CN103698311A - 一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法，包括以下步骤：运用色散型共聚焦拉曼光谱仪进行分析，选择激发拉曼光谱，将精子细胞置反射光镜下中，通过一定的激发功率和曝光时间可采集到精子细胞的化学基团光谱。分别对精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域重复扫描三次，即可获得拉曼数据谱峰，分析其波形变化和位移；最后将采集到的精子形态的拉曼光谱，应用RRUFF拉曼数据库检索，得到精子形态各区域的拉曼光谱。本发明优点在于：本发明采用的激光拉曼光谱为一种非侵入性技术，它不需要任何染料和固定也能反映出每条精子不同个体超微结构、不同成分的散射物质的特性，对精子形态学分析提供了一个新的评估方法。

Description

一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法

技术领域

本发明涉及一种精子形态与结构分析方法，具体地说，是一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法。

背景技术

目前全世界约有20％育龄夫妇患有不孕症，不孕症中男性原因占50％左右，而在男性不育症中约60％以上原因为少、弱精子症，究其原因尚不完全清楚。目前许多医院的临床医师，还是依赖实验室的常规精液分析指标，选择临床治疗方案。尽管常规精液分析的应用具有悠久的历史，但许多医疗单位至今仍然在使用人工显微镜分析技术；灰度计算机分析精液技术（CASA，Computer-aided sperm analysis）分析方法在临床上虽已经广泛应用多年；而相差显微镜的CASA 分析方法因为仪器价格较贵，在医院推广仍很有限。因此精液分析是评价成年男子生育能力和不育症治疗效果的重要手段之一，是常规检测项目，也是存在问题最多的不育评估项目之一。

最新出版的WHO5（2011年2月）提出的严格精子形态学分析方法标准，使男性精子的形态正常比例标准降到了4%。对于人类，用显微镜检查分析精子复杂的形态学过程并不是非常有效，会产生各种异常的和功能不完善的精子。重要的是，研究者要分析引起这些缺陷的原因及其对生育可能造成的后果。随着“蛋白组学”技术和方法的快速发展，我们从男性的基础代谢和精子蛋白质组学、受精的机理以及运动功能等研究中获得了认识，学者们提出了公认的原因：精子的不育原因许多来源于精子的功能异常，其中对精子核DNA的损害是目前研究最多，而且是被越来越多地学者承认与胚胎发育质量和胚胎植入至关重要的影响因素之一。

近年来的研究表明精子DNA的完整性与精子活力、精子形态及精子功能有显著相关性，并且可以影响受精卵的分裂以及胚胎的发育。但目前的精子DNA分析方法尚不稳定，因为它不能识别精子固有的分子异常，虽然有各种测试评估DNA完整性的方法，但这些办法都是使用了各种荧光染料，对精子本身有侵入性伤害，例如彗星法、精子染色质扩散法（SCD）及丫啶橙流式细胞仪分析法等都是使用荧光染料。这些使用荧光染料检查后的精子无法再给临床应用提供可替代选择使用的精子。

随着计算机及其在图像数字处理技术方面的进展，一门崭新的、非侵入性、快速而灵敏的光谱学检测方法，激光拉曼*(Raman) 光谱技术在生物医学领域的应用日渐广泛，被逐步应用于各种细胞分类和鉴别研究工作中。在这里不仅可以观察细胞形貌，而且还能检测出表征细胞形态的峰谱，它包含了单纯形貌观察得不到的更丰富的信息，通过这些信息反映出细胞的物质成分和结构的变化，这在生物遗传及临床医学等学科的研究进程中有潜在的应用前景。目前使用激光拉曼光谱系统对单个精子形态分析方法的建立研究尚未见报道

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法，所述的精子形态和超微结构分析方法包括以下步骤：运用色散型共聚焦拉曼光谱仪进行分析，选择激发拉曼光谱，将精子细胞置反射光镜下中，通过一定的激发功率和曝光时间可采集到精子细胞的化学基团光谱。分别对精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域重复扫描三次，即可获得拉曼数据谱峰，分析其波形变化和位移；最后将采集到的精子形态的拉曼光谱，应用RRUFF拉曼数据库检索，得到精子形态各区域的拉曼光谱。

所述的精子形态和超微结构分析方法包括以下步骤：

（1）选择激光激发波为532nm，激光功率5mW，激发拉曼光谱，曝光时间为10s；

（2）激光拉曼显微镜扫描参数：入射光调节为反射光，拉曼分析平移，即每个点扫描移动时，控制精度为1 um；

（3）根据精子形态分析标准，依据精子顶体、颈部、尾部大小，即顶体宽度3.1-3.5um，顶体长度为4.5-4.9um，颈部长度为4.0-5.0um划分扫描区域：分别对精子顶体前区（质膜）定点扫描3个点、顶体中间(DNA核区)定点扫描4点、顶体后区(赤道板部)定点扫描3点、颈部(线粒体区)部定点扫描7点、尾部（微管区域）定点扫描8点，五个划分区域共定点扫描23点进行扫描，并重复扫描三次，将获得精子拉曼数据谱峰，分析其峰谱变化和位移。

本发明优点在于：

1、本发明采用的激光拉曼光谱为一种非侵入性技术，它不需要任何染料和固定也能反映出每条精子不同个体超微结构、不同成分的散射物质的特性，与激光的频率和激光的强度无关； 

2、本发明通过对四种不同形态的精子进行拉曼光谱的比较研究，发现不同形态的精子均有各自的拉曼特征谱峰，对不同形态的精子特征拉曼谱峰的研究十分有意义，采用激光拉曼光谱仪可对精子形态学分析提供了一个新的评估方法。

附图说明

附图1是精子顶体、颈部、尾部大小。

附图2是根据精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域。

附图3是四例检测样本的精子形态学染色图谱。

附图4是正常可育者精子的拉曼光谱：a、顶体区域的拉曼光谱；b、精子颈部区域的拉曼光谱；c、精子尾部区域的拉曼光谱。

附图5是原发不育男性（确诊为IVF完全不受精）精子拉曼光谱，a、顶体区域的拉曼光谱；b、精子颈部区域的拉曼光谱；c、为精子尾部区域的拉曼光谱。

附图6是圆头精子拉曼光谱，a、圆头精子顶体区域多点重复的拉曼光谱；b、可育者精子顶体区域多点重复的拉曼光谱。

附图7是断头精子拉曼光谱，（I）顶体区域的拉曼光谱，（II）精子颈部区域的拉曼光谱，（III-IV）为精子尾部区域的拉曼光谱。（波长532nm）。

附图8-12是正常精子与死精子的激光拉曼扫描峰谱，红色（下）为正常精子的激光拉曼扫描峰谱，蓝色（上）为死精子的激光拉曼扫描峰谱。其中图8是顶体前区，图9是核区，图10是顶体后区，图11是颈部，图12是尾部。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例

一、研究材料和方法

1、实验设备

1.1 激光拉曼光谱系统

色散型共聚焦拉曼光谱仪（Senterra R200-L），德国Bruker公司生产，具有光谱分辨率≤1.5cm^-1，横向分辨率< 1um，纵向分辨率< 2 um，配有波长分别为785nm、633nm和532nm的三种激光器，三维自动化控制平台等重要性能。

1.2 西班牙CASA分析仪

1.3 Eppendorf 5424小型高速离心机

1.4 检测样本

选取在医院特需门诊就诊的男性精液样本。

(A)已育男性（已生育一男孩，现年18岁）一例 ；

(B)原发不育患者（原发不育12年 ，曾在生殖中心接受IVF治疗，确诊为IVF完全不受精）一例；

(C)圆头精子症患者一例（患者为原发不育5年），精液形态学分析均为100%圆头精子；

(D)严重(98%)畸形精子症（精子形态学分析，可见大部分精子为颈部开始头尾分离，即使头尾连接也是歪颈），患者一例。

以这四例典型病例为研究对象。本组研究以生育者的正常形态精子为对照。四位受检者均被告知实验目的并签署知情同意书。

表1  四例样本精液分析基本情况表

2、研究方法

2.1 精液常规分析：按WHO^5th精液分析要求，使用进口西班牙CASA分析仪进行精子密度、活力、前向运动速度计数。

2.2 精子形态学分析：采用Diff-Quick形态染色方法，100倍油镜下观察200条精子形态并进行正常率的计数。

2.3 精子洗涤纯化

采用45%和90%的Percoll梯度离心法处理精子样品。

(1)分别取90%、45%浓度的Percoll试剂各1ml，加入1ml新鲜精液，梯度离心（300g 20分钟）；

(2)移去上层梯度液，将最下层沉淀物轻轻混匀,加入DPBS液2ml，充分混匀，300g离心5分钟，弃去上清，重复洗两次；

(3)留取下层沉淀的精子用100ul DPBS液溶解，吸取纯化后的精液样本2ul，制备成精液涂片，运用激光拉曼分析仪器（Senterra R200-L）进行分析。

3、激光拉曼显微镜扫描方法

3.1激光拉曼显微镜扫描参数如下：入射光调节为反射光，激光激发波为532nm，激光功率5mW。拉曼分析平移(每个点扫描移动时)控制精度为1 um。

3.2 定位精子整体部位细胞的体积大小，根据精子形态分析标准,依据精子顶体、颈部、尾部大小(头部宽度3.1-3.5um，顶体长度为4.5-4.9um，颈部长度为4.0-5.0um)划分扫描区域。分别对精子顶体前区（质膜）定点扫描3个点、顶体中间(DNA核区)定点扫描4点、顶体后区(赤道板部)定点扫描3点、颈部(线粒体区)部定点扫描7点、尾部（微管区域）定点扫描8点，五个划分区域共定点（扫描23点）进行扫描，并重复扫描三次，将获得精子拉曼数据谱峰，分析其峰谱变化和位移，详细见图1、2。

二、研究结果

1、精子形态学分析标准：

精子包括头部、颈部、中段、主段和尾段，只有头部和尾部都正常，才可以认为精子正常。所有临界形态都应认为异常。

头部在外形上必须是平滑的、弧度规则的、大体上为椭圆形。顶体部分边界清晰，且占头部面积的40～70%（Menkveld et al., 2001）。

中段必须是纤细的、规则的且长度与头部相同。中段的主轴必须与精子头部的主轴相延续。胞浆残余体只有在过多时（也就是说超过精子头部尺寸的三分之一）时才被认为异常（Mortimer & Menkveld, 2001）。

主段必须直径一致，比中段细，且长度大致为45um（大约为精子头部长度的10倍）。可以有自然弯曲，且没有成角弯折（成角弯折提示有鞭毛破损）。请参照附图3。

2、激光拉曼分析方法

选择激发拉曼光谱(曝光时间为10s)，将精子细胞从反射光镜下中，通过一定的激发功率和曝光时间采集到精子细胞的化学基团光谱，分别对精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域重复扫描三次，即可获得拉曼数据谱峰，分析其波形变化和位移。最后将采集到的精子形态的拉曼光谱，应用RRUFF拉曼数据库（http://rruff.geo.arizona.edu/rruff/）检索，得到精子形态各区域的拉曼光谱。

2.1 正常已生育男性的精子拉曼光谱

正常可育者的精子具有明显的头、颈和尾部特征谱峰（如图4）。头部（顶体区）在500-700cm^-1、800-850 cm^-1以及1000-1200 cm^-1区域峰形减弱，而在颈部和尾部这三个区域的峰增强明显，成独立或双峰形；此外，顶体区域在1500-2100 cm^-1具有一个平缓的宽域峰，而在颈部和尾部峰形变窄，且在后期2500 cm^-1区域出现新的增强峰。

2.2 原发不育男性（确诊为IVF完全不受精）精子拉曼光谱

不育男性的精子头、体、尾部的拉曼光谱峰型极其相似，具有500-700cm^-1、800-850 cm^-1以及1000-1200 cm^-1区域典型峰形；以及1500-2500 cm^-1的平缓宽域的峰形。与正常生育者精子相比，缺少了在2500 cm^-1后期增强的峰形（图5）。

2.3 圆头精子拉曼光谱

圆头精子由于顶体部分缺失，头部多次扫描峰形变化不明显，除<500处出现一次小的新峰形，其它峰形均集中于500-700cm^-1、800-850 cm^-1、1500-2500 cm^-1以及1000-1200 cm^-1四个区域；生育者顶体区域多次重复扫描后，峰形也无变化，但与圆头精子相比，在1500-2500 cm^-1区域峰形强度下降明显（见图6）。

2.4 断头精子拉曼光谱

断头精子与生育者精子比较，断头顶体区域1000-1200 cm^-1逐渐增强，而在1500-2500 cm^-1区域出现陡峰（图7-I）；断头颈部在1500-2500 cm^-1区域也出现增强峰，其他峰形与生育者基本一致（图7-II）；断头尾部在800-850cm^-1区域出现微小差别的峰，经峰形放大可见几处峰形增加（图7-III和7-IV）

三、讨论

人类精子有各种不同的畸形类别。生精功能缺陷和某些附睾病变通常会导致精子异常形态率的增高。形态异常通常是混合型的。异常精子通常授精潜能低，并取决于何种异常，也可能携带异常 DNA。形态异常通常伴随着精子DNA碎片增高（Gandini et al., 2000），提示染色体结构缺陷（Lee et al., 1996）、不成熟的染色质（Dadoune et al., 1988）和凋亡（Devillard et al., 2002; Martin et al., 2003）增多。因此，重点在于精子头部，尽管尾部（中段和主段）也需要考虑。

拉曼光谱是由拉曼频移和谱峰强度构成的二维图像。通过分析物质的拉曼光谱谱峰的位置、形状和强度，可以从分子水平上了解物质的构成、特性及其变化规律。拉曼光谱(Raman)与红外光谱互为补充，可以鉴别特殊的结构特征或特征基团。它能将激光聚焦在面积 1μm²的极小区域内，进行分子结构和成分的微区分析，也可实现微秒、纳秒和皮秒量级的分析。拉曼位移的大小、强度及拉曼峰形状是鉴定化学键、官能团的重要依据。

精子为生命体中重要的生物分子，是生命结构和具有传递生命延续功能的基本单元，生物体的特性决定于构成它们的各个细胞部分，精子细胞的蛋白质功能好坏也是一切疾病发生、发展和转归的基础，因此对精子的功能研究在生殖生物学、生殖遗传学中占有重要的地位，处于当代生命科学发展的前沿。精子由包含在细胞膜内的有机物、无机物和生物化学物质的复杂混合体组成，包括核酸、蛋白质、多糖和液体。活动的精子内生物分子的组成和结构可能随生理状态的改变而改变。然而，直接分析悬浮在液体中的单个生物微粒是十分困难和具有挑战性的，因为这些微粒由于布朗运动而进行着不断的随机运动。而激光拉曼光谱系统，可对单个精子进行操控和光谱收集。操作时精子无须特殊处理，被直接放置在载玻片上方位置，减小了玻片的荧光干扰，通过激光强度的控制和激光波长的选择使精子的损伤在一极小的程度，弥补了许多以往精子功能研究方法中的缺点。

我们通过对四种不同情况的男性精子进行了拉曼光谱扫描，从所收集的谱峰可以看到，精子的拉曼谱峰主要由四大区域构成：500-700cm^-1、800-850 cm^-1、1500-2500 cm^-1以及1000-1200 cm^-1四个区域。其中800-850 cm^-1与Konrad等报道(2010)的核酸骨架的分子的散射信号符合，1500-2500 cm^-1区域则为腺嘌呤和鸟嘌呤的富集有关。原发不育男性的精子头体尾部的峰型与生育者相似，具有500-700cm^-1、800-850 cm^-1以及1000-1200 cm^-1区域典型峰形；但是，1500-2500 cm^-1的峰形明显减缓，可见不育者腺嘌呤和鸟嘌呤峰度减小，提示此不育者致病机制可能与线粒体泵等离子通道的减少相关。

据报道，圆头精子的顶体大部分缺失，ICSI后也很难受孕。经拉曼光谱多次扫描分析，多次扫描峰形变化不明显，除<500处出现一次小的新峰形，其它峰形集中500-700cm^-1、800-850 cm^-1、1500-2500 cm^-1以及1000-1200 cm^-1四个区域；同样多次扫描生育者顶体区域，却发现1500-2500 cm^-1区域强度下降明显（见图6）提示圆头精子头部致密，膜蛋白和核苷酸包被紧密，对外界干扰损伤很小，故拉曼激光扫描无明显偏移；而普通精子头部蛋白成分丰富，容易发生峰形偏移。此外，断头精子的拉曼谱峰在1500-2500 cm^-1的区域峰形增强，也与腺嘌呤和鸟嘌呤峰度密切相关。

1）正常精子在拉曼谱峰主要由四大区域构成：500-600cm^-1、800-850 cm^-1、1000-1200 cm^-1以及1300-2000 cm^-1四个区域。峰强集中在500-1100两个区域。请参照附图8-12，附图8-12是正常精子与死精子的激光拉曼扫描峰谱，红色（下）为正常精子的激光拉曼扫描峰谱，蓝色（上）为死精子的激光拉曼扫描峰谱。其中图8是顶体前区，图9是核区，图10是顶体后区，图11是颈部，图12是尾部。

头部（顶体前区）在500-565 cm^-1、1000-1100 cm^-1区域有两个峰谱，在1200-2100 cm^-1区域具有一个平缓的宽域峰带；

头部（DNA核区）在565-810 cm^-1、1000-1100 cm^-1区域有两个峰谱，在1200-2100 cm^-1区域具有一个平缓的宽域峰带；

头部（顶体后区）在562 cm^-1、1000-1100 cm^-1区域有两个峰谱，在1200-2100 cm^-1区域具有一个平缓的宽域峰带；

颈部（线粒体区）在564 cm^-1、以及1000-1100cm^-1这两个区域的峰谱较弱；在1300-2100 cm^-1有一个平缓的宽域峰带；

尾部（微管区域）在500-534 cm^-1、1000-1100cm^-1这两个区域的峰谱较弱；在1300-2100 cm^-1有一个平缓的宽域峰带；

2）异常精子在拉曼谱峰主要由：500-600cm^-1、800-850 cm^-1、1000-1200 cm^-1以及1300-2000 cm^-1四个区域构成。头部、颈部、尾部的峰型与正常精子相似, 在500-1100两个区域均有两个较典型的峰谱。不同的是：

头部（顶体前区）在500-565 cm^-1有一个较小的峰谱、在1000-1100 cm^-1区域有个较典型的峰谱，但在1300、1410、1520、1610 cm^-1等区域具有四个较强的典型宽域峰带；

头部（DNA核区）在565-810 cm^-1有一个较小峰谱，而在1000-1100 cm^-1区域峰谱明显增强，在1100、1360、1707、1943-2000 cm^-1等区域具有四个较典型的宽域峰带；

头部（顶体后区）在562 cm^-1、1000-1100 cm^-1区域有两个峰谱，在区域峰谱明显增强，在1100、1360、1707、1943-2000 cm^-1等区域具有四个较典型的宽域峰带；

颈部（线粒体区）在564 cm^-1这个区域的峰谱较弱；但在1000-1100cm^-1这个区域的峰谱开始增强；在1600、1767、1900 cm^-1这三个区域的峰谱开始增强，有三个较高的典型宽域峰带；

尾部（微管区域）在500-534 cm^-1、1000-1100cm^-1这两个区域的峰谱比较弱，在1089有一个较小的峰谱；在1600、1770、1900-2000 cm^-1这三个区域的峰谱开始增强，有三个典型的宽域峰带；

四、结论

综上所述，传统的精子形态学分析及精子DNA的评估方法只能从外观上评判精子的好坏，而不是作为对人类精子的显微形态进行多方面评估的唯一的方法。细胞形态学分析方法不能准确判断细胞内部的分子变化的程度，而拉曼光谱对细胞分子的结构、构象及所处的环境很敏感，在细胞病变过程中，其扑捉的细胞内物质的结构、构象和数量在谱峰上即发生了明显变化。如今激光拉曼光谱应用于生物体系的研究，特别是在DNA、蛋白质与其它分子相互作用的研究方面已取得了相当快的进展；除此外，拉曼光谱还能对单个细胞及其内部变化，包括与其它细胞相互作用的研究扑捉更细微的变化，这将成为医学生物信息领域一个新的研究重点。

在既往的男性生育诊断、预测、生殖毒理学、基础研究或公共健康研究中，还没有一个标准的、多用途的方法来评估人类精子形态。我们采用的激光拉曼光谱为一种非侵入性技术，它不需要任何染料和固定也能反映出每条精子不同个体超微结构、不同成分的散射物质的特性，与激光的频率和激光的强度无关；不同细胞其拉曼光谱在特征峰有着明显的区别，通过我们对四种不同形态的精子进行拉曼光谱的比较研究，发现不同形态的精子均有各自的拉曼特征谱峰。对不同形态的精子特征拉曼谱峰的研究十分有意义，采用激光拉曼光谱仪可对精子形态学分析提供了一个新的评估方法。如将传统的形态学、DNA分析方法和激光拉曼光谱等方法互补与结合起来，以此探寻可能发生在精子细胞染色质的分子结构变异，可进一步筛选正常精子用于辅助生殖技术开拓一个新的思路。

需要说明的是，本发明的非侵入性精子形态和超微结构分析方法，是一种非治疗和诊断目的的精子形态学分析方法，是对已经脱离人体或动物体的体液进行处理或检测以获取作为中间结果的信息并处理该信息的方法，根据现有技术中的医学知识和本发明申请公开的内容从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果或健康状况，因此本发明的非侵入性精子形态和超微结构分析方法并不属于疾病的诊断方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法，其特征在于，所述的精子形态和超微结构分析方法包括以下步骤：运用色散型共聚焦拉曼光谱仪进行分析，选择激发拉曼光谱，将精子细胞置反射光镜下中，通过一定的激发功率和曝光时间可采集到精子细胞的化学基团光谱；分别对精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域重复扫描三次，即可获得拉曼数据谱峰，分析其波形变化和位移；最后将采集到的精子形态的拉曼光谱，应用RRUFF拉曼数据库检索，得到精子形态各区域的拉曼光谱。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的精子形态和超微结构分析方法包括以下步骤：

（1）选择激光激发波长为532nm，激光功率5mW，激发拉曼光谱，曝光时间为10s；

（2）激光拉曼显微镜扫描参数：入射光调节为反射光，拉曼分析平移，即每个点扫描移动时，控制精度为1μm；

（3）根据精子形态分析标准，依据精子顶体、颈部、尾部大小，即顶体宽度3.1-3.5um，顶体长度为4.5-4.9um，颈部长度为4.0-5.0um划分扫描区域：分别对精子顶体前区，即质膜定点扫描3个点；顶体中间，即DNA核区定点扫描4点；顶体后区，即赤道板部定点扫描3点；颈部，即线粒体区部定点扫描7点；尾部，即微管区域定点扫描8点，五个划分区域共定点扫描23点进行扫描，并重复扫描三次，将获得精子拉曼数据谱峰，分析其峰谱变化和位移。

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