KR20030066520A - 저농도 세포수 측정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 임상 검체, 연구용 검체 에서 백혈구, 적혈구, 혈소판, 거핵구 및 조직세포 등의 저농도 세포수 산정을 위한 세포수 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 일정한 양의 검체를 슬라이드 글라스 상에 떨어뜨린 후, 건조 고정하고, 특수 염색을 하고, 투명 격자 테이프를 부착한 후, 광학 현미경 하에서 격자를 기준으로 전체 슬라이드 내의 세포수를 계수함으로써 세포수를 산정할 수 있다.
Description
혈액, 요, 대변, 체액(흉수, 심낭액, 복수, 활액, 양수, 위액, 뇌척수액) 등 임상검체에서 적혈구, 백혈구(호중구, 호산구, 림프구), 대식세포, 상피세포, 종양세포 등의 세포수의 측정은 질병의 진단, 치료후 관찰 및 예후 판정에 임상적 의의는 크다. 예를 들면, 적혈구의 수로 빈혈의 유무나 정도를 조사할 수 있고, 백혈구는 많은 질환에 있어서 증감이 나타나므로, 그 계수는 질환의 스크리닝에 있어서 중요하고, 특히 뇌척수액에서 백혈구수의 측정은 결핵성 뇌막염, 세균성 뇌막염, 바이러스성 뇌막염의 감별 진단에 이용되는 등, 긴급한 판정이나 치료를 요하는 질환에 있어서는 특히 중요한 검사 항목으로 되어 있다. 또한 연구 목적으로 특정 세포 또는 균주를 배양한 후, 배양의 성공여부와 이를 이차적으로 이용하기 위해서 세포수의 측정은 필수적이다.
현재, 세포수의 계수 방법에는 크게 나누어 시산법(視算法)과 자동화법이 있다. 상기 시산법은 수동혈구측정기상에서 예검(銳檢)하여 계수하는 방법이고, 무처리로 혈구를 계수하는 경우와 염색제로 혈구 세포의 핵을 염색하여 계수하는 경우가 있다. 수동혈구측정기의 원리는 유리 재질로 제작되었으며 검체가 모세관 현상에 의해 확산되어 일정한 양이 들어갈 수 있도록 일정한 부피의 공간으로 이루어져 이를 직접 광학현미경하에서 관찰하여 세포수를 계수하여 세포수를 산정하는 것이다. 상기 자동화법은 혈액을 일정량으로 희석한 후 이것을 극세의 유로로 통과시켜, 전기 저항이나 산란광으로 혈구를 검출하여 혈구 수를 계수하는 방법이고, 통상 자동화 혈구계수장치에 의해 실시된다. 이들 계수 방법은 인간의 시각에 의한 것인가 기계에 의한 것인가의 차이는 있으나, 실제로 세포수를 계산하는 방법이다. 그러나, 이들 계수 방법에는 이하의 문제가 있다.
상기 시산법에서는 적혈구의 용혈이나 혈구의 응집 및 세포의 변형에 의한 세포 오인, 측정자의 숙련도 등에 따라 계수 오차가 발생한다. 또, 시산법에서는 세포의 모양 판별에 어려움이 많아, 도말 염색 표본으로 확인하여, 세포수를 보정할 필요가 있는 경우가 많다. 특히 수동혈구측정기를 이용하여 요 또는 체액내의 세포수 측정시, 세포는 시간의 경과에 따라 변형되어 측정한 세포수는 급격하게 감소하므로 재검하고자 할 경우 불가능하고, 즉시 관찰하여 계수해야만 정확한 결과를 얻을 수 있다. 또한 기존 수동혈구계산기는 정확한 용적을 유지하기 위해 유리 재질로 되어 있어 파손이 잘되며, 비교적 고가인 단점이 있다.
상기 자동화법은 혈구수의 측정에 이용되는데, 적아구의 출현, 피브린의 응괴, 혈소판 응집, 적혈구의 용혈 불량 등의 원인으로, 바른 계수값을 얻을수 없는 경우가 있으며, 특히 백혈구수가 100/㎕ 이하로 존재할 경우에는 측정이 부정확하여 상기 시산법으로 측정하고 있으며, 이러한 장치는 고가이고 대형이다.
[참고 문헌: Transfusion Science 1997;18(4):505-15, Transfusion 1994;34(1):35-8, Clinical Laboratory Haematology 2001;23:43-51, Transfusion 2000;40:513-20, Transfusion 1993;33(5):409-12.]
본 발명의 목적은 세포수 측정용 투명 격자 테이프를 이용하여 편리하며, 정확하고, 간단하고 게다가 저비용으로 임상 검체, 연구용 검체에서 백혈구, 적혈구, 혈소판 및 거핵구 등의 세포수 산정에 광범위하게 이용할 수 있으며, 특히 저농도의 세포수를 정확하게 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저농도의 세포수 측정 방법으로 기존의 정도관리가 되어진 마이크로 피펫을 이용하여 세포수의 농도에 따라 1㎕, 5㎕, 10㎕, 50㎕ 등 일정량을 떨어뜨린 후, 관찰이 용이하도록 염색하여 슬라이드 전체의 세포수를 계수함으로써 세포수를 산정할 수 있다. 슬라이드 전체의 세포수를 계수하기 위해서는 세포수 측정용 투명 격자 테이프를 이용한다. 기존의 수동혈구계산기의 경우, 정확한 측정을 위해서는 정확한 부피의 공간을 만들기 위해 제작시 고도의 정확성을 필요로 하는데 반해 본 방법은 미리 일정양의 검체를 떨어뜨려 염색하여 관찰함으로써 세포의 구별이 용이하고 또한 검사자가 즉시 검사하지 못할 경우, 일단 일정양의 검체를 떨어뜨린 슬라이드만 준비하고 있으면 후에 정확한 검사가 가능하며, 기존의 검사법에서는 추후 재확인하려고 해도 세포수의 감소로 측정이 불가능하였으나 이를 가능하도록 하는 특징을 가지고 있다.
도 1은 본 발명에 따른 세포수 측정용 투명 격자 테이프를 부착한 슬라이드의 평면도 및 현미경 관찰시의 평면도. (가): 투명 격자 테이프를 부착한 슬라이드의 평면도, (나): 40배용 투명 격자 테이프 부착시, 40배 확대 현미경 시야, (다): 100배용 투명 격자 테이프 부착시, 100배 확대 현미경 시야, (라): 200배용 투명 격자 테이프 부착시, 200배 확대 현미경 시야, (마): 400배용 투명 격자 테이프 부착시, 400배 확대 현미경 시야
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
1. 세포수 측정용 투명 격자 테이프2. 일반 슬라이드
본 발명은 현미경용 일반 슬라이드에 접착 가능한 세포수 측정용 투명 격자 테이프를 이용하여 각각 측정하고자하는 세포를 관찰하는 현미경의 확대 배율에 따라 40배용(도1, 나), 100배용(도1, 다), 200배용(도1, 라), 400배용(도1, 마)으로 구분된다. 40배용의 경우, 40배 확대 현미경에서 관찰시 한 시야의 지름은 5 ㎜이므로 각 가로 및 세로의 격자간의 간격은 2.5 ㎜로 제작되어 6.25 ㎟인 정사각형의 한개의 구획이 한 시야에서 관찰이 가능하다.
본 저농도 세포수 측정 방법은 일정한 양의 검체를 슬라이드 위에 떨어뜨린 후, 건조하여 광학 현미경하에서 세포의 관찰이 용이하도록 염색(Wright Giemsa 염색 또는 Hematoxylin Eosin 염색 등)한 후, 등간격으로 획선되어 있는 세포수 측정용 투명 격자 테이프를 붙인 후, 광학현미경하에서 슬라이드 전체의 세포수를 계수하여 세포수를 측정하는 방법으로 본 테이프의 격자를 기준으로 점적된 검체의 세포수 전체를 계수 할 수 있으며, 일정양을 점적함으로써 계수된 세포수로부터 농도를 계산하여 세포수 측정을 할 수 있다. 이와같이 본 세포수 측정 방법은 임상 및 연구용 검체에서 세포수 측정이 요구되는 경우, 쉽게 측정이 가능하다.
이하, 본 고안의 실시 예는 다음과 같다.
정상인 3명의 혈액을 항응고제인 K3EDTA가 함유되어 있는 시험관에 검체를 채취하여 자동혈구계산기인 CellDyn 4000 (Abott, USA)을 이용하여 백혈구수를 측정한 후, 이를 생리식염수로 배수희석하여 각각을 자동혈액계산기, 수동혈구계산기인 Naegeotte chamber 및 본 세포수 측정방법을 이용하여 각각 4회씩 측정한 후, 측정된 평균 백혈구수를 비교하였다. 슬라이드용 세포수 측정 투명 격자 테이프는200배용(도1, 라)을 이용하였으며, 각 검체를 마이크로 피펫을 이용하여 1 ㎕ 또는 10 ㎕씩 슬라이드에 점적한 후, 건조하여 Wright Giemsa 염색을 한 후, 테이프를 부착하여 200배 확대 광학현미경하에서 계수하여 세포수를 산정하였다. 각각의 측정된 백혈구수는 표1과 같으며, 측정된 각 백혈구수를 기대값에 대한 오차[{(기대값-측정값)/기대값}×100]를 계산한 결과(표2), 본 발명에 따른 백혈구측정 방법이 가장 정확도가 높았다. 각 백혈구수를 기대값에 대하여 회귀방정식을 구하고, 기대값과의 상관계수(R2)를 구한 결과, 자동혈구계산기 0.9990, 수동혈구계산기 0.9984 및 본 투명 격자 테이프를 이용한 방법 0.9991로 큰 차이는 없었다.
검체1, 백혈구수 4523/㎕ | 검체2, 백혈구수 6505/㎕ | 검체3, 백혈구수 7540/㎕ | |||||||||
기대값 (/㎕) | 자동 혈구 계산기 | 수동 혈구 계산기 | 투명 격자 테이프 | 기대값 (/㎕) | 자동 혈구 계산기 | 수동 혈구 계산기 | 투명 격자 테이프 | 기대값 (/㎕) | 자동 혈구 계산기 | 수동 혈구 계산기 | 투명 격자 테이프 |
2262 | 2238 | 2218 | 2239 | 3253 | 3227 | 2938 | 3012 | 3770 | 3738 | 3562 | 3549 |
1131 | 1143 | 996 | 1108 | 1626 | 1654 | 1578 | 1592 | 1885 | 1868 | 1772 | 1758 |
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283 | 314 | 254 | 262 | 407 | 439 | 389 | 382 | 471 | 506 | 427 | 441 |
141 | 183 | 126 | 129 | 203 | 266 | 184 | 192 | 236 | 281 | 209 | 220 |
71 | 117 | 62 | 67 | 102 | 148 | 92 | 89 | 118 | 176 | 34 | 105 |
35 | 0 | 28 | 30 | 51 | 0 | 43 | 50 | 59 | 94 | 51 | 54 |
18 | 0 | 14 | 15 | 25 | 0 | 19 | 22 | 29 | 0 | 24 | 25 |
검체1, 백혈구수 4523/㎕ | 검체2, 백혈구수 6505/㎕ | 검체3, 백혈구수 7540/㎕ | |||||||||
기대값 (/㎕) | 자동 혈구 계산기 | 수동 혈구 계산기 | 투명 격자 테이프 | 기대값 (/㎕) | 자동 혈구 계산기 | 수동 혈구 계산기 | 투명 격자 테이프 | 기대값 (/㎕) | 자동 혈구 계산기 | 수동 혈구 계산기 | 투명 격자 테이프 |
2262 | 1.06 | 1.95 | 1.02 | 3253 | 0.80 | 9.68 | 7.41 | 3770 | 0.85 | 5.52 | 5.86 |
1131 | 1.06 | 11.94 | 2.03 | 1626 | 1.72 | 2.95 | 2.09 | 1885 | 0.90 | 5.99 | 6.74 |
565 | 6.37 | 4.96 | 2.30 | 813 | 5.54 | 7.01 | 2.34 | 943 | 5.83 | 3.82 | 2.33 |
283 | 10.95 | 10.25 | 7.42 | 407 | 7.86 | 4.42 | 6.14 | 471 | 7.43 | 9.34 | 6.37 |
141 | 29.78 | 10.64 | 8.51 | 203 | 31.03 | 9.36 | 5.42 | 236 | 19.07 | 11.44 | 6.78 |
71 | 64.79 | 12.68 | 5.63 | 102 | 45.10 | 9.80 | 12.74 | 118 | 49.15 | 71.19 | 11.02 |
35 | 100.00 | 20.00 | 14.29 | 51 | 100.00 | 15.69 | 1.96 | 59 | 59.32 | 13.56 | 8.47 |
18 | 100.00 | 22.22 | 16.67 | 25 | 100.00 | 24.00 | 12.00 | 29 | 100.00 | 17.24 | 13.79 |
이상과 같이 본 발명은 임상 및 연구용 검체를 슬라이드 위에 일정양을 떨어뜨린후, 건조, 염색하여 등간격으로 획선한 투명 격자 테이프를 부착하여 광학현미경 시야에서 백혈구, 적혈구, 혈소판, 거핵구 및 조직세포 등 다양한 세포수 산정에 이용할 수 있으며, 특히 정확한 저농도의 세포수 측정이 가능하다. 본 저농도 세포수 측정방법은 사용이 편리하며, 정확하고, 안정하여, 소형 검사실 및 연구실에서도 다양한 세포수 측정시 편리하게 이용할 수 있다.
Claims (1)
- 저농도의 세포수 측정을 위한 방법으로서 일정한 양의 검체를 슬라이드 글라스 상에 떨어뜨린 후, 건조 고정하는 단계, 특수 염색을 하고, 투명 격자 테이프를 부착한 후, 광학 현미경 하에서 전체 스라이드 내의 세포수를 계수하여 미리 떨어뜨린 검체양에 대한 세포수를 계산하여 저농도의 세포수의 농도를 결정할 수 있는 측정 방법.
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2003
- 2003-07-11 KR KR1020030047277A patent/KR20030066520A/ko not_active Application Discontinuation
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