BRPI0117025B1 - métodos para medir a concentração de esperma total e de esperma móvel em uma amostra e para determinar a velocidade média de células de esperma e a porcentagem de esperma em uma amostra, sistemas para medir a concentração de esperma total em uma amostra e para analisar qualidade de sêmen, e, dispositivo de amostragem para uso na análise óptica um fluido biológico - Google Patents

métodos para medir a concentração de esperma total e de esperma móvel em uma amostra e para determinar a velocidade média de células de esperma e a porcentagem de esperma em uma amostra, sistemas para medir a concentração de esperma total em uma amostra e para analisar qualidade de sêmen, e, dispositivo de amostragem para uso na análise óptica um fluido biológico Download PDF

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Abstract

"métodos para medir a concentração de esperma total e de esperma móvel em uma amostra e para determinar a velocidade média de células de esperma e a porcentagem de esperma em uma amostra, sistemas para medir a concentração de esperma total em uma amostra e para analisar qualidade de sêmen, e. dispositivo de amostragem para uso na análise óptica um fluido biológico". um método para monitorar a concentração de esperma total (tsc) em amostra que compreende: (i) colocar a amostra em um recipiente transparente entre uma fonte de luz sincronicamente pulsante e um fotodetector; e (ii) medir a absortância óptica da amostra na faixa de 800- 1000 nm, o tsc da amostra sendo proporcional à absortância. também apresentado é um dispositivo de amostragem para uso no analisar opticamente um fluido biológico, um método para medir a concentração de esperma móvel (msc) em uma amostra de sêmen, um método de determinar a velocidade média (av) de células de esperma e um sistema para analisar a qualidade de sêmen compreendendo dispositivos para medir tsc, dispositivos para medir msc, e um sistema de visualização por vídeo.

Description

“MÉTODOS PARA MEDIR A CONCENTRAÇÃO DE ESPERMA TOTAL E DE ESPERMA MÓVEL EM UMA AMOSTRA E PARA DETERMINAR A VELOCIDADE MÉDIA DE CÉLULAS DE ESPERMA E A PORCENTAGEM DE ESPERMA EM UMA AMOSTRA, SISTEMAS PARA MEDIR A CONCENTRAÇÃO DE ESPERMA TOTAL EM UMA AMOSTRA E PARA ANALISAR QUALIDADE DE SÊMEN, E, DISPOSITIVO DE AMOSTRAGEM PARA USO NA ANÁLISE ÓPTICA UM FLUIDO BIOLÓGICO” Campo da Invenção A presente invenção trata da análise de sêmen.
Fundamentos da Invenção De acordo com estatísticas da WHO, 8 a 10% de todos os casais procuram os médicos no caso de falha de concepção. Mais de 40 milhões de casais vêm sendo tratados por infertilidade. Entre estes casais inférteis, estima-se que a infertilidade em 40% dos casais pode ser atribuída a causas de origem masculina, e outros 20% são atribuídos a causas combinadas de origem masculina e feminina.. A análise de sêmen é uma técnica principal no avaliar as causas de origem masculina. O protocolo de análise de sêmen envolve a determinação de pelo menos três parâmetros de sêmen principais: 1. concentração total de esperma (TSC); 2. porcentagem de esperma dotado de motilidade; 3. porcentagem de morfologias normal de esperma.
Para todos os fins práticos, a análise de sêmen, um fator chave na medicina da fertilidade masculina, não se alterou desde a década dos 30’s e ainda é atualmente realizada por inspeção microscópica. Na realidade é uma das poucas análises de fluido corporal remanescentes conduzidas in vitro ainda realizada quase exclusivamente através de métodos manuais.
Esta metodologia manual envolve observar cuidadosamente as células de esperma, efetuar sua contagem para determinar sua concentração, classificar sua motilidade, identificar sua morfologia, etc. Este trabalho requer alta perícia, é grandemente laborioso e se conduzido de acordo com os protocolos padrão,leva pelo menos uma hora por teste.
As determinações manuais são reconhecidamente bastante inexatas devido a numerosas fontes de erro. As principais fontes de erro são: - Subjetividade do observador; - Os critérios variáveis usados nos diferentes laboratórios e por diferentes observadores; - Os grandes erros estatísticos devido ao número limitado de esperma analisado. O manual WHO (WHO laboratory manual for the examination ofhuman semen and sperm-cervical mucus interaction, IV edição, Cambridge University Press, 1999) recomenda observar não menos de 200 espermas e classificar a morfologia e motilidade de cada, Este em si próprio é um procedimento introdutor de erros devido ao tédio e natureza consumidora de tempo da tarefa. Na prática,50 a 100 células de esperma no máximo são analisadas. Mesmo se o observador não introduzir quaisquer erros, o erro estatístico sozinho atinge dezenas de porcentagens.
Como um resultado da metodologia acima, os resultados de teste de análise de sêmen são globalmente reconhecidos como altamente subjetivos, inexatos e insatisfatoriamente reproduzíveis. Variações entre laboratórios e entre técnicos são de tais proporções que esta questão é de grande preocupação na medicina de fertilidade masculina e matéria não resolvida de exposição na grande maioria de simpósios, congressos e convenções sobre a matéria objeto.
Para superar estas dificuldades, companhias de instrumental médico têm introduzido sistemas computadorizados dedicados baseados sobre a análise de imagem (CASA - Computer Assisted Semen Analyzers). Estes sistemas exigem uma qualidade de imagem extremamente alta porque todos os seus resultados sào baseados sobre processamento de imagem. Embora estes sistemas tenham tentado substituir a análise manual e estabelecer padrões aceitos pela industria, não tiveram êxito em qualquer um destes objetivos. O primeiro objetivo não podia ser alcançado porque os resultados de analise continuam a depender de ajustes manuais e das diferentes marcas de equipamento. A substituição da análise manual rotineira é totalmente inviável porque os sistemas são extremamente dispendiosos, complexos e difíceis de usar. O fato é que tais sistemas genericamente não são encontrados na análise de semen de rotina porém mais exatamente têm estabelecido seu nicho exclusivamente em centros de pesquisas, hospitais universitários e ocasionalmente em centros de fertilidade altamente especializados.
Uma abordagem adicional para medições de sêmen é descrita nas patentes US: 4 176 953 e 4 197 450, o inteiro teor das quais é aqui incorporado. Estas patentes descrevem um método para medir a motilidade de esperma usando meios eletro-ópticos e um analisador de sinais analógicos. Uma suspensão de células de células de esperma é continuamente examinada em um campo predeterminado de maneira a detectar variações em densidade óptica pela motilidade do esperma. Um sinal elétrico analógico amplitude-modulado é gerado em resposta às variações, e os picos e cavas deste sinal são contados através de um período de tempo predeterminado para oferecer um parâmetro abstrato designado de índice de Motilidade de Esperma (SMI). Este parâmetro está relacionado com a motilidade e fornece leituras que são proporcionais ao número de células móveis multiplicado pela sua respectiva velocidade.
Um analisador de esperma automático designado Analisador de Qualidade de Esperma (SQA) que fornece o parâmetro SMI, encontra-se no mercado há alguns anos. O analisador é usado da seguinte maneira: um espécime de esperma é recolhido por uma câmara descartável que tem um bulbo de borracha numa extremidade para aspirar a amostra, e um delgado compartimento de medição na extremidade oposta. Após aspirar a amostra, o compartimento medidor é inserido no SQA e o SMI da amostra é determinado automaticamente. O parâmetro SMI, embora útil em algumas aplicações, não foi significativamente aceito pela comunidade medica como uma alternativa viável para as medições de sêmen microscópicas convencionais. r E conhecimento comum que em alguns campos de análise de fertilidade veterinária, a concentração total de esperma (TSC), é avaliada medindo a turbidez óptica do espécime. O princípio físico em que se baseia esta abordagem é que as células de esperma são mais opacas que o plasma seminal circundante, e a absortância de um feixe luminoso pelo espécime é por conseguinte proporcional ao TSC.
Por exemplo, a patente US 4 632 562 apresenta um método de medir a densidade de esperma medindo a absortância óptica de uma amostra contendo esperma e relacionar o sinal de saída de absortância com a densidade utilizando três canais de adição. O método apresentado é proposto para uso na inseminação artificial na indústria de procriação de gado, e mede a absorvência óptica na faixa de 400-700 nm. A tecnologia, todavia, não foi e não podería ser adotada para uso humano pelas seguintes razões: (1) Concentrações de esperma humano na faixa normal (e mesmo na faixa mais alta que nos casos normais) são de mais de uma ordem de magnitude mais baixa do que na maioria de suas réplicas veterinárias -onde esta tecnologia foi adotada. (2) Casos humanos são tratados mesmo quando as concentrações de esperma estão muito abaixo de seus níveis normais. Isto naturalmente não é o caso para animais. Animais inférteis são normalmente apartados - de qualquer modo, não são tratados quanto à infertilidade. (3) TSC em humanos é um parâmetro, que em si próprio, é totalmente insuficiente para pesquisas de fertilidade, e análise microscópica é de qualquer modo requerida para todos os outros dados no protocolo de análise de sêmen standard. A um grau substancial, isto também se aplica para aplicações veterinárias, Este fato tomou as medições de absortância óptica supérfluas, e nenhum esforço real foi investido neste campo.
Existe assim uma necessidade por uma técnica objetiva simples para medir TSC no sêmen humano.
De acordo com o manual WHO, a determinação de motilidade de esperma (considerada pela maioria ser o parâmetro de sêmen singular mais importante) pode ser realizada manualmente utilizando um sistema de retícula sob o microscópio ou, altemativamente, pelo uso de CASA. CASA proporciona algumas vantagens em relação aos métodos manuais. Todavia, a precisão e o fornecimento de dados quantitativos são totalmente dependentes de técnicas de preparação de sêmen exatas e ajustes de instrumentos. Estes fatores (alta especialização e ambiente sofisticado) juntamente com o custo proibitivo da dita instrumentação, exclui para todos os fins práticos sua aplicação para análise de sêmen rotineira. A patente US 4 896 966 apresenta um scanner de motilidade para caracterizar o movimento de espermas, bactérias e partículas em fluido. O scanner compreende uma lente de colimação, lente de condensação, lente formadora de imagem e um par de elementos refletores, uma fonte de iluminação, dispositivos sensores de radiação, dispositivos de processamento de sinais, e dispositivos de vídeo. A lente formadora de imagem tem uma profundidade útil de campo no seu plano de objeto de pelo menos cerca de 0,2 mm.
Sumário da Invenção Um dos objetivos da presente invenção é apresentar um método para medir TSC.
Um objetivo adicional da invenção é apresentar um método para determinar a concentração de esperma móvel (MSC) e motilidade 0/0.
Ainda um outro objetivo da invenção é apresentar um dispositivo de amostragem para uso na determinação de parâmetros de sêmen.
Outro objetivo da invenção é apresentar um sistema para a determinação de parâmetros de sêmen.
Sob um primeiro aspecto da invenção, é apresentado um método para medir a concentração total de esperma (TSC) em uma amostra. O método compreende (i) colocar a amostra em um recipiente transparente entre uma fonte de luz sincronicamente pulsante e um fotodetector; e (ii) medir a absortância óptica da amostra na faixa de 800-10000 nm, o TSC da amostra sendo proporcional a absortância. O método da invenção apresenta uma medição de objetiva de TSC que não está subordinada à análise de imagem, e que pode medir a TSC humana. Todavia, o método também pode ser usado para medir o TSC animal.
Em um segundo aspecto da invenção, e apresentado um dispositivo de amostragem para uso na análise óptica de um fluido biológico que compreende: (i) um aspirador para aspirar o fluido para o interior do dispositivo; (ii) uma câmara de medição delgada tendo u ma parede superior e inferior, a distância entre as paredes estando na faixa de 100-500 pm. (iii) uma câmara de medição espessa tendo uma parede superior e inferior, a distância entre as paredes estando na faixa de 0,5-3 cm; e (iv) dispositivos para exclusão do ar das câmaras de medição.
Em uma modalidade preferencial, o campo biológico é sêmen, preferencialmente sêmen humano. O dispositivo atua não só como um coletor de amostras mas também como uma câmara de teste dupla, habilitando simultâneo teste de TSC e MSC. Nenhuma diluição é requerida para qualquer uma das medições. Isto não somente economia trabalho porém também eliminar uma fonte significativa de erros - isto é, a inexatidão de diluição. O dispositivo também habilita (quando exigido) a visualização incorporada do espécime sem sua transferência para uma câmara de visualização em separado. A câmara espessa é também designada de um densitômetro óptico.
Sob um terceiro aspecto da invenção, é apresentado um método para medir a concentração de esperma móvel (MSC) em uma amostra de sêmen que compreende: (i) colocar a amostra em um recipiente transparente entre uma fonte de luz e um fotodetector, onde o movimento do esperma na amostra modula a luz transmitida através da mesma desse modo gerando um sinal; (ii) amostrar o sinal de modo a produzir uma pluralidade de amostras de sinal; (iii) selecionar sinais aceitáveis; (iv) calcular um valor absoluto para cada uma das amostras de sinal aceitáveis; (v) calcular uma média a dos valores absolutos; e (vi) calcular o MSC com base em a média a.
Verificou-se agora que a análise de formas de onda dos sinais analógicos derivados de um feixe de luz que atravessa uma amostra de sêmen pode proporcionar uma indicação do MSC. Usando critérios apropriadamente selecionados, excelente correlação foi comprovada existir entre a área média coberta pela forma de onda e o MSC. O MSC de uma amostra de esperma é obtido de acordo com a invenção analisando as propriedades ópticas da amostra, que variam através do tempo devido à motilidade do esperma.. Esta é na realidade a amplitude de sinal médio nas partes pertinentes da forma de onda, conforme será descrito abaixo em maior detalhe.
Em um quarto aspecto da invenção, é apresentado um método de determinar a velocidade média (AV) de células de esperma que compreende: (i) obter um índice de Motilidade de esperma (SMI) das células de esperma conforme definido na patente US 4 176 953; (ii) obter o MSC; e (iii) calcular AY utilizando uma expressão algébrica envolvendo a relação SMI/MSC.
Referência é feita aqui à patente US n2 4 176 953 concedida em 4 de dezembro de 1979, e que foi implementada em várias versões de Analisadores de Qualidade de Esperma produzidos pela Medicai Electronic Systems, Israel. Esta patente, quando aplicada à análise de sêmen, apresenta um parâmetro designado SMI (índice de Motilidade de Sêmen). Conforme exposto na patente acima e comprovado em numerosos estudos de apoio, o SMI é uma função tanto da concentração de células móveis (que é designada de MSC) e como de sua velocidade média (AV). Para simplificar, pode-se dizer que SMI é uma função de MSCxAV, ou AV é uma função de SMI/MSC. A velocidade media de uma amostra de esperma pode fornecer uma indicação da qualidade da motilidade do esperma.
Indiferentemente ao acima declarado, SMI como u ma função de MSC e AV é mais complexa que uma multiplicação direta. Após observar, analisar e medir mais de uma centena de amostras de sêmen, a correta correlação (fórmula) entre elas foi desenvolvida. Em termos genéricos, a fórmula para extrair a velocidade média pode ser definida como: AV=f(SMI/MSC), ‘f sendo um polinômio do terceiro grau. Trabalhando com f(x) = l/1000x3 + l/10x3 + 0,89x, oferece um fator de correlação de r = 0,82.
Deve ser observado que a maioria dos protocolos de análise de sêmen requer dados sobre 0/0 de esperma dotado de motilidade progressiva mais exatamente que sua velocidade média. A motilidade progressiva é definida como aquele esperma dotado de uma velocidade média de 5 μηι/segundo ou maior. Este parâmetro também pode efetivamente ser extraído da velocidade média se uma dispersão normal de velocidades é presumida em tomo da média. Mesmo nos casos onde a dispersão de velocidade não é normal, o erro no calcular o 0/0 de esperma progressivamente móvel não é significativamente afetado. Outrossim, quando diferentes velocidades mínimas são definidas como de motilidade progressiva, este valor limiar variável é facilmente introduzido no cálculo, desse modo conferindo flexibilidade extra no proporcionar este parâmetro. Isto é importante ao trabalhar em diferentes meios de diluição, temperaturas ambiente ou na realidade diferentes espécies em medições de veterinária.
Sob um quinto aspecto da invenção, é apresentado um sistema para analisar viabilidade de esperma que compreende: (i) dispositivos para medir TSC; (ii) dispositivos para medir MSC; e (iii) um sistema de visualização de vídeo. O sistema da invenção combina a medição dos dois parâmetros de esperma principais TSC e MSC, com a tradicional visualização do esperma, assim habilitando a aquisição do terceiro parâmetro - morfologia do esperma. Em uma modalidade preferencial, TSC e/ou MSC são determinados de acordo com os métodos da invenção. Em outra modalidade preferencial, o sistema ainda compreende o dispositivo de amostragem da invenção.
Deve ser acentuado que existe uma diferença básica entre o sistema de visualização de vídeo usado no sistema da invenção e outros sistemas de visualização de esperma (tal como CASA). Os outros sistemas requerem imagens de alta qualidade porque todos os seus resultados são fundamentados sobre o processamento de imagem. Na presente invenção, por outro lado, a visualização é usada somente como um instrumento complementar para visualizar casos atípicos ou suspeitos, para maior confiança nos resultados processados, identificar patologias específicas e habilitar avaliação de morfologia de esperma manual, quando requerida.
De maneira a desempenhar estas tarefas, o sistema de visualização de vídeo usado na invenção é projetado como um subsistema econômico, compacto, que embora de uso limitado como independente, precisamente desempenha um papel complementar no sistema da invenção. Uma vantagem importante adicional do sistema de visualização quando comparado com procedimentos microscópicos, é que o uso de pipetas, preparação de lâminas, diluição e preenchimento de hemocitômetros é desnecessário. O uso, juntamente com o sistema de visualização de vídeo, do aparelho da invenção, que também atua como uma câmara de teste completa, elimina todo o acima. Estes aspectos característicos, na realidade permitem e habilitam o uso do sistema da invenção em qualquer pequena clinica ou mesmo ambiente de consultório. O sistema de visualização de vídeo permite obter as seguintes informações suplementares com relação à amostra testada; 1. Medição de concentrações de esperma muito baixas. A medição de TSC à concentrações muito baixas (abaixo de 5 milhões de esperma (ml) é intrinsecamente limitada em precisão. Isto é devido ao fato de que a absorção de luz por outros fatores além das células de esperma, muito se tomar relativamente significativo a estes baixos níveis. A absorção de luz pode ser devida à variabilidade de plasma seminal ou à presença de células diferentes de esperma. Entre as últimas se incluem WBCs (leucócitos indicando infecções) e outras células imaturas ou não-espérmicas provenientes de várias fontes, etc. Uma vez que de acordo com a invenção TSC é medida por absorção óptica, sem visualização havería uma possibilidade para ambigüidade nas faixas muito baixas devido às considerações acima mencionadas. Quando TSC é considerada importante nas faixas baixas, a visualização habilita a diferenciação entre as diferentes células contribuindo para a absorção de luz. Uma vez que MSC é medida independentemente de absorção de luz, a 0/0 motilidade (MSC/TSC) pode ser calculada usando o parâmetro TSC visualmente determinado. 2. Identificação de células estranhas no sêmen. O sistema é útil no identificar a presença de outras células que podem ter um efeito sobre o sêmen e/ou assistir na diagnose do mal que afeta o paciente. Por exemplo, leucócitos indicam infecção, células imaturas indicam um problema na espermatogênese, aglutinação pode ser devida a um número de causas, etc. 3. Avaliação manual de morfologia de esperma Embora o sistema da invenção automaticamente avalie a porcentagem de esperma com morfologias normais, o faz de acordo com um critério dado (p.ex. o critério WHO). Lamentavelmente este critério não é universalmente aceito. Tais critérios universalmente aceitos ainda não existem, e são muitas vezes um fator de aplicação. Por exemplo, critérios de morfologia para aplicações IVF e ICSI normalmente são muito mais rigorosos do que nos casos normais. Outros padrões internacionais (tal como o critério rigoroso ou de Krueger) são também amplamente aplicados. A visualização permite que o especialista em fertilidade selecione seus próprios critérios assim como identifique os defeitos específicos presentes (deformidade da cabeça, problema da cauda, etc.). 4. Validação de Vasectomia e Azoospermia.
Para validar completamente o resultado de vasectomia ou obter uma diagnose conclusiva e azoospermia, é necessário determinar a inexistência absoluta de qualquer esperma no sêmen sob avaliação. Isto geralmente não é possível com a tecnologia de absorção de luz, porque as concentrações que devem ser medidas podem ser muito baixas. Neste caso, é necessária a visualização manual para cuidadosamente escanear grandes campos de visão em busca de células de esperma individuais. O sistema de visualização de esperma usado no sistema da invenção é especificamente personalizado para tratar idealmente destas aplicações. 5. Impressão O sistema de visualização de vídeo habilita “congelar” uma vista selecionada dada (ou algumas vistas) que podem então ser impressas e afixadas ao Relatório de Análise de Sêmen. Isto é de grande valia para consultas e validação de eficácia de tratamento. Um subproduto da opção de congelamento é visualizar a amostra de sêmen sob condições estáticas. Isto facilita fortemente a análise e contagem. Nas avaliações microscópicas, isto pode somente ser feito desmobilizando (matando) o esperma anteriormente à visualização. Mesmo então todo esperma morto terminará em uma camada, uma condição que normalmente complica a análise devido à alta concentração e superposição de esperma na camada.
Descrição Sucinta dos Desenhos Para compreender a invenção e ver como pode ser posta em prática, modalidades preferenciais passam a ser descritas a seguir, a título meramente de exemplos não limitativos, com referência aos desenhos apensos, nos quais; A fig. 1 é um diagrama em blocos ilustrando uma modalidade do método de medir TSC de acordo com a invenção; A fíg. 2 é uma vista superior em perspectiva de uma modalidade de um dispositivo de amostragem de acordo com a invenção; A fig. 3 é uma vista seccional lateral parcial do dispositivo da fig. 2; A fig. 4 é uma vista seccional da válvula separadora girada em 90° em relação à vista da fig. 3; A fig. 5 é uma ilustração esquemática de um sistema para análise de sêmen de acordo com uma modalidade da invenção; A fig. 6 é um fluxograma ilustrando um algoritmo para calcular o MSC; A fíg. 7 é um fluxograma ilustrando um algoritmo para calcular a velocidade média; A fig. 8 ilustra um sinal analógico típico de esperma móvel e em função do tempo; A fig.9 é uma curva da correlação do MSC com o sinal analógico médio; e A fig. 10 é um diagrama em blocos ilustrando uma modalidade de um sistema de visualização de vídeo de acordo com a invenção.
Descrição Detalhada da Invenção Exemplo 1 Como declarado acima, a medição óptica automática de TSC em amostras de sêmen humano conforme oposta às amostras de animal tem sido prejudicada no passado devido à baixa concentração de células de esperma. Isto, juntamente com o alto ruído eletrônico e óptico de fundo devido p.ex. à variabilidade de plasma seminal tem impedido a aplicação de métodos rotineiramente usados na análise de fertilidade veterinária. O método da presente invenção vem a superar estes obstáculos combinando os seguintes aspectos característicos: (i) A amostra é colocada em um recipiente transparente entre uma fonte de luz sincronicamente pulsante e um fotodetector sincronicamente habilitado. O uso de uma fonte de luz sincronicamente pulsante e de um fotodetector habilita a distinção de células de esperma a baixas concentrações em relação aos níveis de ruído eletrônico. (ii) medir a absorção óptica da amostra na faixa de 800-1000 nm. Verificou-se que o medir a absorção na região quase infravermelha proporciona as condições ideais para obter forte absorção por células de esperma e baixa absorção por plasma seminal. De preferência a faixa medida é de 850-950 nm. Preferencialmente, a faixa é de 880-9900 nm.
Utilizando o método da invenção, o T SC de uma amostra pode ser determinado em função da absortância. Ainda que o método da invenção de preferência seja usado com amostras de sêmen humano ou esperma humano, também pode ser usada com sêmen e esperma animal, de preferência após diluição apropriada.
Um exemplo de um sistema óptico utilizando uma modalidade do método da invenção é ilustrado na fíg. 1. O sistema, indicado genericamente pelo numeral 2, compreende uma fonte de luz 4, um fotodetector 6 e um retentor de amostra 8 entre eles interposto. Uma fonte de luz preferencial é um emissor de luz sincronicamente pulsante de comutação rápida (LED) que emite luz na região próxima ao infravermelho. A fonte de luz pode ser controlada por um controlador de intensidade de luz 10 que por sua vez é regulado por um modulador 12. O fotodetector é capaz de detectar luz sincronicamente pulsante, O fotodetector transmite os sinais analógicos para um demodulador 14, que é também regulado pelo modulador 12, e deste para a saída 16 do sinal em forma digital. O trajeto do feixe através da amostra de preferência é vertical. A extensão do trajeto de feixe através da amostra está genericamente entre 5 e 15 mm, de preferência 10 mm. O retentor de amostra tem de ser completamente transparente à ondas de luz na região próxima ao infravermelho de entre 800 e 1000 nm. O material plástico do qual o retentor de amostra é construído tem de ser totalmente não tóxico às células de esperma. Um material de preferência é o poliestireno PG-79. O retentor de amostra de preferência deve ser configurado para totalmente prevenir a penetração e a formação de bolhas de ar na amostra, que interfere com a medição óptica.
Pela utilização do método da invenção, níveis de detecção de TSC que chegam até aproximadamente 2 milhões de células/ml. foram alcançados.
Este nível já indica extrema patologia de sêmen.
Amostra 2 A figura 2 ilustra uma modalidade de dispositivo de amostragem 20 de acordo com a invenção para emprego no medir sêmen. O dispositivo compreende uma seção de visualização óptica anterior 22, uma seção de aspiração posterior 24 e uma seção de exclusão de ar intermediária 26. A seção de visualização óptica 22 compreende uma câmara de medição delgada 28 e uma câmara de medição espessa 30. A câmara delgada é usada para medir MSC e/ou para visualização, ao passo que a câmara espessa é para medir TSC. Desta maneira, múltiplos parâmetros podem ser medidos de forma simultânea utilizando o mesmo dispositivo de amostragem e etapa de amostragem. A seção de aspiração 24 compreende um cilindro 32 e um êmbolo mergulhante 3 4 deslizantemente inserido no seu interior. Estas partes casam mutuamente e funciona como em uma seringa standard. Esta seção serve para a aspiração da amostra de sêmen para o interior das câmaras de medição. A seção de exclusão de ar 26 compreende uma válvula separadora 38 para separação das câmaras de medição do volume do cilindro após o enchimento. O aspirador, a câmara de medição delgada, a câmara de medição espessa e a seção de exclusão de ar estão todas em comunicação fluídica.
Um adaptador 38 na forma de um trilho retangular se estende ao longo de um lado do dispositivo 20 e serve para o correto deslizar e alinhar do dispositivo mediante inserção no interior de um instrumento óptico pelo qual a amostra é avaliada. Também oferece o apoio e estabilidade mecânica requerida para medições eletro-ópticas de precisão.
As partes do dispositivo podem ser vistas mais claramente na fíg, 3. A câmara de medição delgada 28 é uma cavidade interna tendo paredes superior 40 e inferior 42 transparentes paralelas através das quais o feixe óptico pode passar. A distância entre as paredes está na faixa de 100 a 500pm, de preferência 250 a 350 pm, preferencialmente cerca de 300 pm. Neste caso, o volume de líquido na câmara é de aproximadamente 24 pl. A extremidade anterior 44 da câmara tem uma abertura através da qual a amostra pode ser captada para o interior do dispositivo. Na modalidade ilustrada, a câmara tem aproximadamente 4 mm de largura. A câmara de medição delgada serve para avaliação da motilidade de esperma e pode ser posicionada entre uma fonte de luz p.ex. oposta à parede inferior 42 e um fotodetector p.ex. oposto à parede superior 40. Será compreendido que a fonte de luz e o fotodetector também podem ser posicionados em lados opostos da câmara. Um feixe de luz é transmitido através da câmara contendo uma amostra de sêmen. O detector do outro lado da câmara registra variações de densidade óptica causadas por célula de esperma em movimento. As variações de densidade óptica são convertidas em um sinal elétrico pelo fotodetector que então rateadas para os circuitos eletrônicos para ser filtrado, digitalizado e processado de modo a indicar o MSC. A câmara de medição delgada também pode ser usada com um sistema de visualização de vídeo, como será adicionalmente explanado abaixo. A câmara de medição espessa 30 tem uma parede transparente superior 46 e uma inferior 48 através das quais um feixe óptico pode passar. A distância entre as paredes está na faixa de 0,5-3 cm„ de preferência de 0,81,2 cm, preferencialmente de aproximadamente 1 cm. O volume aproximado alojado pelo compartimento espesso neste último caso seria de cerca de 0,5 ml.
Esta câmara serve para medições de absorção eletro-óptico de concentração de esperma. Um feixe de luz, que pode ser o mesmo ou diferente daquele da câmara delgada 28, é transmitido através das paredes superior e inferior da câmara e detectado por um fotodetector. 0 volume da câmara deve ser completamente preenchido com uma amostra de esperma de maneira a evitar inexatidões devido à bolhas de ar. A atenuação do feixe de luz quando passa através da câmara é proporcional à concentração de esperma. A intensidade do feixe der luz é medida após passar através da câmara e convertida em unidades de TSC por meios eletrônicos, A ordem das câmaras no dispositivo de amostragem pode ser trocada. O cilindro 32 está em comunicação fluídica com as duas câmaras de medição 28 & 30, de modo que puxando o êmbolo 34, fluido é aspirado para o interior das câmaras. Este método de aspiração permite que grandes volume de amostra sejam aspirados para o interior do dispositivo. Para prevenir que bolhas de ar permaneçam nas câmaras de medição, uma válvula separadora 36 é interposta entre o cilindro e as câmaras de medição e está em comunicação fluídica com as mesmas. A válvula é mostrada em detalhe na fig. 4 e compreende um êmbolo 50 deslizantemente alojado em um corpo de válvula 52. Um diâmetro interno de conexão 54 conectando entre a câmara de medição 30 e o cilindro 32 passa através do êmbolo 50.
Quando a válvula está na posição superior, existe uma conexão entre as câmaras de medição e o cilindro de aspiração. O pressionamento da válvula para baixo interrompe a conexão e assegurar que nenhum ar permaneça nas câmaras de medição onde as amostras são medidas e nenhum vazamento ocorrerá mesmo quando existe uma variação de temperatura. Esta técnica é equivalente ao deslocamento positivo uma vez que o ar é excluído dos volumes de fluido medidos (exceto na extremidade anterior 44). Esta construção habilita trabalhar com amostras de virtualmente todas viscosidades, enquanto ao mesmo tempo prevenindo vazamento e a penetração de bolhas de ar no interior dos volumes de espécime a serem analisados.
Embora os meios para exclusão de ar das câmaras de medição tenham sido exemplificados por uma válvula separadora, outros meios também podem ser usados, tal como uma pipeta de deslocamento positivo.
Todas as partes do dispositivo podem ser fabricadas de qualquer material que não seja tóxico para as células medidas. De preferência, o material é relativamente econômico, tais como materiais plásticos, para que o dispositivo possa ser descartável. Um exemplo de um polímero que pode ser usado para produzir o dispositivo é o poliestireno PG79. A válvula separadora, o cilindro e êmbolo podem ser produzidos de polipropileno. O compartimento de medição delgado é substancialmente a parte mais sensível a toxidez do dispositivo devido à relação de área para volume muito alta do liquido seminal naquela seção.
Para aspirar uma amostra para o interior do dispositivo 20, a extremidade 44 do compartimento de medição delgado 28 é imersa aproximadamente em 3 mm na amostra de sêmen, que é então aspirada para o interior do dispositivo além da válvula separadora 36. Apenas cerca de 0,6 cm3 são enchidos para o enchimento completo do dispositivo. A válvula separadora é então calcada, e o dispositivo pode ser inserido no interior de um aparelho de medição óptico.
Exemplo 3 Como mencionado acima, a determinação do MSC de acordo com a invenção requer a geração de um sinal de tensão (voltagem) que é proporcional ao MSC. A fig. 5 mostra uma modalidade de um sistema para análise de sêmen capaz de gerar um sinal deste tipo.
Uma capilar óptica 100 dotada de uma seção transversal retangular é usada para alojar uma amostra de sêmen 102. A capilar 100 é iluminada com um feixe de luz incidente 105 produzido por uma fonte de luz 110. A capilar 100 tem um trajeto óptico de 300 μηι através do qual passa o feixe de luz 105. Após atravessar o capilar, o feixe de luz dispersa 106 é colimado por uma abertura circular 108 dotada de diâmetro de 70 pm. O feixe colimado 107 incide sobre um fotodetector 115. O fotodetector 115 produz um sinal de tensão analógico 120 proporcional à intensidade do feixe 107. O sinal analógico variar no tempo devido à motilidade do esperma na amostra de sêmen 102, como mostrado por exemplo na fig. 8.. O sinal analógico é alimentado a um conversor analógico/digital 125 que amostra o sinal analógico 120 à razão de p.ex. 8000 Hz e gera um sinal de saída digita 128.0 sinal de saída digital pode ser armazenado em uma memória 130. O movimento de esperma na amostra 102 leva a uma modulação na intensidade do feixe 107, que por vez afeta o sinal analógico 120 e o sinal digital 128.
Um processador 135 é configurado para realizar uma análise de dados armazenados na memória 130 de modo a produzir uma análise da amostra de sêmen 102. Os resultados da análise podem visualmente exibidos em qualquer dispositivo de vídeo tal como uma tela de CRT 140 de um computador pessoal 145, ou sobre uma tela a cristal líquido (LCD) interna 148 do aparelho de medição. A fig. 6 mostra um diagrama de fluxograma para uma modalidade de um algoritmo para calcular o MSC conforme realizada p.ex. pelo processador 135 da fíg 5, de acordo com a invenção.
Na etapa 200, o sinal digital 128 da fig. 5 é digitalmente filtrado de modo a remover altas e baixas frequências que não são pertinentes à freqüência dominante do sinal, que é determinada pelas características de motilidade da amostra de sêmen 102. Isto é realizado de forma a otimizar a relação de sinal para ruído. O componente CC do sinal 128 é também removido. Para amostras de sêmen humano, por exemplo, a gama de freqüência pertinente ideal comprovou estar entre 5 e 30 Hz. Na etapa 205, amostras digitais tendo um valor absoluto abaixo de um primeiro valor limiar predeterminado, que pode ser determinado empiricamente, são excluídas. Na etapa 210 o mesmo valor limiar é subtraído de todas as amostras remanescentes.
Na etapa 215, um procedimento de seleção de forma de onda é realizado para descartar todas as formas de onda atribuíveis a artefatos tais como de células não pertinentes, etc. Uma modalidade preferencial de seleção de forma de onda com esperma humano é eliminar todas as formas de onda que não satisfaçam os seguintes critérios: Altura mínima -10 mV Largura mínima - 37,5 milissegundos Largura máxima - 500 milissegundos Mínimo tempo de ascensão/queda - 2,5 milissegundos A correta definição (e detecção do inicio e término de formas de onda associado com esperma é definidas como aquelas onde significativas mudanças de direção de forma de onda ocorrem. A diferença de tempo entre dois ditos pontos define a duração de tempo de uma onda dada. A maneira de seleção pode ser entendida a título de exemplo com referência à figura 8 (não representada em escala), que mostra a amplitude do sinal analógico (120 na fig. 5) em função do tempo. O valor limiar 302 é determinado empiricamente para proporcionar linearidade ideal entre o sinal de saída e o MSC microscopicamente medido. As formas de onda que são usadas para o cálculo de MSC são designadas 304,305,306 e 307, As outras formas de onda foram rejeitadas por várias razões: 308 porque o seu pico é inferior ao valor limiar, 310 porque é demasiadamente larga, e 312 porque é demasiadamente estreita.
Na etapa 220 da fig. 6 o valor absoluto de todas as amostras selecionadas é calculado, e na etapa 225, a média a dos valores absolutos é calculada. Na etapa 230, o MSC da amostra 102 é calculado sobre a média a. Por exemplo, verificou-se que a dependência de MSC sobre a pode ser descrita por uma equação linear da forma: MSC=aa onde α é uma constante empiricamente derivada. Em uma modalidade preferencial, a dependência de MSC sobre a pode ser descrita por uma equação quadrática da forma: Com referência à fig.9, uma amostra de esperma humano específica foi analisada de acordo com a invenção. Verificou-se a subordinação de MSC sobre a podería ser descrita pela seguinte expressão algébrica: (I) Uma correlação linear satisfatória verificou-se existir para pequenos valores de a. Utilizando a fórmula (I), o fator de correlação (í) para esperma fresco através da inteira gama foi > 0,98.
Análise de amostras de sêmen tratada com viscosidade variável também foi realizada utilizando amostras descongeladas, esperma lavado, amostras diluídas (tanto em Citrato de Sódio a 3% como em buffer de gema de ovo) assim como com amostras contendo até 20% de glicerol tendo viscosidade artificialmente aumentada. Verificou-se que a viscosidade de amostra variável (e por conseguinte a velocidade de esperma), não afetou significativamente a correlação entre MSC e o sinal médio (“r” em todos casos permaneceu acima de 0,96).
Utilizando técnicas de enriquecimento centrífugo, uma gama muito ampla de concentração de esperma humano móvel foi medida (até 250 M/ml)„ Nenhuma saturação significativa foi encontrada. A ligeira não linearidade nas gamas mais altas é facilmente corrigida por uma simples correção polinomial de segundo grau - dada acima.
Análise de sêmen bovino também foi conduzida e fatores de correlação entre MSC bovino e sinal identicamente mediado (mesma metodologia como para humanos) proporcionou resultados igualmente excelentes, Deve ser observado todavia, que o sêmen bovino tem de ser diluído anteriormente às medições. Isto é devido ao seu MSC ser tipicamente uma ordem de magnitude acima daquele do humano.
Exemplo 4 Conforme explanado acima, a velocidade média é uma função de SMI e MSC. Com referência à figura 7, o SMI é calculado na etapa 235. Esta pode ser realizada, por exemplo, conforme exposto na patente US n° 4 176 953, ou utilizando um analisador SQA. Na etapa 240 o MSC é calculado por qualquer método conhecido. Em uma modalidade preferencial, MSC é calculado pelo algoritmo da invenção (ver Exemplo 3 acima). Na etapa 245, a velocidade média AV é calculada utilizando uma expressão algébrica envolvendo a relação SMI/MSC. Em uma modalidade AV é calculada utilizando a expressão algébrica: Na etapa 250 os resultados são visualizados no dispositivo de vídeo 145 ou 148 (fig. 5) Exemplo 5 Uma modalidade de um subsistema de visualização de vídeo (WS) que pode ser usado com o sistema de análise da invenção é ilustrado na figura 10. Uma amostra de sêmen 300 é colocada diante de um iluminador de fase contrastada difusa 305. A amostra pode ser suportada em uma lâmina de laboratório standard ou esffegaço, ou pode ser alojada em um dispositivo de amostragem de acordo com a invenção. A luz proveniente do iluminador 305 passa através da amostra 300 e através de um sistema de lente dupla comutável 310, de preferência com amplificação de 20 e 40. A luz amplificada é, então conduzida para uma videocâmera CCD em miniatura 315. ‘ A imagem resultante pode ser exibida sobre uma tela de visualização interna incorporada 320 ou sobre dispositivo de exibição externa 325 tais como PCs, telas, dispositivos impressores, etc. ■ Em uma modalidade preferencial, WS é construído em tomo do dispositivo de amostragem da invenção, e particularmente o compartimento de medição delgado. O objetivo desta característica é que não serão necessárias quaisquer preparações extras para incorporar esta função ao procedimento de teste normal. Simplesmente toma-se o dispositivo carregado de sêmen sobre o qual o teste automatizado é conduzido e procede-se à sua inserção como tal no interior da porta de visualização. Todavia, o WS não está limitado a uso com o dispositivo de amostragem da invenção, e pode ser usado com lâminas ou esfregaços de laboratório standard. A extremidade frontal do WS é similar àquela do microscópio.Duas lentes objetivas são selecionáveis para otimizar a ampliação e campo de visão de acordo com o pedido (x20 ou x40). Todavia, em vez das oculares de microscópio,, a imagem proveniente da objetiva é conduzida para uma vídeocâmera CCD em miniatura. A dimensão de CCD (diagonal) é de 6 mm. A tela de visualização é um LCD de 100 mm. Isto proporciona uma ampliação de vídeo de aproximadamente 17. Esta efetivamente dá uma amplificação total potencial de 340 ou 6S0. Ainda que fatores de amplificação de somente 200 e 400 sejam requeridos, este conjunto é selecionado de forma que a amplificação acima podería ser alcançada em uma construção muito menor. Esta é desejável p.ex. para uma unidade de área de trabalho (o decréscimo da distância de imagem especificada decresce a amplificação para o que é requerido).
As lentes e sua configuração de ampliação pode ser selecionada de modo que a “distância de trabalho” (do objeto para as lentes) pode ser variada para habilitar o escaneamento através da inteira profundidade do compartimento de medição delgado (p.ex. 300 pm). Isto contrariamente à visualização microscópica normal que não requer tal escaneamento, porque o objeto está normalmente encerrado em uma lâmina que tem apenas 20 pm de profundidade e a inteira profundidade pode ser visualizada sem escaneamento ou re-focalização.
Como mencionado acima, um fator de amplificação total de 200 ou 400 pode ser selecionado. Uma amplificação de 400 será a escolha quando é necessário identificar células não são de esperma (leucócitos, células circulares, etc.) assim como para investigar e avaliar várias patologias morfológicas de células de esperma (aglutinações, células imaturas, defeitos de cabeça ou de cauda de esperma, etc.). Uma amplificação de 200 será preferível para contagem de células - indiferentemente ao fato de serem de esperma ou outras. A amplificação mais baixa oferece um campo de visão maior (4 vezes maior) e desse modo estatísticas de contagem aperfeiçoadas. A possibilidade de congelar imagens otimiza grandemente ambas as aplicações.
Para facilitar as contagens de célula e adquirir um resultado efetivamente quantitativo utilizando o WS, em uma modalidade preferencial uma retícula calibrada pode ser graficamente representada diretamente sobre a tela de visualização LCD. A retícula compreende quadrados de 2 cm que são equivalentes a uma dimensão de pré-amplificação de 0,1 mm no compartimento de medição carregado de sêmen (fator de amplificação de 200). Esta abordagem evita a tarefa muito difícil de traçar precisamente uma retícula diminuta sobre o compartimento de medição propriamente dito. A última solução dispendiosa é incorporada na Câmara de Contagem Mackler assim como em alguns outros hemocitômetros - excluindo seu uso como produto descartável. Na presente invenção isto é desnecessário e o WS permite que a retícula constitua parte da tela de visualização. O WS pode ser útil nas seguintes aplicações: (a) Medir concentrações de esperma muito baixas; (b) Identificar células estranhas no sêmen (diferentes das células de esperma); (c) Análise de morfologia manual de acordo com qualquer critério selecionado; (d) Validação da eficácia de vasectomia (e) Diagnose de Azoospermia (f) Comparação imediata de resultados computadorizados com a análise visual; (g) Proporcionar “Instantâneos” impressos de imagens imobilizadas de várias camadas de sêmen. A imobilização e realizada por congelamento eletrônico das imagens REIVINDICAÇÕES

Claims (26)

1. Método para medir a concentração de esperma total (TSC) em uma amostra, a referida amostra sendo colocada em um recipiente transparente entre uma fonte de luz pulsante e um fotodeteetor sincronicamente operados, habilitando assim a distinção de células de esperma, a faixas de concentração de esperma muito baixas, em relação aos níveis de ruído eletrônico, durante medições de absorção em uma faixa espectral selecionada; o método sendo caracterizado pelo fato de que compreende: medir a absorvâneia óptica da amostra na faixa espectral de 800-1000 nm sendo selecionada para fornecer condições ideais para obter forte absorção por células de esperma e baixa absorção por plasma seminal na amostra, e determinar o TSC da amostra como sendo proporcional à absorvâneia óptica,
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a absorvâneia é medida na faixa de 850-950 nm.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a absorvâneia é medida na faixa de 880-900 nm.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende sêmen humano.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende esperma humano.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende sêmen animal,
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende esperma animal.
8. Sistema óptico para medir a concentração de esperma total (TSC) em uma amostra compreendendo uma fonte de luz pulsante e um fotodeteetor, a fonte de luz pulsante e o fotodeteetor sendo sincronicamente operados, para assim habilitar a distinção de células de esperma, a faixas de concentração de esperma muito baixas, em relação aos níveis de ruído eletrônico; o sistema óptico sendo caracterizado pelo fato de que compreende: (i) a referida fonte de luz pulsante sendo configurada e operável para emitir luz em uma faixa espectral de 800-1000 nm, sendo selecionada para fornecer condições ideais para obter forte absorção por células de esperma e baixa absorção por plasma seminal na amostra; (ii) um retentor de amostra transparente posicionado entre a dita fonte de luz e o dito fotodetector; e (iii) um processador para determinar o TSC como sendo proporcional à absorção da luz.
9. Dispositivo de amostragem (20) para uso na análise de um fluido biológico compreendendo um aspirador para aspirar o fluido para o interior do dispositivo (20), o dispositivo de amostragem (20) sendo caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma câmara de medição delgada (28) tendo paredes superior e inferior, a distância entre as paredes estando na faixa de 100-500 mícrons; (ii) uma câmara de medição espessa (30) tendo paredes superior e inferior, a distância entre as paredes estando na faixa de 0,5-3,0 cm; e (iii) em elemento para exclusão de ar das câmaras de medição (28, 30).
10. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o fluido biológico é o sêmen.
11. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o aspirador, a câmara de medição delgada (28) e a câmara de medição espessa (30) estão em comunicação fluida.
12. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a distância da câmara de medição delgada (28) está na faixa de 250- 350 mícrons.
13. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a distância da câmara de medição espessa (30) está na faixa de 0,8-1,2 cm.
14. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o aspirador compreende um cilindro (32) e um êmbolo (34).
15. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os dito elemento para exclusão de ar compreende uma válvula posicionada entre as câmaras de medição (28, 30) e o aspirador.
16. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um adaptador (38) para alinhar o dispositivo (20) em um instrumento pelo qual o fluido biológico é analisado.
17. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as paredes superior e inferior das câmaras de medição (28, 30) são transparentes.
18. Dispositivo (20) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que ele é descartável.
19. Método para medir a concentração de esperma móvel (MSC) em uma amostra de sêmen pela transmissão de luz através de uma amostra colocada em um recipiente transparente entre uma fonte de luz e um fotodetector, causando assim modulação da luz pelo movimento do esperma na amostra e detectando luz modulada pelo fotodetector, o método sendo caracterizado pelo fato de que compreende: (i) gerar um sinal de forma de onda indicativo da luz modulada detectada; (ii) amostrar o sinal de forma de onda de modo a produzir uma pluralidade de amostras de sinal de forma de onda; (iii) selecionar amostras de sinais de forma de onda aceitáveis calculando um valor absoluto para cada uma das amostras de sinal de forma de onda e excluindo as amostras de sinal de forma de onda tendo valores absolutos abaixo de um limiar predeterminado; (iv) calcular uma média a dos valores absolutos das amostras de sinal de forma de onda aceitáveis selecionadas; e (v) calcular o MSC com base na média a.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o MSC é calculado de acordo com a expressão algébrica MSC = Aa2 + Ba.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o MSC é calculado de acordo com a expressão algébrica MSC = 0,0047a2 + 0,869a.
22. Método para determinar a velocidade média (AV) de células de esperma utilizando um índice de motilidade de esperma (SMI) das células de esperma, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) obter o MSC conforme o método como definido na reivindicação 19; e (ii) calcular AV utilizando uma equação que inclui uma expressão algébrica envolvendo a relação SMI/MSC, sendo esta equação
23. Método para determinar a porcentagem de esperma em uma amostra tendo progressiva motilidade caracterizado pelo fato de que compreende o método como definido na reivindicação 22, onde AV>5 mícrons/s.
24. Sistema para analisar qualidade de sêmen caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um dispositivo para medir TSC; (ii) um dispositivo para realizar o método como definido na reivindicação 19 para medir MSC; e (iii) um sistema de visualização de vídeo.
25. Sistema de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um dispositivo de amostragem para analisar um fluido biológico, o dispositivo de amostragem compreendendo: um aspirador para aspirar o fluido para o interior do dispositivo; uma câmara de medição delgada tendo uma parede superior e inferior, a distância entre as paredes estando na faixa de 100-500 mícrons; uma câmara de medição espessa tendo uma parede superior e inferior, a distância entre as paredes estando na faixa de 0,5-3 cm; e um elemento para exclusão do ar das ditas câmaras de medição.
26. Sistema de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os dispositivos para medir TSC utilizam um método como definido na reivindicação 1.
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