CN115058388A - 间充质干细胞创面修复优势功能亚群及其鉴定和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞创面修复优势功能亚群(Hr‑MSC)及其鉴定和应用。所述间充质干细胞创面修复优势功能亚群具有包括CD29、CD142和CYR61的标志物组合。本发明的创面修复优势功能亚群能够高效促进创面(包括各类急性创面、慢性难愈性创面等)愈合，可用于加速临床各类急慢性创面的愈合，在创面愈合的各个阶段予以干预，以期达到加快创面无瘢痕愈合目标；并且为干细胞创新药物的研发提供充分的数据支撑及技术支持，加速干细胞创新药物的临床应用，有利于定制化开发缩短病程、提高创面愈合质量的“干细胞创新药物”，最终建立科学合理的干细胞应用标准体系。

Description

间充质干细胞创面修复优势功能亚群及其鉴定和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种间充质干细胞创面修复优势功能亚群及其鉴定和应用。
背景技术
人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUCMSC)是理想的种子细胞之一，其在组织损伤修复领域已展现出良好的应用前景。然而，回顾诸多研究发现，干细胞治疗效果存在着不同程度的差异性，植入效率以及整合率均较低，究其根本是因为间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)功能变异和细胞异质性。
单细胞转录组测序技术可实现单个细胞内的基因重现，对于发现细胞异质性、揭示细胞功能、阐述各组间关系(across-omes)以及建立完整图谱等方面具有重大的意义。
单细胞多组学ATAC+GEX(Assay for transposase-accessible chromatin andgene expression)技术可在单个细胞内同时检测RNA和染色质可及性，更深入地表征不同谱系的细胞类型，捕获细胞异质性，结合表观遗传表达谱及基因表达谱推测分子调控网络的全貌，获得更真实、系统的分子变化信息，对于全景式解析脐带间充质干细胞时空异质性是一个全新方向。
流式细胞术(Flow cytometry，FCM)是一项发展迅速的生物医学分析技术，它是集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。流式细胞仪是应用流式细胞术建立起来的仪器装置。它使细胞或微粒在液流中流动，逐个通过一入射光束，并用高灵敏度检测器记录下散射光及各种荧光信号，从而得以对粒子进行多参数分析，包括诸如粒子形状和大小、细胞周期、细胞内细胞因子、细菌表面抗原、细胞DNA内含物等。FCM检测的粒子一般为活性细胞，通过激光光源激发细胞上所标记的荧光物质的强度和颜色以及散射光的强度可以得到细胞内部各种各样的生物信息。另外FCM还可进行细胞分选，可以根据所检测细胞的某种性质进行分选，并且如果分选的过程是在无菌条件下进行的，这些细胞还可以用来培养。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中用于创面修复的间充质干细胞修复效力不一致、重复性差、植入率低的缺陷，提供一种间充质干细胞创面修复优势功能细胞亚群及其鉴定和应用。本发明的创面修复优势功能细胞亚群具有相同的功能特性，重复性好，可用于加速创面的愈合。
发明人对间充质干细胞例如脐带间充质干细胞进行了异质性探讨和实验论证，采用单细胞多组学ATAC+GEX及空间转录组测序，应用单细胞多模态组学多维度全方位绘制出了脐带间充质干细胞异质性图谱，并结合发明人在临床实践以及创面修复中的研究成果，通过流式细胞分选技术最终筛选出与创面愈合相关的优势功能亚群，并对该亚群进行扩增、鉴定及在动物模型初步验证。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面提供一种创面修复优势功能细胞的标志物组合，所述标志物组合包括CD29、CD142和CYR61。
所述CD29也称ITGB1，所述CD142也称F3。
本发明一些实施方案中，所述标志物组合还包括选自以下一种或多种的标志物：DCN、TGFB1、COL3A1、COLIA2和COLIA1。
本发明一些实施方案中，所述标志物组合还包括以下标志物：DCN、TGFB1、COL3A1、COLIA2和COLIA1。
本发明一些较佳实施方案中，所述标志物组合还包括选自以下一种或多种的标志物：DCN、TGFB1、COL3A1、COLIA2、COLIA1、NEAT1、TMP1、GFBP4、SAT1、TGM2、LUM、SERPNF1、MXD4、FOS、ACTA2、HTRA3、HTRA1、PNRC1、APOE和CDKN1C。
本发明一些实施方案中，所述标志物组合还包括以下标志物：DCN、TGFB1、COL3A1、COLIA2、COLIA1、NEAT1、TMP1、GFBP4、SAT1、TGM2、LUM、SERPNF1、MXD4、FOS、ACTA2、HTRA3、HTRA1、PNRC1、APOE和CDKN1C。
本发明的第二方面提供一种分离的细胞亚群，所述细胞亚群表达如第一方面所述的标志物组合。
本发明一些实施方案中，所述细胞亚群中，所述标志物组合的阳性表达比例至少为90％。
较佳地，所述标志物组合的阳性表达比例至少为92％、至少为95％、至少为97％、至少为98％、至少为99％或至少为100％。
本发明的第三方面提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如第二方面所述的细胞亚群和药学上可接受的载体。
本发明一些实施方案中，所述组合物还包括治疗剂。
本发明一些较佳实施方案中，所述治疗剂选自免疫抑制剂、止痛剂和抗感染剂中的一种或多种。
本发明的第四方面提供一种如第一方面所述的标志物组合、如第二方面所述的细胞亚群或如第三方面所述的药物组合物在制备促进创面修复的制剂中的应用。
本发明的第五方面提供一种非诊断目的的创面修复优势功能细胞亚群的鉴定方法，所述方法包括：
(1)基于单细胞多模态组学技术对待测细胞进行分子分型，获得目标候选细胞亚群；
(2)对(1)中获得的目标候选细胞亚群进行特征基因展示和分选，获得包含特征基因的细胞亚群，所述细胞亚群即为创面修复优势功能细胞亚群；
所述特征基因表达如第一方面所述的标志物组合。
本发明中，所述非诊断目的是指：根据所述鉴定方法获得的创面修复优势功能细胞亚群并不能作为创面修复的单一临床指标；所述创面修复仍需要临床医疗人员的经验和专业分析判断，本发明的创面修复优势功能细胞亚群将是重要的参考指标。
本发明一些实施方案中，所述细胞亚群中，如第一方面所述的标志物组合的阳性表达比例至少为90％，例如至少为92％、至少为95％、至少为97％、至少为98％、至少为99％或至少为100％。
本发明一些实施方案中，所述单细胞多模态组学技术可为本领域常规，例如包括单细胞多组学技术例如ATAC+GEX技术。
本发明一些实施方案中，所述细胞为间充质干细胞；例如为脐带间充质干细胞。
本发明中，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞的创面修复优势功能亚群(Hr-MSC)，该概念为发明人所首次提出。
本发明一些实施方案中，所述(1)后包括(1-1)：通过空间转录组学获得所述目标候选细胞亚群的定位信息，所述定位信息包括富集情况、定位情况。
本发明的第六方面提供一种鉴定创面修复优势功能亚群细胞的系统，所述系统包括分型模块和基因展示模块；
其中，所述分型模块通过单细胞多模态组学技术对待测细胞进行分子分型，获得目标候选细胞亚群；所述基因展示模块对分型模块获得的目标候选细胞亚群进行特征基因展示和分选，获得表达特征基因的功能细胞，所述功能细胞即为创面修复优势功能亚群细胞；
所述特征基因包括/表达如第一方面所述的标志物组合。
本发明一些实施方案中，所述功能细胞亚群中，如第一方面所述的标志物组合的阳性表达比例至少为90％，例如至少为92％、至少为95％、至少为97％、至少为98％、至少为99％或至少为100％。
本发明的第七方面提供一种用于鉴定如第一方面所述的标志物组合、或者如第二方面所述的细胞亚群的试剂盒；
所述试剂盒包含检测如第一方面所述的标志物组合的表达水平的试剂。所述试剂例如用于检测标志物的蛋白表达水平的试剂，或用于检测标志物的基因或转录水平的试剂。
本发明一些实施方案中，所述试剂盒包含如第一方面所述的标志物组合。
本发明基于单细胞多模态组学的分群及特征基因展示结果，筛选具有促进创面愈合功能的优势功能亚群Hr-MSC。依据Marker基因在各亚群中的表达情况、各亚群功能富集情况、各亚群转录因子表达情况以及结合Cellmarker、PanglaoDB、EBI等数据库进行综合的初步筛选。其中，将单细胞多组学ATAC+GEX技术及空间转录组学技术应用于脐带华通胶间充质干细胞空间异质性的研究为本发明首创。所述初步筛选包括：定位：亚群Marker基因亚细胞定位及免疫荧光的组织定位；定量：横向比较亚群在不同代次、不同个体、不同性别的比例。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的创面修复优势功能亚群(Hr-MSC)能够高效促进创面(包括各类急性创面、慢性难愈性创面等)愈合，可用于加速临床各类急慢性创面的愈合，在创面愈合的各个阶段予以干预，以期达到加快创面无瘢痕愈合目标；并且为干细胞创新药物的研发提供充分的数据支撑及技术支持，加速干细胞创新药物的临床应用，有利于定制化开发缩短病程、提高创面愈合质量的“干细胞创新药物”，最终建立科学合理的干细胞应用标准体系。
附图说明
图1为脐带间充质干细胞分群结果示意图。
图2A～图2D为Hr-MSC的Marker基因的热图结果示意图。
图3A和图3B为Hr-MSC的Marker基因的表达水平示意图。
图4为脐带干细胞分群结果示意图。
图5为实施例6伤口愈合效率结果示意图。
图6为鉴定创面修复优势功能细胞亚群的系统21。其包括分型模块11与基因展示模块21。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1脐带干细胞分群
本实施例利用单细胞转录组学对脐带间充质干细胞进行测序分析，初步在单细胞水平将脐带干细胞分成不同亚群，利用生物信息学分析对各亚群进行功能注释，确定目标候选亚群。
1、样本来源：人脐带华通胶组织；
入组孕妇在孕期37-40周分娩，选取新生儿脐带进行实验，作后续P0、P3代脐带间充质干细胞组织来源，编号：PUM-A1-000152；
2、仪器：10×Chromium；
3、参数：
(1)每次运行提供8个通道，每个通道可以收集100～10000个细胞；
(2)细胞捕获效率～65％；
(3)测序结果中doublet比例为0.9％/1000个细胞；
(4)不对细胞大小设限。
4、利用Illumina NovaSeq测序平台进行测序并进行后续的数据分析：对原始测序数据提取barcode、UMI和RNA序列，选定人类参考基因组进行比对获取feature-barcode矩阵。后续分析如下：
①对数据进行基因数、UMI数及线粒体的过滤，使用sctransform构建基因表达正则化负二项模型进行数据归一化，然后进行PCA降维，根据碎石图确定PCA的个数；
②使用降维算法例如t-SNE、UMAP将测序方法得到的生信结果转化为生物学结果，确定不同个体、不同区域中细胞类型的异质性，并进行可视化，确定不同个体细胞类型的异质性，得到分型结果，获得亚群(cluster)；
③使用FindClusters函数对分群结果进行基因的差异表达分析，并采用不同形式展现亚群的特征性Marker基因，确定创面修复优势功能亚群(Hr-MCS)；
④对每个cluster的差异表达基因进行GO、KEGG富集、蛋白互作网络、转录因子注释等分析，得到Hr-MSC上调基因富集的参与创面愈合的信号通路。
如图1的A、B所示，脐带间充质干细胞具有有限异质性，初步确定不同个体、不同代次、不同性别细胞组成一致；不同个体、不同代次、不同性别细胞比例不同；不同个体、不同代次、不同性别细胞表达基因不同。
实施例2 Hr-MSC的Marker基因
本实施例针对实施例1获得的脐带干细胞各亚群的Marker基因制作基因表达热图，结果如图2A～图2D所示。
图2A～图2D中的Marker基因包括：UBE2C、TOP2A、CDK1、CENPF、KPNA2、CKS2、PLK1、HMGB2、AURKA、ARL6IP1、GTSE1、MKI67、ASPM、CENPE、NUSAP1、SGO2、AURKB、TPX2、UBE2S、SMC4、NEAT1、ACTA2、MXD4、TIMP1、LMCD1、TAGLN、DCN、IGFBP4、TGM2、PAPPA、ANGPTL4、COL8A1、KCNE4、INHBA、MEG3、SAT1、TUBA1A、CDKN1A、SELENOM、SAA1、CDC20、CCNB1、NCL、PNN、HSP90AA1、HSPA8、DDX21、SFPQ、SLBP、CCNB2、SRSF7、TUBB4B、ODC1、PTTG1、BIRC5、HIST1H4C、HIST1H1A、HIST1H1D、HIST1H1B、ANKRD1、CLSPN、CYR61、GINS2、PTX3、FEN1、MCM7、ATAD2、FBXO5、GMNN、PCNA、HIST1H1C、MCM3、HIST1H1E、TYMS、LUM、SERPINF1、HTRA3、COL3A1、FOS、PNRC1、HTRA1、APOE、TGFBI、COL1A2、CDKN1C、COL1A1、KRT18、GYPC、TK1、CENPX、GNG11、LSM4、S100A16、SRM、SNRPB、CDKN3、MYL9、PFN1、RRM2、RPS27L、EXOSC8、LRRC75A、SET、GOLGA4、DST、KPNB1、B4GALT1、FLNA、HNRNPH1、ANKRD11、ZFP36L1、HEG1、HDLBP、PEG10、ATP2B1、PAK2、CDV3、COL5A1、HBZ、NUDC、GAS6、SLC20A1、MALAT1、BOP1、SERBP1、LRRC59、HNRNPU、IL6ST、HNRNPA3、CAPN2、PFKP、EBNA1BP2、CTGF、HMGN2、TPM1、ACTB、CYCS、RBM8A、STMN1、TPM2、SMS、TMSB4X、ACTG1、FTL、SNRPG、MARCKSL1、RANBP1、HMOX1、SQSTM1、SLC3A2、GADD45A、NUPR1、DDIT3、FTH1、CXCL3、HLA-B、GDF15、TSC22D3、ZFAS1、CXCL1、S100A4、PPP1R15A、LGALS3、IL32、S100A10、KRT7、PDLIM1、CAV1、RTN4、TM4SF1、FAH、CRIP2、PDPN、CD9、SPON2、LMNA、PRSS23、S100A6、MAOA、CYBA、ABHD5、EZR、MT-ND3、FN1、MT-ND6、MT-ATP6、THBS1、MT-ND4、MT-ND1、MT-CYB、MT-ND2、SLC38A2、FBN1、COL4A1、COL5A2、RAB13、POSTN、LDHA、ACTG2、CTSC、COTL1、POLR3K、ANXA2、MT2A、PLAC9、NPW和TUBA1B。
各亚群分类及前4或前5的Marker基因如表1所示。
表1亚群分类及其Marker基因
Figure BDA0003546376940000071
实施例3 Hr-MSC的Marker基因的表达水平
对Hr-MSC的Marker基因测定表达水平，得到各亚群Marker基因种类及阳性表达比例大于等于90％的结果，如图3A和图3B所示。
以Marker基因DCN为例，进行结果分析：DCN在各亚群中均表达，但在第4亚群表达最高，其余各图、各基因分析同前。由此可知，Marker基因的表达水平具有差异。
实施例4鉴定创面修复优势功能细胞亚群的系统
本实施例提供了一种鉴定创面修复优势功能细胞亚群的系统21，如图6所示，其包括：分型模块11与基因展示模块21。
其中，分型模块11通过单细胞多模态组学技术对待测细胞进行分子分型，获得目标候选细胞亚群。
基因展示模块12对分型模块11获得的目标候选细胞亚群进行特征基因展示和分选，获得包含特征基因的细胞亚群，所得细胞亚群即为创面修复优势功能亚群细胞。
特征基因表达以下标志物组合中的一种或多种：
(1)CD29、CD142和CYR61；
(2)DCN、TGFB1、COL3A1、COLIA2和COLIA1；
(3)NEAT1、TMP1、GFBP4、SAT1、TGM2、LUM、SERPNF1、MXD4、FOS、ACTA2、HTRA3、HTRA1、PNRC1、APOE、和CDKN1C。
实施例5 Hr-MSC的分选
参照实施例1，本实施例利用单细胞转录组学测序分析，得到具有目标治疗功能的亚群的Marker基因，通过与流式细胞分选技术结合，将目标亚群从原代混合的脐带间充质干细胞中分选出，如图4所示，该亚群占总细胞的5.310％左右。通过流式细胞术标记阳性marker：CD29+、CD142+、CYR61+鉴定该亚群。此三个指标全阳性的目标亚群为P6，占总体干细胞比值为5.3％，为后续扩增目标亚群。
实施例6效果例
通过制造成年斑马鱼全层皮肤缺损，评估成年斑马鱼缺损创面不同给药(即下述分组)愈合时间即愈合效率进行有效性验证(例如参考Kennard Andrew S等，TheriotJulie A.(2021).Wounding Zebrafish Larval Epidermis by Laceration.Bio Protoc,11(24),e4260；Mhlongo Fikile等，Evaluation of the wound healing properties ofSouth African medicinal plants using zebrafish and in vitro bioassays.[J].JEthnopharmacol,2022,286:114867)。
分组一：CD29+、CD142+、CYR61+阳性干细胞亚群；
分组二：PBS组(对照)；
分组三：CD29-、CD142-、CYR61-阴性组。
本实施例初步验证了CD29+、CD142+、CYR61+阳性干细胞亚群组的愈合效率，与分组二及分组三有统计学差异，如图5所示。

Claims (10)

1.一种创面修复优势功能细胞的标志物组合，其特征在于，所述标志物组合包括CD29、CD142和CYR61。
2.如权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述标志物组合还包括选自以下一种或多种的标志物：DCN、TGFB1、COL3A1、COLIA2和COLIA1；
较佳地，所述标志物组合还包括选自以下一种或多种的标志物：NEAT1、TMP1、GFBP4、SAT1、TGM2、LUM、SERPNF1、MXD4、FOS、ACTA2、HTRA3、HTRA1、PNRC1、APOE、和CDKN1C。
3.一种分离的细胞亚群，其特征在于，所述细胞亚群表达如权利要求1或2所述的标志物组合；
较佳地，所述细胞亚群中，所述标志物组合的阳性表达比例至少为90％；
更佳地，所述标志物组合的阳性表达比例至少为92％、至少为95％、至少为97％、至少为98％、至少为99％或至少为100％。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求3所述的细胞亚群和药学上可接受的载体；
较佳地，所述药物组合物还包括治疗剂；
更佳地，所述治疗剂选自免疫抑制剂、止痛剂和抗感染剂中的一种或多种。
5.一种如权利要求1或2所述的标志物组合、如权利要求3所述的细胞亚群或如权利要求4所述的药物组合物在制备促进创面修复的制剂中的应用。
6.一种非诊断目的的创面修复优势功能细胞亚群的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)基于单细胞多模态组学技术对待测细胞进行分子分型，获得目标候选细胞亚群；
(2)对(1)中获得的目标候选细胞亚群进行特征基因展示和分选，获得包含特征基因的细胞亚群，所述细胞亚群即为创面修复优势功能细胞亚群；
所述特征基因表达如权利要求1或2所述的标志物组合。
7.如权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，所述细胞亚群中，如权利要求1或2所述的标志物组合的阳性表达比例至少为90％，例如至少为92％、至少为95％、至少为97％、至少为98％、至少为99％或至少为100％；
和/或，所述单细胞多模态组学技术包括单细胞多组学技术例如ATAC+GEX技术；
和/或，所述细胞为间充质干细胞；较佳地为脐带间充质干细胞。
8.如权利要求6或7所述的鉴定方法，其特征在于，所述(1)后包括(1-1)：通过空间转录组学获得所述目标候选细胞亚群的定位信息，所述定位信息包括富集情况、定位情况。
9.一种鉴定创面修复优势功能细胞亚群的系统，其特征在于，所述系统包括分型模块和基因展示模块；
其中，所述分型模块通过单细胞多模态组学技术对待测细胞进行分子分型，获得目标候选细胞亚群；所述基因展示模块对分型模块获得的目标候选细胞亚群进行特征基因展示和分选，获得包含特征基因的细胞亚群，所述细胞亚群即为创面修复优势功能亚群细胞；
所述特征基因表达如权利要求1或2所述的标志物组合；
较佳地，所述功能细胞亚群中，如权利要求1或2所述的标志物组合的阳性表达比例至少为90％，例如至少为92％、至少为95％、至少为97％、至少为98％、至少为99％或至少为100％。
10.一种用于鉴定如权利要求1或2所述的标志物组合、或者如权利要求3所述的细胞亚群的试剂盒；
所述试剂盒包含检测如权利要求1或2所述的标志物组合的表达水平的试剂；
较佳地，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的标志物组合。
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