CN104673919A - 一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其包含五条特异性的引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。本发明还提供了采用上述的试剂盒鉴别疟原虫种类的方法，收集待检测的血液样品，提取总DNA；采用特异性的引物扩增DNA片段，将DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，比较PCR扩增产物，若出现一条268bp条带为恶性疟、446bp清晰的条带为三日疟、394bp清晰的条带为卵形疟，清晰的323 bp条带为间日疟原虫。本发明能够简便、快速的鉴别疟原虫的种类，对于疟疾的快速鉴定和控制具有十分重要的意义。

Description

一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及人体疟原虫，具体来说是一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法。
背景技术
随着社会和经济的发展，以及全球疟疾消除工作的不断推进，许多国家的疟疾发病率持续下降，并逐步转变为以输入性疟疾病例为主。在中国，自21世纪以来，本地疟疾病例逐年减少，分布范围逐渐从24个省市减少为2014年的仅云南和西藏2省，但输入性疟疾病例却在逐年增加，同时报告输入病例的省市也逐渐扩展到全国各地。由于疟疾不再是我国居民的常见传染性疾病，因此，许多医务工作者对该病及其病原体的辨识水平逐步下降，从事该方面的专业人员亦逐年呈下降趋势，特别是在疟原虫种类的鉴定方面，仅仅依靠疟疾诊断的金标准—镜检，往往不能满足实践的需求。因此，国家疟疾诊断参比实验室依据形势的变化和《中国消除疟疾行动计划(2010-2020年)》关于疟疾病例的实验室确诊率100％的要求，不断寻求在现场更切实可行且能够准确鉴定疟原虫的检测方法。在疟原虫的3种检测方法中，以PCR为基础的基因检测方法，在准确确定疟原虫虫种和检测多种疟原虫混合感染病例方面能够弥补RDT和镜检方法的不足，已在低疟区、无专业疟疾镜检人员的机构及疟疾病例的复核确认工作中被广泛推荐和应用。当前最为常用的PCR检测体系为Snounou设计的以核糖体RNA小亚基(SSU rRNA或18S rRNA)基因为分子标记的巢式PCR检测体系(NP-1993体系)，及其随后修改完成的NP-2002体系。二者在第一轮反应和第二轮反应中分别有1条属特异引物和种特异引物的序列不同。但这2种体系在检测疟原虫方面均存在各自的缺陷。一方面，二者第二轮扩增体系扩增的间日疟原虫目标片段长度(120bp)和三日疟原虫的(141bp)仅有21bp的差异，在凝胶电泳图上不宜于区分，因此第二轮反应不易于采用多重PCR反应体系开展疟疾病原体检测，只能采用单一种特异引物对，分4次分别扩增检测；另一方面，NP-1993体系不能检测卵形疟中的wallikeri亚种，而NP-2002体系虽能检测，但除三日疟和间日疟外，第二轮PCR扩增获得的卵形疟原虫目标片段长度(226bp)与恶性疟原虫的(205bp)也仅有21bp的差异。因此，本实验室借鉴蔡贤铮等(2001)的双重PCR检测方法中的上游引物，重新设计了4种疟原虫的种特异下游引物，并对改进的新体系进行了特异性和敏感性的应用评价，以解决当前疟疾诊断实践中存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法，所述的这种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法解决了现有技术中检测疟原虫的方法过于繁琐，不宜采用多重PCR一次反应进行检测以及不能鉴别卵形疟wallikeri亚种的技术问题。
本发明一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其包含五条特异性的引物，其碱基序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。
特异的引物序列为：
P1:5’-CGACGGTATCTGATCGTCTTC-3’；
P2：5’-TCATGATTGAGTTCATTGTGTTTG-3’；
P3：5’-TGCTTTGTATATTTATAACAAAGTTG-3’；
P4:5’-CAATACAACGTATCTGTTCTTTGC-3’；
P5:5’-TTTTAAGGACTTTCTTTGCTTCGG-3’。
进一步的，还含有聚合酶链式反应试剂、阳性对照和阴性对照，反应试剂含有10倍聚合酶链式反应缓沖液、灭菌的去离子水、四种脱氧核苷酸(每种脱氧核苷酸浓度为10mM)和Taq DNA聚合酶和属特异引物。
10倍聚合酶链式反应缓沖液包括如下成份：
Tris-HCl 100mM；
MgCl225mM。
属特异引物序列如下：
P6：5’-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3(SEQ ID NO:6)；
P7：5’-TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3’(SEQ ID NO:7)。
本发明还提供了采用上述的试剂盒鉴别疟原虫种类的方法，包括如下步骤：
1)收集待检测的血液样品，提取总DNA，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1μg/ml-0.4μg/ml；
2)采用特异性的引物扩增DNA片段，所述的特异性的引物的碱基序列分别如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示；
3)将扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，比较PCR扩增产物结果，如果DNA片段的大小为268bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有恶性疟虫，如果DNA片段的大小为446bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有三日疟虫，如果DNA片段的大小为394bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有卵形疟虫，如果DNA片段的大小为323bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有间日疟原虫，如果DNA片段不产生条带或者不能清晰的产生条带，说明该血液样品中不含有疟原虫。
进一步的，当提取的DNA浓度较低时，先用SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所述的引物进行首轮扩增后，再以其PCR扩增产物为模板DNA，应用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示特异引物进行扩增。
进一步的，取8μl或适量PCR产物进行电泳，使用50bp DNA ladder检测PCR片段大小。
应用DNAman软件对恶性疟、三日疟、卵形疟和间日疟原虫18S rDNA基因序列(登录号M19172、AF488000、L48987和X13926)进行了比较分析，应用Oligo6.0引物设计软件，于其保守区间的变异区设计引物序列，并初步评价和分析5条引物间可能产生的引物二聚体、发夹结构及Tm值等情况，从中选择出条件较好的引物序列备用和测试，依据所测试的引物及其扩增体系PCR扩增后获得的不同种类疟原虫的目标条带间差异是否明显和彼此易于区分，不同虫种的PCR产物条带是否单一、明晰、鲜亮，扩增体系和扩增条件是否较为稳定等，筛选出最好的引物序列(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5)和扩增体系。
本发明可解决以往判断疟疾患者和疟原虫种类时，不同种类疟原虫的PCR扩增条带大小相差太少(21bp)不宜应用多重PCR扩增区分的难题，以及不能鉴别卵形疟wallikeri亚种的缺陷。不同的血液样品通过总DNA的提取，对于疟疾和疟原虫种类用本方法均可以检测和鉴别出来，本方法既可以直接准确地鉴定原虫血症在600个/μl以上的疟疾患者体内疟原虫虫种(含卵形疟wallieri亚种)或者102-103copy/μl，甚至低至14个/μl或者18copy/μl的疟疾患者也能被准确检测。也可以作为第二轮反应体系，与NP-1993的第一轮体系搭配组成新的巢式PCR反应体系(M-Nest)，并可将多重PCR检测体系的检测敏感性再提高10-100倍(表1-2)。应用实践表明，M-Nest检测体系与NP-1993具有相同的敏感性(表3)。
本发明和现有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明能够简便、快速的鉴别疟原虫的种类，对于在实验室进行各种疟原虫的分类研究、疟疾的快速鉴定和控制具有十分重要的意义。
附图说明
图1是设计引物对4种人体疟原虫的多重PCR反应结果，M:50bp DNA Ladder；1:恶性疟原虫；2：三日疟原虫；3：卵形疟原虫；4：间日疟原虫；C：阴性对照。
具体实施方式
实施例1
1.临床采集的发热病人血液样品总DNA的提取，按常规方法进行，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1ug/ml-0.4ug/ml，
2.聚合酶链式反应：
(一)聚合酶链式反应以20ul为参考，各物品的用量分别为：
(二)PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件如下：
95℃预变性3min，然后按以下条件进行35个循环。
95℃预变性  30秒
59℃退火    40秒
72℃延伸    40秒；35个循环；
循环结束后，在72℃保持5分钟补齐，反应结束后在4℃保存。
(三)PCR反应的电泳监测：取上述反应液8μl与1.6μl载样缓冲液混合，用2％的琼脂糖进行电泳，EB染色，用凝胶成像系统进行紫外检测。
3.鉴定结果的判断：若出现一条268bp条带为恶性疟、446bp清晰的条带为三日疟、394bp清晰的条带为卵形疟，清晰的323bp条带为间日疟原虫，而非疟疾患者不能产生条带，或者不能产生清晰地条带。
实施例2
1.提取镜检阳性的临床恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟病例的样本总DNA，应用属特异引物P6和P7获得4种人疟原虫的18S rDNA部分序列，并制备和获得足量的质粒DNA，经DNA测序确定插入的DNA片段准确无误后，测定质粒DNA OD值，计算其Copy数浓度，并以10的倍数依次稀释，并应用本检测体系检测，直至检测结果呈阴性或为出现目的片段。
2.聚合酶链式反应：
(一)聚合酶链式反应以20ul为参考，各物品的用量分别为：
(二)PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件如下：
95℃预变性3min，然后按以下条件进行35个循环。
95℃预变性  30秒
59℃退火    40秒
72℃延伸    40秒；35个循环；
循环结束后，在72℃保持5分钟补齐，反应结束后在4℃保存。
(三)PCR反应的电泳监测和结果判断：取每次反应液8μl与1.6μl载样缓冲液混合，用2％的琼脂糖进行电泳，EB染色，用凝胶成像系统进行紫外检测。若电泳结果出现一条268bp条带为恶性疟、446bp清晰的条带为三日疟、394bp清晰的条带为卵形疟，清晰的323bp条带为间日疟原虫，而非疟疾患者不能产生条带，或者不能产生清晰地条带。
(四)检测体系敏感性判定
应用本体系扩增，能够出现预期目的片段的质粒DNA浓度，即判定为本体系的最低检测浓度(表1)。
表1 改进检测体系对不同疟原虫18S rDNA质粒模板的最低检测浓度
实施例3
1.收集镜检阳性的临床恶性疟和间日疟病例的样本，根据世卫组织规定的疟原虫密度计算公式：
样本原虫密度＝(原虫数/白细胞数)×8000个白细胞
计数并计算患者的原虫密度。
同时提取血液样本的总DNA，用与血液样本相同体积的DNA溶解液溶解DNA，以实施例2中的质粒DNA为标准品，测定血液样本DNA中疟原虫的copy数浓度，然后以10的倍数依次稀释，一方面应用本检测体系检测，直至检测结果呈阴性或未出现目的片段，即1轮扩增；同时以不同稀释倍数的样本DNA为模板，先用P6和P7属特异引物进行首轮扩增后，再以PCR扩增产物为模板DNA，应用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示特异引物进行扩增，直至检测结果呈阴性或未出现目的片段，即2轮扩增或M-Nest体系扩增。
2.聚合酶链式反应：
(一)聚合酶链式反应以20ul为参考，各物品的用量分别为：
M-Nest属特异引物(P6和P7)PCR反应体系：
本发明的PCR反应体系或M-Nest第二轮反应体系：
*1论扩增时DNA模板用1μl，2轮扩增时DNA模板用2ul。
(二)PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件如下：
M-Nest属特异引物(P6和P7)PCR扩增反应条件：
95℃预变性3min，然后按以下条件进行35个循环。
95℃预变性  30秒
59℃退火    40秒
72℃延伸    1秒；35个循环；
循环结束后，在72℃保持5分钟补齐，反应结束后在4℃保存。
本发明的PCR扩增或M-Nest第二轮的扩增条件：
95℃预变性3min，然后按以下条件进行35个循环。
95℃预变性  30秒
59℃退火    40秒
72℃延伸    40秒；35个循环；
循环结束后，在72℃保持5分钟补齐，反应结束后在4℃保存。
(三)PCR反应的电泳监测和结果判断：取每次反应液8μl与1.6μl载样缓冲液混合，用2％的琼脂糖进行电泳，EB染色，用凝胶成像系统进行紫外检测。若电泳结果出现一条268bp条带为恶性疟、446bp清晰的条带为三日疟、394bp清晰的条带为卵形疟，清晰的323bp条带为间日疟原虫，而非疟疾患者不能产生条带，或者不能产生清晰地条带。
(四)检测体系敏感性判定
应用本体系扩增，能够出现预期目的片段的质粒DNA浓度，即判定为本体系的最低检测浓度(表2)。
表2 对现场恶性疟和间日疟样本的检测敏感性测定
实施例4
1.提取307份西非返乡无临床症状人员血液样本DNA，镜检阳性的临床恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟病例的样本总DNA，应用M-Nest和NP-1993体系分别对其进行扩增检测。
2.聚合酶链式反应体系和条件
M-Nest体系的反应体系和条件参照实施例3，NP-1993体系的反应体系和条件参照参考相关文献。
(三)PCR反应的电泳监测和结果判断：取每次反应液8μl与1.6μl载样缓冲液混合，用2％的琼脂糖进行电泳，EB染色，用凝胶成像系统进行紫外检测。M-Nest体系的结果判断参照实施例3，NP-1993体系的结果判断参照相关文献(表3)。
表3 不同巢式PCR检测体系对返乡人员的疟疾筛查结果
需要指出的是，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的认识能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：包含五条特异性的引物，其碱基序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：还含有聚合酶链式反应试剂、Taq DNA聚合酶、属特异引物、阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求2所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述的属特异引物的序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求2所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述的聚合酶链式反应试剂中含有10倍聚合酶链式反应缓沖液、灭菌的去离子水、四种脱氧核苷酸，四种脱氧核苷酸的浓度均为 10mM。
5.根据权利要求3所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述的10倍聚合酶链式反应缓沖液包括如下成份：
Tris-HCl  100 mM；
MgCl2       25 mM。
6.采用权利要求1所述的试剂盒鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)收集待检测的血液样品，提取总DNA，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1μg/ml-0.4μg/ml；
2)采用特异性的引物扩增DNA片段，所述的特异性的引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示；
3)将扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，比较PCR扩增产物结果，如果DNA片段的大小为268 bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有恶性疟原虫，如果DNA片段的大小为446bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有三日疟原虫，如果DNA片段的大小为394bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有卵形疟原虫，如果DNA片段的大小为323bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有间日疟原虫，如果DNA片段不产生条带或者不能清晰的产生条带，说明该血液样品中不含有疟原虫。
7.根据权利要求6所述的鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于：当提取的DNA浓度较低时，先用SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所述的引物进行首轮扩增后，再以其PCR扩增产物为模板DNA，应用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示特异引物进行扩增。
8.根据权利要求6所述的鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于：取8μl PCR产物进行电泳，使用50bp DNA ladder 检测PCR片段大小。
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