CN113130000B - 一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法 - Google Patents

一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，包括以下步骤：建立疟原虫感染红细胞不同时期虫体对青蒿素作用不同时间的反应效果的单细胞测序后的降维展示的UMAP图；将候选疟原虫基因定位于UMAP图，根据其定位，推测其作为青蒿素靶基因的可能性，如果其分布与感染18小时虫体分布达到90％以上重叠，可推测其作为青蒿素靶基因的可能性较大，如果其分布与感染18小时的虫体分布区有60‑90％重叠，则推测其可能存在一定靶向关系，但较弱，作为青蒿素靶基因；如果其分布与感染18小时虫体分布60％以下重叠，则推定认为该候选疟原虫基因与青蒿素没有靶向关系，不能作为青蒿素靶基因。本发明仅需要选四个时间点，已可以提供足够所需信息。本发明为药物抗疟机制研究和新药开发奠定基础。

Description

一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法
技术领域
本发明属于生命医学科学领域，尤其是涉及一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法。
背景技术
随着青蒿素抗疟机制研究的深入，揭示出的靶基因和靶过程越来越多，如pfTCTP、pfATP6、pfPI3K以及heme激活的青蒿素随机修饰的蛋白等等。尽管在青蒿素作用下，这些潜在的靶基因或靶蛋白表达或分子结构会发生改变，但很难分清楚这种改变是“首发效应”，还是药物作用后的“继发效应”。研究已表明，疟原虫不同发育阶段对青蒿素类药物的敏感性不同。然而目前缺少对于快速高效进行青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，以方便确定青蒿素作用靶点和评估基因在青蒿素抗疟中的作用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，包括以下步骤：
建立疟原虫感染红细胞不同时期虫体对青蒿素作用不同时间的反应效果的单细胞测序后的降维展示的UMAP图；
将候选疟原虫基因定位于UMAP图，根据其定位，推测其作为青蒿素靶基因的可能性，如果其分布与感染18小时虫体分布达到90％以上重叠，可推测其作为青蒿素靶基因的可能性较大，如果其分布与感染18小时的虫体分布区有60-90％重叠，则推测其可能存在一定靶向关系，但较弱，作为青蒿素靶基因；如果其分布与感染18小时虫体分布60％以下重叠，则推定认为该候选疟原虫基因与青蒿素没有靶向关系，不能作为青蒿素靶基因。
在本发明的一个实施方式中，所述可能性较大是指其作为青蒿素靶基因的概率大于60％。
所述可能存在一定靶向关系，但较弱是指候选疟原虫基因作为青蒿素靶基因的概率为1％-60％之间。
该候选疟原虫基因与青蒿素没有靶向关系是指选疟原虫基因作为青蒿素靶基因的概率小于1％。
在本发明的一个实施方式中，建立疟原虫感染红细胞6h、12h、18h、24h、36h和42h不同时期虫体对青蒿素作用不同时间0h、3h、9h和24h的反应效果的单细胞测序后的降维展示的UMAP图。
在本发明的一个实施方式中，建立疟原虫感染红细胞不同时期虫体对青蒿素作用不同时间的反应效果的单细胞测序后的降维展示的UMAP图的方法包括以下步骤：
1)疟原虫感染小鼠模型建立；
2)在疟原虫感染小鼠的虫体收获期收获虫体：
3)利用流式分选仪分选纯化疟原虫；
4)单细胞测序分析；
5)各期marker genes的选择参见下表：
Figure BDA0002987069030000021
对于疟原虫Plasmodium yoelii，选用表1各感染期对映的标记基因，对于其它疟原虫种类，可通过此表找出对应同源基因即可；
6)根据分析结果，做出UMAP图。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中疟原虫感染小鼠模型建立的方式包括：
一，利用带荧光标记的疟原虫株感染小鼠，便于通过流式分选仪分选纯化疟原虫；或，
二，用不带荧光标记疟原虫感染小鼠，通过荧光染料染色后，利用流式分选仪分选纯化疟原虫。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中在疟原虫感染小鼠的虫体收获期收获虫体包括：
(1)疟原虫发育早期形态较多的混合群；(2)疟原虫发育后期形态较多的混合群；(3)疟原虫发育早期和疟原虫发育后期虫体形态数量相当的混合群；
这三个收获期会决定单细胞测序后UMAP图的图形，但不会改变各期对药物的敏感性。
在本发明的一个实施方式中，步骤3)中利用流式分选仪分选纯化疟原虫的过程中，收获细胞时，收集液中要保持一定量的胎牛血清，一旦缺失，严重影响收集细胞的数量；优选地，保证血清终浓度在10％以下。
在本发明的一个实施方式中，步骤4)中单细胞测序分析为成熟的技术，采用现有技术手段即可完成。
步骤6)做出UMAP图以后，即构建了个青蒿素抗疟作用靶基因的筛选平台。
通过研究表明，感染18小时的虫体对药物更敏感，超出其它阶段。为此，本发明通过单细胞测序，系统分析了虫体侵入或感染红细胞6h、12h、18h、24h、36h和42h等不同阶段虫体对青蒿素作用不同时间0h、3h、9h和24h的反应效果，以单细胞分析后得出的降维展示的UMAP图方式呈现。候选靶基因只需在此图进行定位，如果分布于药物敏感期，即可推定其为潜在药靶。否则，该基因或其产物不太可能是药物首发效应对象。
由于目前所提出的药物作用靶基因较多，难有标准加以区分，特别是，有的蛋白是药物直接作用靶点，而另一些则是间接或次生作用产生的效应。仔细区分这些差异将有助于认清药物作用机制和研发新药。
与现有技术相比，本发明仅需要选四个时间点，已可以提供足够所需信息。使用时，仅需要提供所研究基因名称或ID，公司会将该基因定位于UMAP图中。观察该定位在敏感或非敏感虫中的分布，即可推测其是否与药物存在联系。该平台可高通量、快速筛选潜在药物作用靶基因。本发明为药物抗疟机制研究和新药开发奠定基础。
附图说明
图1：通过单细胞测序分析疟原虫不同红细胞感染期对青蒿素不同作用时间的敏感性分析的UMAP图。
图2：Ribonucleoside-diphosphate reductase large subunit(PY17X_0614100)的UMAP分析图。
图3：DNA polymerase epsilon catalytic subunit A(PY17X_1130600)的UMAP分析图。
图4：Glutathione synthetase(PY17X_1112900)的UMAP分析图。
图5：Superoxide dismutase[Fe](PY17X_1424700)的UMAP分析图。
具体实施方式
以下提供一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，包括以下步骤：
1)用疟原虫感染小鼠，常用疟原虫Plasmodium yoelii感染ICR或Bal/c小鼠。可通过荧光标记的疟原虫株或者荧光染料使疟原虫带上荧光以便后期分选。
2)疟原虫感染小鼠感染率达到25％-45％时，从尾静脉收取50-200微升虫体，转入含有5毫升1640培养液的流式分选仪专用收集管。混匀后，置冰上备用。上机后，通过流式分选仪分选出至少15-20万疟原虫细胞。
3)分选后的细胞收获于收集管中，管中收集液一定要保持一定量的胎牛血清，一般保证收集后，血清终浓度在10％以下。过高影响后续分析，一旦缺失，严重影响收集细胞的数量和质量。
4)单细胞测序分析为常规操作。在实施本发明技术方案的过程中可根据需求委托当前任何有资质公司完成。
5)单细胞测序一般上样5000-10000个感染疟原虫的红细胞，分析所得的UMAP图的图形会随着样品变化而变化，但不会改变各期对药物的敏感性。
6)通过各期marker genes(表1)的表达特点，可以将单细胞测序分析所得不同cluster归属不同的感染期。如图1。
表1各期marker genes的选择
Figure BDA0002987069030000041
Figure BDA0002987069030000051
完成构建疟原虫感染红细胞6h、12h、18h、24h、36h和42h不同时期虫体对青蒿素作用不同时间0h、3h、9h和24h的单细胞测序降维展示的UMAP图。
7)青蒿素作用时间也可以选得更密集，如0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h等，但成本过高。本平台仅选四个时间点，已可以提供足够所需信息。
8)使用时，仅需要提供所研究基因名称或ID，公司会将该基因定位于图1中。观察该定位在敏感或非敏感虫中的分布，即可推测其是否与药物存在联系。该平台可高通量、快速筛选潜在药物作用靶基因。本发明为药物抗疟机制研究和新药开发奠定基础。
图1表明：不同感染期虫体对青蒿素敏感程度不同。从感染9小时可见，感染红细胞18小时虫体对药物最敏感，感染24小时、36小时和42小时的虫体依次减弱。感染12小时或更早的虫体对药物不敏感。
将候选基因定位于图1，根据其定位，推测其作为青蒿素靶基因的可能性，即待研疟原虫基因是否为潜在青蒿素靶基因，可将该基因投射入UMAP图，即分析该基因表达虫体在UMAP图中的分布特点，根据其定位，推测其作为青蒿素靶基因的可能性，如果其分布与感染18小时虫体分布达到90％以上重叠，可推测其作为青蒿素靶基因的可能性较大，如果其分布与感染18小时的虫体分布区有60-90％重叠，则推测其可能存在一定靶向关系，但较弱，作为青蒿素靶基因；如果其分布与感染18小时虫体分布60％以下重叠，则推定认为该候选疟原虫基因与青蒿素没有靶向关系，不能作为青蒿素靶基因。所述可能性较大是指其作为青蒿素靶基因的概率大于60％。所述可能存在一定靶向关系，但较弱是指候选疟原虫基因作为青蒿素靶基因的概率为1％-60％之间。该候选疟原虫基因与青蒿素没有靶向关系是指选疟原虫基因作为青蒿素靶基因的概率小于1％。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
使用本发明以上实施方式中记载的方法后，Ribonucleoside-diphosphatereductase large subunit(PY17X_0614100)的UMAP分析图见图2。表达该基因的虫体分布与18小时虫体分布高度相关，提示该基因与药物作用高度相关。
实施例2
使用本发明以上实施方式中记载的方法后，DNA polymerase epsilon catalyticsubunit A(PY17X_1130600)的UMAP分析图见图3。表达该基因的虫体分布与18小时虫体分布高度相关，提示该基因与药物作用高度相关。
实施例3
使用本发明以上实施方式中记载的方法后，Glutathione synthetase(PY17X_1112900)的UMAP分析图见图4。表达该基因的虫体分布与感染18小时等虫体分布不同，提示该基因与药物作用相关性不强。
实施例4
使用本发明以上实施方式中记载的方法后，Superoxide dismutase[Fe](PY17X_1424700)的UMAP分析图见图5。表达该基因的虫体分布与感染18小时等虫体分布不同，提示该基因与药物作用相关性不强。
总之，从上图分析可见，与图1比较，与疟原虫感染18小时虫体分布相似的实施例1和实施例2都可能是潜在药物作用靶点，而实施例3和实施例4，则不太可能是药物作用的首先蛋白。
由于目前所提出的药物作用靶基因较多，难有标准加以区分，特别是，有的蛋白是药物直接作用靶点，而另一些则是间接或次生作用产生的效应。仔细区分这些差异将有助于认清药物作用机制和研发新药。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
建立疟原虫感染红细胞不同时期虫体对青蒿素作用不同时间的反应效果的单细胞测序后的降维展示的UMAP图；
将候选疟原虫基因定位于UMAP图，根据其定位，推测其作为青蒿素靶基因的可能性；
如果其分布与感染18小时虫体分布达到90％以上重叠，不包括90％，可推测其作为青蒿素靶基因的可能性较大，
如果其分布与感染18小时的虫体分布区有60-90％重叠，包括60％以及90％，则推测其可能存在一定靶向关系，但较弱，作为青蒿素靶基因；
如果其分布与感染18小时虫体分布60％以下重叠，不包括60％，则推定认为该候选疟原虫基因与青蒿素没有靶向关系，不能作为青蒿素靶基因；
所述可能性较大是指其作为青蒿素靶基因的概率大于60％；
所述可能存在一定靶向关系，但较弱是指候选疟原虫基因作为青蒿素靶基因的概率为1％-60％之间；
该候选疟原虫基因与青蒿素没有靶向关系是指选疟原虫基因作为青蒿素靶基因的概率小于1％。
2.根据权利要求1所述的一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，其特征在于，所述建立疟原虫感染红细胞6h、12h、18h、24h、36h和42h不同时期虫体对青蒿素作用不同时间0h、3h、9h和24h的反应效果的单细胞测序后的降维展示的UMAP图。
3.根据权利要求1所述的一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，其特征在于，建立疟原虫感染红细胞不同时期虫体对青蒿素作用不同时间的反应效果的单细胞测序后的降维展示的UMAP图的方法包括以下步骤：
1)疟原虫感染小鼠模型建立；
2)在疟原虫感染小鼠的虫体收获期收获虫体：
3)利用流式分选仪分选纯化疟原虫；
4)单细胞测序分析；
5)各期marker genes的选择参见下表：
Figure FDA0003721034950000021
对于疟原虫Plasmodium yoelii，选用表1各感染期对映的标记基因，对于其它疟原虫种类，可通过此表找出对应同源基因即可；
6)根据分析结果，做出UMAP图。
4.根据权利要求3所述的一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，其特征在于，步骤1)中疟原虫感染小鼠模型建立的方式包括：
利用带荧光标记的疟原虫株感染小鼠；或，
用不带荧光标记疟原虫感染小鼠，通过荧光染料染色后，利用流式分选仪分选纯化疟原虫。
5.根据权利要求3所述的一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，其特征在于，步骤2)中在疟原虫感染小鼠的虫体收获期收获虫体包括：(1)疟原虫早期较多的混合群；(2)疟原虫发育后期较多的混合群；(3)疟原虫发育早期和疟原虫发育后期虫体数量相当的混合群。
6.根据权利要求3所述的一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，其特征在于，步骤3)中利用流式分选仪分选纯化疟原虫的过程中，收获细胞时，收集液中要保持一定量的胎牛血清。
7.根据权利要求6所述的一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法，其特征在于，步骤3)中利用流式分选仪分选纯化疟原虫的过程中，收获细胞时，保证血清终浓度在10％以下。
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