BR112018008047B1

BR112018008047B1 - método de determinação da qualidade do sêmen de animais vertebrados não humanos

Info

Publication number: BR112018008047B1
Application number: BR112018008047-0A
Authority: BR
Inventors: François Guillaume; Maena Le Corvec; Thomas De Bretagne; Gildas Michel; Stéphane Basquin; Frédéric Charreaux; Hughes Tariel; Benoit Guyonnet
Original assignee: Union Evolution
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2016-10-15
Publication date: 2021-05-18
Also published as: NZ741347A; BR112018008047A2; DK3365661T3; EP3365661A1; CN108449966A; US10379041B2; CN108449966B; WO2017068266A1; CA3001426A1; CA3001426C; EP3365661B1; US20180313751A1

Abstract

método de determinação da qualidade de sêmen de animais vertebrados. a presente invenção refere-se a um método de determinação da qualidade do sêmen de animais vertebrados. esse método compreende as etapas a seguir: - medição de pelo menos um espectro de absorção de amostras do mencionado sêmen; - seleção de número n de números de ondas (sigma)j (j(pertence)[1;n]) características dos sêmens da raça ou da espécie do mencionado animal; - determinação, a partir do(s) mencionado(s) espectro(s) de absorção, de valor da absorção xj e/ou de valor do segundo derivado da absorção xj (j(pertence)[1;n]) para cada um dos mencionados números de ondas (sigma)j (j(pertence)[1;n]); e - cálculo de taxa de não retorno y em quantidade de dias previamente definida a partir dos mencionados valores de absorção xj e/ou do segundo derivado da absorção xj previamente determinados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo de criação de animais, particularmente de reprodução de gado, aves e peixes.

[002] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método de determinação da qualidade do sêmen de animais vertebrados.

[003] A presente invenção encontra aplicação específica na seleção de sêmen de qualidade para aumentar a taxa de sucesso de inseminação de animais na pecuária ou no controle da qualidade do sêmen de reprodutores.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] No campo da criação de gado, a inseminação é uma etapa importante para otimizar a administração do rebanho. Esta etapa é a mais crucial, pois ela ajuda a maximizar os períodos de produção de leite, por exemplo, no caso de vacas leiteiras. Por estas razões, a qualidade da inseminação e, portanto, do sêmen empregado é essencial.

[005] De fato, inseminação que não causa gestação do animal apresenta impacto negativo sobre a lucrabilidade da fazenda. Para uma vaca, por exemplo, estima-se inseminação bem sucedida pela ausência de retorno a estro registrado durante um período de noventa dias após o ato de inseminação. Se for mal sucedida, a produção anual de leite do animal correspondente sofre impacto direto de redução. Isso gera queda da renda de exploração do criador. Além disso, é necessário repetir a operação de inseminação. É, portanto, importante reduzir as incertezas associadas a essa intervenção.

[006] Desta forma, a avaliação da qualidade do sêmen é um desafio considerável para laboratórios de análise e produtores de sêmen.

[007] Esta qualidade foi examinada em primeiro lugar de acordo com protocolos de seleção de animais. Descobriu-se, entretanto, que animais que possuem patrimônio genético com características muito boas não são necessariamente bons reprodutores. Além disso, a qualidade do sêmen de animais selecionados pela sua boa taxa de reprodução global pode variar em função da saúde dos animais durante a amostragem.

[008] Tentamos então avaliar a qualidade do sêmen coletado. Essa qualidade foi avaliada a partir do sêmen como um todo e/ou dos seus diferentes componentes de acordo com diferentes critérios.

[009] Sêmen é um fluido biológico complexo, que consiste de secreções de diferentes órgãos do trato reprodutor, que contêm os gametas macho. O sêmen consiste, entre outras substâncias, de espermatozoides, plasma seminal e exossomos.

[0010] A fertilidade, que é a capacidade de procriar, é um termo consensual para avaliar a qualidade do sêmen. Este termo apresenta, entretanto, a desvantagem de ser geral e vago. Ele não é satisfatório para realizar a discriminação de indivíduos machos. Consequentemente e segundo as necessidades, foram definidos diferentes critérios para avaliar a fertilidade dos indivíduos.

[0011] Entre os critérios, encontram-se: - taxa de fecundação, que é a taxa de fusão entre os gametas machos e fêmeas, permitindo a formação do zigoto; - TNR, abreviação de taxa de não retorno, é estimativa do resultado da inseminação concluída com sucesso ou falha, com base na ausência de retorno a estro registrado ao longo de intervalo de X dias após o ato de inseminação; - a taxa de concepção, que é o percentual de fêmeas diagnosticadas com gestação ao longo de intervalo de X dias após o ato de inseminação (DeJarnette, J. M., Amann, R. P., Understanding estimates of AI sire fertility: From A to Z, 23a Conferência Técnica sobre Inseminação Artificial e Reprodução, Milwaukee WI, 2010).

[0012] A dificuldade é que a medição desses critérios exige, para obter resultado, espera mais ou menos longa, dependendo da espécie ou da raça dos animais.

[0013] Diversos testes in vitro foram desenvolvidos, portanto, para avaliar o sêmen, alguns dos quais são particularmente recomendados na clínica humana pela Organização Mundial da Saúde (Organização Mundial da Saúde, WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, Genebra: Organização Mundial da Saúde: 2010). Na espécie humana e para outras espécies de vertebrados, os testes existentes não são satisfatórios para prever a fertilidade de amostras de esperma analisadas (De Jonge, C., Semen analysis: looking for an upgrade in class, Fertil. Steril. 2012 - 97: 260266 e Kastelic, J. P., Thundathil, J. C., Breeding soundness evaluation and semen analysis for predicting bull fertility, Reprod. Domest. Anim. Zuchthyg 2008; 43 Supl. 2: 368-373). Os testes macroscópicos (volume, cor, viscosidade...) e microscópicos (mobilidade, concentração, morfologia...) atualmente realizados rotineiramente permitem eliminar sêmens com qualidade extremamente baixa, mas não são conclusivos para identificar a infertilidade idiopática ou animais hipoférteis. Além disso, eles não permitem, por exemplo, prever a variabilidade da fertilidade em touros observada no campo. Esta dificuldade repousa, entre outros, no fato de que os espermatozoides são células complexas e sua avaliação apresenta algumas dificuldades (Mocé, E., Graham, J. K., In vitro evaluation of sperm quality, Anim. Reprod. Sci. 2008; 105: 104-118).

[0014] Um dos problemas inerentes à avaliação da qualidade do sêmen provém do fato de que a amostra contém população heterogênea de espermatozoides. Além da sua formação ao longo da espermatogênese, os espermatozoides atravessam o epidídimo e acumulam-se na extremidade traseira desse órgão até o momento da ejaculação (Dacheux, J-L., Dacheux, F., New insights into epididymal function in relation to sperm maturation, Reprod. Camb. Engl. 2014; 147: R27-42). Os espermatozoides armazenados desta forma originam-se de diferentes ondas de espermatogênese, de forma que os espermatozoides provenientes da mesma ejaculação apresentam diferentes graus de maturação, garantindo, in vivo, maior janela de fecundação. In vivo, durante o seu trânsito ao longo do trato reprodutor feminino, alguns espermatozoides são eliminados da população. Por outro lado, durante a análise in vitro de sêmen, a amostra pode compreender diversos espermatozoides inférteis, que podem ser imóveis, mortos, mal formados etc. (Holt, W. V., van Look, K. J. W., Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality, Reprod. Camb. Engl. 2004; 127: 527-535 e Rodríguez-Martínez, H., Can we increase the estimated value of semen assessment?, Reprod. Domest. Anim. Zuchthyg 2006; 41 Supl. 2: 2-10 e Petrunkina, A. M., Volker, G., Brandt, H., Topfer-Petersen, E., Waberski, D., Functional significance of responsiveness to capacitating conditions in boar spermatozoa, Theriogenology 2005; 64: 1766-1782). Espermatozoides inférteis são, portanto, avaliados, bem como aqueles que poderão fecundar o óvulo.

[0015] Outro problema inerente à determinação da qualidade de sêmen é o fato de que os espermatozoides não reagem uniformemente à mesma tensão (Petrunkina, A. M., Volker, G., Brandt, H., Topfer-Petersen, E., Waberski, D., Functional significance of responsiveness to capacitating conditions in boar spermatozoa, Theriogenology 2005; 64: 1766-1782), mesmo se os espermatozoides apresentarem características similares em certos momentos específicos. Por fim, a complexidade de trabalho com espermatozoides também vem do fato de que essa célula possui múltiplos compartimentos e cada um desses subcompartimentos deve estar intacto e funcional para permitir a fecundação (Amann, R. P., Hammerstedt, R. H., In vitro evaluation of sperm quality: an opinion, J. Androl. 1993; 14: 397-406).

[0016] Para permitir a fecundação, os espermatozoides devem possuir diversas características, tais como mobilidade, produção de ATP, indução de hiperativação, possibilidade de atingir sua capacitação e sua reação acrossômica, membrana de plasma funcional, capacidade de reconhecer e ligar-se à zona pelúcida ou ainda possuir DNA intacto etc. Os espermatozoides são, portanto, células multifuncionais complexas que necessitam de bom funcionamento de diversos parâmetros para atingir seu objetivo final: a fertilização e suporte do desenvolvimento embriônico precoce.

[0017] A infertilidade ou subfertilidade de indivíduos pode ser consequência de uma série de alterações.

[0018] Desta forma, testes que avaliam um dos parâmetros de espermatozoides enfrentam dificuldade para detectar espermatozoides defeituosos em propriedades diferentes da determinada pelo teste. Uma desvantagem desse teste é a fertilidade superestimada da amostra (Graham, J. K., Mocé, E., Fertility evaluation of frozen/thawed semen, Theriogenology 2005; 64: 492-504). Além disso, é pouco provável que o teste de laboratório que avalia um parâmetro de espermatozoides seja capaz de detectar e medir a proporção de espermatozoides que contêm todos os parâmetros necessários para fecundar o ovócito e garantir o desenvolvimento embriônico.

[0019] Por esta razão, os testes de múltiplos parâmetros são interessantes. De fato, a análise de diversos parâmetros de uma amostra de espermatozoides permite a obtenção de vista geral da amostra analisada e aumenta a detecção de parâmetros defeituosos. Desta forma, a análise multiparamétrica explicaria melhor as diferenças de fertilidade entre os diferentes touros analisados (Januskauskas, A., Johannisson, A., Soderquist, L., Rodriguez-Martinez, H., Assessment of sperm characteristics post-thaw and response to calcium ionophore in relation to fertility in Swedish dairy AI bulls, Theriogenology 2000; 53:859-875).

[0020] Outra parte do problema enfrentado para avaliar a fertilidade de animais a partir de resultados de laboratório é resultado de problemas subjacentes à própria análise de laboratório. Para ser válido, o teste de laboratório deverá ser objetivo (criar pouco erro devido ao julgamento ou orientação humana), poder ser repetido (produzir os mesmos resultados durante a repetição do teste), preciso (determinar com precisão um parâmetro dos espermatozoides), rápido e barato (Graham, J. K., Assessment of sperm quality: a flow cytometric approach, Anim. Reprod. Sci. 2001; 68: 239-247). Atualmente, poucos testes de laboratório para análise de sêmen possuem todas essas características.

[0021] Nos últimos anos, o uso do método de análise CASA (abreviatura de análise de esperma assistida por computador) e do método de análise de citometria de fluxo permitiu evolução dos métodos de determinação da qualidade de sêmen em laboratório.

[0022] Uma desvantagem desses métodos de análise de múltiplos parâmetros é que eles não permitem medição in vitro que prevê a fertilidade in vivo. Esta falta de resultados conclusivos pode ser atribuída aos parâmetros e marcadores utilizados para esses testes, que apresentam correlação muito fraca com o fenótipo a ser previsto e/ou são redundantes e/ou seu número é limitado.

[0023] Abordagens de alto rendimento agrupadas com o termo “ômico” ou “fenômico” permitem avaliações mais completas da qualidade do sêmen com interessantes perspectivas tanto na clínica humana (Egea, R. R., Puchalt, N. G., Escrivá, M. M., Varghese, A. C., OMICS: Current and future perspectives in reproductive medicine and technology, J. Hum. Reprod. Sci. 2014; 7: 73-92), quanto na agronomia (Robert, C., Challenges of functional genomics applied to farm animal gametes and pre-hatching embryos, Theriogenology 2008; 70: 1277-1287).

[0024] Uma desvantagem do uso rotineiro desses métodos conhecidos resulta dos seus custos.

[0025] Outra desvantagem é a complexidade de implementação desses métodos.

[0026] Ainda outra desvantagem é que esses métodos conhecidos são realizados a partir de com uma fração de amostra e não com uma amostra intacta.

[0027] Foram propostos outros métodos para permitir a análise de células intactas, especialmente para determinar seu lipidoma (Jones, J. J., Stump, M. J., Fleming, R. C., Lay, J. O. e Wilkins, C. L., Strategies and data analysis techniques for lipid and phospholipid chemistry elucidation by intact cell MALDI-FTMS, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004; 15: 1665-1674) ou seu proteoma (Labas, V., Spina, L., Belleannee, C., Teixeira-Gomes, A-P., Gargaros, A., Dacheux, F. e Dacheux J-L., Analysis of epididymal sperm maturation by MALDI profiling and top-down mass spectrometry, J. Proteomics 2015; 113: 226-243).

[0028] Uma desvantagem desses métodos de análise de células intactas é que eles não permitem a caracterização de espermatozoides intactos para um conjunto de características moleculares e/ou estruturais simultaneamente.

[0029] Também é conhecido um método de análise da qualidade do sêmen por meio de espectroscopia de infravermelho, que consiste particularmente na análise de amostra irradiada sob radiação de infravermelho médio (o comprimento de onda da radiação é de 2,5 μm a 25 μm), também conhecida pela sigla MIR (do inglês, infravermelho médio).

[0030] Quando uma amostra biológica for irradiada por meio de feixe MIR, a radiação será parcial e seletivamente absorvida, dependendo das ligações químicas das diferentes moléculas presentes na amostra. Espectro infravermelho é, portanto, composto de faixas de absorção que podem ser atribuídas a grupos químicos específicos. A posição das faixas depende, por sua vez, da natureza da ligação, mas também do seu ambiente. A posição da faixa de absorção possibilita, portanto, a conexão dessas faixas de absorção a moléculas específicas, tais como proteínas, lipídios ou carboidratos.

[0031] Foram conduzidos estudos de avaliação do desempenho do método espectroscópico no infravermelho médio para diferentes aplicações. Podemos citar, por exemplo, um estudo destinado à tipificação bacteriana (Helm, D., Labischinski, H., Schallehn, G., Naumann, D., Classification and identification of bacteria by Fourier-transform infrared spectroscopy, J. Gen. Microbiol. 1991; 137: 69-79; e Stamm, I., Hailer, M., Depner, B., Kopp, P. A., Rau, J., Yersinia enterocolitica in diagnostic fecal samples from European dogs and cats: identification by fourier transform infrared spectroscopy and matrix- assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, J. Clin. Microbiol. 2013; 51: 887-893), um estudo sobre a identificação de patologias tais como câncer (Backhaus, J., Mueller, R., Formanski, N., Szlama, N., Meerpohl, H-G., Eidt, M., Bugert, P., Diagnosis of breast cancer with infrared spectroscopy from serum samples, Vib. Spectrosc. 2010; 52: 173-177; e Kallenbach-Thieltges, A., Groβemschkamp, F., Mosig, A., Diem, M., Tannapfel, A. e Gerwert. K., Immunohistochemistry, histopathology and infrared spectral histopathology of colon cancer tissue sections, J. Biophotonics, 2013; 6: 88100; e Lewis, P. D., Lewis, K. E., Ghosal, R., Bayliss, S., Lloyd, A. J., Wills, J., Godfrey, R., Kloer, P. e Mur, L. A. J., Evaluation of FTIR spectroscopy as a diagnostic tool for lung cancer using sputum, BMC Cancer 2010; 10: 640), ou patologias articulares (Canvin, J. M. G., Bernatsky, S., Hitchon, C. A., Jackson, M., Sowa, M. G., Mansfield, J. R., Eysel, H. H., Mantsch, H. H. e El-Gabalawy, H. S., Infrared spectroscopy: shedding light on synovitis in patients with rheumatoid arthritis, Rheumatol. Oxf. Engl. 2003; 42: 76-82) ou a detecção de contaminantes na indústria alimentícia (de Carvalho, B. M. A., de Carvalho, L. M., Reis Coimbra, J. S. dos, Minim, L. A., de Souza Barcellos, E., da Silva Júnior, W. F., Detmann, E. e de Carvalho, G. G. P., Rapid detection of whey in milk powder samples by spectrophotometric and multivariate calibration, Food Chem. 2015; 174: 1-7).

[0032] Análise espectroscópica por infravermelho de ondas evanescentes, conhecida pela sigla FEWS (do inglês Fiber Evanescent Wave Spectroscopy), permite trabalhar no MIR. Esta análise é baseada na utilização de sensor composto de fibra óptica de vidro de calcogeneto descrito, por exemplo, nos documentos FR 2958403, WO 2013017324 e FR 1450661. Quando uma onda de luz se propaga em fibra óptica, ela o faz por meio de múltiplas reflexões, em que todos esses raios constituem a onda evanescente. Esta onda pode ser então absorvida por um meio em contato com a fibra.

[0033] Esta técnica oferece inúmeras vantagens. Ao contrário das análises discretas destinadas a pesquisar e/ou quantificar certos metabólitos definidos inicialmente, a análise de MIR possibilita a obtenção de imagem global do perfil metabólico da amostra em uma única análise, de forma a levar em conta as interações entre as moléculas. A particularidade do sensor de fibras ópticas torna-o uma ferramenta que pode ser utilizada em meio líquido, sendo ao mesmo tempo insensível ao teor de água das amostras, ao contrário de outros métodos de obtenção. O resultado é rápido e não exige tratamento específico das amostras.

[0034] Numerosos usos de espectroscopia de Raman já exibiram percepções sobre o potencial deste método aplicado ao campo da reprodução (Mallidis, C., Sanchez, V., Wistuba, J., Wuebbeling, F., Burger, M., Fallnich, C., Schlatt, S., Raman microspectroscopy: shining a new light on reproductive medicine, Hum. Reprod. Update 2014; 20: 403-414). Este método foi aplicado à avaliação da integridade de DNA dos espermatozoides (Mallidis, C., Wistuba, J., Bleisteiner, B., Damm, O. S., Gross, P., Wübbeling, F., Fallnich, C., Burger, M., Schlatt, S., In situ visualization of damaged DNA in human sperm by Raman microspectroscopy, Hum. Reprod. Oxf. Engl. 2011; 26: 1641-1649; e Mallidis, C., Schlatt, S., Wistuba, J., Fallnich, C., Gross, P., Burger, M. e Wuebbeling, F., Means and methods for assessing sperm nuclear DNA structure, WO 2013064159 A1, 2013), à análise do acrossomo para determinar a capacidade de fecundação dos espermatozoides ($!$, ^S, xUíã, MW, ÍU^^, Sperm acrosome zone Raman spectrum peak and use thereof, CN 103698310A, 2014) ou análise de plasma seminal para fins de diagnóstico (Huang, Z., Chen, X., Chen, Y., Chen, J., Dou, M., Feng, S., Zeng, H. e Chen, R., Raman spectroscopic characterization and differentiation of seminal plasma, J. Biomed. Opt. 2011; 16: 110501-1105013).

[0035] Ela nunca foi utilizada, entretanto, para caracterizar uma amostra completa de sêmen.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[0036] O objeto da presente invenção é, particularmente, solucionar as desvantagens do estado da técnica mencionadas acima.

[0037] Mais especificamente, a presente invenção destina-se a fornecer um método de determinação da qualidade do sêmen de animais vertebrados que seja eficaz e confiável para qualquer tipo de sêmen.

[0038] Outro objeto da presente invenção é o de fornecer um método que seja de implementação simples e rápida.

[0039] A presente invenção também se destina a fornecer um método de determinação da qualidade do sêmen de animais vertebrados, com preço de custo reduzido.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0040] Estes e outros objetivos que se tornarão evidentes a seguir são atingidos com o auxílio de um método de determinação da qualidade do sêmen de animais vertebrados.

[0041] No contexto da presente invenção, compreende-se o termo “animal” com seu significado atual, ou seja, ser vivo heterotrófico não humano. Em outras palavras, a presente invenção refere-se a um método de determinação da qualidade do sêmen de animais vertebrados não humanos. Eles podem ser, por exemplo, animais de criação grandes, animais de criação pequenos, aves ou peixes.

[0042] Este método de determinação da qualidade do sêmen de animais vertebrados compreende as etapas a seguir: - medição de pelo menos um espectro de absorção de amostras do mencionado sêmen; - seleção de número n, em que n > 4, de números de ondas Gj (je[i;n]> característicos dos sêmens da raça ou da espécie do mencionado animal; - determinação, a partir do(s) mencionado(s) espectro(s) de absorção, de valor da absorção Xj e/ou de valor do segunda derivada da absorção Xj” (je[1; n]) para cada um dos mencionados números de onda n Gj (je[1; n]); e - cálculo de taxa de não retorno Y em quantidade de dias previamente definida a partir dos mencionados valores de absorção Xj e/ou do segunda derivada da absorção Xj” previamente determinados.

[0043] De forma sem precedentes, portanto, a presente invenção propõe o uso do espectro de absorção do sêmen para avaliar a qualidade do sêmen de animais, a partir de quantidade reduzida de números de ondas representativos de variáveis explicativas, que são características de sêmens da raça ou da espécie do animal.

[0044] A presente invenção possibilita particularmente a determinação de taxa de não retorno, tal como taxa de não retorno em aquecimento a 22, 28, 30, 56, 90 ou 120 dias, para 98% do sêmen de uma raça ou espécie de animal com precisão de ± 10 pontos, a partir de apenas vinte variáveis explicativas e com precisão de ± 5 pontos para 86 % do sêmen. Salienta-se que a taxa de não retorno após D dias (TNRD) é estimativa do resultado da inseminação, bem ou mal sucedida, com base na ausência de retorno a estro registrado ao longo de um intervalo de D dias após o ato da inseminação. Após D dias, as vacas que não retornam a estro são consideradas grávidas.

[0045] Deve-se também observar que a presente invenção permite avaliar a qualidade do sêmen de todas as raças ou espécies de animais vertebrados, sem exceção, de forma rápida e a baixo custo.

[0046] No contexto da presente invenção, compreende-se raça de animal, dentro da mesma espécie de animal, como população de indivíduos homozigóticos para uma certa quantidade de características que condicionam um conjunto de características ou funções morfológicas e a mesma tendência geral de aptidões na mesma espécie de animal, tal como uma raça de bovinos, raça de equinos, raça de suínos, raça de carneiros, raça de cabras, raça de patos, raça de galinhas, raça de gansos, raça de perus, raça de coelhos etc.

[0047] Segundo um aspecto específico da presente invenção, a mencionada taxa de não retorno Y é calculada de acordo com a equação:

em que Xj” <je[i;n]) é o segunda derivada normalizada da absorção para o número de ondas oj e os coeficientes de ponderação β0 e βj <je[1;n]) são constantes.

[0048] A taxa de não retorno é, portanto, calculada de forma determinista.

[0049] Preferencialmente, os valores dos mencionados coeficientes de ponderação são obtidos por meio de processamento das medições de espectro de absorção de uma série de amostras de sêmen de uma população de vertebrados de referência, cujas taxas de não retorno são conhecidas.

[0050] Segundo uma realização vantajosa da presente invenção, durante a mencionada etapa de medição, pelo menos dois, preferencialmente pelo menos três espectros de absorção de uma amostra do mencionado sêmen são medidos e a mencionada etapa de determinação de valores da absorção e/ou segundos derivados da absorção compreende uma etapa de cálculo da média dos mencionados espectros medidos dos quais são determinados os mencionados valores de absorção e/ou segundos derivados de absorção.

[0051] Isso reduz ainda a sensibilidade a artefatos de medição e distúrbios.

[0052] Convenientemente, o número n de números de onda Gj <je[i; n]) é maior ou igual a sete, preferencialmente maior ou igual a nove, de preferência ainda maior, maior ou igual a treze e, de preferência ainda maior, maior ou igual a vinte.

[0053] A precisão de avaliação da qualidade do sêmen aumenta considerando-se quantidade maior, mas limitada, de números de ondas.

[0054] A presente invenção não se limita a números de onda maiores ou iguais a 4. O número n de números de ondas Gj <je[i; n]) pode ser igual a 2 ou 3 sem abandonar o escopo da presente invenção.

[0055] Em um aspecto preferido da presente invenção, cada um dos mencionados números de ondas é representativo de uma molécula ou conjunto de moléculas selecionadas a partir do grupo que compreende, pelo menos: - lipídios; - carboidratos; - proteínas; - ácidos nucleicos; ou - uma combinação de molécula de lipídio, carboidrato, proteína ou molécula de ácido nucleico com pelo menos uma outra molécula de lipídio, carboidrato, proteína ou molécula de ácido nucleico.

[0056] Para touros, por exemplo, podemos selecionar a partir de cerca de 600 variáveis explicativas.

[0057] Em uma realização específica da presente invenção, o mencionado vertebrado é um touro e a taxa de não retorno é uma taxa de não retorno de 90 dias, em que o mencionado touro é originário de uma raça selecionada a partir do grupo que compreende pelo menos Abondance, Béarnaise, Bordelaise, Bretonne pie noir, Brune, Froment du Léon, Jersiaise, Montbéliarde, Pie rouge des plaines, Prim’Holstein, Rouge flamande, Bleue du nord, Normande, Salers e Tarentaise.

[0058] Preferencialmente, pelo menos um dos mencionados números de ondas oj <je[i;n]) é selecionado a partir da faixa de números de onda [960 cm-1; 1100 cm-1], [1440 cm-1; 1550 cm-1] ou [2800 cm-1; 3200 cm-1] ou na faixa intermediária B.

[0059] Segundo um aspecto específico da presente invenção, os mencionados números de ondas oj <je[1;n]) são selecionados a partir do grupo que compreende pelo menos 955,0 ± 0,1 cm-1, 963,1 ± 0,1 cm-1, 1012,1 ± 0,1 cm-1 , 1036,6 ± 0,1 cm-1, 1095,8 ± 0,1 cm-1, 1124,3 ± 0,1 cm-1, 1136,6 ± 0,1 cm-1 ,1365,1 ± 0,1 cm-1, 1383,5 ± 0,1 cm-1, 1428,4 ± 0,1 cm-1, 1444,7 ± 0,1 cm-1, 1452,9 ± 0,1 cm-1, 1503,9 ± 0,1 cm-1, 1520,2 ± 0,1 cm-1, 2805,7 ± 0,1 cm-1, 2956,7 ± 0,1 cm-1 , 2969,0 ± 0,1 cm-1, 2987,4 ± 0,1 cm-1, 3089,4 ± 0,1 cm-1 ou 3091,4 ± 0,1 cm-1.

[0060] Em uma realização específica da presente invenção, os mencionados números de ondas oj (je[i;n]> são selecionados a partir do grupo que compreende pelo menos 3165 ± 1 cm-1, 3136 ± 1 cm-1, 3103 ± 1 cm-1, 3071 ± 1 cm-1, 3026 ± 1 cm-1, 2977 ± 1 cm-1, 2975 ± 1 cm-1, 1736 ± 1 cm-1, 1689 ± 1 cm-1, 1661 ± 1 cm-1, 1618 ± 1 cm-1, 1514 ± 1 cm-1, 1448 ± 1 cm-1, 1430 ± 1 cm-1, 1344 ± 1 cm-1, 1338 ± 1 cm-1, 1336 ± 1 cm-1, 1316 ± 1 cm-1, 1214 ± 1 cm-1, 1183 ± 1 cm-1, 1103 ± 1 cm-1, 1099 ± 1 cm-1, 1020 ± 1 cm-1 ou 975 ± 1 cm-1.

[0061] Em uma realização específica da presente invenção, o número n dos mencionados números de ondas oj <je[i; n]) selecionados é igual a 13 e os valores dos mencionados treze números de ondas oj<je[1; n]) selecionados são: 3i65 ± i cm-i, 3i36 ± i cm-i, 3i03 ± i cm-i, 2975 ± i cm- 1, 1736 ± 1 cm-1, 1661 ± 1 cm-1, 1515 ± 1 cm-1, 1448 ± 1 cm-1, 1430 ± 1 cm-1, 1316 ± 1 cm-1, 1214 ± 1 cm-1, 1020 ± 1 cm-1 e 975 ± 1 cm-1.

[0062] Em uma realização específica da presente invenção, o número n dos mencionados números de ondas oj <je[1; n]) selecionados é igual a quinze e os valores dos mencionados quinze números de ondas selecionados oj(je[1; n]) são: 3071 ± 1 cm-1, 3026 ± 1 cm-1, 2977 ± 1 cm-1, 1689 ± 1 cm-1, 1618 ± 1 cm-1, 1515 ± 1 cm-1, 1430 ± 1 cm-1, 1344 ± 1 cm-1, 1338 ± 1 cm-1, 1336 ± 1 cm-1, 1183 ± 1 cm-1, 1103 ± 1 cm-1, 1099 ± 1 cm-1, 1020 ± 1 cm-1 e 975 ± 1 cm-1.

[0063] Preferencialmente, a mencionada etapa de medição de pelo menos um espectro de absorção compreende uma etapa de preparação da mencionada amostra a partir do mencionado sêmen.

[0064] Em uma realização específica da presente invenção, o método de determinação da qualidade de sêmen conforme descrito acima compreende uma etapa de comparação da mencionada taxa de não retorno Y com limite previamente determinado, possibilitando a seleção do mencionado sêmen para fins de reprodução no caso em que a mencionada taxa de não retorno Y é maior ou igual ao mencionado limite previamente determinado.

[0065] O resultado é, portanto, um método eficaz e de implementação particularmente simples de seleção de sêmens de qualidade.

[0066] Em uma realização vantajosa da presente invenção, o mencionado limite é maior ou igual a 0,4, preferencialmente maior ou igual a 0,5 e, de preferência ainda maior, maior ou igual a 0,6.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0067] Outras características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes mediante leitura da descrição a seguir de uma realização específica da presente invenção, fornecida a título de simples exemplo ilustrativo e não limitador e com os desenhos anexos, nos quais: - a Figura 1 ilustra, em forma de diagrama de blocos, as etapas de um exemplo de realização de um método de determinação da qualidade de sêmen de touro de acordo com a presente invenção; - a Figura 2 representa espectros MIR, derivados e padronizados, obtidos a partir de um canudo, sobrenadante e pelota; - a Figura 3 é uma representação da variação de um canudo e pelota provenientes do mesmo ejaculado, em função do número de onda; - as Figuras 4A, 4B e 5 ilustram a correlação entre valores TNR90 calculados por meio de um modelo com 20 números de ondas para amostras de ejaculado de touros Prim’Holstein e valores conhecidos para essas mesmas amostras, respectivamente para 70 amostras, 16 amostras e para o conjunto dessas 86 amostras; e - a Figura 6 é outra representação da Figura 5, à qual foram adicionadas duas linhas, que representam diferença de valor do TNR90 com relação ao modelo, respectivamente, em +5 pontos e -5 pontos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO PROTOCOLO EXPERIMENTAL

[0068] As amostras analisadas são ejaculados bovinos na forma de canudos, preservados em nitrogênio líquido. Foram realizadas análises preliminares sobre 130 ejaculados provenientes de 50 touros diferentes da linhagem Prim’Holstein. O indicador bruto NRR90 foi utilizado para determinar a qualidade dos ejaculados. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS

[0069] Durante o estágio de preparação das amostras, em primeira etapa, os canudos são descongelados em banho-maria a 37 °C por trinta segundos. Em segunda etapa, os canudos são analisados. Para isso, o conteúdo dos canudos é colocado em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Sete microlitros são depositados em seguida sobre o sensor para obtenção de espectro de MIR de um “canudo”. Em terceira etapa, o sobrenadante é extraído por meio de centrifugação a 3500 g por cinco minutos a 15 °C. O sobrenadante é depositado em seguida sobre o sensor para obtenção do espectro de “sobrenadante”. Em quarta etapa, a pelota é enxaguada com 600 μl de NaCl a 0,9% e realiza-se centrifugação em seguida. A pelota é novamente suspensa em 3,5 μl de NaCl a 0,9% e depositada sobre o sensor para obtenção do espectro de “pelota”. OBTENÇÃO DE ESPECTRO DE MIR DE CANUDO

[0070] Os espectros são obtidos em absorção de 4000 a 400 cm- 1. A resolução de espectro é definida em 4 cm-1, com fator de preenchimento de zeros de 2, e são registradas 64 varreduras.

[0071] É colocado um sensor no espectrômetro, o nível inicial é registrado para calibrar o dispositivo e, em seguida 7 μl de amostra são depositados sobre o sensor. O espectro é registrado após seis minutos. PROCESSAMENTO DOS ESPECTROS

[0072] Os espectros são analisados no domínio de 3800-940 cm-1, o domínio de absorção da maior parte das biomoléculas. É gerada uma linha reta de 2800 a 1800 cm-1 para eliminar a contribuição de CO2 e, em seguida, o segunda derivada (algoritmo de Savisky-Golay com 13 pontos de amortecimento) é calculado de 3200 a 2800 cm-1 e de 1800 a 940 cm-1. É conduzida em seguida normalização vetorial dos segundos derivados. São definidos critérios de qualidade para rejeitar espectros sem conformidade. SELEÇÃO DA MATRIZ PARA PREVISÃO DA QUALIDADE DO SÊMEN

[0073] Foram elaborados e comparados três tipos de obtenção: ejaculado ou sêmen total, pelota e sobrenadante (centrifugação do sêmen). Observação dos espectros (vide a Figura 2) destaca que os espectros de “canudo” 210 e “sobrenadante” 220 possuem numerosas similaridades. Realiza-se análise de componentes principais (ACP) sobre os dados, a fim de comparar os espectros. O mapa fatorial demonstra que os espectros obtidos a partir do sobrenadante são muito próximos dos obtidos do ejaculado total. Desta forma, os espectros obtidos a partir dos canudos contêm informações bioquímicas muito próximas do líquido seminal. Alternativamente, este último é fortemente diluído (3 a 30 vezes) em tampão antes do congelamento e, portanto, não é determinante da qualidade específica do sêmen diluído/congelado/descongelado do touro, pois todos os ejaculados são tratados da mesma forma. Devido à diluição maior ou menor do ejaculado, os espectros de MIR dos canudos refletem necessariamente a composição bioquímica do meio de diluição. Esta contribuição para os espectros de MIR pode, portanto, mascarar a dos espermatozoides, que se supõe conterem as informações de espectro que estabelecem a diferença do ponto de vista da fertilidade. Além disso, caso seja considerado um defeito de fertilidade ligado apenas à qualidade mais baixa do líquido seminal (frutose, pH etc.), espera-se que este defeito seja compensado pela diluição no meio tampão. Ocorre que as informações de espectro que estabelecem a diferença devem ser pesquisadas apenas sobre as células isoladas e não sobre a amostra global mais ou menos diluída. A variabilidade das medições entre canudos e pelotas 230 também foi levada em consideração. Para isso, as variações foram calculadas sobre os três espectros obtidos para o mesmo ejaculado. Os espectros brutos, ou seja, os espectros não derivados, foram padronizados em primeiro lugar por meio do método antidispersão MSC (abreviação inglesa para Multiplicative Scatter Correction), a fim de superar notadamente as variações do nível inicial. Conforme exibido na Figura 3, com representação da variação em função do número de ondas (em cm-1) para análise dos canudos 310 e da pelota 320, ocorre geralmente que os sinais obtidos do sêmen total apresentam mais viabilidade, especialmente na faixa de 1000-940 cm-1.

[0074] As medições são, portanto, conduzidas sobre a pelota de centrifugação que contém essencialmente os espermatozoides. CONSTRUÇÃO DE MODELOS DE DETERMINAÇÃO DA QUALIDADE DO SÊMEN AMOSTRAS DE REFERÊNCIA

[0075] Oitenta e seis ejaculados provenientes de 40 touros da raça Prim’Holstein, cuja taxa de não retorno bruta após 90 dias, ou TNR90 bruta, é conhecida, foram utilizados para o estabelecimento da lei ou equação para determinar a qualidade do ejaculado.

[0076] Estes ejaculados são provenientes de touros com 11 meses a 10,5 anos de idade no momento da coleta dos seus ejaculados. A distribuição do número de ejaculados por touro é a seguinte: 8, 18 e 14 touros produziram, respectivamente, 1, 2 ou 3 ejaculados. PREPARAÇÃO DE CANUDOS

[0077] Para cada ejaculado, seis canudos são descongelados colocando estes últimos em banho-maria a 37 °C por trinta segundos.

[0078] O conteúdo de seis canudos é esvaziado em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e, em seguida, sofre centrifugação a 3500 g por cinco minutos a 15 °C. O sobrenadante é removido e a pelota é enxaguada com 600 μl de NaCl a 0,9%. Esta etapa é renovada uma vez. Após o segundo enxágue, aplica-se nova centrifugação e a pelota é novamente suspensa em 10 μl de NaCl a 0,9%. OBTENÇÃO DOS ESPECTROS

[0079] A partir desta preparação, procede-se à obtenção de três espectros para cada ejaculado. A obtenção de cada um dos espectros é conduzida com inclinação de 2 cm-1 sobre um espectrômetro cuja precisão, seja qual for a posição, ou seja, o número de onda, é de 0,1 cm-1.

[0080] Para obter cada um dos espectros, 7 μl da suspensão formada da pelota e solução salina são depositados no sensor. Os espermatozoides são irradiados no infravermelho médio e seu espectro de absorção é registrado após seis minutos. ANÁLISE DOS DADOS

[0081] Os espectros são submetidos a controle de qualidade com base em vários critérios antes da seleção para análise adicional. Os critérios considerados para controle de qualidade compreendem a potência do sinal, interferência, relação sinal-ruído e teor de água.

[0082] Calcula-se a média de três espectros obtidos para obter espectro médio do ejaculado.

[0083] O espectro médio é tratado de acordo com o procedimento descrito anteriormente no parágrafo 6.1.3.

[0084] Para todas as amostras, os espectros são divididos em duas categorias, os espectros de calibragem provenientes da análise de 70 ejaculados e os espectros de validação provenientes da análise dos 18 ejaculados restantes. Os espectros de calibragem servem para construir o modelo a fim de relacionar uma variável a ser explicada, neste caso a TNR90 bruta, e variáveis de explicação, ou seja, seleção otimizada de números de ondas do espectro. Após a otimização do modelo, os espectros de validação são utilizados para avaliar o desempenho de previsão do mencionado modelo.

[0085] A redução de variáveis explicativas é realizada por meio de algoritmo genético associado a R-PLS com validação cruzada a 10%. Após o término dessa redução, a seleção das variáveis explicativas é otimizada por meio da repetição de cem regressões lineares (LRs), com validação cruzada sobre 10% da população inicial. A validação das variáveis explicativas retidas é realizada por meio da sua integração à lei ou equação linear destinadas à previsão de amostras "desconhecidas".

[0086] Construção de modelos de determinação da qualidade do sêmen:

[0087] As amostras de referência são divididas em uma subpopulação de calibragem e uma subpopulação de validação. A aprendizagem é conduzida sobre 4/5 dos ejaculados, a validação sobre o quinto restante e, para cada uma das subpopulações, maximiza-se a quantidade de ejaculados de touros diferentes que possuem representatividade proporcional dos indivíduos em três classes de TNR90 definidas conforme segue: TNR90 < 40%, 40% < TNR90 < 50% e TNR90 > 50%. MODELO MATEMÁTICO

[0088] O modelo matemático utilizado é definido pela fórmula:

em que: - Y é o TNR90 calculado para o ejaculado; - n (n > 4) é o número de números de ondas ai consideradas no modelo; - Xj” é a segunda derivada normalizada do valor da absorção dos números de ondas oj; - β0 é o desvio na origem; e - βj (1<j<n) é o coeficiente de ponderação do valor da segunda derivada normalizada da absorção Xj'', limitado pelo seu desvio padrão. EXEMPLOS DE MODELOS

[0089] São construídos cinco modelos a partir, respectivamente, de 7, 9, 13, 15 e 20 números de ondas, minimizando o erro de previsão, RMSEP (sigla em inglês de Root-Mean-Square Error of Prediction, previsão sobre a raiz quadrada do erro médio).

[0090] As faixas de espectro de números de ondas selecionados referem-se particularmente ao campo de absorção de lipídios de 3200-2800 cm-1, proteínas (faixa de amida B e domínio de 1440-1500 cm-1), bem como DNA (1514 cm-1, 1099 cm-1 e 975 cm-1). A. MODELO DE COM SETE NÚMEROS DE ONDAS

[0091] Este modelo é detalhado na Tabela 1 abaixo. Ele apresenta coeficiente de determinação calculado R2 (ou R ao quadrado múltiplo) de 0,4804 e RMSEP de 4,8%. TABELA 1

[0092] Distribuição de resíduos, em mínimo, máximo e quartis:

[0093] Desvio padrão residual: 0,05298 com 78 graus de liberdade.

[0094] Coeficiente de determinação ajustado (R2 ajustado ou Adjusted R-Squared em inglês): 0,4337.

[0095] F estatístico (valor F ou valor F do teste de Fisher): 10,3 sobre 78 graus de liberdade; valor P (valor P do teste de Fisher): 4,455e-09. B. MODELO COM NOVE NÚMERO DE ONDAS

[0096] Este modelo com nove números de ondas é detalhado na Tabela 2 abaixo. Ele apresenta coeficiente de determinação calculado R2 de 0,5884 e RMSEP de 4,49%. TABELA 2

[0097] Distribuição de resíduos em mínimo, máximo e quartis:

[0098] Desvio padrão residual: 0,04777 com 76 graus de liberdade.

[0099] Coeficiente de determinação ajustado: 0,5397.

[00100] F estatístico: 12,07 sobre 76 graus de liberdade, valor P: 1,325e-11. c. MODELO COM TREZE NÚMEROS DE ONDAS

[00101] Este modelo é detalhado na Tabela 3 abaixo. Ele apresenta coeficiente de determinação calculado R2 (ou R2 múltiplo) de 0,2972 e RMSEP de 6,3%. TABELA 3

[00102] Distribuição dos resíduos, em mínimo, máximo e quartis:

[00103] Desvio padrão residual: 0,06529 com 201 graus de liberdade.

[00104] Coeficiente de determinação ajustado (R2 ajustado): 0,2517.

[00105] F estatístico (valor F ou valor F do teste de Fisher): 6,537 sobre 13 e 201 graus de liberdade, valor P (valor P ou teste de Fisher): 2,492e-10. D. MODELO COM QUINZE NÚMEROS DE ONDAS

[00106] Este modelo é detalhado na Tabela 4 abaixo. Ele apresenta coeficiente de determinação calculado R2 (ou R ao quadrado múltiplo) de 0,3861 e RMSEP de 5.9%. TABELA 4

[00107] Distribuição dos resíduos, em mínimo, máximo e quartis:

[00108] Desvio padrão residual: 0,06133 com 199 graus de liberdade.

[00109] Coeficiente de determinação ajustado (R2 ajustado): 0,3398.

[00110] F estatístico (valor F ou valor F do teste de Fisher): 8,343 sobre 15 e 199 graus de liberdade, valor P (valor P do teste de Fisher): 1,246e-14. E. MODELO COM 20 NÚMERO DE ONDAS

[00111] Este modelo com 20 números de ondas é detalhado na Tabela 5 abaixo. Ele possui coeficiente de determinação calculado R2 de 0,7785 e RMSEP de 3,29%. TABELA 5

[00112] Distribuição de resíduos, em mínimo, máximo e quartis:

[00113] Desvio padrão residual: 0,03789 com 65 graus de liberdade.

[00114] Coeficiente de determinação ajustado: 0,7104.

[00115] F estatístico: 11,42 sobre 20 e 65 graus de liberdade; valor P: 2,375e-14.

[00116] A relevância desse modelo com 20 números de ondas é ilustrada nas Figuras 4A, 4B e 5.

[00117] Nas Figuras 4A, 4B e 5, é representada a correlação entre os valores de TNR previstos pelo modelo e os valores conhecidos para as amostras utilizadas para calibragem (Figura 4A), para validação do modelo (Figura 4B) e para o conjunto das amostras (Figura 5).

[00118] Como se pode observar na Figura 6, para 86% das amostras, o modelo é preciso até menos de 5 pontos de TNR. EXEMPLO

[00119] São ilustradas com referência à Figura 1, na forma de diagrama sinótico, as etapas de um exemplo de realização de método de determinação da qualidade de sêmen de um animal vertebrado de acordo com a presente invenção.

[00120] Na etapa 110, medimos três vezes o espectro de absorção de pelotas preparadas e, na etapa 111, a partir de dois canudos de sêmen, com o auxílio do espectrômetro modelo FT-IR SPID com sensor LS23 da DIAFIR (marca registrada).

[00121] Em variação desta realização específica da presente invenção, o espectro de absorção pode ser medido por meio de transmissão, reflexão ou ATR (sigla em inglês de reflexão total atenuada).

[00122] É calculada em seguida a média dos três espectros medidos, a fim de obter um espectro médio (etapa 112).

[00123] Na etapa 130, determina-se, a partir do espectro de absorção médio, o valor da segunda derivada da absorção X” para n números de ondas oj (l<j<n) característicos dos sêmens da raça do animal, selecionado durante a etapa 120.

[00124] Calcula-se em seguida, durante a etapa 140, a taxa de não retorno de 90 dias a partir da equação a seguir:

em que os coeficientes βo e βj (1 <j<n) são constantes específicas do fenótipo do fenótipo da raça do animal que produziu o sêmen, utilizando os valores dos segundos derivados da absorção Xj'' (je[1;n]> determinados na etapa 130.

[00125] Em variações desta realização específica da presente invenção, pode-se idealizar o cálculo da taxa de não retorno de 90 dias a partir dos valores de absorção Xj para n números de ondas cj (1<j<n) característicos dos sêmens da raça do animal ou utilizando, alternativamente, os valores da absorção e valores da segunda derivada da absorção para os n números de ondas cj (1 <j<n) característicos dos sêmens da raça do animal.

[00126] Embora a presente invenção tenha sido descrita com relação a diversas realizações específicas, é óbvio que ela não é limitada a estas e compreende todos os equivalentes técnicos dos meios descritos e suas combinações que se encontrem dentro do escopo da presente invenção.

[00127] Desta forma, o método descrito com relação a um exemplo é aplicável a todas as linhagens ou as espécies de vertebrados animais, adaptando- se ao fenótipo da raça ou espécie por meio da seleção de números de ondas (variáveis explicativas) característicos da qualidade do sêmen da raça ou espécie.

Claims

1. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA QUALIDADE DO SÊMEN DE ANIMAIS VERTEBRADOS NÃO HUMANOS, caracterizado por compreender as etapas a seguir: - medição de pelo menos um espectro de absorção de uma amostra do mencionado sêmen; - seleção de um número n, em que n > 4, de números de ondas oj <je[i;n]) que são característicos dos sêmens da raça ou da espécie do mencionado animal; - determinação, a partir do mencionado pelo menos um espectro de absorção, de valor da absorção Xj e/ou de valor da segunda derivada da absorção Xj” (je[1; n]) para cada um dos mencionados n números de ondas oj <je[1; n]); e - cálculo de taxa de não retorno Y em número de dias previamente definido a partir dos mencionados valores de absorção Xj e/ou da segunda derivada da absorção Xj” previamente determinados.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela mencionada taxa de não retorno Y ser calculada de acordo com a lei matemática Y = β0 + ∑'l,=1β]X]’’, em que Xj” <je[1;n]) é a segunda derivada normalizada do valor de absorção para o número de ondas oj e os coeficientes de ponderação β0 e βj <je[1;n]) serem constantes.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelos valores dos mencionados coeficientes de ponderação serem obtidos por meio de processamento das medições dos espectros de absorção de uma série de amostras de sêmen de uma população de vertebrados de referência, cujas taxas de não retorno são conhecidas.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por, na mencionada etapa de medição, pelo menos dois, preferencialmente pelo menos três espectros de absorção de uma amostra da mencionada semente serem medidos e, na mencionada etapa de determinação de valores de absorção e/ou de segundas derivadas da absorção compreender uma etapa de cálculo da média dos mencionados espectros medidos a partir dos quais são determinados os mencionados valores de absorção e/ou as segundas derivadas da absorção.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo número n de números de ondas oj <je[i;n]) ser maior ou igual a sete, preferencialmente maior ou igual a nove e, de preferência ainda maior, ser maior ou igual a treze.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por cada um dos mencionados números de ondas ser representativo de uma molécula ou conjunto de moléculas selecionadas a partir do grupo que consiste de pelo menos: - lipídios; - carboidratos; - proteínas; - ácidos nucleicos; e - uma combinação de molécula de lipídio, carboidrato, proteína ou ácido nucleico com pelo menos uma outra molécula de lipídio, carboidrato, proteína ou ácido nucleico.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo mencionado vertebrado ser um touro e a taxa de não retorno ser uma taxa de não retorno de 90 dias, em que o mencionado touro é proveniente de uma raça selecionada a partir do grupo que compreende pelo menos uma das seguintes raças: Abondance, Béarnaise, Bordelaise, Bretonne pie noir, Brune, Froment du Léon, Jersiaise, Montbéliarde, Pie rouge des plaines, Prim’Holstein, Rouge flamande, Bleue du nord, Normande, Salers e Tarentaise.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por pelo menos um dos mencionados números de ondas oj (je[i;n]> ser selecionado a partir da faixa de números de ondas [960 cm-1; 1100 cm-1], [1440 cm-1; 1550 cm-1] ou [2800 cm-1; 3200 cm-1] ou na faixa de amida B.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelos mencionados números de ondas oj (je[i;n]> serem selecionados a partir do grupo que compreende pelo menos 3165 ± 1 cm-1, 3136 ± 1 cm-1, 3103 ± 1 cm-1, 3071 ± 1 cm-1, 3026 ± 1 cm-1, 2977 ± 1 cm-1, 2975 ± 1 cm-1, 1736 ± 1 cm-1, 1689 ± 1 cm-1, 1661 ± 1 cm-1, 1618 ± 1 cm-1, 1515 ± 1 cm-1, 1448 ± 1 cm-1, 1430 ± 1 cm-1, 1344 ± 1 cm-1, 1338 ± 1 cm-1, 1336 ± 1 cm-1, 1316 ± 1 cm-1, 1214 ± 1 cm-1, 1183 ± 1 cm-1, 1103 ± 1 cm-1, 1099 ± 1 cm-1, 1020 ± 1 cm-1 e 975 ± 1 cm-1.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo número n dos mencionados números de ondas oj <je[1;n]> selecionados ser igual a treze e os valores dos mencionados treze números de ondas oj (je[1;n]> selecionados serem: 3165 ± 1 cm-1, 3136 ± 1 cm-1, 3103 ± 1 cm-1, 2975 ± 1 cm- 1, 1736 ± 1 cm-1, 1661 ± 1 cm-1, 1515 ± 1 cm-1, 1448 ± 1 cm-1, 1430 ± 1 cm-1, 1316 ± 1 cm-1, 1214 ± 1 cm-1, 1020 ± 1 cm-1 e 975 ± 1 cm-1.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo número n dos mencionados números de ondas oj (je[1;n]> selecionados ser igual a quinze e os valores dos mencionados quinze números de ondas oj (je[1;n]> selecionados serem: 3071 ± 1 cm-1, 3026 ± 1 cm-1, 2977 ± 1 cm-1, 1689 ± 1 cm- 1, 1618 ± 1 cm-1, 1515 ± 1 cm-1, 1430 ± 1 cm-1, 1344 ± 1 cm-1, 1338 ± 1 cm-1, 1336 ± 1 cm-1, 1183 ± 1 cm-1, 1103 ± 1 cm-1, 1099 ± 1 cm-1, 1020 ± 1 cm-1 e 975 ± 1 cm-1.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pela mencionada etapa de medição de pelo menos um espectro de absorção compreender uma etapa de preparação da mencionada amostra do mencionado sêmen.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender uma etapa de comparação da mencionada taxa de não retorno Y com limite previamente determinado, para selecionar o mencionado sêmen para fins de reprodução no caso em que a mencionada taxa de não retorno Y for maior ou igual ao mencionado limite previamente determinado.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo mencionado limite ser maior ou igual a 0,4, preferencialmente maior ou igual a 0,5 e, de preferência ainda maior, maior ou igual a 0,6.