CN108801996A - 一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法 - Google Patents

一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法，所述方法包括如下步骤：(1)取外周血血样；(2)对血样中红细胞进行裂解；(3)分离出含有稀有细胞和少量白细胞的混合细胞群；(4)分选富含神经元的细胞群；(5)铺板；(6)特异性标记；(7)利用激光共聚焦显微镜对特异性标记的细胞进行荧光激发，并拍照保存数据；(8)利用image J图像分析统计软件对拍照结果进行分析，得出外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比。本发明通过免疫荧光化学方法对外周血神经元中的磷酸化α突触核蛋白所占比例进行检测，本发明方法快速、准确、灵敏度高。

Description

一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比 的方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种从神经元中准确识别磷酸化α突触核蛋白占比的方法。
背景技术
α-突触核蛋白(α-synuclein)是一种脑内含量丰富的神经蛋白，既参与正常突触功能的维持，又与各种神经退行性疾病有关。在帕金森病患者脑内，α-突触核蛋白是多巴胺神经元中嗜伊红染色Lewy小体主要成分。α-突触核蛋白基因位于染色体4q21.3-q22，均由5个外显子构成。α-突触核蛋白由140个氨基酸残基构成，分子量约19kD。根据估算，α-突触核蛋白占脑匀浆蛋白含量的1％，在端脑中含量丰富。α-突触核蛋白能够直接激活小胶质细胞，介导炎性反应，释放细胞因子和自由基等物质，导致神经元的变性和坏死。α-突触核蛋白在Ser129位置的磷酸化形式(p-ser129-syn)是促使α-突触核蛋白发生聚集的重要因素，当α-突触核蛋白发生聚集后形成Lewy Body(路易小体)，是PD的典型症状之一。在95％以上的Lewy Body中检测到p-ser129-syn，而正常人中则很少检测到，这为使用α-突触核蛋白作为帕金森疾病诊断的分子指标提供了理论依据。
免疫荧光法是一种将抗原、抗体的结合反应与形态学相结合的方法。该法把血清学的特异性、荧光色素的敏感性、显微镜检查法集为一体，扩大了免疫学诊断的效果，是近代免疫学的一种重要研究手段。抗体球蛋白标记上荧光色素，即成为荧光抗体。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快，与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法。本发明通过免疫荧光化学方法对外周血神经元中的磷酸化α突触核蛋白所占比例进行检测，本发明方法快速、准确、灵敏度高。
本发明的技术方案如下：
一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取外周血至少100μL；
(2)在步骤(1)获得的血液样本中加入红细胞裂解液，待溶液变清亮时，离心，收集细胞沉淀备用；
(3)将包被有能与白细胞CD45抗原特异性结合的磁珠，与步骤(2)所得的细胞沉淀混合，进行孵育，利用吸附柱洗脱特异性结合的磁珠粒-白细胞混合体，得到含有稀有细胞和少量白细胞的混合细胞群；
(4)用Anti-CD24抗体孵育步骤(3)所得的混合细胞群，运用流式细胞分选技术或微流体细胞分选系统富集神经元，制得富含神经元的细胞群；
(5)将步骤(4)制得的富含神经元的细胞群铺板于预先用多聚鸟氨酸-层粘连蛋白处理的盖玻片上；
(6)将步骤(5)处理的盖玻片于室温下静置1h，然后用免疫荧光细胞化学方法对4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、神经元细胞核抗原(Neuronal Nuclei，NeuN)、P(S129)-α-syn进行特异性标记；
(7)利用激光共聚焦显微镜对特异性标记的细胞进行荧光激发，并拍照保存数据；
(8)利用image J图像分析统计软件对拍照结果中P(S129)-α-syn阳性细胞在神经元中的比例进行统计分析，得出外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比。
所述步骤(2)中采用红细胞裂解液破碎红细胞；所述红细胞裂解液用量为待测血液样本体积的三倍量，裂解条件为：冰上裂解15分钟，期间颠倒混匀，使溶液变得清亮透明；之后在4℃条件下，450g离心10min，弃上清并收集细胞沉淀；用待测血液样本两倍体积的红细胞裂解液重悬细胞沉淀，在4℃条件下，450g离心10min后收集细胞沉淀。
所述步骤(3)中所述白细胞与CD45磁珠结合后能够被带有磁性的吸附柱特异性的洗脱；吸附柱洗脱所用的洗脱缓冲液组份为MACS BSA Stock Sloution与autoMACSRinsing Solution，两者按1:20混匀，洗脱的具体过程为：先将MS吸附柱插入到Midiseparator上，并用500μL洗脱缓冲液润洗吸附柱；加入细胞悬液后，向吸附柱中滴加500μL洗脱缓冲液，待每次液体滴完最后一滴后立即补充500μL洗脱缓冲液，重复洗脱3次，洗脱下来的细胞即为稀有细胞群，含有极少量白细胞。
步骤(3)中所述吸附柱洗脱所用的洗脱缓冲液需在洗脱之前预冷，新的缓冲液需在管中洗脱缓冲液滴尽后立即加入，确保吸附柱在洗脱过程中保持湿润，所用试剂和耗材均为美天旎公司生产。
步骤(4)中所述anti-CD24抗体为abcam公司生产的小鼠单克隆抗体[SN3]to CD24(FITC)。
步骤(5)中所述铺板所用的载玻片厚度不大于0.16mm；细胞铺板选用4孔板，4孔板为Thermo公司产品。
步骤(6)中所述特异性标记的方法为：
(1)首先配制3％BSA于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中；
(2)然后再用其稀释一抗NeuN和P(S129)-α-syn，稀释比例分别为1:1000和1:150；
(3)将稀释后的抗体加入铺有细胞的4孔板中，室温孵育90分钟；
(4)清洗一抗3遍，用3％BSA按1:1000稀释DAPI和相应的二抗，加入4孔板后室温孵育60分钟。
步骤(6)中所述特异性标记神经元细胞核抗原，可以替换成特异性标记神经微管蛋白(tubulin)或微管联合蛋白-2(MAP-2)。
一种所述检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法的应用，所述方法用于及早预防或治疗帕金森。
本发明有益的技术效果在于：
1、本发明方法仅需要外周血血液样本100μL，取血时剩余的血液样本可以用于其它检测。
2、本发明通过抗原抗体特异性的结合，对血液样本中的神经元细胞和P(S129)-α-syn阳性细胞进行有效、准确的鉴定。
3、本发明方便、快捷，并且对检测者身体无损伤。本发明从取血到出检测结果仅需要10小时不到，任何检测机构和单位仅需要配备激光共聚焦显微镜或高内涵细胞成像系统即可完成检测。
4、本发明检测的磷酸化α突触核蛋白是区别PD患者与非PD患者的一项重要指标，可应用于帕金森病患者初期的筛查，亦可应用于PD患者药物治疗后的疗效评估。
5、本发明可使用特异性标记神经元细胞核，或神经微管蛋白(tubulin)或微管联合蛋白-2(MAP-2)的方法来检测人外周血中神经元数量的方法。通过特异性标记磷酸化α突触核蛋白来检测人外周血神经元中磷酸化α突触蛋白阳性细胞的数量。
附图说明
图1为本发明实施例1的PD样品检测；
图2为临床PD与非PD样品的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取1mL外周血至抗凝管中，2-8℃保存，2h内进行实验。
(2)取100μL步骤(1)获得的血液样本，加入300μL红细胞裂解液，置于1.5mL离心管中，轻柔上下颠倒混匀，冰上裂解15分钟，使溶液变得清亮透明；之后在4℃条件下，450g离心10min，弃上清并收集细胞沉淀，再加入200μL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，在4℃条件下，450g离心10min，收集沉淀，沉淀主要成分为稀有细胞和白细胞群。
(3)首先，用autoMACS Rinsing Solution将MACS BSA Stock Solution稀释20倍，制成洗脱缓冲液，用1mL洗脱缓冲液重悬细胞沉淀，制成细胞悬液，置于冰上；然后，用洗脱缓冲液润湿40μm细胞筛，并将筛子放于50mL离心管口，将细胞悬液过筛，并用500μL缓冲液清洗，短暂离心后，将细胞转入1.5ml离心管中，4℃，300g，离心10min，弃上清液，用80μL缓冲液重悬细胞后，加入20μL CD45磁珠，充分混匀，4℃静置15min；之后，加入1mL洗脱缓冲液清洗细胞，4℃，300g离心10min，弃上清液，用100μL洗脱缓冲液重悬细胞，4℃备用；最后，将MS柱子插入Midi separator，加入500μL缓冲液润洗，使其在重力作用下自然滴尽，将细胞悬液从管底加入，应避免管壁残留细胞，用500μL缓冲液洗脱MS柱子3次，缓冲液应在液体滴尽时尽快加入，4℃，300g，离心10min，得到含有稀有细胞和少量白细胞的混合细胞群。所用试剂和耗材均为美天旎公司生产。
(4)先用Anti-CD24抗体(abcam公司生产的小鼠单克隆抗体[SN3]to CD24(FITC))孵育步骤(3)所得的混合细胞群，再运用流式细胞分选技术或微流体细胞分选系统富集神经元，制得富含神经元的细胞群；
(5)采用300μL DMEM/F12培养基重悬步骤(4)制得的细胞群，将细胞悬液加入预先包被好的PO/Laminin 4孔板(Thermo公司产品)中，500μL每孔，37℃培养1小时，使细胞爬片；弃培养基，用500μLPBS清洗细胞；弃PBS，每孔加入300μL 4％PFA，室温固定细胞15min；弃PFA，每孔加入500μLPBS，清洗残留PFA，重复清洗步骤3次，每次5min；每孔加入300μL0.2％Triton X-100，透膜15分钟；弃Triton X-100，每孔加入300μL 3％BSA溶液，封闭1小时。
(6)用免疫荧光细胞化学方法对4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、神经元细胞核抗原(Neuronal Nuclei，NeuN)、P(S129)-α-syn进行特异性标记；所述特异性标记的方法为：
(a)首先配制3％BSA于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中；
(b)然后再用其稀释一抗NeuN和P(S129)-α-syn，稀释比例分别为1:1000和1:150；
(c)将稀释后的抗体加入铺有细胞的4孔板中，每孔加入180μL，室温孵育90分钟；
(d)弃一抗，每孔加入500μL PBST(含0.1％Tween-20)，清洗一抗3遍，每遍5min；用3％BSA按1:1000稀释DAPI和相应的二抗，加入4孔板，每孔加入180μL二抗，之后室温孵育60分钟；
(e)弃二抗，每孔加入500μL PBST(含0.1％Tween-20)，清洗细胞3次，每次5min；用眼科镊取出细胞爬片，室温下避光干燥10分钟，随后封片。
(7)利用激光共聚焦显微镜对特异性标记的细胞进行荧光激发，并拍照保存数据；
(8)利用image J图像分析统计软件对拍照结果中P(S129)-α-syn阳性细胞在神经元中的比例进行统计分析，得出外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比。测试结果如图1所示，外周血检测样品中神经元(NeuN)、磷酸化synuclein蛋白得到了有效的识别，通过本发明方法可以有效富集外周血样本中神经元细胞，并进行分子水平的检测，从而得出外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比。
步骤(6)中所述特异性标记神经元细胞核抗原，可以替换成特异性标记神经微管蛋白(tubulin)或微管联合蛋白-2(MAP-2)。
实施例2PD和非PD样品的检测结果差异性比较
(1)采集5PD患者、8例非PD人群(control组)血样，按照实施例1的具体步骤完成NeuN、Phospho-α-synuclein阳性细胞检测。检测结果如图2所示；
(2)统计结果并制成表格，如下表1所示：
表1
图2A展示PD人群和非PD人群中P(S129)-α-syn+细胞占外周血NeuN+细胞的比值分布，二者具有显著差异(p＝0.0016，非配对T检验，Welch's校正)；图2B展示ROC曲线分析P(S129)-α-syn+细胞占外周血NeuN+细胞的比值在区分PD人群和非PD人群中的意义，当该比值为73％时，灵敏性为0.68，特异性为0.76，具有较高的PD筛查价值。

Claims (9)

1.一种检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取外周血至少100μL；
(2)在步骤(1)获得的血液样本中加入红细胞裂解液，待溶液变清亮时，离心，收集细胞沉淀备用；
(3)将包被有能与白细胞CD45抗原特异性结合的磁珠，与步骤(2)所得的细胞沉淀混合，进行孵育，利用吸附柱洗脱特异性结合的磁珠粒-白细胞混合体，得到含有稀有细胞和少量白细胞的混合细胞群；
(4)用Anti-CD24抗体孵育步骤(3)所得的混合细胞群，运用流式细胞分选技术或微流体细胞分选系统富集神经元，制得富含神经元的细胞群；
(5)将步骤(4)制得的富含神经元的细胞群铺板于预先用多聚鸟氨酸-层粘连蛋白处理的盖玻片上；
(6)将步骤(5)处理的盖玻片于室温下静置1h，然后用免疫荧光细胞化学方法对4',6-二脒基-2-苯基吲哚、神经元细胞核抗原、P(S129)-α-syn进行特异性标记；
(7)利用激光共聚焦显微镜对特异性标记的细胞进行荧光激发，并拍照保存数据；
(8)利用image J图像分析统计软件对拍照结果中P(S129)-α-syn阳性细胞在神经元中的比例进行统计分析，得出外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用红细胞裂解液破碎红细胞；所述红细胞裂解液用量为待测血液样本体积的三倍量，裂解条件为：冰上裂解15分钟，期间颠倒混匀，使溶液变得清亮透明；之后在4℃条件下，450g离心10min，弃上清并收集细胞沉淀；用待测血液样本两倍体积的红细胞裂解液重悬细胞沉淀，在4℃条件下，450g离心10min后收集细胞沉淀。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述白细胞与CD45磁珠结合后能够被带有磁性的吸附柱特异性的洗脱；吸附柱洗脱所用的洗脱缓冲液组份为MACSBSA Stock Sloution与autoMACS Rinsing Solution，两者按1:20混匀，洗脱的具体过程为：先将MS吸附柱插入到Midi separator上，并用500μL洗脱缓冲液润洗吸附柱；加入细胞悬液后，向吸附柱中滴加500μL洗脱缓冲液，待每次液体滴完最后一滴后立即补充500μL洗脱缓冲液，重复洗脱3次，洗脱下来的细胞即为稀有细胞群，含有极少量白细胞。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述吸附柱洗脱所用的洗脱缓冲液需在洗脱之前预冷，新的缓冲液需在管中洗脱缓冲液滴尽后立即加入，确保吸附柱在洗脱过程中保持湿润，所用试剂和耗材均为美天旎公司生产。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述anti-CD24抗体为abcam公司生产的小鼠单克隆抗体[SN3]to CD24(FITC)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述铺板所用的载玻片厚度不大于0.16mm；细胞铺板选用4孔板，4孔板为Thermo公司产品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述特异性标记的方法为：
(1)首先配制3％BSA于磷酸缓冲盐溶液中；
(2)然后再用其稀释一抗NeuN和P(S129)-α-syn，稀释比例分别为1:1000和1:150；
(3)将稀释后的抗体加入铺有细胞的4孔板中，室温孵育90分钟；
(4)清洗一抗3遍，用3％BSA按1:1000稀释DAPI和相应的二抗，加入4孔板后室温孵育60分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述特异性标记神经元细胞核抗原，可以替换成特异性标记神经微管蛋白或微管联合蛋白-2。
9.一种权利要求1所述检测外周血神经元中磷酸化α突触核蛋白阳性细胞占比的方法的应用，其特征在于，所述方法用于及早预防或治疗帕金森。
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