CN103698310A - 一种精子顶体区拉曼光谱峰及其用途 - Google Patents
一种精子顶体区拉曼光谱峰及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种精子顶体区拉曼光谱峰及其用途，所述的拉曼光谱峰如摘要附图所示，其可用于精子受精功能评估和检测以及精子理论研究。本发明还涉及一种精子受精功能评估方法，包括：a）制备精液涂片；b）在激光激发波为532nm，激光功率5mW扫描精液涂片上的单个精子顶体区至少三次，获得拉曼数据谱峰；c）将检测样本的拉曼数据谱峰与上述精子顶体区拉曼光谱峰对比，判断精子是否具备受精功能。本发明优点是：提供了判定精子受精潜能的标准拉曼光谱峰，其判定结果准确可靠、可信度高，因而可作为精子受精潜能检测的一种新方法，该方法可对单个精子进行操控，精子无须特殊处理且损伤可被控制在极低的程度，并可直接用于后续的研究或辅助生殖治疗。
Description
技术领域
本发明涉及精子受精功能检测技术领域，具体地说，是一种精子顶体区拉曼光谱峰及其在检测精子受精功能中的用途。
背景技术
精子受精功能的评估和检测是男性不育诊断与治疗、建立男性避孕技术与珍稀动物的人工育种、经济动物的优良种培育的重要手段。深入研究人类精子结构与功能，对探索精子发生之谜、出生健康子代意义重大。
精子为生命体中重要的生物分子。精子由包含在细胞膜内的有机物、无机物和生物化学物质的复杂混合体组成，包括核酸、蛋白质、多糖和液体。活动的精子内生物分子的组成和结构可能随生理状态的改变而改变。然而，直接分析精子细胞内单个小分子物质与化学基团十分困难且极具挑战。因为这些分子或基团由于布朗运动而进行着不断的随机运动。但目前的精子DNA分析方法是不稳定的，因为它不能识别精子固有的分子异常。现有的精子功能检测多采用化学染色等方法，例如彗星法、精子染色质扩散法（SCD）及丫啶橙流式细胞仪分析法等都是使用荧光染料对精子进行染色，该种方法对精子的损伤是不可修复的，也无法直接进行后续的辅助生殖治疗。
随着计算机及其在图像数字处理技术方面的进展，一门崭新、非侵入性、快速而灵敏的光谱学检测方法——激光拉曼（Raman）光谱技术在生物医学领域的应用日渐广泛，被逐步应用于各种细胞分类和鉴别研究工作中。经拉曼扫描不仅可以观察细胞形貌，而且还能检测出表征细胞形态的峰谱，它包含了单纯形貌观察得不到的更丰富的信息，通过这些信息反映出细胞的物质成分和结构的变化，这在生物遗传及临床医学等学科的研究进程中有潜在的应用价值。
拉曼光谱的分析方法具备以下优点：不需要对样品进行前处理，也没有样品的制备过程，避免了一些误差的产生，并且在分析过程中操作简便，测定时间短，灵敏度高。
目前还未见有人报道拉曼光谱技术在正常、具有受精潜能的精子筛选中的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种精子顶体区拉曼光谱峰；提供一种上述精子顶体区拉曼光谱峰的用途；提供一种精子受精功能评估方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种精子顶体区拉曼光谱峰，所述的精子顶体区拉曼光谱峰横坐标为波长，单位nm；纵坐标为强度，单位a.u；有六条特征峰，波长分别为：520-540nm、810-900nm、1000-1100nm、2300-2400nm、3200-3500nm，对应强度分布分别为：500-600a.u，100-200a.u，200-250a.u，100-200a.u，400-600a.u。
如上所述的精子顶体区拉曼光谱峰在非治疗目的的精子受精功能评估和检测中的应用。
如上所述的精子顶体区拉曼光谱峰在非治疗目的的人类精子受精功能评估和检测中的应用。
如上所述的精子顶体区拉曼光谱峰在精子理论研究中的应用。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种精子受精功能评估方法，所述的方法包括下列步骤：
a）精子洗涤纯化，制备精液涂片；
b）在激光激发波为532nm，激光功率5mW扫描精液涂片上的单个精子顶体区至少三次，获得一个拉曼数据谱峰；
c）将步骤b）得到的拉曼数据谱峰与上述精子顶体区拉曼光谱峰进行对比，判断精子是否具备受精功能。
步骤c）所述的判断精子是否具备受精功能是观察步骤b）得到的拉曼数据谱峰的520-540nm特征峰对应强度分布是否在500-600a.u，810-900nm特征峰对应强度分布是否在100-200a.u，3200-3500nm特征峰对应强度分布是否在400-600a.u，如果是，则判断该受试精子具备受精潜能，相反则不具受精潜能。
本发明优点在于：
本发明提供了判定精子受精潜能的标准拉曼光谱峰，其判定结果准确可靠、可信度高，因此，本发明为精子受精潜能的检测提供了一种新方法，该方法可对单个精子进行操控和光谱收集，受试精子无须特殊处理，可被直接放置在载玻片上方位置，减小了玻片的荧光干扰，通过激光强度的控制和激光波长的选择使精子的损伤被控制在一极低的程度，可直接用于后续的研究或辅助生殖治疗，弥补了现有技术中精子功能研究方法的缺陷。
附图说明
附图1是实验组精子顶体区的拉曼光谱峰。
附图2是对照组精子顶体区的拉曼光谱峰。
附图3是实验组和对照组精子顶体区的拉曼光谱峰对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1 本发明拉曼光谱峰的获得
1 实验设备与材料
1.1 实验设备
激光拉曼光谱系统：色散型共聚焦拉曼光谱仪（Senterra R200-L），德国Bruker公司生产，具有光谱分辨率≤1.5cm-1，横向分辨率<1μm，纵向分辨率< 2μm，配有波长分别为785nm、633nm和532nm的三种激光器，三维自动化控制平台等重要性能；西班牙CASA分析仪；Eppendorf 5424小型高速离心机。
1.2 实验材料
选取在上海交通大学医学院附属仁济医院上海市人类精子库的捐精志愿者精液样本10份，该10份精液样本的捐精志愿者均为已育男性。在每份精液样本中放入4颗卵子，37℃培养箱孵育2h。从每份精液样本中筛选能够和卵子透明带紧密结合（具备受精潜能）的精子10条作为实验组，挑选不能与卵子透明带紧密结合（无受精潜能）的精子10条作为对照组。以上两组共计200条精子。
2 研究方法
2.1 精液常规分析
按国家卫生部人类精子库捐精志愿者精液分析要求，使用美国Hamilton-Thorn CASA分析仪进行精子密度、活力、前向运动速度计数。
2.2 精子顶体完整性分析
采用豌豆凝集素顶体特异染色方（PSA-FITC），在荧光显微镜（100倍油镜下）观察200条精子形态并进行顶体完整率的计数。
2.3 精子洗涤纯化
采用45%和90%的Isolate（Irvine Scientific，CA，USA）梯度离心法处理精子样品：
（1）分别取90%、45%浓度的Isolate（Irvine Scientific，CA，USA）精子洗涤试剂各1ml，加入1ml新鲜精液，梯度离心（300g，15分钟）；
（2）移去上层梯度液，将最下层沉淀物轻轻混匀，加入DPBS液2ml，充分混匀，300g离心5分钟，弃去上清，重复洗两次；
（3）留取下层沉淀的精子用100μl DPBS液溶解，吸取纯化后的精液样本2-5μl，制备成精液涂片，运用激光拉曼分析仪进行分析。
2.4 激光拉曼显微镜扫描
2.4.1激光拉曼显微镜扫描参数如下：激光激发波为532nm，激光功率5mW。
2.4.2精子扫描模式：顶体区、赤道板区以及核区分别取平行的三个线性点，等间距（1μm）；其他区域扫描7个点，颈部一个、中段和尾部各3个点，等间距（1μm）。
2.4.3 激光拉曼分析方法
选择激发拉曼光谱（曝光时间为5s），将精子细胞从光势阱中释放出来，再以同样的激发功率和曝光时间采集附近的背景光谱，对精子顶体区重复扫描三次，即可获得一个拉曼数据谱峰，分析其波形变化和位移。其他精子重复相同步骤。最后将采集到的精子形态的拉曼光谱，从相关文献报道获取对应谱峰的化学键成分，具体文献可参照：
1. Maquelin K, Choo-Smith LP, Endtz HP, Bruining HA, Puppels GJ (2002) Rapid identification of Candida species by confocal Raman microspectroscopy. J Clin Microbiol 40: 594-600.
2. Schuster KC, Reese I, Urlaub E, Gapes JR, Lendl B (2000) Multidimensional information on the chemical composition of single bacterial cells by confocal Raman microspectroscopy. Anal Chem 72: 5529-5534.
3. Deng H, Callender R (1999) Raman spectroscopic studies of the structures, energetics, and bond distortions of substrates bound to enzymes. Methods Enzymol 308: 176-201.
4. Uzunbajakava N, Lenferink A, Kraan Y, Willekens B, Vrensen G, et al. (2003) Nonresonant Raman imaging of protein distribution in single human cells. Biopolymers 72: 1-9.
5. Uzunbajakava N, Lenferink A, Kraan Y, Volokhina E, Vrensen G, et al. (2003) Nonresonant confocal Raman imaging of DNA and protein distribution in apoptotic cells. Biophys J 84: 3968-3981.
6. Harz M, Rosch P, Popp J (2009) Vibrational spectroscopy--a powerful tool for the rapid identification of microbial cells at the single-cell level. Cytometry A 75: 104-113.
3 实验结果
3.1 实验组精子顶体区拉曼光谱峰
实验组100条精子顶体区的拉曼光谱峰均呈现如图1所示的拉曼光谱峰态势。其横坐标为波长，单位nm；纵坐标为强度，单位a.u。它有六条特征峰波长分别为：520-540nm、810-900nm、1000-1100nm、2300-2400nm、3200-3500nm，对应强度分布500-600a.u，100-200a.u，200-250a.u，100-200a.u，400-600a.u。
3.2 对照组精子顶体区拉曼光谱峰
对照组100条精子顶体区的拉曼光谱峰均呈现如图2所示的拉曼光谱峰态势。其横坐标为波长，单位nm；纵坐标为强度，单位a.u。它有六条特征峰波长分别为：520-540nm、810-900nm、1000-1100nm、2300-2400nm、3200-3500nm，对应强度分布0-50a.u，0-50a.u，200-350a.u，100-120a.u，50-180a.u。
3.3 实验组和对照组精子顶体区拉曼光谱峰的比较
我们将三种强度峰范围分别定义为：低强度峰0-50 a.u（对应纵坐标），中强度峰50-100 a.u，高强度峰大于100 a.u。
实验组和对照组精子顶体区拉曼光谱峰的比较如图3所示。从图中可以看出，与对照组精子顶体区的拉曼光谱峰相比，实验组的精子在顶体区的拉曼谱峰的三个比较明显的区域（波长520-540nm的区域、波长810-900nm的区域、波长3200-3500nm的区域）从低强度峰跃迁到高强度峰，即520-540nm特征峰对应强度分布是否在500-600a.u，810-900nm特征峰对应强度分布是否在100-200a.u，3200-3500nm特征峰对应强度分布是否在400-600a.u，如果是，则判断该受试精子具备受精潜能，相反则不具受精潜能。
3.4 精子内物质变化的推测
参照文献记载可知，1、低强度峰代表碳水化合物骨架、水键、核酸骨架；2、中强度峰代表二硫键；3、高强度峰代表糖基上的磷酸键、碱基键。再参照受检精子的拉曼光谱峰可推断出精子内何种物质发生了变化，以及该类物质变化给精子受精潜能带来的影响。
实施例2 本发明拉曼光谱峰可用于判断精子受精功能的验证
1 样本来源
收集在临床男科门诊采集就诊患者60例，受检者均被告知实验目的并签署知情同意书，从每位受检者的精液中挑取10条精子，受试精子共600条，随机分成3组，各组受试精子200条。
2 激光拉曼显微镜扫描
先采用拉曼光谱仪按照实施例1的方法对受试精子顶体区进行扫描，获得精子顶体前区、后区的拉曼光谱峰，再将所得拉曼光谱峰同本发明的拉曼光谱峰进行比较，考察精子顶体前区、后区的拉曼光谱峰是否从低强度峰跃迁至高强度峰，记录实验结果。
3 透明带选择实验
拉曼光谱分析之后回收精子，进行透明带选择实验测试精子受精功能，具体操作同实施例1，记录实验结果。
4 化学染色法
将精子涂片，空气中干燥；将涂片至于无水酒精中，固定1小时以上；将固定好的涂片至于豌豆凝集素荧光染料中（PSA-FITC），4℃染色2小时以上；取出后，用PBS清洗2次（避光）。采用荧光显微镜观察精子顶体完整与否。如完整，则认为具备受精潜能，相反，则认为不具受精潜能。记录受试精子受精功能检测结果。
5 结果比较
将每条受试精子的拉曼光谱分析试验结果与透明带选择试验结果和化学染色法试验结果进行对比，统计拉曼光谱分析试验结果与透明带选择试验结果和化学染色法试验结果一致的受试精子数，统计结果如表1所示。由表1可知，本发明的拉曼光谱峰能够作为评价精子受精功能的标准，准确度高。
表1 试验统计结果
| 实验组1 | 实验组2 | 实验组3 | |
| 结果一致（条） | 99 | 100 | 99 |
| 结果不一致（条） | 1 | 0 | 1 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种精子顶体区拉曼光谱峰，其特征在于，所述的精子顶体区拉曼光谱峰横坐标为波长，单位nm；纵坐标为强度，单位a.u；有六条特征峰，波长分别为：520-540nm、810-900nm、1000-1100nm、2300-2400nm、3200-3500nm，对应强度分布为：500-600a.u，100-200a.u，200-250a.u，100-200a.u，400-600a.u。
2.权利要求1所述的精子顶体区拉曼光谱峰在非治疗目的的精子受精功能评估和检测中的应用。
3.权利要求1所述的精子顶体区拉曼光谱峰在非治疗目的的人类精子受精功能评估和检测中的应用。
4.权利要求1所述的精子顶体区拉曼光谱峰在精子理论研究中的应用。
5.一种精子受精功能评估方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：
a）精子洗涤纯化，制备精液涂片；
b）在激光激发波为532nm，激光功率5mW扫描精液涂片上的单个精子顶体区至少三次，获得一个拉曼数据谱峰；
c）将步骤b）得到的拉曼数据谱峰与权利要求1的精子顶体区拉曼光谱峰进行对比，判断精子是否具备受精功能。
6.根据权利要求5所述的精子受精功能评估方法，其特征在于，步骤c）所述的判断精子是否具备受精功能是观察步骤b）得到的拉曼数据谱峰的520-540nm特征峰对应强度分布是否在500-600a.u，810-900nm特征峰对应强度分布是否在100-200a.u，3200-3500nm特征峰对应强度分布是否在400-600a.u，如果是，则判断该受试精子具备受精潜能，相反则不具受精潜能。
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