CN108449966B - 用于确定脊椎动物精液质量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于确定脊椎动物精液质量的方法。该方法包括以下步骤：测量精液样品的至少一个吸收光谱；选择n个波数σj(j∈[1；n])，所述波数是动物品种或物种的精液所特有的；基于所述至少一个吸收光谱，确定所述n个波数σj(j∈[1；n])的每一个的吸收值Xj和/或吸收的二阶导数的值Xj″(j∈[1；n])；由先前确定的吸收值Xj和/或吸收的二阶导数的值Xj″来计算在预定义天数的不返回率Y。

Description

用于确定脊椎动物精液质量的方法
技术领域
本发明涉及繁殖领域，特别涉及繁殖牛、禽类和鱼类。
更具体地说，本发明涉及一种用于确定脊椎动物精液质量的方法。
本发明在选择高质量精液以改善动物在繁殖操作中授精的成功率或在控制种畜的精液质量方面具有特别的应用。
背景技术
在家畜繁殖领域，授精是优化畜群管理的重要步骤。例如在奶牛的情况下，因为该步骤有助于最大限度地延长牛奶生产期，所以这一步更为重要。由于这些原因，授精质量以及所使用的精液至关重要。
事实上，不能导致动物妊娠的授精对农场的收益率具有负面影响。例如，对于一头母牛，在授精行为后90天内没有回到发情期，则估计授精成功。如果不成功，相关动物的年产奶量直接受到影响。这导致农民的营业收入较低。此外，有必要重复授精操作。因此减少与这种干预相关的不确定性非常重要。
因此，对于分析实验室和精液生产者而言，评估精液质量是一个相当大的挑战。
首先根据动物选择方案评估这种质量。然而，已经发现具有很好的遗传组成的动物不一定是好的种畜。此外，因其良好的整体繁殖率而选择的动物的精液质量可能因取样过程中动物的健康状况而有变化。
然后我们尝试评估所采集的精液质量。根据不同的标准，由精液整体和/或由其不同的组分对这种质量进行评估。
精液是一种复杂的生物流体，由不同生殖道器官的分泌物组成，含有雄性配子。精液包括精子、精浆和外泌体等物质。
生育力是生殖的能力，是一种用于评估精液质量的共识术语。但是，这个术语有笼统和模糊的缺点。不能令人满意地辨别雄性个体。因此，根据需要，为了评估个体生育能力定义了不同的标准。
这些标准包括：
-受精率，其是能够形成合子(zygote)的雄性配子和雌性配子之间的融合率；
-NRR，是不返回率(non-return rate)的首字母缩略词，其是基于在受精行为后记录的X天内没有回到发情期而做出的受精成功或失败的结果预估；
-受孕率，其是在受精行为后X天内被诊断为妊娠的雌性的百分比(DeJarnetteJM,Amann RP.《Understanding estimates of AI sire fertility:From A to Z.》23rdTechnical Conference on Artificial Insemination&Reproduction,Milwaukee,WI.2010)。
困难在于，根据动物物种或品种的不同，这些标准的测量需要有更长或更短的等待时间才能得到结果。
因此，开发了许多体外测试来对精液进行评估，其中一些被世界卫生组织特别推荐在人类临床操作中使用。《WHO laboratory manual for the examination andprocessing of human semen.》Geneva:World Health Organization；2010)。在人类中，与其他脊椎动物物种相比，现有测试在预测所分析的精子样品的生育能力方面并不令人满意(De Jonge C.《Semen analysis:looking for an upgrade in class.》Fertil Steril2012-97:260–266and Kastelic JP,Thundathil JC.《Breeding soundness evaluationand semen analysis for predicting bull fertility.》Reprod Domest Anim Zuchthyg2008；43Suppl 2:368–373)。目前进行的宏观测试(体积、颜色、粘度...)和微观测试(运动力、浓度、形态...)通常会消除质量极差的精液，但不能确定性地鉴定特发性不孕症或生育力减低(hypofertile)的动物。此外，例如，它们不能预测在田间观察到的公牛(bull)的生育力的变化性。这个困难在于精子是复杂的细胞，并且其评估具有一些困难等(MocéE,Graham JK.《In vitro evaluation of sperm quality.》Anim Reprod Sci 2008；105:104–118)。
评估精液质量的固有问题之一源于样品中含有异质的精子群体。按照其在精子发生期间的训练(training)，精子会流经附睾并在尾部聚积直至射精时刻(Dacheux J-L,Dacheux F.《New insights into epididymal function in relation to spermmaturation.》Reprod Camb Engl 2014；147:R27–42)。由此储存的精子来自不同的精子发生波，因此来自同一次射精的精子具有不同的成熟度，确保在体内具有更宽的受精窗口。在体内，在其通过雌性生殖道运输的过程中，一些精子从群体中消除。相反地，在精液的体外分析中，样品可能包括几个不育精子，它们可能是静止的、死的、畸形的......(Holt WV,Van Look KJW.《Concepts in sperm heterogeneity,sperm selection and spermcompetition as biological foundations for laboratory tests of semen quality.》Reprod Camb Engl 2004；127:527–535et Rodríguez-Martínez H.《Can we increase theestimated value of semen assessment？》Reprod Domest Anim Zuchthyg 2006；41Suppl2:2–10et Petrunkina AM,Volker G,Brandt H,
Figure BDA0001635441140000032
E,Waberski D.《Functional significance of responsiveness to capacitating conditions in boarspermatozoa.》Theriogenology 2005；64:1766–1782)。因此，对不育精子以及能够使卵子受精的精子都进行了评估。
精液质量评估的另一个固有问题是精子对相同压力的反应不一致(PetrunkinaAM,Volker G,Brandt H,
Figure BDA0001635441140000031
E,Waberski D.《Functional significance ofresponsiveness to capacitating conditions in boar spermatozoa.》Theriogenology2005；64:1766-1782)，即使在某些特定时间精子具有相似的特征。最后，使用精子的复杂性还来自这样一个事实，即这种细胞是多区室化的(multicompartmented)，并且这些子区室(sub-compartment)的每一个都必须是完整的和有功能的才能够受精(Amann RP,Hammerstedt RH.<<In vitro evaluation of sperm quality:an opinion.》J Androl1993；14:397–406)。
为了确保受精，精子必须具有几个特征，例如运动力、ATP产生、诱导超激活、实现其精子获能(capacitation)和其顶体反应的能力，功能性质膜、识别并结合透明带的能力、或者具有完整的DNA等。因此，精子是复杂的多功能细胞，其需要几个参数正确运行才能达到其最终目标：受精和支持早期胚胎发育。
个体的不孕症或生育力低下(subfertility)可能是多种变化的结果。
因此，评估一种精子参数的测试难以检测缺陷精子的除了该测试所评估的性质之外的性质。这种测试的缺点是高估了样品的生育力(Graham JK,Mocé E.《Fertilityevaluation of frozen/thawed semen.》Theriogenology 2005；64:492–504)。此外，这种评估精子参数的实验室测试不太可能检测到含有使卵母细胞受精和确保胚胎发育所必需的所有参数的精子比例。
这就是为什么多参数测试是令人感兴趣的。事实上，分析精子样品的几个参数可以实现所分析的样品的总体视图，并改善对缺陷参数的检测。通过这种方法，多参数分析可以更好地解释所分析的公牛之间的生育力差异(Januskauskas A,Johannisson A,
Figure BDA0001635441140000041
L,Rodriguez-Martinez H.《Assessment of sperm characteristics post-thaw and response to calcium ionophore in relation to fertility in Swedishdairy AI bulls.》Theriogenology 2000；53:859–875)。
从实验室结果中评估动物的生育力所面临的另一部分问题与实验室分析本身的潜在问题有关。为了有效，实验室测试应该是客观的(由于人为判断或偏差而产生的误差很小)、可重复的(在重复测试过程中产生相同的结果)、准确的(精确地评估精子参数)、快速且便宜的(Graham JK.《Assessment of sperm quality:a flow cytometric approach.》Anim Reprod Sci 2001；68:239–247)。目前，很少有用于精液分析的实验室测试能有这些特征。
近年来，CASA分析技术(Computer Assisted Sperm Analysis的首字母缩略词)和流式细胞仪分析的使用使得实验室精液质量评估方法得到了发展。
这些多参数分析技术的缺点是它们不能够在体外进行预测体内生育力的测量。这种确定性结果的缺乏可归因于这些测试所使用的参数和标记，它们与待预测的表型关联太弱和/或在数量上是冗余的和/或数量有限的。
根据术语“组学(omics)”或“表型组学(Phenomics)”分组的高通量方法允许对精液质量进行更全面的评估，并在人类临床研究(Egea RR,Puchalt NG,EscriváMM,VargheseAC.OMICS:《Current and future perspectives in reproductive medicine andtechnology.》J Hum Reprod Sci 2014；7:73–92)以及农学(Robert C.《Challenges offunctional genomics applied to farm animal gametes and pre-hatching embryos.＞＞Theriogenology 2008；70:1277–1287)中具有令人感兴趣的前景。
常规使用这些已知技术的缺点源于其成本。
另一个缺点是实施这些技术的复杂性。
另一个缺点是这些已知技术采用一部分样品，而非完整样品。
已提出了能够分析完整细胞的其他技术，包括确定其脂质组(lipidome)(JonesJJ,Stump MJ,Fleming RC,Lay JO,Wilkins CL.《Strategies and data analysistechniques for lipid and phospholipid chemistry elucidation by intact cellMALDI-FTMS.》J Am Soc Mass Spectrom 2004；15:1665–1674)或其蛋白质组(Labas V,Spina L,Belleannee C,Teixeira-Gomes A-P,Gargaros A,Dacheux F,Dacheux J-L.《Analysis of epididymal sperm maturation by MALDI profiling and top-down massspectrometry.》J Proteomics 2015；113:226–243)。
这些完整细胞分析技术的缺点是它们不能够同时对完整精子的一组分子和/或结构特征进行表征。
还已知一种通过红外光谱来分析精液质量的技术，其特别涉及在中红外辐射下(辐射波长范围在2.5μm至25μm之间，也称为MIR首字母缩写)分析所照射的样品。
当生物样品被MIR束照射时，取决于样品中存在的不同分子的化学键，辐射将被部分和选择性地吸收。因此，红外光谱由可归因于特定化学基团的吸收谱带组成。谱带的位置取决于化学键的性质，也取决于其环境。因此，吸收谱带的位置使得这些吸收谱带可能与特定分子如蛋白质、脂质或碳水化合物有关联。
进行了一些研究以评估中红外光谱技术在各种应用中的性能。例如，我们可以引用一项旨在细菌分型的研究(Helm D,Labischinski H,Schallehn G,Naumann D.《Classification and identification of bacteria by Fourier-transform infraredspectroscopy.》J Gen Microbiol 1991；137:69–79；et Stamm I,Hailer M,Depner B,Kopp PA,Rau J.《Yersinia enterocolitica in diagnostic fecal samples fromEuropean dogs and cats:identification by fourier transform infraredspectroscopy and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrometry.》J Clin Microbiol 2013；51:887–893)，鉴定病理学如癌症(Backhaus J,Mueller R,Formanski N,Szlama N,Meerpohl H-G,Eidt M,Bugert P.《Diagnosis of breast cancer with infrared spectroscopy from serum samples.》Vib Spectrosc 2010；52:173–177；et Kallenbach-Thieltges A,Groβerüschkamp F,Mosig A,Diem M,Tannapfel A,Gerwert K.《Immunohistochemistry,histopathology andinfrared spectral histopathology of colon cancer tissue sections.》JBiophotonics 2013；6:88–100；et Lewis PD,Lewis KE,Ghosal R,Bayliss S,Lloyd AJ,Wills J,Godfrey R,Kloer P,Mur LAJ.《Evaluation of FTIR spectroscopy as adiagnostic tool for lung cancer using sputum.》BMC Cancer 2010；10:640)或关节病变(Canvin JMG,Bernatsky S,Hitchon CA,Jackson M,Sowa MG,Mansfield JR,Eysel HH,Mantsch HH,El-Gabalawy HS.《Infrared spectroscopy:shedding light on synovitisin patients with rheumatoid arthritis.》Rheumatol Oxf Engl 2003；42:76–82)等的研究，或食品工业中污染物检测(de Carvalho BMA,de Carvalho LM,Reis Coimbra JSdos,Minim LA,de Souza Barcellos E,da Silva Júnior WF,Detmann E,de CarvalhoGGP.《Rapid detection of whey in milk powder samples by spectrophotometric andmultivariate calibration.》Food Chem 2015；174:1–7)的研究。
光纤消逝波光谱红外分析(Fiber Evanescent Wave Spectroscopy infraredanalysis,FEWS)能够在MIR中工作。该分析基于使用由光纤硫属化物玻璃组成的传感器，其例如在文献FR2958403、WO2013017324和FR1450661中描述。当光波在光纤中传播时，其通过多次反射来实现传播，所有这些射线都构成了消逝波。然后该波可以被与纤维接触的介质吸收。
这一技术提供了许多优点。与旨在发现和/或定量某些先验定义的代谢物的离散分析不同，MIR分析使得可以在单次分析中获得样品代谢谱的整体图像，从而考虑分子之间的相互作用。与其他采集技术不同，光纤传感器的特殊性使其成为可以在液体介质中使用的工具，同时对样品的含水量不敏感。结果很快，并且不需要对样品进行特殊处理。
拉曼光谱的几种用途已经显示了该技术应用于生殖领域的可能性(Mallidis C,Sanchez V,Wistuba J,Wuebbeling F,Burger M,Fallnich C,Schlatt S.《Ramanmicrospectroscopy:shining a new light on reproductive medicine.》Hum ReprodUpdate 2014；20:403–414)。该技术已被用于评估精子DNA的完整性(Mallidis C,WistubaJ,Bleisteiner B,Damm OS,Gross P,Wübbeling F,Fallnich C,Burger M,Schlatt S.《Insitu visualization of damaged DNA in human sperm by Raman microspectroscopy.》Hum Reprod Oxf Engl 2011；26:1641–1649；et Mallidis C,Schlatt S,Wistuba J,Fallnich C,Gross P,Burger M,Wuebbeling F.《Means and methods for assessingsperm nuclear DNA structure.》WO2013064159A1,2013)，分析精子顶体以测定精子的受精能力(李铮,朱勇,刘锋,何琳,刘宇飞.《Sperm acrosome zone Raman spectrum peakand use thereof.》CN103698310A,2014)或用于诊断目的的精浆分析(Huang Z,Chen X,Chen Y,Chen J,Dou M,Feng S,Zeng H,Chen R.《Raman spectroscopiccharacterization and differentiation of seminal plasma.》J Biomed Opt 2011；16:110501–1105013)。
然而，迄今为止它还没有被用来表征完整的精液样品。
发明目标
本发明的目的尤其是弥补上述现有技术的缺点。
具体地，本发明旨在提供一种用于确定脊椎动物精液质量的方法，其对任意类型的精液都是有效且可靠的。
本发明的另一目的还在于提供一种能简单且快速实施的技术。
本发明还旨在提供低成本的用于确定脊椎动物精液质量的方法。
发明内容
稍后，通过使用确定脊椎动物精液质量的方法，这些目标以及其他将变得显而易见。
在本发明的背景中，术语“动物”是指其当前含义，即非人类异养生物。更具体地说，本发明涉及一种确定非人类脊椎动物精液质量的方法。例如，它们可能是大型动物、小型牲畜、禽类或鱼类。
这种用于确定脊椎动物精液质量的方法包括以下步骤：
-测量所述精液样品的至少一个吸收光谱；
-选择n个波数σj(j∈[1；n])，n≥4，所述波数是所述动物品种或物种的精液所特有的；
-由所述一个或多个吸收光谱，确定所述n个波数σj(j∈[1；n])中的每一个的吸收值Xj和/或吸收的二阶导数的值Xj”(j∈[1；n])；
-由先前确定的所述吸收值Xj和/或吸收的二阶导数Xj”来计算在预定义天数的不返回率Y。
因此，本发明以前所未有的方式提出使用精液的吸收光谱，从代表解释变量的波数的数量减少，来评估动物的精液质量，所述解释变量是动物品种或物种的精液所特有的。
本发明尤其可以确定不返回率(NRR)，例如，仅用20个解释变量，确定22、28、30、56、90或120天的发情期不返回率，对于98％的动物品种或物种的精液具有±10个点的精确度，对于86％的精液具有±5个点的精确度。需要记住的是，第D天的NRR(NRRD)是基于在受精行为后D天时间内没有回到发情期而做出的授精成功或失败的结果预估。在D天后，母牛没有回到发情期则被认为是怀孕。
还应该注意的是，本发明能够毫无例外地快速且便宜地评估所有脊椎动物品种或物种的精液质量。
在本发明的上下文中，在相同动物物种内的术语动物品种是指，针对一定数量的、决定一组性状或形态特征的特性和相同动物物种内的能力的相同总体趋势而言的纯合个体种群，例如，牛品种，马品种，猪品种，绵羊品种，山羊品种，鸭子品种，鸡品种，鹅品种，火鸡品种，兔子品种。
根据本发明的一个特定方面，根据以下数学法则计算所述不返回率Y，
Figure BDA0001635441140000091
其中Xj”(j∈[1；n])是波数σj的吸收的归一化二阶导数并且加权系数β0和βj(j∈[1；n])是常数。
因此确定性地计算不返回率。
优选地，所述加权系数的值是通过处理参考脊椎动物种群的多个精液样品的吸收光谱测量结果而获得的，所述参考脊椎动物种群的不返回率是已知的。
根据本发明的有利实施方案，在所述测量步骤中，测量所述精液样品的至少2个，优选至少3个吸收光谱，并且所述确定吸收值和/或吸收的二阶导数的步骤包括以下步骤：对所述测量光谱进行平均，由此确定所述吸收值和/或吸收的二阶导数。
这降低了对测量伪影和干扰的敏感度。
有利的是，波数σj(j∈[1；n])的数量n大于或等于7，优选地大于或等于9，甚至更优选地大于或等于13，还更优选地大于或等于20。
通过考虑较大但有限数量的波数来增加精液质量测定的准确度。本发明不限于大于或等于4的波数。在不脱离本发明的范围的情况下，波数σj(j∈[1；n])的数量n可以等于2或3。
在本发明的一个优选方面，所述波数分别代表一种分子或一组分子，所述一种分子或一组分子选自至少由以下组成的组：脂质，碳水化合物，蛋白质，核酸，或脂质、碳水化合物、蛋白质或核酸分子与至少一种其他脂质、碳水化合物、蛋白质或核酸分子的组合。例如，对于公牛，我们可以从约600个解释变量中进行选择。
在本发明的一个具体实施方案中，所述脊椎动物是公牛，不返回率是90天的不返回率，所述公牛来自以下品种，所述品种选自由至少一种以下品种组成的组：阿邦当斯(Abondance)，波米滋(Béarnaise)，波尔多(Bordelaise)，布雷东派皮诺(Bretonne pienoir)，布朗(Brune)，弗洛蒙特杜莱昂(Froment du Léon)，泽西岛(Jersiaise)，蒙贝利亚(Montbéliarde)，派鲁德斯普兰斯(Pie rouge des plaines)，普里姆荷斯坦(Prim'Holstein)，弗拉芒红(Rouge flamande)，北方蓝(Bleue du nord)，诺曼底(Normande)，萨勒(Salers)，塔朗泰兹(Tarentaise)。
优选地，所述波数σj(j∈[1；n])中的至少一个选自波数范围[960cm-1；1100cm-1]，[1440cm-1；1550cm-1]或[2800cm-1；3200cm-1]或酰胺B带。
根据本发明的一个特定方面，所述波数σj(j∈[1；n])选自至少由以下组成的组：955.0±0.1cm-1，963.1±0.1cm-1，1012.1±0.1cm-1，1036.6±0.1cm-1，1095.8±0.1cm-1，1124.3±0.1cm-1，1136.6±0.1cm-1,1365.1±0.1cm-1，1383.5±0.1cm-1，1428.4±0.1cm-1，1444.7±0.1cm-1，1452.9±0.1cm-1，1503.9±0.1cm-1，1520.2±0.1cm-1，2805.7±0.1cm-1，2956.7±0.1cm-1，2969.0±0.1cm-1，2987.4±0.1cm-1，3089.4±0.1cm-1，3091.4±0.1cm-1。
在本发明的一个特定方面中，所述波数σj(j∈[1；n])选自至少由以下组成的组：3165±1cm-1，3136±1cm-1，3103±1cm-1，3071±1cm-1，3026±1cm-1，2977±1cm-1，2975±1cm-1，1736±1cm-1，1689±1cm-1，1661±1cm-1，1618±1cm-1，1514±1cm-1，1448±1cm-1，1430±1cm-1，1344±1cm-1，1338±1cm-1，1336±1cm-1，1316±1cm-1，1214±1cm-1，1183±1cm-1，1103±1cm-1，1099±1cm-1，1020±1cm-1，975±1cm-1。
在本发明的一个特定实施方案中，所选定的波数σj(j∈[1；n])的数量n为13，并且所述13个选定波数σj(j∈[1；n])的值为：3165±1cm-1，3136±1cm-1，3103±1cm-1，2975±1cm-1，1736±1cm-1，1661±1cm-1，1515±1cm-1，1448±1cm-1，1430±1cm-1，1316±1cm-1，1214±1cm-1，1020±1cm-1，975±1cm-1。
在本发明的一个特定实施方案中，所选定的波数σj(j∈[1；n])的数量n为15，并且所述15个选定波数σj(j∈[1；n])的值为：3071±1cm-1，3026±1cm-1，2977±1cm-1，1689±1cm-1，1618±1cm-1，1515±1cm-1，1430±1cm-1，1344±1cm-1，1338±1cm-1，1336±1cm-1，1183±1cm-1，1103±1cm-1，1099±1cm-1，1020±1cm-1，975±1cm-1。
优选地，所述测量至少一个吸收光谱的步骤包括以下步骤：由所述精液制备所述样品。
在本发明的特定实施方案中，如上所述的用于确定精液质量的方法包括以下步骤：将所述不返回率Y与预定阈值进行比较，使得可以在所述不返回率Y大于或等于所述预定阈值的情况下选择用于繁殖目的的所述精液。
结果是一种有效的技术，特别易于实施来选择优质精液。
在本发明的一个有利实施方案中，所述阈值大于或等于0.4，优选地大于或等于0.5，甚至更优选地大于或等于0.6。
附图说明
在阅读以下本发明的一个特定实施方案的描述和附图后，本发明的其他特征和优点将变得显而易见，所述本发明的一个特定实施方案的描述仅作为说明性和非限制性示例给出，其中：
-图1以框图形式示出了根据本发明的用于确定公牛精液质量的方法的示例性实施方案的步骤；
-图2表示从管状物(straw)、上清液和沉淀中获得的衍生和标准化MIR光谱；
-图3表示管状物和来自相同射精物的沉淀的根据波数的方差(variance)；
-图4A、4B和5分别示出了70个样品、16个样品和所有这些86个样品的通过用普里姆荷斯坦公牛的射精物样品的20个波数模型而计算的NRR90值与这些样品的已知值之间的关系；
-图6是图5的另一种表示，其中添加了两条线，表示NRR90值相对于模型的差异，分别+5个点和-5个点。
具体实施方式
1.实验方案
所分析的样品是牛的射精物，以管状物形式保存在液氮中。对Prim'Holstein品种的50只不同公牛的130次射精物进行初步分析。用NRR90总量指标来确定射精的质量。
1.1样品制备
在样品制备阶段，第一步，将管状物在37℃的水浴中解冻30秒。第二步，分析管状物。为此，将管状物的内容物放入1.5ml Eppendorf管中。然后将7微升放置在传感器上以采集“管状物”的MIR光谱。第三步，通过在15℃以3500g离心5分钟来提取上清液。然后将上清液放置在传感器上以采集“上清液”光谱。第四步，用600μl 0.9％NaCl冲洗沉淀，然后进行离心。再次将沉淀悬浮于3.5μl的0.9％NaCl中并放置在传感器上以采集“沉淀”光谱。
1.2采集管状物的MIR光谱
在4000至400cm-1的吸光度下获得光谱。光谱分辨率设置为4cm-1，零填充因子为2，并记录64次扫描。
将传感器放入分光计中，记录基线以校准设备，然后将7μl样品放置在传感器上。6分钟后记录光谱。
1.3光谱处理
在3800-940cm-1区域(大多数生物分子的吸收区域)中分析光谱。从2800至1800cm-1生成一条直线以消除CO2的贡献，然后计算从3200至2800cm-1和1800至940cm-1的二阶导数(具有13个平滑点的Savisky-Golay算法)。然后进行二阶导数的矢量归一化。质量标准被定义为拒绝不合格的光谱。
1.4选择用于预测精液质量的基质
做了三种类型的采集并对其进行比较：射精物或总精液、沉淀和上清液(精液的离心)。对光谱的观察(见图2)强调“管状物”210和“上清液”220的光谱具有许多相似之处。对数据进行主成分分析(PCA)以比较光谱。析因图(factorial map)显示由上清液采集的光谱非常接近由总射精物采集的光谱。因此，由管状物采集的光谱含有非常接近于精液的生物化学信息。或者，后者在冷冻前用缓冲液强烈稀释(从3到30倍)，因为所有射精物都以相同的方式处理，因此不是公牛的稀释/冷冻/解冻精液的特定质量的决定因素。由于射精物的稀释度较大或较小，管状物的MIR谱必然反映稀释介质的生物化学组成。因此，这种对于MIR光谱的贡献可能掩盖应该含有从生育角度来看有所不同的光谱信息的精子的贡献。此外，如果考虑仅与较低质量的精液(果糖，pH，......)相关的生育力缺陷，则预计该缺陷被用缓冲介质稀释而抵消。事实证明，仅在细胞上发现了有差异的光谱信息，而在或多或少稀释的总体样品上则没有发现。还考虑了管状物和沉淀230之间的测量结果的变化性。为此，对同一射精物采集的3个光谱计算方差。原始光谱，即非衍生光谱，首先通过多元散射校正MSC方法标准化以克服基线变化。如图3所示，其将方差表示为波数(单位为cm-1)的函数以讨论管状物310和沉淀320，一般来说，从总精液中获取的信号具有更大的变化性，尤其是在1000-940cm-1范围内。
因此，对基本上含有精子的离心沉淀进行测量。
2.构建确定精液质量的模型
2.1参考样品
使用来自40头荷斯坦(Holstein)公牛的86个射精物来建立确定射精物质量的法则或公式，所述40头荷斯坦公牛的90天总不返回率或NRR90总量是已知的。
这些射精物来自在收集其射精物时年龄为11个月至10.5年的公牛。每头公牛的射精物数量分布如下：8、18和14头公牛分别产生1、2或3个射精物。
2.2管状物的制备：
对于每个射精物，六份管状物通过将其放置在37℃的水浴中30秒而解冻。
将六份管状物的内容物倒入1.5ml Eppendorf管中，然后在15℃下以3500g离心5分钟。除去上清液并用600μl 0.9％NaCl冲洗沉淀。该步骤重复一次。第二次漂洗后，再次离心并将沉淀物再次悬浮于10μl的0.9％NaCl中。
2.3光谱的采集
从该制备中，为每个射精物采集三个光谱。在光谱仪上以2cm-1的间距采集各光谱，无论位置如何(即波数)，该光谱仪精度为0.1cm-1。
为了采集每个光谱，将由沉淀和盐溶液形成的7μl悬浮液放置在传感器中。用中红外照射精子，6分钟后记录其吸收光谱。
2.4数据分析
在选择用于进一步分析之前，光谱经过各种标准的质量控制。考虑用于质量控制的标准包括信号强度、干扰、信噪比和含水量。
对三个所采集的光谱进行平均以获得射精物的平均光谱。
根据先前在1.3节中描述的程序对平均光谱进行处理。
对于所有样品，光谱分为两类：来自70个射精物的分析的校准光谱和来自剩余十八个射精物的分析的验证光谱。用校准光谱来构建模型，从而关联要解释的变量(这里是NRR90总量)和解释变量，即光谱波数的优化选择。模型被优化后，用验证光谱来评估模型的预测性能。
通过与10％交叉验证R-PLS相关的遗传算法来减小解释变量。一旦这种减小完成后，通过重复100次线性回归(LR)来优化变量的选择，对初始种群的10％进行交叉验证。通过将其整合到用于预测“未知”样品的法则或线性方程中来验证所接受的解释变量。
2.5构建确定精液质量的模型
将参考样品分成校准亚群和验证亚群。用4/5的射精物进行学习程序，用剩余的第5部分进行验证，并且对于每个亚群，最大化了来自不同公牛但在如下定义的3类NRR90方面具有个体比例代表性的射精物的数量：NRR90<40％、40％≤NRR90≤50％和NRR90>50％。
2.5.1数学模型
由以下公式定义所使用的数学模型：
Figure BDA0001635441140000151
其中：
Y是针对射精物计算的NRR90；
n(n≥4)是模型中所考虑的波数σj(j∈[1；n])的数量；
Xj”是吸收值对波数σj的归一化二阶导数；
β0是原点的偏移量(offset)；
βj(1≤j≤n)是吸收的归一化二阶导数的值Xj”的加权系数，由其标准误差描绘。
2.5.2.模型的实例
五个模型分别由7、9、13、15和20个波数构建，最小化预测误差，RMSEP(“预测的均方根误差”)。
所选定的波数的光谱范围特别涉及脂质3200-2800cm-1、蛋白质(酰胺B带和区域1440-1500cm-1)以及DNA(1514cm-1、1099cm-1和975cm-1)的吸收区域。
a)7个波数模型
该模型详述于下表1中。其计算的决定系数(coefficient of determination)R2(或“多R平方(Multiple R-Squared)”)为0.4804，RMSEP为4.8％。
Figure BDA0001635441140000152
表1
残留物的分布，以最小值、最大值和四分位值表示：
最小值 第1四分位值 中值 第3四分位值 最大值
-0.144853 -0.028759 0.000373 0.033174 0.109250
标准化残差(residual standard error)：0.05298，具有78自由度
调整后的R平方(Adjusted R-Squared)：0.4337
F值或Fisher检验的F值：10,3，超过78自由度，P值或(Fisher检验的P值)：4.455e-09
a)9个波数模型
该9个波数模型详述于下表2中。其计算的多R平方为0.5884，RMSEP为4.49％。
Figure BDA0001635441140000161
表2
残留物的分布，以最小值、最大值和四分位值表示：
最小值 第1四分位值 中值 第3四分位值 最大值
-0.115369 -0.023260 -0.005633 0.021377 0.122507
标准化残差：0.04777，具有76自由度
调整后的多R平方：0.5397
F值：12,07，超过76自由度，P值：1.325e-11
a)13个波数模型
该模型详述于下表3中。其多R平方为0.2972，RMSEP为6.3％。
解释变量j 波数σ(cm<sup>-1</sup>) 系数β 标准误差 检验结果 概率
估计 标准误差 t值 Pr(>|t|)
0 -0.1649 0.2345 -0.703 0.48275
1 3164.886 -1.2917 3.4928 -0.370 0.71191
2 3136.318 3.9653 4.0591 0.977 0.32979
3 3103.67 -1.8260 4.33 -0.422 0.67368
4 2975.115 -6.4489 3.4555 -1.866 0.06346
5 1736.504 3.5545 1.5065 2.359 0.01926
6 1661.004 0.244 1.339 0.182 0.85558
7 1514.085 -13.7841 2.3808 -5.790 2.68e-08
8 1448.787 5.1977 1.584 3.281 0.00122
9 1430.422 -23.5023 3.9896 -5.891 1.59e-08
10 1316.152 6.6227 3.62 1.829 0.06881
11 1214.124 6.0439 3.0219 2 0.04684
12 1020.273 -10.1756 2.5485 -3.993 9.16e-05
13 975.3806 -6.2081 1.4327 -4.333 2.32e-05
表3
残留物的分布，以最小值、最大值和四分位值表示：
Figure BDA0001635441140000181
标准化残差：0.06529，具有201自由度
调整后的R平方：0,2517
F值或Fisher检验的F值：6.537，超过13和201自由度，P值或(Fisher检验的P值)：2.492e-10
a)15个波数模型
该模型详述于下表4中。其多R平方为0.3861，RMSEP为5.9％。
解释变量j 波数σ(cm<sup>-1</sup>) 系数β 标准误差 检验结果 概率
估计 标准误差 t值 Pr(>|t|)
0 0.1618 0.2033 0.796 0.427213
1 3071.021 12.198 4.3248 2.82 0.005281
2 3026.129 3.2041 3.8144 0.84 0.401918
3 2977.156 -6.9854 3.4328 -2.035 0.043185
4 1689.572 1.1852 0.7567 1.566 0.11887
5 1618.152 -4.0715 1.5196 -2.679 0.007995
6 1514.085 -8.8803 2.4751 -3.588 0.00042
7 1430.422 -21.7955 3.7797 -5.767 3.05e-08
8 1344.719 -18.6905 6.149 -3.040 0.002687
9 1338.598 38.3873 14.814 2.591 0.01027
10 1336.557 -29.9668 13.9565 -2.147 0.032991
11 1183.516 9.7122 3.5233 2.757 0.006384
12 1103.935 9.9713 2.9172 3.418 0.000765
13 1099.854 -9.4505 2.0387 -4.636 6.43e-06
14 1020.273 -8.8229 2.4303 -3.630 0.00036
15 975.3806 -2.7333 1.3692 -1.996 0.047276
表4
残留物的分布，以最小值、最大值和四分位值表示：
最小值 第1四分位值 中值 第3四分位值 最大值
-0.178825 -0.031587 0.001598 0.036951 0.163905
标准化残差：0.06133，具有199自由度
调整后的R平方：0.3398
F值或Fisher检验的F值：8.343，超过15和199自由度，P值或(Fisher检验的P值)：1.246e-14
a)20个波数模型
该20个波数模型详述于下表5中。其计算的多R平方为0.7785，RMSEP为3.29％。
Figure BDA0001635441140000191
Figure BDA0001635441140000201
表5
残留物的分布，以最小值、最大值和四分位值表示：
最小值 第1四分位值 中值 第3四分位值 最大值
-0.068317 -0.024352 -0.004114 0.019129 0.086793
标准化残差：0.03789，具有65自由度
调整后的多R平方：0.7104
F值：11.42，超过20和65自由度，P值：2.375e-14
该20个波数模型的相关性示于图4A、4B和5中。
图4A、4B和5显示了由模型预测的NRR值与用于校准的样品(图4A)、用于验证模型的样品(图4B)和用于所有样品(图5)的已知值之间的关系。
如图6所示，对于86％的样品，模型精确到小于5个NRR点。
3.本发明的示例性实施方案
参照图1，以框图形式示出了本发明用于确定脊椎动物精液质量的方法的示例性实施方式的步骤。
在步骤110中，我们使用FT-IR SPID型光谱仪和DIAFIR(注册商标)的传感器LS23，对步骤111中制备的沉淀(来自精液的两份管状物)的吸收光谱进行了3次测量。
在本发明的这个特定实施方案的一个变形中，可以通过透射、通过反射或通过ATR(衰减全反射)测量吸收光谱。
然后对3个所测量的光谱进行平均以获得平均光谱(步骤112)。
在步骤130中，由步骤120中选择的动物品种的平均吸收光谱，确定n个精液特有的波数σj(1≤j≤n)的吸收的二阶导数Xj”。
然后，在步骤140中，根据以下数学法则，使用步骤130中确定的吸收的二阶导数的值Xj”(j∈[1；n])，计算90天不返回率：
Figure BDA0001635441140000211
其中β0和βj(1≤j≤n)是特定于产生精液的动物品种的表型的常数。
在本发明的该特定实施例的变形中，可以设想由动物品种的精液所特有的n个波数σj(1≤j≤n)的吸收值Xj或同时使用动物品种的精液所特有的n个波数σj(1≤j≤n)的吸收值和吸收的二阶导数值来计算90天不返回率。
虽然已经结合若干具体实施方案对本发明进行了描述，但是显而易见的是，本发明不限于此，并且其包括本发明的范围内的所描述的方法及其组合的所有技术上的等同物。
因此，本方法通过选择品种或物种的精液质量所特有的波数(解释变量)来适应品种或物种的表型描述了适用于所有脊椎动物品种或物种的实施例。

Claims (18)

1.一种用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
-测量所述精液样品的至少一个吸收光谱；
-选择n个波数σj(j∈[1；n])，n≥4，所述波数是所述动物品种或物种的精液所特有的；
-由所述至少一个吸收光谱，确定所述n个波数σj(j∈[1；n])的每一个的吸收值Xj和/或吸收的二阶导数的值Xj”(j∈[1；n])；
-由先前确定的吸收的二阶导数的值Xj”来计算在预定义天数的不返回率Y；
其中根据以下数学法则计算所述不返回率Y，
Figure FDA0003121802900000011
其中Xj”(j∈[1；n])是波数σj的吸收值的归一化二阶导数并且加权系数β0和βj(j∈[1；n])是常数。
2.根据权利要求1所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述加权系数的值是通过处理参考脊椎动物种群的多个精液样品的吸收光谱的测量结果而获得的，所述参考脊椎动物种群的不返回率是已知的。
3.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，在所述测量步骤中，测量所述精液样品的至少2个吸收光谱，并且所述确定吸收值和/或吸收的二阶导数的步骤包括以下步骤：对所测量的光谱进行平均，由此确定所述吸收值和/或吸收的二阶导数。
4.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，在所述测量步骤中，测量所述精液样品的至少3个吸收光谱，并且所述确定吸收值和/或吸收的二阶导数的步骤包括以下步骤：对所述测量光谱进行平均，由此确定所述吸收值和/或吸收的二阶导数。
5.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，波数σj(j∈[1；n])的数量n大于或等于7。
6.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，波数σj(j∈[1；n])的数量n大于或等于9。
7.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，波数σj(j∈[1；n])的数量n大于或等于13。
8.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述波数分别代表一种分子或一组分子，所述一种分子或一组分子选自至少由以下组成的组：
-脂质；
-碳水化合物；
-蛋白质；
-核酸；
-脂质、碳水化合物、蛋白质或核酸分子与至少一种其他脂质、碳水化合物、蛋白质或核酸分子的组合。
9.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述脊椎动物是公牛，不返回率是90天的不返回率，所述公牛来自选自由至少一种以下品种组成的组的品种：阿邦当斯，波米滋，波尔多，布雷东派皮诺，布朗，弗洛蒙特杜莱昂，泽西岛，蒙贝利亚，派鲁德斯普兰斯，普里姆荷斯坦，弗拉芒红，北方蓝，诺曼底，萨勒，塔朗泰兹。
10.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述波数σj(j∈[1；n])中的至少一个选自波数范围[960cm-1；1100cm-1]，[1440cm-1；1550cm-1]或[2800cm-1；3200cm-1]或酰胺B带。
11.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述波数σj(j∈[1；n])选自至少包含以下的组：3165±1cm-1，3136±1cm-1，3103±1cm-1，3071±1cm-1，3026±1cm-1，2977±1cm-1，2975±1cm-1，1736±1cm-1，1689±1cm-1，1661±1cm-1，1618±1cm-1，1515±1cm-1，1448±1cm-1，1430±1cm-1，1344±1cm-1，1338±1cm-1，1336±1cm-1，1316±1cm-1，1214±1cm-1，1183±1cm-1，1103±1cm-1，1099±1cm-1，1020±1cm-1，975±1cm-1。
12.根据权利要求11所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所选定的波数σj(j∈[1；n])的数量n等于13，并且所述13个选定波数σj(j∈[1；n])的值为：3165±1cm-1，3136±1cm-1，3103±1cm-1，2975±1cm-1，1736±1cm-1，1661±1cm-1，1515±1cm-1，1448±1cm-1，1430±1cm-1，1316±1cm-1，1214±1cm-1，1020±1cm-1，975±1cm-1。
13.根据权利要求11所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所选定的波数σj(j∈[1；n])的数量n等于15，并且所述15个选定波数σj(j∈[1；n])的值为：3071±1cm-1，3026±1cm-1，2977±1cm-1，1689±1cm-1，1618±1cm-1，1515±1cm-1，1430±1cm-1，1344±1cm-1，1338±1cm-1，1336±1cm-1，1183±1cm-1，1103±1cm-1，1099±1cm-1，1020±1cm-1，975±1cm-1。
14.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述测量至少一个吸收光谱的步骤包括以下步骤：由所述精液制备所述样品。
15.根据权利要求1或2所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，其包括以下步骤：将所述不返回率Y与预定阈值进行比较，从而在所述不返回率Y大于或等于所述预定阈值的情况下选择用于繁殖目的的所述精液。
16.根据权利要求15所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述阈值大于或等于0.4。
17.根据权利要求15所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述阈值大于或等于0.5。
18.根据权利要求15所述的用于确定非人类脊椎动物精液质量的方法，其特征在于，所述阈值大于或等于0.6。
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