 현미경으로 관찰하는 방법으로, 믿을만한 말라리아 검출법이지만 많은 시간과 노력이 요구되는 동시에 오랜 경험과 숙련을 필요로 하는 단점이 있다.

이와 같은 단점을 보완하기 위하여, 간접면역형광항체법(indirect fluoresence assay; IFTA), 효소면역법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), DNA나 RNA 탐침자(probe)를 이용한 교잡(hybridization)반응 방법 등이 개발되고 있으나, 이들 방법에는 특수한 장비가 필요하고 과정이 복잡한 단점이 있다.

한편, 딥스틱(dipstick)을 이용하여 말라리아 감염자 혈액에서 말라리아의 항원을 빠른 시간 내에 검출하는 신속검사(rapid diagnostic test; RDT)가 개발되었지만, 열대열말라리아를 대상으로 개발되었기 때문에 삼일열말라리아와 열대열말라리아의 감별 검출에 적용하기에는 낮은 특이도와 민감도가 문제된다.

한국특허출원10-1998-0039111(말라리아의 검출방법)에는 삼일열말라리아의 더피(Duffy) 혈액형부착표면단백질을 코딩하는 유전자를 이용한 말라리아의 검출방법이, 한국특허출원 10-1999-0050616 (삼일열말라리아원충 분열소체막단백질의 DNA 서열)에는 분열소체막단백질의 유전자 서열을 이용한 검출방법이 공지되어 있으나,삼일열말라리아와 열대열말라리아의 종별 동시 검출용으로 사용하기에는 문제점이 있다.

또한, 종래의 중합효소연쇄반응법은 1 회 반응으로 말라리아의 감염 여부를 확인한 다음, 2 회 반응으로 감염 종을 알아내야 하기 때문에 시간과 비용이 많이 드는 단점이 있으며, 아직까지 1 회 중합효소연쇄반응으로 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 빠르고 정확하게 검출하는 방법은 보고된 바 없다.

본 발명은 검사자의 숙련도에 관계없이 단기간에 동시에 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 정확하게 검출하기 위한 프라이머와 검출방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 열대열말라리아와 삼일열말라리아의 18s rRNA 유전자에 동시에 민감하고 특이적으로 반응하는 프라이머를 제작한 부위

도 2는 열대열말라리아 및 삼일열말라리아에 대한 본 발명의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응의 민감도를 나타내는 결과

도 3은 본 발명의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응으로 발견할 수 있는 18s rRNA의 유전자 수를 나타내는 결과

도 4는 본 발명의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응은 열대열말라리아 및 삼일열말라리아에 대하여 교차반응 및 경쟁적 반응이 없다는 결과

도 5는 열대열말라리아 및 삼일열말라리아의 중복감염을 확인한 결과

도 6은 본 발명의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 검사와 기존의 말초혈액도말 검사와의 비교 분석 결과

도 7은 열대열말라리아의 18s rRNA 유전자 절편을 도입한 플라스미드 pGEMPf18 의 구조도

도 8은 삼일열말라리아의 18s rRNA 유전자 절편을 도입한 플라스미드pGEMPv18 의 구조도

본 발명은 열대열말라리아(Plasmodium falciparum)와 삼일열말라리아(Plasmodium vivax)의 18s rRNA 유전자에 동시에 특이적이고 민감하게 반응하는 프라이머를 찾아내고, 이 들 프라이머를 이용하여 1 회의 멀티플렉스(One-shot multiplex) 중합효소연쇄반응(PCR)으로 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 빠르고 정확하게 검출하는 방법과 키트에 관한 것이다.

18s rRNA를 코딩하는 유전자는 말라리아의 미토콘드리아내에 존재하며, 말라리아 원충 1 마리 당 15 ~ 20 개의 미토콘드리아가 존재한다(참조 : Preiser etal., EMBO J 15 : 684-693, 1996).

열대열말라리아와 삼일열말라리아의 18s rRNA를 코딩하는 유전자를 미국 NIH(National Institute of Health)의 유전자은행(Genbank)에서, 열대열말라리아(Genbank No. M19172) 및 삼일열말라리아(Genbank No. U03079)에서 찾아냈다.

유전자 서열을 비교 분석하여 두 종간에 유사성이 높은 부위에 공통인 프라이머를 찾아낸 다음, 일부 서열을 치환하여 프라이머를 제작하였다.

제작된 프라이머를 이용하여 많은 실험을 실시하여, 각각의 종에 특이적이며 민감한 프라이머를 표 1과 같이 찾아냈다.

이들 프라이머 서열들 중 센스 서열 1개와 안티센스 서열 1 개 또는 2 개를 사용하고, 말라리아 환자 혈액에서 분리된 DNA를 주형으로 사용하여 1 회의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 실시하여 말라리아의 종별 검출을 한다.

또한, 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 산물인 열대열말라리아의 18s rRNA의 유전자 1451 bp와 삼일열말라리아의 18s rRNA의 유전자 833 bp를 벡터에 클로닝하여 콘트롤(Control)로 사용한다.

또한, 본 발명의 프라이머와 중합효소 및 완충액을 포함하는, 열대열말라리아와 삼일열말라리아 동시 검출 키트를 제작하여 사용한다.

본 발명의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응은 혈액 1 ㎕에 0.1 마리의 원충만 있어도 확인이 가능한 민감도를 보이며, 본 발명의 프라이머들은 열대열말라리아 및 삼일열말라리아 각각에 대하여 특이적으로 반응하며, 두 종 간에 교차 반응 및경쟁반응은 없다.

또한, 본 발명의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응은, 기존의 말초혈액도말 검사에서 확인 할 수 없었던 열대열말라리아와 삼일열말라리아의 중복감염 검출에도 유용하다.

이하, 실시예와 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 열대열말라리아와 삼일열말라리아에 동시에 민감하고 특이적으로 반응하는 프라이머의 제작

미국 NIH(National Institutes of Health)의 유전자정보은행(Genbank)에서 열대열말라리아(Genbank No. M19172)와 삼일열말라리아(Genbank No. U03079)의 18s rRNA을 암호화하는 유전자 서열을 찾아냈다.

열대열말라리아와 삼일열말라리아의 18s rRNA 유전자의 속 특이적(genus-specific)인 부위에서 센스(forward)프라이머를 찾아내고 종 특이적(species-specific)인 부위에서 각 종에 대한 안티센스(revers)프라이머를 찾아내고, 일부서열을 치환하여 표 1과 같이 프라이머를 제작하였다.

프라이머의 제작부위는 도 1 에 나타냈다.

< 표 1 > 제작된 프라이머

서열번호	명 칭	유전자 서열	가 닥
1	MUF1	5'-TCAGCTTTTGATGTTAGGGTATT-3'	센스
2	MUF2	5,-CTATCAGCTTTTGATGTTAG-3'	센스
3	MUF3	5'-CTATCAGCTTTTGATGTTAGG-3'	센스
4	MUF4	5'-TATCAGCTTTTGATGTTAGG-3'	센스
5	MUF5	5'-TATCAGCTTTTGATGTTAGGG-3'	센스
6	MUF6	5'-ATCAGCTTTTGATGTTAGGG-3'	센스
7	MUF7	5'-ATCAGCTTTTGATGTTAGGGT-3'	센스
8	MUF8	5'-TCAGCTTTTGATGTTAGGGT-3'	센스
9	MUF9	5'-TCAGCTTTTGATGTTAGGGTA-3'	센스
10	MUF10	5'-CAGCTTTTGATGTTAGGGTA-3'	센스
11	MUF11	5'-CAGCTTTTGATGTTAGGGTAT-3'	센스
12	MUF12	5'-AGCTTTTGATGTTAGGGTAT-3'	센스
13	MUF13	5'-AGCTTTTGATGTTAGGGTATT-3'	센스
14	MUF14	5'-GCTTTTGATGTTAGGGTATT-3'	센스
15	MUF15	5'-GCTTTTGATGTTAGGGTATTG-3'	센스
16	MUF16	5'-CTTTTGATGTTAGGGTATTG-3'	센스
17	MUF17	5'-CTTTTGATGTTAGGGTATTGG-3'	센스
18	PVR1	5'-TAAACTCCGAAGAGAAAATTCT-3'	안티센스
19	PVR2	5'-GAATAAACTCCGAAGAGAAA-3'	안티센스
20	PVR3	5'-GAATAAACTCCGAAGAGAAAA-3'	안티센스
21	PVR4	5'-AATAAACTCCGAAGAGAAAA-3'	안티센스
22	PVR5	5'-AATAAACTCCGAAGAGAAAAT-3'	안티센스
23	PVR6	5'-ATAAACTCCGAAGAGAAAAT-3'	안티센스
24	PVR7	5'-ATAAACTCCGAAGAGAAAATT-3'	안티센스
25	PVR8	5'-TAAACTCCGAAGAGAAAATT-3'	안티센스
26	PVR9	5'-TAAACTCCGAAGAGAAAATTC-3'	안티센스
27	PVR10	5'-AAACTCCGAAGAGAAAATTC-3'	안티센스
28	PVR11	5'-AAACTCCGAAGAGAAAATTCT-3'	안티센스
29	PFR1	5'-GCATCAAAGATACAAATATAAGC-3'	안티센스
30	PFR2	5'-AATATAAGCATCAAAGATAC-3'	안티센스
31	PFR3	5'-AATATAAGCATCAAAGATACA-3'	안티센스
32	PFR4	5'-ATATAAGCATCAAAGATACA-3'	안티센스
33	PFR5	5'-ATATAAGCATCAAAGATACAA-3'	안티센스
34	PFR6	5'-TATAAGCATCAAAGATACAA-3'	안티센스
35	PFR7	5'-TATAAGCATCAAAGATACAAA-3'	안티센스
36	PFR8	5'-ATAAGCATCAAAGATACAAA-3'	안티센스
37	PFR9	5'-ATAAGCATCAAAGATACAAAT-3'	안티센스
38	PFR10	5'-TAAGCATCAAAGATACAAAT-3'	안티센스
39	PFR11	5'-TAAGCATCAAAGATACAAATA-3'	안티센스
40	PFR12	5'-AAGCATCAAAGATACAAATA-3'	안티센스
41	PFR13	5'-AAGCATCAAAGATACAAATAT-3'	안티센스
42	PFR14	5'-AGCATCAAAGATACAAATAT-3'	안티센스
43	PFR15	5'-AGCATCAAAGATACAAATATA-3'	안티센스
44	PFR16	5'-GCATCAAAGATACAAATATA-3'	안티센스
45	PFR17	5'-GCATCAAAGATACAAATATAA-3'	안티센스
46	PFR18	5'-CATCAAAGATACAAATATAA-3'	안티센스
47	PFR19	5'-CATCAAAGATACAAATATAAG-3'	안티센스
48	PFR20	5'-ATCAAAGATACAAATATAAG-3'	안티센스
49	PFR21	5'-ATCAAAGATACAAATATAAGC-3'	안티센스

표 1 과 같이 센스 프라이머로 MUF1(서열번호 1)부터 MUF17(서열번호 17)까지 17 개를, 안티센스로 PVR1(서열번호 18)부터 PVR11(서열번호 28)까지 11 개를, 또 하나의 안티센스로 PFR1(서열번호 29)부터 PFR21(서열번호 49)까지 21 개를 제작하였다.

< 실시예 2 > 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 실시

열대열말라리아 및 삼일열말라리아 환자의 혈액 100 ㎕로 부터 QIAamp DNA blood 키트 (Qiagen Co., USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다.

추출된 DNA 2 ㎕에 1.6 ㎕ dNTP (2.5 mM), 2 ㎕ 10 X PCR 완충액 (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2, 1 ㎎/㎖ BSA), 1 ㎕ 센스 프라이머(MUF1 ; 서열번호1)(0.1 ㎍/㎕), 0.5 ㎕ 씩 두 종류(PVR1 ; 서열번호 18, PFR1 ; 서열번호 29)의 안티센스 프라이머 (0.05 ㎍/㎕), 12.3 ㎕ D.W. (증류수), 0.1 ㎕ 택(Taq) 폴리머라제 (5 U/㎖)를 94 ℃에서 45 초, 57 ℃에서 45 초, 72 ℃에서 45 초의 주기로 연쇄반응을 35 회 수행하였다.

중합효소연쇄반응 산물 중 4 ㎕을 1 % 아가로스 젤 상에서 전기영동을 실시하여 UV 상에서 확인하였다.

그 다음 아가로스 젤로부터 QIAEX Ⅱ kit(Qiagen Co., Valencia, CA, USA)를 이용하여 증폭된 DNA를 추출하였다.

< 실시예 3 > 증폭된 DNA의 염기서열 분석

실시예 2에서 증폭된 DNA의 염기서열을 자동분석기로 분석하였다.

그 결과 열대열말라리아에서 1451 bp의 서열을 얻었고, 분석된 서열은 서열번호 50에 나타냈다.

삼일열말라리아에서는 833 bp를 얻었고, 분석된 서열은 서열번호 51 로 나타냈다.

< 실험예 1 > 멀티플렉스 중합효소연쇄반응의 민감도 확인

열대열말라리아 및 삼일열말라리아 환자의 혈액을 채취한 다음, 정상인의 혈액으로 10 배 연속 희석하여, 혈액 1 ㎕에 0.01 마리가 되도록 시료를 만들었다.

준비된 시료를 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로, DNA를 추출하고 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 실시하고, 그 결과를 도 2에 나타냈다.

도 2 위에 숫자는 혈액 1 ㎕ 당 감염된 말라리아 원충 수 이다.

도 2 에서와 같이, 두 종류의 말라리아에 대하여 혈액 1 ㎕에 0.1 마리만 있어도 확인되어 매우 높은 민감도를 보였다.

< 실험예 2 > 멀티플렉스 중합효소연쇄반응으로 확인 가능한 유전자수의 검증

열대열말라리아 및 삼일열말라리아의 DNA 로부터 증폭된 DNA 각각을 T4 DNA 라이게이즈(Progamega Co., Madison, WI, USA)를 이용하여 16 ℃에서 16 시간 반응하여 pGEM-T-easy 벡터(Promega Co., Madison, WI, USA)의 삽입 위치(cloning site)에 접합하였다.

이 벡터는 상업적으로 판매하는 제품으로, 삽입 위치 부분에 T overhang 이 붙어 있어서, 택(Taq) 폴리머라제를 이용한 중합효소연쇄반응의 산물이 자동으로 접합하는 특징을 갖고있다.

열대열말라리아의 18s rRNA를 암호화하는 유전자가 클로닝된 플라스미드를 pGEMPf18 이라 명명하고(도 7 참조), 삼일열말라리아의 18s rRNA를 암호화하는 유전자가 클로닝된 플라스미드를 pGEMPv18 이라 명명하였다(도 8 참조).

각 플라스미드를 10배 연속 희석한 다음, 이것을 주형으로 이용하여 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 실시하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3 위의 숫자는 18s rRNA를 암호화하는 유전자 수 이다.

도 3과 같이 열대열말라리아 및 삼일열말라리아 각각에 대하여 4 개의 플라스미드만 있어도 반응이 일어나는 것이 확인되었다.

18s rRNA를 암호화하는 유전자는 미토콘드리아내에 존재하며, 열원충 1마리 당 약 15 ∼ 20개의 미토콘드리아가 존재하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 하는 튜브 내에 열대열말라리아 또는 삼일열말라리아 원충이 한 마리만 있어도 확인이 가능하다.

< 실험예 3 > 멀티플렉스 중합효소연쇄반응의 특이도 검증

동일한 원충 수가 감염된 열대열말라리아 환자의 혈액과 삼일열말라리아 환자의 혈액을 표 2와 같이 혼합하여 인위적으로 중복 감염된 시료를 제작하였다.

<표 2> 열대열말라리아와 삼일열말라리아 환자의 혈액 혼합비율

구 분	혈액 혼합비율(%)
열대열말라리아	100	75	50	25	0
삼일열말라리아	0	25	50	75	100

준비된 시료에서 실시예 2와 같은 방법으로, DNA를 추출하고 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 하고, 그 결과를 도 4에 나타냈다.

도 4에서와 같이 두 종간에 교차반응 및 경쟁반응은 없었으며, 두 종 각각에 대하여 매우 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다.

< 실험예 4 > 말초혈액도말 검사와 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 검사의 결과 비교분석

열대열말라리아 감염자 혈액 32개, 삼일열말라리아 감염자 혈액 178개, 및 정상인 혈액 60개의 시료에 대하여 말초혈액도말 검사와 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 검사를 하고, 그 결과를 도 5와 도 6에 나타냈다.

말초혈액도말 검사 결과와 멀티플렉스 중합효소반응 검사의 결과는 도 6에서와 같이 1개의 시료를 제외하고는 모두 일치하였으며, 말초혈액도말 검사에서 열대열말라리아로 진단되었던 시료 1 개가 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 검사에서는 중복감염으로 확인되었다.

이와 같이 말초혈액도말 검사로는 중복 감염을 확인할 수 없으나, 1 회의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 검사로 중복감염을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의해, 열대열말라리아(Plasmodium falciparum)와 삼일열말라리아(Plasmodium vivax)의 18s rRNA 유전자에 동시에 특이적이고 민감하게 반응하는 프라이머가 제공되고, 이들 프라이머를 이용하여 1 회의 멀티플렉스(One-shot multiplex) 중합효소연쇄반응(PCR)으로 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 빠르고 정확하게 검출하는 방법과 키트가 제공되며, 말라리아의 종별 검출을 위한 단계가 생략되고, 검사자의 숙련도에 관계없이 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

Claims

열대열말라리아와 삼일열말라리아의 18s rRNA를 암호화하는 유전자에 속 특이적인 센스 프라이머와 종 특이적인 안티센스 프라이머를 사용하여, 1 회의 멀티플렉스 중합효소연쇄반응으로 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 동시에 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 센스 프라이머는 서열번호 1 ~ 서열번호 17에서 선택된 하나이고, 안티센스 프라이머는 서열번호 18 ~ 서열번호 28에서 선택된 하나와, 서열번호 29 ~ 서열번호 49에서 선택된 하나인 것이 특징인, 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 동시에 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 센스 프라이머는 서열번호 1이고, 안티센스 프라이머는 서열번호 18과 서열번호 29 인 것이 특징인, 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 동시에 검출하는 방법.
열대열말라리아와 삼일열말라리아의 18s rRNA를 암호화하는 유전자에 동시에특이적인 프라이머와 중합효소 및 완충액을 포함하는 열대열말라리아와 삼일열말라리아를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응 키트.
열대열말라리아와 삼일열말라리아의 검출을 위한 프라이머로, 서열번호 1, 서열번호 18, 서열번호 29로 나타내는 올리고뉴클레오티드.
열대열말라리아의 18s rRNA를 암호화하는 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 열대열말라리아를 검출하는 방법.
제 6항에 있어서, 프라이머가 센스서열은 서열번호 1이고 안티센스 서열은 서열번호 29인 것이 특징인, 열대열말라리아를 검출하는 방법.
삼일열말라리아의 18s rRNA를 암호화하는 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 삼일열말라리아를 검출하는 방법.
제 8항에 있어서, 프라이머가 센스서열은 서열번호 1이고, 안티센스 서열은 서열번호 18 인 것이 특징인, 삼일열말라리아를 검출하는 방법.
열대열말라리아의 18s rRNA를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pGEMPf18
삼일열말라리아의 18s rRNA를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pGEMPv18