CN103940802B - 一种活动精子dna的拉曼光谱的快速测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种活动精子DNA的基于拉曼光谱快速测量方法。本发明采用的技术方案是：试管收集精液样品，室温环境下精液自然液化；吸取已液化精液加入到含有密度梯度离心液离心管中，离心后吸弃上层精浆，而后再加入PBS缓冲液再次离心洗涤，吸弃上清，加入PBS缓冲液制成精子悬液，孵育；将金属底板粘贴在培养皿上，加入PBS缓冲液，吸取孵育后的精子悬液浸入培养皿中，精子游出并接触金属底板；设置光谱测量范围、积分时间、激发光波长，获得精子头部拉曼光谱数据。本发明利用细管玻璃吸管操作，可使从吸管尖头部分游出的活动精子吸附于金属底板，通过测量头部吸附于金属底板的精子评估精子DNA损伤情况。

Description

一种活动精子DNA的拉曼光谱的快速测量方法

技术领域

本发明涉及一种活动精子DNA的基于拉曼光谱快速测量方法。

背景技术

近年来，不孕不育患者呈逐年增多的趋势。世界卫生组织统计，全球约10～15%的夫妇遇到不孕不育的问题。中国已婚人群中，不孕不育比例达7%～10%，呈现快速上升的趋势。其中，由于男性因素导致的不孕不育所占比例将近40%。临床上，精液常规检查主要是利用计算机辅助评估、分析精液中精子的浓度，活力，及形态等参数（通常称为CASA）。研究表明，如果男性精液中质量差的精子所占比例超过一定范围，意味着自然受孕的概率低，需借助辅助生殖技术进行生育。自1978年最早的辅助生殖技术（俗称第一代试管婴儿）诞生以来，已帮助无数的不孕不育夫妇获得自己的小孩。随着技术的进步和发展，胞浆内精子注射技术（ICSI，俗称第二代试管婴儿），因其适应于少、弱精子症患者，且有较高的受精率，成为目前辅助生殖领域的主要关键技术之一。ICSI的成功率很大程度上受精子质量准备和显微操作技术的影响。其中如何优选成熟的、质量合格的具有受精潜能的活动精子成为关键的问题。现阶段的操作，医生主要凭靠个人经验，挑选形态正常和活力强的精子，再利用显微操纵将精子注入到成熟的卵母细胞，完成受精。因而优质精子的选取主要取决于医生的操作经验和判断，主观性强。研究表明，不育（或低生育能力）男性精液分选出的形态完全正常的精子细胞中，头部DNA损伤的精子占据很大比例，一旦这些形态正常但DNA受损的精子细胞被挑选注入到卵母细胞后，将可能导致无法受精，或降低受精卵着床，影响胚胎的正常发育。更有甚者，受损DNA遗传到下一代，影响下一代的生育能力。

临床ICSI操作前，通常将精液进行优化和预处理。如精子密度梯度离心；精子上游法；透明质酸受体检测；凋亡精子细胞磁珠分离；以及根据精子细胞大小和所带电荷采用的电泳分离法。尽管这些方法可筛选出形态和活动力俱佳的精子，并有效降低不成熟或可能“凋亡”精子细胞的数量，却无法将DNA有损伤的精子细胞完全筛除。而目前常用的精子DNA完整性评估方法，如精子染色质结构分析试验（SCSA），彗星试验（COMETassay），末端转移酶介导的dUTP末端标记法，染色质扩散试验（SCD）等，无一例外的需要进行染色预处理，无法对活动精子的DNA完整性进行评估。因此，即便检测为正常的精子也因染色操作后无法用于卵细胞的受精。

近期，Gianaroli等评估通过采用偏振光研究精子头部双折射现象评估精子细胞顶体状态与ICSI结果的相关性，然而顶体正常并不意味着DNA也正常。Huser等初步开展了基于拉曼光谱的DNA正常分装和异常的离体精子细胞，初步验证拉曼光谱可用于DNA正常和受损两种状态区分。Victoria等在生殖领域核心期刊FertilityandSterility首次报导了将精子头部拉曼光谱测量结果与流式细胞仪分析精子DNA损伤情况进行比较，发现拉曼光谱峰位1055cm^-1与1095cm^-1的比值与流式细胞仪分析的DNA碎片指数（DFI）呈线性关系，即比值越大，DNA损伤越严重。然而，目前研究尚未见单个活动精子的显微拉曼光谱研究。因而开展基于显微拉曼的非标记的活动精子研究对于今后辅助生殖技术中精子质量的客观评估和优质精子的筛选具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活动精子DNA的拉曼光谱快速测量方法，即首先使活动精子头部吸附于光滑的金属板面上，并保持原有的活力，然后采用显微拉曼光谱技术测量精子头部拉曼光谱数据。利用该快速测量方法得到的活动精子DNA拉曼光谱数据，与离体失活精子DNA的主要拉曼光谱数据进行比较，实现客观评价优质精子细胞的目的，有效克服目前ICSI辅助生殖技术中主观选择精子存在的DNA损伤的风险。

为实现本发明的目的采用的技术方案是：

（1）精液液化

无菌试管收集精液样品，室温环境下静置20分钟使精液自然液化。

（2）精液中活动精子的分离与准备。

利用移液枪吸取已液化精液，加入到含有密度梯度离心液（Puresperm40/80）的离心管中，1000g离心10分钟，吸弃上层精浆，保留离心管底部的精子。而后再加入PBS缓冲液（磷酸盐缓冲液，PhosphateBuffersolution）重悬，再次离心洗涤，吸弃上清，然后加入1mlPBS缓冲液重悬制成精子悬液，置于孵育箱中孵育。

上述步骤中，液化精液：密度梯度离心液：PBS缓冲液=2ml：1.5ml：5ml；

所述的孵育是在37℃的孵育箱中孵育30分钟。

（3）活动精子的“固定”处理

首先将尺寸为2×4cm的金属底板粘贴在培养皿上，往培养皿内加入PBS缓冲液，利用头部细长的玻璃毛细管吸取少量孵育后的精子悬液，然后将玻璃毛细管垂直浸入装有PBS缓冲液的培养皿中，玻璃毛细管细长的头部距离金属底板2～3mm，静置3分钟，精子将以头部往下的方式游出，并接触金属底板，形成头部“固定”尾部剧烈摇摆的吸附状态。

所述的金属底板是指铝合金金属底板或不锈钢金属底板。

（4）精子头部拉曼光谱的测量

设置600～1800cm^-1的光谱测量范围，利用显微镜普通观察模式下，将吸附于金属底板上的精子头部移动到视野中心，设置积分时间为30秒，选择785nm的激发光波长，获得精子头部拉曼光谱数据。

（5）活动精子DNA拉曼光谱特征提取和判别

通过比较活动精子和离体失活精子的DNA拉曼光谱数据，活动与离体失活精子DNA的主要拉曼光谱谱峰基本一致。其中DNA归属于PO₂ ^-骨架的1055cm^-1和1095cm^-1谱峰强度的比值可作为评估DNA是否损伤的依据，即精子DNA损伤越小，对应的谱峰强度比值(I₁₀₅₅/I₁₀₉₅)越小，DNA完整的活动精子，两者的谱峰强度比值(I₁₀₅₅/I₁₀₉₅)初步计算为：0.35。

本发明的优势在于，简单地利用细管玻璃吸管操作，可使从吸管尖头部分游出的活动精子吸附于金属底板，通过测量头部吸附于金属底板的精子评估精子DNA损伤情况。

附图说明

图1是本发明对离体失活精子的拉曼光谱检测光谱图。

图2是本发明对头部“固定”的活动精子与离体失活精子拉曼光谱比较图。

具体实施方式

为了对本发明更好的理解，现结合附图以实施例的方式做进一步的说明。

图1中，纵坐标表示拉曼光谱相对强度，横坐标表示拉曼光谱频移，曲线是DNA完整的离体失活精子在600-1800cm^-1之间测定的光谱曲线，其中归属于DNA的PO2^-骨架的1055cm^-1和1095cm^{-1处谱峰强度}比值约为0.31。

图2中，曲线（a）（b）分别表示DNA完整的活动精子和DNA完整的离体失活精子的拉曼光谱曲线，两者在1055cm^-1和1095cm^{-1处谱峰强度}比值差异很小。

实施例1

（1）精液液化

无菌试管收集精液2ml样品，室温环境下静置20分钟使精液自然液化。

（2）精液中活动精子的分离与准备。

利用移液枪吸取已液化精液，加入到1.5ml含有密度梯度离心液（Puresperm40/80）的离心管中，1000g离心10分钟，吸弃上层精浆，保留离心管底部的精子，再加入5mlPBS缓冲液重悬，1000g再次离心10分钟，洗涤，吸弃上清，然后加入1mlPBS缓冲液重悬制成精子悬液，置于37℃孵育箱中孵育30分钟。

（3）活动精子的“固定”处理

首先将尺寸为2×4cm的铝合金材质金属底板粘贴在培养皿上，往培养皿内加入PBS缓冲液，利用头部细长的玻璃毛细管吸取少量孵育后的精子悬液，然后将玻璃毛细管垂直浸入装有PBS缓冲液的培养皿中，玻璃毛细管细长的头部距离金属底板3mm处，静置3分钟，精子将以头部往下的方式游出，并接触金属底板，形成头部“固定”尾部剧烈摇摆的吸附状态。（4）精子头部拉曼光谱的测量

失活精子测量：设置600～1800cm^-1的光谱测量范围，利用显微镜普通观察模式下，将吸附于金属底板上的精子头部移动到视野中心，设置积分时间为30秒，选择785nm的激发光波长，获得精子头部拉曼光谱数据。

活动精子测量：首先将表面光滑的不锈钢材质的Ramchip基底粘附于Petridish培养皿上；加入一定量的PBS缓冲液，使液面浸没基底上表面2-3mm深度；将吸取少量精液的长颈玻璃细管垂直浸入Petridish培养皿中，并形成吸管头部距底部2-5mm距离，并保持3分钟。部分游出精子形成头部吸附于基底，尾部保持正常摆动现象，利用63倍水镜(N.A.=1.2,Leica)在透射模式下观察并选择活动力强的精子，测量600-1800cm^-1波数范围的活动精子头部拉曼光谱数据。

（4）活动精子DNA拉曼光谱特征提取和判别

通过比较活动精子和离体失活精子的DNA拉曼光谱数据，活动与离体失活精子DNA的主要拉曼光谱谱峰基本一致。其中DNA归属于PO₂ ^-骨架的1055cm^-1和1095cm^-1谱峰强度的比值可作为评估DNA是否损伤的依据，即精子DNA损伤越小，对应的谱峰强度比值(I₁₀₅₅/I₁₀₉₅)越小，DNA完整的活动精子，两者的谱峰强度比值(I₁₀₅₅/I₁₀₉₅)初步计算为：0.35。

本实施例对离体失活精子的拉曼光谱检测光谱图如图1所示，对头部“固定”的活动精子与离体失活精子拉曼光谱比较图如图2所示。

实施例2

（1）精液液化

无菌试管收集精液2ml样品，室温环境下静置20分钟使精液自然液化。

（2）活动精子的“固定”处理

首先将表面光滑的不锈钢材质的Ramchip基底粘附于60mm×15mm尺寸的Petridish培养皿上；加入一定量的PBS缓冲液，使液面浸没基底上表面2-3mm深度；长颈玻璃吸管利用毛细原理吸取少量的经离心重悬处理后的精子悬液；最后将玻璃细管垂直浸入装有PBS溶液中的Petridish培养皿中，使得吸管头部距底部Ramchip基底2-5mm距离并保持3分钟；精子将以头部往下的方式游出，并接触金属底板，形成头部“固定”尾部剧烈摇摆的吸附状态。

（3）精子头部拉曼光谱的测量

设置600～1800cm^-1的光谱测量范围，显微观察模式下，利用63倍水镜(N.A.=1.2,Leica)观察并选择活动力强的精子，将精子头部移动到视野中心，设置积分时间为30秒，选择785nm的激发光波长，获得精子头部拉曼光谱数据。

（4）活动精子DNA拉曼光谱特征提取和判别

通过比较活动精子和离体失活精子的DNA拉曼光谱数据，活动与离体失活精子DNA的主要拉曼光谱谱峰基本一致。其中DNA归属于PO₂ ^-骨架的1055cm^-1和1095cm^-1谱峰强度的比值可作为评估DNA是否损伤的依据，即精子DNA损伤越小，对应的谱峰强度比值(I₁₀₅₅/I₁₀₉₅)越小，DNA完整的活动精子，两者的谱峰强度比值(I₁₀₅₅/I₁₀₉₅)初步计算为：0.35。

Claims (4)

1.一种活动精子DNA的拉曼光谱的快速测量方法，其特征是：

（1）精液液化：

无菌试管收集精液样品，室温环境下静置20分钟使精液自然液化；

（2）精液中活动精子的分离与准备：

利用移液枪吸取已液化精液，加入到含有密度梯度离心液的离心管中，1000g离心10分钟，吸弃上层精浆，保留离心管底部的精子，而后再加入PBS缓冲液重悬，再次离心洗涤，吸弃上清，然后加入PBS缓冲液重悬制成精子悬液，置于孵育箱中孵育；

（3）活动精子的“固定”处理：

首先将尺寸为2×4cm的金属底板粘贴在培养皿上，往培养皿内加入PBS缓冲液，利用头部细长的玻璃毛细管吸取少量孵育后的精子悬液，然后将玻璃毛细管垂直浸入装有PBS缓冲液的培养皿中，玻璃毛细管细长的头部距离金属底板2～3mm，静置3分钟，精子将以头部往下的方式游出，并接触金属底板，形成头部“固定”尾部剧烈摇摆的吸附状态；

（4）精子头部拉曼光谱的测量：

设置600～1800cm^-1的光谱测量范围，利用显微镜普通观察模式下，将吸附于金属底板上的精子头部移动到视野中心，设置积分时间为30秒，选择785nm的激发光波长，获得精子头部拉曼光谱数据。

2.根据权利要求1所述的一种活动精子DNA的拉曼光谱的快速测量方法，其特征是步骤（2）中液化精液：密度梯度离心液：PBS缓冲液=2ml：1.5ml：5ml。

3.根据权利要求1所述的一种活动精子DNA的拉曼光谱的快速测量方法，其特征是步骤（2）中所述的孵育是在37℃的孵育箱中孵育30分钟。

4.根据权利要求1所述的一种活动精子DNA的拉曼光谱的快速测量方法，其特征是所述的金属底板是指铝合金金属底板或不锈钢金属底板。