CN103558204A - 一种生精小管拉曼光谱峰及鉴别生精小管生精功能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生精小管拉曼光谱峰及鉴别生精小管生精功能的方法。具体提供一种用于鉴别非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症的生精小管拉曼光谱峰，所述的拉曼光谱峰可用于鉴别非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症的生精小管，并在非诊断和治疗目的地评估生精小管生精功能中的应用。本发明还提供一种拉曼光谱无损性检测人类生精小管中蛋白质的差异，评估生精小管生精功能的方法。本发明优点是：提供了用以评估生精小管生精功能的拉曼光谱，其判定结果准确可靠、可信度高，该方法无需对生精小管进行特殊处理且损伤可被控制在极低的程度，并可直接用于后续的研究或辅助生殖治疗。

Description

一种生精小管拉曼光谱峰及鉴别生精小管生精功能的方法

【技术领域】

    本发明涉及生精小管生精功能检测技术领域，具体地说，是一种生精小管拉曼光谱峰及鉴别生精小管生精功能的方法

【背景技术】

非梗阻性无精子症（Non-obstructive azoospermia，NOA）在不育男性中的发病率约10%，占到无精子症的60%，其患者特征为睾丸体积偏小以及卵泡刺激素水平（Follicle-stimulating hormone，FSH）升高。睾丸组织活检是男性不育诊断的基础，但是其只能证实睾丸生精小管内生精功能的紊乱，不能在手术过程中提供实时的鉴别帮助。某些情况下，非梗阻性无精子症患者睾丸的部分区域依然存在精子发生，因此睾丸活检并不能全面准确的评估患者的生精功能。即便其可以证实精子的存在，此时精子已经被破坏，也不能再用于临床使用。

手术取精配合卵胞浆内单精子注射技术（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是治疗男性不育，尤其是严重生精功能障碍患者实现生育的首选方式。睾丸显微取精术（Microdissection testicular sperm retrieval，Micro-TESE）在手术中借助光学显微镜挑选外观饱满、颜色不透明的生精小管获取精子，通常这种小管被认为存在精子发生，凭借这种技术精子获取率可达到40-60%。但是问题在于生精小管的选择过于依赖手术者的主观判断，并不足以保证精子的成功获取，而且过多睾丸组织的失去也增加了手术并发症的风险，如睾丸血供破坏、性腺功能低下以及术后睾酮水平下降。

因此，临床上亟需一种可以无损检测生精小管生精功能的方法。拉曼光谱是一种激光检测技术，通过非弹性光与物质的相互作用得到物质的生物信息，如分子结构、化学组成等，并反映在二维的光谱图像上。任何细胞生物化学的改变都可以转化为拉曼光谱上的差异。拉曼光谱凭借其无损性和实时检测的优势，已经广泛应用于医学领域，如肿瘤性质的鉴别鉴定、活体细胞的研究、血清标记物的筛查等。在生殖医学界中，拉曼光谱被用于精子DNA损伤的检测、线粒体功能的评估、卵子透明带结合精子的筛选。

中国专利文献CN：103196890A公开了一种基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法。中国专利文献CN：103091300A公开了一种基于表面增强共振拉曼光谱的TNT检验方法。但是关于拉曼光谱法检测生精小管生精功能的专利目前还未见报道。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于鉴别非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症的生精小管拉曼光谱峰。

本发明的再一的目的是，提供如上所述的生精小管拉曼光谱峰用途。

本发明的另一的目的是，提供一种生精小管生精功能的评估方法。

本发明的第四个目的是，提供一种鉴别不同生精小管蛋白质组成差异的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于鉴别非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症的生精小管拉曼光谱峰，拉曼光谱横坐标为波长，单位nm，纵坐标为强度，单位a.u，睾丸生精小管的特征位置为745 cm^-1, 1001 cm^-1, 1152 cm^-1, 1441 cm^-1, 1515 cm^-1, 1658 cm^-1, 2935 cm^-1。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的拉曼光谱峰在非诊断和治疗目的地评估生精小管生精功能中的应用。

如上所述的拉曼光谱峰在非诊断和治疗目的地鉴别非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种生精小管生精功能的评估方法，所述的评估方法包括下列步骤：

a）取待检测睾丸组织，在激光激发波为532nm、激光功率5mW下对待检测睾丸组织的生精小管进行激光扫描，软件自动生成待检测睾丸组织的生精小管拉曼光谱峰；

b）将步骤a）获得的生精小管拉曼光谱峰与要求1所述的生精小管拉曼光谱峰进行比对，如正常生精小管的拉曼光谱峰。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种鉴别不同生精小管蛋白质组成差异的方法，所述的方法包括以下步骤：

a）在在激光激发波为532nm、激光功率5mW下对生精小管进行激光扫描

软件自动生成生精小管拉曼光谱峰

b)判断各生精小管蛋白质组成：

745 cm^-1为碱基呼吸链, 1001 cm^-1为苯丙氨酸, 1152 cm^-1为蛋白质C-C和C-N键的伸展振动, 1441 cm^-1为脂质, 1515 cm^-1为酪氨酸, 1658 cm^-1为AmideⅠ, 2935 cm^-1为CH₂和CH₃键的伸展振动。

本发明优点在于：

本发明采用一种非创伤性、且无需添加任何化学试剂的新型检测方法-拉曼光谱检测人类生精小管生精功能，具有灵敏度、准确度高的优点，克服了睾丸显微取精手术中生精小管的选择过于依赖手术者的主观判断，并不足以保证精子的成功获取，而且过多睾丸组织的失去也增加了手术并发症的风险。

【附图说明】

附图1A是拉曼光谱系统示意图.附图1B是拉曼显微镜下单根生精小管的影像及扫描位点（红十字点所示）。

附图1C是拉曼显微镜下NOA生精小管睾丸冰冻切片的影像及扫描位点（红十字点所示）。

附图1D是拉曼显微镜下OA生精小管睾丸冰冻切片的影像及扫描位点（红十字点所示）。

附图2A是生精功能正常的生精小管。

附图2B是生精功能正常的生精小管对应的拉曼光谱。

附图2C是生精功能低下或生精阻滞在精子细胞期的生精小管。

附图2D是生精功能低下或生精阻滞在精子细胞期的生精小管对应的拉曼光谱。

附图2E是生精阻滞在精母细胞期的生精小管。

附图2F是生精阻滞在精母细胞期的生精小管对应的拉曼光谱。

附图2G是唯支持细胞综合征或不含细胞成分的生精小管。

附图2H是唯支持细胞综合征或不含细胞成分的生精小管对应的拉曼光谱。

附图2I是生精小管拉曼光谱（图中上曲线）和切片管壁拉曼光谱（图中下曲线）的比较。

附图2J是NOA（图中上曲线）和OA（图中下曲线）基底校正处理后的拉曼光谱比较。

附图3是四组睾丸组织生精小管界膜厚度的比较。

附图4A是唯支持细胞综合征或不含细胞成分的生精小管界膜厚度。

附图4B是生精阻滞在精母细胞期的生精小管界膜厚度。

附图4C是生精功能低下或生精阻滞在精子细胞期的生精小管界膜厚度。

附图4D是生精功能正常的生精小管界膜厚度。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1  本发明拉曼光谱峰的获得

1 实验设备与材料

1.1 实验设备

激光拉曼光谱系统：色散型共聚焦拉曼光谱仪（Senterra R200-L），德国Bruker公司生产，具有光谱分辨率≤1.5cm^-1，横向分辨率<1μm，纵向分辨率< 2μm等重要特性，配有波长分别为785nm、633nm和532nm的三种激光器，三维自动化控制平台等重要性能；光学显微镜(BX61VS, Olympus, Tokyo)

1.2 实验材料

52例组织标本由上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科提供。患者的睾丸组织通过显微取精术获得，包括非梗阻性无精子症（Non-obstructive azoospermia，NOA）与梗阻性无精子症（Obstructive azoospermia，OA）。本实验中非梗阻性无精子症皆为特发性不育，排除隐睾、克氏症、低促性腺功能低下等；梗阻性无精子症皆为输精管或附睾管炎症引起的排精管道梗阻，而患者睾丸生精功能依然正常。

2、研究方法

2.1 睾丸病理学检测

1）、将一部分睾丸组织浸入Bouins固定液、保存在70%乙醇中，然后经石蜡包埋、切成5μm薄片做H&E染色。

2）、睾丸病理切片在40倍光学显微镜下(BX61VS, Olympus, Tokyo)观察，每张睾丸切片计数100个生精小管以确定其Johnsen评分。

3）、根据Johnsen评分将睾丸组织样本分为4组：第一组，1-2分；第二组，3-5分；第三组，6-8分；第四组，9-10分，分别对应了所有睾丸病理类型：唯支持细胞综合征、生精阻滞、生精功能低下以及生精功能正常。余下的睾丸组织用于拉曼光谱检测。

2.2 生精小管拉曼光谱检测

2.2.1激光拉曼显微镜扫描参数如下：激光激发波为532nm，激光功率5mW。

a）每根生精小管沿正中设定线性等距的激光扫描位点（共10个点，间距为5μm），每个位点扫描时间为10秒。每例样本选取10根生精小管进行检测。

b）使用VS-ASW软件测量睾丸病理切片生精小管的界膜（即管壁）厚度，每例样本测量20个生精小管，每个生精小管随机选择5个位置。

2.3激光拉曼分析方法

拉曼光谱由OPUS 6.5软件自动生成。将10个扫描位点的光谱平均得到代表每根生精小管的拉曼光谱，然后将10根生精小管的光谱再次平均得到代表每例睾丸组织的特征光谱。将4组标本的拉曼光谱进行比较。为分析NOA与OA患者睾丸生精小管的物质组成差异，将拉曼光谱进行基底校正处理，并标记其谱峰位置。从相关文献报道获取对应谱峰的化学键成分，具体文献可参照：

1. Peticolas WL. Raman spectroscopy of DNA and proteins. Methods Enzymol. 1995;246:389-416. Epub 1995/01/01.

2. Maquelin K, Kirschner C, Choo-Smith LP, et al. Identification of medically relevant microorganisms by vibrational spectroscopy. J Microbiol Methods. 2002;51(3):255-71. Epub 2002/09/12.

3. Kunapareddy N, Freyer JP, Mourant JR. Raman spectroscopic characterization of necrotic cell death. J Biomed Opt. 2008;13(5):054002. Epub 2008/11/22.

4. Sato Y, Nozawa S, Iwamoto T. Study of spermatogenesis and thickening of lamina propria in the human seminiferous tubules. Fertil Steril. 2008;90(4):1310-2. Epub 2008/02/29.

5. Albrecht M. Insights into the nature of human testicular peritubular cells. Annals of anatomy = Anatomischer Anzeiger : official organ of the Anatomische Gesellschaft. 2009;191(6):532-40. Epub 2009/09/22.

6. Volkmann J, Muller D, Feuerstacke C, et al. Disturbed spermatogenesis associated with thickened lamina propria of seminiferous tubules is not caused by dedifferentiation of myofibroblasts. Hum Reprod. 2011;26(6):1450-61. Epub 2011/04/07.

3 实验结果

3.1 Johnsen评分组和拉曼光谱峰的检测

52例睾丸组织根据Johnsen评分分组如下，第一组18例；第二组12例；第三组12例；第四组10例。睾丸组织Johnsen评分与其拉曼光谱强度成反比，第一组（唯支持细胞综合征）拉曼光谱强度最高，第四组（生精功能正常）拉曼光谱强度最低。4组拉曼光谱的强度区域为：第四组<2000(au); 第三组2000-5000(au); 第二组5000-10000(au); 第一组>8000(au)。

基底校正后的拉曼光谱显示，生精小管的谱峰出现在745 cm^-1、1001 cm^-1、 1152 cm^-1、 1441 cm^-1、1515 cm^-1、 1658 cm^-1、2935 cm^-1等处。且NOA生精小管在1001 cm^-1、 1152 cm^-1、 1515 cm^-1、 1658 cm^-1谱峰处明显高于OA生精小管。此外，生精小管的拉曼光谱与睾丸切片管壁的拉曼光谱一致，说明生精小管拉曼扫描的信号来自于界膜，即管壁。 

3.2 生精小管内物质变化的推测

    参照文献记载可知，745 cm^-1为碱基呼吸链, 1001 cm^-1为苯丙氨酸, 1152 cm^-1为蛋白质C-C和C-N键的伸展振动, 1441 cm^-1为脂质, 1515 cm^-1为酪氨酸, 1658 cm^-1为AmideⅠ, 2935 cm^-1为CH₂和CH₃键的伸展振动。

3.3 生精小管界膜厚度

睾丸生精小管界膜厚度的计算方法如下: 将5个界膜厚度值平均得到代表每根生精小管的界膜厚度，然后将20个生精小管厚度平均得到每例睾丸组织的界膜厚度。将4组标本的界膜厚度进行比较。

4组睾丸组织界膜厚度值为：9-10分组为4.42±0.74μm; 6-8分组为6.32±1.97μm; 3-5分组为8.47±1.28μm; 1-2分组为12.61±2.95μm。由此看出Johnsen评分越低，生精小管界膜厚度越大。且生精小管拉曼光谱强度与界膜厚度呈正相关。

4 结论

传统评估生精小管生精功能的方法依赖于睾丸病理性检查，然而这一创伤性的检测手段无法在手术当中对提高精子获取率给予帮助。此次实验中，我们利用一种非创伤性、且无需添加任何化学试剂的新型检测方法-拉曼光谱，对不同生精状态的生精小管进行检测。实验结果显示，生精功能正常（OA）的生精小管拉曼光谱强度<2,000(au)，而生精功能异常（NOA）的生精小管拉曼光谱强度>2,000(au)，且生精功能越差，光谱强度越高。

本次实验对生精小管界膜厚度进行测量，发现Johnsen评分越低（即生精功能越差），生精小管的界膜越厚。这也解释了NOA与OA生精小管在拉曼光谱强度上的差异，当拉曼激光聚焦在生精小管上，NOA生精小管增厚的界膜收集更多的信号，得到更强的光谱强度。

生精小管拉曼光谱经基底校正后，谱峰出现在745 cm^-1、1001 cm^-1、 1152 cm^-1、1441 cm^-1、 1515 cm^-1、 1658 cm^-1、 2935 cm^-1等处。这些位置所对应的物质和化学集团在之前的研究中已被证实：745 cm^-1为碱基呼吸链, 1001 cm^-1为苯丙氨酸, 1152 cm^-1为蛋白质C-C和C-N键的伸展振动, 1441 cm^-1为脂质, 1515 cm^-1为酪氨酸, 1658 cm^-1为AmideⅠ, 2935 cm^-1为CH₂和CH₃键的伸展振动。NOA生精小管在1001 cm^-1、1152 cm^-1、1515 cm^-1、 1658 cm^-1谱峰处明显高于OA生精小管，这些位置对应着蛋白物质，说明NOA管壁蛋白质的含量更高，也许是由于增生的胶原纤维导致。

5 讨论

拉曼光谱法基于分子能级跃迁，从量子力学角度考察样品成分，通过分析拉曼光谱各拉曼峰的高度、宽度、面积、位置（频率）和形状可得到待测样品的多种信息，如样品的分子官能团结构信息，分子对称性、化学键、电子密度等物理信息。拉曼分析通常是非破坏性的，并且不要求作样品预处理，与样品也不作物理接触。这种既容易又方便的与样品对接的界面方式是拉曼光谱优于其他分析方法最重要的特点之一。另外，激光穿透性强，能穿过由玻璃或塑料制成的包装或透明窗口收集拉曼信息，而且对样品没有损伤。拉曼光谱灵敏度高，可进行微量甚至痕量分析。因此，拉曼光谱无创性检测生精小管的生精功能具有临床应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于鉴别非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症的生精小管拉曼光谱峰，其特征在于，拉曼光谱横坐标为波长，单位nm，纵坐标为强度，单位a.u，睾丸生精小管的特征位置为745 cm^-1, 1001 cm^-1, 1152 cm^-1, 1441 cm^-1, 1515 cm^-1, 1658 cm^-1, 2935 cm^-1，所述的非梗阻性无精子症得拉曼光谱峰在1001 cm^-1, 1152 cm^-1, 1441 cm^-1, 1515 cm^-1, 1658 cm^-1处的峰强度高于梗阻性无精子症的生精小管拉曼光谱峰。

2.根据权利要求1所述的拉曼光谱峰在非诊断和治疗目的地评估生精小管生精功能中的应用。

3.根据权利要求1所述的拉曼光谱峰在非诊断和治疗目的地鉴别非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症中的应用。

4.一种生精小管生精功能的评估方法，其特征在于，所述的评估方法包括下列步骤：

a）取待检测睾丸组织，在激光激发波为532nm、激光功率5mW下对待检测睾丸组织的生精小管进行激光扫描，软件自动生成待检测睾丸组织的生精小管拉曼光谱峰；

b）将步骤a）获得的生精小管拉曼光谱峰与要求1所述的生精小管拉曼光谱峰进行比对。

5.一种鉴别不同生精小管蛋白质组成差异的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

a）在在激光激发波为532nm、激光功率5mW下对生精小管进行激光扫描

软件自动生成生精小管拉曼光谱峰；

b)判断各生精小管蛋白质组成：

745 cm^-1为碱基呼吸链, 1001 cm^-1为苯丙氨酸, 1152 cm^-1为蛋白质C-C和C-N键的伸展振动, 1441 cm^-1为脂质, 1515 cm^-1为酪氨酸, 1658 cm^-1为AmideⅠ, 2935 cm^-1为CH₂和CH₃键的伸展振动。

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